JP2002534961A - リンパ球膜タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、リンパ球膜タンパク質（LMPRO）並びにLMPROを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はLMPROの発現に関わる疾患の診断、治療又は予防の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、リンパ球膜タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びに癌、免
疫系異常及び感染症の診断、治療及び予防におけるこれらの配列の利用法に関す
るものである。

【０００２】 発明の背景 白血球は、免疫反応の主要な作用因子である。白血球には、例えば、Bリンパ
球、Tリンパ球、顆粒球、単球及び好中球等の多様な細胞型が含まれ、それらは
血液由来や局所性の感染と戦い、また炎症性及びアレルギー性の反応を誘発する
。白血球は、細胞型に特異的なマーカーとして機能するだけでなく、細胞間の伝
達、細胞分化、細胞増殖及びシグナル伝達の重要な媒介物として機能する細胞表
面タンパク質の特徴的な一群を発現する。また、ある一定の白血球は細胞小器官
に局在する異なった膜貫通タンパク質を発現し得ることが最近の研究によって示
唆されている。

【０００３】 Ly-6抗原は、膜結合タンパク質のファミリーを含み、それらは主としてTリン
パ球表面において発現され、より少ない程度で他の白血球及び白血球前駆体にお
いて発現される（Reviewed in Barclay, A.N. et al. (1995) The Leiicocvte A ntigen Facts Book , Academic Press, San Diego CA, pp. 352-354; Friedman,
S. et al. (1990) Immunogenetics 31:104-111）。マウスにおいて、Ly-6A、6B
及び6C等のLy-6抗原は、染色体15に位置する多重遺伝子複合体のメンバーによっ
てコードされる。この複合体における遺伝子は、恐らくは遺伝子重複事象によっ
て発生する。Ly-6は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー
によって細胞表面に固定される。Ly-6の各々は、約135個のアミノ酸の長さであ
り、互いに約50％の同一性を有する。N末端の約25個のアミノ酸には、成熟タン
パク質から分割されたシグナルペプチドが含まれる。また、その成熟タンパク質
には、規則正しく離隔された10個のシステイン残基によって特徴付けられるモチ
ーフが含まれる（ExPASy PROSITE database, document PDOC00756を参照）。ま
た、このモチーフは、補体膜侵襲複合体のインヒビタCD59並びにウロキナーゼプ
ラスミノーゲン活性化因子受容体（u-PAR）等の他のGPIで固定される細胞表面タ
ンパク質においても保存される。また、推定上のGPI固定部位は、未成熟タンパ
ク質の概ねアミノ酸105で生じるアスパラギン残基に制限されてきた。Ly-6抗原
の機能の詳細については不明であるが、これらのタンパク質は、細胞膜を横切っ
て分裂誘起シグナルを伝達し、リンパ球の活性化に応じてアップレギュレートさ
れることが研究によって示されている。

【０００４】 Jaw1は、発生的に調節される新規なタンパク質であり、それらは主としてBリ
ンパ球及びTリンパ球において発現され、より少ない程度で別の種類の白血球に
おいて発現される（Behrens, LW. et al. (1994) J. Immunol. 153:682-690）。
Jaw1は555個のアミノ酸の長さであり、小胞体（ER）に局在している。Jaw1は、
そのC末端の71個のアミノ酸によってER膜の細胞質表面に固定される。そのタン
パク質の中央には、約150個のアミノ酸のコイルドコイル・ドメインが含まれる
。その発現パターン及びER局在化に基づけば、Jaw1は、分化性Bリンパ球及びTリ
ンパ球の細胞表面に対するリンパ球特異性受容体の輸送において所定の役割を果
たし得る。

【０００５】 免疫反応におけるリンパ球の機能は、シグナル伝達及び遺伝子発現に関与する
タンパク質の適切な発現及び調節に依存する。Bリンパ球及びTリンパ球は、微生
物及びウイルス感染の各々に対する免疫反応に特に重要である。リンパ球の機能
が十分でない場合には、感染症に対する罹病率が増大し得る。更に、過剰なリン
パ球の増殖によって、ホジキン病等のリンパ腫を含めた腫瘍性の疾患が引き起こ
され得る。

【０００６】 新規なリンパ球膜タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチドの開示
は、癌、免疫系異常及び感染症の診断、予防及び治療に役立つ新たな組成物を提
供して当業者の要求を満たすものである。

【０００７】 発明の概要 本発明は、まとめて「LMPRO」、個別には「LMPRO-1」及び「LMPRO-2」と称される実
質的に精製されたポリペプチドであるリンパ球膜タンパク質を特徴とする。一実
施態様において、本発明はSEQ ID NO:1-2及びそれらの断片からなる群より選択
されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。また、
本発明にはSEQ ID NO:1-2からなる群より選択されたアミノ酸配列から1又はそれ
以上の保存的アミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる
。

【０００８】 また、本発明はSEQ ID NO:1-2及びそれらの断片からなる群より選択された少
なくとも1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のアミノ酸同一性を有す
る実質的に精製された変異体を提供する。更に本発明はSEQ ID NO:1-2及びそれ
らの断片からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
る単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。更に本発明にはSEQ ID NO:
1-2及びそれらの断片からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70%以上のポリヌクレオチ
ド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列が含ま
れる。

【０００９】 更に、本発明はSEQ ID NO:1-2及びそれらの断片からなる群より選択されたア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェン
トな条件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供
する。また本発明はSEQ ID NO:1-2及びそれらの断片からなる群より選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的
な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【００１０】 また、本発明は核酸を含むサンプルにおけるポリヌクレオチドの検出方法を提
供し、その方法には（ａ）サンプルの少なくとも1つのポリヌクレオチドとポリ
ヌクレオチドの相補配列とをハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複
合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過
程であって、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルに
おけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有するよう
な検出過程とが含まれる。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼーションの
前にポリヌクレオチドを増幅する過程を更に含む。

【００１１】 更に、本発明はSEQ ID NO:3-4及びそれらの断片からなる群より選択されたポ
リヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。ま
た本発明はSEQ ID NO:3-4及びそれらの断片からなる群より選択されたポリヌク レオチド配列に対して少なくとも70%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有 する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列を提供する。更に本発明は SEQ ID NO:3-4及びそれらの断片からなる群より選択されたポリヌクレオチド配 列を含むポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポ リヌクレオチドを提供する。

【００１２】 更に、本発明はSEQ ID NO:1-2からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクタ
ーを提供する。別の実施態様では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される。

【００１３】 また、本発明はポリペプチドの製造方法を提供し、その方法には（ａ）前記ポ
リペプチドの発現に適した条件の下で、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベ
クターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペ
プチドを回収する過程とが含まれる。

【００１４】 更に、本発明はSEQ ID NO:1-2及びそれらの断片からなる群より選択されたの
アミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と共
に含む医薬品成分を提供する。

【００１５】 更に、本発明にはSEQ ID NO:1-2及びそれらの断片からなる群より選択された
ポリペプチドに結合する精製された抗体が含まれる。また本発明は前記ポリペプ
チドの精製されたアゴニスト及び精製されたアンタゴニストを提供する。

【００１６】 更に、本発明はLMPROの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予
防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な患者に対してSEQ ID
NO:1-2及びそれらの断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する実質
的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む有効な量の医薬品組
成物を投与する過程が含まれる。

