JP2002538175A - 催吐活性に関するアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ４型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）のインヒビターにおける催吐活性に関するアッセイを開示する。該アッセイは、（Ａ）麻酔作用を引き起こすのに十分な量の麻酔化合物を試験哺乳動物に投与し、（Ｂ）ＰＤＥ４阻害活性を有する試験化合物を該試験哺乳動物に投与し、（Ｃ）該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動物を観察し、（Ｄ）その麻酔された試験哺乳動物において観察された麻酔作用の変化を標準体と相関させることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本発明は、４型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）インヒビターとして有用な
試験化合物の催吐活性を検出するためのアッセイに関する。そのような化合物は
、重要な生物活性を有し、喘息ならびに他の炎症性疾患および状態の治療または
予防に使用することができる（Ｈａｒｂｉｎｓｏｎら，１９９７；Ｋａｒｌｓｓ
ｏｎおよびＡｌｄｏｕｓ，１９９７；Ｓｉｌｖｅｓｔｒｅら，１９９８；Ｎｉｅ
ｍａｎら，１９９８；ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＳｈａｄｉｄ，１９９４）。し
かし、これらの物質はヒトおよび種々の動物種において嘔吐を引き起こすことが
公知である（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｅら，１９９８；Ｍｕｒｄｏｃｈら，１９９８；
Ｒｏｂｉｃｈａｕｄら，１９９８；ＨｅａｓｌｉｐおよびＥｖａｎｓ，１９９５
；Ｈｕｍｐｅｌら，１９８６；ＨｏｒｏｗｓｋｉおよびＳａｓｔｒｅ−ｙ−Ｈｅ
ｒｎａｎｄｅｚ，１９８５）。この衰弱性副作用は、この新規クラスの薬物の治
療的潜在性を著しく損なう。

【０００２】 したがって、本発明の１つの目的は、ＰＤＥ４インヒビターの嘔吐誘発メカニ
ズムを解明することであった。

【０００３】 もう１つの目的は、信頼しうる嘔吐に関するアッセイを提供することであった
。

【０００４】 より詳しくは、本発明の目的は、ＰＤＥ４インヒビターにより誘発される嘔吐
におけるノルアドレナリン作動性神経系の関与を調べ、これらの化合物の催吐活
性に関するアッセイを提供することであった。

【０００５】 さらに、このアッセイは、試験化合物の作用部位の同定に特に有用である。

【０００６】 本発明の１つの態様においては、本アッセイは、大脳および／または末梢作用
部位において活性を有する試験化合物の同定に有用である。したがって、それは
、血液脳関門を通過しうる試験化合物の選択に有用に適用される。

【０００７】 これらの及び他の目的は、本明細書に記載する教示から当業者に明らかとなる
であろう。

【０００８】 （発明の概要） 本発明は、 （Ａ）麻酔作用を引き起こすのに十分な量の麻酔化合物を試験哺乳動物に投与
し、 （Ｂ）ＰＤＥ４阻害活性を有する試験化合物を該試験哺乳動物に投与し、 （Ｃ）該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動物を観察し、 （Ｄ）その麻酔された試験哺乳動物において観察された麻酔作用の変化を標準
体と相関させることを含んでなる、ＰＤＥ４阻害性化合物の催吐活性に関するア
ッセイを含む。

【０００９】 （図面の簡単な記載） 本発明は、以下に説明する図面に関連づけて例示されている。

【００１０】 図１は、ラットにおけるキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）／ケタミン（１０ｍｇ
／ｋｇ）での麻酔の持続時間に対するＰＤＥ４インヒビターの効果のグラフであ
る。麻酔の誘導の１５分後、□ビヒクル（６０％ ＰＥＧ−２００、ｎ＝１４）
、■ＲＳ−１４２０３、○Ｒ−ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）、●Ｓ−ロリプ
ラムまたは△ＣＴ−２４５０をラットに注射した。麻酔の持続時間を、立ち直り
反射の戻りにより評価した。データは、動物４〜９匹／用量を試験した場合の平
均±ＳＥＭとして表されている。^＊は、ｐ＜０．０５におけるビヒクル群からの
統計差を示す（分散分析（ＡＮＯＶＡ））。

【００１１】 図２は、ラットにおけるキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）／ケタミン（１０ｍｇ
／ｋｇ）での麻酔の持続時間に対するα−２アドレナリン受容体アンタゴニスト
ＭＫ−９１２およびＭＫ−４６７の効果のグラフである。麻酔の誘導の１５分後
、Ａ．ＭＫ−９１２、Ｂ．ＭＫ−４６７をラットに注射した。麻酔の持続時間を
、立ち直り反射の戻りにより評価した。ＭＫ−９１２およびＭＫ−４６７に使用
したビヒクルは６０％ ＰＥＧ−２００であった。結果は、ＭＫ−９１２で処理
した動物が、低用量で短い横臥持続時間を有することを示している。ＭＫ−４６
７での該動物の処理は、高用量であっても、ビヒクル処理動物との比較において
横臥時間に影響を及ぼしていない。データは、平均±ＳＥＭとして表されている
。^＊は、ｐ＜０．０５におけるビヒクル群からの統計差を示す（ＡＮＯＶＡ）。

