JP2002536964A - ヒト免疫不全ウイルスに対する遺伝子抑制エレメント - Google Patents

ヒト免疫不全ウイルスに対する遺伝子抑制エレメント

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JP2002536964A JP2000589689A JP2000589689A JP2002536964A JP 2002536964 A JP2002536964 A JP 2002536964A JP 2000589689 A JP2000589689 A JP 2000589689A JP 2000589689 A JP2000589689 A JP 2000589689A JP 2002536964 A JP2002536964 A JP 2002536964A
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スティーヴン ジェイ． ダン、
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の活性を抑制する遺伝的エレメントに関する。特に、本発明は、ＨＩＶ−１ゲノムから単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを単離、同定および設計する方法、並びにＨＩＶ感染および／または複製に対するヒト細胞の保護のためのそれらの使用法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 １．序論 本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の活性を抑制する遺伝子エレメン
トに関する。特に、本発明は、ＨＩＶ−１ゲノムから単離されたポリヌクレオチ
ド、前記ポリヌクレオチドを単離、同定および設計する方法、並びに、ＨＩＶ感
染および／または複製に対するヒト細胞の保護のためのそれらの使用法に関する
。
【０００２】 ２．発明の背景 ２．１．ヒト免疫不全ウイルス 後天性免疫不全症候群（エイズ）の主な原因は、ＨＩＶであることが示されて
いる（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：
８６８〜８７０；Ｇａｌｌｏら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：５００〜
５０３）。ＨＩＶは、免疫系の重要な細胞型に感染して、よってそれを枯渇させ
ることにより個体に免疫不全を引き起こす。これに次いで、日和見感染、神経機
能障害、新生物増殖、および死に至る。
【０００３】 ＨＩＶは、レトロウイルスのレンチウイルスファミリーの一員である（Ｔｅｉ
ｃｈら、１９８４、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＲＮＡ腫瘍ウイルス
）、Ｗｅｉｓｓら編、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、９４９〜９５６項）。レトロウイル
スは、二倍体の一本鎖ＲＮＡゲノムを含む、小さい外被をもつウイルスであり、
ウイルスにコードされる逆転写酵素であるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによ
り産生されるＤＮＡ中間体を介して複製する（Ｖａｒｍｕｓ、１９８８、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４０：１４２７〜１４３９）。ＨＩＶには少なくとも２つの異なる
サブタイプがある：ＨＩＶ−１（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら、１９８３、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８〜８７０；Ｇａｌｌｏら、１９８４、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２４：５００〜５０３）およびＨＩＶ−２（Ｃｌａｖｅｌら、１９８
６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３〜３４６；Ｇｕｙａｄｅｒら、１９８７、
Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６６２〜６６９）である。遺伝子不均一性がこれらの各
ＨＩＶサブタイプ内に存在する。
【０００４】 ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＩＶ感染の主要な標的である。なぜなら、ＣＤ４細胞表
面タンパク質は、ＨＩＶ付着の細胞受容体として作用するからである（Ｄａｌｇ
ｌｅｉｓｈら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６３〜７６７；Ｋｌａｔｚ
ｍａｎｎら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６７〜７６８；Ｍａｄｄｏｎ
ら、１９８６、Ｃｅｌｌ ４７：３３３〜３４８）。細胞へのウイルス侵入は、
ウイルスタンパク質ｇｐ１２０の、細胞性ＣＤ４受容体分子（ＭｃＤｏｕｇａｌ
ら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：３８２〜３８５；Ｍａｄｄｏｎら、１
９８６、Ｃｅｌｌ ４７：３３３〜３４８）および、ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５
のようなケモカイン共受容体（Ｍｏｏｒｅ、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６
：５１〜５２）への結合に依存する。
【０００５】 ２．２．ＨＩＶ治療 ＨＩＶ感染は汎発性であり、ＨＩＶ関連疾患は、世界中の健康問題となってい
る。抗ＨＩＶ様式の設計における、かなりの努力にも関わらず、これまでエイズ
に対し効を奏した予防または治療措置はない。しかし、ＨＩＶ生活環の数個の段
階が、治療介入の可能性ある標的として考えられている（Ｍｉｔｓｕｙａら、１
９９１、ＦＡＳＥＢ Ｊ．５：２３６９〜２３８１）。例えば、ウイルスにコー
ドされる逆転写酵素は、薬物開発の主要な焦点である。ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ
、およびｄｄＴ等の２’，３’−ジデオキシヌクレオチド類似体を含む多くの逆
転写酵素を標的とした薬物が、ＨＩＶに対して有効であることが示されている（
Ｍｉｔｓｕｙａら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５３３〜１５４４）
。有益であるが、これらのヌクレオチド類似体は、おそらく、薬物耐性ＨＩＶ変
異体が迅速に出現するために、治癒的ではない（Ｌａｎｄｅｒら、１９８９、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４３：１７３１〜１７３４）。さらに、薬物は、しばしば、骨
髄抑制、嘔吐、および肝異常等の毒性副作用を示す。
【０００６】 標的化されているＨＩＶ生活環の別の段階は、ＨＩＶ感染の最初期の段階であ
る、ウイルスの細胞への侵入である。このアプローチは、主に、いくつかのＨＩ
Ｖ−１株によるＣＤ４＋Ｔ細胞の感染を阻害するために、組換え可溶性ＣＤ４タ
ンパク質を使用する（Ｓｍｉｔｈら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１７
０４〜１７０７）。しかし、ある主要なＨＩＶ−１単離株は、組換えＣＤ４によ
る阻害に比較的感受性が低い（Ｄａａｒら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６５７４〜６５７９）。これまで、組換え可溶
性ＣＤ４臨床試験により、決定的ではない結果が得られている（Ｓｃｈｏｏｌｅ
ｙら、１９９０、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１２：２４７〜２５３；Ｋａｈｎ
ら、１９９０、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１２：２５４〜２６１；Ｙａｒｃｈ
ｏａｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｖｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ ＡＩＤＳ、
５６４項、ＭＣＰ１３７）。
【０００７】 さらに、あるウイルスタンパク質および酵素の、重大なウイルス特異的な二次
的プロセシングに関与する、ＨＩＶ複製の後期段階も、抗ＨＩＶ薬物開発に標的
化されている。後期段階のプロセシングは、ウイルスによりコードされるプロテ
アーゼの活性に依存し、このプロテアーゼを阻害するために、ネルフィナビル、
サキナビル、リトナビルおよびインジナビルを含む薬物が開発されている（Ｐｅ
ｔｔｉｔら、１９９３、Ｐｅｒｓｐ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｓｉｇｎ
１：６９〜８３）。このクラスの薬物では、薬物耐性ＨＩＶ変異体の出現も問題
である；ある阻害剤に対する耐性は、他のプロテアーゼ阻害剤に対する交差耐性
も付与することが多い（Ｃｏｎｄｒａら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５
６９〜５７１）。これらの薬物は、吐気、味覚の変化、口腔周囲異常感覚、脂肪
異栄養症および腎結石症等の毒性副作用を示すことが多い。さらに、これらの薬
