JP2002541835A

JP2002541835A - バチルスタンパク質生産細胞

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Publication number: JP2002541835A
Application number: JP2000612425A
Authority: JP
Inventors: トロエルスヨエルゲンセン，スティーン; ルンドクリステンセン，クリスティナ; クリステンセン，ティナ
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2002-12-10
Also published as: WO2000063346A1; AU3418600A; CN1347449A; ATE470700T1; CN1203171C; EP1173546A1; DE60044528D1; EP1173546B1

Abstract

(57)【要約】問題のポリペプチドの改良された生産のためのバチルス細胞及び問題のポリペプチドを生産する方法。その生産は、ｙｊｂＨ遺伝子の発現を抑制することにより改良される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、問題のポリペプチドの改良された生産のためのバチルス細胞及び問
題のポリペプチドを生産するための方法に関する。発明の背景バチルス細胞は問題のポリペプチドの工業生産のために広く用いられている。
Ｋｕｎｓｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９０：２４９〜２５６（１９９７
）はグラム陽性細菌バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の完全なゲノム配列を記載する。発明の概要本発明により解決すべき問題は、問題のポリペプチドの増加された収量を生産
することができるバチルス細胞を供することである。

【０００２】その解決法は、本発明者らが、配列番号：１に示すＤＮＡ配列を含む遺伝子を
野生型より少いレベルで発現するバチルス細胞が増加した収量の問題のポリペプ
チドを生産することを同定したことに基づく。

【０００３】その遺伝子はバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）
細胞内で同定され、そのバチルス・サブチリス細胞内のｙｊｂＨと呼ばれる。Ｋ
ｕｎｓｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９０：２４９〜２５６（１９９７）
を参照のこと。

【０００４】更に、本発明者らはＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
細胞内の相同なｙｊｂＨ遺伝子を同定している（配列番号：３）。

【０００５】上述の通り（背景を参照；Ｋｕｎｓｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９０
：２４９〜２５６（１９９７）），ｙｊｂＨ遺伝子は本発明の優先日において、
知られていない。即ち、その遺伝子に関連している知られた機能はない。

【０００６】本明細書で供される教示に基づき、当業者は、例えば本明細書に開示されるｙｊｂＨ遺伝子（配列番号：１及び３）と相同なＤＮＡ配列により、別々のバチル
ス細胞内の相同な遺伝子を同定してそれにより先に概説される解決法に従って問
題のポリペプチドの増加した収率を得ることができるバチルス細胞を直ちに生産
することができる。

【０００７】更に、配列番号：１に示すＤＮＡ配列はいずれの細胞からのいずれの他の既知
のＤＮＡ配列とも極めて低い同一性しか有さない。公共的に知られているデータ
ベース、例えばＥＭＢＬで行った相同性サーチは、配列番号：１に示すＤＮＡ配
列といずれの近い同一性を有する他の配列もないことを示した。

【０００８】同様に、配列番号：２に示すポリペプチド配列を用いる、公共的に利用できる
ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにおける相同性サーチは、いずれの近い同一性
を有する他のポリペプチドもないことを示した。

【０００９】従って、第１の態様において、本発明は、問題のポリペプチドの改良された生
産のためのバチルス細胞であって、（ａ）配列番号：１中の位置１〜８２８に示すＤＮＡ配列；（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列と少くとも７０％の同一性であるＤＮＡ配列；（ｃ）配列番号：２中の位置１〜２７５に示すポリペプチド配列をコードする
ＤＮＡ配列；又は（ｄ）配列番号：２中の位置１〜２７５に示すポリペプチド配列と少くとも７
０％の同一性であるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を野生型より少いレベルで発現するバチルス細胞に関する。

【００１０】更に、本発明者らは、配列番号：１中の位置１〜１４７からのＤＮＡ配列とし
て示される部分配列が高度に保存されていることを同定した。

【００１１】従って、第２の態様において、本発明は、問題のポリペプチドの改良された生
産のためのバチルス細胞であって、（ａ）配列番号：１中の位置１〜１４７に示すＤＮＡ配列；（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列と少くとも７０％の同一性であるＤＮＡ配列；（ｃ）配列番号：２中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列をコードするＤ
ＮＡ配列；又は（ｄ）配列番号：２中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列と少くとも７０
％の同一性であるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を野生型より少い量で発現するバチルス細胞に関する。