【００１２】 （詳細な記載） ＰＤＥ４インヒビターとして公知の化合物における最も一般的な副作用は嘔吐
であると認識されている。本発明は、この特定の薬物クラスの催吐作用と良く相
関するアッセイを提供する。

【００１３】 本発明の１つの態様においては、 （Ａ）麻酔作用を引き起こすのに十分な量の麻酔化合物を試験哺乳動物に投与
し、 （Ｂ）ＰＤＥ４阻害活性を有する試験化合物を該試験哺乳動物に投与し、 （Ｃ）該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動物を観察し、 （Ｄ）その麻酔された試験哺乳動物において観察された麻酔作用の変化を標準
体と相関させることを含んでなる、ＰＤＥ４阻害性化合物の催吐活性に関するア
ッセイを開示する。

【００１４】 本発明のもう１つの態様においては、麻酔作用を引き起こすのに十分な量で該
試験哺乳動物に投与する麻酔化合物が、キシラジン、メデトミジン（ｍｅｄｅｔ
ｏｍｉｄｉｎｅ）、デクスメデトミジン（ｄｅｘｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ）、
デトミジン（ｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ）およびクロニジンよりなる群から選ばれる
α−２アドレナリン受容体アゴニスト化合物であるアッセイを開示する。

【００１５】 本発明のもう１つの態様においては、ケタミン、フェンシクリジンおよびチレ
タミンよりなる群から選ばれる麻酔薬と共に該麻酔性α−２アゴニスト化合物を
投与するアッセイを開示する。

【００１６】 本発明のもう１つの態様においては、該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動
物を観察するステップが、該試験哺乳動物を背部横臥（ｄｏｒｓａｌ ｒｅｃｕ
ｍｂｅｎｃｙ；うつ伏せ）で配置し立ち直り反射の回復に関して観察することを
含むアッセイを開示する。本発明で用いる背部横臥の持続時間は、立ち直り反射
の回復のための時間と同意義である。

【００１７】 本発明のもう１つの態様においては、該立ち直り反射の回復を、該試験ＰＤＥ
４阻害性化合物の嘔吐誘発傾向と相関させるアッセイを開示する。

【００１８】 本発明のもう１つの態様においては、該試験哺乳動物が、ラット、マウスおよ
びフェレットよりなる群から選ばれるアッセイを開示する。

【００１９】 本明細書に記載のとおり、α２アドレナリン受容体アゴニスト麻酔薬の麻酔作
用のモジュレーションとＰＤＥ４インヒビターの催吐作用との間には良好な相関
性が存在する。

【００２０】 ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物の具体例は、１９９８年１月２０日付けで付
与された米国特許第５，７１０，１６０号および第５，７１０，１７０号、米国
特許第５，６０８，０７０号、１９９７年４月２２日付けで付与された米国特許
第５，６３２，９７７号、および１９９８年９月２８日付けで出願された米国特
許出願第０９／１６３，０３３号（それらのすべての全体を参照により本明細書
に組み入れることとする）に記載されている。

【００２１】 ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）ＲＳ１４２０３およびＣＴ−２４５０は公知
ＰＤＥ４阻害性化合物である。それらの構造を以下に示す。

【００２２】

【化１】

【００２３】 ＭＫ−９１２およびＭＫ−４６７は以下の構造を有する。

【００２４】

【化２】

【００２５】 本発明で用いる、非ヒト哺乳動物における「催吐活性」は、悪心、嘔吐、過剰
唾液分泌、換気亢進、むかつき及び口での引っ掻きを意味する。ヒトにおいては
、これは、悪心、嘔吐、吐き気など意味する。

【００２６】 クロニジンは、一般には麻酔薬として作用しない公知α２アドレナリン受容体
アゴニストである。その代わりに、それは抗高血圧薬として作用する。キシラジ
ンは、もう１つの公知α２アドレナリン受容体アゴニストであり、麻酔薬として
獣医学において有用である。

