JP2002541434A - ハイスループットスクリーニングの試薬としてのアプタマー - Google Patents

ハイスループットスクリーニングの試薬としてのアプタマー

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、非核酸分子、即ち低分子があるターゲットに結合するかどうかを判定するハイスループットスクリーニング法におけるアプタマーの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、非アプタマーリガンド、典型的には低分子の同定を促進するために
アプタマーを使用するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法に向けられ
ている。多種多様なターゲットに結合するアプタマーが同定され、このターゲッ
トへの結合についてアプタマーと競合し得る低分子を同定するために使用し得る
。 発明の背景 ほとんどの製薬企業の薬物探索は経口で活性な化合物の同定に集中している。
検証済みのターゲットに対する好適な化合物ライブラリー（一般には低分子）の
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、新薬候補物質のパイプラインを
創出及び／又は維持することを最終目標とする探索研究グループの主要な活動の
１つを構成する。従って、そのようなライブラリーから活性化合物を効率的に検
出することを可能にするＨＴＳアッセイの開発は、医薬探索のきわめて重要な因
子である。検証済みのターゲットと化合物ライブラリーの数の増加につれて、Ｈ
ＴＳの実験室はスループットを増やしてコストを下げる方法を見出すことにかな
り迫られている。アッセイ開発及びバリデーションは、しばしばこのプロセスに
おけるボトルネックの１つである（Fox et al. (November 1998) Drug Discover
y & Development (Supplement to R&D Magazine) pp. 32-37, そのまま参照によ
り本明細書に組込まれている）。
【０００２】 アプタマー(核酸リガンドとも呼ばれる)は、高いアフィニティー及び特異性で
他の分子(すなわち、ターゲット)に結合し得る、構造的に特有な核酸である。ア
プタマーは、反復ラウンドのアフィニティー選択及び増幅を使用して特定の結合
特性をもった配列を同定するＳＥＬＥＸ法により、大きなランダムライブラリー
から得られる。ＳＥＬＥＸ法については以下に詳しく説明する。現在までのとこ
ろ、有機低分子、炭水化物、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質に結合するアプ
タマーが同定されていて、単鎖核酸配列の大きな集合のなかに多数の結合特異性
が存在していることを示している(Gold et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64
: 763-797)。アプタマーは、成長因子、酵素、受容体及び構造タンパク質を含む
タンパク質ターゲットに、高度に特異的なやり方で、典型的にはナノモル(及び
、時にはピコモル)の範囲の解離定数で結合する。上記の特有な結合特性があれ
ば、ヌクレアーゼに対して安定化され、適切に製剤化されたアプタマーは、治療
薬として実質的な潜在可能性を有する。治療用の使用については、アプタマーは
、抗体のように、経口で利用することが制限されているために、腸管外でデリバ
リーされる。
【０００３】 積年のドグマは、核酸が主に情報の役割を担っているということであった。「
Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（指数的濃縮に
よるリガンドの系統進化法）」（ＳＥＬＥＸ法と呼ばれる）として知られる方法
により、核酸にはタンパク質と異ならない３次元構造の多様性があることが明ら
かになった。ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット分子に対して高度に特異的に結合する
核酸分子の in vitro 進化の方法であり、「指数的濃縮によるリガンドの系統進
化法」と題した米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日
出願、現在放棄された）、「核酸リガンド」と題した米国特許出願第０７／７１
４，１３１号（１９９１年６月１０日出願、現在、米国特許第５，４７５，０９
６号）、及び「核酸リガンドの同定法」と題した米国特許出願第０７／９３１，
４７３号（１９９２年８月１７日出願、現在、米国特許第５，２７０，１６３号
（ＷＯ９１／１９８１３号も参照のこと）に記載されていて、これらはいずれも
参照により特別に本明細書に組込まれている。本明細書でＳＥＬＥＸ特許出願と
総称される、上記出願のそれぞれは、所望のターゲット分子に対する核酸リガン
ドをつくるための根本的に新しい方法を説明する。ＳＥＬＥＸ法はアプタマー又
は核酸リガンドと呼ばれる一群の産物を提供し、それぞれのリガンドは特有の配
列を有し、所望のターゲット化合物又は分子と特異的に結合する特性を有する。
ＳＥＬＥＸで同定されたそれぞれの核酸リガンドは、ある一定のターゲット化合
物又は分子に特定のリガンドである。ＳＥＬＥＸ法は、核酸が多種多様な２次元
及び３次元構造を形成するのに十分な能力と、モノマー又はポリマーのいずれで
あれ、ほとんどすべての化学化合物との（特異的な結合対を形成する）リガンド
として作用する、そのモノマー内部に供される十分な化学的融通性を有する、と
いう独自の洞察に基づいている。任意のサイズ又は組成の分子がターゲットとし
て役立ち得る。
【０００４】 高アフィニティー結合の用途に応用されるＳＥＬＥＸ法は、結合のアフィニテ
ィー及び選択性の所望される判断基準をほとんどすべて達成するために、候補オ
リゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同一の一般選択スキームを使用して結
合、分画及び増幅を段階的に反復することを含む。好ましくはランダム配列のセ
グメントを含んでなる、核酸の混合物から出発するＳＥＬＥＸ法には、結合に好
ましい条件下でこの混合物をターゲットと接触させること、ターゲット分子と特
異的に結合した核酸から非結合の核酸を分画すること、この核酸−ターゲット複
合体を解離させること、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて
、リガンドが濃縮した核酸の混合物を産生することの工程、次いで、ターゲット
分子に対する高度に特異的な高アフィニティー核酸リガンドを産生するために、
