JPH04197178A - 枯草菌の遺伝子発現調節蛋白、発現調節変異株、および該発現変異株を用いた物質生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明はバチルス属細菌の遺伝子発現を調節する蛋白と
その遺伝子、および該遺伝子に変異を設けた変異株の造
成法に関する０本発明は、特に／ｓｌチルス属細菌の種
々のプロテアーゼ遺伝子の発現を調節する新規蛋白とそ
の遺伝子、更にその遺伝子を変化させて変異株を造成す
る方法、およびそれに依り得られる変異株に関する０本
発明は、また菌体外プロテアーゼ二重欠損株（中性プロ
テアーゼ欠損、およびアルカリ性プロテアーゼ欠損）の
残存プロテアーゼ活性を更に低下させる方法にも関する
。この方法により得られた低プロテアーゼ変異株は組換
えＤＮＡ技術による物質生産の際の優れた宿主株となる
ものである。従って本発明の産業上の利用分野は微生物
を用いた物質生産に関する領域である。

ご従来の技術〕 近年の組換えＤＮＡ技術の発展により微生物を宿主とし
て異種蛋白を生産させることが原理的に可能となり、な
かにはヒト成長ホルモン、ヒトインシュリンのように既
に実用段階にまで達したものもある。

微生物を宿主とした物質生産では所望の異種蛋白を宿主
微生物の細胞内に生産させる、いわゆる菌体内生産と細
胞外に分泌させる、いわゆる菌体外生産の二つの方法が
ある。菌体内生産の場合は生産される蛋白の精製が繁雑
なことおよび高次構造が正しく保持されない場合が多い
ことが知られている（参考文献■、■）、それに対し菌
体外生産においては細胞外に目的蛋白が蓄積するため精
製がより容易となり、しかも高次構造が正しく保持され
る場合が多い（参考文献■）、このような長所があるに
もかかわらず菌体外生産の場合には目的とする蛋白が培
養液中もしくはべりプラズム画分において宿主菌により
生産されたプロテアーゼにより分解されてしまう場合が
よく知られている。

菌体外生産の場合、大腸菌を宿主菌株として用いると目
的とする異種蓋口が発現分泌した際にペリプラズム画分
にとどまる例が多いため、培地への分泌のためにはバチ
ルス属細菌、特に分泌能および安全性が高く基礎的知見
も豊富なバチルス・ズブチリスが好適と考えられる。し
かしバチルス属細菌は菌体外プロテアーゼの分泌量が多
（、その培養液中には高い蛋白分解活性は高く、これま
でに異種蛋白分泌生産の数々の試みがこの障壁のために
挫折してきた（参考文献■、■、■）、その為プロテア
ーゼ欠損株の造成が試みられ１９８４年カワムラおよび
トイによりバチルス・ズブチリスの菌体外プロテアーゼ
活性のほぼ９０％を占める二種類のプロテアーゼ、菌体
外アルカリ性プロテアーゼ（ズブチリシン）及び菌体外
中性プロテアーゼ、欠損株（二重欠損株）が造成された
（参考文献■）、シかしながら本株をもとに更に胞子形
成初期遺伝子欠損とした改良宿主を用いた場合ですら残
存するマイナーなプロテアーゼの活性により目的とする
異種蛋白が分解しその生産性が極めて低い例が報告され
ている（参考文献■）。

このような従来技術の問題点を解決するためには上述の
プロテアーゼ二重欠損株（菌体外アルカリ性および中性
プロテアーゼ）に於いても未だ残存するマイナーなプロ
テアーゼ群による蛋白分解活性を欠損もしくは低下せし
める必要がある。その為には、残存プロテアーゼの遺伝
子に欠損等の変異を設は当該プロテアーゼ欠損株を造成
すればよいが、この方法の場合その原理の明快さとは裏
腹に残存プロテアーゼの種類が複雑でかつ何種類あるか
不明の現状ではそれらの遺伝子を各々草履し更に変異を
設けるという繁雑な過程を要するため目標の達成は困難
である。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的はこのような各プロテアーゼ遺伝子を個別
に欠損させる方法ではなく、種々のプロテアーゼ遺伝子
の発現を調節している、これまで知られていなかった蛋
白の遺伝子を単離・解析し、その応用として残存プロテ
アーゼの発現レベルを低下せしめた変異株を造成する方
法を提供するものである０本発明の他の目的はかかる変
異株を宿主として用いる姐換えＤＮＡ技術による物質生
産法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕 上記本発明の目的は、バチルス属細菌のプロテアーゼ遺
伝子発現の調節に係る蛋白で第１図に示すアミノ酸配列
を有するもの、第２図に示すＤＮＡ配列である前記プロ
テアーゼ遺伝子発現の調節に係る蛋白の遺伝子、バチル
ス属細菌の染色体上に存在する第２図に示すＤＮＡ配列
である遺伝子に変異を設けて当該遺伝子の構造を変化さ
せることを特徴とする遺伝子発現の調節が変化した変異
株の造成法、該方法により得られた菌株および該菌株を
宿主菌株として用いることを特徴とする組換えＤＮＡ技
術による物質生産法である。