【００１２】先の記載から明らかなように、本明細書に記載されるバチルス細胞は問題のポ
リペプチドの生産のために極めて適している。

【００１３】従って、本発明の第３の態様は、問題のポリペプチドを生産するための方法で
あって、次のステップ：（ｉ）第１又は第２の先の態様のバチルスを、問題のポリペプチドの生産を許
容する条件下で培養し；（ii）問題のポリペプチドを単離することを含む方法である。定義：本発明の詳細な実施形態の議論の前に、本発明の主な態様に関係する特定の用
語の定義を供する。

【００１４】用語“遺伝子”は、本明細書において、前記細胞内にポリペプチドに発現され
得る遺伝子（ＤＮＡ配列）をいう。従って、前記遺伝子は、開始コドン（通常、
“ＡＴＧ”，“ＧＴＧ”、又は“ＴＴＧ”）から始まり終止コドン（通常、“Ｔ
ＡＡ”，“ＴＡＧ”、又は“ＴＧＡ”）で終わるオープン読み枠として定義され
よう。

【００１５】前記遺伝子を発現するために、細胞内の遺伝子の発現のために必要な、遺伝子
と関連した当業界で知られたような要素が存在しなければならない。このような
標準要素は、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーション配列を含み
得、そして当業界で知られるような他の要素であり得る。

【００１６】本発明の第１及び第２の態様による用語“バチルス細胞が遺伝子を野生型より
少いレベルで発現する”とは、野生型より少いレベルの遺伝子を発現する細胞を
生ずる野生型のいずれかの変化をいう。これらの変化は、プロモーター及び／又
はオープン読み枠の変化、例えば当業界で知られるようなＤＮＡの欠失、挿入、
フレームシフト又はいずれかの操作であり得る。

【００１７】上述の通り変化したバチルス細胞内の遺伝子の発現レベルは、好ましくは、前
記細胞内の問題のポリペプチドの生産レベルを、親の変化していないバチルス細
胞内の問題のポリペプチドの生産レベルと比較することにより決定される。その
変化していない細胞と比べた時にその変化した細胞がより多くの問題のポリペプ
チドを生産するなら、本発明の第１及び第２の態様によるバチルス細胞は野生型
より少いレベルの遺伝子を発現する。問題のポリペプチドの生産レベルの測定の
ための実際のアッセイは、問題の特定のポリペプチドに依存するであろう。好適
なアッセイを選択することは当業者に一般に知られている。ＤＮＡ配列の同定本発明の第１の態様の“配列番号：１の位置１〜８２８に示すＤＮＡ配列と少
くとも７０％の同一性であるＤＮＡ配列”及び本発明の第２の態様の“配列番号
：１の位置１〜１４７に示すＤＮＡ配列と少くとも７０％の同一性であるＤＮＡ
配列”は、第１の配列の第２のものからの派生を示す２つの配列間の同一性の程
度として決定される。同一性は、好適には、当業界で知られたコンピュータープ
ログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisco
nsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Scien
ce Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）（Needleman, S.B. 及びWunsch, C
.D.,(1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443〜453）に供されるＧＡＰ
を利用して決定することができる。ＤＮＡ配列比較のために次のセッティング：
５．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．３のＧＡＰエクステンショ
ンペナルティーを用いて、先に示す同様のＤＮＡ配列は、本発明の第１の態様の
位置１〜８２８に示されるＤＮＡ配列；又は本発明の第２の態様の配列番号：１
の位置１〜１４７に示すＤＮＡ配列と、好ましくは少くとも７０％、より好まし
くは少くとも７５％、より好ましくは少くとも８０％、より好ましくは少くとも
９０％、より好ましくは少くとも９５％、より好ましくは少くとも９７％の程度
を示す。ポリペプチド配列の同一性本発明の第１の態様の“配列番号：２中の位置１〜２７５に示すポリペプチド
配列と少くとも７０％の同一性であるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列
”及び第２の態様の“配列番号：２中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列と
少くとも７０％の同一性であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列”は、第１
の配列の、第２のものからの派生を示す２つの配列間の同一性の程度として決定
される。相同性は、好適には当業界で知られたコンピュータープログラム、例え
ばＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package,
Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madi
son, Wisconsin, USA 53711）（Needleman, S.B. 及びWunsch, C.D.,(1970), Jo
urnal of Molecular Biology, 48, 443〜453）に供されるＧＡＰを利用して決定
することができる。ポリペプチド配列比較のために以下のセッティング：３．０
のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．１のＧＡＰエクステンションペナ
ルティーでＧＡＰを用いて、本発明の同様のＤＮＡ配列によりコードされるポリ
ペプチドは、第１の態様の配列番号：２の位置１〜２７５に示すポリペプチド配
列、又は本発明の第２の態様の配列番号：２の位置１〜４９に示すポリペプチド
配列と、好ましくは少くとも７０％、より好ましくは少くとも７５％、より好ま
しくは少くとも８０％、より好ましくは少くとも９０％、より好ましくは少くと
も９５％、特に少くとも９７％の同一性の程度を示す。発明の詳細な記載本発明の第１又は第２の態様によるポリペプチドの改良された生産のためのバ
チルス細胞本明細書に記載される遺伝子は、好ましくはバチルス内の２つの公知の遺伝子
マーカー、ｓｒｆＡＡ及びｔｈｙＡの間に配置される。