この結合、分画、解離及び増幅の工程を所望されるだけ多くのサイクルで繰り返
す工程が含まれる。
【０００５】 ＳＥＬＥＸ法は、化学化合物としての核酸が広範囲の形状、サイズ及び配置を
形成し得ること、及び生物学的システムにある核酸により示されるものよりずっ
と広い範囲の結合及び他の機能が可能であることを示す。ＳＥＬＥＸ又はＳＥＬ
ＥＸ様の方法は、任意のターゲットについて核酸リガンドが同定され得るのに類
似したやり方で、選択された任意の反応を促進し得る核酸を同定するために使用
し得る。理論的には、約１０13〜１０18個ある核酸の候補混合物のなかに、多種
多様な物理的及び化学的な相互作用のそれぞれを促進するのに適した形状を有す
る核酸が少なくとも１個存在する。
【０００６】 基本のＳＥＬＥＸ法は多数の特別な目的を達成するために変更されている。例
えば、「構造に基づいた核酸の選択法」と題した米国特許出願第０７／９６０，
０９３号（１９９２年１０月１４日出願、現在、放棄された；米国特許第５，７
０７，７９６号を参照のこと）は、ゲル電気泳動と組み合わせて、折れ曲がり（
bent）ＤＮＡのような特定の構造特徴をもった核酸分子を選択するためのＳＥＬ
ＥＸ法の使用を説明する。「核酸リガンドの光選択」と題した米国特許出願第０
８／１２３，９３５号（１９９３年９月１７日出願、現在、放棄された；米国特
許第５，７６３，１７７号を参照のこと）は、ターゲット分子に結合する及び／
又は光架橋結合する及び／又はそれを光不活性化することが可能な光反応基を含
有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸをベースとした方法を説明する
。「テオフィリンとカフェインを判別する高アフィニティー核酸リガンド」と題
した米国特許出願第０８／１３４，０２８号（１９９３年１０月７日出願、現在
、放棄された；米国特許第５，５８０，７３７号を参照のこと）は、非ペプチド
であり得る近縁の分子を判別し得る、カウンターＳＥＬＥＸと命名された、高度
に特異的な核酸リガンドを同定する方法を説明する。「指数的濃縮によるリガン
ドの系統進化法：溶液ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許出願第０８／１４３，５６
４号（１９９３年１０月２５日出願、現在、放棄された；米国特許第５，５６７
，５８８号を参照のこと）は、ターゲット分子への高アフィニティーと低アフィ
ニティーを有するオリゴヌクレオチドの高度に効率的な分画を達成する、ＳＥＬ
ＥＸをベースとした方法を説明する。
【０００７】 ＳＥＬＥＸ法には、改善された in vivo 安定性又は改善されたデリバリー特
性のような、改善された特性をリガンドに与える修飾されたヌクレオチドを含有
する高アフィニティー核酸の同定が含まれる。そのような修飾の例には、リボー
ス及び／又はリン酸及び／又は塩基の位置での化学的な置換が含まれる。修飾さ
れたヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸ法で同定された核酸リガンドが、「修
飾されたヌクレオチドを含有する高アフィニティー核酸リガンド」と題した米国
特許出願第０８／１１７，９９１号（１９９３年９月８日出願、現在、放棄され
た；米国特許第５，６６０，９８５号を参照のこと）に記載されている。これは
、ピリミジンの５’及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有
するオリゴヌクレオチドについて説明する。米国特許出願第０８／１３４，０２
８号、同上は、２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、
及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ又はそれ以上の
ヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドについて説明する。「求核
置換による既知及び新規２’修飾ヌクレオシドの新しい製造法」と題した米国特
許出願第０８／２６４，０２９号（１９９４年６月２２日出願）は、様々な２’
−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドについて説明する。
【０００８】 ＳＥＬＥＸ法には、「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：キメラのＳＥ
ＬＥＸ」と題した米国特許出願第０８／２８４，０６３号（１９９４年８月２日
出願、現在、米国特許第５，６３７，４５９号）及び「指数的濃縮によるリガン
ドの系統進化法：混合したＳＥＬＥＸ」と題した米国特許出願第０８／２３４，
９９７号（１９９４年４月２８日出願、現在、米国特許第５，６８３，８６７号
）にそれぞれ記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択され
たオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチドの機能ユニットと結合させるこ
とが含まれる。上記の応用により、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状や他の特
性、並びに効率的な増幅や複製の特性を、他の分子の所望される特性と組み合わ
せることが可能になる。
【０００９】 ＳＥＬＥＸ法には、「核酸リガンド複合体」と題した米国特許出願第０８／４
３４，４６５号（１９９５年５月４日出願）に記載されるように、選択された核
酸リガンドを、診断又は治療の複合体において、親油性化合物又は非免疫原性の
高分子量化合物と結合することが含まれる。基本的なＳＥＬＥＸ法の様々な変更
について説明する上記特許出願は、いずれもそのまま参照により本明細書に特別
に組込まれている。 発明の要約 本発明は、非アプタマーリガンドの同定を促進するためのアプタマーの使用に
ついて説明する。より特定すると、本発明には、アプタマーをそのターゲットか
ら置換し得る化合物を迅速に同定する競合結合アッセイにおけるアプタマーの使
用が含まれる。競合化合物のアフィニティーは、そのターゲットに対するアプタ
マーの既知のアフィニティーと競合プロフィールから算出し得る。本方法が高度
に融通性があり、多種多様なＨＴＳプラットフォームに適合可能であるのは、化
学合成された分子としてのアプタマーがその結合アフィニティーを減ずることな
く様々な方法で標識化され得るからである。
【００１０】 本発明の方法は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及び小麦胚芽凝集素という
