JP2002541061A - サイトカイン結合ドメイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 少なくとも１つのサイトカインに結合し、かつ単一のサイトカイン受容体を介してサイトカインシグナルを変換することができるサイトカイン結合ドメインまたはその部分が提供される。該ドメインは、サイトカイン受容体のβ_c鎖のドメイン４のＢ’−Ｃ’ループの部分またはその類似構造物からなる。好ましくは、サイトカイン結合ドメインは、ドメイン４のＢ’−Ｃ’ループの部分およびＢ’−Ｃ’、Ｆ’−Ｇ’ループおよびドメイン４のＮ末端部によって画定される溝からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、サイトカイン結合ドメインに関し、さらに、サイトカイン結合アン
タゴニストおよび／またはサイトカイン結合アゴニストに関する。本発明はさら
に、そのような化合物を識別するための方法およびそのような化合物を治療、予
防および診断に使用することに関する。

【０００２】

【発明の背景】

ヘテロ二量体のサイトカイン受容体は、２つ（または３つ）のサブユニットか
らなり、それらはそれぞれ異なりかつ特異的な機能を有する。それらには、主要
なリガンド結合サブユニット（αサブユニット）およびシグナル発生サブユニッ
ト（βまたはγサブユニット）がある。重要なのは、後者が、適当なα鎖に複合
化したいくつかのサイトカイン類を認識することができかつそれらのシグナルを
変換することができることである。このことは、ヒト顆粒球−マクロファジーコ
ロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびＩＬ−
５受容体、共通ＩＬ−２受容体γ鎖（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９
およびＩＬ−１５受容体により共有）およびｇｐ１３０（ＩＬ−６、ＩＬ−１１
、ＬＩＦ、毛様体神経栄養因子、オンコスタチンＭおよびカルジオトロフィン受
容体により共有）の共通β鎖（β_c）によって例示される。意義深いのは、好酸
球の生産を刺激することが知られているわずか３つのサイトカイン類、ＩＬ−５
、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦが、アレルギー性炎症を患った肺において同時に
上昇し得るということである。

【０００３】 ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の３つすべてが同時に拮抗作用をもた
らすことがおそらくは望ましく、実際好酸球を刺激するのに必要であろう。アレ
ルギーに関連する主要な型の細胞であると考えられる好酸球は、数回に分けて保
持され得、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−５によって刺激され得る（Lope
z et al, 1989）。３つすべてのサイトカイン類の拮抗作用は、したがって、好
酸球および好塩基球の作用を阻害するのに必要であり得る。同様に、アレルギー
においてエフェクタとして作用すると考えられている好塩基球は、ＩＬ−３、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦまたはＩＬ−５のいずれかによって刺激され得る（Lopez et al, 199
0）。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の拮抗作用は、異なる各サイトカ
インに対して特定の複数のアンタゴニストを同時に投与することによりもたらさ
れ得る。実行可能ではあるが、この方法は、最高３つの異なるタンパク質を投与
する必要があるという点で不利であり、これは不便である他、免疫原性および他
の副作用の危険を増すことになる。

【０００４】 これら３つのサイトカインのすべては共通の受容体サブユニット（β_c）を介
して作用するので、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の作用を、このサブ
ユニット（β_c）を介する単一の化合物によって同時に阻害できる可能性がある
。

【０００５】 かくして、β_c鎖に対するアンタゴニストによって、３つすべてのサイトカイ
ンの機能を同時に阻害できる可能性があり、しかも、有用な治療効果をもたらす
可能性がある。

【０００６】 サイトカイン類に複合化される共有のサブユニットの結合部位について構造の
データを得るには、次のような大きな問題が１つある。サイトカイン類に直接結
合し得るホモ二量体の受容体またはヘテロ二量体の受容体の分離されたα鎖とは
違って、共通のサブユニットはそれ自身によってはサイトカイン類に結合するこ
とができない。この問題を解決するため、本発明者らは、あるモノクローナル抗
体（Ｍａｂ）を開発した。このモノクローナル抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３
／ＩＬ−５の共通するβ鎖受容体のドメイン４（Ｄ４β_c）内においてサイトカ
イン高アフィニティ結合に重要な領域に対するものである。このＭａｂ（ＢＩＯ
Ｎ−１と命名）は、ヒト好酸球に対するＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５
の高アフィニティ結合を阻害し、かつそのインビトロでの生産および機能的活性
化を阻害した。したがって、ＢＩＯＮ−１は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩ
Ｌ−５受容体の最初の共通するアンタゴニストであり、共通するβ鎖におけるサ
イトカイン結合部位を探るためのユニークな手段となる。

【０００７】 リガンド−受容体複合体は未だに結晶化されておらず、そのリガンド−結合部
位の構造がはっきりわかっていないため、β_cの各リガンドへのアフィニティ変
換に関する分子レベルでの機構は十分にわかっていない。本発明者は今回、結晶
化を行ない、ＢＩＯＮ−１の形態のアンタゴニストが結合したＧＭ−ＣＳＦ／Ｉ
Ｌ−３／ＩＬ−５受容体のＤ４β_cドメインの構造を決定した。

【０００８】

【発明の概要】

本発明は、サイトカイン結合ドメインまたはその部分を提供し、それは、少な
くとも１つのサイトカインに結合するものであり、かつ単一のサイトカイン受容
体を介してサイトカインシグナルを変換できるものである。そのようなドメイン
は、サイトカイン受容体のβ_c鎖のドメイン４（Ｄ４β_c）のＢ′−Ｃ′ループの
部分またはそれに類似する構造からなる。

【０００９】 より好ましくは、そのドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分なら
びにＢ′−Ｃ′、Ｆ′−Ｇ′ループおよびドメイン４のＮ末端部位またはそれに
類似する構造によって画定される溝からなる。

【００１０】 一具体例において、当該ドメインは、α鎖サブユニットまたはβ_c鎖サブユニ
ットのドメイン３と相互作用が可能なチロシン残基をさらに含み、それは、サイ
トカインの高アフィニティ結合を可能にする。さらに好ましい具体例において、
このチロシンは、Ｔｙｒ４２１またはそれに等価な残基である。Ｔｙｒ４２１ま
たはそれに等価な残基は、β_c分子内相互作用および／または受容体サブユニッ
ト−受容体サブユニット間の相互作用あるいはオリゴマー化を促進する。好まし
くは、当該結合部位は、α鎖に複合化した少なくとも２つのサイトカインを認識
できるものである。好ましくは、これらのサイトカインは、限定されることなく
、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦよりなる群、あるいはＩＬ−４および
ＩＬ−１３よりなる群から選択されるものである。これらのサイトカイン、特に
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦは、まずα鎖によって結合され、サイト
カイン：α鎖複合体を形成するサイトカイン受容体の共通β_c鎖を介して結合し
得る。

【００１１】 本発明の他の局面において、サイトカインアゴニストまたはアンタゴニストの
活性を有する化合物を識別する方法が提供される。この方法は、 可能性のあるサイトカインアゴニストおよび／またはサイトカインアンタゴニ
スト化合物をサイトカイン結合ドメインまたはその部分に供すること（当該ドメ
インは少なくとも１つのサイトカインに結合するものであり、かつ単一のサイト
カイン受容体を介してサイトカインシグナルを変換できるものである。また当該
ドメインは、サイトカイン受容体のβ_c鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部
分またはそれに類似する構造からなる）、および サイトカインの活性について、当該化合物がアゴニスト反応またはアンタゴニ
スト反応を示すかどうか測定することを含む。

【００１２】 より好ましくは、当該ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分およ
びＢ′−Ｃ′、Ｆ′−Ｇ′ループおよびドメイン４のＮ末端部位あるいはその類
似する構造によって画定される溝からなる。

【００１３】 サイトカイン結合ドメインは、いくつかのサイトカイン類に共通する受容体の
ドメインであり得る。好ましくは、当該ドメインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３お
よびＩＬ−５に共通するものであるか、またはＩＬ−４およびＩＬ−１３に共通
する共通シグナル発生構造である。

【００１４】 好ましい局面において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５アゴニストま
たはアンタゴニストを識別する方法が提供される。この方法は、 ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５結合ドメインまたはその部分に対して
可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストを供すること（当該ドメインは、
サイトカイン類の少なくとも１つに結合するものであり、かつ単一のサイトカイ
ン受容体を介してサイトカインシグナルを変換できるものであり、当該ドメイン
は、サイトカイン受容体のβ_c鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分またあ
それに類似する構造からなる）、および ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の活性について当該化合物がアゴニス
ト反応またはアンタゴニスト反応を示すかどうか測定することも含む。

【００１５】 より好ましくは、当該ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分およ
びＢ′−Ｃ′、Ｆ′−Ｇ′ループおよびドメイン４のＮ末端部位またはその類似
する構造によって画定される溝からなる。

【００１６】 本発明の好ましい局面の１つにおいて、サイトカインアンタゴニスト活性を有
する化合物を識別する方法が提供される。この方法は、 サイトカイン結合ドメインまたはその部分に対し可能性あるサイトカインアン
タゴニストを供すること（そこにおいて当該ドメインまたはその部分は、少なく
とも１つのサイトカインに結合するものであり、かつ単一のサイトカイン受容体
を介してサイトカインシグナルを変換できるものであり、当該ドメインは、サイ
トカイン受容体のβ_c鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分またはそれに類
似する構造からなるものである）、および サイトカイン結合ドメインに結合した化合物を同定すること（そこにおいて当
該化合物は、サイトカインの活性に対しアンタゴニスト反応を有するものである
）を含む。

【００１７】 より好ましくは、当該ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分およ
びＢ′−Ｃ′、Ｆ′−Ｇ′ループおよびドメイン４のＮ末端部位またはその類似
する構造によって画定される溝からなる。

【００１８】 好ましい具体例において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のアンタゴ
ニストを識別するための方法が提供される。この方法は、 サイトカイン結合ドメインまたはその部分に対して可能性のあるサイトカイン
アンタゴニストを供すること（そこにおいて当該ドメインまたはその部分は、サ
イトカイン類の少なくとも１つに結合するものであり、かつ単一のサイトカイン
受容体を介してサイトカインシグナルを変換できるものであり、当該ドメインは
、サイトカインレセプタのβ_c鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分または
その類似の構造からなるものである）、および サイトカイン結合ドメインに結合した化合物を同定すること（そこにおいて当
該化合物は、サイトカインの活性に対してアンタゴニスト反応を有するものであ
る）を含む。

【００１９】 より好ましくは、当該ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分およ
びＢ′−Ｃ′、Ｆ′−Ｇ′ループおよびドメイン４のＮ末端部位またはその類似
する構造によって画定される溝からなる。