【００１７】 更に、本発明はLMPROの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又は予
防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な患者に対してSEQ ID
NO:1-2及びそれらの断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの有効な量のアンタゴニストを投与する過程が含まれる。

【００１８】 発明を実施するための形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の装置、材料、及び方法に限定されるものではなく、その実
施形態は変更可能であることを理解されたい。また、ここで使用した専門用語は
、特定の実施例のみを説明する目的で用いたものであり、特許請求の範囲のみで
限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解され
たい。

【００１９】 請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含
むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそ
のような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、1又はそれ以上の抗体及び
当業者に周知のその等価物なども表している。

【００２０】 特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用
語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解され
るものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法、装
置、及び材料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書におい
ては好適な方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献
で報告された本発明に関して用いられ得る株化細胞、プロトコル、試薬、及びベ
クターを説明・開示するために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内
容は、本発明が従来発明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるもの
と解釈してはならない。

【００２１】 定義 用語「LMPRO」は、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及びヒ
トを含む哺乳類の種から得られたものであって、天然、合成、半合成か、或いは
組換え体を起源として得られた実質的に精製されたLMPROのアミノ酸配列を指す
。

【００２２】 用語「アゴニスト」は、LMPROの生物学的活性を強化したり、模擬する分子を
指す。このアゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、小分子又は他の任意の化
合物や組成物が含まれ、それらはLMPROと直接相互作用するか、或いはLMPROが関
与する生物学的経路の成分に作用することによってLMPROの活性を調節する。

【００２３】 用語「アレル変異配列」は、LMPROをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル
変異配列は、核酸配列における少なくとも1つの突然変異に起因し、変異したmRN
A或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化する場合と変化
しない場合とがある。遺伝子には、自然発生型のアレル変異配列がないもの、1
つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列が生じ
る通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加又は置換によるものである。
これらの変化の形態の各々は、単独又は他の変化と組み合わされて、所定の配列
において1又はそれ以上の回数で生じ得る。

【００２４】 ここで用いるLMPROをコードする「変異(altered)」核酸配列には、結果として同
一のLMPRO又はLMPROの機能的特徴の少なくとも1つを含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換をと
もなうそれらの配列が含まれる。この定義には、LMPROをコードするポリヌクレ
オチド配列の正常な染色体の位置とは異なる位置のアレル変異配列に対する不適
切な或いは予期しないハイブリダイゼーションや、LMPROをコードするポリヌク
レオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或い
は検出困難な多型が含まれる。コードされたタンパク質もまた「変異」したもので
あり得て、サイレント変化(silent change)をもたらして結果的に機能的に等価
のLMPROとなるアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含み得る。意図的なアミノ
酸置換は、LMPROの生物学的又は免疫学的活性が保持される限りにおいて、残基
の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質についての類
似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸
及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが
含まれる。類似の親水性値を有する非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸には、ロ
イシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；並びにフェニルアラ
ニン及びチロシンが含まれる。

【００２５】 用語「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプ
チド若しくはタンパク質の配列又はそれらの何れかの断片であり、自然発生や合
成の分子を指す。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子のアミノ酸配列
を指すのに用いられる場合は、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、そのアミノ
酸配列を、記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に
限定するものではない。

【００２６】 用語「増幅」は、核酸配列の更なる複製物を生成することであり、通常は当業
者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて実施される。

【００２７】 用語「アンタゴニスト」は、LMPROの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子
である。アンタゴニストには、抗体、核酸、糖質、小分子又は他の任意の化合物
や組成物などのタンパク質が含まれ、それらはLMPROと直接相互作用するか、或
いはLMPROが関与する生物学的経路の成分と作用することによってLMPROの活性を
調節する。

【００２８】 用語「抗体」は、完全な分子や、抗原決定基と結合し得るFa、F(ab')₂、及びFv
フラグメントのようなそれらの断片を指す。LMPROポリペプチドに結合する抗体
は、未処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原として関与する小型
のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物（例えば、マウ
ス、ラット又はウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチド又はオリゴペプチ
ドは、RNAの翻訳又は化学的に合成されたものから得られ、必要ならば担体タン
パク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する通常用いられる担体には
、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニ
ン（KLH）が含まれる。次に、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する
。

【００２９】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ち、エピトープ
）を指す。タンパク質若しくはタンパク質の断片を用いて宿主の動物を免疫化す
る場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域
又は3次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、
抗体への結合に関して元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために用いられる免
疫原）と競合し得る。

【００３０】 用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」鎖と相補的な核酸配列を
含む任意の成分を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で生
成することができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入されると、
細胞によって作られた天然の配列と結合して2重鎖を形成し、転写や翻訳を妨げ
る。「ネガティブ」若しくは「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し
、「ポジティブ」若しくは「プラス（＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある
。

【００３１】 用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節機能又は生化
学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、適切な動物
や細胞において特定の免疫反応を誘発し、特定の抗体と結合するための、天然の
LMPRO、組換え体のLMPRO若しくは合成のLMPRO又はその任意のオリゴペプチドの
能力を指す。

【００３２】 用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然
な結合を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は相補的配列「3'T-C-A5'」に結合す
る。2つの1本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合しているような「部
分的」なものや、或いは1本鎖分子間に完全な相補性が存在するような「完全」な
ものもある。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーショ
ンの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によっ
て左右される増幅反応や、ペプチド核酸（PNA）分子の設計及び使用において特
に重要である。

【００３３】 用語「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」及び「所定のアミノ酸配列
を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤又は水溶液が含まれ得る
。LMPRO若しくはLMPROの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、ハ
イブリダイゼーションプローブとして利用できる。このプローブは凍結乾燥した
状態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合させることができる。
ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブを、塩（例えば、NaCl）、界面
活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)）及び他の物質（例えば、デン
ハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNA等）を含む水溶液に分散させることができ
る。

【００３４】 用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基を分離した核酸配
列か、XL-PCR kit(The Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)を用いて5‘方向及び
／又は3’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いは断片の組み立て
ためのコンピュータプログラム（例えば、GELVIEW Fragment Assembly system,
GCG, Madison WI）を用いて、2種以上のインサイトクローンや、また場合によっ
ては1又はそれ以上の公有のESTの重複した配列から組み立てられた核酸配列であ
る。いくつかの配列が伸長され且つ組み合わされてコンセンサス配列が作られる
。

【００３５】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど損なわない置
換を指し、つまり、その置換によってそのタンパク質の構造や、ことに機能は大
きくは変化せずに保存される。以下に、タンパク質の元のアミノ酸が別のアミノ
酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile, Leu, Thr 一般に、保存的なアミノ酸置換では、（ａ）置換領域のポリペプチドの主鎖構
造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、（ｂ）置換部位の分子の電荷若
しくは疎水性並びに／又は（ｃ）側鎖の大部分が維持される。

【００３６】 用語「欠失」は、結果的に1個又はそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸
残基が欠けるようなヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の変化を指す。