２種のタンパク質ターゲットで明示される。それぞれのタンパク質について、わ
ずかに偏った分子のセットを、コグネイトアプタマー（ＰＤＧＦではナフタレン
スルホン酸誘導体、ＷＧＡではオリゴ糖）を置換する能力についてスクリーニン
グする。ＰＤＧＦとＷＧＡの両方で、最良のリガンドが容易に同定され得る。さ
らに、競合剤の結合アフィニティーは in vitro アッセイにおけるその活性と相
関する（以下参照、及び１９９８年７月１４日発行の米国特許第５，７８０，２
２２号）。 発明の詳細な説明 本発明は、細胞ベースのアッセイ、受容体結合及び他のタンパク質−タンパク
質相互作用アッセイと一緒にか又はそれに代わって使用し得る、ハイスループッ
トスクリーニング（ＨＴＳ）の新しいクラスの試薬としてのアプタマーの使用を
説明する。一般に、タンパク質ターゲットに対してアプタマーを同定するには、
ナノモルの範囲でのアフィニティーを達成するのに、５〜１５ラウンドのＳＥＬ
ＥＸ法が必要とされる。マニュアル・プロトコールを使用するＳＥＬＥＸ法の１
ラウンドは約１日かかるが、「核酸リガンドを自動産生するための方法及び装置
」と題した米国特許出願第０９／２３２，９４６号（１９９９年１月１９日出願
：これはそのまま参照により本明細書に組込まれている）に記載されるような自
動化プロトコールを使用すると、これよりずっと短い。このように、アプタマー
同定は迅速である。
【００１１】 本明細書に記載の競合アッセイに使用するのに、アプタマー群のそのターゲッ
トに対するアフィニティーがあまり高い必要はないことに着目することは重要で
ある。なぜなら、典型的には、第一世代のリード化合物群のアフィニティーは、
アプタマーのそれよりずっと低い（例えば、マイクロモルの範囲）からである。
例えば、本発明のためには、マイクロモルのアフィニティーでＰＤＧＦに結合す
る競合剤の同定を促進するために、かつて同定されたＰＤＧＦアプタマー（「高
アフィニティーのＰＧＤＦ核酸リガンド」と題した米国特許第５，７２３，５９
４号、１９９８年３月３日発行、これはそのまま本明細書に組込まれている）の
アフィニティーを約１０倍減少させることが有用であった。アフィニティー要求
性がより低いために、競合アッセイに適したアプタマーの同定がさらに加速され
得る。より一般的に言えば、アプタマーのアフィニティーと結合条件（例えば、
結合分子種の濃度）は、ある一定の濃度範囲におけるリガンドの検出を促進する
ように調整し得る。アプタマーは、オーファン受容体のような、既知の結合パー
トナーを有さないタンパク質ターゲットに対するリガンドの同定に特に有用であ
り得る。
【００１２】 アプタマー（又は他のリガンド）を用いた競合結合スクリーンの使用は、ター
ゲットに結合し得る化合物がライブラリーからすべて同定されることを保証しな
い。なぜなら、このアッセイでは競合置換が必要とされるからである。活性化合
物を逸失する機会を減らすために、スクリーンに対して１種以上のアプタマーを
使用し得る。しかしながら、この文脈では、ほとんどの場合、タンパク質ターゲ
ットに対して同定されたアプタマーが、異なる配列ファミリーに属するか又は異
なる組成（ＲＮＡ、ＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ）を有するときでも、概して互
いに競合することに留意することが重要である。それでも、サイズ（典型的には
６〜１３ｋＤａ）が与えられれば、ほとんどのアプタマーがそのタンパク質ター
ゲットの有意な表面分画を包含する可能性があるので、競合アッセイにおける偽
陰性の問題は減るはずである。さらに、ＷＧＡアプタマー（「レクチンに対する
高アフィニティーの核酸リガンド」と題した米国特許第５，７８０，２２８号、
１９９８年７月１４日発行、これはそのまま本明細書に組込まれている）につい
て明示されるように、タンパク質表面の特定部位に結合するアプタマーは、その
部位に結合するリガンドが利用可能であれば、選択することが可能である。
【００１３】 タンパク質ターゲットに対するアプタマーの高アフィニティー結合は、典型的
には、２０〜４０ヌクレオチドの配列にコード化されている。高アフィニティー
結合の効率的なコード化により、完全に化学的に、例えば固相ホスホロアミダイ
ト法により、アプタマーを合成することが可能になる。バッチごとの変動性を制
御し、試薬コストを下げることを可能にするという利点とは別に、化学合成は、
その鋭敏な結合特性を壊さないやり方で、様々な非核酸の機能をアプタマーへ取
込むことを促進する。従って、本明細書の実施例では放射標識アプタマーが使用
されるが、アプタマーは多種多様な他の方法（例、光吸収、蛍光、化学発光部分
、ビオチン、等）で標識化することが可能であり、ある種のＨＴＳ応用でより適
している場合がある。 定義 本発明の側面について述べるのに本明細書では様々な用語が使用される。本発
明のこの部分に関する記述内容の明確化を促進するために、以下の定義を提供す
る。
【００１４】 本明細書で使用される「アプタマー」又は「核酸リガンド」は、ターゲットに
対して所望される作用を有する、天然に存在しない核酸である。所望される作用
には、限定しないが、ターゲットに結合すること、ターゲットを触媒的に変化さ
せること、ターゲット又はターゲットの機能活性を修飾／変化させるやり方でタ
ーゲットと反応すること、自殺阻害剤のようにターゲットへ共有結合すること、
ターゲットと他の分子との反応を促進することが含まれる。好ましい態様では、
この作用はターゲット分子に特異的な結合アフィニティーであり、そのようなタ
ーゲット分子は、ワトソン／クリック塩基対合や三重らせん結合に主に依拠する
機序を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の３次元化学構造体
であり、ここで核酸リガンドはターゲット分子により結合される既知の生理学的
機能を有する核酸ではない。核酸リガンドには、以下を含んでなる方法により核
酸の候補混合物から同定される核酸が含まれる（前記核酸リガンドはある一定の
ターゲットのリガンドである）：ａ）この候補混合物をターゲットと接触させる
こと（ここで、候補混合物に比べてターゲットに対して強まったアフィニティー
を有する核酸は候補混合物の残りから分画され得る）；ｂ）強まったアフィニテ
ィーを有する核酸を候補混合物の残りから分画すること；及びｃ）強まったアフ
ィニティーの核酸を増幅し、リガンド濃縮された核酸の混合物を産生すること。
【００１５】 本明細書で使用されるように、「非アプタマーリガンド」又は「非核酸分子」
は、アプタマーではない任意の分子である。一般に、この用語には、限定しない
が、低分子が含まれる。
【００１６】 本明細書で使用されるように、「候補混合物」は、所望のアプタマーが選択さ