以下本発明の詳細な説明する。

一般に、遺伝子とは、遺伝情報をになっている一つ一つ
の単位を表わす。遺伝情報は、ＤＮＡ上の塩基配列の順
序として蓄えられ、それがｍＲＮＡを経て特定の蛋白を
合成することにより発現される。遺伝子の発現は、複雑
な正と負の制御を行う遺伝子の調節を受けていることが
知られている、枯草菌のプロテアーゼの産生の場合も、
栄養増殖期ではプロテアーゼ遺伝子の発現が抑制されて
おり、胞子形成期になってプロテアーゼ遺伝子の発現が
開始されることが知られていた。このことからも想像さ
れるように、プロテアーゼの遺伝子発現は複雑な正と負
の制御を行う遺伝子の調節を受けていると考えられてい
る。産生を促進する正の調節番行うものとしては、５ａ
ｃＱ（参考文献■）、ｐｒｔＲ（参考文献（１））、５
ｅｎ（参考文献■）および５ａｃＵ（参考文献＠、■）
について報告されている。負の調節により産生を抑制す
るものとしては、５ｉｎ（参考文献０）およびｈｐｒ（
参考文献■）について報告がされている。

一方、枯草菌の場合は、菌体外に多量のプロテアーゼを
産生じ、培養液中に分泌させた有用異種蛋白質を分解さ
せてしまうという点から、枯草菌のプロテアーゼ遺伝子
の発現調節を行うことよりプロテアーゼの産生を制御す
ることは、物質生産上重要なことである。

本発明で言うバチルス属細菌のプロテアーゼ遺伝子発現
の調節を行う蛋白としては、第１図に示すアミノ酸配列
を有し、本発明でいうバチルス属細菌のプロテアーゼ遺
伝子の調節を行う蛋白の遺伝子は、第２図に示すＤＮＡ
配列を有する遺伝子をさす、このＤＮＡ配列は、既に知
られている５ａｃＱ、ｐｒｔＲＳｓｅｎ、５ａｃＵ、ｓ
　ｉｎ、ｈｐｒとは異なるものである。

また、バチルス属細菌のプロテアーゼ遺伝子発現の調節
を行う蛋白としては、新たに、遺伝子組換えの手法によ
って単離されたものであっても、プロテアーゼ欠損株に
該蛋白の遺伝子に変異を設けることによって、親株より
プロテアーゼ活性を低下させられるものであればよい、
実用上の観点から、枯草菌には数種のプロテアーゼの存
在が知られており、複数のプロテアーゼ遺伝子の産生を
抑制する遺伝子の方が好ましい。

枯草菌染色体ＤＮＡ中の遺伝子の発現を調節する遺伝子
に変異を設けるには、該遺伝子を１ｎｖｉｔｒｏで構造
変化を生しさせ、枯草菌染色体Ｄ　Ｎ　Ａの相同性を利
用した通常の方法を用いればよい。また、該遺伝子に変
異を設けることが可能な方法であればいかなる方法でで
もよい。

菌体外中性プロテアーゼまたは、およびアルカリ性中性
プロテアーゼの活性を低下させた枯草菌は、ニトロソグ
アニジン等の変異剤処理、ＵＶ照射、Ｔ−線照射による
変異処理あるいは遺伝子組換えでの手法で該遺伝子をｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏで欠損させ再度枯草菌に導入する方法
およびそれらを組合せた方法で得ることができる。

