JP2002536416A5 - - Google Patents
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Description
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ワクチンとして使用できる免疫性組成物
【特許請求の範囲】
【請求項１】 免疫性組成物であって、該免疫性組成物が、
・哺乳動物において標的細胞との結合および次の融合によって感染を誘起する感染性病原体の１つおよび／または複数の標的受容体を発現する、細胞、ベクターおよびリポソームからなる群から選択される第１手段を、上記標的受容体を識別する病原体の領域を少なくとも発現する第２手段とともに、該第１および第２手段との間で複合体を形成するよう第１，第２手段の相互作用を可能とする条件において、インキュベーションを行うことによって得られる調製体から生成され、
ここで前記第２手段は、
少なくとも１つの受容体に対する少なくとも１つの結合領域を担持するベクター（特に、ウイルスベクター）によってあらかじめ形質転換された細胞であるか、
少なくとも１つの標的受容体に対する少なくとも１つの結合領域を担持するウイルスベクターから構成されているか、
病原体を生成する感染した細胞であるか、感染性病原体から構成されているか、
ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質の少なくとも保存領域を含むウイルスベクターによってあらかじめ形質転換された細胞から構成されているか、このようなウイルスベクターから構成されているか、
ＨＩＶを生成する感染した細胞であるか、ＨＩＶウイルス自体から構成されているか、または、
自然の形または組換えた形のｇｐ１２０またはｇｐ１６０ＨＩＶエンベロープタンパク質から構成されているか、この種のタンパク質の少なくとも保存領域から構成され、
・上記インキュベーション段階は、融合段階に対応する複合体を生ずるような期間に従って遂行され、
・生成した複合体を固定剤と、抗体が形成されるべきエピトープの暴露およびコンホメーションによって複合体を固定するような期間にわたって接触させ、
・上記第１，第２手段が、哺乳動物に許容されることを特徴とする、免疫性組成物。
【請求項２】 第１手段が、哺乳動物の自家移植細胞、および、特に、ワクチンを投与すべき患者から採取したヒトの健全細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】 第１手段が、表面に１つまたは複数の標的受容体を発現するベクターであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】 第１手段が、表面に１つまたは複数の標的受容体を担持するリポソーム、特に、請求項３に定義の如きベクターであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】 上記病原体が、ウイルス、特に、レトロウイルス、バクテリア、ミコバクテリアまたは寄生虫（例えば、Plasmodium sp,Leishmania sp,Trypanosoma cruziおよびTrypanosoma brucei）であることを特徴とする請求項１−４の１つに記載の組成物。
【請求項６】 病原体が、ＨＩＶであることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】 上記調製体が、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現する第１手段を、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質の少なくとも保存領域を発現する第２手段とともにインキュベーションを行うことによって得られることを特徴とする請求項１−４の１つに記載の組成物。
【請求項８】 使用した第１手段が、所望の相互作用のために十分な量のＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現するよう刺激された哺乳動物の自家移植細胞から構成されていることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】 第１手段が、表面にＣＤ４および／またはＨＩＶ共受容体を発現するウイルスベクター、例えば、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルスまたは更には酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】 第１手段が、表面にＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現するリポソームであり、上記発現がウイルスベクターによって行われることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】 ＨＩＶ共受容体の１つが、モノクロナール抗体で置換されていることを特徴とする請求項７−１０の１つに記載の組成物。
【請求項１２】 該組成物が、第１手段としての可溶性のＣＤ４と、第２手段としての、場合によっては組換えられた形の可溶性のｇｐ１２０とを含み、共受容体に固定されるｇｐ１２０のゾーンに対して向けられるモノクロナール抗体と共に含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】 調製体が、インキュベーション後、アルジドリチオール−２で固定されていることを特徴とする請求項１−１２の１つに記載の組成物。
【請求項１４】 請求項１−１３の１つに記載の組成物に対して形成された、新規の製品としての血清および抗体。
【請求項１５】 哺乳動物への投与のための、感染性病理因子に対するワクチン組成物において、該組成物が、請求項１−１３の１つに記載の有効量の免疫組成物を、哺乳動物への投与のために許容される不活性ビヒクルと共に、場合によっては更にアジュバントと共に、含むことを特徴とするワクチン組成物。
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、特に、哺乳動物において、感染性病理因子に対して、特に、ワクチンとして使用できる免疫性組成物に関する。
【０００２】
本発明にもとづき標的病理因子は、細胞依存性タイプであり、即ち、感染プロセスが、哺乳動物の標的細胞に対する病原体の結合（および、場合によっては付随する融合）の後で進展する。
【０００３】
【従来の技術】
病原体（agents pathogenes）によって誘起される感染時に上記病原体の若干の領域によって果たされる主要な役割は公知である。
【０００４】
従って、例えば、ＨＩＶに関して、多くの研究において、標的細胞の受容体（ＣＤ４受容体および化学反応性受容体（例えば、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４））との相互作用に関連する領域がウイルスエンベロープの保存領域であることが判明している。
【０００５】
上記領域に対する抗体の形成には、現在まで、重要なエピトープへのアクセスの問題がある。複雑な相互作用および構造変化が、標的細胞に対するウイルスの結合および以降の融合の間に起こり、その結果、融合領域のエピトープへのアクセスが阻止され、追加暴露時間の極めて短い標的細胞との相互作用に直接に関連する細胞の近傍領域のエピトープへのアクセスが困難となる。
【０００６】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８３，１５．０１．１９９９に記載のＬａＣａｓｓｅらの実験システムによって、マウスにおいて、ＨＩＶの感染性分離体（仏isolats、英isolates）に対して中和作用を有する抗体の形成が達成され、従って、対応して、上記エピトープへのある程度のアクセス性が達成されると云える。
【０００７】
提案のシステムは、ＨＩＶ−１（Ｐ１６８）の１次分離体の機能エンベロープを発現するよう改質した真猿類線維芽細胞腫をＣＤ４受容体およびＣＣＲ５共受容体を発現するヒトの神経芽細胞腫と融合し、次いで、融合期間の４−５時間後に、形成された複合体をホルムアルデヒドで固定することによって得られる。マウスに関する実験において、この種の複合体は、著しく多種類のサブタイプに起因するＨＩＶの感染性分離体に対して中和作用を有する抗体を形成できるということが判明した。
【０００８】
しかしながら、この種のシステムは、免疫性複合体を形成する細胞集団の潜在的危険性を考慮してヒトには使用できない。
【０００９】
更に、システム生成のために使用される条件は、エピトープのコンホメーションの維持および大きい当該領域に対するアクセスを保証しない。
【００１０】
本発明者は、融合の進展および固定実施条件の制御によって、融合に関与するエピトープの近傍にあるエピトープを含む当該のエピトープが特に十分に暴露され且つその自然のコンホメーションに保持されることになる段階において複合体を得た。さて、この種の複合体において実証されている免疫性質は、複合体調製のために適切な製品を使用した場合にヒトに使用できるという著しい利点を有するワクチンの生成のための選択優位性をなす。
【００１１】
この種のシステムは、有利なことには、標的細胞との結合段階および、場合によっては、次の融合段階を含む感染プロセスを有するすべてのタイプの病原体に一般的に適用できる。
【００１２】
【発明の開示】