【００１８】用語“バチルス内の２つの公知のマーカー、ｓｒｆＡＡ及びｔｈｙＡの間に配
置”とは、本明細書において、前記遺伝子がＢ．サブチリス染色体上の約３２°
に位置するｓｒｆＡＡの３′端とＢ．サブチリス染色体上の約１６２．５°に位
置するｔｈｙＡの５′端との間に見い出されることをいう（Ｆ．Ｋｕｎｓｔｅ
ｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ３９０（２０）：２４９〜２５６）。

【００１９】遺伝子マーカーｓｒｆＡＡはバチルス内でサーファクチンシンターゼサブユニ
ットＩをコードする。更なる詳細についてはＦｕｍａＳｅｔａｌ．，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９３；２１（１）：９３〜７を参照のこ
と。

【００２０】遺伝子マーカーｔｈｙＡは、バチルス内でチシジレートシンターゼＡをコード
する。更なる詳細についてはＴａｍ，Ｎ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌＧｅｎ
Ｇｅｎｅｔ．１９９８；２５８（４）：４２７〜３０を参照のこと。

【００２１】ｓｒｆＡＡマーカーは、多数の異なる原種生物細胞内に見い出される相同なマ
ーカーのスーパーファミリーのメンバー、例えばＳｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓ中のｓｕｒＡ（Ｌｉｎｄｕｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１９９８；１８０（２３）：６３８４〜８）及びＢａｃｉｌｌｕｓｂ
ｒｅｖｉｓ中のｇｒｓＡ（Ｋｒａｕｓｅ，Ｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１９８８；１７０（１０）：４６６９〜７４）である。

【００２２】ｔｈｙＡマーカーは多数の異なる原種生物細胞、例えばNeisseria gonorrhoea
e(Carlson, J.H. et al., FEMS Microbiol Lett. 1997; 151(2): 225〜30), Bac
illus amyloliquefaciens(Tam, N.H. et al., Mol Gen Genet. 1998; 258(4): 4
27〜30), Mycobacterium tuberculosis(Cole, S.T. et al., Nature. 1998; 393
(6685): 537〜44)において公知である。

【００２３】本明細書に記載される遺伝子は、より好ましくはバチルス内の２つの公知の遺
伝子マーカーｍｅｃＡ及びｔｅｎＡ（Ｆ．Ｋｕｎｓｔｅｔａｌ．，１９９７
，Ｎａｔｕｒｅ３９０（２０）：２４９〜２５６）の間に位置する。

【００２４】用語“バチルス内の２つの公知の遺伝子マーカー、ｍｅｃＡ及びｔｅｎＡの間
に位置する”とは、本明細書において、前記遺伝子がＢ．サブチリス染色体上の
約１０５°に位置するｍｅｃＡの３′端とＢ．サブチリス染色体上の約１０６°
に位置するｔｅｎＡの５′端との間に見い出されることをいう（Ｆ．Ｋｕｎｓｔ
ｅｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ３９０（２０）：２４９〜２５６）
。

【００２５】遺伝子マーカーｍｅｃＡはバチルスにおいて遺伝子応答能の負のレギュレータ
ーをコードする。更なる詳細についてはＫｏｎｇ．Ｌｅｔａｌ．，Ｍｏｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１９９３Ｊｕｌ：９（２）：３６５〜７３を参照のこと
。

