JP2003004723A

JP2003004723A - 毒性物質検知方法と検知装置

Info

Publication number: JP2003004723A
Application number: JP2001338882A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Taguchi; 和之田口; Yoshiharu Tanaka; 良春田中
Original assignee: Fuji Electric Co Ltd
Current assignee: Fuji Electric Co Ltd
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2001-11-05
Publication date: 2003-01-08
Anticipated expiration: 2021-11-05
Also published as: JP4045780B2

Abstract

(57)【要約】【課題】発光細菌の使い捨てや測定者のミス等の従来
の問題を解消し、水中の毒性物質を連続的にかつ安定し
て自動測定可能な毒性物質検知方法および装置を提供す
る。【解決手段】発光細菌を高分子材料のゲル中に固定
し、試料液を通水した時の発光細菌の発光量の減少から
試料液中の毒性物質を検知することとし、その装置とし
ては、発光細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光細菌固
定手段（例えば発光細菌を固定したビーズ状小塊６ａを
カラム６ｂに充填したもの、または薄膜状固定化膜を備
えるフローセル）と、この発光細菌固定手段に試料液を
連続的に導入する試料液導入手段と、発光細菌の発光量
を測定する光検出手段１３と、この測定データを処理し
発光量に応じた出力を行なうデータ処理手段１６とを備
えるものとする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、上下水道の各処
理プロセスの処理水や河川水、湖沼水などの環境水また
は廃棄物埋立処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工
場排水などを対象として、水中の毒性物質をモニタリン
グすることを目的としたバイオセンサを応用した水質の
検知方法と検知装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】環境中には６〜１０万種といわれる人為
的に合成された化学物質に加え、非意図的な生成物質で
あるトリハロメタンなどの消毒副生成物やダイオキシン
類などの燃焼副生成物、あるいは環境中での変化体など
数多くの化学物質が存在している。上下水処理プロセス
の処理水や廃棄物処分場の浸出水などこれらの化学物質
に汚染された水を、オゾンや生物、活性炭などによって
処理を進めていく過程において、各処理プロセスで水中
の毒性が除去されているか監視することが重要となって
きている。このような処理プロセス中の毒性は、その評
価結果を処理プロセスにフィードバックする必要があ
り、迅速かつ簡便に毒性を検出することが強く要望され
ている。

【０００３】一方、発光細菌は自ら発光する微生物であ
り、毒性物質に曝されダメージを受けると、発光量が減
少するという特徴を持っている。生物のこの発光現象は
生物発光と呼ばれ、原生生物、菌類、細菌などの微生物
にみられる。

【０００４】発光細菌における発光反応は、以下のよう
なサイクルで進行すると考えられている。はじめ(1)の
反応において発光基質ルシフェリンに相当する物質であ
るFMN（フラビンモノヌクレオチド）がフラビン還元酵
素によりFMNH₂に還元される。このときNADH（還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド）は電子供与体と
して働く。ついで(2)式のようにFMNH₂がルシフェラーゼ
と結合したFMNH₂−ルシフェラーゼ複合体が生成し、こ
の複合体が酸素と反応するとフラビン中間体１が生成す
る。このフラビン中間体１が(3)式のようにR-CHO（直鎖
飽和アルデヒド）と反応するとフラビン中間体２が生
じ、(4)式のように直鎖飽和アルデヒドがR-COOH（直鎖
飽和カルボン酸）に酸化されると同時に、フラビン中間
体２が基底状態(フラビン中間体３)に移行するため、こ
のときの遷移エネルギーが光量子として490nmの波長の
光が放出される。最後に(5)式のようにフラビン中間体3
はFMNとルシフェラーゼに分解し、FMNは再びフラビン還
元酵素によりFMNH₂に還元される。このようなルシフェ
ラーゼによる発光反応は一般的に(6)式のようにまとめ
られる。 (1)NADH＋FMN＋H⁺→NAD⁺＋FMNH₂ (2)FMNH₂＋ルシフェラーゼ＋O₂→フラビン中間体１ (3)フラビン中間体１＋R-CHO→フラビン中間体２ (4)フラビン中間体２→フラビン中間体３＋R-COOH＋ｈ
ν (5)フラビン中間体３→FMN＋H₂O＋ルシフェラーゼ (6)FMNH₂＋O₂＋R-CHO→FMN＋H₂O＋R-COOH＋ｈν こうした発光反応は、発光細菌の呼吸とカップリングし
て起こり、発光細菌では呼吸によって得られたエネルギ
ーによってATP（アデノシン5’-三リン酸）が生産さ
れ、生産されたATPはその加水分解により生じるエネル
ギーによって生体の高分子の生合成やその他エネルギー
が必要な反応に使用される。しかし、発光反応ではエネ
ルギーは光として放出されるだけでATPの生産は行われ
ない。このような過程で発光細菌が何らかの有害物質に
曝露されると、生物発光が阻害され発光量が減少する。