従って、本発明の課題は、細胞感染に依存する感染性病理因子に対して、哺乳動物に使用できる免疫性組成物およびワクチン組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明は、更に、上記組成物に使用される新規の製品としての免疫性複合体、および標的細胞との融合に関連する細胞の近傍の、しかも、直近の病原体の領域のエピトープに対して形成される抗体を意図する。
【００１４】
本発明に係る免疫性組成物は、該組成物が、
・上記の如き感染性病原体の１つおよび／または複数の標的受容体を発現する第１手段を、上記標的を認識する病原体の領域を少なくとも発現する第２手段とともに、複合体を形成するよう第１，第２手段の相互作用を可能とする条件において、インキュベーションを行うことによって得られる調製体から生成され、
・上記インキュベーション段階は、異なる融合段階に対応する複合体を生ずるよう異なる期間（duree）に従って（それゆえ新たに脱マスクされたエビトープの暴露およびコンホメーションによって）遂行され、
・抗体の形成が望ましいエピトープ（すなわち形成されるべき抗体に対するエピトープ）の異なる暴露およびコンホメーションによって複合体を固定するよう、生成した複合体を固定剤（仏agent fixateur、英binding agent）と異なる期間にわたって接触させ、
・上記第１，第２手段が、哺乳動物に許容される（仏tolerer、英tolerate）ことを特徴とする。
【００１５】
本発明の実施例にもとづき、第１手段は、哺乳動物の自家移植（autologues）細胞である。ワクチンを投与すべき患者から採取した健全細胞、例えば、ヒトの特に全ＰＢＭＣ，リンパ細胞または分離されたマクロファージが対象である。
【００１６】
上記細胞は、必要あれば、所望の相互作用に必要な十分量の１つまたは複数の受容体を発現するよう刺激される。
【００１７】
本発明の他の実施例にもとづき、上記第１手段は、表面に１つまたは複数の標的受容体を発現するベクターである。この種のベクターは、例えば、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）または更には酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）を含む。
【００１８】
本発明の更に他の実施例にもとづき、第１手段は、正しく表現され、従って、標的細胞を模倣する１つまたは複数の標的受容体を表面に担持するリポソームである。
【００１９】
（１つまたは複数の通路を有する）標的トランスメンブラン受容体は、昆虫、酵母または哺乳動物の細胞表面（１０６−１０７／細胞）に発現ベクターにもとづき多量に発現された受容体から生じたリポソーム内に含まれている。リポソームへの細胞受容体の通過は、細胞膜の分離後、Ｒｉｇａｕｄのプロトコル（以下の引用参照）に従う適切な洗剤（detergent）によるその処理後、且つ適切な膜内におけるその封入（inclusion）後に行われる。
【００２０】
本発明にもとづき、使用した第２手段は、標的細胞と結合でき且つ上記細胞と融合できる感染性病原体の領域であって少なくともこの領域を発現する手段である。
【００２１】
本発明にもとづき使用する第２手段は、更に、少なくとも１つの標的受容体に対する少なくとも１つの結合領域を担持するベクターによってあらかじめ形質転換された細胞で構成される。上記の如きウイルスベクター、即ち、バキュロウイルス、ＳＦＶまたは、更に、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）が有利である。
【００２２】
変更例にもとづき、第２手段は、ウイルスベクター自体から構成される。
【００２３】
他の変形例にもとづき、第２手段は、病原体を生成する感染した細胞であるか、感染性病原体自体から構成されている。
【００２４】
上記病原体は、ウイルス、特に、レトロウイルス、バクテリア、ミコバクテリアまたは寄生虫（例えば、Plasmodium sp,Leishmania sp,Trypanosoma cruziおよびTrypanosoma brucei）であってよい。
【００２５】
本発明は、ＨＩＶの場合に特に有用である。この用語は、ヒトまたは動物の各種株の分離体および自然のまたは組換えた、場合によっては、変異したエンベロープを有するウイルスを定義するために、詳細な説明および請求項で使用した。
【００２６】
従って、本発明は、特に、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現する第１手段を、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質の少なくとも保存領域を発現する第２手段とともにインキュベーションを行うことによって上記調製体を調製した免疫性組成物を対象とする。
【００２７】
詳細な説明および請求項で使用した如き表現“エンベロープ・タンパク質”は、天然タンパク質および当業者に周知の組換えたタンパク質または変異したタンパク質を含む。変異したタンパク質は、標的受容体との融合後に生成される抗体によって認識されるエンベロープ・サイトを同定できるという利点を有する。
【００２８】
この種の組成物の場合、使用した第１手段は、上記の如き哺乳動物の自家移植細胞から構成されている。上記細胞は、所望の相互作用のために十分な量のＣＤ４受容体および／またはＣＤ４共受容体（例えば、ＣＣＲ５，ＣＸＣＲ４，バンド３タンパク質または他のトランスメンブラン・タンパク質）を発現するよう刺激される。刺激は、例えば、ＰＨＡおよび／またはＩＬ２によって行う。
【００２９】
変更例にもとづき、第１手段は、表面に、ＣＤ４および／またはＨＩＶ共受容体を発現するウイルスベクターである。上記の如く、この種のベクターは、バキュロウイルス、ＳＦＶまたは更には酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）を含む。
【００３０】
更に他の変更例の場合、第１手段は、上述したように、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を表面に発現するリポソームである。従って、上記リポソームは、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を含むことができる。
【００３１】
有利には上記第１手段を含むこの種の組成物の場合、使用する第２手段は、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープ・タンパク質の少なくとも保存領域を発現する。
【００３２】
上記第２手段は、ＨＩＶのエンベロープ・ウイルスベクターによってあらかじめ形質転換された細胞、または、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０タンパク質の少なくとも保存領域から構成される。上記の如きウイルスベクターが有利である。
【００３３】
変更例にもとづき、第２手段は、ウイルスベクター自体から構成される。
【００３４】
他の変更例の場合、第２手段は、ＨＩＶを生成する感染した細胞であるか、ＨＩＶウイルス自体から構成されている。１次分離体から得られる紡錘形（英fusogenic）ウイルスを使用するのが有利である。
【００３５】
ここで付言するが、本発明にもとづき、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０タンパク質またはｇｐ１２０またはｇｐ１６０タンパク質の少なくとも保存領域を含むタンパク質は、自然の形または組換えた形または変異した形である。
【００３６】
上記第２手段は、この種のタンパク質から構成され、従って、場合によっては組換えた形の可溶性のｇｐ１２０モノマーまたは、同じく場合によっては組換えた形のｇｐ１２０またはｇｐ１６０オリゴマーであれば有利である。更に、これらは少なくとも保存領域を含む上記タンパク質の一部であってもよい。
【００３７】
本発明の有利な実施例の場合、第２手段は、抗共受容体性モノクロナール抗体を含む。例えば、モノクロナール抗体１７ｂ，４８ｄまたはＣＧ１０が対象となる。この構成（disposition）によって、ｇｐ１２０の共受容体に対する結合サイト（共受容体がｇｐ１２０に結合しているサイト）の近傍にある当該のエピトープにアクセスできる。
【００３８】
このタイプの好ましい組成物は、分子の形であり、第１手段としての可溶性のｇｐ１２０モノマーと、第２手段としての可溶性のＣＤ４と、上記の如きモノクロナール抗体またはこの種の抗体のＦａｂフラグメント（断片）とを含む。
【００３９】
第１，第２手段のインキュベーションは、第１手段が第２手段との融合プロセスに関与するような複合体を形成するよう実施される。
【００４０】
上記工程を異なる期間にわたって実施するのが有利であり、かくして、各種の融合段階を実現でき、動物実験によって、所望の免疫性に関してより良い結果を与える段階を選択できる。
【００４１】
概ね、１５分間〜５時間の期間で操作する。
【００４２】
上記の各段階のコンホメーションは、当該のエピトープを有意に変性することなく融合を停止できる試薬の添加によって固定される。
【００４３】
これに関して特に好ましい固定剤は、２，２´−ジチオピリシン（アルジドリチオール（aldidrithiol）−２、略してＡＴ−２と呼ぶ）から構成される。
【００４４】
研究応用を意図する場合は特に、他の固定剤（例えば、ホルモール）を使用できる。
【００４５】
固定は、異なる期間において実施され、従って、存在するエピトープの不動化に関する固定反応速度論（cinetique）作用の効果を検討できる。
【００４６】
得られた調製体は、回収、洗浄し、適切な緩衝溶液中に懸濁させる。
【００４７】