物はまた、ＨＩＶ感染の治療によく使用される多くの薬物と相互作用する（Ｆｌ
ｅｘｎｅｒ、１９９８、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：１２８１〜１２９
２）。
【０００８】 ヌクレオシド類似体とプロテアーゼ阻害剤の様々な組合せを使用したＨＩＶの
抗ウイルス療法が、近年、単一の薬物のみの使用よりも効果的であることが示さ
れた（Ｔｏｒｒｅｓら、１９９７、Ｉｎｆｅｃ．Ｍｅｄ．１４：１４２〜１６０
）。しかし、ウイルス負荷を有意に減少できるにも関わらず、これまで、入手可
能な薬物の組合せにより、エイズの治癒的医療が得られたという証拠は全くない
。
【０００９】 エイズ治療を開発する他のアプローチは、外来遺伝子を感染細胞に送達するこ
とを含む。このような遺伝子療法アプローチの１つは、毒性遺伝子産物を導入し
てＨＩＶ感染細胞を死滅させるための、遺伝子改変ウイルスベクターの使用を含
む。例えば、複製欠陥ベクターを設計して、細胞増殖阻害遺伝子を、宿主細胞に
導入した（ＷＯ９０／１２０８７、１９８０年１０月１８日）。数個のグループ
により試みられた１つの戦略は、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（
ｔｋ）毒素遺伝子の送達を含む。ｔｋ遺伝子産物は、ガンシクロビル等のヌクレ
オシド類似体の存在下でのみ、哺乳動物細胞に毒性である（Ｖｅｎｔａｋａｓｈ
ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８７４
６〜８７５０；Ｂｒａｄｙら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１：３６５〜３６９；ＷＯ９０／０７９３６、１９９０年７月２
６日）。ジフテリア毒素遺伝子も使用され、この遺伝子は、シス作用ＨＩＶ調節
配列の制御下に配置された（米国特許第５，３０６，６３１号、１９９４年４月
２６日発行）。他は、ＨＩＶｔａｔの存在下で阻害遺伝子産物の発現能を有する
、ＨＩＶの複製非適合性変異体を使用した（ＷＯ９４／１６０６０、１９９４年
７月２１日）。
【００１０】 特異的にウイルス複製を破壊することにより、ウイルス感染細胞を細胞溶解か
ら保護するための、別の形の遺伝子療法が設計される。適切な保護遺伝子を同定
する努力は、主に、ＨＩＶ複製の分子生物学の解明に基づく。このアプローチの
いくつかの実施例は以下の通りである。
【００１１】 ＨＩＶ−１Ｒｅｖ遺伝子は、感染細胞での全長ＨＩＶ−１転写物の発現および
ＨＩＶ−１ビリオンの産生に必要なタンパク質をコードする。ＲｅｖＭ１０とし
て知られる１つのＲｅｖ変異体によるトランスフェクションが、ＨＩＶ感染に対
して細胞を保護することが示された（Ｍａｌｉｍら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１７６：１１９７；Ｂｅｖｅｃら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９８７０〜７４）。典型的には、形質移入体は、
接種時から約２週間、ＨＩＶ−１感染に耐性であり、その後、耐性変異形が出現
する（Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１：１１５８１〜８５）。
【００１２】 さらに、Ｒｅｖ機能は、過剰のＲｅｖタンパク質の結合部位（Ｒｅｖ応答エレ
メント（ＲＲＥ）と称される）を産生し、よって、ウイルス転写物のＲＲＥへの
Ｒｅｖの結合を防ぐことにより干渉できる。ＲＲＥおよびｔＲＮＡから構成され
るキメラＲＮＡからなる「おとり」は、約４０日以上の期間、培養細胞の感染を
防いだ（Ｌｅｅら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：８２５４〜６４）
。
【００１３】 別に、ウイルス外被タンパク質に結合できる融合タンパク質を、ＨＩＶ−１ビ
リオンの産生を防ぐために作成した。実施例は、ＣＤ４およびリソソーム標的化
タンパク質のプロカテプシンＤ、および小胞体に分泌される抗外被Ｆｖからなる
融合タンパク質を含む（Ｌｉｎら、ＷＯ９３／０６２１６；Ｍａｒａｓｃｏら、
１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７８８９〜
９３）。
【００１４】 ＨＩＶ−１転写物と複合体を形成し捕獲するアンチセンスポリヌクレオチドも
設計された（Ｈｏｌｍｅｓら、ＷＯ９３／１１２３０；Ｌｉｐｐｓら、ＷＯ９４
／１０３０２；Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒら、ＥＰ５９４，８８１；およびＣｈａｔ
ｔｅｒｊｅｅら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１４８５）。さらに、リ
ボザイムと称される、酵素的に活性なＲＮＡを使用して、ウイルス転写物を切断
する。ＨＩＶ−１耐性造血細胞系の形成へのリボザイムによるアプローチが報告
されている（Ｏｊｗａｎｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：１０８０２〜０６；Ｙａｍａｄａら、１９９４、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ １：３８〜４５；Ｈｏら、ＷＯ９４／２６８７７；およびＣｅ
ｃｈおよびＳｕｌｌｅｎｇｅｒ、ＷＯ９５／１３３７９）。
【００１５】 Ｒｏｎｉｎｓｏｎらは、ＨＩＶ−１感染から細胞を保護できる、ＨＩＶ−１ゲ
ノムからの遺伝的断片を単離する方法を記載した（米国特許第５，２１７，８８
９号およびＷＯ９２／０７０７１）。この方法は、ＨＩＶ−１ゲノムのランダム
な配列断片を含む、ランダム断片発現（ＲＦＥ）ライブラリーとして知られる発
現ライブラリーの調製を含む。次いで、ＨＩＶ−１遺伝子抑制エレメント（ＨＩ
Ｖ−１ ＧＳＥ）と称される遺伝子断片を、広範な選択手順に従って、ＲＦＥラ
イブラリーから選択する。選択段階は、ＨＩＶ−１感染が普通細胞毒性である細
胞系へのＲＦＥライブラリーのトランスフェクションを含む。しかし、この選択
段階の感受性が低いことから、実践的な手順の使用は大きく制限される。さらに
、この方法を使用して、ＨＩＶ−１感染を抑制できる特異的ＧＳＥ配列は報告さ
れていない。
【００１６】 ３．発明の要約 本発明は、ヒト細胞のＨＩＶ感染および／または複製を抑制する、本明細書で
ＧＳＥと称される特異的ＨＩＶ由来ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを
単離および同定する方法、前記ポリヌクレオチドを設計する方法、並びに、ＨＩ
Ｖ感染の予防または治療におけるそれらの使用法に関する。
【００１７】 本発明は、一部には、ＣＤ４＋細胞系における潜伏ＨＩＶ−１の活性化を抑制
する能力、または、ＨＩＶ−１による増殖性感染から細胞を防ぐ能力に基づいて
、ヌクレオチド断片をＨＩＶ−１ゲノムから単離できるという出願人の発見に基
づく。これに関連して、ＨＩＶ複製に関連した任意の細胞性またはウイルス性マ
ーカを使用して、潜伏ＨＩＶの活性化または細胞の増殖性感染をモニタリングで
きる。多くの新規ＨＩＶ−１ ＧＳＥポリヌクレオチドが、誘導細胞によるＣＤ
４発現を維持する能力に基づいて選択され、かかる配列のいくつかが、非感染Ｔ
細胞をＨＩＶ−１による増殖性感染から保護することがさらに示される。ＧＳＥ
は、ＲＮＡ産物またはタンパク質産物の形で機能し得、その両方が、本発明の範
囲内である。別の模範的なマーカは、細胞内ｐ２４である。感受性細胞でのＨＩ
Ｖの複製は、細胞内ｐ２４の蓄積に関連し、同時に表面ＣＤ２４はダウンモジュ
レーションする。増殖性感染を干渉できるＧＳＥの発現により、ＣＤ４＋、ｐ２
４−表現型を示す保護細胞が増える。かかる細胞は、感染個体群からＦＡＣＳに
より分離できる。
【００１８】 本発明はまた、単離されたＧＳＥは、ＨＩＶ−１ゲノムの狭く限定された領域
にクラスターを形成するという発見、特に、ＧＳＥの阻害または保護クラスター
が、以前に標的化していない領域（ＲＴおよびｎｅｆ）からも単離されたという
驚くべき発見に基づく。本発明の好ましい実施形態は、かかるＧＳＥクラスター
の共通配列に基づいて、ＧＳＥを設計する方法を提供する。
【００１９】 ＧＳＥをＨＩＶ−１感受性細胞型に移すことによる、エイズ治療および予防を
含むがこれに限定されない、多種多様の用途が本発明に包含される。例えば、Ｇ
ＳＥを、Ｔ細胞または造血前駆細胞にインビトロで移し、次いで、それを自己、
組織適合性またはさらには組織非適合性レシピエントに移植し得る。本発明の別
の実施形態において、ＨＩＶ感染に感受性の任意の細胞を、インビボで、ＧＳＥ
を用いて直接的に形質導入または形質移入し得る。
【００２０】 ５．発明の詳細な説明 本発明は、Ｒｏｎｉｎｓｏｎらにより米国特許第５，２１７，８８９号に開示
された方法の改良により同定された、特異的ＨＩＶ由来ポリヌクレオチドに関す
る。より具体的には、方法の改良は、ＯＭ１０．１等の潜伏および誘導ＨＩＶ−
１プロウイルスを含む細胞系の使用を含む。さらに、改良はまた、ＨＩＶ−１感
染を効果的に抑制する、ＨＩＶ−１ ＲＦＥライブラリーからのポリヌクレオチ
ドについて選択するために、ＣＤ４等のＨＩＶ感染に関連したマーカの使用を包
含する。この手順により選択されたＧＳＥはまた、ＨＩＶ感染からの非感染細胞
を保護できる。
【００２１】 本発明の別の態様において、ＧＳＥは、ＨＩＶ−１による増殖性感染から細胞
を防ぐ能力に基づいて単離する。
【００２２】 一般に、本発明の方法は、１）ＨＩＶ−１ゲノムを１００〜７００塩基対（ｂ
ｐ）断片に断片化するステップ、２）断片を発現ベクターに挿入し、よって断片