【００３７】 用語「誘導体」は、化学的に修飾されたポリペプチド配列若しくはポリヌクレ
オチド配列を指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、水素からア
ルキル基、アシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基への置換が含まれ得る。ポリ
ヌクレオチド誘導体は、自然発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持する
ポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化(pegylation)、又は元のポリペプチドの生物学的若しくは免疫学
的機能を保持する別の任意のプロセスで修飾されたものである。

【００３８】 用語「断片」は、LMPRO若しくはLMPROをコードするポリヌクレオチドの固有の
部分であって、その親配列(parent sequence)と同一であるがより長さの短い配
列を指す。「断片」には、所定の配列の長さから1つのヌクレオチド／アミノ酸
残基を差し引いた長さのものまでが含まれ得る。例えば、或る断片には、5〜100
0個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基が含まれ得る。プローブ、プラ
イマー、抗原、治療用分子又はその他の目的に用いる断片は、少なくとも5、10
、15、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500個の連続するヌ
クレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、分子の特定の領域か
ら優先的に選択されることもある。例えば、ポリペプチド断片には、所定の配列
に示すような最初の250若しくは500個のアミノ酸（又は、ポリペプチドの最初の
25%又は50%）から選択された連続する所定の長さのアミノ酸が含まれ得る。これ
らの長さは例示的なものであり、本発明の実施例には、配列表、表及び図面を含
めた明細書に記載された任意の長さが含まれ得る。

【００３９】 SEQ ID NO:3-4の或る断片には、例えば同一のゲノム内の他の配列とは異なる
、SEQ ID NO:3-4を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域が含ま
れる。SEQ ID NO:3-4の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅
技術や、SEQ ID NO:3-4を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に
おいて有用である。或る断片と一致するSEQ ID NO:3-4の断片やSEQ ID NO:3-4の
領域の正確な長さは、その断片の目的に基づいて周知技術によってルーチン的に
決定可能である。

【００４０】 SEQ ID NO:1-2の或る断片は、SEQ ID NO:3-4の或る断片によってコードされる
。SEQ ID NO:1-2の或る断片には、SEQ ID NO:1-2を特異的に同定する固有のアミ
ノ酸配列の領域が含まれる。例えば、SEQ ID NO:1-2の或る断片は、SEQ ID NO:1
-2を特異的に認識する抗体の産生のための免疫原性ペプチドとして有用である。
或る断片と一致するSEQ ID NO:1-2の断片やSEQ ID NO:1-2の領域の正確な長さは
、その断片の目的に基づいて周知技術によってルーチン的に決定可能である。

【００４１】 用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。類似性には、部分的な類似
性と、完全な類似性がある。用語「類似性」の代わりに「同一性」が用いられ得る。
同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する
部分的に相補的な配列を「実質的に類似」と称する。完全に相補的な配列と標的
配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性の条件下で、ハイブ
リダイゼーションアッセイ（サザンブロット、ノーザンブロット又は溶液ハイブ
リダイゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に類似な配列又はハイブ
リダイゼーションプローブは、緩やかなストリンジェントな条件下で、標的配列
に対する完全に類似（同一）な配列の結合について競合してそれを阻害し得る。
これは、緩やかなストリンジェントな条件では、非特異的な結合が許容されると
いうことを意味するものではなく、緩やかなストリンジェントな条件では、2つ
の配列の相互の結合が特異的（即ち、選択的）な相互作用であることが必要であ
る。非特異的な結合が存在しないことを、部分的な相補性さえも有していない（
即ち、約30%未満の類似性又は同一性）第2の標的配列を用いることにより検査す
ることができる。非特異的結合が存在しない場合には、実質的に類似な配列又は
プローブは第2の非相補的な標的配列とハイブリダイズしない。

【００４２】 ポリヌクレオチド配列についての用語「同一性のパーセント」又は「同一性の
％」とは、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2つ
以上のポリヌクレオチド配列間の残基の一致の百分率を意味する。このようなア
ルゴリズムでは、2つの配列間のアラインメントを最適化するために、標準的な
再現性のある方法で、比較される配列にギャップを挿入して2つの配列間のより
有意な比較を行うことができる。

【００４３】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
のパラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェ
アパッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison
WI）である。このCLUSTAL Vについては、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (198
9) CABIOS 5:151-153並びにHiggins, D.G. ら (1992) CABIOS 8:189-191に記載
されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラ
メーターは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4及び「diagonals saved」=4と
設定する。「重みづけされた」残基重みづけ表がデフォルトとして選択される。
CLUSTAL Vによって、同一性のパーセントは、アラインメントされたポリヌクレ
オチド配列の対の間の「類似性のパーセント」として報告される。

【００４４】 或いは、一般的に用いられる無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式は、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS T/ ）などを含めた幾つかのソースから入手できるNational Center for Biotechn
ology Information（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Alt
schul, S.F. ら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）によって提供される。BLA
STソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と種々のデータベースか
らの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含
めた様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と称される
ツールが入手可能であり、2つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用
いる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html にアクセスして対話形式で利用可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、b
lastn 及び blastp（後述）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、
一般的には、デフォルト設定に設定されたギャップ及び他のパラメーターと共に
用いられる。例えば、2つのヌクレオチド配列を比較するとき、デフォルトのパ
ラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（May-07-199
9）をblastnと共に使用できる。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、
以下のようなものであり得る。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: −2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で定められる配列の全長に対
して測定するか、或いはより短い長さの配列、例えば、より大きな所定の配列か
ら得られた断片（例えば、少なくとも、20、30、40、50、70、100又は200個の連
続するヌクレオチドの断片）の長さに対して測定してもよい。このような長さは
単に例示的なものであり、配列表、表及び図面を含めた明細書に記載の配列の任
意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定され得る長さを示すことが
できることを理解されたい。

【００４５】 高い同一性を示さない核酸配列にも関わらず、遺伝子コードが縮重するために
類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。縮重を利用して核酸配列を変化さ
せて、それらが全て実質的に同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配
列を作り出すことができる。

【００４６】 ポリペプチド配列についての用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％」
とは、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2つ以上
のポリペプチド配列間の残基の一致の百分率を意味する。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮するものもある。先に詳述したこのような保存的な置換では、通常
は置換部位の酸性度や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造が（従って機能も
）保存される。

【００４７】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（前述）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトのパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いるポリぺプチド
配列の対のアライメントの場合、デフォルトのパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリクス
が、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライン
メントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の間の同一性のパ
ーセントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。

【００４８】 或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられ得る。例えば、２つのポリペ
プチド配列の対の比較をする場合、デフォルトのパラメータで設定された「BLAS
T 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)をblastpと共に使用できる
。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようなものであり得る。
Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で定められるポリペプチド配
列の全長に対して測定するか、或いはより短い長さの配列、例えば、より大きな
所定のポリペプチド配列から得られた断片（例えば、少なくとも、15、20、30、
40、50、70又は150個の連続する残基の断片）の長さに対して測定してもよい。
このような長さは単に例示的なものであり、配列表、表及び図面を含めた明細書
に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定され得る
長さを示すことができることを理解されたい。

【００４９】 「ヒト人工染色体」（HAC）は、6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含み、且つ安定
した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体
である。

【００５０】 用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持しながらヒト抗
体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列を変化させた抗体
分子を指す。