次いで、動物について、より良い免疫応答を誘起するための、かつ感染を阻止する抗体を生成するためのより良い融合固定時点を評価する。
【００４８】
本発明は、融合固定工程から得られる、新規の製品としての抗原性複合体を意図する。
【００４９】
特に結晶化した形の上記複合体は、有利な態様で、エンベロープのｇｐ１２０および／またはｇｐ４１の相互作用サイトおよび上記サイトの直近の領域を検討し、明示するために、有利に使用できる。
【００５０】
上記の免疫性組成物の調製法は、同じく、本発明の枠内にある。この方法は、上記第１，第２手段の使用と、上記の如きその融合およびその固定とからなる。
【００５１】
本発明の組成物の免疫性の検討によって、その強い免疫能を証明できる。
【００５２】
従って、ＣＤ４＋，ＣＸＣＲ５＋トランスジェニックマウスまたはウサギに上記組成物を投与した後に採取した血清は、抗体の高い比率（含有量）を示した。
【００５３】
上記血清および上記血清から調製した抗体は、従来の技術によって精製され、本発明の部分をなす。
【００５４】
従って、上記抗体は、抗原抗体反応にもとづき、感染性病原体を識別でき、かくして、その感染能を阻止できることを特徴とする。
【００５５】
哺乳動物についてインビボで実施した実験から明らかな如く、精製した血清および抗体は、ＨＩＶの１次分離体の大きい（広範な）スペクトルの感染性を阻止できる。
【００５６】
従って、本発明は、場合によってはアジュバントないしは添加剤と組合せた、哺乳動物に投与できる不活性のビヒクルを含む、上記の如き有効量の免疫性組成物を含むことを特徴とするワクチン組成物を意図する。
【００５７】
ワクチンを投与すべき哺乳動物の器官の免疫反応を増進できるアジュバントとして、無機アジュバント（例えば、リン酸アルミニウム）、油性アジュバント（例えば、不完全フロインドアジュバント）、バクテリア源アジュバント（例えば、完全フロインドアジュバント）を挙げる。特に好ましいアジュバントは、アジュバントＲｉｂｉからなる。
【００５８】
ワクチン組成物は、注射によってまたは経口で投与し、注射の３ヶ月後に追加投与する。
【００５９】
ワクチン組成物は、感染性病原体の抗原に関して宿主に免疫を与えることができるプロトコルにもとづき十分量だけ投与する。
【００６０】
本発明の他の特徴および利点は、下記の実施例から明らかであろう：
【００６１】
【発明の実施の形態】
細胞性免疫組成物の調製
一方では、ワクチンを投与すべき患者から採取され、ＪＶＩ １９９８，７１：８２７３−８２８０のＲｉｌｅｙらの方法にもとづき３−６日間ＰＭＡ／ＩＬ２で励起（stimulation）した後ＣＤ４／ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４を発現するヒトの自家移植細胞を使用し、他方では、ＨＩＶ−１の１次分離体またはこの種の分離体によって感染された細胞を使用した。
それぞれ１５，３０，４５，６０，１２０，１８０，２４０および３００分間の各期間にわたって３７℃においてインキュベーションを行うため、これら２つの集団を各ペトリボックスに分配した。各実験のため、３×１０６〜１０８の自家移植細胞および、例えば、ＨＩＶの２つの共受容体ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を利用するエイズ・リサーチ・アンド・リファレンス・プログラム，ＮＩＨ（ＥＵＡ）から得た１次分離体９２ＨＴ５９３またはＡＣＨ１６８．１０を使用した。
所定の期間の終了後、ＡＴ−２を６００−１０００μｍの割合でＰＢＳ溶液として加えた。固定は、４℃において、Ｒｏｓｓｉｏら（ＪＶＩ，１９９８，７２，７９９２参照）が推奨している如き時間、即ち、１−１２時間にわたって実施した。−８０℃で保存するため、形成された細胞複合体をＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）で洗浄、回収し、１０６〜１０８細胞／０，１ｍｌの割合でＰＢＳ／（ＤＭ５０ １０％）中に懸濁させた。
凍結した病原体を解凍し、複数回洗浄し、次いで、同量のアジュバント、例えば、Ｒｉｂｉ（Ｒ−７００またはＲ−７３０）を加えた。
【００６２】
ウイルスベクターを含む免疫性組成物の調製
実施例１と同様に操作した。但し、一方では、ＣＤ４およびＣＣＲ５受容体および／またはＣＸＣＲ４を表面に担持するバキュロウイルス系を使用し，他方では、ｇｐ１２０モノマーまたはｇｐ１２０オリゴマーおよびｇｐ４１オリゴマーを担持する疱瘡ウイルスまたはセムリキ森林ウイルスを使用した。換言すれば、それ自体の膜内にタンパク質を発現できるバキュロウイルス系を使用した（Boublickら、Biotechnology,1995,13:1079-84）。
【００６３】
リポソーム・ベースの免疫性組成物の調製
実施例１と同様に操作した。但し、ＣＤ４およびＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４を表面に担持するリポソームを使用した。上記リポソームの調製は、機能メンブランタンパク質またはトランスメンブランタンパク質を担持するリポソームを記載したRigaudらの情報（Biochim.Acta Phys.1995,1231:223-246またはPitardらの情報（Eur.J.Biochem.1996,235,3769-3778参照）に依拠した。これらを融合のため、ＨＩＶ−１エンベロープまたはＨＩＶ−２エンベロープとともにインキュベーションを行った。異なる組換えエンベロープを含むＨＩＶウイルス（プソイドタイプの補完ウイルスの利用）またはＨＩＶ組換えエンベロープを担持するウイルスベクターが対象となる。リポソームへの細胞膜のトランスメンブラン受容体の通過のために、細胞当り１０６−１０７ヶの受容体コピーを得ることができる発現性の強いベクター（例えば、バキュロウイルスまたはSaccharomyces cerevisae）を用いた。
【００６４】
ＨＩＶ−１の感染に対抗して哺乳動物に投与されるワクチン調製体
実施例３の免疫性組成物を使用した。この場合、あらかじめ、上記組成物に対して、その抗体応答形成能を評価するため動物実験を行った。この組成物をＰＢＳ中で複数回洗浄し、生理学的血清中に懸濁させ、次いで、上記組成物にアジュバントとしてＲｉｂｉを添加した。
上記調製体を上記動物（ハツカネズミ、サル、場合によっては、ヒト）に０，０５ｍｌ−１ｍｌの割合で注射した。更に４−６ヶ月後、追加注射を行った。
【００６５】
昆虫細胞表面におけるＣＣＲ５共受容体および／またはＣＤ４受容体のクローニングおよび発現
【００６６】
ＣＣＲ５／６ヒスチジンのクローニングおよびバキュロウイルスの発現
１．ｐｃＤＮＡ３ ＣＣＲ５は、ヒトのＣＣＲ５の完全なシークエンスを含む（遺伝子バンクのアクセスナンバー：ＮＭ０００５７９）。ＰＣＲによってＥｃｏ−ＲＩサイトとＴＧＡサイトとの間のＣ−末端領域を増強した。ＡＴＧ（＋１０）から出発して、ＥｃｏＲＩサイトは、位置７９３にあり、Ｓｔｏｐ遺伝暗号は、位置１０６６にある。
２．シークエンス化のため、上記フラグメントをプラスミドｐＵＣ１８においてクローニングし、次いで、フラグメントをＥｃｏＲＩ−ＸｂａｌのｐｃＤＮＡ３ＣＣＲ５に再挿入した。
３．かくして、プラスミドｐｃＤＮＡ３Ｃ ＣＲ５を改質し、ｐｃＤＮＡ３ ＣＣＲ５−６ＨＩＳとした。
４．ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩをカットすることによってｐｃＤＮＡ３から遺伝子ＣＣＲ５およびＣ−末端のその６ＨＩＳタッグを抽出した。
５．次いで、ＢｇＩ ＩＩ−ｂｇｌ Ｉによって、プロモータｐ１０の下流（仏aval）において遺伝子ＣＣＲ５−６ＨＩＳを伝達ベクター（バキュロ）ｐ１１９に導入した。
６．伝達ベクターｐ１１９にＣＣＲ５−６ＨＩＳ遺伝子を添加した後、上記伝達ベクターをウイルスＡｃＳＬＰ１０のＤＮＡとともに昆虫（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）のＳｆ９細胞に共移入した。
７．ＣＣＲ５−６ＨＩＳが、上記細胞の表面に発現された。上記ＣＣＲ５−６ＨＩＳの密度をスキャッチャード（ＲＥＦ）によって評価した。
８．上記受容体の機能特徴を、上記細胞に対するウイルスＨＩＶまたはＨＩＶｇｐ１２０の固定能によって評価した。
【００６７】
ＣＤ４のクローニング、同一タイプのプロトコルの使用：
１．ＣＤ４遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ｔプラスミドに６つのヒスチジンタッグを加えた。ＡＴＧ（＋１）から出発して、Ｂｓｕ３６１サイトは、位置１０８７にあり、Ｓｔｏｐ遺伝暗号は、位置１３７５にある。
２．Ｃ−末端に６つのヒスチジンタッグを加えたＣＤ４遺伝子を、ＢｇＩ ＩＩ−ｂｇｌＩによって、ｐＧＥＭＡｃＩ１６Ｔ伝達ベクターのポリエドリン（polyedrine）のプロモータの下流に導入した。
３．ｐＧＥＭＡｃＩ１６Ｔ ＣＤ４−６ＨＩＳ伝達ベクターを、ＡｃＳＬＰ１０ウイルスのＤＮＡとともに、昆虫（Autographa californica）のＳｆ９細胞に共移入した。
４．ＣＤ４−６ＨＩＳが、上記細胞の表面に発現された。上記ＣＣＲ５−６ＨＩＳの密度をスキャッチャード（Cahoreauら、1992,Biochimie,74,1053-1065））によって評価した。
５．上記受容体の機能特徴を、上記細胞に対するウイルスまたはＨＩＶｇｐ１２０の固定能によって評価した。
【００６８】
ＣＤ４およびＣＣＲ５のダブル組換え体の発現：
１．ＣＣＲ５−６ＨＩＳ遺伝子およびＣＤ４−６ＨＩＳ遺伝子を、それぞれ、ベクターｐ１１９およびｐＧＥＭＡｃＩ１６Ｔにおいてクローニングした。