が転写および翻訳され発現ライブラリーを形成するステップ、３）発現ライブラ
リーを、誘導性潜伏ＨＩＶ−１プロウイルスを含む細胞またはＨＩＶ感染に感受
性の細胞個体群に移すステップ、４）ＨＩＶ感染に関連した細胞性またはウイル
ス性マーカの発現をモニタリングすることにより、ＨＩＶ−１ ＧＳＥの豊富な
発現ライブラリーのサブセットを含む、細胞亜個体群を選択するステップ、そし
て５）選択した細胞個体群からＧＳＥを回収するステップを含む。この方法はさ
らに、二次または三次ライブラリーを用いた前記ステップの繰返しを含み、よっ
て、多くのラウンドを連続的に選択できる。ＧＳＥの選択は、ＣＤ４等の細胞性
マーカの連続発現、あるいは、ｐ２４またはｇｐ１２０等のウイルス性マーカの
発現減少を抗体を使用してモニタリングすることにより実施できる。
【００２３】 本発明は、制限するためではなく単に説明する目的のために、以下の小段落で
より詳細に議論する。議論の明瞭化のために、本明細書に記載した具体的な手順
および方法は、ＯＭ１０．１細胞、ＣＥＭ−ｓｓ細胞、腫瘍壊死因子−α（ＴＮ
Ｆ−α）、抗ＣＤ４抗体、および抗ｐ２４抗体を使用して例示するが、それらは
本発明の実践の単なる例である。類似の手順および技法を、誘導性潜伏プロウイ
ルスを含む任意の細胞系、または、ＨＩＶ感染に感受性の任意の細胞系または新
しく単離した細胞個体群、および容易にアッセイできるＨＩＶ感染に関連した任
意のマーカを使用して、異なるサブタイプのＨＩＶからのＧＳＥの単離に等しく
適用できる。
【００２４】 ５．１．ＨＩＶ−１ ＧＳＥライブラリーの調製およびトランスフェクショ
ン ＨＩＶ ＲＦＥライブラリーを、ＨＩＶプロウイルス挿入断片を含む、１プラ
スミドまたは複数のプラスミドのＤＮＡから構築できる。ＨＩＶプロウイルスＤ
ＮＡを、最初に、酵素で処理して、ランダムに切断された断片を作成する。これ
は、Ｍｎ＋＋の存在下で、ＤＮａｓｅＩ切断により簡便に実施できる（Ｒｏｎｉ
ｎｓｏｎら、特許第５，２１７，８８９号、５段落、５〜２０行）。その後、ラ
ンダムに切断されたゲノムＤＮＡを、ゲル電気泳動によりサイズ分画する。１０
０ないし７００ｂｐの断片が、ＲＦＥライブラリーの構築に好ましい長さである
。サイズを選択した断片の一本鎖破壊は、例えば、クレノウまたはＴ４ポリメラ
ーゼにより修復し、５’および３’アダプターでライゲートする。
【００２５】 ５’および３’アダプターは、非付着制限部位を有するように選択され、よっ
て、各断片を定位で発現ベクターに挿入できる。さらに、５’アダプターは、正
しい相にオープンリーディングフレームを含む断片の翻訳を可能とするように、
少なくとも１つの開始（ＡＴＧ）コドンを含む。
【００２６】 アダプターでライゲートした後、断片を、適切な発現ベクターに挿入する。宿
主細胞での効率的な断片の発現をもたらす任意の発現ベクターを使用できる。好
ましい実施形態において、レトロウイルスベクターＬＸＳＮおよび修正ＬＳＸＮ
ベクターのＬＸＳＮｇｆｒ等の、ウイルスをベースとしたベクターを例示する（
ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、１９８９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７
：９８０）。別に、アデノ随伴ウイルスベクターも、この目的に使用し得る。
【００２７】 ウイルスをベースとしたベクターを使用する場合、ライゲートしたベクターを
、最初に、パッケージング細胞系に形質移入し、ウイルス粒子を産生する。レト
ロウイルスベクターでは、ＰＡ３１７（ＭｉｌｌｅｒおよびＢｕｔｔｉｍｏｒｅ
、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５〜２９０２；ＡＴＣＣ
ＣＲＬ ９０７８番）またはＢＩＮＧ等の任意の広宿主性パッケージング系を
、ウイルスを効率的に産生するために使用し得る。本発明の好ましい実施形態に
おいて、ウイルスベクターはまた、ｎｅｏｒ遺伝子または切断短縮神経成長因子
受容体（ＮＧＦＲ）遺伝子等の選択遺伝子を含み、これにより、ベクターを含む
細胞の単離が可能となる。
【００２８】 各ＧＳＥ発現ライブラリーに存在する独立的なクローンの数は変化し得る。好
ましい実施形態において、約５×１０４から１０６の独立的なクローンのライブ
ラリーを使用し得る。
【００２９】 ５．２．ＨＩＶ感染細胞におけるＧＳＥの選択 例えば特定の実施形態において、ＯＭ１０．１細胞を使用してＧＳＥについて
選択し、Ｂｕｔｅｒａ（米国特許第５，２５６，５３４号）に記載した慣用的な
組織培養液で維持する。ＨＩＶ−１ ＧＳＥの選択におけるＯＭ１０．１細胞の
使用の目的は、それらが、ＴＮＦ−αにより誘導される潜伏ＨＩＶ−１プロウイ
ルスを含むことである。他の細胞系も、誘導ＨＩＶプロウイルスを用いて同様に
工学し得る。潜伏ＨＩＶで感染させる細胞系の実施例は、Ｕ１、Ｕ３３、８Ｅ５
、ＡＣＨ−２、ＬＬ５８、ＴＨＰ／ＨＩＶおよびＵＨＣ４を含むがこれに限定さ
れない（ＢｅｄｎａｒｉｋおよびＦｏｌｋｓ、１９９２、ＡＩＤＳ ６：３〜１
６）。様々な物質が、潜伏ＨＩＶ感染細胞を誘導できることが示され、これらは
、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターロイキン−１、−２、−３、−４および−
６、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激
因子、インターフェロン−γ、トランスフォーミング増殖因子−β、ＰＭＡ、レ
チノイン酸およびビタミンＤ３を含む（ＰｏｌｉおよびＦａｕｃｉ、１９９２、
ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ９：１９１〜１９
７）。
【００３０】 ＨＩＶ感染細胞を、使用するベクター系に適切な当分野で公知の任意の技法に
より、ＨＩＶ−１ ＲＦＥライブラリーで形質導入し得る。本発明の１つの実施
形態において、ウイルスベクターはまた、ＨＩＶ−１ゲノムのランダムな断片に
加えて、選択マーカを含む。適切なマーカは、ｎｅｏｒ遺伝子であり、これによ
り薬物Ｇ−４１８による選択が可能となる。別の実施形態において、ライブラリ
ーのビリオンの感染多重度を調整して、よって、ベクターにより形質導入される
細胞を前以て選択する必要がない。
【００３１】 ＯＭ１０．１細胞の場合、形質導入した個体群を、２４〜７２時間の期間、好
ましくは約２４時間、Ｂｕｔｅｒａの方法に従って、１０Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−α
で処理する。ＯＭ１０．１における潜伏ＨＩＶ−１プロウイルスの活性化は、細
胞表面ＣＳ４の抑制により検出できる。ウイルスタンパク質ｇｐ１２０が、細胞
質のＣＤ４に結合し、これにより、細胞表面上のＣＤ４のその後の発現が防がれ
ると考えられる。ＨＩＶ複製に耐性のクローンは、細胞表面ＣＤ４を発現し続け
る。かかるクローンは、ＣＤ４の任意の慣用的な抗体染色技法および蛍光活性化
細胞選別機（ＦＡＣＳ）を使用した細胞選別により選択できる。
【００３２】 連続的なＣＤ４発現について選択した後、推定上のＧＳＥを有し、ＴＮＦ−α
誘導後に選別したＯＭ１０．１細胞を使用して、ゲノムＤＮＡを精製し、挿入断
片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。所望により、選択したＯ
Ｍ１０．１細胞を、マーカ遺伝子、例えばＧ−４１８の選択条件下で再度培養し
て、細胞が、ＨＩＶ−１ ＲＦＥライブラリー由来のＧＳＥを保持することを確
認した。
【００３３】 ＨＩＶ−１ ＲＦＥライブラリーで形質導入したＣＤ４＋細胞の画分を、ベク
ターのみからなる発現ライブラリーで形質導入した細胞と比較できる。ＨＩＶ−
１ ＲＦＥライブラリーと対照ライブラリーの間の相対的差異の増加は、各追加
のラウンドのＴＮＦ−α誘導で見出すことができる。従って、本発明の好ましい
実施形態において、ＨＩＶ−１ ＧＳＥが、さらなる特徴づけのために細胞から
回収される前に、誘導、選択および再培養のサイクルが少なくとも２回ある。
【００３４】 ５．３．選択した細胞からのＧＳＥの回収 選択後、特異的ＧＳＥ配列を、ＴＮＦ−αによる潜伏ＨＩＶプロウイルスの誘
導後にＣＤ４を発現し続けた細胞から回収できる。この個体群でのＨＩＶ−１関
連ＧＳＥは、リンカー配列に従って、プライマーを使用してＰＣＲ増幅により回
収される。
【００３５】 回収されたＧＳＥは、上記の段落５．１に議論したように発現ベクターに導入
できる。得られたＨＩＶ−１ ＧＳＥ発現ライブラリーは、二次ライブラリーと
して知られる。二次ライブラリーは、一次ライブラリーの構築に使用したのと同
じまたは異なるベクターを使用し得る。二次ライブラリーを、別の細胞個体群に
形質導入し得、得られた個体群を、本明細書に記載したように、選択し、再培養
し、処理する。
【００３６】 さらに、各個々に回収したエレメントを、その具体的ヌクレオチド配列、その
配向およびそれが由来するＨＩＶゲノムの部分を決定するために、クローニング
ベクターに導入できる。同時に、単離したＧＳＥを解析して、その最小コア配列
を決定でき、以前に非感染の細胞をＨＩＶ感染から保護する能力について試験で
きる。
【００３７】 配列番号１〜２５に示した配列に加えて、これらの配列またはその相補配列に
、高または中緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成できるヌクレオチ
ド配列は、十分に本発明の範囲内である。高緊縮ハイブリッド形成条件は、０．
５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリッド形成として定義され得