【００２７】 より弱い催吐活性を有するＰＤＥ４インヒビターは、より大きな嘔吐誘発傾向
を有するＰＤＥ４インヒビターほどには、試験哺乳動物においてキシラジン／ケ
タミンで認められる麻酔作用を減少させないことが認められている。より大きな
催吐作用を有するＰＤＥ４インヒビターは、試験哺乳動物に、より素早く立ち直
り反射から回復させる。したがって、嘔吐誘発能と麻酔作用の短縮との間には相
関性が存在する。特定の作用メカニズムに限定されるものではないが、α２−ア
ドレナリン受容体アンタゴニスト麻酔薬の麻酔作用の変化とＰＤＥ４インヒビタ
ーで認められる嘔吐との間の相関性に関する１つの説明は、該ＰＤＥ４インヒビ
ターが、α２−アドレナリン受容体アンタゴニストの生物学的作用を模倣するこ
とにより嘔吐を誘発するというものである。これはラットおよびフェレットにお
いて示されている。ラットおよびフェレットにおいてキシラジン／ケタミン麻酔
薬に影響を及ぼす構造的に異なるＰＤＥ４インヒビターを使用した。ＲＳ１４２
０３、Ｒ−ロリプラムおよびＳ−ロリプラムは、キシラジン／ケタミンの組合せ
で麻酔したラットの横臥の持続時間を用量依存的に減少させた。最小の嘔吐誘発
傾向を有する本明細書に記載のＰＤＥ４阻害性化合物であるＣＴ−２４５０は、
試験した用量（３〜３０ｍｇ／ｋｇ）において、立ち直り反射の回復に影響を及
ぼさなかった。

【００２８】 試験化合物は、末梢および／または大脳作用部位において有効でありうる。こ
のアッセイの適用において、該試験化合物の作用部位を特徴づけることができる
。この適用のもう１つの態様において、大脳作用部位に影響を及ぼしうる従って
血液脳関門を通過する可能性を示す試験化合物が、試験哺乳動物においてキシラ
ジン／ケタミンで認められる麻酔作用を減少させることが認められた。末梢作用
部位のみに影響を及ぼす試験化合物は、試験哺乳動物においてキシラジン／ケタ
ミンで誘導された麻酔の持続時間に何ら影響を及ぼさない。

【００２９】 以下のアッセイプロトコールを用いて、ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物を特
徴づけることができる。ＰＤＥ４阻害活性を測定するためのアッセイ ＰＤＥ４ａ酵素を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞系の確立 プロスタサイクリン受容体を安定に発現し既に記載されているとおり（Ｙ．Ｂ
ｏｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．：２６９，１２１７３−１２１７８，１９
９４）のＧ４１８選択下で培養されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、αＭＥＭ培地、１０
％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマ
イシン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）および５００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１
８（完全培地）を含有するＴ−１７５フラスコ（Ｇｉｂｃｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔ
ｏｎ，ＶＴ）中、１．７５×１０^６細胞／１７５ｃｍ^２の密度でプレーティング
した。該細胞をインキュベーター中、３７℃、５％ ＣＯ_２で２４時間配置した
。ついで該細胞を、加温された無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、Ｏｐ
ｔｉ−ＭＥＭ中、２ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡおよび９ｍｇ／ｍｌリポフェクタミン試
薬と共に３７℃、５％ ＣＯ_２で７時間インキュベートした。該インキュベーシ
ョン溶液を、２０％ ＦＢＳを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭで１：２希釈し、一晩
インキュベートした。その一晩のインキュベーションの後、該培地を、５００ｍ
ｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有する完全培地と交換した。コロニーを同定し
、更なる特徴づけのためにＴ−１７５フラスコ中で培養した。

【００３０】 全細胞ｃＡＭＰ含量の測定 ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０^６細胞／１７５ｃｍ^２の密度（５００ｍｇ／ｍｌハ
イグロマイシンと共に完全培地を含有する）でプレーティングした。該フラスコ
をインキュベーター中、３７℃、５％ ＣＯ_２で７２時間維持した。該培地を交
換し、該細胞を一晩培養した。該細胞を洗浄し、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有す
るＰＢＳで該プレートから解離させた。該細胞懸濁液を１５０ｇ×１０分間遠心
分離し、該細胞を０．２×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＨａｎｋｓ緩衝食塩溶液に
再懸濁させることにより、細胞ｃＡＭＰ含量を測定した。該細胞を室温で１５分
間プレインキュベートし、ついで１０ｍＭプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）
および示されている化合物と共に更に１０分間インキュベートした。該細胞を０
．１％ ＤＭＳＯ中でインキュベートすることにより、基礎ｃＡＭＰレベルを測
定した。ＨＣｌ（最終０．１Ｎ）の添加によりインキュベーションを終了させ、
後記のとおりに該細胞をｃＡＭＰに関して測定した。