れる、様々な配列をもった核酸の混合物である。候補混合物の供給源は、天然に
存在する核酸又はそのフラグメント、化学合成した核酸、酵素的に合成した核酸
、又は上記技術の組み合わせにより創出した核酸に由来するものであり得る。好
ましい態様では、それぞれの核酸は、ランダム領域の周囲に、増幅法を促進する
固定の配列を有する。
【００１７】 本明細書で使用されるように、「核酸」は、単鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ
、及びその化学修飾物を意味する。修飾には、限定しないが、追加の電荷、分極
率、水素結合、静電相互作用、及び流動性を核酸リガンドの塩基又は核酸リガン
ド全体に取込む他の化学基を供給するものが含まれる。そのような修飾には、限
定しないが、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外
アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウ
ラシルの置換；骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジ
ンのような、稀な塩基対合の組み合わせ、等が含まれる。修飾には、キャッピン
グのような３’及び５’修飾も含まれる。
【００１８】 「ＳＥＬＥＸ」法には、所望されるやり方、例えばタンパク質への結合でター
ゲットと相互作用する核酸リガンドの選択に、この選択された核酸の増幅を組み
合わせることが含まれる。この選択／増幅工程のサイクルを選択的に繰り返すこ
とにより、ごく多数の核酸を含有するプールから、ターゲットと最も強く相互作
用する１つ又は少数の核酸を選択することが可能になる。選択／増幅法のサイク
ルは選択される目標が達成されるまで続けられる。ＳＥＬＥＸ法についてはＳＥ
ＬＥＸ特許出願に説明されている。
【００１９】 「ターゲット」は、それに対するリガンドが所望される、関心対象のあらゆる
化合物又は分子を意味する。ターゲットは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、
ポリサッカリド、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基
質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子
等であり得て、制限がない。
【００２０】 本明細書で使用されるように、「個体支持体」は、共有結合か非共有結合を介
して分子が結合され得る任意の表面として定義される。これには、限定しないが
、膜、プラスチック、磁気ビーズ、帯電紙、ナイロン、ラングミュア・ブロジェ
ット膜、機能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、ガ
リウム砒素、金及び銀が含まれる。アミノ、カルボキシル、チオール又はヒドロ
キシルのような官能基をその表面に有することが可能な、当技術分野で知られて
いる他の材料も考慮される。これには、限定しないが、球状の表面又は溝の入っ
た表面を含む、任意のトポロジーを有する表面が含まれる。
【００２１】 「分画」には、ターゲット分子に結合したアプタマーをターゲット分子に結合
していない核酸から分離し得る方法が含まれる。より広義に述べれば、分画は、
候補混合物中のすべての核酸を、ターゲット分子への相対アフィニティーに基づ
いて、少なくとも２つのプールへ分離することを考慮する。分画は、当技術分野
で知られている様々な方法により達成され得る。核酸−タンパク質の対合物はニ
トロセルロース膜に結合し得るが、対合していない核酸は結合しない。核酸−タ
ーゲットの複合体を特異的に保持するカラムが分画に使用し得る。例えば、カラ
ムに結合したターゲット分子と会合し得るオリゴヌクレオチドにより、最も高い
アフィニティーの核酸リガンドを分離して単離するためのカラムクロマトグラフ
ィーの使用が可能になる。ターゲット分子がコンジュゲートされるビーズも混合
物中の核酸リガンドを分画するのに使用し得る。表面プラスモン共鳴技術は、セ
ンサーチップ上にターゲットを固定化し、このチップ上に混合物を流すことによ
って混合物中の核酸を分画するのに使用し得る。ここではターゲットへアフィニ
ティーを有する核酸をターゲットに結合させ、残りの核酸を洗い落とすことがで
きる。ゲル濾過法だけでなく、液体−液体分画法、並びに密度勾配遠心分離法も
利用し得る。
【００２２】 その最も基本的な形態では、ＳＥＬＥＸ法は以下の工程の系列により規定され
得る。 １）様々な配列の核酸の候補混合物を調製する。一般に、この混合物には、固
定された配列の領域（即ち、候補混合物のメンバーのそれぞれが同じ位置に同一
の配列を含有する）とランダム配列の領域が含まれる。固定配列の領域は、ａ）
以下に記載の増幅工程を促進する；ｂ）ターゲットに結合することが知られてい
る配列を模倣する；又はｃ）一定の構造配置をした核酸の候補混合物における濃
度を高めることのいずれかのために選択される。ランダム配列は、全体に無作為
化され得る（即ち、ある位置にある塩基を見出す確率は１／４である）か、又は
部分的にのみ無作為化され得る（即ち、ある位置にある塩基を見出す確率を０〜
１００％の任意のレベルで選択し得る）。
【００２３】 ２）この候補混合物を、ターゲットと候補混合物のメンバーとが結合するのに
好ましい条件の下で、選択されたターゲットと接触させる。上記の状況下で、タ
ーゲットと候補混合物の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲット
への最も強いアフィニティーを有する核酸との核酸−ターゲット対が形成される
と考えられる。
【００２４】 ３）ターゲットへの最も高いアフィニティーを有する核酸を、ターゲットへよ
り低いアフィニティーを有する核酸から分画する。最高アフィニティーの核酸に
相当する配列はごくわずかな数しか（１分子の核酸しかない可能性もある）候補
混合物に存在しないので、候補混合物にある適量の核酸が分画の間に保持される
ように、分画の判定基準を設定することが概して望ましい。
【００２５】 ４）次いで、ターゲットに対する相対的により高いアフィニティーを有するも
のとして分画の間に選択された核酸を増幅し、ターゲットへの相対的に高いアフ
ィニティーを有する核酸が濃縮された新たな候補混合物を創出する。
【００２６】 ５）上記の分画及び濃縮工程を繰り返すことによって、新たに形成される候補
混合物に含まれる固有の配列はどんどん少なくなり、ターゲットに対する核酸の
平均アフィニティー強度は概して増加する。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は、元の