、続いて、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で洗浄する（Ａｕｓｕｂ
ｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（分子生物学の現在のプロト
コル、第Ｉ巻）、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，
Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨー
ク、２．１０．３項）。中緊縮条件等の、より低い高緊縮条件は、上記のように
実施したハイブリッド形成として定義され得、続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄する（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）。
【００３８】 ５．４．ＧＳＥのコア配列の決定 本発明はまた、各ＧＳＥのコア配列を決定する方法も含む。これは、独立的に
得られたＧＳＥの重複配列を比較することにより実施し得る。図３は、独立的に
得られたＧＳＥの多くのクラスターを示す。本発明の驚くべき発見は、単離した
ＧＳＥが、ＨＩＶ−１ゲノムの狭く限定された領域にクラスターを形成すること
である。さらに、以前に標的化していない領域（すなわち、逆転写酵素およびｎ
ｅｆ）からのＧＳＥのクラスターも単離された。図３では、増殖性感染を防ぐ能
力に基づいて選択された多くのＧＳＥが、ＨＩＶ−１単離株ＢＲＵ（ＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号Ｋ０２０１３）の配座２４２６〜２５１１の領域（ＲＴ）にクラス
ターを形成する。かかるＧＳＥはまた、ウイルス感染細胞に阻害効果を示した（
図４）。当業者は、この領域から選択した配列は、増殖性感染を防ぎ、潜伏感染
細胞の誘導を阻害するのに、有効であると期待されることを理解するだろう。同
様に、多くのＧＳＥが、センスおよびアンチセンス配向の両方で、ＨＩＶ−１ゲ
ノムの領域８１９５〜８５９９にクラスターを形成する。この領域から選択され
た配列を含むヌクレオチドは、増殖性感染を防ぐおよび／または潜伏感染細胞の
ウイルス誘導を阻害するのに有効であろうことが当業者には明らかであろう。
【００３９】 特異的ＧＳＥの作用機序に応じて、ＧＳＥ配列の長さは、ＨＩＶ−１感染の阻
害能に影響を及ぼし得る。図３に示したウイルスゲノムの領域から選択した配列
は、好ましくは、少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０
ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長である。
【００４０】 別に、ＧＳＥは、付加、置換または欠失により変化し得、ＨＩＶ抑制機能の維
持についてアッセイし得る。ＧＳＥ配列の変化は、当業者には公知の様々な化学
的および酵素的方法を使用して作成し得る。例えば、オリゴヌクレオチド特異的
変異誘発を使用して、一定の様式でＧＳＥ配列を変化させ得、および／または配
列内の特定の領域に制限部位を導入し得る。さらに、欠失変異体を、Ｂａｌ３１
またはＥｘｏＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼ等のＤＮＡヌクレアーゼを使用して
作成し得る。ＧＳＥ配列の漸増的に大きな欠失は、ＤＮＡを、より長時間ヌクレ
アーゼと共にインキュベートすることにより作成し得る（変異誘発技法の論評に
ついては、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の現在のプロトコル
）参照）。
【００４１】 変化した配列は、適切な宿主細胞でのｐ２４等のＨＩＶタンパク質の発現を抑
制する能力について評価し得る。ＨＩＶ感染抑制能を保持した、任意の変化した
ＧＳＥ配列を、さらなる用途のために、組換え発現ベクターに組み込み得ること
は本発明の十分範囲内である。
【００４２】 ５．５．ＨＩＶ−１感染に対するＧＳＥによる非感染細胞の保護 選択したＧＳＥが、ＨＩＶ−１感染から非感染細胞を保護できることを確認す
るために、ＧＳＥを、ＨＩＶ感受性宿主細胞に移し得、次いでＨＩＶ感染させ得
る。保護実験は、潜在的なＨＩＶ−１ ＧＳＥを取込み、他の点ではＨＩＶ感染
に感受性である任意の細胞型で実施できる。一例として好ましい実施形態におい
て、ＣＥＭ−ｓｓ細胞系を使用する（Ｆｏｌｅｙら、１９６５、Ｃａｎｃｅｒ
１８：５２２〜２９）。ＨＩＶ−１の定量的感染性についての標的としてのＣＥ
Ｍ−ｓｓ細胞の使用は、Ｎａｒａ ＆ Ｆｕｓｃｈｉｎｇｅｒにより記載されて
いる（１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４６９〜７０）。ＨＩＶ感染に感受性
の他の細胞系は、ＨＵＴ−７８、Ｈ９、ジャーカットＥ６−１、Ａ３．０１、Ｕ
−９３７、ＡＡ−２、ＨｅＬａ ＣＤ４＋およびＣ８１６６を含むがこれに限定
されない。
【００４３】 潜在的なＨＩＶ−１ ＧＳＥの試験は、初期の選択段階中に細胞のＲＦＥライ
ブラリー形質導入に使用したのと同じ発現ベクター系を使用して実施できる。他
の実施形態において、ベクター系を修正して、より高いレベルの発現を達成でき
、例えば、リンカーを使用して、メッセージの翻訳効率を増加させるリーダー配
列を導入できる。１つのかかる配列は、Ｋｏｚａｋ、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｅ ７６：８１５〜８２１に開示される。
【００４４】 ＨＩＶに対するＧＳＥの効力を試験する別の方法は、潜在的ＨＩＶ−１ ＧＳ
Ｅの効果を無効にし得るＨＩＶ−１変異形が発達する迅速さを決定することであ
る。かかる試験は、ＣＥＭ−ｓｓ細胞等の感受性細胞の培養液の、低い感染多重
度での感染、並びに、繰返し培養液をアッセイして、ＨＩＶ−１感染が蔓延した
か、およびどの程度速やかに蔓延したかを決定することを含む。有用な感染多重
度の範囲は、１０６のＣＥＭ−ｓｓ細胞あたり、約１００ないし１０００の組織
培養感染単位（ＴＣＩＤ５０）である。ＴＣＩＤ５０は終点法により決定し、イ
ンプット感染多重度（ｍｏｉ）の決定に重要である。
【００４５】 潜在的なＨＩＶ−１ ＧＳＥの効果に耐性のＨＩＶ−１株の試験培養液におけ
る発達に関連したパラメータは、培養液中で感染した細胞の割合である。この割
合は任意の手段により決定できる。固定した透過化細胞のＨＩＶ−１ｐ２４抗原
に特異的な抗体による免疫蛍光染色は、感染した細胞の割合を決定する簡便な方
法である。市販で入手できる試薬は、かかる試験の実施に適している（Ｌｅｅら
、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：８２５４〜８２６４）。
【００４６】 以下の段落６．２では、ＧＳＥを、ＨＩＶ−１のＳＦ２およびＩＩＩＢ株によ
る感染からＣＥＭ−ｓｓ細胞を保護する能力について試験した。非感染細胞を、
非関連ＤＮＡまたはＧＳＥ配列を含むＬＸＳＮ構築物で形質導入した。非形質導
入細胞を、選択剤Ｇ−４１８への曝露により排除した。ｐ２４＋細胞の比率は、
感染後の特定の時点で決定した。結果により、試験したＧＳＥは、感受性宿主細
胞で増殖性ＨＩＶ−１感染を保護できることが示される。
【００４７】 ５．６．ＨＩＶ−１感染を抑制するためのＧＳＥの使用 本発明の別の態様は、ＨＩＶ感染に対して予防的にまたは治療的に、単離ＧＳ
Ｅを使用することである。これに関して、発現を制御するプロモータ等の調節配
列に作動可能に連結したＧＳＥを、インビトロで、ＣＤ４＋Ｔ細胞等の任意のＨ
ＩＶ感受性宿主細胞、あるいは骨髄または動員末梢血から得られたＣＤ３４＋細
胞等の造血前駆細胞に、電気穿孔法、トランスフェクションまたは形質導入等の
当分野で公知の任意のＤＮＡ導入技法により移し得、次いで細胞をレシピエント
に移植する。ＧＳＥ含有前駆細胞がインビボで分化する場合、前駆細胞は、ＧＳ
Ｅを発現し、ＨＩＶに耐性となる。
【００４８】 別に、ＧＳＥは、遺伝子療法発現ベクターを使用して、インビボで直接投与し
得る。特に、抗ＨＩＶ ＧＳＥは、ＨＩＶ感染の発達に対して保護するために、
ＨＩＶ感染または非感染個体の両方の、ＣＤ４＋Ｔ細胞に送達または移行できる
。ＧＳＥはまた、マクロファージを含む間質細胞に移行できる。
【００４９】 レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピロ
ーマウイルス等のウイルスから得られた発現ベクターを、組換えＧＳＥの標的細
胞個体群への送達に使用し得る。当業者に公知の方法を、発現を制御するプロモ
ータに作動可能に連結したＧＳＥ配列を含む組換えウイルスベクターを構築する
ために使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング実験
マニュアル）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の現在のプ
ロトコル）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓおよ
びＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク）。一例として具体的
な実施形態において、ＧＳＥ配列を、レトロウイルスベクターに挿入した。アデ
ノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、ＧＳＥ配列を、アデノウイルス
転写−翻訳制御複合体、例えば、後期プロモータおよび三部分リーダー配列にラ
イゲートし得る。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換