【００３１】 全細胞ｃＡＭＰ含量の測定は、ＳｃｉｎｔｉＳｔｒｉｐ（商標）ウェル（最終
容積３００ｍｌ）中、１００ｍｌの再構成ウサギ抗スクシニルｃＡＭＰ血清を１
００ｍｌの該全細胞反応または既知ｃＡＭＰ標準および３０ｐｍｏｌの^１２５Ｉ
−ｃＡＭＰ ＴＭＥと共に室温で１８時間インキュベートすることにより行なっ
た。ｃＡＭＰ標準のサンプルの存在下で、全ｃｐｍ（Ｂ_０）を測定した。ついで
該反応混合物を該ウェルから吸引除去し、１分間、１０〜９９９で窓を開けたＢ
ｅｃｋｍａｎ ＬＳ ６０００ＳＣ中で個々の細胞を計数した。該データを、％
Ｂ／Ｂ_０＝［（標準またはサンプルのｃｐｍ−非特異的ｃｐｍ）／（Ｂ_０ ｃｐ
ｍ−非特異的ｃｐｍ）］×１００として表した。非特異的ｃｐｍは、Ｓｃｉｎｔ
ｉＳｔｒｉｐ（商標）ウェル中、アッセイバッファー（５０ｎＭ酢酸塩；ｐＨ５
．８）と共に^１２５Ｉ−ｃＡＭＰ ＴＭＥのみをインキュベートすることにより
測定した。すべての測定は三重に行なった。

【００３２】 ホスホジエステラーゼシンチレーション近位アッセイ ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ
および２００ｍＭ ｂ−メルカプトエタノールを含有する氷冷溶液中、５０％の
出力設定の超音波処理（Ｂｒａｕｎｓｏｎｉｃ Ｍｏｄｅｌ ２０００）により
１０分間細胞溶解した。該超音波処理物を１００，０００×ｇ、４℃で９０分間
遠心分離することにより、該細胞の可溶性および粒子状画分を得た。５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０
０ｎＭ（または示されている）^３Ｈ−ｃＡＭＰ（最終容積１００ｍＭ）を含有す
る溶液中、種々の濃度のインヒビターの存在下でＰＤＥ活性を測定した。酵素を
含有する反応混合物を、９６ウェルＶｉｅｗ Ｐｌａｔｅｓ（Ｐａｃｋａｒｄ）
中、３０℃で１０分間インキュベートし、１８ｍＭ ＺｎＳＯ_４を含有する５０
ｍｌのホスホジエステラーゼシンチレーション近位アッセイ（Ｐｈｏｓｐｈｏｄ
ｉｅｓｔｅｒａｓｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓ
ｓａｙ）（ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加により、それを終了させ
た。該プレートをＷａｌｌａｃ １４５０ｍＢｅｔａ ＬＳＣカウンター中で計
数することにより、^３Ｈ−ｃＡＭＰの加水分解の量を測定した。

【００３３】 白血球内のｃＡＭＰの上昇 細胞内ｃＡＭＰに対するＰＤＥ４阻害性化合物の効果を、ヒト好中球またはモ
ルモット好酸球を使用して調べた。ヒト好中球を末梢血から分離し、ジヒドロサ
イトカラシンＢおよび該試験化合物と共に１０分間インキュベートし、ついでＦ
ＭＬＰで刺激した。モルモット好酸球を、ヒト血清の腹腔内注射で予め処理され
た動物の腹膜潅流により回収した。好酸球を該腹膜滲出液から分離し、イソプレ
ナリンおよび試験化合物と共にインキュベートした。両方の細胞型に関して、懸
濁液を該インキュベーションの終了時に遠心分離し、該細胞ペレットをバッファ
ーに再懸濁させ、１０分間煮沸した後、特異的ラジオイムノアッセイ（ＤｕＰｏ
ｎｔ）によりｃＡＭＰの測定を行なった。

【００３４】 白血球の機能の抑制 ＰＤＥ４阻害性化合物を、スーパーオキシド生成、好中球および好酸球の化学
走性および接着に対するそれらの効果に関して調べた。単離された白血球を、Ｆ
ＭＬＰでの刺激の前に、スーパーオキシド生成用のジヒドロサイトカラシンＢお
よび試験化合物と共にインキュベートした。

【００３５】 ヒト末梢血単球（ＰＢＭ）による腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のリポ多糖（ＬＰＳ
）誘導合成は、ＰＤＥ４阻害性化合物により抑制される。

【００３６】 インビトロにおける収縮気道平滑筋の弛緩 単離されたモルモット気管平滑筋に対するＰＤＥ４阻害性化合物の効果を調べ
た。単離された気管輪を器官浴内に懸濁させ、酸素化クレブス溶液に浸した。次
第に増加する濃度の試験化合物を該器官浴に加える前に、該平滑筋を亜最大濃度
のヒスタミンまたはカルバコールで収縮させた。該化合物は、ヒスタミンおよび
カルバコールにより誘導された収縮の濃度依存的逆転を引き起こした。