【０００５】発光細菌を用いその発光量の減少から試料
中の毒性物質を検知する試験法は、Ｂｕｌｉｃｈ，Ａ．
Ａ．により開発され（Ｂｕｌｉｃｈ，Ａ．Ａ．：Ｔｏｘ
ｉｃｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｕｓｉｎｇｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｖｏｌ．１，ｐ５７−７４，ＣＲ
ＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ（１９８６）参
照）、MICROTOXという商品名で装置化されている。この
装置に用いられている発光微生物は海洋性発光細菌であ
るＶｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ（ビブリオ・フィシ
ェリ）である。試料中の毒性物質は、その濃度に比例し
て発光細菌の発光量を減少させるため、発光量を毒性物
質の指標として用いることができる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところで、従来の毒性
物質検知装置においては、発光細菌は使い捨てであるた
めに、測定毎に新たに発光細菌を補充しなければなら
ず、多量の試料液を測定する場合、発光細菌を含む試薬
の費用が高くなり経済的ではない。また試料液中への発
光細菌試薬の分注、発光量の測定がすべて手動であるた
め、測定者の熟練を要し、多量の試料液を測定する場合
には測定者の負担が大きくなり、測定者のミスが多くな
りやすい。そのため、この装置は試料液の連続的な毒性
検知には不適当であった。

【０００７】この発明は、上記従来の問題点に鑑みてな
されたもので、この発明の課題は、上記の発光細菌の使
い捨てを止め、測定者のミスの防止を図るために、発光
細菌を固定化し、測定を自動化することにより、水中の
毒性物質を連続的に安定して自動的に測定可能な毒性物
質検知方法と装置を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
めに、この発明の毒性物質検知方法は、発光細菌を多糖
類またはタンパク質などの高分子材料のゲル中に固定
し、試料液を通水した時の発光細菌の発光量の減少から
試料液中の毒性物質を検知することとする（請求項１の
発明）。

【０００９】上記検知方法を実施するための装置として
は、発光細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光細菌固定
手段と、この発光細菌固定手段に試料液を連続的に導入
する試料液導入手段と、発光細菌の発光量を測定する光
検出手段と、この測定データを処理し発光量に応じた出
力を行なうデータ処理手段とを備えるものとする（請求
項２の発明）。

【００１０】上記請求項１ないし２の発明によれば、発
光細菌の発光量を測定することにより、自動で連続的に
安定して試料液中の毒性物質を測定できる。

【００１１】また、前記請求項２の発明に係る毒性物質
検知装置の実施態様としては、下記請求項３ないし１１
の発明が好ましい。即ち、請求項２に記載の毒性物質検
知装置において、前記発光細菌固定手段は、発光細菌を
高分子ゲル化剤でビーズ状小塊に固定し、複数個の前記
ビーズ状小塊をカラム中に充填してなるものとする（請
求項３の発明）。

【００１２】上記請求項３の発明によれば、固定化した
発光細菌を円筒の石英ガラス管などのカラムに充填し、
毒性物質を含む試料液と発光細菌の栄養成分の混合した
溶液を、このカラムの下方から上方へ向けて通水する。
固定化発光細菌の発光はカラムより放出される。この発
光量を光電子増倍管などの光デバイスによって連続的に
測定し、毒性物質による発光量の減少を測定することに
より、自動で連続的に安定して試料液中の毒性物質を測
定できる。

【００１３】また、装置の性能・寿命上の観点から、下
記請求項４の発明が好ましい。即ち、前記請求項２に記
載の毒性物質検知装置において、前記発光細菌固定手段
は、発光細菌を高分子ゲル化剤で薄膜状固定化膜として
固定し、この薄膜状固定化膜を、試料液が連続的に導入
されるフローセル内に配設してなるものとする。