えにより、アデノウイルスゲノムに挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（
例えばＥ１またはＥ３領域）への挿入により、生存可能で、感染宿主でＧＳＥを
発現できる組換えウイルスが得られる（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ、１９８４
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３６５５〜３６５９
）。
【００５０】 別に、組換えＧＳＥ核酸分子は、標的細胞への送達のために、リポソームに再
構築できる。リポソームは、内部が水性で球状の脂質二重層である。リポソーム
形成時に水溶液中に存在する全ての分子（この場合、オリゴヌクレオチド）が、
この水性内部に取り込まれる。リポソーム内容物は、外部の微小環境から保護さ
れ、また、リポソームは細胞膜と融合するので、細胞の細胞質に効率的に送達さ
れ、ポリヌクレオチドの陰性電荷を中和する必要がない。
【００５１】 具体的な開始シグナルも、挿入ＧＳＥ配列の効率的な翻訳に必要であり得る。
ＡＴＧ開始コドンを含む、外来性翻訳制御シグナルが提供されなければならない
。さらに、開始コドンは、全挿入断片の翻訳を確実とするために、ＧＳＥ配列の
読み枠を含む相に存在しなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルお
よび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源であり得る。発現効率は
、適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子等を封入することにより増
強し得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１５３：５１６〜５４４参照）。
【００５２】 単離ＧＳＥ配列は、コードタンパク質またはＲＮＡ産物によりＨＩＶ活性を抑
制する。本発明は、融合タンパク質、リーダーペプチドおよび局在化シグナルを
含む、任意のかかるタンパク質産物を包含する。さらに、ＨＩＶ感染を阻害する
ように機能するアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ分子およびリボザイムも、本発明の
範囲内である。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的化ｍＲＮＡに結合
し、タンパク質翻訳を防ぐことにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接的に遮断するよう
に作用する。ＧＳＥは、おとりとして作用する構造的ＲＮＡにより示され得る。
【００５３】 いくつかのＧＳＥはまた、三本鎖を形成し得る。オリゴデオキシリボヌクレオ
チドは、二本鎖ＤＮＡの特異的相補配列に水素結合することにより、配列特異的
三重ラセンを形成できる。特異的三重ラセンの形成は、機能的なトランス作用因
子の特異的結合を禁止することにより、標的化遺伝子の複製および／または遺伝
子発現を選択的に阻害し得る。
【００５４】 三重ラセン形成に使用されるポリヌクレオチドは、一本鎖で、デオキシヌクレ
オチドからなるべきである。これらのポリヌクレオチドの塩基組成は、フーグス
ティーン型塩基対形成則を介して三重ラセン形成を促進するように設計しなけれ
ばならず、これは、一般にかなり大きなプリンまたはピリミジン伸長が二本鎖の
１つの鎖に存在することを必要とする。ポリヌクレオチド配列は、ピリミジンを
ベースとし得、これにより、ＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットが、得られた三重
ラセンの３つの会合した鎖に交差する。ピリミジンリッチなポリヌクレオチドは
、その鎖に平行な配向で、二本鎖の１つの鎖のプリンリッチな領域に塩基相補性
を提供する。さらに、プリンの豊富な、例えばＧ残基の伸長を含む、ポリヌクレ
オチドが選択され得る。これらのポリヌクレオチドは、ＧＣ対の豊富なＤＮＡ二
本鎖と三重ラセンを形成し、大半のプリン残基は、標的二本鎖の１つの鎖上に位
置し、これにより、ＧＧＣトリプレットは、三本鎖の３つの鎖に交差する。
【００５５】 別に、三重ラセン形成に標的化できる潜在的な配列は、いわゆる「スイッチバ
ック」オリゴヌクレオチドを創製することにより増加し得る。スイッチバックオ
リゴヌクレオチドは、５’−３’、３’−５’の交互の様式で合成され、よって
、それらは二本鎖の最初の１つの鎖と、次いで他方と塩基対を形成し、かなり大
きなプリンまたはピリミジン伸長が二本鎖の１つの鎖上に存在する必要はない。
【００５６】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リ
ボザイムの作用機序は、標的ＲＮＡに相補的なリボザイム分子の配列特異的ハイ
ブリッド形成、続くヌクレオチド鎖切断を含む。ＨＩＶ ＲＮＡ配列のヌクレオ
チド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する、頭部がハンマー状の工学モチーフリ
ボザイム分子は本発明の範囲内である。標的配列に高い親和性結合を示す、アン
チセンスＲＮＡにより示されるＧＳＥもまた、当業者に公知の酵素的に活性な配
列の添加によりリボザイムとして使用できる。
【００５７】 本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子の両方、およびリボザイムは、
当分野で公知の任意の方法により調製し得る。これらは、固相ホスホルアミジト
化学合成等の当分野で公知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成す
る技法を含む。別に、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮ
Ａ配列のインビトロおよびインビボでの転写により作成し得る。かかるＤＮＡ配
列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモータ等の適切なＲＮＡポリメラーゼ
プロモータを取り込んだ多種多様なベクターに取込み得る。別に、使用するプロ
モータに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成する、アン
チセンスｃＤＮＡ構築物を、宿主細胞に安定に導入できる。
【００５８】 核酸分子の様々な修正が、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として
導入され得る。可能な修正は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ドのフランキング配列の、分子の５’および／または３’末端への付加、または
、オリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなく
ホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用を含む。
【００５９】 ポリヌクレオチドを細胞または組織に導入する方法は、裸ポリヌクレオチドの
挿入（すなわち組織への注入による）、ＧＳＥの細胞へのエクスビボでの導入（
すなわち自己細胞治療における使用）、ウイルス、レトロウイルス、ファージま
たはプラスミド等のベクターの使用、または、インビボまたはエクスビボで使用
し得る電気穿孔法等の技法を含む。
【００６０】 ＧＳＥは、製剤化され得、全身、局在、または局所投与を含む、様々な手段に
より投与され得る。製剤化および投与の技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの医薬科学）」、
Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版に見出
し得る。投与形態は、生体の所望の標的部位への送達を最大限にするように選択
し得る。
【００６１】 全身投与のために、注入経路は、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む
。目的のポリヌクレオチドは、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液
、例えばハンクス液、リンガー液、または生理学的食塩水緩衝液中で製剤化する
。さらに、ポリヌクレオチドは、固体または凍結乾燥形で製剤化し得、その後、
使用直前に再溶解または懸濁する。
【００６２】 ６．実施例：ＨＩＶ−１に対するＧＳＥの単離および同定 ６．１．材料および方法 ６．１．１．ＲＦＥライブラリーの構築 ＨＩＶ−１ゲノムＤＮＡは、ＨＩＶ−１ＢＲＵ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
およびＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ、ロックビル、メ
リーランド州）（ＡＲＲＲＰ）の５’方向半分から得られたｐＢＥＮＮ７（製造
番号３４２）、ＨＩＶ−１ＳＦ２およびＨＩＶ−１ＨＸＢ２ゲノムＤＮＡの３’
方向半分から得られた９Ｂ／６Ｒを含む。１つのＲＦＥライブラリーを、ＤＮＡ
源として、ＨＩＶ−１ＢＲＵおよびＨＩＶ−１ＳＦ２由来ゲノムを使用して構築
した。二次ライブラリーを、ＨＩＶ−１ＨＸＢ２ゲノムＤＮＡから作成した。プ
ラスミドは、マンガンの存在下で、ＤＮＡｓｅＩで部分消化した（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング実験マニュアル）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）。これらの条件