【００３７】 インビトロにおける心筋に対する効果 また、ＰＤＥ４阻害性化合物を、単離された心筋に対するそれらの効果に関し
て試験した。右心房および乳頭筋をモルモットの心臓から切除し、器官浴内に吊
るして、自発的拍動性心房の速度（変時性）および電気的に刺激された乳頭筋の
力（変力性）を測定した。これらの調製物においては、ロリプラムなどの選択的
ＰＤＥ４インヒビターは直接的な効果を及ぼさず、一方、ミルリノンなどの選択
的ＰＤＥ ＩＩＩインヒビターは正の変時性および変力性効果を有する。喘息に
おいて気管支拡張薬として使用される非特異的ＰＤＥインヒビターであるテオフ
ィリンも、頻脈などの有意な心臓血管変化を引き起こす。したがって、選択的Ｐ
ＤＥ４インヒビターは、心臓血管の副作用の減少により、テオフィリンを凌ぐ利
点を有する。

【００３８】 インビボにおける抗炎症性活性 ラットにおけるインターロイキン−５（ＩＬ−５）により誘導された胸膜好酸
球（Ｌｉｓｌｅら，１９９３，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０８，２３０
ｐ）は、ＰＤＥ４阻害性活性を有する化合物により阻害される。

【００３９】 また、ＰＤＥ４阻害性化合物は、血小板活性化因子（ＰＡＦ）によりラットに
おいて誘導される炎症性応答を減少させることが示されうる。

【００４０】 インビボにおける抗アレルギー活性 感作モルモットによる抗原の吸入により誘導されたＩｇＥ媒介アレルギー性肺
炎に対する効果に関して、ＰＤＥ４阻害性化合物を試験した。水酸化アルミニウ
ムおよび百日咳ワクチンと組合せた抗原の腹腔内注射により、穏やかなシクロホ
スファミド誘導性免疫抑制下、モルモットをオボアルブミンに対して初期感作し
た。２および４週間後ならびに第６週の時点で、ブースター用量の抗原を投与し
、動物を、腹腔内投与された抗ヒスタミン剤（メピラミン）の保護（ｃｏｖｅｒ
）下でエアゾール化オボアルブミンで攻撃した。さらに４８時間後、気管支肺胞
洗浄（ＢＡＬ）を行ない、ＢＡＬ液中の好酸球および他の白血球の数を計数した
。また、炎症性傷害に関する組織学的検査用に該肺を摘出した。抗原攻撃後４８
時間における３回までの実施例の化合物の投与（０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ
ｉ．ｐ．またはｐ．ｏ．）は、好酸球および他の炎症性白血球の蓄積の有意な減
少を招く。また、該実施例の化合物で処理された動物の肺においては、炎症性傷
害は、より少なかった。

【００４１】 肺動力学に対する効果 ＰＤＥ４阻害性化合物（経口または他の投与経路により０．００１〜１０ｍｇ
／ｋｇ）は、感作モルモットにおいて抗原により引き起こされるアレルギー性気
管支収縮を減少させる。

【００４２】 ＰＤＥ４阻害性化合物を、モルモットの気道のオゾン誘導性過剰反応に対する
それらの効果に関して試験した。オゾン吸入後のモルモットは、吸入されたヒス
タミンの気管支収縮効果に対して、天然動物より非常に感受性になる（Ｙｅａｄ
ｏｎら，１９９２，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｐｈａｒｍ．，５，３９）。ヒスタミ
ンに対する用量反応曲線の、左側（１０〜３０倍）への顕著な移動、および肺抵
抗における最大増加の非常に顕著な増加が認められる。オゾン処理の１時間前に
腹腔内または経口経路で投与した化合物（０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ）は、オ
ゾン誘導性過剰反応の用量依存的阻害を引き起こす。

【００４３】 ＳＰＡに基づくＰＤＥ活性アッセイプロトコール ＩＶ型ｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼによるｃＡＭＰからＡＭＰへの加
水分解を阻害する化合物を、以下のとおりに９６ウェルプレート形式でスクリー
ニングした。

【００４４】 ９６ウェルプレートにおいて、３０℃で、該試験ＰＤＥ４阻害性化合物（２μ
ｌのＤＭＳＯに溶解したもの）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、［２，８−^３Ｈ］サイクリックアデノシン３
’，５’−リン酸（ｃＡＭＰ，１００ｎＭ〜５０μＭ）を含有する１８８ｍｌの
基質バッファーを加えた。１０ｍｌのヒト組換えＰＤＥ−ＩＶ（３０℃で１０分
間で〜１０％の産物が生成するようにその量を制御した）の添加により、該反応
を開始させた。１０分後、１ｍｇのＰＤＥ−ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
の添加により、該反応を停止させた。生成した産物であるＡＭＰをＭｉｃｒｏｂ
ｅｔａ ９６ウェルプレートカウンター上で定量した。酵素の不存在下のシグナ
ルをバックグラウンドと定めた。１００％活性を、酵素およびＤＭＳＯの存在下
で検出されたシグナルから該バックグラウンドを差し引いたものと定めた。それ
に従って阻害率（％）を求めた。ＩＣ_５０値は、１０点の力価測定からの標準的
な４−パラメーター／多結合部位等式の非線形回帰適合により近似した