候補混合物由来の核酸を代表する、ターゲット分子に対して最高のアフィニティ
ーを有する独特な核酸を１つ又は少数含有する候補混合物を産生する。
【００２７】 ＳＥＬＥＸ特許出願は、この方法について説明し、より詳しく述べている。そ
れには、この方法に使用し得るターゲット；開始の候補混合物の調製法；候補混
合物にある核酸を分画する方法；及び分画された核酸を増幅して濃縮された候補
混合物を産生する方法が含まれる。ＳＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核
酸結合タンパク質であるか又はそうでないタンパク質ターゲットを含め、多数の
ターゲット種に対して得られるリガンド溶液についても説明する。
【００２８】 本発明の好ましい態様では、自動化フォーマットにおいて多数のウェルの検査
を可能にする既存のＨＴＳプラットフォームと組み合わせて、アプタマーが使用
される。本発明の使用には、いくつかの、及びすべてのＨＴＳプラットフォーム
が考慮される。例えば、あるターゲットを個体支持体上に固定化し、標識された
アプタマーとインキュベートすることができる。本発明には任意の標識法が考慮
されるが、それには、限定しないが、放射活性、光吸収、蛍光、化学発光又は他
の検出可能な部分が含まれる。次いで、非アプタマー候補分子のライブラリーを
、ターゲットからアプタマーを置換するその能力につき、置換された標識アプタ
マーの量か又は個体支持体上に残っている標識かアプタマーの量のいずれかを測
定することによって、試験し得る。他のやり方では、アプタマーを個体支持体上
に固定化し、標識されたターゲットとインキュベートすることができる。次いで
、非アプタマー候補分子のライブラリーを、標識化ターゲットを置換するその能
力につき、上記のように試験し得る。置換されたアプタマーを検出する既知の方
法が本発明に考慮されるが、それには、限定しないが、直接検出、又は「核酸リ
ガンド−リガンドのビーコン相互作用を介したターゲットの均質検出」と題した
米国特許出願第０９／１５７，２０６号（１９９８年９月１８日出願、これはそ
のまま参照により本明細書に組込まれている）に記載のような増幅検出が含まれ
る。
【００２９】 ある種の態様では、アプタマーと低分子が同時に競合する溶液でこの方法をな
し得る。
【００３０】
【実施例】
以下に供される実施例は本発明の具体的な態様である。それらは本発明の範囲
を限定するものとして受け取られてはならない。 実施例１ 材料と方法 材料 ヒト組換え血小板由来増殖因子、ＢＢアイソフォーム（ＰＤＧＦ ＢＢ）は、
担体フリーの凍結乾燥粉末品として、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ＭＮ）
から購入した。小麦胚芽（Triticum vulgare）凝集素（ＷＧＡ）はＥＹラボラト
リーズ（サンマテオ、ＣＡ）から購入した。
【００３１】 オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ、Ｍｏｄｅｌ ３９４
のオリゴヌクレオチド合成機を使用して、最適化プロトコールにより合成した。
ＰＤＧＦアプタマーの２０ｔａは、センスの合成３３マーＤＮＡオリゴ：５’−
ＣＧＧＧＣＧＣＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＧＴＴＡＣＴＴＴＴＡＧＴＣＣＣＧ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１）であり、アプタマーの２０ｔｂは、センスの合成２７マー
ＤＮＡオリゴ：５’−ＧＧＧＣＣＧＴＴＴＣＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＴＡＧＴＣＣ
Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であり、アプタマーＰＤ３１６は、いくつかの修
飾された塩基（２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチル、それぞれ、イタリック文字及び
太字）と、血清での安定性を増加させる、いくつかの塩基に換わる１８原子のＰ
ＥＧスペーサーを含有する合成オリゴであり、
【００３２】
【化１】
【００３３】 の配列である。ＷＧＡアプタマー１１．２０は２’−アミノピリミジン塩基を有
する９８マーのＲＮＡ転写物であり、以下の配列である：５’−ＧＧＧＡＡＡＡ
ＧＣＧＡＡＵＣＡＵＡＣＡＣＡＡＧＡＵＵＧＧＵＣＧＵＡＣＵＧＧＡＣＡＧＡＧ
ＣＣＧＵＧＧＵＡＧＡＧＧＧＡＵＵＧＧＧＡＣＡＡＡＧＵＧＵＣＡＧＣＵＣＣＧ
ＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。ＰＤＧＦ
アプタマーについては、「高アフィニティーＰＤＧＦ核酸リガンド」と題した米
国特許第５，７２３，５９４号（１９９８年３月３日発行）にかつて記載された
。ＷＧＡアプタマーについては、「レクチンに対する高アフィニティー核酸リガ
ンド」と題した米国特許第５，７８０，２２８号（１９９８年７月１４日発行）
にかつて記載された。
【００３４】 ＰＤＧＦアプタマー競合アッセイに使用されるオリゴアニオンは、以下のもの
であった：エバンスブルー、トリパンブルー、アマランス、スルホナゾＩＩＩ、
Ｎｅｗ Ｃｏｃｃｉｎｅ、ヘキサ硫酸ミオイノシトール、ＳＰＡＤＮＳ（２−（
４−スルホフェニルアゾ）−１，８−ジヒドロキシ−３，６−ナフタレンジスル
ホン酸）、カルシオン及びアゾカルミンＢ（アルドリッチ、ミルウォーキー、Ｗ
Ｉ）；ＮＴＳＡ（１，３，６−トリスルホン酸ナフタレン、Ｆｌｕｋａより）、
スラミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ラジョラ、ＣＡ）及びオクタ硫酸スクロース
（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（トロント、カナダ
）。
【００３５】 ＷＧＡアプタマー競合アッセイに使用されるオリゴ糖は、以下のものであった
：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）（シグマ、セントルイス、
ＭＯ）；Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ）2、Ｎ，Ｎ’，Ｎ
”−トリアセチルキトトリオース（ＧｌｃＮＡｃ）3、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’
−テトラアセチルテトラオース（ＧｌｃＮＡｃ）4、ガラクトース１−β−３（