下で、ＤＮＡｓｅＩは、ほぼ二本鎖破壊をもたらすことが知られる。得られた断
片を、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴ４ポリメラーゼのクレノウ断片で修復し、
合成的な二本鎖アダプターにライゲートした。一次ライブラリーのアダプター配
列は、３つのＡＴＧを含んだ： ５’−ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧ（配列番号２６）。
二次ライブラリーについては、１つのＡＴＧのみを使用した： ５’−ＧＡＴＴＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴ（配列番号２７）
。両方のライブラリーが、３つの終止コドンを含む同じ３’プライマーを使用し
た： ５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡ（配列番号２８）。
【００６３】 その後、混合物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、カラム精製し、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した、レトロウイルスベクターＬＸＳＮ（Ｍｉ
ｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、１９８９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９
８０〜９９０）にライゲートした。別に、断片を、ベクターＬＸＳＮｇｆｒ（こ
れは、ＬＸＳＮのネオマイシン耐性遺伝子を、切断短縮低親和性神経成長因子受
容体遺伝子で置換することにより構築した）にライゲートした。ライゲート混合
物を、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。全プラスミドを、〜１００，０００組変え
クローンから精製した。クローン化断片のサイズ分布を、アダプターに隣接した
ベクター配列から得られたプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅により試験した。
【００６４】 ６．１．２．細胞株および試薬 ＯＭ１０．１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、
ロックビル、メリーランド州、からＣＲＬ１０８５０（Ｂｕｔｅｒａ、米国特許
第５，２５６，５３４号）として入手できる。ＯＭ１０．１細胞は、ＨＩＶ−１ ＢＲＵ 単離株の単一のコピーを含む、ＨＬ−６０の慢性的に感染した前骨髄球ク
ローンであった。ＣＥＭ−ｓｓ細胞は、ＡＲＲＲＰから製造番号７７６として入
手できる。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２で１０％ウシ胎児血清を捕ったＲＰＭＩ
１６４０培地で維持した。両栄養性パッケージング細胞系ＢＩＮＧは、３７℃で
５％ＣＯ２で１０％ＦＢＳで捕捉したＤＭＥＭ中に維持した。永続的ＨＩＶ感染
細胞のＨＵＴ７８／ＨＩＶ−１ＳＦ２およびＨ９／ＨＩＶ−１ＩＩＩＢをＡＲＲ
ＲＰから得、ＨＩＶ−１ＳＦ２およびＨＩＶ−１ＩＩＩＢウイルスストックを調
製するために使用した。
【００６５】 抗ＣＤ抗体のＱ４１２０ＰＥ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）およ
びＬ１２０（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔ
ｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）、および抗ｐ２４（ＫＣ
−５７ＦＩＴＣ、Ｃｏｕｌｔｅｒ、ハイアリーア、フロリダ州）抗体を購入した
。ＴＮＦ−αは、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）から得た。Ｇ４１８は、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬからネオマイシンとして
購入した（ゲーサーズバーグ、メリーランド州）。
【００６６】 ６．１．３．トランスフェクションおよび形質導入 上記の段落６．１．１．の方法に従って調製したプラスミドＤＮＡを、標準的
なリン酸カルシウム法を使用して、パッケージング細胞系のＢＩＮＧに形質移入
した。ＬＸＳＮをベースとしたライブラリーおよびＧＳＥ用に、パッケージング
細胞を、２〜３時間、ＯＭ１０．１細胞またはＣＥＭ−ＳＳ細胞と共培養した。
３つの共培養物を、トランスフェクションの２４、４８および７２時間後に使用
した。次いで、細胞を、２週間、ネオマイシン選択下で増殖させた。生存細胞を
、「ＦＩＣＯＬＬ」を使用して精製し、任意のさらなる操作の前にネオマイシン
非含有培地で増殖させた。異なる方法を、ＬＸＳＮｇｆｒをベースとしたライブ
ラリーおよびＧＳＥに使用した。ＢＩＮＧ細胞からろ過したレトロウイルス上清
（２４時間および４８時間のウイルス）を使用して、１２００×ｇで９０分間遠
心分離することにより、標的細胞を感染した。１週間後、細胞を、ＮＧＦＲモノ
クローナル抗体で染色し、ＮＧＦＲ陽性個体群により示される形質導入細胞を、
４８８ｎｍアルゴンレーザーを装備したＦＡＣＳバンテージ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して選別した。細胞を、培地中で培養し、使用前にＮ
ＧＦＲについて検査した。
【００６７】 ６．１．４．免疫蛍光法およびフローサイトメトリー ＣＤ４＋またはＮＧＦＲ＋細胞の選択のために、１０７の細胞を、アッセイ緩
衝液（５００ｍｌのＰＢＳ、１ｍｌの０．５ｍＭのｐＨ８のＥＤＴＡ、０．５ｍ
ｌの１０％アジ化ナトリウムおよび１０ｍｌのウシ胎児血清）で２回洗浄し、５
００μｌのＰＢＳに再懸濁し、これに、５０μｌの抗ＣＤ４抗体、Ｑ４１２０Ｐ
ＥまたはＬ１２０、またはＰＥ接合抗ＮＧＦＲ抗体２０．４（ＡＴＣＣ）を加え
た。４℃で３０分間インキュベートした後、５ｍｌのアッセイ緩衝液を加え、細
胞を１２００ｒｐｍで４分間遠心分離した。細胞を、ＦＡＣＳにより選別する前
に、２回、アッセイ緩衝液で洗浄した。前記の手順を、無菌条件下で実施した。
【００６８】 ＨＩＶ感染細胞でのｐ２４発現を決定するために、細胞を、最初に２回、アッ
セイ緩衝液で洗浄した。約１０６の細胞を、１００μｌのアッセイ緩衝液に懸濁
し、２ｍｌのＯｒｔｈｏ ＰｅｒｍｅａＦｉｘ溶液（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ、ラリタン、ニュージャージー州）と混合し、４０分間、室温でイン
キュベートした。１２００ｒｐｍで４分間室温で遠心分離した後、細胞を、２ｍ
ｌの洗浄緩衝液（５００ｍｌのＰＢＳ、２５ｍｌのウシ胎児血清、１．５％ウシ
血清アルブミンおよび０．００５５％ＥＤＴＡ）に、１０分間、室温で再懸濁し
た。遠心分離後、細胞を、５０μｌの洗浄緩衝液に再懸濁し、１：５００希釈の
ＩｇＧ２ａ抗体と、２０分間、室温で混合し、次いで、５〜１０μｌの抗ｐ２４
抗体（ＫＣ５７−ＦＩＴＣ、Ｃｏｕｌｔｅｒ、ハイアリーア、フロリダ州）と共
に３０分間室温でインキュベートした。次いで、細胞を、２回、洗浄緩衝液で洗
浄し、フローサイトメトリーにより解析した。
【００６９】 ６．１．５．ＯＭ１０．１細胞におけるＧＳＥの選択 ＯＭ１０．１細胞（ＧＳＥライブラリーまたは挿入断片を含まないベクター）
の形質導入個体群を、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、５×１０５細胞／ｍｌの密
度で１０％ＦＢＳで捕捉したＲＰＭＩ中の０．１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、インディアナ州）
で誘導した。２４時間後、細胞を、ＰＥ結合抗ＣＤ４モノクローナル抗体で染色
した。ヨウ化プロピジウムを、選別する直前に、最終濃度１０μｇ／ｍｌとなる
まで加えた。ヨウ化プロピジウム陰性のＣＤ４陽性個体群を、フローサイトメト
リーにより選別した。細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを精製した。挿入断片を、ベ
クター由来プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、混合物をＢａｍＨＩおよびＥｃ
ｏＲＩで消化し、カラム精製し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ベクターにライゲ
ートし、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。形質転換体からの精製ＤＮＡを、その後
のラウンドの選択用のプールとして使用する、および／または個々に単離し、Ａ
ＬＦ ＤＮＡシーケンサー（ファルマシアＬＫＢ、ピスカタウェイ、ニュージャ
ージー州）を使用して配列決定した。
【００７０】 ６．１．６．ＧＳＥの増殖性感染選択 形質導入ＣＥＭ−ｓｓ細胞（ＧＳＥライブラリーまたは挿入断片非含有ベクタ
ー）を、ポリブレンの存在下で、１０６細胞あたり、３０００の組織培養感染用
量（ＴＣＩＤ５０）のＨＩＶ−１ＩＩＩＢで感染させた。感染の９日後、１０７ の細胞を、ＣＤ４およびｐ２４について染色した。ｐ２４陰性でＣＤ４陽性の個
体群を選別した。ゲノムＤＮＡ精製、挿入断片増幅およびサブクローニングを、
上記のように実施した。
【００７１】 ６．１．７．ＧＳＥの回収および配列解析 ゲノムＤＮＡを、推定ＧＳＥを有するＯＭ１０．１細胞またはＣＥＭ細胞の選