【００４５】 嘔吐および麻酔アッセイプロトコール 該ＰＤＥ４インヒビターの催吐能を、キシラジンなどのα２−アドレナリン受
容体アゴニスト麻酔薬で得られる麻酔に対する、該ＰＤＥ４阻害性化合物が示す
阻害レベルと相関させる。これを、以下のアッセイプロトコールを用いて示す。

【００４６】 嘔吐応答： すべての実験プロトコールは、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ａｔ Ｍｅｒｃｋ Ｆｒｏｓｓｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより承認されたものである。雄成体フェレット（Ｍ
ｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ；１〜２ｋｇ，Ｍａｒｓｈａｌｌ
Ｆａｒｍｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用し、既に記載
されている方法（Ｒｏｂｉｃｈａｕｄら，１９９８）に従い実験を行なった。該
フェレットを、湿度および温度が制御された環境中に収容し、食餌（Ｍａｒｓｈ
ａｌｌ Ｐｒｅｍｉｕｍフェレット食餌；Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｆａｒｍｓ，Ｎｏ
ｒｔｈ Ｒｏｓｅ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）および水を任意量で与えた。

【００４７】 簡単に説明すると、該実験当日、フェレットを個々の籠内に配置し、少なくと
も３０分間、馴化させた。絶食は、これらの実験の必要条件ではなかった。関心
のある物質またはビヒクルでの前処理は、催吐攻撃の６０分前に皮下、腹腔内ま
たは経口投与により行なった。該ＰＤＥ４インヒビターを使用直前に１００％
ＰＥＧ−２００に溶解し、４０ｃｍ給餌用チューブ（Ｍｏｎｏｊｅｃｔ，Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して１ｍｌ／ｋｇの容積で経口投与した。

【００４８】 該薬物の投与後、ＰＤＥ４インヒビターの投与の１２０分後まで該動物を連続
的に観察した。その間、挙動の変化、すなわち、悪心（すなわち、腹部のリズミ
カルな収縮）および嘔吐運動（すなわち、胃腸管からの固体／液体物質の吐出ま
たはその試み）の数を記録した。

【００４９】 麻酔の持続時間 雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３３８±５ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ
ｉｖｅｒ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｃ，Ｃａｎａｄａ）を、キシラジン（１
０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せの、背部後足への１
回の筋肉内注射投与で麻酔した。１５分後、処理薬物またはそのビヒクルを皮下
に注射し（投与容積＝１ｍｌ／ｋｇ）、該動物を背部横臥で配置した。立ち直り
反射の戻りにより、すなわち、該動物がもはや仰向けではなく完全にうつ伏せに
戻った際に、麻酔の持続時間を測定した。

【００５０】 麻酔の持続時間に対するＰＤＥ４インヒビターの効果を、フェレットの場合と
同様にして評価した。簡単に説明すると、フェレットを、麻酔の誘導の前に少な
くとも８時間、任意量の水を与えながら絶食させた。該動物を、後部後足へのキ
シラジン（２ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）の組合せの１回の筋肉
内注射で麻酔した（Ｓｙｌｖｉｎａら，１９９０）。１５分後、試験薬物または
そのビヒクルを、０，２５ｍｌ／ｋｇの投与容積で頚の基底に皮下投与した。該
フェレットを背部横臥で配置し、麻酔の持続時間を立ち直り反射の戻りにより評
価した。各フェレットをそれ自身の対照として用い、処理の合間に２週間の洗浄
期間を設けて両方の処理をランダムに行なった。ヨヒンビンの０．５ｍｇ／ｋｇ
を陽性対照として使用した。

【００５１】 薬物： ＰＤＥ４インヒビターＲＳ１４２０３、Ｒ−およびＳ−ロリプラムならびにＣ
Ｔ−２４５０を、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍｏ
ｎｔｒｅａｌ，Ｑｃ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。ＣＴ２４５０は、元々はＣ
ｅｌｌｔｅｃｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ（Ｓｌｏｕｇｈ，Ｕ．Ｋ．
）により合成されたものである。ＭＫ−９１２およびＭＫ−４６７をＭｅｒｃｋ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ
．Ａ．）から入手した。クロニジンをＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕ
ＳＡ）から、キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ）をＢａｙｅｒ（Ｅｔｏｂｉｃｏｋｅ，
Ｏｎｔ．，Ｃａｎａｄａ）から、ケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ）をＡｙｅｒｓｔ（
Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。