２．ｐ１０プロモータおよびＣＤ４−６ＨＩＳの監視下（仏controle）のＣＣＲ５−６ＨＩＳの発現をポリエドリンのプロモータの監視下で実施した。
３．２つの伝達ベクターを、ＡｃＳＬＰ１０ウイルスのＤＮＡとともに、昆虫（Autographa californica）のＳｆ９細胞に共移入した。
４．かくして、ＣＣＲ５−６ＨＩＳおよびＣＤ４−６ＨＩＳ対の等割合のダブル組換え体を表面に発現するＳｆ９細胞が得られた。
【００６９】
ＣＣＲ５およびＣＤ４に富んだ細胞膜の精製および対応するプレテオリポソームの調製
かくして、Ｓｆ９細胞膜から、下記を含むリポソーム内に受容体を再構成できる：
１．ＣＣＲ５のみ，
２．ＣＤ４のみ，
３，ＣＣＲ５およびＣＤ４を個別に発現する細胞から選択した割合のＣＣＲ５およびＣＤ４，
４．同量のＣＣＲ５およびＣＤ４を同時に発現する細胞から選択した割合のＣＣＲ５およびＣＤ４。
ＨＩＶの共受容体と融合するＨＩＶエンベロープを調製し、次いで、固定剤（例えば、パラホルアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）によって融合を停止し、ｈｕＣＤ４／ｈｕＣＣＲ５トランスジェニックマウスまたはマカックモデルまたは他の真猿類に上記免疫性対を注射した。結果に依存して、上記製剤をヒトに注射できる。
ＣＸＣＲ４について同一の系を用意した。
【００７０】
プロテオリポソーム中にトランスメンブランタンパク質を再構成するための戦略
Ｒｉｇａｕｄら（1988,Biochemistry,27、2677-2688），Paternostreら（Biochemistry 1988,27,2668-2677）およびＧａｙｍａｒｄら（J.Biol.Chem.1996,271,22863-22870）が誘導した方法にもとづきプロテオリポソームを得るため、受容体ＣＣＲ５（またはＣＸＣＲ４）および／またはＣＤ４を超発現（仏surrexpriment、英overexpress）するAutographa californicaのＳｆ９細胞を適切な洗剤によって消化した。
【００７１】
ＣＣＲ５および／またはＣＤ４の機能性の評価
１．Ｓｆ９細胞の表面に発現された場合
ａ）ＦＡＣＳおよび共焦（仏confocale）顕微鏡によって解析した細胞表面の受容体の存在：
Ｉ．特殊な抗−ＣＤ４または抗−ＣＣＲ５抗体による
II．特殊抗体によってマーキングされたｇｐ１２０による
III．変異したまたは変異してないエンベロープを担持するＨＩＶ−１による
IV．第１に、Ｓｆ９細胞の表面における受容体の機能性を特徴づけ、スキャッチャード（Ｃａｈｏｒｅａｕら、既述）によって、細胞膜の脂質（仏lipidique）状態が認められる細胞毎に分子数を定量する。
ｂ）Robert Blumenthalの誘導した方法（ＮＩＨ，個人的コミニュケーシュン，２０００）およびＶｉｄａｌらの誘導した方法(1996,J.Biol.Chem.270,17823-17829)による融合の特殊蛍光の共焦解析
Ｉ．（場合によっては変異した）ＨＩＶ−１エンベロープを発現する細胞との接触後
II．ＨＩＶ−１（または場合によっては変異したエンベロープを担持するプソイドタイプ・ウイルス）との接触後
III．ウイルスプソイド粒子による。
２．対応するプレテオリポソームにおいて
ａ．上記方法による特殊蛍光の共焦解析
ｂ．エネルギ伝達の他の方法（FRET:fluoresecnce resonance energy transfer（Mattjusら，1999,Anal.Biochem.268,297-３０４）
【００７２】
ＣＣＲ−５，Ｃ−末端の６つのヒスチジン残渣の導入
１．ＣＣＲ５についてＥｃｏＲＩサイトとＴＧＡサイトとの間のＣ−末端領域のＰＣＲによる増強；
【化１】
Ｂａｃ−ＣＣＲ５：原プラスミドの変異したフラグメントの再組込みのために（遺伝暗号の変性（仏degenerescence）によって形成された）ＳｔｕｌサイトとＸｂａｌサイトの上記オリゴヌクレオチドへの導入。
【化２】
増強されたフラグメントＥｃｏＲＩ−ＸｂａｌをＥｃｏＲＩ−ＸｂａｌのベクターｐＵＣ中でクローニングし、次いで、シークエンス化した。次いで、変異したフラグメントをＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ原プラスミド中に再挿入した。
【００９３】
２．ＣＣＲ５のＣ−末端の下流への６つのヒスチジン遺伝暗号の導入
このように改質したプラスミドをＳｔｕｌおよびＸｂａによってカットし、次いで、上記のＳｔｕｌ−Ｘｂａｌ ＤＮＡフラグメントと結合した。このフラグメントは、６つのヒスチジン遺伝暗号および１つのＳｔｏｐ遺伝暗号ＴＡＡを与える。
【化３】
中間体ｐＵＣベクターに適合したオリゴヌクレオチドをクローニングし、かくして、シークエンスを検証できるよう、ＥｃｏＲＩサイトを上流に加えた。
【００７３】
ＣＤ４の改質（modification）およびクローニング
１）ＣＤ４遺伝子を含むｐＧＥＭ−ＴプラスミドのＣ−末端領域のシークエンス化
ＰＣＲ＊段階後、プラスミドのＣ−末端領域をシークエンス化によって検証した。
２）ＣＤ４のＣ−末端への６つのヒスチジン残渣の添加：
１）（ポリリンカー中の）Ｂｓｕ３６１−Ｂａｎｉｍ領域のＰＣＲによる増強
ＰＣＲのオリゴヌクレオチド：
【化４】
【００７４】
ＨＩＶ−１エンベロープを発現する細胞のカルセインによるマーキング
試薬：
−細胞培地
−カルセインＡＭ（Molecular Probe,INC）１μｇ／ｍｌ（−２．５ｍＭ）（カルセイン５０μｇ／ＤＭＳＯ２０μｌ，−２０℃に保存）
−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
−ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ
−ＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬのＤｕｌｂ ＰＢＳ）
−ＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａｌ ＭＯ４Ｒによる遠心分離
方法：
１．フラスコ内の細胞の計数。
２．１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離。
３．媒体５ｍｌ中への細胞の懸濁（例えば、細胞０．５×１０６／ｍｌ）。
４．カルセイン１μｌ／細胞５ｍｌ（約２．５ｍｍｏｌカルセイン）の添加。
５．良好な混合を達成するための渦流（vortex）
６．遮光状態でＣＯ２５−７％中で３７℃において４５ｍｉｎインキュベーション。
７．１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離。
８．媒体（またはＰＢＳ）１０ｍｌで２回洗浄。
９．媒体（またはＰＢＳ）５ｍｌ中にまたは細胞０．５×１０６／ｍｌの濃度で細胞の懸濁。
１０．遮光状態でＣＯ２５−７％中で３７℃において３０ｍｉｎインキュベーション。
１１．媒体（またはＰＢＳ）１０ｍｌで２回洗浄。
１２．媒体（またはＰＢＳ）５ｍｌ中にまたは細胞０．５〜１×１０６／渦流ｍｌの濃度で細胞の懸濁。
【００７５】
ＣＭＴＭＲによる標的細胞のマーキング
ＣＭＴＭＲは、生きている細胞膜を経て自由に拡散するクロロメチルの蛍光性誘導体である。細胞内で、僅かにチオ反応性のゾンデ（プローブ）は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼにもとづき反応して、細胞膜を透過しない蛍光性着色付加生成物を生成する。
ＣＭＴＭＲによる細胞の着色によって、不動の各周辺領域、ＥＲおよびＧｏｌｇｉでのタンパク質との反応から生ずる鮮明な蛍光が生じ、且つまた小さい融合気孔を経て拡散できる細胞質ゾル中の蛍光性グルタチオン付加生成物（ＰＭ〜６００Ｄａ）に起因するより弱い蛍光が生ずる。
１．蛍光性細胞質ゾンデＣＭＴＭＲ（５−（（（４−クロロメチル）べンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）および（６−（（（４−クロロメチル）べンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）（Molecular Probe,cat＃C-2927,ex/em541/565nm）をＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度で溶解した。
１０μｌまたは２０μｌの分別量を採取し、−２０℃に保存した。加熱によって不活性化したＳＶＦ１０％（１００μ／ペニシリンｍｌ，１００μｇ／ストレプトマイシンｍｌ（Ｄ１０））を補足したＤＭＥＭでＣＭＴＭＲの希釈物（１：５００）を調製した。
２．（微小ウエル上で）標的細胞から媒体を除去し、ＣＭＴＭＲの希釈溶液１ｍｌを塗布した。３７℃において４５−６０ｍｉｎ試料のインキュベーションを行った。着色溶液を１ｍｌのＤ１０で置換し、更に１５−３０ｍｉｎ、インキュベーションを続行した。
融合の実施
１．ＣＭＴＭＲでマーキングした標的細胞に、カルセインでマーキングしたエフェクター細胞（２ｍｌ）を加えた。３７℃において３−５時間、２つの細胞集団のインキュベーションを行った。
２．インキュベーション終了後、媒体を１ｍｌのＤ−ＰＢＳで置換し、４０倍の油浸レンズで相および蛍光を撮影した。
カルセインで着色された細胞の観察のため、ＦＩＴＣ（励起装置：ＢＰ４７０−４９０；プリズムＤＭ５０５；伝送器：ＢＡ５１５−５５０）を使用し、ＣＭＴＭＲのためにローダミン（励起装置：ＢＰ５３０−５５０；プリズムＤＭ５７０；伝送器：ＢＡ５９０）を使用した。かくして、着色剤の蛍光を観察する際に生ずるオーバフローが避けられた。各試料についてランダムに選択した６−１０の異なるフィルタによって像を統合した。