【００２６】遺伝子マーカーｔｅｎＡは、バチルス内で細胞外酵素の生産を制御するポリペ
プチドをコードする。更なる詳細についてＰａｎｇ．ＡＳ．ｅｔａｌ．，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１９９１Ｊａｎ；１７３（１）：４６〜５４を参照のこ
と。

【００２７】これら２つのマーカーは多数の異なる原種生物細胞、例えばBacillus firmus
(Guo, D et al., Biochem Biophys Acta 1998 Jan 5; 1389(1): 34〜42), Staph
ylococcus aureus及びS. epidermis(Ryffel, et al., Gene.1990 Sep 28; 94(1)
:137〜8), Helicobacter Pylori(Tomb, JF. et al., Nature. 1997 Aug 7; 388(
6642): 539〜47) において公知である。

【００２８】上述の引用文献に基づく他のものの中で、問題の特定のバチルス細胞、例えば
Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕ
ｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎ
ｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｕｍｓ、又はＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｎｅｓｉｓ内でこれらの遺伝子マーカー遺伝子を同定することは当業者に知ら
れている。

【００２９】好ましくは、それは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、又はＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ細胞である。

【００３０】本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載されるバチルス細胞であって、
その遺伝子が不活性化されることにより、本明細書に記載される遺伝子を野生型
より少いレベルで発現するバチルス細胞である。

【００３１】遺伝子は、当業者に公知のストラテジーのいずれか、例えば遺伝子内の又はプ
ロモーター内の欠失、挿入又はフレームシフト変異に従って不活性化することが
できる。

【００３２】更なる実施形態は、本明細書に記載されるバチルス細胞であって、問題のポリ
ペプチドが酵素、例えばプロテアーゼ；セルラーゼ；リパーゼ；キシラナーゼ；
ホスホリパーゼ；又は好ましくはアミラーゼであるバチルス細胞に関する。

【００３３】配列番号：３及び配列番号：４に、各々Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｍｉｆ
ｏｒｍｉｓからのｙｊｂＨ遺伝子の部分ＤＮＡ及びポリペプチド配列を示す。配
列番号：１中の位置１〜１４７に示すＤＮＡ配列及び配列番号：３中の位置１〜
１４７に示すＤＮＡ配列は７６％の同一性である。配列番号：２中の位置１〜４
９に示すポリペプチド配列及び配列番号：４中の位置１〜４９に示すポリペプチ
ド配列は７９％の同一性である。

【００３４】従って、これらの配列は本発明の第１及び第２の態様の範囲内にあり、次に本
発明の実施形態は、遺伝子が配列番号：３中の位置１〜１４７に示すＤＮＡ配列
を含むか、又は遺伝子が配列番号：４中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列
をコードするＤＮＡ配列を含むバチルス細胞に関する。

【００３５】なお更なる態様において、本発明は、問題のポリペプチドの改良された生産の
ためのバチルス細胞であって、（ａ）配列番号：３内の位置１〜１４７に示すＤＮＡ配列；（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列と少くとも７０％の同一性であるＤＮＡ配列；（ｃ）配列番号：４中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列をコードするＤ
ＮＡ配列；又は（ｄ）配列番号：４中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列と少くとも７０
％の同一性であるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を野生型より少い量で発現するバチルス細胞に関する。

【００３６】本発明の第１及び第２の態様に関する全ての実施形態、例えば好ましいマーカ
ー間の好ましい相同性同一性及び遺伝子の位置も、上述の態様に関連する好まし
い実施形態である。

【００３７】本発明の第３の態様に従って含む問題のポリペプチドを生産するための方法：この方法における本質的な要旨は本明細書に記載されるバチルス細胞の使用で
ある。

【００３８】問題のポリペプチドの生産を許容する特定の培養ストラテジー条件は、当業者
に知られた多数の培養条プロトコルのいずれであってもよい。

【００３９】同様に、第３の態様のii）の問題の問題のポリペプチドを単離するための特定
のストラテジーは、当業者に知られた多数の単離プロトコルのいずれであっても
よい。