胞子形成初期遺伝子とは、現在、５ｐｏＯＡ、５ｐｏＯ
Ｂ、５ｐｏＯＦ、５ｐｏＯＧ、ｓｐｏ。

Ｈ，，５ｐｏＯＪ、ｓｐｏ、０ＫＳｓｐｏＯＬの８種類
が知られている。これらの遺伝子の突然変異株は、栄養
増殖は正常に生育するが、胞子形成を開始することがで
きず、胞子形成期になると溶菌してしまう。５ｐｏＱ変
異株のうち、５ｐｏＯＡ変異株が最も多面的で、胞子形
成能のほか、プロテアーゼ産生能、形質転換能抗生物質
産生能、ファージ産生能、などの性質を一挙に失う（参
考文献■）。

本発明者は、菌体外アルカリ性および中性プロテアーゼ
の二重欠損株（ＭＴ−４３０）（ＦＥＲＭＢＰ−１０７
９）の染色体ＤＮＡにこの胞子形成初期遺伝子を導入し
てＭＴ−５００株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２７６０）を得
た。このもののカゼイン−寒天培地上でのハロー形成は
、ＭＴ−４３０に比し低く抑制されていた。しかしなが
ら、カゼイン−寒天培地上に３７℃で１００時間以上放
置しておくと、ＭＴ−５００株でも僅かではあるがハロ
ーの形成が認められた。

次に　このＭＴ−５００株の染色体ＤＮＡ上に存在する
遺伝子発現の調節に係る遺伝子の構造を変化させること
により造成した変異株ＭＴ−６００株（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２７６１）は驚くべきことに上記のＭ２ＳＯ４株に
比べ、残存していたプロテアーゼ活性が導入により抑制
され、カゼイン−寒天培地上に３７°Ｃで１００時間以
上放置してもハローの形成が認められないことが本発明
者より見い出された。

上記の如くして得たＭＴ−６００株を宿主として所望の
異種蛋白を分泌生産するためにはバチルス属細菌の菌体
外プロテアーゼ遺伝子の発現、分泌を司さどる領域、即
ちプロモーター、分泌シグナル領域の直後に所望の遺伝
子あるいはそれを含むＤＮＡ塩基配列を結合して構築し
た＆ｌ換えＤＮＡを該宿主菌へ導入すればよい。

ここで用いることのできる組換えＤＮＡとしては、本発
明者らは既にヒト成長ホルモン分泌用のｐｈＣ，Ｈ３２
４（参考文献＠）を構築している。

なお、ここで用いることのできるプラスミドとしては、
如何なるものも使用可能であるが、例としてｐＰＩＦ２
５　（参考文献＠）　、ｐ　ｈＧＨ７２４（参考文献＠
）等を挙げることが出来る。

上記の発現・分泌の為の組換えＤＮＡをＭＴ６００株に
導入するには通常のプロトプラスト形質転換法を用いれ
ばよい。

かくして得られた形質転換株を用い有用異種蛋白を得る
には、その菌株を通常の方法で液体培養すればよい。

培養液からの有用物質の調製は、通常の方法で培養上清
から回収精製を行えば実施可能である。

特に本発明者の方法を用いれば、真核生物由来の異種蛋
白を枯草菌を宿主として従来達し得なかったレベルで分
泌生産出来るものであり、所望の蛋白の回収、精製がよ
り容易となる。

さらに本発明をより具体的に説明すればつぎのとおりで
ある。

バチルス属細菌におけるプロテアーゼ遺伝子の発現は転
写レベルで制御されており、その制御に関与する蛋白因
子がいくつか知られている９本発明では、マルチコピー
状態でプロテアーゼ活性を抑制する新規なりＮＡ配列を
得て、その構造を解析することにより、該ＤＮＡ配列に
は新規蛋白がコードされている可能性のあるオープンリ
ディングフレーム（○ＲＦ）構造を有することを見出し
た。更にマルチコピー状態で当該ＤＮＡ配列を有する枯
草菌形質転換株は２１　ｋＤａのサイズの蛋白を多量に
菌体内に蓄積することが判明した。この蛋白を精製して
Ｎ末端アミノ酸配列を決定した結果、上述したＤＮＡ配
列によりコードされる０ＲＦＯＮ末と一致した。これよ
り、この２１ｋＤａ蛋白が、本発明のプロテアーゼ産生
を抑制する遺伝子の転写産物であることが判明した。該
蛋白は、プロテアーゼ高生産株である枯草菌５ａｃＵ（
Ｈ）３２株のプロテアーゼ活性、および中性・アルカリ
性菌体外プロテアーゼの二重欠損株であるＭＴ−４３０
株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０７９）の残存プロテアーゼ
活性をも抑制した。これより、該蛋白は複数の種類のプ
ロテアーゼ活性を抑制することが判明した。