フコース−１−α−４）グルコサミン（ルイスＡ三糖）、ガラクトース１−β−
４（フコース１−α−３）グルコサミン（ルイスＸ三糖）、フコース１−α−２
ガラクトース１−β−４（フコース１−α−３）グルコサミン（ルイスＹ四糖）
、シアリル・ルイスＡ、シアリル・ルイスＸ、フコース１−α−４グルコサミン
、フコース１−α−３グルコサミン、Ｎ−アセチル−ラクトサミン（ＬａｃＮＡ
ｃ）、３’α−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（α−シアリル−ＬａｃＮ
Ａｃ）、３’β−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（β−シアリル−Ｌａｃ
ＮＡｃ）（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、トロント
、カナダ）。 方法 低分子／アプタマー競合アッセイ ＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質への結合についてＰＤＧＦアプタマー２０ｔｂと競
合する能力について、低分子オリゴアニオンをスクリーニングした。低分子（又
はコールド２０ｔｂ）競合剤を様々な濃度で室温において５’−32Ｐ末端標識２
０ｔｂリガンドと混合した。次いで、ＰＤＧＦをこの混合液へ加え、室温で４５
分間、次いで３７℃で１５分、平衡化させた。競合混合液（容量９０μＬ）はい
ずれも32Ｐ末端標識２０ｔｂ（１．１６ｎＭ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ（１ｎＭ）を有
し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０６７％ ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）、ｐＨ７．４（ＨＢＳＭＣ）の濃度であった。前洗浄した０．４５μＭのニ
トロセルロース膜フィルター（ミリポア；ベッドフォード，ＭＡ）を通す濾過に
より、ＰＤＧＦに結合したアプタマーをフリーのアプタマーから分離した。フィ
ルターを、室温で５ｍＬのＨＢＳＭＣで洗浄した。このフィルターをシンチラン
ト付きの試験管に入れ、放射活性を計数して、各競合剤の濃度で結合している32 Ｐ末端標識２０ｔｂリガンドの分画を定量した。
【００３６】 小麦胚芽凝集素タンパク質への結合についてＷＧＡアプタマー１１．２０と競
合する能力について、低分子オリゴ糖をスクリーニングした。低分子（又はコー
ルド１１．２０）競合剤を様々な濃度で室温において５’−32Ｐ末端標識１１．
２０リガンドと混合した。次いで、ＷＧＡをこの混合液へ加え、室温で６０分間
、平衡化させた。競合混合液（容量９０μＬ）はいずれも32Ｐ末端標識１１．２
０（１０ｎＭ）、ＷＧＡ（１０ｎＭ）を有し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１３７ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、
０．０６７％ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ｐＨ７．４（ＨＢＳＭＣ）の濃
度であった。前洗浄した０．４５μＭのニトロセルロース膜フィルターを通す濾
過により、ＷＧＡに結合したアプタマーをフリーのアプタマーから分離した。フ
ィルターを、室温で５ｍＬのＨＢＳＭＣで洗浄した。このフィルターをシンチラ
ント付きの試験管に入れ、放射活性を計数して、各競合剤濃度で結合している32 Ｐ末端標識１１．２０の分画を定量した。 競合データの分析 競合実験の結果を式（１）を用いて分析し、加えた競合剤の全濃度［ＣT］の
関数として、フリータンパク質の濃度［ＰF］を決定した： ［ＰF］＝［ＰT］／（１＋ＫdR［ＲT］／（１＋ＫdR［ＰF］）＋ＫdC［ＣT］
／（１＋ＫdC［ＰF］）） （１） ここで、ＫdRは分子種Ｒのタンパク質に対する結合定数（１：１の化学量比と
仮定する）であり、ＫdCは、競合剤である分子種Ｃのタンパク質に対する結合定
数（１：１の化学量比と仮定する）である。一定の［ＰF］に対して式（１）を
１ｘ１０-5の精度で解いた。上記［ＰF］の数値を使用して、［ＣT］の関数とし
てのタンパク質−リガンド複合体の濃度［ＰＲ］を式（２）を用いて決定した： ［ＰＲ］＝ＫdR［ＲT］［ＰF］（１＋ＫdC［ＰF］） （２） 実験データは％［ＰＲ］として表されるので、［ＰＲ］の算出濃度を、競合剤
不在下での［ＰＲ］である、［ＰＲ0］により正規化した。［ＰＲ0］は、［ＣT
］＝０である式（１）を解くことによって得た。最大（Ｍ）及び最少（Ｂ）％［
ＰＲ］は、式（３）に示すように、分析の間自由に変動させた： ％［ＰＲ］＝［ＰＲ］／［ＰＲ0］（Ｍ−Ｂ）＋Ｂ （３） 非線形最小２乗適合法を、Bates and Watts (Bates and Watts (1988), Non-L
inear Regression Analysis and its Applications, D. M. Bates and D. G. Wa
tts editors, John Wiley & Sons, NY, NY) に記載のように使用した。使用した
プログラムは、元は Dominic Zichi and Brenda Javornic, ＮｅＸｓｔａｒ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によりＣプログラム言語で書かれたも
のである。データを式（１）及び（３）に適合させて、ＫdR及び［ＰT］を一定
にしたまま［ＣT］の関数としてＫdC、Ｍ及びＢについての最適パラメータを得
た。 ＰＤＧＦ刺激［3Ｈ］−チミジン取込みの阻害 Ａ１０ラットの平滑筋細胞を、ＤＭＥ １００μＬ＋グルコース ４．５ｇ／
Ｌ＋ＨＥＰＥＳ＋０．１％ ＦＢＳの各ウェルに７〜８ｘ１０3個で、９６穴組
織培養プレートにおいて培養し、約２０時間、飢餓状態にした。アプタマー又は
低分子オリゴアニオンの量を、オリゴアニオンについては１：３の希釈工程によ
り１ｍＭから０．３μＭへ、アプタマーについては１：３希釈工程により１μＭ
から０．３ｎＭへ希釈した同一３検体のウェルにおいて、９６穴プレート全体で
滴定した。すぐに、ＰＤＧＦ−ＢＢを、非刺激対照を除く全ウェルへ加えて１０
ｎｇ／ｍＬとした。陽性対照にはＰＤＧＦ−ＢＢだけがあり、他の化合物はなか
った。５％ＣＯ2において３７℃で６時間後、3Ｈ−チミジンを加え（０．２５μ
Ｃｉ／穴）、さらに２４時間インキュベートした。室温で２０〜３０分間、ゆっ
くり振盪させながら、細胞を１％トライトン−Ｘ１００に溶かし、次いで９６穴