３．ソフトウエアMetamorph（Universal Imaging Inc.）を使用して像を重畳させ、計数してデータを解析した。ＣＭＴＭＲについてプラスの全細胞数および２つの蛍光ゾンデについてプラスの全細胞数を計数した。マーキングした細胞が相互に重畳するが融合してないプラスの比率を区別するため、高光沢像を使用する。融合％は、下式にもとづき計算する：
融合％＝１００×［２つの着色剤についてプラスの細胞数］／［全標的細胞数］
【発明の名称】 ワクチンとして使用できる免疫性組成物
【特許請求の範囲】
【請求項１】 免疫性組成物であって、該免疫性組成物が、
・哺乳動物において標的細胞との結合および次の融合によって感染を誘起する感染性病原体の１つおよび／または複数の標的受容体を発現する、細胞、ベクターおよびリポソームからなる群から選択される第１手段を、上記標的受容体を識別する病原体の領域を少なくとも発現する第２手段とともに、該第１および第２手段との間で複合体を形成するよう第１，第２手段の相互作用を可能とする条件において、インキュベーションを行うことによって得られる調製体から生成され、
ここで前記第２手段は、
少なくとも１つの受容体に対する少なくとも１つの結合領域を担持するベクター（特に、ウイルスベクター）によってあらかじめ形質転換された細胞であるか、
少なくとも１つの標的受容体に対する少なくとも１つの結合領域を担持するウイルスベクターから構成されているか、
病原体を生成する感染した細胞であるか、感染性病原体から構成されているか、
ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質の少なくとも保存領域を含むウイルスベクターによってあらかじめ形質転換された細胞から構成されているか、このようなウイルスベクターから構成されているか、
ＨＩＶを生成する感染した細胞であるか、ＨＩＶウイルス自体から構成されているか、または、
自然の形または組換えた形のｇｐ１２０またはｇｐ１６０ＨＩＶエンベロープタンパク質から構成されているか、この種のタンパク質の少なくとも保存領域から構成され、
・上記インキュベーション段階は、融合段階に対応する複合体を生ずるような期間に従って遂行され、
・生成した複合体を固定剤と、抗体が形成されるべきエピトープの暴露およびコンホメーションによって複合体を固定するような期間にわたって接触させ、
・上記第１，第２手段が、哺乳動物に許容されることを特徴とする、免疫性組成物。
【請求項２】 第１手段が、哺乳動物の自家移植細胞、および、特に、ワクチンを投与すべき患者から採取したヒトの健全細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】 第１手段が、表面に１つまたは複数の標的受容体を発現するベクターであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】 第１手段が、表面に１つまたは複数の標的受容体を担持するリポソーム、特に、請求項３に定義の如きベクターであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】 上記病原体が、ウイルス、特に、レトロウイルス、バクテリア、ミコバクテリアまたは寄生虫（例えば、Plasmodium sp,Leishmania sp,Trypanosoma cruziおよびTrypanosoma brucei）であることを特徴とする請求項１−４の１つに記載の組成物。
【請求項６】 病原体が、ＨＩＶであることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】 上記調製体が、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現する第１手段を、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質の少なくとも保存領域を発現する第２手段とともにインキュベーションを行うことによって得られることを特徴とする請求項１−４の１つに記載の組成物。
【請求項８】 使用した第１手段が、所望の相互作用のために十分な量のＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現するよう刺激された哺乳動物の自家移植細胞から構成されていることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】 第１手段が、表面にＣＤ４および／またはＨＩＶ共受容体を発現するウイルスベクター、例えば、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルスまたは更には酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】 第１手段が、表面にＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現するリポソームであり、上記発現がウイルスベクターによって行われることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】 ＨＩＶ共受容体の１つが、モノクロナール抗体で置換されていることを特徴とする請求項７−１０の１つに記載の組成物。
【請求項１２】 該組成物が、第１手段としての可溶性のＣＤ４と、第２手段としての、場合によっては組換えられた形の可溶性のｇｐ１２０とを含み、共受容体に固定されるｇｐ１２０のゾーンに対して向けられるモノクロナール抗体と共に含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】 調製体が、インキュベーション後、アルジドリチオール−２で固定されていることを特徴とする請求項１−１２の１つに記載の組成物。
【請求項１４】 請求項１−１３の１つに記載の組成物に対して形成された、新規の製品としての血清および抗体。
【請求項１５】 哺乳動物への投与のための、感染性病理因子に対するワクチン組成物において、該組成物が、請求項１−１３の１つに記載の有効量の免疫組成物を、哺乳動物への投与のために許容される不活性ビヒクルと共に、場合によっては更にアジュバントと共に、含むことを特徴とするワクチン組成物。
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、特に、哺乳動物において、感染性病理因子に対して、特に、ワクチンとして使用できる免疫性組成物に関する。
【０００２】
本発明にもとづき標的病理因子は、細胞依存性タイプであり、即ち、感染プロセスが、哺乳動物の標的細胞に対する病原体の結合（および、場合によっては付随する融合）の後で進展する。
【０００３】
【従来の技術】
病原体（agents pathogenes）によって誘起される感染時に上記病原体の若干の領域によって果たされる主要な役割は公知である。
【０００４】
従って、例えば、ＨＩＶに関して、多くの研究において、標的細胞の受容体（ＣＤ４受容体および化学反応性受容体（例えば、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４））との相互作用に関連する領域がウイルスエンベロープの保存領域であることが判明している。
【０００５】
上記領域に対する抗体の形成には、現在まで、重要なエピトープへのアクセスの問題がある。複雑な相互作用および構造変化が、標的細胞に対するウイルスの結合および以降の融合の間に起こり、その結果、融合領域のエピトープへのアクセスが阻止され、追加暴露時間の極めて短い標的細胞との相互作用に直接に関連する細胞の近傍領域のエピトープへのアクセスが困難となる。
【０００６】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８３，１５．０１．１９９９に記載のＬａＣａｓｓｅらの実験システムによって、マウスにおいて、ＨＩＶの感染性分離体（仏isolats、英isolates）に対して中和作用を有する抗体の形成が達成され、従って、対応して、上記エピトープへのある程度のアクセス性が達成されると云える。
【０００７】
提案のシステムは、ＨＩＶ−１（Ｐ１６８）の１次分離体の機能エンベロープを発現するよう改質した真猿類線維芽細胞腫をＣＤ４受容体およびＣＣＲ５共受容体を発現するヒトの神経芽細胞腫と融合し、次いで、融合期間の４−５時間後に、形成された複合体をホルムアルデヒドで固定することによって得られる。マウスに関する実験において、この種の複合体は、著しく多種類のサブタイプに起因するＨＩＶの感染性分離体に対して中和作用を有する抗体を形成できるということが判明した。
【０００８】
しかしながら、この種のシステムは、免疫性複合体を形成する細胞集団の潜在的危険性を考慮してヒトには使用できない。
【０００９】
更に、システム生成のために使用される条件は、エピトープのコンホメーションの維持および大きい当該領域に対するアクセスを保証しない。
【００１０】
本発明者は、融合の進展および固定実施条件の制御によって、融合に関与するエピトープの近傍にあるエピトープを含む当該のエピトープが特に十分に暴露され且つその自然のコンホメーションに保持されることになる段階において複合体を得た。さて、この種の複合体において実証されている免疫性質は、複合体調製のために適切な製品を使用した場合にヒトに使用できるという著しい利点を有するワクチンの生成のための選択優位性をなす。
【００１１】
この種のシステムは、有利なことには、標的細胞との結合段階および、場合によっては、次の融合段階を含む感染プロセスを有するすべてのタイプの病原体に一般的に適用できる。