【００１４】前記請求項３の発明のように、発光細菌を
高分子ゲル化剤でビーズ状小塊に固定し、連続的に試料
液を長期間送液した場合、高分子ゲル化剤が劣化して発
光細菌が漏出したり、また、ビーズ状小塊の中心部まで
酸素や栄養分が透過せず発光細菌が死滅または発光量の
低下をもたらし、性能・寿命上の問題が懸念される。こ
れに対して、前記請求項４の発明の場合には、薄膜状に
固定された発光細菌全体に略均等に酸素や栄養分を浸透
させることができるので、発光細菌の発光量の低下を防
止し、発光細菌を長期間保持できる。

【００１５】さらに、前記薄膜状固定化膜の実施態様と
しては、下記請求項５ないし６の発明が好ましい。即
ち、請求項４に記載の毒性物質検知装置において、前記
フローセル内に配設してなる薄膜状固定化膜は、微孔性
親水性膜と光透過性膜との間に挟持されてなり、前記試
料液は前記微孔性親水性膜側に導入されてなるものとす
る（請求項５の発明）。また、請求項５に記載の毒性物
質検知装置において、前記微孔性親水性膜はそのポアサ
イズが０．２〜１．０μｍからなるニトロセルロース製
の膜とし、前記光透過性膜は透明軟質塩化ビニル製の膜
とするものとする（請求項６の発明）。請求項５ないし
６の発明については、後に詳述する。

【００１６】また、前記高分子ゲル化剤の実施態様とし
ては、下記請求項５ないし６の発明が好ましい。即ち、
請求項２ないし６のいずれかに記載の毒性物質検知装置
において、前記高分子ゲル化剤は、アルギン酸ナトリウ
ム、カラギーナン、寒天などの多糖類，コラーゲン、ゼ
ラチンなどのタンパク質，光硬化樹脂，ポリアクリルア
ミドの内のいずれかとする（請求項７の発明）。さら
に、請求項２ないし６のいずれかに記載の毒性物質検知
装置において、前記高分子ゲル化剤は、その分子量が８
万〜１１万からなるアルギン酸ナトリウムとする（請求
項８の発明）。前記請求項７ないし８の発明について
も、後に詳述する。

【００１７】また、前記フローセルの実施態様として
は、下記請求項９ないし１１の発明が好ましい。即ち、
前記請求項５に記載の毒性物質検知装置において、前記
フローセルは、前記微孔性親水性膜と光透過性膜との間
に挟持された薄膜状固定化膜と、この薄膜状固定化膜を
それぞれシール部材を介して保持する上部ケースおよび
下部ケースとからなり、前記微孔性親水性膜を上部ケー
ス側に配設し、かつ上部ケースと前記微孔性親水性膜と
の間の空間に前記試料液を導入してなるものとする（請
求項９の発明）。これにより、薄膜状固定化膜を備えた
フローセルの構成が簡略化され、かつ測定の安定化を図
ることができる。

【００１８】また、薄膜状固定化膜の前記微孔性親水性
膜の表面に付着し、発光細菌の活性を維持するための栄
養成分や試料水中に含まれる有機物を基質とする雑菌な
どに由来する汚れを取り除く観点から、下記請求項１０
の発明が好ましい。即ち、請求項９に記載の毒性物質検
知装置において、前記フローセルにおける上部ケースと
微孔性親水性膜との間の空間に、試料液の導入によって
前記微孔性親水性膜表面に付着した汚れを回転または攪
拌運動によって除去するための洗浄用ボールを配設して
なるものとする。

【００１９】さらに、前記請求項９または１０に記載の
毒性物質検知装置において、前記フローセルにおける下
部ケースに、前記薄膜状固定化膜の光透過性膜と対向し
て光検出器を配設してなるものとする（請求項１１の発
明）。これにより、フローセルと光検出器との組合せ構
造がシンプルとなり、また測定精度の向上を図ることが
できる。

【００２０】

【発明の実施の形態】図面に基づき、本発明の実施の形
態について以下にのべる。

【００２１】図１は、本発明に関わる毒性物質検知装置
の一例を示す模式的構成図で、発光細菌を高分子ゲル化
剤でビーズ状小塊に固定し、複数個の前記ビーズ状小塊
をカラム中に充填してなる実施例の構成図である。