【００５１】 用語「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件の下
で或る1本鎖ポリヌクレオチドが相補的な鎖と塩基対を形成することによるアニ
ーリングプロセスを指す。特異的なハイブリダイゼーションとは、2つの核酸配
列が高度な同一性を有することを意味する。特異的なハイブリダイゼーション複
合体はアニーリングが許容される条件の下で形成され、「洗浄過程」の後もハイブ
リダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスのスト
リンジェンシーの決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条件で
は、非特異的な結合（即ち、完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少す
る。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によってルーチン的
に決定され、ハイブリダイゼーション実験の間は一定であるが、一方で、所望の
ストリンジェンシーのために実験中に洗浄条件を変更可能であり、従ってハイブ
リダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば
、温度68℃で、約6×SSC、約1%（w/v）のSDS及び約100μg/mlの変性サケ精子DNA
の存在下で成立する。

【００５２】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの一部は、洗浄過程を
行う温度で表すことができる。通常、この洗浄温度は、所定のイオン強度とpHに
おける特定の配列の融点（Tm）よりも約5〜20℃低く選択される。このTmは、（
所定のイオン強度とpHの下で）標的の配列の50%が、完全に一致するプローブと
ハイブリダイズする温度である。Tmを算出するための式及び核酸のハイブリダイ
ゼーションの条件は周知であり、Sambrook らの文献（1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview
NY; 特に2巻の9章を参照）に記載されている。

【００５３】 本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの高いストリンジェン
シーの条件には、約0.2×SSC及び約1%のSDSの存在下の約68℃での1時間の洗浄過
程が含まれる。或いは、65℃、60℃、55℃又は42℃の温度で行う。SSCの濃度は
、約0.1%のSDSの存在下で、約0.1〜2×SSCの範囲を変化し得る。通常は、遮断剤
を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には
、例えば、約100〜200μg/mlの変性サケ精子DNAが含まれる。約35〜50%v/vの濃
度のホルムアミドなどの有機溶剤を、例えば、RNAとDNAのハイブリダイゼーショ
ンなどの特定の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な変更につ
いては、当業者には容易に明白であろう。特に高度なストリンジェントな条件で
のハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。
このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリペプチドに対
して類似の役割を強く示唆している。

【００５４】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の水素結合形成
の力によって、2つの核酸配列間で形成された複合体を指す。ハイブリダイゼー
ション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、C₀t又はR₀t解析）、或いは溶
液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メンブラン、フィルタ、
ピン若しくはガラススライド、又は細胞若しくはその核酸が固定される他の適切
な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。

【００５５】 用語「挿入」或いは「付加」は、1又は2個以上のヌクレオチド若しくはアミノ
酸残基をそれぞれ付加するようなヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の変化を指
す。

【００５６】 用語「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症又は伝染性若しくは遺伝性の疾患
に関連する症状を指す。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用する種々
の因子（例えば、サイトカイン、ケモカイン及び他のシグナル伝達分子）の発現
によって特徴づけられる。

【００５７】 用語「マイクロアレイ」は、基板上の種々のポリヌクレオチドの配置を指す。

【００５８】 マイクロアレイの文脈における用語「エレメント」又は「アレイエレメント」は、
基板の表面に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。

【００５９】 用語「調節(modulate)」は、LMPROの活性の変化を指す。例えば、調節によっ
て、タンパク質活性、結合特性、又はLMPROの他の任意の生物学的特性、機能的
特性若しくは免疫学的特性の増大や低下がもたらされる。

【００６０】 用語「核酸」又は「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌ
クレオチド又はそれらの任意の断片を指す。また、これらの用語は、1本鎖若し
くは2本鎖の、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のゲノム起源又は合成起源のDNA
若しくはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様若しくはRNA様物質も指す
。

【００６１】 用語「機能的に結合（する）」は、第1の核酸配列と第2の核酸配列が機能的な
関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影
響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合してい
る。一般に、同じ読み枠内で2つのタンパク質をコードする領域が結合する必要
がある場合は、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続し得
る。

【００６２】 用語「ペプチド核酸」（PNA）は、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチ
ドバックボーンに結合した少なくともヌクレオチド5個以上の長さのオリゴヌク
レオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤(anti-gene agent)を指す。末
端のリジンがその組成に溶解性を賦与している。PNAは相補的な1本鎖DNAやRNAに
優先的に結合して転写物の伸長を止め、またPNAをポリエチレングリコール化し
て細胞におけるPNAの寿命を延ばすことが可能である。

【００６３】 「プローブ」とは、LMPRO、それらの相補配列又はそれらの断片をコードする
核酸配列のことであり、それらを同一の核酸配列、アレル核酸配列又は関連する
核酸配列の検出に用いる。プローブは、検出可能な標識又はレポーター分子に結
合した単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識
には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素が含まれる。「プ
ライマー」は、短い核酸（通常はDNAオリゴヌクレオチド）であり、それらは、
相補的な塩基対を形成することで標的のポリヌクレオチドにアニーリングされ得
る。次に、プライマーは、DNAポリメラーゼ酵素によって標的のDNA鎖に沿って延
長され得る。プライマーの組は、例えば、PCR法による核酸配列の増幅（及び同
定）に用いること可能である。

【００６４】 本発明に用いるプローブ及びプライマーは、通常は既知の配列の少なくとも15
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることが可能であり、そのようなプローブ及びプライマーには
、例えば、開示した核酸配列の連続する少なくとも20、25、30、40、50、60、70
、80、90、100又は150のヌクレオチドが含まれる。プローブ及びプライマーは、
これらの例よりも相当長い場合もあり、表、図面及び配列表を含めた本明細書に
示された任意の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。

【００６５】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.らによる、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻（Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）、又はAusubel, F.M.
らによる、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」（Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY）、並びに Innisらによる
、1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」（Ac
ademic Press, San Diego CA）を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例
えば、Primer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Rese
arch, Cambridge MA）ような目的のためのコンピュータプログラムを用いて既知
の配列から得ることができる。

【００６６】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、各々が最大100個のヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択や、32
キロベースまでの入力ポリヌクレオチド配列からの最大5,000個のヌクレオチド
までのオリゴヌクレオチド及びより大きなポリヌクレオチドの分析に有用である
。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡張する更なる機能が組込ま
れている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at Unive
rsity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、メ
ガベースの配列から特定のプライマーを選択可能であり、ゲノムワイドスコープ
(genome-wide scope)におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライマ
ー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Ca
mbridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として
避けたい配列をユーザーが指定する「ミスプライミングライブラリ(mispriming
libaray)」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのためのオリ
ゴヌクレオチドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラム
のソースコードは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーの特定のニ
ーズを満たすように変更することもできる）。PrimerGenプログラム（UK Human
Genome Mapping Project Resource Centre, Cambridge UK より入手可能）は、
多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメン
トされた核酸配列の最も保存された領域又は殆ど保存されない領域の何れかとハ
イブリダイズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラム
は、固有の保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有
用である。前述の任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチド及びポリヌク
レオチドの断片は、例えば、PCR法や配列決定のプライマー、マイクロアレイ要
素、或いは核酸のサンプルにおいて完全又は部分的に相補的なポリヌクレオチド
を同定する特定のプローブとしてハイブリダイゼーション技術において有用であ
る。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上述の方法に限定されるものではない。