ガラス繊維フィルタープレート（パッカード）上に採取し、乾燥させた。シンチ
ラントを加え、取込まれた3Ｈ−チミジンの放射活性を計数した。ＧｒａｐｈＰ
ａｄ Ｐｒｉｓｍコンピュータ・プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ）の可変スロープモデルを用いる非線形回帰へデータを適合させることによ
り、ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導3Ｈ−チミジン取込みの阻害についてのＥＣ５０値を得
た。 実施例２．ＰＤＧＦアプタマー競合アッセイ ＰＤＧＦアプタマー競合アッセイでは、以前に同定したＤＮＡ・ＰＤＧＦアプ
タマー配列を使用した。ここで使用したアプタマー及び方法については実施例１
に詳しく説明されている。この実験で得られたアプタマーは、受容体結合とＰＤ
ＧＦ−ＢＢ誘導ＤＮＡ合成を in vitro で阻害するやり方で、ＰＤＧＦのＢ鎖に
選好的に結合する。光架橋形成実験を使用して、このアプタマーにある特定のヌ
クレオチドが、受容体結合に関わることが知られているＰＤＧＦの領域の付近に
位置する、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖のフェニルアラニン−８４と相互作用することが示さ
れた（Green et al. (1996) Biochemistry 35: 14413-24）。競合剤の検出をマ
イクロモルの範囲において容易にするために、ＰＤＧＦアプタマーである２０ｔ
ａ（Ｋd＝５０ｐＭ）、３３マーのアフィニティーを、さらなる先端切断により
、意図的に１０倍減少させた。競合結合実験に使用したアプタマー、２０ｔｂは
２７マーで、０．５ｎＭのＫdでＰＤＧＦ−ＢＢに結合する。
【００３７】 32Ｐ−放射標識アプタマー（２０ｔｂ）をＰＤＧＦ−ＢＢから置換する能力に
ついて、ほとんどがスルホン酸ナフタレンのクラスであるオリゴアニオンのパネ
ルをスクリーニングした。上記の化合物を選んだのは、スマリンとこのファミリ
ーに含まれる他の数種のメンバーが、ＰＤＧＦ受容体を発現する細胞に対するＰ
ＤＧＦの結合を阻害するためである（Garrett et al. (1984) PNAS 81: 7466-74
70; Powis et al. (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 31: 223-228）。ＰＤ
ＧＦアプタマーも受容体結合を阻害する（しかもずっと高い力価で）ので、スマ
リンとこのアプタマーが相互排除的なやり方でＰＤＧＦに結合すると予測するこ
とは理に適っていた。これは、意図的に偏ったライブラリーであって、従来のラ
イブラリーやコンビナトリアルライブラリーに近似させることを意図したもので
はなく、このような競合アッセイが実施可能であることを示すためだけのもので
あった。ニトロセルロースフィルター結合法を使用して、非結合アプタマーから
結合したアプタマーを分離した。この競合アッセイに使用した競合剤の構造を、
その競合プロフィール（図２）から式（１）〜（３）（実験法）により算出した
ＫdC値とともに図１に示す。すべての競合実験で、32Ｐ−末端標識２０ｔｂアプ
タマーとＰＤＧＦ−ＢＢの濃度は、それぞれ１．１６ｎＭと１．０ｎＭであった
。結合反応は３７℃で実施し、インキュベーション時間は平衡状態が確保される
ように少なくとも６０分とした（アプタマーがＰＤＧＦ−ＢＢから解離するとき
のｔ1/2は約２分である）。こういったアッセイで迅速な解離運動が明らかに有
利であるのは、平衡に達するのに必要な時間の長さがそれにより短縮されるから
である。
【００３８】 スルホン酸ナフタレン誘導体クラスの１１種の化合物でＰＤＧＦアフィニティ
ーに開きがあるのは明らかである。ヘキサアニオンであるスマリンは、実はＰＤ
ＧＦ−ＢＢの最良のリガンドではない。このセットを検査すると、硫酸基（又は
アニオン一般）を立体的に換えることが結合アフィニティーの強い決定要因にな
ることが明瞭に示唆される。例えば、１，３，６−トリスルホン酸ナフタレンが
８７０μＭのＫdCで結合するのに対し、ＳＰＡＤＮＳ（１，３，６−トリスルホ
ン酸ナフタレンと構造類似性がある別のトリアニオン）は１９μＭのＫdCで結合
する。陰電荷の全数は、その好適な置換ほど重要ではないように見える（ヘキサ
アニオンであるスマリンと、やはりヘキサアニオンであるヘキサ硫酸ミオイノシ
トールとオクタアニオンのオクタ硫酸スクロースとを比較すること）。 実施例３．Ａ１０ラット平滑筋細胞におけるＰＤＧＦ誘導3Ｔ−チミジン合成に
対するリガンドの効果 低分子オリゴアニオンの同じパネルを、実施例１に記載のように、Ａ１０ラッ
ト平滑筋細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢ誘導3Ｔ−チミジン取込みに対するその効
果について試験した。試験した全化合物についてのＥＣ５０を実施例１に記載の
ように算出し、図１に列挙する。 実施例４．小麦胚芽凝集素アプタマーの競合アッセイ ＷＧＡ競合アッセイでは、以前に同定した２’−アミノピリミジンＲＮＡアプ
タマー１１．２０を使用した。ここで使用したアプタマー及び方法については実
施例１に詳しく説明されている。アプタマー１１．２０は、ランダム核酸ライブ
ラリーをＷＧＡとインキュベートし、非結合分子を除去し、次いで、特定部位へ
結合したアプタマーを競合剤、（ＧｌｃＮＡｃ）3で置換することによって選択
した。このように、タンパク質上のどこにでも高アフィニティー結合することで
選択されたＰＤＧＦアプタマーとは異なり、ＷＧＡアプタマーは特定部位である
（ＧｌｃＮＡｃ）3結合部位に結合することで選択した。アプタマー１１．２０
とこの方法により単離した関連アプタマーは、ヒツジ赤血球のＷＧＡ介在性凝集
を強力に阻害した。驚くにあたらないが、アプタマー１１．２０と関連アプタマ
ーは、（１９９８年７月１４日発行の「レクチンに対する高アフィニティーの核
酸リガンド」と題した米国特許第５，７８０，２２８号に記載のように）（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）3で置換され得る。
【００３９】 ＧｌｃＮＡｃ3に関連した一群の炭水化物を、放射標識アプタマー１１．２０
をＷＧＡから置換する能力について試験した。ＰＤＧＦと同じように、ニトロセ
ルロースフィルター結合アッセイを使用して、非結合アプタマーから結合アプタ
マーを分離した。このアッセイに使用した競合剤の構造を、その競合プロフィー
ル（図４）から式（１）〜（３）により算出したＫdC値とともに図３に示す。結
合条件は実施例１に詳しく説明されている。