【００２２】図１において、発光細菌を固定化したビー
ズ状小塊６ａを円筒形石英ガラス管のようなカラム６ｂ
に充填し、通水手段のポンプ１４により連続的に試料液
をカラム６ｂに通水し、光電子増倍管などの光検出器１
３によって固定化発光細菌の発光量を測定し、このデー
タを処理するコンピュータ１６に伝送する。この処理デ
ータから毒性物質の量を検知することができる。この
際、微小発光量を測定するために、発光細菌を充填した
カラムと光検出器とは、外界から光が入らないように暗
箱１５に収められる。この装置のカラムは、例えば円筒
形石英ガラス管のような光が透過できる材料を用いて、
その内部に固定化発光細菌を充填し保持できる構造を有
する。

【００２３】この毒性物質検知装置を用い、毒性物質注
入時の発光強度の時間経過を測定した結果の一例を図９
に示す。ここでは毒性物質試料液として２０ｍｇ／Ｌの
フェノールを注入した。図９から明らかなように、フェ
ノールを注入すると発光量の低下が認められ、１５分間
曝露後の発光量は、初期値から約４０％低下している。
次に試料液からフェノールを除去すると発光量が上昇
し、発光細菌の発光が毒性物質の除去により復帰してい
ることがわかる。このように前記図１に示した実施例に
より、固定化発光細菌を用いて連続的に水中の毒性物質
を検知することができることが確認された。

【００２４】次に、発光細菌を高分子ゲル化剤で薄膜状
固定化膜として固定する実施例について述べる。

【００２５】まず、発光細菌の薄膜状固定化膜の構成に
ついて述べる。図２に薄膜状固定化膜の斜視図、図３に
側断面図を示す。図２および３に示すように、薄膜状固
定化膜６は、発光細菌１が微孔性親水性膜３と光透過性
膜４との間に挟み込まれ、両面テープ２によって前記２
つの膜が接着された構造を有し、発光細菌１は、後に詳
述する高分子ゲル化剤によって固定されている。試料液
および栄養成分や空気中の酸素が微孔性親水性膜３に接
触し、薄膜状固定化膜内部の発光細菌へ浸透し供給され
る。発光細菌１の発光は、光透過性膜２を透過し、図示
しない後述する光検出器で捉えられる。

【００２６】上記薄膜状固定化膜６を構成する各部材の
最適化に関して検討した結果について、以下に述べる。
まず、微孔性親水性膜３について述べる。親水性を有す
る微孔性膜は、発光細菌を吸引ろ過しまた固定化後には
発光細菌が漏出しないようなポアサイズ０．２〜１．０
μｍであることが望ましい。また、試料や栄養成分、酸
素などが透過できるような親水性の材料であることが望
ましい。このような材料としては、ニトロセルロース、
親水性ポリ塩化ビニリデンクロライド、ポリカーボネー
ト等が使用できる。

【００２７】一般に細菌の捕捉に用いられる膜材料のポ
アサイズは、０．２μｍ、０．４５μｍ、１．０μｍの
ものが用いられる。ポアサイズ０．２μｍの膜は、発光
細菌を吸引ろ過するときに目詰まりを起こしやすく、菌
体を多く固定することが比較的困難であり、また、ポア
サイズ１．０μｍの膜は、発光細菌が漏出する恐れがあ
るので、ポアサイズ０．４５μｍが最適である。

【００２８】一方、材質面ではポリカーボネート製の膜
は破断しやすく扱いにくく、また親水性ポリビニリデン
クロライド製の膜はニトロセルロース製の膜よりも約半
分の菌体量しかろ過できないため、親水性を有する微孔
性膜としては、ニトロセルロースが最適である。

【００２９】次に、前記光透過性膜２について述べる。
光透過性膜としては、ガラスや石英などの無機材料、透
明軟質塩化ビニルやポリカーボネートなどの有機材料が
使用できる。上記の内、ガラスや石英などの無機材料
は、固定化膜の製膜時やセンサ装着時の操作性の面から
割れやすい性質を持つので、この観点から有機材料が好
ましい。種々の有機材料の中で、透明または半透明の材
質とその評価結果を表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】光透過性膜は円形の親水性を有する微孔性
膜と両面テープを介して張り合わせるため、光透過性材
料を打抜きポンチなどを用い所定のサイズで円形に切断
する必要がある。そのため、材質は軟質のものが適して
いる。このことから、表１に示すように、光透過性材料
として透明軟質塩化ビニルと低密度ポリエチレンの２種
類を選択し、これらの材料のうち発光細菌が放出する波
長490nmの光を吸収するかどうかの確認を行った。使用
する材質のシートの厚さは標準品で厚さが最も薄い0.1
μｍとした。