【００４０】更に、本明細書の教示の理解のために当業者に明らかであろうように、本明細
書に供されるいずれの範囲又は装置、値も、見い出される効果を失うことなく広
げ、又は変化させることができる。実施例：材料及び方法特に示さなければ、試験管内ＤＮＡ作業、細菌細胞の形質転換等は、分子生物
学の標準的な方法(Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. "Molecular C
loning. A laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratories, 1982; Aus
ubel, F. M., et al. (eds.)"Current Protocols in Molecular Biology". John
Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecu
lar Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990)を用いて
行った。

【００４１】特に示さなければ、ＤＮＡ操作のための酵素は、供給元の明細に従って用いた
。

【００４２】用いた培地（ＴＹ，ＢＰＸ及びＬＢアガー）は、ＥＰＯ５０６７８０に記載
されている。ＬＢＰＳＧアガーはホスフェート（０．０１ＭＫ₃ ＰＯ₄)、グル
コース（０．４％）、及びデンプン（０．５％）が補給されたＬＢアガーである
。ＷＯ９４／１９４５４に記載されるような染色されたアミロペクチンを含む、
アガープレートを、増加したアミラーゼ生産のためのプレートスクリーニングに
用いた。用いた最小培地は、グルコースをリボースで置きかえたＳｐｉｚｉｚｅ
ｎの最小培地であった（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９５８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４４，１０７２〜１０７８）。 α−アミラーゼアッセイ培養上清中のα−アミラーゼ活性は、Ｐｈａｄｅｂａｓ（登録商標）Ａｍｙｌ
ａｓｅＴｅｓｋＫｉｔ（ＰｈａｒｍａｃｉａＤｉａｇｎｏｓｉｃｓ）を用
いて測定した。そのプロトコルには、Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイキットを供した
。実施例１：不活性化した時にα−アミラーゼの生産を増加させることができるＢａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を供する遺伝子の不活性化：染色体に組み込まれた遺伝子からキメラα−アミラーゼを発現するＢａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ株を、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０トランスポゾンｐＦＣ３３
３（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｍ及びＲｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７２：５０１９）を用いて変異誘発させた。用いた株は、Ａｍｙ
ＬＱＳ５５−４と呼ぶキメラα−アミラーゼを発現するＤＮ１８８５ｘｙＩＲ：
：ｐＣＪ２０３であった。このキメラα−アミラーゼ遺伝子の正確な組成及びこ
の株の構造は公開されている(Christina Lund Jensen (1997) Secretion of chi
meric α-amylases from Bacillus subtilis. Ph. D. Thesis, Technical Unive
rsity of Denmark (DTU)）。トランスポゾンのＢ．サブチリスの染色体への組込
みは、標的遺伝子の不活性化を引きおこし得；このような不活性化がアミラーゼ
生産の増加を導く遺伝子は、０．４％グルコース、０．０１ＭホスフェートpH７
，０．２％キシロース、染色化アミロペクチン、６μｇ／mLクロランフェニルコ
ール及び１２０μｇ／mLスペクチノマイシンを含むＬＢプレート上のハロ形成に
よる、キメラα−アミラーゼＡｍｙＬＱＳ５５−４の生産の増加のためのトラン
スポゾンライブラリーのスクリーニングにより見い出した。実施例２：不活性化された時にＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞内でその細胞をα
−アミラーゼの生産を増加させることができるようにする遺伝子（配列番号：１
）の同定：以下に記載されるように、α−アミラーゼの増加した生産を有するバチルス細
胞を単離し、遺伝子（配列番号：１）の同定を行った。

【００４３】トランスポゾンン挿入により不活性化された遺伝子は、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０が
複製のｐＵＣ起点を含んでいるので、容易に同定することができた。トランスポ
ゾン挿入部に隣接するＤＮＡを救出するために、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０トランスポ
ゾン内を切断しない制限酵素を利用することが必要であった。いくつかの制限酵
素は、この目的のために用いることができたが、この研究においては、Ｅ₁₀ＲＩ制限酵素を用いた。ほとんどの場合、要求されるプラスミドを得ることが可能で
あった。トランスポゾン挿入部の周りの隣接領域の単離に加えて、各々の変異体
においてトランスポゾン挿入物の数を検査するために、サザンブロットのために
染色体ＤＮＡも用いた。Ｅ₁₀ＲＩ制限酵素を用いるトランスポゾン変異体のサザ
ンブロット分析は、変異体のほとんどが１つの挿入物のみを含んでいることを示
した。変異体のうち２つのみが、染色体中に挿入された１超のトランスポゾンを
有した。