【００６７】 用語「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の異なる離隔され
たセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工的組み合せは、化学
合成によって実施する場合も多いが、より一般的には、例えば、前出のSambrook
（前出） に記載されたような遺伝工学的手法によって核酸の離隔されたセグメ
ントを人工的に操作する。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の付加、置
換又は欠失によって変更された核酸も含まれる。組換え核酸には、プロモーター
配列に機能的に結合した核酸配列が含まれる場合もある。このような組換え核酸
は、例えば、ある細胞を形質転換するために用いられるベクターの一部であり得
る。

【００６８】 或いは、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワク
チン接種に用いられ、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発するワクシニアウ
イルスに基づくウイルスベクターの一部であり得る。

【００６９】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。LMPROをコードする核
酸若しくはその断片、又はLMPRO自体を含む疑いのあるサンプルには、体液や、
細胞から分離された染色体、細胞小器官又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、溶
液中の、或いは固体支持体に結合したゲノムDNA、RNA又はcDNAや、組織や、組織
プリント等が含まれ得る。

【００７０】 用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子又は任意の天然若しくは合成
の結合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造
（例えば、結合する分子が認識する抗原決定基、つまりエピトープ）の存在に左
右されることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特異的
である場合、標識された遊離した「A」及びその抗体を含む反応において、エピ
トープ「A」（つまり遊離し、標識されていない「A」）を含むポリヌクレオチド
が存在することにより、抗体に結合する標識された「A」の量が低下する。

【００７１】 用語「実質的に精製され」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列又はアミ
ノ酸配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から単離又は
分離されて、その構成要素が少なくとも約60%以上、好ましくは約75%以上、最も
好ましくは約90%以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。

【００７２】 用語「置換」は、1個又は2個以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を、別のヌク
レオチド或いはアミノ酸にそれぞれ置換することを意味する。

【００７３】 用語「基板」は、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、
磁気或いは非磁気のビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管を
含む適切な固体又は半固体の支持体を指す。基板は、ポリヌクレオチドやポリペ
プチドが結合する壁、溝、ピン、チャンネル及び孔等の様々な表面形態をとるこ
とが可能である。

【００７４】 用語「形質転換」は、外来性のDNAが入り込み宿主細胞を変化させるプロセス
を意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法によって自然又は人工の条
件下で起こり、またそれは外来性の核酸配列を原核細胞又は真核細胞の宿主細胞
に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質転換の方法は、形質転換
される宿主細胞の種類によって選択され、それらには、以下に限定しないが、ウ
イルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェク
ション及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「形質転換された」細
胞には、挿入されたDNAを自律的に複製するプラスミドとして、或いは宿主の染
色体の一部として複製可能な安定的に形質転換された細胞や、限られた時間で導
入されたDNAやRNAを発現する一時的に形質転換された細胞が含まれる。

【００７５】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトのパラメーター設定の「BLAS
T 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を伴うblastnを用いて、所
定の長さにおいて特定の核酸配列に対して少なくとも40％の配列の同一性を有す
ることが明らかにされた核酸配列である。このような核酸の対は、所定の長さに
おいて、例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%若しくは98%又
はそれ以上の同一性を示し得る。或る変異配列は、例えば、「アレル」（前述）
、「スプライス」、「種」又は「多形性」変異配列と記述され得る。スプライス
変異配列は、基準分子に対して有意な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング
の際のエキソンの選択的スプライシングによってポリヌクレオチドの数がより多
くなるか、或いは少なくなり得る。対応するポリペプチドは、更なる機能ドメイ
ンを有するか、或いは基準分子に存在するドメインが欠落し得る。種変異配列は
、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。生じるポリペプチドは、通常
は互いに有意なアミノ酸同一性を有する。多形性変異配列は、所定の種の個々の
間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なるものである。また、多形性変
異配列には、ポリヌクレオチド配列の1つのヌクレオチドが変異する「1つのヌク
レオチド多形性」（SNP）が含まれ得る。SNPの存在は、例えば、所定の個体群、
病状又は病態の特徴を示唆し得る。

【００７６】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトのパラメーター設定の
「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を伴うblastpを用い
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも40%と決定された核酸配列のことである。所定の長さにおいて特定のポ
リペプチド配列に対して少なくとも40％の配列の同一性を有することが明らかに
されたポリペプチド配列である。このようなポリペプチドの対は、或る長さにお
いて、例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%若しくは98%又は
それ以上の同一性を示し得る。

【００７７】 発明 本発明は、新規なヒトリンパ球膜タンパク質（LMPRO）、LMPROをコードするポ
リヌクレオチド、並びに癌、免疫系異常及び感染症の診断、治療又は予防のため
のこれらの組成物の利用法の発見に基づくものである。

【００７８】 本発明のLMPRO-1をコードする核酸は、核酸及び／又はアミノ酸配列アライメ
ントについてのコンピュータ検索を用いて子宮のcDNAライブラリ（UTRSNOT08）
からのインサイト社クローン2083433H1において初めて同定された。コンセンサ
ス配列、SEQ ID NO:3は、次に挙げる重複及び／又は伸長された核酸配列、イン
サイト社クローン2083433H1 (UTRSNOT08)、2850781F6 (BRSTTUT13)、4790284H1
(EPIBIJNT01)、5297246H1 (MUSCNOT11)、3201319F6 (PENCNOT02)、2364668F6 (A
DRENOT07)、231153R1 (SINTNOT02)、3750238H1 (UTRSNOT18)及び2285063R6 (BRA
INON01)から導出された。

【００７９】 一実施例において、図１Ａ〜図１Ｅに示すように、本発明はSEQ ID NO:1のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。LMPRO-1は、284個のアミノ酸の長さで
あり、残基N36における1つの潜在的Nグリコシル化部位と、残基S69におけるcAMP
及びcGMP依存性のプロテインキナーゼによる1つの潜在的リン酸化部位と、残基T
122、S138、S184、T194、S204及びS249におけるカゼインキナーゼIIによる6つの
潜在的リン酸化部位と、残基S37、T51及びS203におけるプロテインキナーゼCに
よる3つの潜在的リン酸化部位と、残基Y156におけるチロシンキナーゼによる1つ
の潜在的リン酸化部位と、残基A115からT122までの潜在的ATP／GTP結合部位（P
ループ）とを有する。また、LMPRO-1は、残基I227からY244までの予測された膜
貫通ドメインを含む。LMPRO-1は、ヒトJaw1（GI 544492; SEQ ID NO:5）、ヒトM
RVI1A（GI 4587965）及びヒトMRVI1B（GI 4587967）と化学的および構造的類似
性を有する。図２に示すように、残基M1からK75までのLMPRO-1の領域は、残基V3
07からR381までのJaw1の領域と40％の同一性を共有する。この領域は、概ね残基
V307からL349までのJaw1コイルドコイルドメインの約45個のアミノ酸と重複する
。概ね1198番目から1242番目までのヌクレオチドのSEQ ID NO:3の断片は、例え
ば、SEQ ID NO:3と関連する配列とを区別するためや、SEQ ID NO:3を同定するた
めのハイブリダイゼーション及び増幅技術において有用である。そのコードされ
たポリペプチドは、例えば免疫原性ペプチドとして有用である。ノーザン分析は
、種々のライブラリにおいてこの配列の発現を示し、これらの少なくとも41%が
癌に関係し、少なくとも28%が炎症に関係するものである。特に注目すべきは、
生殖及び胃腸組織におけるLMPRO-1の発現である。例えば、LMPRO-1は、クローン
病を患う結腸組織及び乳癌組織から得られたcDNAライブラリにおいて発現される
。