【００３２】これらのシートを分光光度計にて吸収波長
のスキャンを行った結果、低密度ポリエチレンの490nm
での光の吸収は0.18であったが、透明軟質塩化ビニルで
は0.046でありこの波長の光をほとんど吸収しなかっ
た。従って、発光細菌固定化膜に用いる光透過性材料と
しては、透明軟質塩化ビニルが好適である。

【００３３】次に、前記高分子ゲル化剤について述べ
る。前述のように、薄膜状固定化膜またはビーズ状小塊
において、発光細菌の流動を防ぐために高分子ゲル化剤
で発光細菌をゲル化し固定する。ゲル化材料としては、
アルギン酸ナトリウムの他に多糖類のカラギーナン、寒
天や、タンパク質のコラーゲン、ゼラチンなどが使用で
き、また、高分子材料の光硬化樹脂やポリアクリルアミ
ドなども使用できる。

【００３４】上記の内、アルギン酸ナトリウムは、塩化
カルシウム溶液を添加するのみでゲル化し、他のゲル化
剤のように加熱や紫外線照射などの操作が不要であるた
め、ゲル化材料として好適である。しかし、アルギン酸
ナトリウムゲルの硬さが硬すぎると菌体は保持できるが
酸素や栄養分の透過性が悪くなり、逆に柔らかすぎると
透過性はよくなるが菌体を保持できないことが考えられ
る。

【００３５】そこでアルギン酸ナトリウムの分子量(重
合度)に関して、下記のような種々のアルギン酸ナトリ
ウムについて評価を行なった。その結果を表２に示す。

【００３６】

【表２】

【００３７】アルギン酸ナトリウムは君津化学工業製を
用いた。アルギン酸ナトリウム溶液の粘度は分子量(重
合度)に応じて増大しゲルの硬さも増大する。アルギン
酸ナトリウムをピペットで吸い上げるなどの操作には粘
度の小さいものが適している。分子量(重合度)の異なる
アルギン酸ナトリウムを用いて発光細菌をビーズ状に固
定化し、ロータリーシェイカーで振とうしてゲルが崩れ
ないか否かの確認を行った。培養した発光細菌を遠心分
離し、得られた菌体ペレットを各アルギン酸ナトリウム
の１％溶液に懸濁した。この発光細菌／アルギン酸懸濁
液を２％塩化カルシウム溶液に滴下し発光細菌固定化ビ
ーズを作成した。得られたビーズを６穴のポリスチレン
製マイクロプレートにいれ、培地を添加し２日間振とう
した。

【００３８】この結果、No.2およびNo.3,No.4ではビー
ズの形状が保持されていたが、No.1ではビーズが崩壊し
た。No.1は検討したアルギン酸ナトリウムの中で最も粘
度が低くゲルが柔らかいため崩壊したと考えられる。表
２の結果から、発光細菌の流動を防ぐアルギン酸ナトリ
ウムは１％の粘度が３２０cP以上であり、分子量が約８
万〜11万のものが適していることがわかった。

【００３９】発光細菌を固定化したビーズの発光量を冷
却型CCDカメラ(LAS-1000,富士フィルム社製)を用い、露
出時間10秒で観察したところNo.3が最も発光量が高く、
ビーズ内の発光細菌への物質の透過性が良好であると考
えられる。他のアルギン酸ナトリウムではNo.3の約40か
ら60％の発光量であった。上記により、発光細菌を固定
化するアルギン酸ナトリウムとして１％溶液の粘度が50
0〜600cPで分子量約１０万のものが最適である。

【００４０】これらの検討結果を総合すると、本発明の
発光細菌の薄膜状固定化膜においては、発光細菌を固定
する親水性を有する微孔性膜としては、ポアサイズが
０．４５μｍのニトロセルロース製の膜、光透過性膜と
しては、透明塩化ビニル製のシート、発光細菌の流動を
防ぐ高分子ゲル化剤としては、１％溶液の粘度が500〜6
00cPであり分子量約１０万のアルギン酸ナトリウムが最
適である。

【００４１】次に、上記薄膜状固定化膜の作成方法につ
いて述べる。図４は、薄膜状固定化膜の作成工程の一例
を示す。まず、図４（ａ）に示すように、両面テープ２
の片面に発光細菌ろ過用の微孔性親水性膜３をあらかじ
め接着し、微孔性親水性膜側から吸引しながら発光細菌
１の培養液を滴下し発光細菌１をろ過する。