【００１２】
【発明の開示】
従って、本発明の課題は、細胞感染に依存する感染性病理因子に対して、哺乳動物に使用できる免疫性組成物およびワクチン組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明は、更に、上記組成物に使用される新規の製品としての免疫性複合体、および標的細胞との融合に関連する細胞の近傍の、しかも、直近の病原体の領域のエピトープに対して形成される抗体を意図する。
【００１４】
本発明に係る免疫性組成物は、該組成物が、
・上記の如き感染性病原体の１つおよび／または複数の標的受容体を発現する第１手段を、上記標的を認識する病原体の領域を少なくとも発現する第２手段とともに、複合体を形成するよう第１，第２手段の相互作用を可能とする条件において、インキュベーションを行うことによって得られる調製体から生成され、
・上記インキュベーション段階は、異なる融合段階に対応する複合体を生ずるよう異なる期間（duree）に従って（それゆえ新たに脱マスクされたエビトープの暴露およびコンホメーションによって）遂行され、
・抗体の形成が望ましいエピトープ（すなわち形成されるべき抗体に対するエピトープ）の異なる暴露およびコンホメーションによって複合体を固定するよう、生成した複合体を固定剤（仏agent fixateur、英binding agent）と異なる期間にわたって接触させ、
・上記第１，第２手段が、哺乳動物に許容される（仏tolerer、英tolerate）ことを特徴とする。
【００１５】
本発明の実施例にもとづき、第１手段は、哺乳動物の自家移植（autologues）細胞である。ワクチンを投与すべき患者から採取した健全細胞、例えば、ヒトの特に全ＰＢＭＣ，リンパ細胞または分離されたマクロファージが対象である。
【００１６】
上記細胞は、必要あれば、所望の相互作用に必要な十分量の１つまたは複数の受容体を発現するよう刺激される。
【００１７】
本発明の他の実施例にもとづき、上記第１手段は、表面に１つまたは複数の標的受容体を発現するベクターである。この種のベクターは、例えば、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）または更には酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）を含む。
【００１８】
本発明の更に他の実施例にもとづき、第１手段は、正しく表現され、従って、標的細胞を模倣する１つまたは複数の標的受容体を表面に担持するリポソームである。
【００１９】
（１つまたは複数の通路を有する）標的トランスメンブラン受容体は、昆虫、酵母または哺乳動物の細胞表面（１０６−１０７／細胞）に発現ベクターにもとづき多量に発現された受容体から生じたリポソーム内に含まれている。リポソームへの細胞受容体の通過は、細胞膜の分離後、Ｒｉｇａｕｄのプロトコル（以下の引用参照）に従う適切な洗剤（detergent）によるその処理後、且つ適切な膜内におけるその封入（inclusion）後に行われる。
【００２０】
本発明にもとづき、使用した第２手段は、標的細胞と結合でき且つ上記細胞と融合できる感染性病原体の領域であって少なくともこの領域を発現する手段である。
【００２１】
本発明にもとづき使用する第２手段は、更に、少なくとも１つの標的受容体に対する少なくとも１つの結合領域を担持するベクターによってあらかじめ形質転換された細胞で構成される。上記の如きウイルスベクター、即ち、バキュロウイルス、ＳＦＶまたは、更に、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）が有利である。
【００２２】
変更例にもとづき、第２手段は、ウイルスベクター自体から構成される。
【００２３】
他の変形例にもとづき、第２手段は、病原体を生成する感染した細胞であるか、感染性病原体自体から構成されている。
【００２４】
上記病原体は、ウイルス、特に、レトロウイルス、バクテリア、ミコバクテリアまたは寄生虫（例えば、Plasmodium sp,Leishmania sp,Trypanosoma cruziおよびTrypanosoma brucei）であってよい。
【００２５】
本発明は、ＨＩＶの場合に特に有用である。この用語は、ヒトまたは動物の各種株の分離体および自然のまたは組換えた、場合によっては、変異したエンベロープを有するウイルスを定義するために、詳細な説明および請求項で使用した。
【００２６】
従って、本発明は、特に、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を発現する第１手段を、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質の少なくとも保存領域を発現する第２手段とともにインキュベーションを行うことによって上記調製体を調製した免疫性組成物を対象とする。
【００２７】
詳細な説明および請求項で使用した如き表現“エンベロープ・タンパク質”は、天然タンパク質および当業者に周知の組換えたタンパク質または変異したタンパク質を含む。変異したタンパク質は、標的受容体との融合後に生成される抗体によって認識されるエンベロープ・サイトを同定できるという利点を有する。
【００２８】
この種の組成物の場合、使用した第１手段は、上記の如き哺乳動物の自家移植細胞から構成されている。上記細胞は、所望の相互作用のために十分な量のＣＤ４受容体および／またはＣＤ４共受容体（例えば、ＣＣＲ５，ＣＸＣＲ４，バンド３タンパク質または他のトランスメンブラン・タンパク質）を発現するよう刺激される。刺激は、例えば、ＰＨＡおよび／またはＩＬ２によって行う。
【００２９】
変更例にもとづき、第１手段は、表面に、ＣＤ４および／またはＨＩＶ共受容体を発現するウイルスベクターである。上記の如く、この種のベクターは、バキュロウイルス、ＳＦＶまたは更には酵母（例えば、Saccharomyces cerevisae）を含む。
【００３０】
更に他の変更例の場合、第１手段は、上述したように、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を表面に発現するリポソームである。従って、上記リポソームは、ＣＤ４受容体および／またはＨＩＶ共受容体を含むことができる。
【００３１】
有利には上記第１手段を含むこの種の組成物の場合、使用する第２手段は、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープ・タンパク質の少なくとも保存領域を発現する。
【００３２】
上記第２手段は、ＨＩＶのエンベロープ・ウイルスベクターによってあらかじめ形質転換された細胞、または、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０タンパク質の少なくとも保存領域から構成される。上記の如きウイルスベクターが有利である。
【００３３】
変更例にもとづき、第２手段は、ウイルスベクター自体から構成される。
【００３４】
他の変更例の場合、第２手段は、ＨＩＶを生成する感染した細胞であるか、ＨＩＶウイルス自体から構成されている。１次分離体から得られる紡錘形（英fusogenic）ウイルスを使用するのが有利である。
【００３５】
ここで付言するが、本発明にもとづき、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０タンパク質またはｇｐ１２０またはｇｐ１６０タンパク質の少なくとも保存領域を含むタンパク質は、自然の形または組換えた形または変異した形である。
【００３６】
上記第２手段は、この種のタンパク質から構成され、従って、場合によっては組換えた形の可溶性のｇｐ１２０モノマーまたは、同じく場合によっては組換えた形のｇｐ１２０またはｇｐ１６０オリゴマーであれば有利である。更に、これらは少なくとも保存領域を含む上記タンパク質の一部であってもよい。
【００３７】
本発明の有利な実施例の場合、第２手段は、抗共受容体性モノクロナール抗体を含む。例えば、モノクロナール抗体１７ｂ，４８ｄまたはＣＧ１０が対象となる。この構成（disposition）によって、ｇｐ１２０の共受容体に対する結合サイト（共受容体がｇｐ１２０に結合しているサイト）の近傍にある当該のエピトープにアクセスできる。
【００３８】
このタイプの好ましい組成物は、分子の形であり、第１手段としての可溶性のｇｐ１２０モノマーと、第２手段としての可溶性のＣＤ４と、上記の如きモノクロナール抗体またはこの種の抗体のＦａｂフラグメント（断片）とを含む。
【００３９】
第１，第２手段のインキュベーションは、第１手段が第２手段との融合プロセスに関与するような複合体を形成するよう実施される。
【００４０】
上記工程を異なる期間にわたって実施するのが有利であり、かくして、各種の融合段階を実現でき、動物実験によって、所望の免疫性に関してより良い結果を与える段階を選択できる。
【００４１】
概ね、１５分間〜５時間の期間で操作する。
【００４２】
上記の各段階のコンホメーションは、当該のエピトープを有意に変性することなく融合を停止できる試薬の添加によって固定される。
【００４３】
これに関して特に好ましい固定剤は、２，２´−ジチオピリシン（アルジドリチオール（aldidrithiol）−２、略してＡＴ−２と呼ぶ）から構成される。
【００４４】
研究応用を意図する場合は特に、他の固定剤（例えば、ホルモール）を使用できる。
【００４５】
固定は、異なる期間において実施され、従って、存在するエピトープの不動化に関する固定反応速度論（cinetique）作用の効果を検討できる。
【００４６】
得られた調製体は、回収、洗浄し、適切な緩衝溶液中に懸濁させる。