次に、該蛋白のプロテアーゼ活性抑制の機構について、
中性プロテアーゼを一例として検討した。中性プロテア
ーゼ遺伝子のｍＲＮＡレベルの解析の結果、この２１ｋ
Ｄａの蛋白が中性プロテアーゼ遺伝子の発現において転
写レベルでの制御に関わるものであることが判明した。

転写レベルとは、ＤＮＡからｍＲＮＡになる過程をさす
０次に、枯草菌株Ｍ７Ｃ３株の染色体のこの２１　ｋＤ
ａの蛋白の遺伝子に挿入欠損を設け、プロテアーゼ産生
に与える影響について検討を加えた。得られたＭＴ８２
３株はプロテアーゼ生産が、野生株であるＭ７Ｃ３株で
は抑制されるような高グルコース培地においても、プロ
テアーゼの産生が認めろれることが判明した。これは、
Ｍ１６Ｂ株からプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制する遺
伝子が破壊された結果、プロテアーゼ遺伝子の発現を抑
制する蛋白が産生されなくなったためになった結果であ
ると考えられる。このことからも、本発明の２１ｋＤ蛋
白がプロテアーゼ遺伝子を抑制する蛋白であることが再
確認された。さらに、既に造成した菌体外アルカリ性お
よび中性両プロテアーゼ二重欠損株・胞子形成欠損株で
あるＭ２ＳＯ４株の染色体上の当該遺伝子に挿入欠損を
設け、プロテアーゼ産生に与える影響について検討した
。このようにして得られたＭ７６００株は、驚くべきこ
とに、Ｍ７８２３株の場合とは異なり、親株であるプロ
テアーゼ活性低下株ＭＴ−５００株に比し、更にプロテ
アーゼ活性が低下することを見出した。

本株を宿主株として天然型ヒト成長ホルモンを分泌した
場合２ＸＬＢ培地（０，２％グルコース含有）の通常回
分培養で３５０ｍｇ／Ｉの成長ホルモンが分泌されるこ
とが判明した。同し培養条件下で　Ｍ２ＳＯ４株を宿主
とした場合の分泌量は、２２０ｍｇ／ｌであった。さら
にＭ２ＳＯ４株を宿主とした場合に認められた成長ホル
モンの低分子化もＭ２ＳＯ４株においては抑制されるこ
とが認められた。

〔実施例〕

以下本発明を具体例で説明するが本発明はこの実施例に
より何ら限定されるものではない。

実施例１（プロテアーゼ遺伝子の発現を抑制する遺伝子
の単離と効果の検定） 枯草菌Ｍａｒｂｕｒｇ株の染色体ＤＮＡを制限酵素５ａ
ｕ３Ａ■で部分消化し、２．０−４．５ｋｂのＤＮＡ断
片をベクタープラスミドｐＵＢ１１０のＢａｍＨ１部位
に挿入結合した組換え体プラスミドを用いて枯草菌２０
７−２５をプロトプラスト法で形質転換した。得られた
カナマインン耐性を示す形質転換株をカゼイン寒天培地
上に移植したところ、３０００株中の１株にハロー形成
が抑制された株が認められた。この株よりプラスミドを
調製し、挿入ＤＮＡ断片のサイズを調べたところ、この
プラスミドは、約２．５　ｋ　ｂの供与ＤＮＡ断片が挿
入されたものであることが判明し、本プラスミドをｐＰ
Ａ１１２１と命名した。ｐＰＡ１１２１の制限酵素地図
は第３図に示す。