【００４２】続いて、図４（ｂ）に示すように、ろ過し
た発光細菌上に発光細菌の流動を防ぐため、高分子ゲル
化剤としてのアルギン酸ナトリウム溶液５を滴下する。
なお、ゲル化材料としては、前述のように、アルギン酸
ナトリウムのほかに多糖類のカラギーナン、寒天など、
またタンパク質のコラーゲン、ゼラチンなど、さらに、
高分子材料の光硬化樹脂やポリアクリルアミドなども使
用できる。

【００４３】続いて、図４（ｃ）に示すように、両面テ
ープ２上に光透過性膜４を張り合わせ、アルギン酸ナト
リウムをゲル化するため、塩化カルシウム溶液に浸漬す
る。

【００４４】上記により作成した発光細菌の固定化膜
を、高感度CCDカメラで撮影した画像を図８に示す。発
光細菌の固定化膜をルミノイメージアナライザー（富士
フィルム製）で撮影したところ、発光細菌による発光が
観察できた。

【００４５】次に、上記薄膜状固定化膜を用いたフロー
セルの構成や毒性物質検知装置の構成について述べる。
図５は、フローセルの構成の一例を示す側断面図であ
る。図５に示すフローセル１２は、フローセルの下部ケ
ース１１に、ガスケット９、固定化膜支持用のガラス板
８、薄膜状固定化膜６を順に積層し、薄膜状固定化膜６
の上部から、Ｏリング７を介して、上部ケース１０を押
圧して締め付け一体化したものとして構成される。試料
および栄養成分は、空気とともに、上部ケース１０の図
示下方１０ａから注入され、上方１０ｂから排出され
る。

【００４６】次に、上記フローセル１２を用いた毒性物
質検知装置の模式的構成の一例を図６に示す。図６にお
いて、試料液はポンプ１４により発光細菌の活性を維持
するための栄養成分とともに下方から上方に向かって通
水される。また、このとき発光細菌が消費する酸素量が
律速になり発光量が低下しないようにするため、エアポ
ンプによりエアが送られる。発光細菌による発光量は、
光電子増倍管などの光検出器１３によって検出し、電圧
値として出力され、コンピュータ１６により記録され
る。また、フローセル１２および光検出器１３は外界か
ら光が入らないように暗箱１５に収める。

【００４７】次に、フローセルの上記図５とは異なる実
施例について、図７により説明する。図７は、図５に対
応する側断面図を示す。図７に示すフローセル１２は、
薄膜状固定化膜６を固定化膜支持用のガラス板８の上部
に配置し、上下２個のＯリング７で挟み込み、また上部
ケース１０および下部ケース１１により挟み込むことに
より、入口１０ａ，出口１０ｂのシールされた試料液の
流路を形成する。このとき、図５と同様に、薄膜状固定
化膜６の微孔性親水性膜側は前記流路側に面し、発光細
菌へ試料液、栄養成分、酸素が浸透し供給される。光透
過性膜側はガラス板側に面する。発光細菌固定化膜から
の発光細菌による発光量は、光電子増倍管などの下部ケ
ース１１に挿入された光検出器１３によって検出され、
電圧値として出力される。

【００４８】また、図７に示すフローセル１２は、前記
上部ケースと微孔性親水性膜との間の流路空間に、試料
液の導入によって前記微孔性親水性膜表面に付着した汚
れを回転または攪拌運動によって除去するための洗浄用
ボール２０が複数個設けられる。連続的に測定を行って
いると、前述のように、発光細菌の活性を維持するため
の栄養成分や試料水中に含まれる有機物を基質とする雑
菌などに由来する汚れが薄膜状固定化膜６の微孔性親水
性膜の表面に付着し、発光細菌に供給されるべき栄養成
分や酸素が雑菌によって消費されるため、発光量が減少
する。

【００４９】この汚れを取り除き長時間安定に有害物質
の検知を可能にするため、フローセル内部に直径約３ｍ
ｍの洗浄用ボール２０を配設した。この洗浄用ボール２
０はフローセル内でエアポンプによるエアリフトと自重
による沈降を繰り返し、洗浄用ボールの回転運動または
撹拌運動により、微孔性親水性膜の表面に付着した汚れ
を掻きだし、１０ｂから排出する機能を有する。