【００２０】 本発明の他の局面において、サイトカインに関連する疾患を予防または治療す
る方法が提供される。この方法は、上述した方法により同定された化合物、アゴ
ニストまたはアンタゴニストの有効量を患者に投与することを含む。

【００２１】

【発明のより詳細な説明】

本発明により提供されるサイトカイン結合ドメインまたはその部分は、少なく
とも１つのサイトカインに結合するものでありかつ単一のサイトカイン受容体を
介してサイトカインシグナルを変換することができるものである。当該ドメイン
は、サイトカイン受容体のβ_c鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分または
それに類似する構造からなる。

【００２２】 より好ましくは、当該ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの部分およ
びＢ′−Ｃ′、Ｆ′−Ｇ′ループおよびドメイン４のＮ末端部位によって画定さ
れる溝またはサイトカイン受容体の類似する構造からなる。

【００２３】 他の具体例において、当該ドメインは、α鎖サブユニットまたはβ_c鎖サブユ
ニットのドメイン３と相互作用が可能であり、それによりサイトカインの高アフ
ニティ結合を可能にするチロシン残基をさらに含む。より好ましい具体例におい
て、このチロシンは、Ｔｙｒ４２１またはそれに等価な残基である。Ｔｙｒ４２
１またはそれに等価な残基は、β_c分子内相互作用および／または受容体サブユ
ニット−受容体サブユニット間の相互作用もしくはオリゴマー化を促進する。用
語「鎖」および「鎖サブユニット」は、本明細書において交換可能に使用するこ
とができる。たとえば、「α鎖」は、「α鎖サブユニット」と同じ意味で用いる
ことができる。

【００２４】 本明細書において、用語「からなる」は、他の添加物、成分、整数または工程
を排除することを意図するものではない。

【００２５】 ここで使用される「等価な残基」という用語は、同様の機能を奏し得るアミノ
酸残基を意味する。

【００２６】 好ましくは、結合ドメインは、適当なα鎖に複合化した少なくとも２つのサイ
トカインを認識しかつそれらに結合することができるものである。好ましくは、
そのようなサイトカインは、限定されることなく、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧ
Ｍ−ＣＳＦから選択されるかあるいはＩＬ−４およびＩＬ−１３から選択される
。３つのサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＭＦは、まず最初にα
鎖によって結合されそしてサイトカイン：α鎖複合体を形成するサイトカイン受
容体の共通β_c鎖を介して結合することができる。同様に、ＩＬ−４およびＩＬ
−１３は、サイトカイン受容体に対して、β_cに類似する共通のシグナル発生ユ
ニットを有してもよい。

【００２７】 共通β_c鎖は、次のＧＭ−ＣＨＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体を含む受容
体の任意の１つからもたらされ得る。β_cに類似する構造を有する共通シグナル
発生サブユニットは、共通ＩＬ−２受容体γ鎖（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７
、ＩＬ−９およびＩＬ−１５受容体に共通）およびｇｐ１３０（ＩＬ−６、ＩＬ
−１１、ＬＩＦ、毛様体神経栄養因子、オンコスタチンＭおよびカルジオトロフ
ィン受容体に共通）から得ることができ、あるいは、サイトカインスーパーファ
ミリー受容体、限定されることなくたとえば、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、ＩＬ−２
Ｒβ、ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−３Ｒα、ＥＰＯＲ、Ｔ
ＰＯＲおよびＯＢＲからなる群より選択することができ、あるいは、関連する（
クラス１）サイトカイン受容体構造、限定されることなくたとえば成長ホルモン
受容体（ＧＨＲ）、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）、エリトロポエチン受容体
（ＥＰＯＲ）、Ｇ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）およびｇｐ１３０からなる群
から選択することができる。Ｄ４β_cとこれらの受容体との間の対合による配列
の同一性は、構造に基づく整列を行なった後、１２％（Ｇ−ＣＳＦ）〜２７％（
ｇｐ１３０）の範囲にある。これらの受容体を通じて厳密に保存されている残基
は７つのみ（Ｐｒｏ３４３、Ｔｒｐ３５８、Ｌｅｕ４０２、Ｔｙｒ４０８、Ａｒ
ｇ４１３、Ｇｌｙ４２３、Ｓｅｒ４２６）である。これらのすべてが、構造上の
役割を果たしていると考えられる。構造上の重なりは、Ｄ４β_cがＰＲＬＲに最
も近く（ｒ．ｍ．ｓ．８６のＣａ原子について１．４Åの偏差、２０％の配列同
一性）、次いでＧＨＲが近い（ｒ．ｍ．ｓ．８１のＣａ原子について１．５Åの
偏差、２３％の配列同一性）。

【００２８】 好ましくは、共通β_c鎖は、ＩＬ−５、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦ受容体か
ら得られる。これらのサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＭは、
好酸球の生産を刺激することが知られており、アレルギー性の炎症を患う肺にお
いてともに増加し得る。それらが同時に増加することによって、好酸球の数が増
加し得、好酸球の活性化があらゆる程度で起こり得、種々の段階の好酸球の浸潤
が起こり得、さらに好酸球によって仲介される炎症が局所的なものになるか全身
的なものになるかが決定され得る。このことは、好酸球がエフェクタの役割を果
たす喘息のような特定の疾患の病理学において特に重要であり得る。

【００２９】 β_cの結合ドメインについて本発明を説明するが、これは単なる例示であり、
本発明はそれに限定されるものではない。

【００３０】 本発明者は、β_cの第４番目（活性化）ドメイン（Ｄ４β_c）を大腸菌において
発現させ、イオン交換および逆相高速液体クロマトグラフィにより均質になるま
でそれを生成した。ＢＩＯＮ−１ＭｏＡｂをパパインで消化し、Ｆａｂフラグメ
ントを生成させた。そして、それをプロテインＡセファロースのクロマトグラフ
ィにより精製した。Ｄ４β_cおよびＢＩＯＮ−１Ｆａｂの滴定により、化学量論
的に１：１の複合体が生じ、それは後に結晶となった。それらの結晶において回
折は十分であり、満足のいく結晶学的な構造の決定を進めることができた。

【００３１】 本発明者らは、ドメイン４の共通β_c鎖（Ｄ４β_c）が、コンパクトな球状の形
を有することを見出した。その球状の形は、全体的なサイズが４５Å×２５Å×
２０Å（図１Ａ）であった。Ｎ末端およびＣ末端はそれぞれ、細胞外領域の残部
と膜貫通ドメインに対する付着部位となっている。この分子は、多数の疎水性相
互作用を介して互いに詰まっている２つの逆平行βシート（４２％シート）を有
するフィブロネクチンタイプＩＩＩのトポロジーを備えており、それは、芳香族
性残基の２つのクラスタを含む（Ｔｒｐ４３４、Ｔｙｒ３５４およびＴｙｒ３７
６；Ｔｒｐ３５８、Ｐｈｅ３７２およびＨｉｓ３７０）。シートＡは、３つのβ
鎖（Ａ′（残基３４４〜３５０）、Ｂ′（残基３５３〜３５９）およびＥ′（残
基３９６〜３９８））から構成されており、シートＢは４つの鎖（Ｃ′（残基３
６９〜３７８）、Ｄ′（残基３８９〜３９２）、Ｆ′およびＦ″（残基４０６〜
４１７）およびＧ′（残基４３２〜４３６）から構成されており、最も長い鎖Ｃ
′は、当該分子のほとんど全長にわたっている。アミノ酸配列モチーフＷＳＸＷ
Ｓ（Ｘは任意の残基である）は、多くのサイトカイン受容体の特有の構造であり
、Ｆ鎖、特にＦ″とＧ鎖、特にＧ′鎖との間に位置している。また、当該アミノ
酸配列モチーフは、二重βバルジ構造をとっている（図１Ａ）。鎖Ｆ′からのア
ルギニン残基は、当該モチーフのトリプトファン残基の間に入り込んでおり、塩
基性残基と芳香族性残基が交互に配置されるラダーを形成している。このラダー
は、さらなる芳香族性残基および塩基性残基（Ｔｙｒ４２１−Ａｒｇ４１５−Ｔ
ｒｐ４２５−Ａｒｇ４１３−Ｔｒｐ４２８−Ａｒｇ４１１−Ｔｒｐ３８３−Ａｒ
ｇ３７７−Ｔｒｐ４０９−Ａｒｇ４０７）によってそれぞれの方向に延びている
。このラダーにおいてＡｒｇ３７７〜Ｔｒｐ４０９にはサイドステップがある。
この１０段の梯子は、２９〜３５Å、好ましくは２９Åの長さであり、段の幅は
約５Åである。そのラダーは、当該分子の表面において、唯一の顕著な正に帯電
したパッチである。

【００３２】 結晶学的分析の結果を表１に示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】 ラダーの他に、注目すべき３つの他の顕著な表面の特徴が存在する。その表面
には、２つの大きな疎水性のパッチが存在する。その第１のものＨ１は、疎水性
残基が密集したストリップであり、Ｄ′およびＥ′鎖によって画定されるβ−サ
ンドイッチの一端に位置し、その長さは２７Åであり、幅は６Åである（図１Ｄ
）。その第２のものＨ２は、第１に対向する面に存在し、当該分子の表面におい
てはっきり現われている溝の端にリップの一部を形成する（図１Ｃ）。Ｈ２パッ
チは、残基Ｉｌｅ３３８、Ａｌａ３４１、Ｍｅｔ３６１、Ｔｙｒ３６５から構成
され、さらに好ましくはＭｅｔ３４０およびＰｒｏ３４２、Ｌｙｓ３６２の脂肪
族部分、ならびに好ましくはＩｌｅ３６８およびＴｙｒ４２１を含む。この溝は
、当該分子のＮ末端に位置し、そこにおいて、１つの壁は、Ｂ′−Ｃ′ループと
Ｆ″−Ｇ′ループの一部によって形成され、もう一方の壁はＮ末端（残基３３８
〜３４２）によって形成される（図１Ｃ）。

【００３５】 ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループまたはサイトカイン受容体の共通β_c鎖（Ｄ４
β_c）またはその一部は、サイトカインの結合に必要である。Ｂ−Ｃループおよ
び好ましくはＦ−Ｇループは、当該タンパク質の本体から顕著に突き出ており、
サイトカイン結合に影響を与えている（図１Ａ、Ｂ）。それは、タイプ１β−タ
ーンを形成する３６５〜３６８の残基を有するＤ４β_cにおいて規則的な構造を
とっている（図１）。好ましくは、当該ドメインのＢ′−Ｃ′ループの一部は、
Ｔｙｒ３６５、Ｉｌｅ３６８およびＨｉｓ３６７を含む。ＧＣＳＦＲ、ＧＨＲお
よびＰＲＬＲは、Ｔｙｒ３６５に等価な芳香族性の残基を有する一方、Ｈｉｓ３
６７に相当する残基は存在しない。