ｐＰＡ１１２１の特性を解析するために、このプラスミ
ドをＰＳＬ　１株（オハイオ大学バチルスストックセン
ター保存株、保存番号ｌＡ３１０）に導入した株ＭＴ−
１２１（ＦＥＲＭ−ＢＰ−２２２９）を造成した。ＭＴ
−１２１およびＰＳＬ１株を５ｈｅａｆｆｅｒの胞子形
成培地（参考文献＠）で培養し、培養液上清中のプロテ
アーゼ活性、アミラーゼ活性、アルカリ性ホスファター
ゼ活性の活性レベルを調べた。アミラーゼ活性、アルカ
リ性ホスファターゼ活性の測定は、いずれもＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａ　　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（参考文献２１
）に記載されている方法に従った。その結果、ｐＰＡ１
１２１の導入により対照であるＰＳＬ　１に比較して、
アルカリ性プロテアーゼは２．０％、中性プロテアーゼ
は１４．２％、アミラーゼは４８．１％、アルカリ性ホ
スファターゼは２．０％以下のレベルに低下することが
明らかとなった。また同じ培養の菌体中のプロテアーゼ
活性を調べた結果、ｐＰＡ１１２１は対照と比較して３
０％のレベルまで菌体内プロテアーゼ活性レベルを低下
させしめるものであることが認められた。さらにＭＴ−
１２１株およびＰＳＬ　１株を２％のシュクロースを含
むＬＢ培地で培養しレバンシュクラーゼ活性をＤｅｄｏ
ｎｄｅｒの方法（参考文献２２）を用いて測定した。そ
の結果、ｐＰＡ１１２１の導入によりレバンシュクラー
ゼ活性も対照と比較して３０％のレベル以下に低下させ
ることが判明した。次に、プロテアーゼを多量に分泌す
るプロテアーゼ高生産株である５ａｃＵ（Ｈ）３２株（
オハイオ大学バチルスストックセンター保存株、保存番
号ＩＡ９５）にｐＰＡ１１２１を導入し、その効果をカ
ゼイン寒天培地上の７１０−形成で調べた。その結果、
ｐＰＡ１１２１はプロテアーゼ高生産株のプロテアーゼ
産生能をも抑制することが判明した。さらに、プロテア
ーゼ欠損株の残存プロテアーゼ抑制に対する効果を調べ
るため、ｐＰＡ１１２１を中性、アルカリ性両プロテア
ーゼ活性の二重損株であるＭ７４００株（ＦＥＲＭ−Ｂ
Ｐ−１０７８）に導入しカゼイン寒天培地上のハロー形
成能を検定した。その結果、驚くべきことにｐＰＡ１１
２１は残存するプロテアーゼの産生も抑制できることが
判明した。

実施例２（プロテアーゼ遺伝子の発現抑制に関与する領
域の決定） ｐＰＡ１１２１の挿入ＤＮＡ断片の中から、プロテアー
ゼ遺伝子の発現抑制に関与する領域を決定するため、挿
入ＤＮＡ断片の小型化を行った。

すなわち、第３図に示すｐＰＡＴ１２１ＤＮＡの制限酵
素切断部位を用いて挿入ＤＮＡ断片に欠失を設けたプラ
スミド（ｐＰＡＩ３１４、ｐＰＡ［４２０）を種々構築
しプロテアーゼ産生抑制能を調べた結果、プロテアーゼ
遺伝子の発現抑制に関する領域は挿入ＤＮＡ断片のＰｖ
ｕｌｌより上流の部分が必要であることが判明した。