【００８０】 本発明のLMPRO-2をコードする核酸は、核酸及び／又はアミノ酸配列アライメ
ントについてのコンピュータ検索を用いて陰茎のcDNAライブラリ（PENGNOT01）
からのインサイト社クローン3378920H1において初めて同定された。コンセンサ
ス配列、SEQ ID NO:4は、次に挙げる重複及び／又は伸長された核酸配列、イン
サイト社クローン3378920H1 (PENGNOT01)、3094509F6及び3094509T6 (CERVNOT03
)、並びに961662R6及び961662H1 (BRSTTUT03)から導出された。

【００８１】 一実施例において、図３Ａ〜図３Ｃに示すように、本発明はSEQ ID NO:2のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。LMPRO-2は、125個のアミノ酸の長さで
あり、残基N77及びN88における2つの潜在的Nグリコシル化部位と、残基T67にお
けるカゼインキナーゼIIによる1つの潜在的リン酸化部位と、残基S38及びT79に
おけるプロテインキナーゼCによる2つの潜在的リン酸化部位とを有する。また、
LMPRO-2は、残基M1からA18までの予測されたシグナルペプチドを含む。BLOCKS解
析によって、LMPRO-2が残基L6からC25まで並びに残基L85からN98までの2つのLy-
6/u-PARサイン(signatures)を含むことが示されている。推定上のLy-6モチーフ
は、残基C22からC97までのLMPRO-2において生じる。このモチーフに特徴的な10
個のシステインが残基C22、C25、C33、C39、C47、C65、C72、C91、C92及びC97に
おいて生じる。また、推定上のGPI結合部位が残基N98において保存される。LMPR
O-2は、ラットLy6-B（GI 205248; SEQ ID NO:6）と化学的および構造的類似性を
有する。図４に示すように、LMPRO-2は、残基Ly6-Bと21％の同一性を共有する。
概ね全てのシステインが双方のタンパク質において保存され、それらについては
太字で示している。概ね401番目から430番目までのヌクレオチドのSEQ ID NO:4
の断片は、例えば、SEQ ID NO:4と関連する配列とを区別するためや、SEQ ID NO
:4を同定するためのハイブリダイゼーション及び増幅技術において有用である。
そのコードされたポリペプチドは、例えば免疫原性ペプチドとして有用である。
ノーザン分析は、皮膚又は生殖組織から得られた4つのcDNAライブラリにおける
この配列の発現を示ている。詳細には、第１のライブラリは炎症性疾患、結節性
紅斑を患う皮膚組織から得られたものであり、第２のライブラリは乳癌組織から
得られたものである。

【００８２】 また、本発明はLMPROの変異体を含む。好適なLMPRO変異体は、LMPROアミノ酸
配列に対して少なくとも約80%以上、或いは少なくとも約90%以上、更には少なく
とも約95%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またLMPROの機能的若しくは構造
的特徴の少なくとも1つを含む。

【００８３】 更に、本発明はLMPROをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の実施
例において、本発明はLMPROをコードするSEQ ID NO:3-4からなる群より選択され
た配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。

【００８４】 更に、本発明はLMPROをコードするポリヌクレオチドの変異配列を含む。特に
、そのようなポリヌクレオチドの変異配列は、LMPROをコードするポリヌクレオ
チド配列に対して少なくとも約70%以上、或いは少なくとも約85%以上、更には少
なくとも約95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。本発明の特定の
態様には、SEQ ID NO:3-4からなる群より選択された配列を含むポリヌクレオチ
ド配列の変異配列が含まれ、それはSEQ ID NO:3-4からなる群より選択された核
酸配列に対して少なくとも約70%以上、或いは少なくとも約85%以上、更には少な
くとも約95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。上記のポリヌクレ
オチドの変異配列は何れもLMPROの機能的又は構造的特徴の少なくとも1つを含む
アミノ酸配列をコードすることが可能である。

【００８５】 遺伝暗号の縮重の結果、既知の遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオチ
ド配列に対する最小の類似性を有する幾つかのものを含め、多数のLMPROをコー
ドするポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであ
ろう。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出
され得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組
合せは自然発生のLMPROのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリ
プレット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異は
ここに明確に開示されると考えられたい。

【００８６】 LMPROをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された
厳密性の条件下に於いて、自然発生のLMPROのヌクレオチド配列に対してハイブ
リダイズ可能であることが好ましいが、それは非自然発生のコドンを含める等の
実質的に異なるコドンの用法を有するLMPRO又はその誘導体をコードするヌクレ
オチド配列を作り出すのに有利である。特定のコドンが宿主により利用される頻
度に従い、真核生物又は原核生物の宿主に於いてペプチドの発現が起こる割合を
高めるようにコドンを選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化
させることなしにLMPRO及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的
に変更する別の理由は、自然発生の配列から作り出された転写物よりも長い半減
期のようなより望ましい特性を有するRNA転写物を作り出すためである。

【００８７】 また本発明は、LMPRO及びLMPROの誘導体をコードするDNA配列、又はその断片
を専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者に
よって周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿
入することが可能である。更に、合成化学を利用してLMPROをコードする配列又
はそれらの任意のフラグメントに突然変異を導入し得る。

【００８８】 また本発明に包含されるものには、種々の厳密な条件の下で、請求項に記載さ
れたポリヌクレオチド配列、また特にSEQ ID NO:3-4並びにそれらの断片に対し
てハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Wahl, G.M.
及びS.L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399-407；Kimmel, A.R.(1987) M
ethods Enzymol. 152:507-511参照）。ハイブリダイゼーション条件には、「定義」 に記載したアニーリング及び洗浄条件が含まれる。

【００８９】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、本発明の任意の実施例においても
利用され得る。その方法は、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、SEQUEN
ASE（US Biochemical, Cleveland,OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、耐
熱性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）、或いは
ELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）に於いて発見
されたようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼの組合
せのような酵素を使用する。配列の準備は、MICROLAB 2200 liquid transfer sy
stem（Hamilton, Reno NV）、PTC200 thermal cycler（MJ Research,Watertown
MA）及びABI CATALYST 800 thermal cycler（Perkin-Elmer）のような装置によ
って自動化することが好ましい。次に、ABI 373若しくは377 DNAシークエンシン
グシステム（Perkin-Elmer）、MEGABACE 1000 DNA sequencing system（Molecul
ar Dynamics, Sunnyvale CA）又は他の周知の装置を用いてシークエンシングを
行う。結果として得られた配列を当業者に周知の種々のアルゴリズムを用いて分
析する（例えば、Ausubei, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biolog y , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecul ar Biology and Biotechnology , Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853を参照
）。