択した個体群から、細胞ペレットを、０．１％トリトンＸ−１００、１×ＰＣＲ
緩衝液中２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫに再懸濁し、５５℃で１時間インキュ
ベートし、１０分間煮沸することにより単離した。ゲノムＤＮＡを、ベクター由
来プライマーを使用するＰＣＲ増幅に使用し、ＬＸＳＮベクターにクローン化し
、当分野で公知の技法を使用してＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。個々のプラスミ
ドを、ＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを使用してＥ．ｃｏｌｉクローンから精製
した。挿入断片を、ジデオキシ手順（ＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により配列決定し、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ ＬＫＢ Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサーにかけた。配列は、ＤＮ
ＡＳＴＡＲプログラムを使用して解析した。
【００７２】 ６．２．結果 ＨＩＶ−１生活環は、２つの異なる段階からなる：増殖性または急性感染およ
び潜伏。理想のＨＩＶ阻害剤は、両方の段階に対して効果的であるべきである。
従って、ＨＩＶ−１ ＧＳＥの２つの選択アプローチを開発した。潜伏感染細胞
でのウイルス誘導を阻害するように設計された第１のアプローチは、ＯＭ１０．
１細胞の独特な特性を基にした。ＯＭ１０．１細胞でのＧＳＥの選択のために、
ＨＩＶ−１ ＲＦＥライブラリーを、ウイルスのゲノムを含むプラスミドから構
築した。全ライブラリーをパッケージング細胞系に形質移入した後、ウイルスを
、共培養によりＯＭ１０．１細胞に移した。ウイルス形質導入細胞を、Ｇ−４１
８を含む培養培地で選択して、ウイルスベクターの維持を確認した。
【００７３】 形質導入ＯＭ１０．１細胞を、ＴＮＦ−αで処理し、細胞表面分子ＣＤ４に特
異的な抗体で染色すると、約９０％の細胞に迅速なＣＤ発現の消失が観察された
（図１）。これに対し、約９９％の非誘導ＯＭ１０．１細胞がＣＤ４発現を維持
した。ＯＭ１０．１細胞でのＴＮＦ−αによる潜伏ウイルスの活性化は、細胞質
ＣＤ４に結合した、ウイルスタンパク質ｇｐ１６０／１２０の産生をもたらし、
これにより、その細胞表面の転位が防がれると考えられる。ＣＤ４＋ＯＭ１０．
１細胞の減少も、ＴＮＦ−α誘導後の細胞のウイルスタンパク質ｐ２４の産生増
加に関連していた（図２）。
【００７４】 これらの知見に基づいて、誘導に干渉できるＧＳＥの発現により、ＯＭ１０．
１細胞により表面ＣＤ４が保持されると期待された。少数の残留ＣＤ４＋細胞を
、抗ＣＤ４抗体で染色し、ＦＡＣＳにより選別した。細胞を培養液中で増殖した
後、個々のＧＳＥポリヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅により回収し、そのヌクレオ
チド配列を決定した。
【００７５】 第２の選択計画を、増殖性ＨＩＶ感染を阻害できるＧＳＥを選択するように設
計した。感受性細胞でのＨＩＶの複製は、細胞内ｐ２４の蓄積に関連し、同時に
表面ＣＤ２４はダウンモジュレーションする。増殖性感染選択のために、ＨＩＶ
−１ ＲＦＥライブラリーを、ウイルスのゲノムを含むプラスミドから構築した
。全ライブラリーを、ＣＥＭ−ｓｓ細胞に形質移入した。細胞を、ＨＩＶ−１Ｉ ＩＩＢ で感染させ、ＣＤ４陽性でｐ２４陰性細胞についてフローサイトメトリー
により選別した。
【００７６】 様々なＨＩＶ−１単離株からのＲＦＥライブラリーを、レトロウイルスベクタ
ーにクローン化した。ＬＸＳＮベクターの単離株ＨＩＶ−１ＢＲＵおよびＨＩＶ
−１ＳＦ２からのライブラリーを、ＯＭ１０．１選択に使用した。ＬＸＳＮベク
ターのＨＩＶ−１ＨＸＢ２からのライブラリーを、増殖性感染選択に使用した。
ＬＸＳＮｇｆｒベクターのＨＩＶ−１ＨＸＢ２からの三次ライブラリーを、ＯＭ
１０．１細胞の２つの個々の独立的な実験に使用した。各ＲＦＥライブラリーを
、標的細胞（ＯＭ１０．１またはＣＥＭ−ｓｓ）に移し、２ラウンドの選択を実
施した。系の再現性は、独立的な導入および同じＲＦＥライブラリーの選択によ
り示した。ＯＭ１０．１細胞での第二ラウンドの選択後、４０〜５０％のエレメ
ントが、ＨＩＶ−１ゲノムの数個の短い領域に由来し、これは、これらの配列の
選択を示す。全ての選択に豊富な個々のエレメントの配列比較により、７つの重
複配列のクラスターが判明し、５つはセンス配向で２つはアンチセンス配向であ
った（図３）。２つのクラスターは、ＨＩＶ−１ゲノムの領域に由来し、２つ以
上のウイルス遺伝子が重複する（ｖｐｒ／ｔａｔ、ｒｅｖ／ｔａｔ、ｅｎｖ／ｎ
ｅｆ）。いくつかのエレメントが、増殖性感染選択で単離されたものとほぼ同一
であった。従って、３つのクラスター（ｎｅｆセンスクラスター、ｒｅｖ／ｔａ
ｔセンスクラスター、およびｖｐｒ／ｔａｔアンチセンスクラスター）を、全て
のライブラリーおよび選択で同定した。逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子からのセンス
配向エレメントのクラスターが、増殖性感染選択のみに見出され、これはおそら
く、逆転写が組込みに先行したためであろう。配列番号１〜２５は、センスまた
はアンチセンス配向のＧＳＥに対応する選択ポリヌクレオチドのヌクレオチド配
列を示す。より具体的には、配列番号１のＧＳＥ ＩＧＸ−１４９は、ｇａｇ（
ｐ２４）センス配向である。ＩＧＸ−１０４（配列番号２）、ＩＧＸ−１０９（
配列番号３）およびＩＧＸ−１０２（配列番号４）は、ｐｏｌ（逆転写酵素）セ
ンス配向にある。ＩＧＸ−１１１（配列番号５）、ＩＧＸ−０１３（配列番号６
）、ＩＧＸ−０１８（配列番号７）、ＩＧＸ−１１７（配列番号８）、ＩＧＸ−
２１７（配列番号９）およびＩＧＸ−０５０（配列番号１０）は、ｖｐｒ／ｔａ
ｔセンス配向にある。ＩＧＸ−１２０（配列番号１１）、ＩＧＸ−１０８（配列
番号１２）、ＩＧＸ−０３１（配列番号１３）およびＩＧＸ−２０１（配列番号
１４）は、ＲＦＥアンチセンス配向にある。ＩＧＸ−１０３（配列番号１５）お
よびＩＧＸ−１７１（配列番号１６）は、ｒｅｖ／ｔａｔセンス配向にある。Ｉ
ＧＸ−２２２（配列番号１７）、ＩＧＸ−００３（配列番号１８）、ＩＧＸ−２
１９（配列番号１９）、ＩＧＸ−２１０（配列番号２０）、ＩＧＸ−２２１（配
列番号２１）およびＩＧＸ−１５１（配列番号２２）は、ｅｎｖ／ｎｅｆアンチ
センス配向にある。ＩＧＸ−０７８（配列番号２３）、ＩＧＸ−１２１（配列番
号２４）およびＩＧＸ−１４０（配列番号２５）は、ｎｅｆセンス配向にある。
【００７７】 ＨＩＶ−１ゲノムの狭く限定された領域からの重複配列を有するＧＳＥが、異
なるＨＩＶ−１単離株を使用して、異なる選択系で単離されたという事実は、こ
れらのＧＳＥが、ウイルスゲノムの機能的に重要で保存された領域に由来するこ
とを示す。驚くべきことに、以前に標的化していない領域（ＲＴおよびｎｅｆ）
からのＧＳＥのクラスターも単離された。
【００７８】 第１のＯＭ１０．１選択からのＧＳＥを、ＴＮＦ−αによるＨＩＶ−１誘導を
防ぐ能力についてさらに試験した。誘導後、陰性対照（ＯＭ１０．１細胞および
ＬＸＳＮベクターを有するＯＭ１０．１細胞）は、１０％のＣＤ４陽性細胞のバ
ックグラウンドレベルを示した（図４）。プラスミドベクターからのアノニマス
ＤＮＡ挿入断片を含む２つの追加の陰性対照（３４番および２２０番）は８〜１
１％ＣＤ４陽性であった。しかし、個々のＧＳＥは、ＴＮＦ−αでの誘導時に、
１８〜２６％の形質導入細胞に、ＣＤ４を維持させることにより、一貫した再現
性の阻害効果を示した（図４）。これに対し、トランスドミナント変異体のＲｅ
ｖＭ１０（Ｍａｌｉｎら、１９８９、Ｃｅｌｌ ５８：２０５）を含むＯＭ１０
．１細胞は、潜伏からウイルスの誘導を阻害するのに効果的ではなかった。
【００７９】 ＯＭ１０．１選択により単離したＧＳＥを、増殖性ＨＩＶ−１感染からの非感
染ヒトＴ細胞を保護する能力について試験した。これらの各配列を含むプラスミ
ドを、ＣＥＭ−ｓｓ細胞に移し、次いでＧ４１８選択を実施した。Ｒｅｖトラン
スドミナント変異体のＲｅｖＭ１０および関連性のないプラスミドＤＮＡ片（３
４番）を含むＬＸＳＮベクターを、対照として使用した。Ｇ４１８耐性細胞は、
９９％ＣＤ４＋であり、次いで、低力価（５００〜１０００のＴＣＩＤ５０）の
ＨＩＶ−１ＳＦ２または高力価（３０００のＴＣＩＤ５０）のＨＩＶ−１ＩＩＩ Ｂ で感染させた。細胞を、感染後の様々な日に取り出し、ＨＩＶ感染の指示薬と
しての蛍光抗ｐ２４抗体で染色した。
【００８０】 ＨＩＶ−１ＳＦ２による感染時に、細胞内ｐ２４染色により決定したところ、
増殖性感染の発達に、有意な遅延が観察された（図５Ａ）。増殖性感染選択で単
離されたＧＳＥは、ＯＭ１０．１選択からのものと重複した配列を有し、ウイル
ス攻撃時に類似の効果を示した。増殖性感染選択で単離されたエレメントのＲＴ
クラスターは、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢで攻撃した場合に阻害効果を示した（図５Ｂ
）。全ての感染において、ＧＳＥは、Ｔ細胞における既知のＨＩＶ−１複製阻害
剤である、トランスドミナント変異体のＲｅｖＭ１０と類似またはより良好な阻
害効果を示した。
【００８１】 結論すると、大量のＧＳＥが、ＴＮＦ−αでの誘導による潜伏ＨＩＶの活性化
後の、ＯＭ１０．１細胞のＣＤ４発現を維持する能力に基づき、または、ＣＥＭ