即ち、制限酵素ＰｓｔｌとＥｃｏＲＩでｐＰＡ１１２１
を切断し生じたＤＮＡ断片のうち、Ａ、Ｂ断片を回収後
、Ｔ４リガーゼで結合させ組換え体プラスミドｐＰＡＩ
４２０を構築した（第４図）、このｐＰＡＩ４２０を用
いてＰＳＬ　１株を形質転換し、ＰＳＬＩ　（ＰＰＡＩ
４２０）を造成した。この形質転換株とＰＳＬＩ　（ｐ
ＰＡ１１２１）およびＰＳＬＩ株を２ｘＬＢ培地で３０
℃、１８時間培養し、カゼイン分解活性を指標にして菌
体外プロテアーゼ活性を測定した結果、ｐＰＡ１４２０
ではもはやプロテアーゼ産生抑制能は観察されなかった
（表１）、これらのことより、ｐｐＡ１１２１の挿入Ｄ
ＮＡ断片のうちＰｖｕ■部位を含む領域がプロテアーゼ
遺伝子の発現抑制に関する領域であることが認められた
。また、ｐＰＡ１１２１の挿入ＤＮＡ断片の中に存在す
るＣｌａｌ部位に相当する枯草菌染色体上の位置にクロ
ラムへニコール耐性遺伝子を挿入した株では、通常野生
株ではプロテアーゼ産生の見られない２％グルコース入
りの胞子形成培地で培養した場合でも、プロテアーゼの
産生が認められた。以上のことから、ｐｖｕＩ［、Ｃ１
ａＥに挾まれる領域にプロテアーゼ遺伝子の発現抑制に
関する遺伝子が存在することが判明した。そこで、ｐＰ
Ａ１１２１の挿入ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を決定した結
果、この領域には１７２アミノ酸をコードするオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在することが判明
した。このＯＲＦはＡＴＣを５゛末端に有し最も長い場
合１７２アミノ酸から成るものであり（第１図）、この
５′末上流には枯草菌１６ｓｒＲＮＡ３’末（３’　Ｕ
ＣＵＵＵＣＣＵＣＣＡＣＵＡＧ５’　）と極めて強い相
補性の高いリボゾーム結合領域と考えられるＤＮＡ配列
（５’　ＡＴＡＡＡＣ；ＧＣ，０３’　）が存在するこ
とから、このＯＲＦは蛋白をコードしている可能性が高
いと考えられた。さらに、マルチコピー状態で当該ＤＮ
Ａ配列を有する枯草菌形質転換株は、２１ｋＤのサイズ
の蛋白質を多量に菌体内に蓄積することが判明した。こ
の蛋白を５Ｏ５−ゲルから切り出す方法により精製し、
Ｎ末端アミノ酸配列を決定した（参考文献２３）結果、
上述したＤＮＡ配列によりコードされる蛍白のＮ末端ア
ミノ酸配列と一致した、この分子サイズの蛋白は、１ア
ミノ酸の分子サイズを０．１ｋＤとして計算すると、約
２００アミノ酸に相当する。これらのことより、上述し
たＯＲＦと２１ｋＤ蛋白が同一のものであることが判明
した。なお、ＰＳＬＩ　（ｐＰＡＩ４２０）の菌体には
この２１ｋＤのサイズを有する蛋白が認められなかった
。

このことから、第１図に示すアミノ酸配列を有する２１
ｋＤ蛋白が、プロテアーゼ遺伝子の発現を抑制する蛋白
質で、該蛋白の遺伝子は、第２図に示すＤＮＡ配列を有
するものであることが判明した。

表　　１ ＰＳＬＩ（ｐＵＢｌｌｏ）のカゼイン分解活性を１００
とした。

実施例３（バチルス属細菌の染色体上に存在する遺伝子
発現の調節化に係る遺伝子の構造を変化させた変異株造
成法） 菌体外中性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ
の二重欠損株でさらに胞子形成遺伝子欠損である枯草菌
ＭＴ−５００株（ＦＲＥＭ−２７６０）は、その菌体外
蛋白分解活性が野生株にくらべて３％以下となっている
ものである。

二〇Ｍ７５００株の遺伝子の発現を調節する遺伝子の構
造を変化させ、遺伝子発現の調節が変化した変異株の造
成は以下のように行った。

まず、この遺伝子の発現調節を行う遺伝子を含むプラス
ミドｐＰＡＩ１２１を有する枯草菌ＭＴ−１２１株（Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−２２２９）からＧｒｙｃｚａｍらの方
法（参考文献２４）に従いＰＰＡ１１２１を調整した。

調製にあたっては、１１のＬＢ培地を用い３０°Ｃで１
２時間培養した菌体を使用した。得られたプラスミドの
一部は制限酵素切断部位を調べ、このプラスミドが、ｐ
ＰＡ■１２１であることを確認した。

次に′ｐＰＡ１１２１を用いて、本発明のプロテアーゼ
遺伝子の発現を抑制する蛋白の遺伝子の中のＣｌａｌ部
位にクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入を設けるこ
とを試みた。