【００４４】トランスポゾン変異体の隣接領域を、染色体ＤＮＡをＥ₁₀ＲＩで消化し、連結
して、大腸菌ＳＪ２（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｂ．ｅｔａｌ．１９９０，Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４３１５〜４３２１）のエレクトロコンピテン
ト細胞へのエレクトロポレーションにより形質転換し、スペクチノマイシン耐性
（１２０μｇ／mL）について選択することにより得た。救済されたプラスミドを
制限酵素分析により検査し、トランスポゾン挿入により不活性化された遺伝子を
、プライマーＴＫｐ１（５′−ＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＧＣＣＣ
ＴＣＴＣ−３′）及びＴＫｐ２（５′−ＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣ
ＡＴＧＣＴＴＣ−３′）を用いてその救済されたプラスミドの配列分析によ
り同定した。ＤＮＡ配列を自動配列決定により決定した。標的化される遺伝子を
同定するために、得られた配列をＢ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓの完全なゲノム配列に対
して分析した。（Ｆ．Ｋｕｎｓｔｅｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ３
９０（２０）：２４９〜２５６）。

【００４５】以下の遺伝子へのトランスポゾン挿入を、実施例１に記載されるように得た変
異体：ｙｊｂＨを分析することにより同定した。トランスポゾン挿入は、ｙｊｂＨオープン読み枠内のヌクレオチド７１１の後であった。実施例３：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞中での遺伝子（配列番号：１）の不活
性化がα−アミラーゼの改良された生産を供することの確認極めて豊富な培地中での長期の増殖の間のα−アミラーゼの蓄積染色体遺伝子コピーからのキメラα−アミラーゼＡｍｙＬＱＳ５５−４を発現
する、株ＤＮ１８８５ｘｙＩＲ：：ｐＣＪ２０３ｙｊｂＨトランスポゾン変異体
を振とうフラスコ内で増殖し、その培養上清中に蓄積されたα−アミラーゼの量
を非変異誘発親株から蓄積された量と比較した。０．２％キシロース及び６μｇ
／mLクロランフェニルコールを補給したＢＰＸ培地中での３７℃での７日発酵の
後、その培養上清中にα−アミラーゼ活性をＰｈａｄｅｂａｓアッセイを用いて
測定した。野生型株と比べてｙｊｂＨ変異体についてα−アミラーゼ活性の４０
％増加が観察された。定常増殖相内でのＢ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓからのα−アミラーゼの分泌染色体遺伝子コピーからのキメラα−アミラーゼＡｍｙＬＱＳ５５−４を発現
する、株ＤＮ１８８５ｘｙＩＲ：：ｐＣＪ２０３ｙｊｂＨトランスポゾン変異体
も、６μｇ／mLクロランフェニルコール及び１％キシロースを補給したＴＹ培地
を含む振とうフラスコ内で増殖させて、α−アミラーゼ合成を誘導した。３７℃
での培養の間、サンプルを回収して、培養上清中の細胞密度（ＯＤ₆₆₀ ／mL）及
びα−アミラーゼ活性（ＮＵ／mL）を測定した。非変異誘発化ＤＮ１８８５ｘｙＩＲ：：ｐＣＪ２０３を増殖させ、平行してサンプルをとった。α−アミラーゼ
の比生産性を以下の等式を用いて計算した：比生産性＝（ｄＰ／ｄｔ）×（１／ＯＤ₆₆₀) 比生産性（ＮＵ／ｍｉｎ／ＯＤ₆₆₀) Ｐ：培養上清中の生産／活性ｔ：増殖時間（ｍｉｎ）ＯＤ₆₆₀ ：細胞密度（ＯＤ₆₆₀ ／mL）比活性は所定時間内−この場合１分間にα−アミラーゼを生産する細胞の能力
の基準である。比生産性を計算するために、時間の関数として増殖及び時間の関
数としてのα−アミラーゼ活性を記述する等式を、増殖実験の間に得られたデー
タ点から見積もった。次にこれら２つの等式を用いて比生産性を計算した。

【００４６】 α−アミラーゼの比生産性の増加が、親細胞の比生産性と比べて、ｙｊｂＨ変
異体について観察された。比生産性は、指数増殖期後において親細胞と比べてこ
の変異体について約７０％高かった。