【００４７】
次いで、動物について、より良い免疫応答を誘起するための、かつ感染を阻止する抗体を生成するためのより良い融合固定時点を評価する。
【００４８】
本発明は、融合固定工程から得られる、新規の製品としての抗原性複合体を意図する。
【００４９】
特に結晶化した形の上記複合体は、有利な態様で、エンベロープのｇｐ１２０および／またはｇｐ４１の相互作用サイトおよび上記サイトの直近の領域を検討し、明示するために、有利に使用できる。
【００５０】
上記の免疫性組成物の調製法は、同じく、本発明の枠内にある。この方法は、上記第１，第２手段の使用と、上記の如きその融合およびその固定とからなる。
【００５１】
本発明の組成物の免疫性の検討によって、その強い免疫能を証明できる。
【００５２】
従って、ＣＤ４＋，ＣＸＣＲ５＋トランスジェニックマウスまたはウサギに上記組成物を投与した後に採取した血清は、抗体の高い比率（含有量）を示した。
【００５３】
上記血清および上記血清から調製した抗体は、従来の技術によって精製され、本発明の部分をなす。
【００５４】
従って、上記抗体は、抗原抗体反応にもとづき、感染性病原体を識別でき、かくして、その感染能を阻止できることを特徴とする。
【００５５】
哺乳動物についてインビボで実施した実験から明らかな如く、精製した血清および抗体は、ＨＩＶの１次分離体の大きい（広範な）スペクトルの感染性を阻止できる。
【００５６】
従って、本発明は、場合によってはアジュバントないしは添加剤と組合せた、哺乳動物に投与できる不活性のビヒクルを含む、上記の如き有効量の免疫性組成物を含むことを特徴とするワクチン組成物を意図する。
【００５７】
ワクチンを投与すべき哺乳動物の器官の免疫反応を増進できるアジュバントとして、無機アジュバント（例えば、リン酸アルミニウム）、油性アジュバント（例えば、不完全フロインドアジュバント）、バクテリア源アジュバント（例えば、完全フロインドアジュバント）を挙げる。特に好ましいアジュバントは、アジュバントＲｉｂｉからなる。
【００５８】
ワクチン組成物は、注射によってまたは経口で投与し、注射の３ヶ月後に追加投与する。
【００５９】
ワクチン組成物は、感染性病原体の抗原に関して宿主に免疫を与えることができるプロトコルにもとづき十分量だけ投与する。
【００６０】
本発明の他の特徴および利点は、下記の実施例から明らかであろう：
【００６１】
【発明の実施の形態】
細胞性免疫組成物の調製
一方では、ワクチンを投与すべき患者から採取され、ＪＶＩ １９９８，７１：８２７３−８２８０のＲｉｌｅｙらの方法にもとづき３−６日間ＰＭＡ／ＩＬ２で励起（stimulation）した後ＣＤ４／ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４を発現するヒトの自家移植細胞を使用し、他方では、ＨＩＶ−１の１次分離体またはこの種の分離体によって感染された細胞を使用した。
それぞれ１５，３０，４５，６０，１２０，１８０，２４０および３００分間の各期間にわたって３７℃においてインキュベーションを行うため、これら２つの集団を各ペトリボックスに分配した。各実験のため、３×１０６〜１０８の自家移植細胞および、例えば、ＨＩＶの２つの共受容体ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を利用するエイズ・リサーチ・アンド・リファレンス・プログラム，ＮＩＨ（ＥＵＡ）から得た１次分離体９２ＨＴ５９３またはＡＣＨ１６８．１０を使用した。
所定の期間の終了後、ＡＴ−２を６００−１０００μｍの割合でＰＢＳ溶液として加えた。固定は、４℃において、Ｒｏｓｓｉｏら（ＪＶＩ，１９９８，７２，７９９２参照）が推奨している如き時間、即ち、１−１２時間にわたって実施した。−８０℃で保存するため、形成された細胞複合体をＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）で洗浄、回収し、１０６〜１０８細胞／０，１ｍｌの割合でＰＢＳ／（ＤＭ５０ １０％）中に懸濁させた。
凍結した病原体を解凍し、複数回洗浄し、次いで、同量のアジュバント、例えば、Ｒｉｂｉ（Ｒ−７００またはＲ−７３０）を加えた。
【００６２】
ウイルスベクターを含む免疫性組成物の調製
実施例１と同様に操作した。但し、一方では、ＣＤ４およびＣＣＲ５受容体および／またはＣＸＣＲ４を表面に担持するバキュロウイルス系を使用し，他方では、ｇｐ１２０モノマーまたはｇｐ１２０オリゴマーおよびｇｐ４１オリゴマーを担持する疱瘡ウイルスまたはセムリキ森林ウイルスを使用した。換言すれば、それ自体の膜内にタンパク質を発現できるバキュロウイルス系を使用した（Boublickら、Biotechnology,1995,13:1079-84）。
【００６３】
リポソーム・ベースの免疫性組成物の調製
実施例１と同様に操作した。但し、ＣＤ４およびＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４を表面に担持するリポソームを使用した。上記リポソームの調製は、機能メンブランタンパク質またはトランスメンブランタンパク質を担持するリポソームを記載したRigaudらの情報（Biochim.Acta Phys.1995,1231:223-246またはPitardらの情報（Eur.J.Biochem.1996,235,3769-3778参照）に依拠した。これらを融合のため、ＨＩＶ−１エンベロープまたはＨＩＶ−２エンベロープとともにインキュベーションを行った。異なる組換えエンベロープを含むＨＩＶウイルス（プソイドタイプの補完ウイルスの利用）またはＨＩＶ組換えエンベロープを担持するウイルスベクターが対象となる。リポソームへの細胞膜のトランスメンブラン受容体の通過のために、細胞当り１０６−１０７ヶの受容体コピーを得ることができる発現性の強いベクター（例えば、バキュロウイルスまたはSaccharomyces cerevisae）を用いた。
【００６４】
ＨＩＶ−１の感染に対抗して哺乳動物に投与されるワクチン調製体
実施例３の免疫性組成物を使用した。この場合、あらかじめ、上記組成物に対して、その抗体応答形成能を評価するため動物実験を行った。この組成物をＰＢＳ中で複数回洗浄し、生理学的血清中に懸濁させ、次いで、上記組成物にアジュバントとしてＲｉｂｉを添加した。
上記調製体を上記動物（ハツカネズミ、サル、場合によっては、ヒト）に０，０５ｍｌ−１ｍｌの割合で注射した。更に４−６ヶ月後、追加注射を行った。
【００６５】
昆虫細胞表面におけるＣＣＲ５共受容体および／またはＣＤ４受容体のクローニングおよび発現
【００６６】
ＣＣＲ５／６ヒスチジンのクローニングおよびバキュロウイルスの発現
１．ｐｃＤＮＡ３ ＣＣＲ５は、ヒトのＣＣＲ５の完全なシークエンスを含む（遺伝子バンクのアクセスナンバー：ＮＭ０００５７９）。ＰＣＲによってＥｃｏ−ＲＩサイトとＴＧＡサイトとの間のＣ−末端領域を増強した。ＡＴＧ（＋１０）から出発して、ＥｃｏＲＩサイトは、位置７９３にあり、Ｓｔｏｐ遺伝暗号は、位置１０６６にある。
２．シークエンス化のため、上記フラグメントをプラスミドｐＵＣ１８においてクローニングし、次いで、フラグメントをＥｃｏＲＩ−ＸｂａｌのｐｃＤＮＡ３ＣＣＲ５に再挿入した。
３．かくして、プラスミドｐｃＤＮＡ３Ｃ ＣＲ５を改質し、ｐｃＤＮＡ３ ＣＣＲ５−６ＨＩＳとした。
４．ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩをカットすることによってｐｃＤＮＡ３から遺伝子ＣＣＲ５およびＣ−末端のその６ＨＩＳタッグを抽出した。
５．次いで、ＢｇＩ ＩＩ−ｂｇｌ Ｉによって、プロモータｐ１０の下流（仏aval）において遺伝子ＣＣＲ５−６ＨＩＳを伝達ベクター（バキュロ）ｐ１１９に導入した。
６．伝達ベクターｐ１１９にＣＣＲ５−６ＨＩＳ遺伝子を添加した後、上記伝達ベクターをウイルスＡｃＳＬＰ１０のＤＮＡとともに昆虫（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）のＳｆ９細胞に共移入した。
７．ＣＣＲ５−６ＨＩＳが、上記細胞の表面に発現された。上記ＣＣＲ５−６ＨＩＳの密度をスキャッチャード（ＲＥＦ）によって評価した。
８．上記受容体の機能特徴を、上記細胞に対するウイルスＨＩＶまたはＨＩＶｇｐ１２０の固定能によって評価した。
【００６７】
ＣＤ４のクローニング、同一タイプのプロトコルの使用：
１．ＣＤ４遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ｔプラスミドに６つのヒスチジンタッグを加えた。ＡＴＧ（＋１）から出発して、Ｂｓｕ３６１サイトは、位置１０８７にあり、Ｓｔｏｐ遺伝暗号は、位置１３７５にある。
２．Ｃ−末端に６つのヒスチジンタッグを加えたＣＤ４遺伝子を、ＢｇＩ ＩＩ−ｂｇｌＩによって、ｐＧＥＭＡｃＩ１６Ｔ伝達ベクターのポリエドリン（polyedrine）のプロモータの下流に導入した。
３．ｐＧＥＭＡｃＩ１６Ｔ ＣＤ４−６ＨＩＳ伝達ベクターを、ＡｃＳＬＰ１０ウイルスのＤＮＡとともに、昆虫（Autographa californica）のＳｆ９細胞に共移入した。
４．ＣＤ４−６ＨＩＳが、上記細胞の表面に発現された。上記ＣＣＲ５−６ＨＩＳの密度をスキャッチャード（Cahoreauら、1992,Biochimie,74,1053-1065））によって評価した。
５．上記受容体の機能特徴を、上記細胞に対するウイルスまたはＨＩＶｇｐ１２０の固定能によって評価した。
【００６８】
ＣＤ４およびＣＣＲ５のダブル組換え体の発現：
１．ＣＣＲ５−６ＨＩＳ遺伝子およびＣＤ４−６ＨＩＳ遺伝子を、それぞれ、ベクターｐ１１９およびｐＧＥＭＡｃＩ１６Ｔにおいてクローニングした。