【００３６】 Ｂ′−Ｃ′ループとのサイトカインの相互作用において、好ましいことは、サ
イトカインと受容体の相互作用において残基Ｔｙｒ３６５、Ｈｉｓ３６７および
Ｉｌｅ３６８が関連していることである。理想的には、Ｔｙｒ３６５、Ｈｉｓ３
６７およびＩｌｅ３６８が、サイトカイン結合性の３つ組を形成し、集まってピ
ボットポイントを形成する。そのようなピボットポイントに対して、３つのすべ
てのサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５）が必須のグルタメ
ート残基（ＧＭ−ＣＳＦのＧｌｕ２１、ＩＬ−３のＧｌｕ２２およびＩＬ−５の
Ｇｌｕ１３）を介して結合し得る。

【００３７】 Ｆ′−Ｇ′ループは、Ｄ４β_cにおいてその先端でタイプＩＶβターンをとっ
ており、この領域の最も顕著な特徴は、Ａｒｇ４１８およびＴｙｒ４２１である
。それらの各々は、溶液から突き出ている（図１Ａ）。したがって、サイトカイ
ンがβ_c鎖と相互作用するとき、Ｔｉｒ４２１は、β_cのドメイン３および／また
はα鎖と相互作用して、受容体−受容体相互作用またはオリゴマー化を促進する
ことができる。

【００３８】 より好ましくは、当該ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの一部およ
びＢ′−Ｃ′、Ｆ′−Ｇ′ループおよびドメイン４のＮ−末端部位によって画定
される溝からなる。

【００３９】 他の具体例において、当該ドメインはさらに、α鎖サブユニットまたはβ_c鎖
サブユニットのドメイン３と相互作用することができ、それによりサイトカイン
の高アフィニティ結合をもたらすことができるチロシン残基を含む。さらに好ま
しい具体例において、このチロシンはＴｙｒ４２１またはそれに等価な残基であ
る。Ｔｙｒ４２１またはそれに等価な残基は、β_c分子内相互作用および／また
は受容体サブユニット−受容体サブユニット相互作用またはオリゴマー化を向上
させる。

【００４０】 他の好ましい具体例において、サイトカインに結合することができる結合性ド
メインまたはその部分は、次の残基Ｌｙｓ３６２、Ｔｙｒ３６５、Ｈｉｓ３６７
、Ｉｌｅ３６８、Ａｒｇ４１８、Ｇｌｙ４２０、Ａｓｎ４２２、Ｔｈｒ４１６、
Ｉｌｅ３３８、Ｇｌｎ３３９、Ｍｅｔ３４０およびＭｅｔ３６１のいずれかによ
って区切られている領域または他の受容体における共通シグナル発生ユニットの
類似する残基によって区切られている領域によって画定することができる。これ
らの残基の大半は、Ｂ′−Ｃ′ループに存在し、したがって、サイトカインシグ
ナルを変換することができるＢ′−Ｃ′ループの部分を構成する。この結合ドメ
インは、「溝」として記述することができ、この溝は、限定されることなく、疎
水性の残基、好ましくは上に挙げたような残基によって大きく形成された窪んだ
表面を有する。

【００４１】 疎水性表面のパッチ、Ｄ４β_cのＨ１およびＨ２（図１Ｃ、１Ｄ）は、他の受
容体の殆どにおいて相当する特徴を有する。ｇｐ１３０を除いて、すべての受容
体は、Ｈ１の位置（Ｄ′−Ｅ′鎖結合の中心）に相当する顕著な疎水性パッチを
有する。しかしながら、疎水性の程度および範囲は大きく異なっている。Ｈ２に
等価な領域は、ｇｐ１３０を除くすべてにおいて保存されている。他の受容体と
の類似性により、Ｄ４β_cのＨ２パッチは、無傷の受容体のドメイン３からのＡ
−Ｂループと相互作用し得る。

【００４２】 Ｄ４β_cとＢＩＯＮ−１のようなアンタゴニストあるいはサイトカインとの相
互作用を下の表２にまとめる。

【００４３】

【表２】

【００４４】 １ BION-1を有するまたはそうでないｃのｖｄｗ接触 ２ Ｄ４βｃ／ＢＩＯＮ−１複合体の形成において失われる溶液−露出領域、ds
sp Kabschを計算、W.S.他（1983）Biopolymers 22, 2577 ３ 塩橋および水素結合を含み、Kabsch & Sander Kabschの距離および幾何学的
基準に基く。W.S.他(1983)Biopolymer 22, 2577 ４ Sun. Q他(1999)Blood, 1943からのアラニンに対する突然変異に基く。 ５ Woodcok, J.M他(1994)EMBO, J.13.5176: Woodcok, J.M他J.Bio.Chem., 271.
25999からのアラニンに対する突然変異に基く。 ６ Ｎ．Ｄ．測定されず。

【００４５】 この発明の別の局面では、サイトカインアゴニストまたはアンタゴニスト活性
を有する化合物を識別する方法が提供され、前記方法は、 潜在的なサイトカインアゴニストおよび／またはサイトカインアンタゴニスト
化合物をサイトカイン結合ドメインまたはその部分に供するステップを含み、前
記ドメインは、少なくとも１つのサイトカインに結合し、単一のサイトカイン受
容体を介してサイトカインシグナルを変換することができ、前記ドメインは、β _c 鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの一部またはサイトカイン受容体の類似の
構造からなり、前記方法はさらに、 サイトカインの活性に対する化合物のアゴニストまたはアンタゴニスト反応の
存在を判断するステップを含む。

【００４６】 より好ましくは、ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの一部と、ドメ
イン４のＢ′−Ｃ′ループ、Ｆ′−Ｇ′ループおよびＮ−末端部または類似の構
造によって画定される溝とからなる。

【００４７】 別の実施例では、ドメインはさらに、サイトカインの高アフィニティ結合を可
能にするために、α鎖サブユニットまたはβ_c鎖サブユニットのドメイン３との
相互作用を可能とするチロシン残基を含む。さらに好ましい実施例では、チロシ
ンは、Ｔｙｒ４２１または等価の残基である。Ｔｙｒ４２１または等価の残基は
、β_c分子内相互作用および／または受容体サブユニット−受容体サブユニット
相互作用またはオリゴマー化を改良する。

【００４８】 共通β_c鎖は、ＩＬ−３、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦに共通であってもよく
、またはそれは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に共通の同様の構造であってもよい
。

【００４９】 アゴニストまたはアンタゴニスト反応は、サイトカイン反応を結合しかつ活性
化するかまたは阻害する化合物の能力によって測定されてもよく、またはそれは
、突然変異サイトカイン結合ドメインに結合する不能力によって測定されてもよ
い。これは、サイトカインのいずれかと関連付けられる細胞活性によって測定可
能である。たとえば、好酸球付着のサイトカインＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦおよび
ＩＬ−３刺激では、脱顆粒球化（degranulation）および細胞毒性のための呼び
水、ならびに生存能力の増大は、前述のとおり、サイトカイン結合ドメインまた
はその一部に結合するアゴニストまたはアンタゴニストの存在または不在下で測
定されてもよい。

【００５０】 好ましい局面では、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５アゴニストまたは
アンタゴニストを識別する方法が提供され、前記方法は、 潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストをＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩ
Ｌ−５結合ドメインまたはその部分に供するステップを含み、前記ドメインは、
サイトカインの少なくとも１つに結合し、単一のサイトカイン受容体を介してサ
イトカインシグナルを変換することができ、前記ドメインは、β_c鎖のドメイン
４のＢ′−Ｃ′ループの一部またはサイトカイン受容体の類似の構造からなり、
前記方法はさらに、 ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の活性に対する化合物からのアゴニス
トまたはアンタゴニスト反応の存在を判断するステップを含む。

【００５１】 より好ましくは、ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの一部と、ドメ
イン４のＢ′−Ｃ′ループ、Ｆ′−Ｇ′ループおよびＮ−末端部または類似の構
造によって画定される溝とからなる。

【００５２】 この発明の別の好ましい局面では、サイトカインアンタゴニスト活性を有する
化合物を識別する方法が提供され、前記方法は、 潜在的なサイトカインアンタゴニストをサイトカイン結合ドメインまたはその
部分に供するステップを含み、前記ドメインまたはその部分は、少なくとも１つ
のサイトカインに結合し、単一のサイトカイン受容体を介してサイトカインシグ
ナルを変換することができ、前記ドメインは、β_c鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′
ループの一部またはサイトカイン受容体の類似の構造からなり、前記方法はさら
に、 サイトカイン結合ドメインに結合している化合物を識別するステップを含み、
前記化合物は、サイトカインの活性に対するアンタゴニスト反応を有する。

【００５３】 より好ましくは、ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの一部と、ドメ
イン４のＢ′−Ｃ′ループ、Ｆ′−Ｇ′ループおよびＮ−末端部または類似の構
造によって画定される溝とからなる。

【００５４】 別の実施例では、ドメインはさらに、サイトカインの高アフィニティ結合を可
能にするために、α鎖サブユニットまたはβ_c鎖サブユニットのドメイン３との
相互作用を可能とするチロシン残基を含む。さらに好ましい実施例では、チロシ
ンは、Ｔｙｒ４２１または等価の残基である。Ｔｙｒ４２１または等価の残基は
、β_c分子内相互作用および／または受容体サブユニット−受容体サブユニット
相互作用またはオリゴマー化を改良する。

【００５５】 好ましい実施例では、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のアンタゴニス
トを識別するための方法が提供され、前記方法は、 潜在的なサイトカインアンタゴニストをサイトカイン結合ドメインまたはその
部分に供するステップを含み、前記ドメインまたはその部分は、サイトカインの
少なくとも１つに結合し、単一のサイトカイン受容体を介してサイトカインシグ
ナルを変換することができ、前記ドメインは、β_c鎖のドメイン４のＢ′−Ｃ′
ループの一部またはサイトカイン受容体の類似の構造からなり、前記方法はさら
に、 サイトカイン結合ドメインに結合している化合物を識別するステップを含み、
前記化合物は、サイトカインの活性に対するアンタゴニスト反応を有する。