【００９０】 LMPROをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術
に於いて周知の種々のPCR法をベースとした方法で伸長し、プロモータ及び調節
エレメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、用いられる方
法の1つである制限部位PCR法は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを
用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば
、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照）。逆PCR法を用い
る別の方法では、多岐に伸長して環状化鋳型から未知の配列を増幅するプライマ
ーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限
酵素断片に由来する。（Triglia, T.ら（1988）Nucleic Acids Res. 16:8186）
。第3の方法として、キャプチャーPCR法(capture PCR)には、ヒト及び酵母菌の
人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅が含まれる（例えば、L
agerstrom, M.ら（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法で
は、多数の制限酵素の消化及びライゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の
配列の領域に組換え2本鎖配列を挿入することができる。また、未知の配列を回
収するのに用いられ得る他の方法が当業者に周知である（例えば、Parker, J.D.
ら (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-306を参照）。更に、PCR法、ネスト化
プライマー、PROMOTERFINDERライブラリ（Clonetech, Palo Alto, CA）を用いて
、ゲノムDNA内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニング
する必要がなく、イントロン／エキソン移行部の発見に有用である。全てのPCR
法をベースとした方法については、プライマーは、OLIGO^TM 4.06 Primer Analys
is software（National Biosciences Inc., Plymouth, MN）のような市販のソフ
トウェア又は別の適切なプログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチド、GC含
有率が約50%以上、また約68℃〜72℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよ
う設計され得る。

【００９１】 完全長cDNAをスクリーニングするとき、大きなcDNAを含むようにサイズ選択さ
れたライブラリを用いることが好ましい。また、遺伝子の5’領域を配列を含む
ことが多いランダムプライムド(random-primed)ライブラリは、oligo d(T)ライ
ブラリで完全な長さのcDNAを得られない場合に好適である。またゲノムライブラ
リは、5’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。

【００９２】 配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析又は確認のために、市
販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラリ
ーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、4つの異なる
ヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、及び放射された波長
の検出を行うCCDカメラを使用し得る。出力／光強度は適切なソフトウエア（例
えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGATOR (Perkin Elmer)）を用いて電気信号に
変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子データ表示ま
での全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法は、特定のサ
ンプル内に限られた量だけしか存在しないこともあるDNAの小片の配列決定に特
に好適である。

【００９３】 本発明の別の実施例では、LMPROをコードするポリヌクレオチド配列又はその
断片を組換えDNA分子に用いて、LMPRO、その断片又はその機能的等価物の適切な
宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によっ
て、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列
が作り出され、LMPROの発現のために用いることができる。

【００９４】 限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改
変すること等の種々の理由により、LMPROをコードする配列を改変するために、
本発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ラン
ダムな断片化によるDNA混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再
構成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、オリゴヌクレオチド媒
介の部位特異的変異誘発により、新しい制限部位を生成する突然変異の挿入、グ
リコシル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライシングバリアントの生
成等が可能である。

【００９５】 本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法を用いて、LMPROをコー
ドする配列の全体、或いはその一部を合成することができる（例えば、Caruther
s.M.H.ら(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn,T.ら(1980)Nucl.Acids
Res.Symp.Ser.225-232参照）。或いは、化学的手法を用いて、LMPROそのもの又
はその断片を合成することができる。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド
合成を行うことができる（例えば、Roberge, J.Y.ら(1995) Science 269:202-20
4参照）。また、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて合成
の自動化を行なうことができる。更に、LMPROのアミノ酸配列若しくはその任意
の部分を、直接の合成において改変することにより、並びに／又は他のタンパク
質若しくはその任意の部分に由来する配列と結合させることにより、変異体ポリ
ペプチドを生成可能である。

【００９６】 そのペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製する
ことができる（例えば、Chiez, R.M.及びRegnier. F.Z. (1990) Methods Enzymo
l. 182:392-421参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配列
決定法により確認することができる（Creighton,T.(1983) Proteins. Structure s avd Molecular Properties ,WH Freeman, New York NY）。

【００９７】 生物学的に活性なLMPROを発現させるために、LMPROをコードするヌクレオチド
配列又はその誘導体を、適切な発現ベクター（即ち、適切な宿主に挿入されたコ
ーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入する
。これらのエレメントには、ベクター及びLMPROをコードするポリヌクレオチド
配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、5’及び3’
の非翻訳領域等の調節配列が含まれる。このようなエレメントの長さ及び特異性
は変化し得る。特定の開始シグナルを利用して、LMPROをコードする配列のより
効果的な翻訳を行なうことが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コ
ドンや例えばコザック配列等の隣接する配列が含まれる。LMPROをコードする配
列、その開始コドン、及び上流の調節配列が、適切な発現ベクターに挿入された
場合は、付加的な転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは不用となり得る。しか
しながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、読み枠の
中のATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターよって与え
られなければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合
成の種々のものからなり得る。用いられる特定の宿主細胞株に適当なエンハンサ
ーを含むことにより、発現の効率を高めることが可能である（例えば、Scharf,
D. ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162を参照）。

【００９８】 LMPROをコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクター
を作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v itro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換え技術が含まれる（例え
ば、Sambrook, J.ら(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Press, Plainview, NY, ch.4,8,及び16-17；Ausubel,F.M.ら(1995) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York, NY,
ch.9,13及び16を参照）。

【００９９】 LMPROをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿
主系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオフ
ァージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のよう
な微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクタ
ー（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクタ
ー（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）又はタバコモザイクウイル
ス（TMV））或いは細菌の発現ベクター（例えば、Ti又はpBR322プラスミド）で
形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用され
る宿主細胞によって限定されるものではない。

【０１００】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、LMPROをコー
ドするポリヌクレオチド配列の使用の目的に応じて選択できる。例えば、LMPRO
をコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング
、及び増殖は、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）又はpSportl plasmid
（Life Technologies）等の多機能性E.coliベクターを用いて実施することが可
能である。ベクターの多数のクローニング部位へのLMPROをコードする配列のラ
イゲーションによりlacZ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細
菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクター
は、クローニングされた配列のin vitroでの転写、ジデオキシークエンシング、
ヘルパーファージによる1本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成に有用である（
例えば、Van Heeke. G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-55
09を参照）。例えば、抗体産生の目的等に多量のLMPROが必要な場合、ハイレベ
ルなLMPROの発現をもたらすベクターが用いられ得る。例えば、強力な誘発性のT
5又はT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが用いられ得る。

【０１０１】 LMPROの生成に酵母の発現系を利用できる。酵母菌Saccharomyces cerevisiae
又はPichia pastorisにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、及びPGHなど
の構成型又は誘導型のプロモーターを含む多種のベクターを使用可能である。更
に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌若しくは細胞内保持の何
れかを導き、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来性の配列を組込みを可
能とする（例えば、上記のAusubel, 前出; 及び Grantら(1987) Methods Enzymo
l.153:516-54；Scorer, C.A.ら(1994) Bio/Technology 12:181-184を参照）。

【０１０２】 植物系もLMPROの発現に使用できる。LMPROをコードする配列の転写は、ウイル
ス性のプロモータ（例えば、CaMVの35S及び19Sプロモーター単独、又はTMV由来
のオメガリーダー配列との組合わせ）で促進され得る（Takamatsu, N.ら(1987)
EMBO J. 6:307-311）。これらの作製物は、直接のDNA形質転換又は病原体媒介の
形質移入によって、植物細胞中に導入可能である。（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York; pp.191-1
96を参照）。