【００５０】次に、前記の毒性物質検知装置を用い、毒
性物質注入時の発光強度の時間経過を測定した結果につ
いて述べる。先に、図９に基づき、図１のビーズ状小塊
をカラムに充填した装置を用いた測定結果の一例につい
て述べた。図１０は、図９に示した発光強度の出力（In
tensity）を、相対値の変化に変換した結果を示す。フ
ェノール暴露直前の出力を１００％として示すが、前述
のように、フェノール暴露１５分間後に、相対出力は、
約４０％低下している。

【００５１】図１１は、薄膜状固定化膜を備えるフロー
セルを用いて発光強度の時間経過を測定した結果の一例
を示す。経過時間のスケールは図１０とは異なるもの
の、図１０と同様に、発光強度の相対出力（％）の変化
で示す。発光細菌の薄膜状固定化膜をセンサ部に取り付
け、発光量が安定化したところで、最終暴露濃度が20mg
/Lになるようにフェノール溶液を30分間注入したとこ
ろ、図１０と同様に、電圧値が低下し発光量の低下が認
められた。また、フェノール溶液を除去すると、出力が
上昇し発光量が復帰し、繰り返し測定が可能であること
が確認された。

【００５２】次に、洗浄用ボールによる発光量維持の効
果に関する検証実験を行なった結果を、図１２に示す。
図１２においては、発光強度の出力は電圧値（Ｖ）で示
し、また、横軸は、経過時間を時間（ｈ）で示す。図１
２において、出力履歴Ａは洗浄用ボール有りのデータ、
Ｂは洗浄用ボールなしのデータを示す。出力履歴のモー
ドに関して、主に、出力履歴Ａをベースに以下に述べ
る。

【００５３】まず、薄膜状固定化膜をフローセルに取り
付け、発光細菌の活性維持に必要な栄養成分を含む溶液
を連続的に通水すると、発光量が上昇する。その理由
は、固定化された発光細菌の活性が上昇し、増殖をはじ
めるためと考えられる。その後、発光量が低下するが、
その理由は、固定化膜中の発光細菌の個数が増えすぎた
ため、栄養分や酸素が不足し、発光細菌の活性の低下や
死滅が起こるためと考えられる。

【００５４】洗浄用ボールを用いたＡの場合、所定経過
時間後は、発光量の変化が少なくなり、出力の準安定化
状態が得られる。これは固定化膜中の発光細菌の増殖と
死滅のバランスが保たれた状態が得られたたためと考え
られる。洗浄用ボールを用いないＢの場合には、発光量
が低下したままで、準安定化状態は得られない。

【００５５】上記のように、洗浄用ボールを用いた場
合、発光量が洗浄用ボールを用いないものに比べて、少
なくとも４倍以上の期間、固定化膜からの発光量を維持
することができ、汚れの影響を受けずに、長期間安定に
有害物質の検知が可能であることが判明した。

【００５６】

【発明の効果】上記のとおり、この発明によれば、発光
細菌を多糖類またはタンパク質などの高分子材料のゲル
中に固定し、試料液を通水した時の発光細菌の発光量の
減少から試料液中の毒性物質を検知することとし、ま
た、上記検知方法を実施するための装置としては、発光
細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光細菌固定手段と、
この発光細菌固定手段に試料液を連続的に導入する試料
液導入手段と、発光細菌の発光量を測定する光検出手段
と、この測定データを処理し発光量に応じた出力を行な
うデータ処理手段とを備えるものとしたので、発光細菌
の使い捨てや測定者のミス等の従来の問題を解消し、水
中の毒性物質を連続的にかつ安定して自動測定すること
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に関わる毒性物質検知装置の一例を示す
模式的構成図