【００５６】 より好ましくは、ドメインは、ドメイン４のＢ′−Ｃ′ループの一部と、ドメ
イン４のＢ′−Ｃ′ループ、Ｆ′−Ｇ′ループおよびＮ−末端部または類似の構
造によって画定される溝とからなる。

【００５７】 別の実施例では、ドメインはさらに、サイトカインの高アフィニティ結合を可
能にするために、α鎖サブユニットまたはβ_c鎖サブユニットのドメイン３との
相互作用を可能とするチロシン残基を含む。さらに好ましい実施例では、チロシ
ンは、Ｔｙｒ４２１または等価の残基である。Ｔｙｒ４２１または等価の残基は
、β_c分子内相互作用および／または受容体サブユニット−受容体サブユニット
相互作用またはオリゴマー化を改良する。

【００５８】 アンタゴニストは、好ましくは、Ｂ′−Ｃ′ループの一部または同様の構造を
介して、サイトカイン、好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦのβ _c への、またはＩＬ−４およびＩＬ−１３の、β_cと同様の共通シグナル発生ユニ
ットへの結合を阻害する。好ましくは、その部分は、上述したとおり、「溝」ま
たはその部分によって識別される。サイトカインは、共通β_c鎖または共通シグ
ナル発生ユニットを結合してもよく、より特定的には、Ｂ′−Ｃ′ループの一部
に結合してもよい。

【００５９】 さらに好ましい実施例では、アンタゴニストは、Ｔｙｒ４２１または等価の残
基、および、α鎖サブユニットまたはβ_cサブユニットのドメイン３のいずれか
においてＴｙｒ４２１または等価の残基と相互作用するアミノ酸またはアミノ酸
のグループを付着し、標的とし、または遮断し得る。

【００６０】 前記方法は、β_cまたは他の共通シグナル発生ユニットの部分を介しておよび
／またはＴｙｒ４２１または等価の残基および／またはβ_c鎖サブユニットのド
メイン３および／またはサイトカイン受容体のα鎖サブユニットまたは他の受容
体における類似の共通鎖を介して作用することのできるサイトカインのアゴニス
トおよびアンタゴニストの識別および設計を可能にする。好ましくは、サブユニ
ットは、β_cなどのＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５に共通であるか、ま
たはＩＬ−４およびＩＬ−３などの他の受容体において共通の類似の鎖である。

【００６１】 サイトカイン結合ドメインの結晶形もこの発明において提供され、薬物または
ファージディスプレイ（タンパク質展示ファージ）により標的とされた選択の構
造ベースの設計を可能とする。潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストは、「
溝結合体」（溝において結合し得る化合物）についてスクリーニングすることに
よって識別され得る。これらは、野生型対突然変異ドメイン４を分子とみなすこ
とにより判断され得る。突然変異は溝の床におけるアラニンへの突然変異により
生成され得る。突然変異は、突然変異を作るための、Ｇｌｎ３４０、Ｉｌｅ３３
８およびＭｅｔ３６１を含むグループから選択される残基のいずれかに向けられ
てもよい。

【００６２】 共通β_cのドメイン４の構造のさらなる使用は、溝の床における、Ｇｌｎ３４
０、Ｉｌｅ３３８および／またはＭｅｔ３６１での突然変異を含むものなどの、
設計された突然変異を用いてアフィニティ成熟を可能にする。本発明者は、ドメ
イン４の構造を導き出したので、抗原構造は、この説明によってさらに理解され
、ＢＩＯＮ−１類似体の開発、ペプチドまたは非ペプチドのいずれかは、この出
願の範囲に含まれる。

【００６３】 別の局面において、上述の方法によって識別される化合物、アゴニストまたは
アンタゴニストが提供される。この化合物アゴニストまたはアンタゴニストは、
サイトカイン結合ドメインに向けられる抗体またはそのフラグメントであっても
よく、より好ましくは、サイトカイン受容体ドメインのβ_c鎖サブユニットまた
は、他の受容体における類似の共通鎖であり得る。さらにより好ましくは、該抗
体またはそのフラグメントは、β_c鎖サブユニットのドメイン４のＢ’−Ｃ’ル
ープの一部もしくはサイトカイン受容体の類似の構造に向けられてもよく、また
は、該抗体は、β_c鎖サブユニットのドメイン３もしくはα鎖サブユニットのい
ずれかにおける、Ｔｙｒ４２１もしくは同等の残基、または、Ｔｙｒ４２１もし
くは同等の残基と相互作用するアミノ酸もしくはアミノ酸のグループ、に向けら
れてもよい。該抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはそ
の活性部分であってもよい。

【００６４】 このような抗体を作製する方法は当業者にはよく知られており、それが以下の
ようなステップをさらに含むことは理解されるであろう。すなわち、該方法は、
上述のサイトカイン結合ドメインまたはその一部を有するペプチド分子を動物に
接種するステップと、抗体生産細胞を骨髄腫細胞系と融合するステップと、サイ
トカイン結合ドメインまたはその一部と反応する抗体を生成する細胞系をスクリ
ーニングするステップと、その細胞系から抗体を採取するステップと、高アフィ
ニティ結合の阻害をテストするステップと、機能の阻害または励起をテストする
ステップと、を含む。該方法はさらに、サイトカイン結合ドメインまたはその一
部を結合することのできる上記細胞系によって生成される抗体の小さなフラグメ
ントを作製するステップを含んでもよい。該細胞系は、好都合にはマウス細胞系
であってもよく、また、該方法は、非結合領域におけるマウスの配列をヒトの配
列に置換することによって上記抗体フラグメントを「ヒト化する」、さらなるス
テップを含んでもよい。ヒト化するステップは、当業者に公知のどのような方法
で行なってもよい。

【００６５】 抗体フラグメントは、可変領域の、Ｆａｂフラグメントのような大きい部分で
あってもよく、はるかに小さなフラグメントであってもよい。これらのフラグメ
ントは、別個の分子として使用されてもよく、代替的に、組換え分子の一部を形
成してもよい。後者の場合、組換え分子は、治療の目的で使用される。したがっ
て、たとえば、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の可変領域をコード
する核酸を、適当な発現ベクターにおいて、ヒト起源の非可変領域をコードする
核酸に組換えることによって、「ヒト化する」ことができる。

【００６６】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、サイトカイン結合ドメイ
ンまたはその一部と反応してサイトカインとの結合を競う、抗体に限られるもの
ではない。サイトカイン結合ドメインまたはその一部へのサイトカインの結合を
競うことのできる、合成もしくは天然の化合物または小さな分子を含む他の化合
物もまた、本発明に含まれる。

【００６７】 本発明の別の局面において、サイトカイン関連疾患を予防または治療する方法
が提供される。該方法は、上述の化合物、アゴニストまたはアンタゴニストを有
効量、患者に投与するステップを含む。

【００６８】 該化合物、アゴニストまたはアンタゴニストは、単独で使用してもよく、コル
チコステロイド等の他の治療薬と組合せて使用してもよい。

【００６９】 サイトカイン関連疾患とは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５、または
ＩＬ−４およびＩＬ−１３からなる群のいずれかに関連する疾患であるか、また
は、共通β_c鎖または他の受容体における類似の共通鎖へのサイトカインの結合
を必要とする疾患である。

【００７０】 下の例では、サイトカイン結合ドメインに対する抗体の使用をアンタゴニスト
を例に挙げて説明するが、サイトカインの結合を阻害することのできる他の化合
物もまた同様に適用可能である。

【００７１】 アンタゴニストの効果は、好ましくは、共通β_c鎖または類似の共通鎖に結合
され得るサイトカインのいずれかの、少なくとも１つの機能を遮断することにつ
ながる。これらのアンタゴニストから得られると考えられる利点の１つは、サイ
トカインの１つによって刺激される細胞を修飾するのにそれらを使用することで
あり、さらに、特定的な一例では、サイトカインの活性を修飾することで、好酸
球の機能を含む細胞の機能に大きな影響を与えることが考えられる。したがって
、好ましくは、その活性が、エフェクター細胞の活性化の刺激の阻害につながり
、また、抗体もしくはそのフラグメントが（たとえば）喘息の治療に使用される
場合には、その活性がもっとも好ましくは、ＩＬ−５、ＩＬ−３およびＧＭ−Ｃ
ＳＦまたはＩＬ−４およびＩＬ−１３を媒介とする好酸球の活性化の阻害につな
がる。しかし、好酸球以外の細胞もまた、これらのサイトカインによる刺激の結
果としてヒトおよび動物につらい症状をもたらすエフェクターであることは理解
されるであろう。したがって、そのような刺激の阻害もまた、本発明によって意
図される。そのような細胞としては、その刺激が病気につながるＧＭ−ＣＳＦ、
ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体、またはＩＬ−４およびＩＬ−１３受容体のうち
いずれかまたはすべてを発現させる細胞を含み、例として、白血病細胞、内皮細
胞、乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、小細胞肺ガン細胞、大腸ガン細胞、慢性関節
リウマチ等の慢性炎症のマクロファージ、および、免疫抑制による樹状細胞、が
ある。

【００７２】 好酸球の機能の多種多様のファセットは修飾することができ、たとえば、ＩＬ
−５、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４およびＩＬ−１３を媒介とす
る好酸球の残存が、阻害または遮断される。さらには、ＩＬ−５、ＩＬ−３およ
びＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−４およびＩＬ−１３を媒介とする好酸球の活性化
が、阻害または遮断される。

【００７３】 治療は、病気にかかる危険を減じることで予防的であることが意図され得るが
、症状を緩和または回避するためにも行なわれ得る。治療薬の投与は、製薬上許
容される形であればどのような形で行なわれてもよく、好適な担体に入れられて
もよい。

【００７４】 本発明者は、β_c鎖サブユニットのＢ’−Ｃ’ループの一部またはＴｙｒ４２
１もしくは同等の残基を結合する化合物の構造、および、β_c鎖サブユニットの
ドメイン３またはα鎖サブユニットのいずれかにおいてＴｙｒ４２１または同等
の残基と相互作用するアミノ酸またはアミノ酸のグループが、ＩＬ−３、ＧＭ−
ＣＳＦおよびＩＬ−５またはＩＬ−４およびＩＬ−１３が病原となる、主にアレ
ルギー、喘息、白血病、リンパ腫および、関節炎を含む炎症等の症状を抑えるの
に、治療上有用であり得る。