【００４７】指数的に増殖するＢ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞におけるα−アミラーゼの分泌。

【００４８】ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ株ＤＮ１８８５ｘｙＩＲ：：ｐＣＪ１９
９(Christina Lund Jensen (1997) Secretion of chimeric α-amylases from B
acillus subtilis. Ph. D. Thesis, Technical University of Denmark (DTU))
は、染色体に位置する遺伝子コピーからＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓの野生型α−アミラーゼを発現する。ｙｊｂＨトランスポゾン変異を、
ＤＮ１８８５ｘｙＩＲ：：ｐＣＪ２０３のｙｊｂＨ変異体株から調製した染色体
ＤＮＡで受容体のコンピテント細胞を形質転換することによりこの株に移した。

【００４９】ＤＮ１８８５ｘｙＩＲ：：ｐＣＪ１９９株及びｙｊｂＨ変異体誘導体を、α−
アミラーゼ合成の誘導ために６μｇ／mLクロランフェニルコール及び１％キシロ
ースを補給した主な炭素原として１％リボースを含む、最小培地を用いて振とう
フラスコ内で増殖させた。３７℃での培養の間、サンプルを、細胞密度（ＯＤ₆₆ ₀ ／mL）及び培養上清中のα−アミラーゼ活性（ＮＵ／mL）の測定のために回収
した。α−アミラーゼの比生産性を上述の通り計算した。

【００５０】比生産性は、指数増殖の間、親細胞と比べてｙｊｂＨについて約６０％、高か
った。

【００５１】これらのデータから、ｙｊｂＨ変異体は、野生型細胞と比べてα−アミラーゼ
生産に関して改良されていることが明らかである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA05 BA11 BA12 BA13 BA14 CA01 DA07 GA14 GA25 4B050 CC03 DD02 LL02 4B064 AG01 CA02 DA10 4B065 AA15X AA19X AB01 BA03 BA16 CA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】問題のポリペプチドの改良された生産のためのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であって、（ａ）配列番号：１中の位置１〜８２８に示すＤＮＡ配列；（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列と少くとも７０％の同一性であるＤＮＡ配列；（ｃ）配列番号：２中の位置１〜２７５に示すポリペプチド配列をコードする
ＤＮＡ配列；又は（ｄ）配列番号：２中の位置１〜２７５に示すポリペプチド配列と少くとも７
０％の同一性であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を野生型より少いレベルで発現するバチルス細胞。
【請求項２】問題のポリペプチドの改良された生産のためのバチルス細胞
であって、（ａ）配列番号：１中の位置１〜１４７に示すＤＮＡ配列；（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列と少くとも７０％の同一性であるＤＮＡ配列；（ｃ）配列番号：２中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列をコードするＤ
ＮＡ配列；又は（ｄ）配列番号：２中の位置１〜４９に示すポリペプチド配列と少くとも７０
％の同一性であるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を野生型より少い量で発現するバチルス細胞。
【請求項３】前記遺伝子が遺伝子マーカーｍｅｃＡ及びｔｅｎＡの間に位
置する請求項１又は２のいずれかに記載のバチルス細胞。
【請求項４】前記バチルス細胞が、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である請求項１〜３
のいずれかに記載のバチルス細胞。
【請求項５】前記バチルス細胞が、請求項１又は２に記載の遺伝子を、該
遺伝子が不活性化されることにより野生型より少いレベルで発現する請求項１〜
４のいずれかに記載のバチルス細胞。
【請求項６】前記問題のポリペプチドが、酵素、例えばプロテアーゼ；セ
ルラーゼ；リパーゼ；キシラナーゼ；ホスホリパーゼ；又は好ましくはアミラー
ゼである請求項１〜５のいずれかに記載のバチルス細胞。
【請求項７】前記遺伝子が、配列番号：３中の位置１〜１４７に示すＤＮ
Ａ配列を含むか、又は前記遺伝子が、配列番号：４中の位置１〜４９に示すポリ
ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む請求項１〜６のいずれかに記載のバ
チルス細胞。
【請求項８】問題のポリペプチドを生産するための方法であって、（ｉ）先の請求項のいずれかに記載のバチルスを、問題のポリペプチドの生産
を許容する条件下で培養し、（ii）問題のポリペプチドを単離することを含む方法。