【図２】本発明に関わる薄膜状固定化膜の斜視図

【図３】図２の薄膜状固定化膜の側断面図

【図４】本発明に関わる薄膜状固定化膜の作成工程の一
例を示す図

【図５】本発明に関わるフローセルの構成の一例を示す
側断面図

【図６】図５のフローセルを用いた毒性物質検知装置の
模式的構成の一例を示す図

【図７】図５とは異なるフローセルの構成の一例を示す
側断面図

【図８】薄膜状固定化膜における発光細菌による発光の
一例の撮像図

【図９】図１の装置により毒性物質注入時の発光強度の
時間経過を測定した結果の一例を示す図

【図１０】図９の測定結果の発光強度を相対出力で示す
図

【図１１】図５の装置により毒性物質注入時の発光強度
の時間経過を測定した結果の一例を示す図

【図１２】洗浄用ボールによる発光量維持の効果に関す
る検証結果を示す図

【符号の説明】

１：発光細菌、２：両面テープ、３：微孔性親水性膜、
４：光透過性膜、６：薄膜状固定化膜、６ａ：ビーズ状
小塊、６ｂ：カラム、７：Ｏリング、８：ガラス板、
９：ガスケット、１０：上部ケース、１１：下部ケー
ス、１２：フローセル、２０：洗浄用ボール。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ // Ｃ１２Ｎ 11/04 Ｃ１２Ｎ 11/04 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 CB21 FA11 GC15 HA09 4B029 AA07 BB02 CC05 FA12 4B033 NA12 NB35 NB45 NB48 NB62 NB63 NB68 NB70 NC06 ND05 ND20 NE07 NE08 4B063 QA01 QA18 QQ18 QR75 QR83 QR84 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】発光細菌を多糖類またはタンパク質などの
高分子材料のゲル中に固定し、試料液を通水した時の発
光細菌の発光量の減少から試料液中の毒性物質を検知す
ることを特徴とする毒性物質検知方法。
【請求項２】発光細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光
細菌固定手段と、この発光細菌固定手段に試料液を連続
的に導入する試料液導入手段と、発光細菌の発光量を測
定する光検出手段と、この測定データを処理し発光量に
応じた出力を行なうデータ処理手段とを備えることを特
徴とする毒性物質検知装置。
【請求項３】請求項２に記載の毒性物質検知装置におい
て、前記発光細菌固定手段は、発光細菌を高分子ゲル化
剤でビーズ状小塊に固定し、複数個の前記ビーズ状小塊
をカラム中に充填してなるものとすることを特徴とする
毒性物質検知装置。
【請求項４】請求項２に記載の毒性物質検知装置におい
て、前記発光細菌固定手段は、発光細菌を高分子ゲル化
剤で薄膜状固定化膜として固定し、この薄膜状固定化膜
を、試料液が連続的に導入されるフローセル内に配設し
てなるものとすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項５】請求項４に記載の毒性物質検知装置におい
て、前記フローセル内に配設してなる薄膜状固定化膜
は、微孔性親水性膜と光透過性膜との間に挟持されてな
り、前記試料液は前記微孔性親水性膜側に導入されてな
るものとすることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項６】請求項５に記載の毒性物質検知装置におい
て、前記微孔性親水性膜はそのポアサイズが０．２〜
１．０μｍからなるニトロセルロース製の膜とし、前記
光透過性膜は透明軟質塩化ビニル製の膜とすることを特
徴とする毒性物質検知装置。
【請求項７】請求項２ないし６のいずれかに記載の毒性
物質検知装置において、前記高分子ゲル化剤は、アルギ
ン酸ナトリウム、カラギーナン、寒天などの多糖類，コ
ラーゲン、ゼラチンなどのタンパク質，光硬化樹脂，ポ
リアクリルアミドの内のいずれかとすることを特徴とす
る毒性物質検知装置。
【請求項８】請求項２ないし６のいずれかに記載の毒性
物質検知装置において、前記高分子ゲル化剤は、その分
子量が８万〜１１万からなるアルギン酸ナトリウムとす
ることを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項９】請求項５に記載の毒性物質検知装置におい
て、前記フローセルは、前記微孔性親水性膜と光透過性
膜との間に挟持された薄膜状固定化膜と、この薄膜状固
定化膜をそれぞれシール部材を介して保持する上部ケー
スおよび下部ケースとからなり、前記微孔性親水性膜を
上部ケース側に配設し、かつ上部ケースと前記微孔性親
水性膜との間の空間に前記試料液を導入してなるものと
することを特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項１０】請求項９に記載の毒性物質検知装置にお
いて、前記フローセルにおける上部ケースと微孔性親水
性膜との間の空間に、試料液の導入によって前記微孔性
親水性膜表面に付着した汚れを回転または攪拌運動によ
って除去するための洗浄用ボールを配設してなることを
特徴とする毒性物質検知装置。
【請求項１１】請求項９または１０に記載の毒性物質検
知装置において、前記フローセルにおける下部ケース
に、前記薄膜状固定化膜の光透過性膜と対向して光検出
器を配設してなることを特徴とする毒性物質検知装置。