【００７５】 同様に、他のサイトカイン受容体についても、アンタゴニストまたはアゴニス
トが治療上有用であり得る。

【００７６】 ｇｐ１３０は、それがＩＬ−６、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）およびＩＬ−１１のための信号
トランスデューサおよび共通結合サブユニットであるという点で、ＧＭ−ＣＳＦ
／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体系におけるβ_cと機能的に類似であるため、このサ
イトカイン結合ドメインを標的とすること／遮断することが、ＩＬ−６、ＬＩＦ
、ＯＳＭ、ＣＮＴＦおよびＩＬ−１１の拮抗作用につながることが示唆される。
この受容体系の拮抗作用は、炎症、白血病およびリンパ腫に有用である。ＩＬ−
２Ｒβ／γのアンタゴニストは、免疫抑制薬として有用である。ＬＩＦＲのアン
タゴニストは、子宮内の胚の移植の予防に有用である。ＩＬ−４／ＩＬ−１３の
アンタゴニストは、ＩｇＥの生産を阻害し、喘息およびアレルギーの治療に有用
である。［M. Willis-Karp他（１９９８）］。

【００７７】 ＩＬ−３のアンタゴニストは、アレルギーおよび小胞Ｂ細胞リンパ腫の治療に
有用である。ＩＬ−４のアンタゴニストは、ＩｇＥの生成を阻害し、喘息および
アレルギーの治療に有用である。ＩＬ−６Ｒのアンタゴニストは、抗炎症薬とし
て有用であり、骨髄腫の増殖を阻害するのに使用することができる。ＩＬ−７に
対するアンタゴニストは、免疫抑制薬として有用である。レプチン受容体（ＯＢ
Ｒ）のアンタゴニストは、ＡＩＤＳ、ガンおよび寄生虫性の疾患等の症状におけ
る体重減、悪液質の治療に有用である。

【００７８】 上述のようにＢ’−Ｃ’ループを介してβ_cと結合するアゴニスト因子は、造
血を刺激するのに、また、微生物および寄生虫に対する免疫反応を増進するのに
使用することができる。ＬＩＦＲに結合するアゴニスト因子は、胚幹細胞の分化
を抑えるのに有用である。ＩＬ−２Ｒβに結合するアゴニスト因子は、免疫刺激
に使用することができる。ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３に結合するアゴニスト因子は
、抗腫瘍活性を有し得る。

【００７９】 特定のサブユニットＩＬ−３Ｒに結合するアゴニスト因子は、初期の造血細胞
のインビボおよびエクスビボの増殖に使用することができる。ＩＬ−４Ｒに結合
するアゴニスト因子は、有用な抗腫瘍活性を有し得る。ＩＬ−７Ｒに結合するア
ゴニスト因子は、有用な抗腫瘍免疫を有し得る。ＩＬ−１１に結合するアゴニス
ト因子は、ガン治療への有用な補助薬となり得る。ＥＰＯＲに結合するアゴニス
ト因子は、慢性腎臓疾患の、慢性炎症疾患の、および悪性疾病の貧血を治すのに
使用することができる。ＴＰＯＲに結合するアゴニスト因子は、（慢性炎症疾患
、悪性腫瘍、化学および放射線治療等に関連し得る）血小板減少症を治すのに有
用である。

【００８０】 有用なアゴニストの例として、血液細胞の損失、化学療法、放射線療法、免疫
抑制または骨髄移植の後に血液中の赤血球および血小板を増加させる、エリトロ
ポエチンおよびトロンボポエチンのものが挙げられる。ＯＢＲのアゴニストは、
体重減を促すのに使用することが可能であり、特に、高血圧症、冠状動脈血栓症
および非インスリン依存性糖尿病の要因であると考えられる肥満に、使用するこ
とができる。アゴニストであれアンタゴニストであれ、分子は、上述のようにサ
イトカイン結合ドメインと相互作用することのできるその能力に基づいて、分離
することが可能である。

【００８１】 次に、本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、以下の説明は単に
例示であって、上述の発明の一般性を限定するものと捕らえられてはならない。

【００８２】

【例】

例１−結晶化されたＢＩＯＮ−１−Ｄ４β_c複合体 Ｄ４β_c（Ｎ末端Ｍｅｔを付加した残基３３８〜４３８）を、ｐＥＣ６１１ベ
クターを使用して大腸菌において発現させ、逆相ＨＰＬＣによって精製した。発
現されたタンパク質は不溶性であったが、６Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０中に溶解させることによって大腸菌から回収
することができた。ＨＰＬＣの後、タンパク質を、５ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６
．０に対して十分に透析させた。Ｄ４β_cに対してＢＩＯＮ−１ＭｏＡｂを生じ
させ（Sun, Q. et al (1999)）Blood, 1943）、Ｆａｂフラグメントを生成させ
、標準的な方法によって精製した。ＢＩＯＮ−１ＦａｂおよびＤ４β_cを混合す
ることにより複合体を生じさせ、１：１（モル／モル）の複合体を得た。得られ
た複合体をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（Amersham Pharmacia）ゲル濾過カラムによっ
て精製した。２２℃においてハンギング−ドロップ蒸気拡散法により複合体の結
晶を成長させた。タンパク質溶液（タンパク質の濃度５〜７ｍｇ／ｍｌ）の２μ
ｌ液滴を、１．５μｌの貯蔵溶液と混合し、１２％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリ
コール４０００を含むｐＨ５．５の１００ｍＭクエン酸塩緩衝液からなる１ｍｌ
の貯蔵液に対して平衡化させた。１０日間で到達した結晶の最高サイズは約０．
６ｍｍ×０．２ｍｍ×０．２ｍｍであった。結晶は、Ｐ４₁２₁２の空間群に属し
、その単位胞の大きさは、ａ＝ｂ＝７７．６Å、ｃ＝２９４．９Åであった。結
晶をミクロ操作し、貯蔵緩衝液中において数回洗浄し、ＳＤＳ−トリシンサンプ
ル緩衝液中に溶解させ、ゲル電気泳動を行ない、結晶が無傷の複合体であること
を確認した。結晶は熱に敏感であったため、冷凍が必須であった。しかし、結晶
は脆く、通常使用されている凍結防止剤を配置すると、結晶の劣化が起こった。
そこで、フラッシュ凍結プロトコルを確立し、そこにおいて、結晶を浸漬させて
いる溶液中の２−メチル−２，４−ペンタンジオールの濃度を２分間で５％（ｖ
／ｖ）増加させ、最終的に１５％（ｖ／ｖ）２−メチル−２，４−ペンタンジオ
ールの濃度にした。一連の加工していないデータを、ＲｉｇａｋｕＲＵ−２００
回転アノードジェネレータによって発生させられたＣｕＫａＸ線を使用して、Ｍ
ＡＲＲｅｓｅａｒｃｈイメージングプレートエリア検出器においてインハウスで
単一のフラッシュ凍結結晶から得た。使用した凍結防止剤は１５％ＭＰＤであっ
た。得られた回折データを処理し、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Z. O
twinowskiおよびW. Minor, (1997)）および一連のＣＣＰ４におけるプログラム
（Daresbury Laboratory, UK）を使用して分析した。この処理により、解像度を
３．３Åにセットして１３１４３の固有反射によって構成される９１％完全デー
タが得られた。オーバオールＲ_symは１２．４％であった。多重度は２．５であ
った。（表１の結晶学的分析を参照）。

【００８３】 結晶の構造は、ＡＭｏＲｅ（Navaza, J. (1994)）およびインハウスでの加工
していない一連のデータを用いて分子置換法によって解析した。重複していない
Ｆａｂフラグメントを、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）からダウンロードし
、分子置換サーチプローブとして系統的にテストした。テストした第２番目のサ
ーチプローブ、ＰＤＢアイデンティファイア１ＹＥＣ（Charbonnier, J. B. et
al (1997)）を伴うマウスＦａｂフラグメントがうまくいった。回転関数におけ
る１０番目のピーク（ピークの高さ３．３σ）は、トランスレーション関数にお
いて最も高いピークを形成した（相関係数は２７．９であり、Ｒ_factorは５４．
１％であり、１７．３の相関係数および５７．５％のＲ_factorを有する次に高い
ピークと比較した。統計値によって、Ｐ４₁２₁２が正しい鏡像体空間群であるこ
とがわかった。最初の解析について剛体の改善を施したところ、モデルの相関係
数は２８．７となり、Ｒ_factorは４９．９％となった（解像度の範囲は１０．０
Å〜４．５Å）。複数のＦａｂドメインを別々の剛体として取扱いさらに改善を
行なったところ、統計値はさらによくなった（Ｒ_factorは４６．１％、Ｒ_freeは
５０．９％から４３．８％に低下）。この解析から計算されたマップは、Ｄ４β _c について容易に解釈可能な密度をもたらした。次いでこの複合体のモデルを、
プログラムＯ（Jones, T. A. (1991)）を用いて骨格化地図により構築し、プロ
グラムパッケージＣＮＳ（Brunger, A. T. et al (1998)）における最大見込目
標を用いて改良した。この改良は、加工していない一連のシンクロトロンデータ
を用いて達成した（表１）。最終段階において、バルク解補正および制限された
個々のイソトロピックなＢ係数を適用した。最終的に得られた地図の品質は非常
によく、主鎖の連結において切断はなく、残基の地図への実際の空間適合係数（
Jones，T. A. (1991)）は０．７を下回ることがなかった。最終的なモデルは、
Ｄ４β_cについて残基３３８〜４３８を含み、さらに、Ｆａｂフラグメントにつ
いてのすべての残基、１２４のソルベント分子および１つの炭水化物ユニット、
すなわちＮ−アセチルグルコサミンユニットを含み、ＢＩＯＮ−１の残基Ａｓｎ ^26L が外された。ソルベント分子の選択は保存的であった。それらは、異なる地
図においてｒ．ｍ．ｓ．誤差の３倍よりも大きいシグナルを有するピークとして
現われ、得られる２Ｆ_O−Ｆ_c地図にさらに現われ、少なくとも１つの水素結合性
相互作用に寄与し、かつ８０Ųより小さい温度係数を有するときのみ受入れら
れた。最終的なモデルの立体化学的な質は良好であり（表１）、他の立体化学パ
ラメータ、たとえば側鎖ｃｈｉ角度値、ペプチド結合の平面性、α−炭素の４面
体の歪み、および非結合相互作用は、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Laskowski, R. A. et
al (1993)）によって許容される範囲よりも顕著にすべて良好である。この追跡
の正しさは、残基オミット地図（そこにおいて、モデルの１％が削除され、バイ
アスを減らすためにアニーリングのシミュレーションのラウンドが行なわれ、得
られた地図は削除の領域において検査される）によって裏付けられ、さらに化学
的に不合理な環境において残基がないことを示す０．２を下回らない３Ｄ−１Ｄ
スコア（Luthy, R. et al (1992)）によりさらに裏付けられる。