−ｓｓ細胞での増殖性ＨＩＶ感染を阻害する能力に基づき、ＨＩＶ−１ゲノムか
ら単離されている。単離されたＧＳＥは、センスおよびアンチセンス配向の両方
のヌクレオチド配列を含み、ＨＩＶ−１ゲノムの異なる領域にマッピングされる
。インテグラーゼ、ＮｅｆおよびＲｅｖ／Ｔａｔ遺伝子の一部に対応する数個の
エレメントが、感染細胞のｐ２４レベルを減少させることにより、Ｔ細胞のＨＩ
Ｖ−１感染を抑制できる。かかるポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１による感染を
防御するのに、および／またはヒト宿主細胞でのＨＩＶ−１の複製を抑制するの
に有用である。
【００８２】 本発明は、例示した実施形態により範囲を限定されず、本発明の個々の態様の
説明として捉える。実際に、本明細書に示し記載したものに加えて、本発明への
様々な変形が、前記載および添付の図面から当業者には明らになるだろう。この
ような変形は、添付の特許請求の範囲内に該当すると捉えられる。
【００８３】 本明細書に引用した全ての刊行物は、参考としてその全体を取込む。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＤ４＋ＯＭ１０．１細胞の比率は、ＴＮＦ−α誘導後に減少する；ＴＮＦ誘
導細胞、−■−；非誘導細胞、−◆−。
【図２】 ＯＭ１０．１細胞のＨＩＶ ｐ２４レベルは、ＴＮＦ−α誘導後に増加する；
ＴＮＦ−α誘導細胞、−◆−；非誘導細胞、−■−。
【図３】 ＨＩＶ−１ＢＲＵゲノム上の単離ＨＩＶ ＧＳＥの位置。矢印は、アンチセン
ス配向エレメントを示し、一方、陰のついたボックスは、センス配向エレメント
を示す。ＨＩＶ−１ゲノムの目盛りはキロベースである。
【図４】 ＴＮＦ−α誘導後にＧＳＥを含むＯＭ１０．１細胞のＣＤ４保持レベルである
。
【図５】 ＧＳＥを含むＣＥＭ−ｓｓ細胞のウイルス感染の時間経緯である。結果は、感
染後の特定の日におけるｐ２４陽性細胞の比率として示す。全ての結果が代表的
な実験から得られたものである。図５Ａ：ＩＧＸ−１１７（ｖｐｒ／ｔａｔセン
ス、配列番号９）、ＩＧＸ−２０１（ＲＲＥアンチセンス、配列番号１５）およ
び対照を含む、ＣＥＭ−ｓｓ細胞を、ＨＩＶ−１ＳＦ２の５００のＴＣＩＤ５０ で感染させた。図５Ｂ：ＩＧＸ−１０４（ＲＴセンス、配列番号２）および対照
を含むＣＥＭ−ｓｓ細胞を、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢの３０００のＴＣＩＤ５０で感
染させた。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月８日（２００１．１．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ホルツマイアー、 ターニャ エイ． アメリカ合衆国 94043 カリフォルニア 州 マウンテン ヴュー ウィンドミル パーク レーン 880 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA02 EA04 HA15 4B065 AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZC552 4C087 AA02 BC83 NA14 ZC55

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１〜２５のいずれか１つに列挙したヌクレオチド配
    列を含む、単離ポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、調節配列
    に作動可能に連結され、前記ヌクレオチド配列の宿主細胞での発現は、ＨＩＶ−
    １による感染を抑制する、前記単離ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 組換えベクターに含まれる、請求項１に記載の単離ポリヌク
    レオチド。
  3. 【請求項３】 発現ベクターに含まれる、請求項１に記載の単離ポリヌクレ
    オチド。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載のベクターを含む遺伝子改変宿主細胞。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列をペプチドとして発現する、請求項４
    に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  6. 【請求項６】 ヌクレオチド配列をＲＮＡとして発現する、請求項４に記載
    の遺伝子改変宿主細胞。
  7. 【請求項７】 細胞を請求項１に記載のポリヌクレオチドと接触させ、それ
    によって前記細胞でのＨＩＶ複製を阻害することを含む、ＨＩＶ感染を阻害する
    方法。
  8. 【請求項８】 被検者のＨＩＶ感染を治療する方法であって、前記被検者に
    、治療有効量の請求項１に記載のポリヌクレオチドを投与することを含む、前記
    方法。
  9. 【請求項９】 高緊縮な条件下で、配列番号１〜２５のいずれか１つに相補
    的な第２のヌクレオチド配列にハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む、
    単離ポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能
    に連結され、前記ヌクレオチド配列の宿主細胞での発現は、ＨＩＶ−１による感
    染を抑制する、前記単離ポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 組換えベクターに含まれる、請求項９に記載の単離ポリヌ
    クレオチド。
  11. 【請求項１１】 発現ベクターに含まれる、請求項９に記載の単離ポリヌク
    レオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１１のベクターを含む、遺伝子改変宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 前記ヌクレオチド配列をペプチドとして発現する、請求項
    １２に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 ヌクレオチド配列をＲＮＡとして発現する、請求項１２に
    記載の遺伝子改変宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 ＨＩＶ感染を阻害する方法であって、細胞を請求項９に記
    載のポリヌクレオチドと接触させ、よって前記細胞でのＨＩＶ複製を阻害するこ
    とを含む、前記方法。
  16. 【請求項１６】 被検者のＨＩＶ感染を治療する方法であって、前記被検者
    に、治療有効量の請求項９に記載のポリヌクレオチドを投与することを含む、前
    記方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL94482A (en) * 1989-05-25 2003-09-17 Univ Duke Transdominant repressor mutant of retroviral protein, dna encoding the protein and process for their preparation and use thereof
US5217889A (en) * 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
WO1993012234A1 (en) * 1991-12-13 1993-06-24 Sri International Antiviral reagents based on rna-binding proteins
US6107062A (en) * 1992-07-30 2000-08-22 Inpax, Inc. Antisense viruses and antisense-ribozyme viruses
WO1997007808A1 (en) * 1995-08-25 1997-03-06 The Regents Of The University Of California Chimeric antiviral agents which incorporate rev binding nucleic acids
US5753490A (en) * 1995-11-28 1998-05-19 Clinical Technologies, Inc. Recombinant HIV and modified packaging cells and method for treating acquired immune deficiency syndrome
US6426412B1 (en) * 1995-12-20 2002-07-30 Subsidiary No. 3, Inc. Nucleic acids encoding human immunodeficiency virus type 1 genetic suppressor elements
US6071743A (en) * 1997-06-02 2000-06-06 Subsidiary No. 3, Inc. Compositions and methods for inhibiting human immunodeficiency virus infection by down-regulating human cellular genes

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