方法は以下の方法によった。ＰＰＡ１１２１をＣａｔで
切断し生したコヘッシプエンドをクレノーフラグメント
を用いてプラントエンドに変換した（ＤＮＡ断片Ｃとし
た。） 次に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミ
ドｐｌＮＴ５３０をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ［［で切断
することにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含
む部分を切り出し、その両端のコヘソシブエンドをプラ
ントエンドに変換したのち、ＤＮＡ断片Ｃと結合させ、
ｐｌＮＴ８２３を構築した。このものはヘクター側にカ
ナマシン耐性遺伝子を有し、本発明のプロテアーゼの発
現を抑制する遺伝子の内部にクロラムフェニコール耐性
遺伝子が挿入されて結合したものである。カナマイシン
耐性遺伝子の内部には、Ｂｇｌ１１部位が存在する。そ
こで、Ｂ、ｇｌＩ［で切断し、カナマイシン耐性遺伝子
を不活性化したｐｌＮＴ８２３ＤＮＡと枯草菌染色体Ｄ
ＮＡとの相同性を利用したコンピテントセル形質転換を
行った。クロラムフェニコール耐性で、しかもカナマイ
シン惑受性となった形質転換株は、枯草菌染色体ＤＮＡ
上の本発明のプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制する遺伝
子の内部にあるＣｌａｌ部位の両側で、ｐｌＮＴ５３０
　ＤＮＡと相同領域の間で組換えを起こした枯草菌であ
る。しかもこの株は、クロラムフエニコール耐性遺伝子
が、枯草菌染色体ＤＮＡ上の本発明のプロテアーゼ遺伝
子の発現を抑制する遺伝子の内部に挿入されたものであ
る。すなわち、ＭＴ−６００株は菌体外アルカリ性およ
び中性プロテアーゼ、胞子形成遺伝子５ｐｏＯＡ欠損株
であるＭＴ−５００株の染色体上の本発明のプロテアー
ゼ遺伝子の発現を抑制する遺伝子に変異を設けた株であ
る。この株をＭＴ−６００と命名した（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２７６１）、菌体外蛋白分解活性を測定した結果、
野生株に比べ１％以下となっていることが判明した。

得られたＭＴ−６００株を用いて、次にヒト成長ホルモ
ンの菌体外生産に就いて検討した。

実施例４　（ＭＴ−６００株を利用したヒト成長ホルモ
ンの分泌生産） ＭＴ−５００株、およびＭＴ−６００株にプロトプラス
トトランスホーメーション法を用いて形質転換すること
により、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）分泌プラスミドｐ
ｈＧＨ４２７を導入したＭＴ−５００（ｐｈＧＨ４２７
）　、ＭＴ−６００（ｐｈＧＨ４２７）を構築した。な
お、ｐｈＧＨ４２７は、ＭＴ−４３０（ｐ　ｈＧＨ４２
７）（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８０）より調製した０両
者を用いてマイクロジャー（実容積；　４００ｍ１）で
培養し、ｈＧ）Ｉに対する抗体を用いた酵素免疫測定法
で、ｈＧＨの分泌蓄積量を測定した。その結果、肘−６
００（ｐｈＧＨ４２７）は、３３０驕ｇ／Ｉ　　のヒト
成長ホルモンが培養液中に分泌蓄積されていることが判
明した。

また、同じ培養で、ＭＴ−５００（ｐｈＧＨ４２７）の
分泌蓄積量は、２２０ｍｇ八であった。さらに、ＭＴ−
５００株を宿主とした場合に認められたヒト成長ホルモ
ンの低分子化もＭＴ−６００株においては、抑制されて
いることが判明した。また、ＭＴ−６００（ｐｈＧＨ４
２７）の培養上清１００マイクロリツターにトリクロロ
酢酸を添加して得た上清をｌＯマイクロリッターのサン
プルバッファーに再けん濁して５Ｏ５−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳道に供与して培養上清中の蛋白を解析し
た結果、該培養上清中に存在する蛋白の３０−４５％が
成長ホルモンであることが判明した。

なお、実施例１．２．３における電気泳動、酵素反応、
ＤＮＡ抽出用に使用した緩衝液等は、いずれも説明書、
多くの参考文献（例えば、参考文献２５）、あるいは手
引き書等に記載されている一般的な組成を用いたもので
ある。

〔発明の効果〕

以上の結果から、枯草菌菌株の染色体上のプロテアーゼ
遺伝子の発現を抑制する遺伝子に挿入欠損を設けたＭＴ
−６００株を宿主として、ヒト成長ホルモンを分泌させ
た場合、ヒト成長ホルモンが分解されることなく、培養
上清中に分泌蓄積することが判明し、本発明の宿主の有
用性が実証された。