【００８４】 例２−β_cのα鎖、ドメイン３および４とＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５およびＩＬ
−３との間の複合体のモデル β_c鎖がなぜ３つのすべてのサイトカインを認識するのか知るために、β_cのα
鎖、ドメイン３および４と各サイトカインとの間の複合体のモデルを作った。

【００８５】 モデル化は以下のように進めた。（ｉ）すべての知られたクラス１サイトカイ
ン受容体構造からのサイトカイン結合相同領域（ＣＨＲ）の構造に基づく配列の
整列を行なった。次に、ＧＭ−ＣＳＦα鎖ＣＨＲのアミノ酸配列およびβ_cのド
メイン３のアミノ酸配列を加え、マニュアルにより整列させた。α鎖のＣＨＲお
よびβ_cのドメイン３は、ガイドとしてマルチプル配列アライメントを使用して
ＧＨＲ結晶構造への相同性によって構築した。ループ領域は、ペプチドフラグメ
ントデータベースおよびエネルギ最小化に供されたモデルから構築された。各モ
デルの立体化学的な質はプログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（R. A. Laskowski他(1993
)）によって非常に良好であると判断され、その正しさは、０を下回らない３Ｄ
−１Ｄスコアによって裏付けられた（R. Luthy他(1992)）。（ii）Ｄ４β_cの構
造を、ＧＨＲの対応するドメインに重ね合わせた。（iii）ドメイン３を、他の
クラス１サイトカイン受容体に見られるＬ形状の配向に基づいてドメイン４に繋
げた。この配置は、ＢＩＯＮ−１との一体的な重なりがないことによって裏付け
られた。ＢＩＯＮ−１は、ドメイン３および４、これらのドメインの間の短い２
残基リンカーを含むβ_cのフラグメントを認識するものである。さらに、この配
置は、リガンドが結合されていないｇｐ１３０構造が同じ配向で当該ドメインを
有するという知見によって裏付けられた。（iv）ＧＭ−ＣＳＦ（K. Diederichs
他(1991)）は、開始点としてＧＨＲ複合体構造を使用し、次いですべての利用可
能な突然変異体のデータを使用して相互作用を最適化することにより、マニュア
ルによりその対応するα鎖上に設けた。（ｖ）サイトカインα鎖複合体を、ＧＭ
−ＣＳＦコンポーネントをＧＨＲ複合体のホルモン上に重ね合わせることによっ
て（突然変異データに一致する部位２配向を使用して）モデル化されたβ鎖上に
設けた。（vi）サイトカインとβ鎖との間の接触を最適化するため、Ｄ４β_cに
ついてサイトカインα鎖複合体上でマニュアルにより小さな剛体の調整を行なっ
た。（vi）他のサイトカインＩＬ−３（Y. Feng他(1996)）およびＩＬ−５（M.
V. Milburn他、Nature 363,172 (1993)）を、モデル化された複合体のＧＭ−Ｃ
ＳＦ上に重ね合わせた。（vii）２つのαサブユニット、２つのβサブユニット
および２つのサイトカインモノマーから構成される六量体の複合体を、三量体で
あるαサブユニット／βサブユニット／サイトカインモデルから、２つの三量体
間における適当な２倍様式を想定することにより構築した（正確な２倍の関係か
らの偏差は実際に存在し得るが、大きな偏差は考えられない。というのも、すべ
てのサブユニットが、複合体の形態において膜に埋込まれて存在する膜貫通領域
を有するからである）。生化学データを伴うモデル化により、２つの解が得られ
た。すなわち、膜の表面を見下ろしたとき、第１の三量体に対して、第２の三量
体は、時計方向または反時計方向のいずれかに位置した（図３）。しかし、１つ
の解（図３）のみが、Ｔｙｒ４２１の重要性を説明した。面白いことに、ＧＭ−
ＣＳＦの結晶学的二量体（Walter, M. R.他(1992)）の各モノマーおよびＩＬ−
５共有結合二量体（M. V. Milburn他(1993)）の各モノマーは、好ましい複合体
モデルにおいて各α鎖に結合する。

【００８６】 得られたモデルは次のようなことを明らかにする。（ｉ）α鎖相同モデルの膜
に隣接するドメインは、１５Å×８Åのサイズの長く延びた疎水性表面パッチを
有する。このパッチに主に寄与するものは、Ｖａｌ２２４、Ｖａｌ２２６、Ｃｙ
ｓ２２８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１５およびＧｌｙ３１６（ＧＭ−ＣＳＦα鎖
による番号付け）である。これらの残基のほとんどが、異なる受容体および異な
る種からのα鎖において保存されている（データは示さず）。（ii）α鎖の疎水
性パッチは、Ｄ４β_cのＨ１パッチに十分近く、これら２つの間の相互作用が考
えられる。しかし、相互作用領域は小さい可能性が高く、サイトカインが存在し
ないときにはほとんどまたは全く二量体の形成が見られないということを示すデ
ータに合っている（Woodcock, J.M.他（1997））。ＧＨＲの対応するＨ１パッチ
も、サブユニットの接触に必要である（DeVos, A.M.他（1992））。各サイトカ
インとＢ′−Ｃ′ループとの間には多数の相互作用が存在する。重要なのは、Ｔ
ｙｒ３６５、Ｈｉｓ３６７およびＩｌｅ３６８の側鎖が、それらの先端で近接し
て集まるサイトカイン結合３つ組を形成して、ピボット点を形成し、それに３つ
すべてのサイトカインが必須のグルタメートを介して結合することである（ＧＭ
−ＣＳＦのＧｌｕ２１、ＩＬ−３のＧｌｕ２２およびＩＬ−５のＧｌｕ１３）（
Hercus, T.R. et al.（1994））。これらの観察は、Ｔｙｒ３６５、Ｈｉｓ３６
７およびＩｌｅ３６８が重要なＧＭ−ＣＳＦ結合決定基であることを示す突然変
異誘発データと矛盾しない（Lock, P. et al.（1994））。驚くべきことに、Ｔ
ｙｒ４２１、すなわち、高アフィニティ結合に含まれるＦ′−Ｇ′ループの唯一
の残基は（Woodcock, J.M. et al（1996））、結晶構造中のサイトカイン結合部
位から離れる向きにされる（図１Ａ）。また生化学データが示すのは、Ｔｙｒ４
２１ Ｐｈｅ突然変異は細胞質ドメインのホスホリル化に対して大きな影響を有
するが、Ｂ′−Ｃ′ループ中の突然変異はわずかな影響しか有しないことである
（図２）。この残基の決定的な役割に関する説明は、結晶構造と、α、βヘテロ
二量体が高次の複合体として存在する（Lia, F. et al.（1996）, Stomski, F.C
. et al（1998））という観察とから来ている。ＧＭ−ＣＳＦ受容体複合体中の
ジスルフィド架橋の場所に基づいて（Stomski, F.C. et al.（1998））かつ同様
の六量体の複合体を形成することを示されたＩＬ−６受容体系への類似性により
、２つのα鎖、２つのβ鎖および２つのサイトカインのヘテロ六量体の複合体が
提案された（Ward, L.D. et al.（1994））。我々は六量体の複合体をモデル化
しかつ、Ｔｙｒ４２１が複合体の第２のα鎖と相互作用するための理想的な位置
にあることを見出す（図３）。

【００８７】 モノクローナル抗体アンタゴニストＢＩＯＮ−１は、受容体ドメインと広範な
かつ密接な相互作用を形成する（図４および表２）。複合体形成上に埋め込まれ
た合計表面積は１，５００Ųであり、これは、他の抗体−タンパク質抗原複合
体について報告された範囲にある（Davies, D.R.およびCohen G.H.（1996））。
合計で、２塩橋、８水素結合相互作用および８６ファンデルワールス（ｖｄｗ）
相互作用が存在する。

【００８８】 接触面は、Ｖ_Hからの９つの残基およびＶ_Lからの６つの残基とともに、ＢＩＯ
Ｎ−１からの１５の残基からなる。接触の大部分は、４つのＣＤＲ、すなわち、
ＣＤＲ Ｌ１（１水素結合および２４ｖｄｗ接触）、ＣＤＲ Ｌ３（１塩橋、３
水素結合および２０ｖｄｗ接触）、ＣＤＲ Ｈ１（１塩橋、３水素結合および１
８ｖｄｗ接触）およびＣＤＲ Ｈ３（１水素結合および１５ｖｄｗ接触）の間で
大まかに共有される。さらに、ＣＤＲ Ｈ２は、多数の接触を与えるが（９ｖｄ
ｗ接触）、ＣＤＲ Ｌ２は受容体ドメインとは接触しない。モデル化が示唆する
のは、ＣＤＲ Ｌ２が無傷のｂ鎖のドメイン３と相互作用することである。合計
で、（残基３６２と３６８との間の）Ｂ′−Ｃ′ループからの６つの残基および
（残基４１６と４２２との間の）Ｆ′−Ｇ′ループからの４つの残基が抗体相互
作用に関係する。Ｂ′−Ｃ′ループは、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１および
Ｌ３と相互作用し、一方、Ｆ′−Ｇ′ループは、ＣＤＲ Ｈ３およびＬ１としか
相互作用しない。Ｂ′−Ｃ′ループと抗体との間の特定の極性相互作用は以下の
とおりである。Ｌｙｓ３６２がＡｓｐ９４Ｌへの塩橋を形成し、Ｇｌｕ３６６が
Ｌｙｓ３５Ｈへの塩橋を形成しかつ、以下の残基が潜在的な水素結合相互作用を
形成する。それらはすなわち、Ａｒｇ３６４およびＴｙｒ３３Ｈ、Ａｒｇ３６４
（主鎖）およびＴｙｒ３３Ｈ、Ｔｙｒ３６５およびＧｌｕ９３Ｌ（主鎖）、Ｔｙ
ｒ３６５およびＡｓｐ９４Ｌ、Ｇｌｕ３６６およびＴｙｒ３３Ｈ（主鎖）、Ｈｉ
ｓ３６７およびＡｓｎ９１Ｌ（主鎖）である。Ｆ′−Ｇ′に関係する２つの潜在
的な水素結合相互作用が存在する。すなわち、Ｔｈｒ４１６およびＴｙｒ２８Ｌ
、Ａｒｇ４１８およびＧｌｙ９６ａＨ（主鎖）である。抗体−抗原界面には、９
．９ųの小さな穴が１つ存在する。穴は、受容体の残基Ｔｙｒ３６５、Ｈｉｓ
３６７およびＩｌｅ３６８と、抗体Ｌ鎖のＶａｌ２７、Ｔｙｒ２８、Ｐｈｅ３２
およびＡｓｎ９２により、まっすぐ延びる。