【００５２】 データ： 頻度（応答動物の数／試験した動物の数）および潜伏期（投与から最初の悪心
または嘔吐エピソードまでの時間）を算出した。すべての非応答動物には、観察
期間の長さに対応する潜伏期を割り当てた。値を、平均±ＳＥＭとして表し、ｔ
−検定分析（対または不対）または多重比較（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）による分
散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて有意差に関して分析した。ｐ＜０．０５を、有意
差があるとみなした。

【００５３】 結果 α２−アドレナリン受容体： α２−アドレナリン受容体アンタゴニストであるヨヒンビンでフェレットを前
処理した。腹腔内注射後、意外にも、ヨヒンビンは、試験したすべてのフェレッ
トにおいて、投与後迅速に（平均潜伏期＝７±１分）悪心および嘔吐を誘発した
。経口的または皮下に該薬物を投与した場合にも、同様の効果が認められた。他
の２種の選択的α−２アドレナリン受容体アンタゴニストＭＫ−９１２およびＭ
Ｋ−４６７（Ｐｅｔｔｉｂｏｎｅら，１９８７；Ｃｌｉｎｅｓｃｈｍｉｄｔら，
１９８８）の投与後にも、嘔吐が記録された。

【００５４】 α２−アドレナリン受容体アゴニストであるクロニジンを、６２．５〜２５０
μｇ／ｋｇの用量範囲でフェレットに投与した。それ単独では、嘔吐を誘発しな
かった。しかし、用量に関連しているらしい軽い鎮静が、該投与後に迅速に認め
られた。催吐用量のＲＳ１４２０３（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）での攻撃に際し
て、クロニジンは、ＲＳ１４２０３により誘発された悪心（ｐ＝０．０００９）
および嘔吐（ｐ＝０．００２）の数の用量依存的減少を引き起こし、開始の潜伏
期を増加させた（ｐ＝０．０００１）（表１）。

【００５５】

【表１】

【００５６】 ＰＤＥ４インヒビター（ＲＳ１４２０３ １ｍｇ／ｋｇ；ＣＴ−２４５０ ３
０ｍｇ／ｋｇ；Ｒ−ロリプラム ３ｍｇ／ｋｇ）で嘔吐誘発する６０分前に該動
物を前処理した。嘔吐を２時間にわたりモニターし、非応答動物はすべて、１２
０分の潜伏期とした。クロニジンに使用したビヒクルは食塩水であり、ＰＤＥ４
インヒビターには１００％ ＰＥＧ−２００を使用した。データを平均±ＳＥＭ
として表した。 ^＊ ｐ＜０．０５におけるビヒクル群からの統計差（ＡＮＯＶＡまたは不対ｔ
−検定）。 ^ａ 応答動物の数／試験した数

【００５７】 試験した最高用量（２５０μｇ／ｋｇ）において、クロニジンで前処理された
６匹中５匹の動物はＲＳ１４２０３誘発性嘔吐に対する完全な防御を示した。そ
の特定の群において催吐応答を現した動物は、１つの悪心および１つの嘔吐エピ
ソードを示した。同様に、クロニジン（２５０μｇ／ｋｇ）はまた、処理された
すべての動物において、ＣＴ−２４５０により誘発される嘔吐を阻止し、催吐用
量のＲ−ロリプラムで攻撃された３匹中２匹の動物において完全な防御をもたら
した。

【００５８】 フェレットへのＲＳ１４２０３の投与は、嘔吐に加えて、唾液過多、換気亢進
、むかつき及び口での引っ掻きなどの他のいくつかの挙動的効果をもたらした。
これらの効果は、ビヒクルで前処理されたすべての動物において認められた（表
２）。

【００５９】

【表２】

【００６０】 クロニジン２５０μｇ／ｋｇ前処理群においては、該動物のいずれにおいても
唾液過多は示さず、６匹中１匹がＲＳ１４２０３投与後に換気亢進を示した。し
かし、むかつき及び口における引っ掻きは影響されなかった。

【００６１】 麻酔の持続時間に対するＭＫ−９１２およびＭＫ−４６７の効果 ラットにおいては、キシラジンとケタミンとの組合せにより誘導された麻酔は
、ＭＫ−９１２の投与により有意かつ用量依存的に逆転されうるが、ＭＫ−４６
７ではそうではない（図２）。ＭＫ−９１２は、脳透過性α−２アドレナリン受
容体アンタゴニストとして特徴づけられており（Ｐｅｔｔｉｂｏｎｅら，１９８
７）、一方、ＭＫ−４６７は、末梢的に活性なα−２アドレナリン受容体アンタ
ゴニストである（Ｃｌｉｎｅｓｃｈｍｉｄｔら，１９８８）。立ち直り反射の回
復がＭＫ−９１２では認められＭＫ−４６７では認められないことは、試験哺乳
動物においてキシラジン／ケタミンの麻酔作用を減弱しうる化合物も血液脳関門
を通過しうることを示唆している。