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【図面の簡単な説明】

第１図は、プロテアーゼ産生抑制に関与している蛋白の
アミノ酸配列を示した図である。 第２図は、プロテアーゼ産制抑制に関与している蛋白を
コードするＤＮＡ配列を示す図である。 第３図は、ｐＰＡ１１２１の構造を示す図である。黒く
塗りつぶした部分は２プロテアーゼ産生抑制能を有する
挿入ＤＮＡ断片（約２．５ｋｂ）を示す。 第４図は、ｐ　ＰＡ　Ｉ　４２０の構築を示す図である
。 なお、第１図、第２図において、Ａはアデニンを、Ｃは
ノドシンを、Ｔはチミンを、Ｇはグアニンを示す。また
、Ａｌａはアラニンを、Ｖａｔはバリンを、Ｉｃｅはイ
ソロイシンを、Ｍｅｔはメチオニンを、Ｔｒｐはトリプ
トファンを、Ｐｈｅは、フェニルアラニンを、Ｐｒｏは
プロリンを、ｃｒｙはグリシンを、Ｓｅｔはセリンを、
Ｔｈｒはスレオニンを、Ｃｙｓはシスティンを、Ｔｙｒ
はチロシンを、Ａｓｐはアスパラギンを、Ｇｌｕはグル
タミンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、
Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎは、アスパラギン酸を、
Ｇｉｎはグルタミン酸を示す。第４図において、Ｅｃｏ
ＲＩ、ＰｖｕｌＩはそれぞれの制限酵素による処理を、
ｌｉｇａｔｉｏｎはＴ４ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ断片の結合を示す。 特許出願人　　三井東圧化学株式会社 第　　１　　図 Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−ＩＩｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−↑ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇ２ｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍ
ｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈ
ｅ−ｌｉｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−旧ｓ−Ｇｌｕ−　Ｉ　ｌ
ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｒ
ｇ−１１ｅ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ一旧ｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｉ１ｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−
１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａ１−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉ１
ｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
ＡＩａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ 第２図 ５゜＾ＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧ
ＣＡＧＣＣＧＧＧＡＡＧＡＴＴＴＡＣＡＡＡＣＡＣＴＴ
Ｃ＾＾ＣＡＡＴＴＧＡＧＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣ＾
ＡＴＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＣＴＣ
ＡＣＣＴＧＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＴＴＴＡ
ＧＡＡＡＧＣＧＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣ
ＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＴＡＴＧＴＣ
ＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴＴ
ＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＧＴＡＡ
ＡＧＧＴＣＡＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＣ
ＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴ
ＧＡＡＡＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＡＡＧＡ
ＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＧＣＴＴＧＧ
ＣＡＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＴＡ
ＧＡＡＡＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＣＧＴＡＡＴＡＡＡＡ
ＡＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴ
ＴＴＴＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＴＣＡ
ＧＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＧ
ＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＡ
ＴＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＡ　３’

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属細菌のプロテアーゼ遺伝子発現の調節
   に係る蛋白で以下のアミノ酸配列を有するもの。 【遺伝子配列があります】
2. （２）以下に示すＤＮＡ配列であることを特徴とする請
   求項１に記載するバチルス属細菌のプロテアーゼ遺伝子
   の発現調節に係る蛋白の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
3. （３）バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスであるこ
   とを特徴とする請求項１に記載する蛋白。
4. （４）バチルス属細菌の染色体上に存在する請求項２に
   記載する遺伝子に変異を設けて当該遺伝子の構造を変化
   させることを特徴とする遺伝子発現の調節が変化した変
   異株の造成法。
5. （５）バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の変異株の
   造成法。
6. （６）バチルス・ズブチリスが菌体外アルカリ性および
   中性プロテアーゼの二重欠損株でさらに胞子形成初期遺
   伝子欠損であることを特徴とする特許請求項５に記載す
   る変異株の造成法。
7. （７）請求項６記載の方法により菌体外残存プロテアー
   ゼレベルをさらに低下させた変異株ＭＴ６００株。
8. （８）請求項６に記載の方法で得られた変異株を宿主菌
   株として用いることを特徴とした組換えＤＮＡ技術によ
   る物質生法。