【００８９】 Ｄ４β_cのＢ′−Ｃ′ループは、Ｖ_HおよびＶ_Lドメイン間の浅い抗体結合溝の
中に横たわり、一方、Ｆ′−Ｇ′ループは、ＢＩＯＮ−１のＣＤＲ Ｌ１とのよ
り周辺の相互作用を形成する。Ｂ′−Ｃ′ループからの相互作用がＢＩＯＮ−１
とのＤ４β_cの相互作用合計の７５％を占める。特に留意すべきなのは、ＢＩＯ
Ｎ−１からの芳香族残基ならびに受容体のＴｙｒ３６５およびＨｉｓ３６７に関
係する数多くの芳香族性相互作用である（図４および表２）。これらのタイプの
相互作用は、抗体複合部位での共通の特徴である。

【００９０】 ＢＩＯＮ−１によって認識されるＤ４β_cのエピトープは、サイトカインと相
互作用する表面と大きく重なる。さらに、ＢＩＯＮ−１は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ
−３／ＩＬ−５により誘導されるインビトロでの好酸球の増殖を阻止し、いくつ
かのサイトカインの単一の分子アンタゴニストの可能性を強調する。アレルギー
性炎症および癌において、このマルチヒットアプローチが有用と判明するかもし
れず、ここでは２つ以上のサイトカインがこれらの病気としばしば関連付けられ
る。ここに提示された構造は、新しい治療の設計に対する多数の可能性を提供す
る。（ｉ）無傷のβ鎖に対するＢＩＯＮ−１のアフィニティは、高アフィニティ
サイトカイン結合の０．１ｎＭに対して、５０ｎＭである。この構造は、より高
いアフィニティ抗体または、ＢＩＯＮ−１からの主な寄与ＣＤＲの環化された突
然変異体などの、対応する小さな分子類似体を工作する機会を提供する。（ｉｉ
）サイトカイン結合界面での溝の存在は、小さな分子アンタゴニストの設計にと
っては魅力ある部位である。（ｉｉｉ）臨界サブユニット界面でのＴｙｒ４２１
の場所は、構造ベースの阻害剤の設計に別の明確なターゲットを提供する。

【００９１】 例３ − Ｂ−ＣループおよびＴｙｒ⁴²¹の機能的役割 Ｄ４β_Cの構造は、Ｔｙｒ⁴²¹がサイトカイン結合に関係するＢ−Ｃループにお
ける３つの残基（Ｔｙｒ³⁶⁵，Ｈｉｓ³⁶⁷＆Ｉｌｅ³⁶⁸）に極めて接近しているこ
とを明らかにしたが、その側鎖は異なる機能的役割を反映するこれらの可能性の
方に向いてはいない。これまでの実験において、ＩＬ−３の高アフィニティ結合
はＴｙｒ⁴²¹の突然変異に対しては感受性を有するが（Woodcock, J.M.（1996）
）、Ｂ−Ｃループの個々の残基のリプレイスメントに対しては感受性を有さない
ことが示唆された（Woodcock, J.M. et al.（1994））。我々は、ＧＭ−ＣＳＦ
およびＩＬ−５を結合する際に結び付けられる残基のＢ−Ｃループにおける多重
突然変異がＩＬ−３高アフィニティ結合に影響を及ぼすかどうかを調べた。この
結果、（図６Ａにあるように）Ｂ−Ｃループにおける残基３６５−３６８のアラ
ニン置換によりＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の両方の高アフィニティ結合が排除
されることが示された。我々は、次に、細胞質チロシン残基のホスホリル化を調
べた。これはリガンド／α−鎖複合体に対するβ_Cの補充における非常に感度の
高い尺度であるからである。サイトカインがα−鎖単独のそれ以下であるためα
／β複合体のアフィニティゆえにアフィニティ変換できないβ_Cの類似体は、そ
れにもかかわらず、チロシンホスホリル化において差異を呈するかもしれない。
我々は、ＩＬ−３に応答してチロシンホスホリル化を受けるβ_cの能力に対する
Ｂ−ＣループまたはＴｙｒ⁴²¹の突然変異の影響を、別々にまたは組合せて調べ
、その結果、Ｔｙｒ⁴²¹の置換は明らかな効果を有し、高レベルのβ_Cのチロシン
ホスホリル化は３μＭのＩＬ−３、つまり元の受容体が必要とする（６ｎＭ）よ
りも約５００倍高い濃度においてのみ達成されることを発見した。一方、Ｂ−Ｃ
ループ単独の突然変異は、用いられる高い濃度では、ＩＬ−３により誘導される
β_Cのホスホリル化を損なわなかった。それにもかかわらず、β_C活性化における
Ｂ−Ｃループに対する役割は、ＩＬ−３に誘導されるβ_Cのチロシンホスホリル
化を排除するＢ−ＣループおよびＴｙｒ⁴²¹の複合化された突然変異体により示
された（図６Ｂ）。

【００９２】 例４ − β_c活性化ドメインとのアンタゴニスト相互作用 ＢＩＯＮ−１／Ｄ４β_C複合体の構造の詳細な分析により、これらの観察は、
ＢＩＯＮ−１が受容体活性化ドメインとの拡張的かつ密接な相互作用をなすと見
られて、確認されさらに広がった（図１Ａ、Ｂおよび７）。複合体形成上に埋め
込まれた全表面領域は１，５００Ųであり、これは他の抗体−プロテイン抗原
複合体に対して報告された範囲内にあるものである（Davies, D.R.およびCohen,
G.H.（1996））。全体として、２つの塩橋（Ｌｙｓ³⁶²／Ａｓｐ^L94およびＧｌ
ｕ³⁶⁶／Ｌｙｓ^H35）、８つの潜在的な水素結合、および１２４のファンデルワー
ルス（ｖｄｗ）相互作用がある（表２）。Ｄ４β_CのＢ−ＣループはＶ_Hドメイン
とＶ_Lドメインとの間の狭い抗原結合溝に横たわり、一方、Ｆ−ＧループはＢＩ
ＯＮ−１のＣＤＲ Ｌ１とのより周縁における相互作用をなす（図１Ａ、Ｂおよ
び７）。その接触表面はＶ_Hからの９つの残基およびＶ_Lからの５つの残基でＢＩ
ＯＮ−１からの１４の残基を含む。これら接触の大部分はＣＤＲのうちの４つ：
ＣＤＲ Ｌ１（１つの水素結合と２９のｖｄｗ接触）；ＣＤＲ Ｌ３（１つの塩
橋、３つの水素結合および２８のｖｄｗ接触）；ＣＤＲ Ｈ１（１つの塩橋、３
つの水素結合および３６のｖｄｗ接触）；ＣＤＲ Ｈ３（１つの水素結合および
２３のｖｄｗ接触）間にて大まかに共有される。さらに、ＣＤＲ Ｈ２によって
ある数の接触（８つのｖｄｗ接触）が与えられるが、ＣＤＲ Ｌ２は受容体ドメ
インとは全く接触をなさない。全体として、Ｄ４β_CのＢ−Ｃループからの６つ
の残基（残基３６２と３６８との間）とＦ−Ｇループからの３つの残基（残基４
１６と４２２との間）とが、全体の７５％を占めるＢ−Ｃループからのそれらと
の抗体相互作用に関係する。Ｂ−ＣループはＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１お
よびＬ３と相互作用し、一方、Ｆ−ＧループはＣＤＲ Ｈ３およびｌ１とのみ相
互作用する（図４）。抗体−抗原界面には９．９ųの１個の小さな穴が存在す
る。この穴は受容体の残基Ｔｙｒ³⁶⁵、Ｈｉｓ³⁶⁷およびＩｌｅ³⁶⁸ならびに抗体
Ｌ鎖のＶａｌ²⁷、Ｔｙｒ²⁸、Ｐｈｅ³²およびＡｓｎ⁹²によって区画される。上に
同定された潜在的な塩橋および水素結合のすべてが複合体形成に生産的に貢献す
る可能性があるわけではなく、というのも、置換分析では、Ｄ４β_CにおけるＧ
ｌｕ³⁶⁶のＡｒｇ⁴¹⁸およびＭｅｔ³⁶³またはＡｒｇ³⁶⁴がＢＩＯＮ−１の結合のた
めのエピトープに貢献するとして同定されたにすぎないからである（Sun. Q. et
al.（1999）Blood, 1943）（表２）。

【００９３】 最後に、さまざまな他の修正および／または変形がここに記載された本発明の
精神から逸脱することなくなされてもよいことを理解されたい。

【００９４】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｄ４β_cの構造を示す。（Ａ） Ｆａｂ／受容体β_cドメイン４（
Ｄ４β_c）複合体は、リボンで表わされている。ＭｏＡｂのＨ鎖は、ダークグレ
ーで示され、Ｌ鎖および受容体はライトグレーで示される。Ｄ４β_cの主要な構
造の特徴は、標識され、重要な残基の位置は、棒で示されている。これらの図は
、Molscript（Kraulis, 1991）およびRaster３Ｄ（MerrittおよびMurphy, 1994
）を使用して作製した。（Ｂ）（Ａ）を垂直軸について９０°回転させた構造を
示している。（Ｃ）プログラムＧＲＡＳＰ³⁵を使用して受容体の表面を表わした
ものである。黒く塗り潰された表面は、疎水性／芳香族性パッチＨ１の位置を示
している。当該分子は、（Ａ）に対して反時計方向に約２０°傾いている。（Ｄ
）（Ｃ）に関して作製した疎水性／芳香族性パッチＨ２を示すものである。当該
分子は、（Ｂ）に対して、垂直軸について、以上に示したものから時計方向に約
２０°傾けられ、時計方向に約６０°回転されている。

【図２】 Ｔｒｐ／Ａｒｇ「ラダー」（はしご）を示すものである。Ｄ４β _c の構造はリボンで示されており、Ｔｒｐ／Ａｒｇの側鎖の重なりは、球と棒に
よって示されている。この分子構造を示す図は、Molscript（Kraulis, 1991）お
よびRaster３Ｄ（MerrittおよびMurphy, 1994）を使用して作製した。

【図３】 六量体のＧＭ−ＣＳＦ受容体複合体モデルの表面を示したもので
あり、（Ａ）は側面から見たもの、（Ｂ）は上から見たものである。α鎖は、赤
で示され、β鎖は黄色で示され、各ＧＭ−ＣＳＦモノマーは、マゼンタおよびシ
アンで示される。