【００６２】 参照文献

【表３】 引用されているすべての参照文献の全体を、参照により本明細書に組み入れる
こととする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ラットにおけるキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）／ケタミン（１０ｍｇ
／ｋｇ）での麻酔の持続時間に対するＰＤＥ４インヒビターの効果のグラフであ
る。

【図２Ａ】 図２Ａは、ラットにおけるキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）／ケタミン（１０ｍ
ｇ／ｋｇ）での麻酔の持続時間に対するα−２アドレナリン受容体アンタゴニス
トＭＫ−９１２の効果のグラフである。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、ラットにおけるキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）／ケタミン（１０ｍ
ｇ／ｋｇ）での麻酔の持続時間に対するα−２アドレナリン受容体アンタゴニス
トＭＫ−４６７の効果のグラフである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年４月１０日（２００１．４．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 23/00 Ａ６１Ｐ 23/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サボア，シアンタル カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシ ユ・３・エル・１、カークランド、トラン ス−カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者 チヤン，チー・チュン カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシ ユ・３・エル・１、カークランド、トラン ス−カナダ・ハイウエイ・16711 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 AA20 MA02 MA52 NA06 ZA041 ZC611 4C085 HH20 KA36 LL13 LL20 4C086 BC21 BC38 BC87 MA02 MA52 NA06 ZA04 4C206 AA01 FA29 MA02 MA72 NA06 ZA04

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）麻酔作用を引き起こすのに十分な量の麻酔化合物を試
   験哺乳動物に投与し、 （Ｂ）ＰＤＥ４阻害活性を有する試験化合物を該試験哺乳動物に投与し、 （Ｃ）該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動物を観察し、 （Ｄ）その麻酔された試験哺乳動物において観察された麻酔作用の変化を標準
   体と相関させることを含んでなる、ＰＤＥ４阻害性化合物の催吐活性に関するア
   ッセイ。
2. 【請求項２】 麻酔作用を引き起こすのに十分な量で該試験哺乳動物に投与
   する麻酔化合物が、キシラジン、メデトミジン、デクスメデトミジン、デトミジ
   ンおよびクロニジンよりなる群から選ばれるα−２アドレナリン受容体アゴニス
   ト化合物である、請求項１に記載のアッセイ。
3. 【請求項３】 ケタミン、フェンシクリジンおよびチレタミンよりなる群か
   ら選ばれる麻酔薬と共に該麻酔性α−２アゴニスト化合物を投与する、請求項１
   に記載のアッセイ。
4. 【請求項４】 該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動物を観察することが
   、その麻酔された哺乳動物を立ち直り反射の回復に関して観察することを含む、
   請求項１に記載のアッセイ。
5. 【請求項５】 該立ち直り反射の回復を、該試験ＰＤＥ４阻害性化合物の嘔
   吐誘発傾向と相関させる、請求項４に記載のアッセイ。
6. 【請求項６】 該試験哺乳動物が、ラット、マウスおよびフェレットよりな
   る群から選ばれる、請求項１に記載のアッセイ。
7. 【請求項７】 試験化合物をその脳透過性に関して選択するための方法であ
   って、 （Ａ）麻酔作用を引き起こすのに十分な量の麻酔化合物を試験哺乳動物に投与
   し、 （Ｂ）試験化合物を該試験哺乳動物に投与し、 （Ｃ）該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動物を観察し、 （Ｄ）その麻酔された試験哺乳動物において観察された麻酔作用の変化を標準
   体と相関させることを含んでなり、 標準体と比較した場合の該試験哺乳動物における該麻酔作用の変化が、該試験
   化合物が該脳透過性を有することに関する指標となることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 麻酔作用を引き起こすのに十分な量で該試験哺乳動物に投与
   する麻酔化合物が、キシラジン、メデトミジン、デクスメデトミジン、デトミジ
   ンおよびクロニジンよりなる群から選ばれるα−２アドレナリン受容体アゴニス
   ト化合物である、請求項７に記載のアッセイ。
9. 【請求項９】 ケタミン、フェンシクリジンおよびチレタミンよりなる群か
   ら選ばれる麻酔薬と共に該麻酔性α−２アゴニスト化合物を投与する、請求項７
   に記載のアッセイ。
10. 【請求項１０】 該麻酔作用の変化に関して該試験哺乳動物を観察すること
    が、その麻酔された哺乳動物を立ち直り反射の回復に関して観察することを含む
    、請求項７に記載のアッセイ。
11. 【請求項１１】 該立ち直り反射の回復を、該試験化合物が脳透過性を有し
    うることと相関させる、請求項１０に記載のアッセイ。
12. 【請求項１２】 該試験哺乳動物が、ラット、マウスおよびフェレットより
    なる群から選ばれる、請求項７に記載のアッセイ。