２．ｐ１０プロモータおよびＣＤ４−６ＨＩＳの監視下（仏controle）のＣＣＲ５−６ＨＩＳの発現をポリエドリンのプロモータの監視下で実施した。
３．２つの伝達ベクターを、ＡｃＳＬＰ１０ウイルスのＤＮＡとともに、昆虫（Autographa californica）のＳｆ９細胞に共移入した。
４．かくして、ＣＣＲ５−６ＨＩＳおよびＣＤ４−６ＨＩＳ対の等割合のダブル組換え体を表面に発現するＳｆ９細胞が得られた。
【００６９】
ＣＣＲ５およびＣＤ４に富んだ細胞膜の精製および対応するプレテオリポソームの調製
かくして、Ｓｆ９細胞膜から、下記を含むリポソーム内に受容体を再構成できる：
１．ＣＣＲ５のみ，
２．ＣＤ４のみ，
３，ＣＣＲ５およびＣＤ４を個別に発現する細胞から選択した割合のＣＣＲ５およびＣＤ４，
４．同量のＣＣＲ５およびＣＤ４を同時に発現する細胞から選択した割合のＣＣＲ５およびＣＤ４。
ＨＩＶの共受容体と融合するＨＩＶエンベロープを調製し、次いで、固定剤（例えば、パラホルアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）によって融合を停止し、ｈｕＣＤ４／ｈｕＣＣＲ５トランスジェニックマウスまたはマカックモデルまたは他の真猿類に上記免疫性対を注射した。結果に依存して、上記製剤をヒトに注射できる。
ＣＸＣＲ４について同一の系を用意した。
【００７０】
プロテオリポソーム中にトランスメンブランタンパク質を再構成するための戦略
Ｒｉｇａｕｄら（1988,Biochemistry,27、2677-2688），Paternostreら（Biochemistry 1988,27,2668-2677）およびＧａｙｍａｒｄら（J.Biol.Chem.1996,271,22863-22870）が誘導した方法にもとづきプロテオリポソームを得るため、受容体ＣＣＲ５（またはＣＸＣＲ４）および／またはＣＤ４を超発現（仏surrexpriment、英overexpress）するAutographa californicaのＳｆ９細胞を適切な洗剤によって消化した。
【００７１】
ＣＣＲ５および／またはＣＤ４の機能性の評価
１．Ｓｆ９細胞の表面に発現された場合
ａ）ＦＡＣＳおよび共焦（仏confocale）顕微鏡によって解析した細胞表面の受容体の存在：
Ｉ．特殊な抗−ＣＤ４または抗−ＣＣＲ５抗体による
II．特殊抗体によってマーキングされたｇｐ１２０による
III．変異したまたは変異してないエンベロープを担持するＨＩＶ−１による
IV．第１に、Ｓｆ９細胞の表面における受容体の機能性を特徴づけ、スキャッチャード（Ｃａｈｏｒｅａｕら、既述）によって、細胞膜の脂質（仏lipidique）状態が認められる細胞毎に分子数を定量する。
ｂ）Robert Blumenthalの誘導した方法（ＮＩＨ，個人的コミニュケーシュン，２０００）およびＶｉｄａｌらの誘導した方法(1996,J.Biol.Chem.270,17823-17829)による融合の特殊蛍光の共焦解析
Ｉ．（場合によっては変異した）ＨＩＶ−１エンベロープを発現する細胞との接触後
II．ＨＩＶ−１（または場合によっては変異したエンベロープを担持するプソイドタイプ・ウイルス）との接触後
III．ウイルスプソイド粒子による。
２．対応するプレテオリポソームにおいて
ａ．上記方法による特殊蛍光の共焦解析
ｂ．エネルギ伝達の他の方法（FRET:fluoresecnce resonance energy transfer（Mattjusら，1999,Anal.Biochem.268,297-３０４）
【００７２】
ＣＣＲ−５，Ｃ−末端の６つのヒスチジン残渣の導入
１．ＣＣＲ５についてＥｃｏＲＩサイトとＴＧＡサイトとの間のＣ−末端領域のＰＣＲによる増強；
【化１】
【化２】
【００９３】
２．ＣＣＲ５のＣ−末端の下流への６つのヒスチジン遺伝暗号の導入
このように改質したプラスミドをＳｔｕｌおよびＸｂａによってカットし、次いで、上記のＳｔｕｌ−Ｘｂａｌ ＤＮＡフラグメントと結合した。このフラグメントは、６つのヒスチジン遺伝暗号および１つのＳｔｏｐ遺伝暗号ＴＡＡを与える。
【化３】
【００７３】
ＣＤ４の改質（modification）およびクローニング
１）ＣＤ４遺伝子を含むｐＧＥＭ−ＴプラスミドのＣ−末端領域のシークエンス化
ＰＣＲ＊段階後、プラスミドのＣ−末端領域をシークエンス化によって検証した。
２）ＣＤ４のＣ−末端への６つのヒスチジン残渣の添加：
１）（ポリリンカー中の）Ｂｓｕ３６１−Ｂａｎｉｍ領域のＰＣＲによる増強
ＰＣＲのオリゴヌクレオチド：
【化４】
ＨＩＶ−１エンベロープを発現する細胞のカルセインによるマーキング
試薬：
−細胞培地
−カルセインＡＭ（Molecular Probe,INC）１μｇ／ｍｌ（−２．５ｍＭ）（カルセイン５０μｇ／ＤＭＳＯ２０μｌ，−２０℃に保存）
−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
−ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ
−ＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬのＤｕｌｂ ＰＢＳ）
−ＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａｌ ＭＯ４Ｒによる遠心分離
方法：
１．フラスコ内の細胞の計数。
２．１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離。
３．媒体５ｍｌ中への細胞の懸濁（例えば、細胞０．５×１０６／ｍｌ）。
４．カルセイン１μｌ／細胞５ｍｌ（約２．５ｍｍｏｌカルセイン）の添加。
５．良好な混合を達成するための渦流（vortex）
６．遮光状態でＣＯ２５−７％中で３７℃において４５ｍｉｎインキュベーション。
７．１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離。
８．媒体（またはＰＢＳ）１０ｍｌで２回洗浄。
９．媒体（またはＰＢＳ）５ｍｌ中にまたは細胞０．５×１０６／ｍｌの濃度で細胞の懸濁。
１０．遮光状態でＣＯ２５−７％中で３７℃において３０ｍｉｎインキュベーション。
１１．媒体（またはＰＢＳ）１０ｍｌで２回洗浄。
１２．媒体（またはＰＢＳ）５ｍｌ中にまたは細胞０．５〜１×１０６／渦流ｍｌの濃度で細胞の懸濁。
【００７５】
ＣＭＴＭＲによる標的細胞のマーキング
ＣＭＴＭＲは、生きている細胞膜を経て自由に拡散するクロロメチルの蛍光性誘導体である。細胞内で、僅かにチオ反応性のゾンデ（プローブ）は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼにもとづき反応して、細胞膜を透過しない蛍光性着色付加生成物を生成する。
ＣＭＴＭＲによる細胞の着色によって、不動の各周辺領域、ＥＲおよびＧｏｌｇｉでのタンパク質との反応から生ずる鮮明な蛍光が生じ、且つまた小さい融合気孔を経て拡散できる細胞質ゾル中の蛍光性グルタチオン付加生成物（ＰＭ〜６００Ｄａ）に起因するより弱い蛍光が生ずる。
１．蛍光性細胞質ゾンデＣＭＴＭＲ（５−（（（４−クロロメチル）べンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）および（６−（（（４−クロロメチル）べンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）（Molecular Probe,cat＃C-2927,ex/em541/565nm）をＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度で溶解した。
１０μｌまたは２０μｌの分別量を採取し、−２０℃に保存した。加熱によって不活性化したＳＶＦ１０％（１００μ／ペニシリンｍｌ，１００μｇ／ストレプトマイシンｍｌ（Ｄ１０））を補足したＤＭＥＭでＣＭＴＭＲの希釈物（１：５００）を調製した。
２．（微小ウエル上で）標的細胞から媒体を除去し、ＣＭＴＭＲの希釈溶液１ｍｌを塗布した。３７℃において４５−６０ｍｉｎ試料のインキュベーションを行った。着色溶液を１ｍｌのＤ１０で置換し、更に１５−３０ｍｉｎ、インキュベーションを続行した。
融合の実施
１．ＣＭＴＭＲでマーキングした標的細胞に、カルセインでマーキングしたエフェクター細胞（２ｍｌ）を加えた。３７℃において３−５時間、２つの細胞集団のインキュベーションを行った。
２．インキュベーション終了後、媒体を１ｍｌのＤ−ＰＢＳで置換し、４０倍の油浸レンズで相および蛍光を撮影した。
カルセインで着色された細胞の観察のため、ＦＩＴＣ（励起装置：ＢＰ４７０−４９０；プリズムＤＭ５０５；伝送器：ＢＡ５１５−５５０）を使用し、ＣＭＴＭＲのためにローダミン（励起装置：ＢＰ５３０−５５０；プリズムＤＭ５７０；伝送器：ＢＡ５９０）を使用した。かくして、着色剤の蛍光を観察する際に生ずるオーバフローが避けられた。各試料についてランダムに選択した６−１０の異なるフィルタによって像を統合した。
３．ソフトウエアMetamorph（Universal Imaging Inc.）を使用して像を重畳させ、計数してデータを解析した。ＣＭＴＭＲについてプラスの全細胞数および２つの蛍光ゾンデについてプラスの全細胞数を計数した。マーキングした細胞が相互に重畳するが融合してないプラスの比率を区別するため、高光沢像を使用する。融合％は、下式にもとづき計算する：
融合％＝１００×［２つの着色剤についてプラスの細胞数］／［全標的細胞数］
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