【００４０】 試験した炭水化物では、ＷＧＡへのアフィニティーにかなりの開きがある。最
良のリガンドは、この順に、（ＧｌｃＮＡｃ）4、（ＧｌｃＮＡｃ）3、及び（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）2あった（図３及び４）。この結果は、以前の観察事実に一致して
いる（Goldstein and Poretz (1986): The Lectins. Properties, Functions, a
nd Applications in Biology and Medicine, Academic Press, NY, pp 233-247
）。ＧｌｃＮＡｃは、この濃度範囲では競合剤とならなかった。ＷＧＡ介在性凝
集を阻害する（ＧｌｃＮＡｃ）3及びＧｌｃＮＡｃの能力は以前試験された（１
９９８年７月１４日発行の「レクチンに対する高アフィニティーの核酸リガンド
」と題した米国特許第５，７８０，２２８号を参照のこと）（凝集を完全に阻害
するのに、両化合物の１８．５μＭ及び８００μＭがそれぞれ必要とされた）。
このように、この競合アッセイで試験した炭水化物の亜集合については、ＫdC値
が機能アッセイの阻害強度に相関する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＰＤＧＦ競合アッセイに使用した低分子オリゴアニオン競合剤の構造
（点線（ｃ2v）は２つ折り対称軸を示す）、並びに、競合プロフィールから式（
１）〜（３）により算出したＫdC値と3Ｔ−チミジン取込みアッセイから導かれ
たＥＣ５０値を示す。
【図２】 図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、ＰＤＧＦアプタマーの結合をＰＤＧＦへ置換するこ
とについての様々な低分子オリゴアニオン競合剤の競合プロフィールを示す。
【図３】 図３は、ＷＧＡ競合アッセイに使用した低分子オリゴ糖競合剤の構造、並びに
、競合プロフィールから式（１）〜（３）により算出したＫdC値を示す。
【図４】 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、ＷＧＡアプタマーの結合をＷＧＡへ置換する
ことについての様々な低分子オリゴ糖競合剤の競合プロフィールを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 FB02 FB07 FB08 FB12 FB13 4B063 QA18 QQ61 QR35 QR56 QS32 QX01

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非核酸分子があるターゲットに結合するかどうかを決定する
    方法であって、前記ターゲットへのアフィニティーを有する核酸リガンドを前記
    非核酸分子で置換することを含んでなる、前記方法。
  2. 【請求項２】 非核酸分子があるターゲットに結合するかどうかを決定する
    方法であって、 ａ）ターゲットを個体支持体へ固定化すること； ｂ）標識化した核酸リガンドを前記ターゲットと接触させること（ここで、こ
    の核酸リガンドのターゲットへの結合により、複合体が形成される）； ｃ）非核酸分子をこの複合体へ加えること（ここで、ターゲットへの結合につ
    いて核酸リガンドと競合する非核酸分子は複合体を壊し、核酸リガンドを遊離さ
    せる）；及び ｄ）遊離した核酸リガンドを検出し、それにより前記非核酸分子が前記ターゲ
    ットへ結合することを決定すること： を含んでなる、前記方法。
  3. 【請求項３】 ｉ）核酸の候補混合物を調製すること； ｉｉ）この核酸の候補混合物を前記ターゲットと接触させること（ここで、前
    記ターゲットに対して前記候補混合物に比べて強まったアフィニティーを有する
    核酸が候補混合物の残りから分画され得る）； ｉｉｉ）強まったアフィニティーの核酸を候補混合物の残りから分画すること
    ；及び ｉｖ）強まったアフィニティーの核酸を増幅し、前記ターゲットに対する結合
    についての相対的により高いアフィニティー及び特異性をもった核酸が濃縮され
    た核酸の混合物を産生し、それにより核酸リガンドが同定されること： を含んでなる方法により前記核酸リガンドが同定される、請求項２に記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 前記標識が放射活性、蛍光、化学発光からなる群から選択さ
    れる、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記非核酸分子が低分子である、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 非核酸分子があるターゲットに結合するかどうかを決定する
    方法であって、 ａ）核酸リガンドを個体支持体へ固定化すること； ｂ）標識化したターゲットを前記核酸リガンドと接触させること（ここで、こ
    の核酸リガンドのターゲットへの結合により、複合体が形成される）； ｃ）非核酸分子をこの複合体へ加えること（ここで、ターゲットへの結合につ
    いて核酸リガンドと競合する非核酸分子は複合体を壊し、ターゲットを遊離させ
    る）；及び ｄ）遊離したターゲットを検出し、それにより前記非核酸分子が前記ターゲッ
    トへ結合することを決定すること： を含んでなる、前記方法。
  7. 【請求項７】 ｉ）核酸の候補混合物を調製すること； ｉｉ）この核酸の候補混合物を前記ターゲットと接触させること（ここで、前
    記ターゲットに対して前記候補混合物に比べて強まったアフィニティーを有する
    核酸が候補混合物の残りから分画され得る）； ｉｉｉ）強まったアフィニティーの核酸を候補混合物の残りから分画すること
    ；及び ｉｖ）強まったアフィニティーの核酸を増幅し、前記ターゲットに対する結合
    についての相対的により高いアフィニティー及び特異性をもった核酸が濃縮され
    た核酸の混合物を産生し、それにより核酸リガンドが同定されること： を含んでなる方法により前記核酸リガンドが同定される、請求項６に記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 前記標識が放射活性、蛍光、化学発光からなる群から選択さ
    れる、請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記非核酸分子が低分子である、請求項６に記載の方法。
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