【図４】 抗体（ＢＩＯＮ−１）とＤ４β_cとの間の相互作用および界面を
示している。

【図５】 立体的に見た２Ｆ_obs−Ｆ_calc電子密度地図を示しており、受容
体の重要な領域を示すものである。この地図は、最終的なモデルから計算された
ものであり、１σで輪郭が描かれている。（Ａ）はＢ′−Ｃ′ループ示しており
、（Ｂ）は伸長されたＷＳＸＷＳボックスである。

【図６】 受容体活性化におけるＢ−Ｃループおよび／またはＦ−Ｇループ
のＴｙｒ⁴²¹を突然変異させたことによる示差的効果を示している。（Ａ）野生
型β_c（Ｅ）または³⁶⁵ＡＡＡＡ³⁶⁸突然変異体β_cでトランスフェクションされた
細胞に結合する¹²⁵Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦおよび¹²⁵Ｉ−ＩＬ−３について結合等温線
のスキャッチャードトランスフォーメーションを示している。（Ｂ）種々の濃度
のＩＬ−３で刺激した後の野生型および突然変異β_cのウエスタンブロットを示
している。このブロットは、ホスホチロシン（上のパネル）およびβ_c（下のパ
ネル）について行なわれた。ゲルの各レーンにおける二重のバンドは、β_cのグ
リコシル化変異体を表わしている（Woodcock, J. M. et al（1997）Blood 90:30
05）。

【図７】 Ｄ４β_cとＧＨＲの膜に近いドメインとを比較した結果を示すも
のである。Ｄ４β_cと、ＧＨのヘリックスＡ／ヘリックスＣ面と相互作用するＧ
ＨＲのサブユニットのドメイン２は、それらのコア残基を介して整列した構造を
とった。それらの表面は、プログラムInsightll（ＭＳＩ）を使用して表わされ
ている。Ｄ４β_cの疎水性／芳香族性パッチＨ２および対向する受容体分子と相
互作用するＧＨＲの部位の位置は、黒く塗られた表面で示されており、さらに丸
で囲まれ、「受容体界面残基」の表示がつけられている。ＧＨと相互作用するこ
とが知られている領域を示すＤ４β_cの黒く塗られた表面は、丸で囲まれ、「リ
ガンド結合残基」の表示がつけられている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 19/02 29/00 29/00 35/00 35/00 35/02 35/02 37/04 37/04 37/06 37/06 37/08 37/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/566 33/566 (31)優先権主張番号 ＰＱ ０２６４ (32)優先日 平成11年５月11日(1999．5．11) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウッドコック，ジョアンナ・メイ オーストラリア、5152 サウス・オースト ラリア、クラファーズ、エメット・ロー ド、74 (72)発明者 パーカー，マイケル・ウィリアム オーストラリア、3015 ビクトリア、ニュ ーポート、ファーム・ストリート、73 (72)発明者 ロペス，エンジェル・フランシスコ オーストラリア、5081 サウス・オースト ラリア、メディンディ、アーサー・ストリ ート、15 (72)発明者 バグリー，クリストファー・ジェームズ オーストラリア、5063 サウス・オースト ラリア、フラートン、クレモーン・ストリ ート、22 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB03 4C084 AA01 NA14 ZA552 ZA592 ZB082 ZB092 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB272 4C085 AA11 AA14 BB17 CC23 EE01 4H045 AA10 CA40 DA51 EA22

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１つのサイトカインに結合し、かつ単一のサイト
   カイン受容体を介してサイトカインシグナルを変換することができるサイトカイ
   ン結合ドメインまたはその部分であって、 前記ドメインは、サイトカイン受容体のβ_c鎖のドメイン４のＢ’−Ｃ’ルー
   プの部分またはその類似構造物からなる、サイトカイン結合ドメインまたはその
   部分。
2. 【請求項２】 ドメイン４のＢ’−Ｃ’ループの部分およびＢ’−Ｃ’、Ｆ
   ’−Ｇ’ループおよびドメイン４のＮ末端部によって画定される溝からなる、請
   求項１に記載のサイトカイン結合ドメイン。
3. 【請求項３】 サイトカインの高アフィニティ結合を可能にするため、α鎖
   サブユニットまたはβ_c鎖サブユニットのドメイン３と相互作用することができ
   るチロシン残基をさらに含む、請求項１または２に記載のサイトカイン結合ドメ
   イン。
4. 【請求項４】 前記チロシンは、Ｔｙｒ４２１または類似の共通シグナル発
   生構造の等価な残基である、請求項３に記載のサイトカイン結合ドメイン。
5. 【請求項５】 前記ドメイン４のＢ’−Ｃ’ループは、タイプＩβ−ターン
   を形成する残基３６５〜３６８からなるか、または類似の共通シグナル発生構造
   における類似の構造物からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトカ
   イン結合ドメイン。
6. 【請求項６】 少なくとも１つのサイトカインに結合する前記β_cの結合ド
   メインまたはその部分は、Ｌｙｓ３６２、Ｔｙｒ３６５、Ｈｉｓ３６７、Ｉｌｅ
   ３６８、Ａｒｇ４１８、Ｇｌｙ４２０、Ａｓｎ４２２、Ｔｈｒ４１６、Ｉｌｅ３
   ３８、Ｇｌｎ３３９、Ｍｅｔ３４０およびＭｅｔ３６１を含む残基の任意の１つ
   またはサイトカイン受容体の類似する共通シグナル発生構造における等価な残基
   によって区切られる領域によって画定される、請求項１〜５のいずれか１項に記
   載のサイトカイン結合ドメイン。
7. 【請求項７】 前記ドメイン４のＢ’−Ｃ’ループは、Ｔｙｒ３６５、Ｉｌ
   ｅ３６８およびＨｉｓ３６７を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のサイ
   トカイン結合ドメイン。
8. 【請求項８】 ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−４お
   よびＩＬ−１３を含む群から選択される少なくとも２つのサイトカインに結合す
   るものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のサイトカイン結合ドメイン
   。
9. 【請求項９】 前記共通β_c鎖またはサイトカイン受容体の類似構造物は、
   ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体、共通ＩＬ−２受容体γ鎖（ＩＬ
   −２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−１５受容体によって共有され
   る）およびｇｐ１３０（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、毛様体神経栄養因子、
   オンコスタチンＭおよびカルジオトロフィン受容体によって共有される）の任意
   の１つから得られるものであるか、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ
   −４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−３Ｒα、ＥＰＯＲ、ＴＰＯＲおよ
   びＯＢＲよりなる群を含むサイトカインスーパーファミリー受容体の任意の１つ
   から得られるか、または、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、プロラクチン受容体
   （ＰＲＬＲ）、エリトロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）、Ｇ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−
   ＣＳＦＲ）およびｇｐ１３０を含む群から選択される関連する（クラス１）サイ
   トカイン受容体構造から選択されるものである、請求項１〜８のいずれか１項に
   記載のサイトカイン結合ドメイン。
10. 【請求項１０】 前記共通β_c鎖は、ＩＬ−５、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳ
    Ｆ受容体から得られるものである、請求項９に記載のサイトカイン結合ドメイン
    。
11. 【請求項１１】 前記Ｆ’−Ｇ’ループは、ドメイン４においてその先端に
    タイプＩＶβターンをとり、かつ残基Ａｒｇ４１８およびＴｙｒ４２１を含むも
    のである、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のサイトカイン結合ドメイン。
12. 【請求項１２】 サイトカインアゴニスト活性またはサイトカインアンタゴ
    ニスト活性を有する化合物を識別する方法であって、 サイトカインアゴニストおよび／またはサイトカインアンタゴニストとして可
    能性のある化合物を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のサイトカイン結合
    ドメインまたはその部分に供すること、および 前記化合物のサイトカイン活性に対するアゴニスト反応またはアンタゴニスト
    反応の存在を測定すること を含む、方法。
13. 【請求項１３】 サイトカインアンタゴニスト活性を有する化合物を識別す
    る方法であって、 可能性のあるサイトカインアンタゴニストを、請求項１〜１１のいずれか１項
    に記載のサイトカイン結合ドメインまたはその部分に供すること、および 前記サイトカイン結合ドメインに結合した化合物を同定すること（そこにおい
    て、前記化合物はサイトカインの活性に対してアンタゴニスト反応を有するもの
    である） を含む、方法。
14. 【請求項１４】 前記サイトカインは、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−Ｃ
    ＳＦまたはＩＬ−４およびＩＬ−１３を含む群から選択されるものであり、アゴ
    ニストまたはアンタゴニストの存在は、ＩＬ−３、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦ
    、ＩＬ−４、ＩＬ−１３反応を活性化するか阻害するアゴニストまたはアンタゴ
    ニストの能力によって測定される、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記サイトカインアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｔ
    ｙｒ４２１またはサイトカイン受容体の共通シグナル発生ユニットの等価な残基
    にさらに結合する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法によって識
    別されるサイトカインアゴニストまたはアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のサイトカイン結合
    ドメインに対する抗体またはそのフラグメント。
18. 【請求項１８】 Ｇｌｎ３４０、Ｉｌｅ３３８およびＭｅｔ３６１を含む群
    より選択される残基の任意の１つまたはサイトカイン受容体の共通シグナル発生
    ユニットの等価な残基に対して突然変異が誘導されている、請求項１〜１１のい
    ずれか１項に記載の突然変異サイトカイン結合ドメイン。
19. 【請求項１９】 請求項１６または１７に記載の抗体、アゴニストまたはア
    ンタゴニストの有効量を対象に投与することを含む、サイトカイン関連疾患を予
    防または治療する方法。
20. 【請求項２０】 前記サイトカイン関連疾患が、好酸球の機能の残存または
    活性化、喘息、白血病、乳癌、前立腺癌、小細胞肺癌、大腸癌、慢性関節リウマ
    チを含む慢性の炎症、免疫抑制、アレルギー、リンパ腫、および悪液質を含む群
    から選択されるものであり、請求項１６または１７に記載のアンタゴニストまた
    は抗体を投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記サイトカイン関連疾患は、アレルギー性炎症であり、
    かつ前記アンタゴニストは、ＩＬ−５、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦのいずれか
    １つのＩＬ−５、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合を阻害するもので
    ある、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記アレルギー性炎症は喘息をもたらすものである、請求
    項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記サイトカイン関連疾患は、造血、免疫応答の促進、胚
    幹細胞分化の抑制、免疫刺激、抗腫瘍活性、初期造血細胞の増殖、貧血、血小板
    減少症の矯正を含む群から選択されるものであり、請求項１６に記載のアゴニス
    トを投与することを含む、請求項１９に記載の方法。