【０１０３】 哺乳動物の細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用することが
できる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、LMPROをコード
する配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス
転写／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域
における挿入により、宿主細胞においてLMPROを発現する感染性のウイルスが得
られる（例えば、Logan, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:36
55-3659を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような転
写エンハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いることが
できる。また、タンパク質の高レベルの発現のために、SV40又はEBVをベースと
したベクターを用いることができる。

【０１０４】 また、ヒト人工染色体（HAC）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現
され得るものに比べてより大きなDNAの断片を供給することもできる。治療を目
的とし、6kb〜10MbのHACを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカ
チオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる（例えば、
Harrington, J. J.ら(1997) Nat Genet. 15:345-355）。

【０１０５】 哺乳類系の組換え型タンパク質の産生を長期間にわたり確保するためには、細
胞株におけるLMPROの安定した発現が好ましい。例えば、発現ベクターを用いてL
MPROをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能であり、その発現ベク
ターには、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性の発現エレメント並びに同
一或いは個別のベクターの上の選択マーカー遺伝子が含まれる。ベクターの導入
の後、選択培地に切り替える前に濃縮培地内で細胞を1〜2日間増殖させる。選択
可能なマーカーの目的は、選択的な媒介物に対して耐性を与えることであり、ま
たその存在によって導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能
とすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の
型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。

【０１０６】 形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナー
ゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれは
、tk⁻及びapr⁻細胞において用いられる（例えば、Wigler,M.ら(1977)Cell 11:
223-32；Lowy,I.ら(1980)Cell 22:817-23参照）。また代謝拮抗剤、抗生剤或い
は除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばdhfrはメトト
レキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドネオマイシン及びG-418
に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、ホス
フィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransfera
se)に対する耐性を与える（例えば、Wigler, M.ら(1980) Proc. Natl. Acad. Sc
i. 77:3567-70；Colberre-Garapin, F. ら(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参
照）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、代謝産物に対する細胞の必要性
を変更するtrpB及びhisDが文献に記載されている（例えば、Hartman, S.C.及びR
.C. Mulligan(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051参照）。例えば、ア
ントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP; Clontech）、β-グルクロニダーゼ及
びその基質β-グルクロニド、又はルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等
の可視マーカーを利用できる。これらのマーカーは形質転換体を同定するだけで
なく、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定
量するために広く用いられる（例えば、Rhodes, C.A.ら(1995)Methods Mol. Bio
l.55:121-131参照）。

【０１０７】 マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される
が、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばLMPROを
コードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、LMPROをコードする
配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことによ
り同定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、LMPROをコードす
る配列とマーカー遺伝子を直列に配置することができる。選択又は誘導に応じた
標識遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。

【０１０８】 一般に、当業者に周知の様々な方法により、LMPROをコードする核酸配列を含
みLMPROを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定し
ないが、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション、PCR増幅、並びに核
酸とタンパク質配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液
、若しくはチップを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれ
る。

【０１０９】 特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体のいずれかを用いる
LMPROの発現を検出・測定するための免疫学的手法は、当業者に周知のものであ
る。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ELISA）、ラジオイムノア
ッセイ（RIAs）及び蛍光細胞分析分離（FACS）が含まれる。LMPRO上において2つ
の非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位のモ
ノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoass
ay）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これらアッセイ及び他のア
ッセイは、当業者によって開示されている（例えば、Hampton, R.ら(1990);Sero logical Methods, a Laboratory Manual , APS Press,St Paul,MN Section IV；C
oligan, J. E.ら(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Assoc
iates and Wiley-lnterscience, New York, NY; 及びPound, J.D.(1998) Immuno chemical Protocols , Humana Press, Totowa NJを参照）。

【０１１０】 多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びア
ミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。LMPROをコードするポリヌクレ
オチドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプ
ローブやPCRプローブを作製するための手段には、オリゴ標識(oligolabeling)、
ニックトランスレーション法、末端標識(end-labeling)、或いは標識ヌクレオチ
ドを用いるPCR増幅などが含まれる。或いは、LMPROをコードする配列、又はその
任意の断片を、mRNAプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。その
ようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例えば
T7、T3或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加
えることによってin vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの方
法は、種々の市販のキット（Amersham Pharmacia Biotech、Promega (Madison W
I)、及びUS Biochemical提供）を用いて実施することができる。検出を容易にす
るために用いる適切なレポーター分子、即ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光
剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質、コファクター、インヒビター、磁性
粒子等が含まれる。

【０１１１】 細胞培養からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下において、LMPROを
コードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる
。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／又
はベクターに応じて分泌されるか、又は細胞内に保持され得る。当業者に理解さ
れるように、LMPROをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核
生物か真核生物の細胞膜を通してLMPRO分泌を指向するシグナル配列を含むよう
に設計することができる。

【０１１２】 更に、宿主細胞株は、挿入した配列の発現の調節能力又は発現したタンパク質
を所望の形にプロセシングする能力によって選択される。このようなポリペプチ
ドの修飾には、以下に限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、
グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)、及びアシル化が含まれる。タン
パク質の「prepro」形を切断する翻訳後プロセシングを用いて、タンパク質の標
的、折り畳み及び／又は活性を特定することができる。翻訳後の活性のための特
定の特徴的な機構及び細胞装置を有する種々の宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、M
DCK、MEK293、及びWI38）は、American Type Culture Collection（ATCC, Mana
ssas, VA）より入手可能であり、外来性のタンパク質の正しい修飾及びプロセシ
ングを確実にするために選択され得る。

【０１１３】 本発明の別の実施例では、LMPROをコードする天然の核酸、改変された核酸、
又は組換えの核酸配列を、前述の任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異
種配列に結合させ得る。例えば、市販の抗体によって識別できる異種部分を含む
キメラLMPROタンパク質が、LMPROの活性のインヒビターに対するペプチドライブ
ラリのスクリーニングを促進し得る。また、市販の親和性の基質を用いて、異種
タンパク質及びペプチド部分が、融合タンパク質の精製を促進し得る。このよう
な部分には、以下に限定されるものではないが、グルタチオンSトランスフェラ
ーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カ
ルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）
が含まれる。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、固定されたグルタチオ
ン、マルトース、フェニルアルシン酸化物、カルモジュリン、及び金属キレート
樹脂の各々で同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG、c-mc、及び赤血
球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的に識別する市販のモ
ノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和
性の精製が可能である。また、LMPROをコードする配列と異種タンパク質配列と
の間に位置するタンパク質切断部位を融合タンパク質が含むように、融合タンパ
ク質が操作されて、精製の後にLMPROが異種部分から切断され得る。融合タンパ
ク質の発現及び精製方法については、Ausubelの文献（1995, 前出, ch 10）に記
載されている。また、融合タンパク質の発現及び精製の促進のために、種々の市
販のキットを用いることができる。

【０１１４】 本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液又はコムギ胚芽
抽出系（Promega）を用いてin vitroで放射能標識したLMPROの合成を行なうこと
ができる。これらの系は、T7、T3、又はSP6プロモーターと機能的に結合したタ
ンパク質をコードする配列の転写と翻訳を結びつける。転写は放射能標識された
アミノ酸前駆体（好ましくは³⁵S-メチオニン）の存在の下で起こる。

【０１１５】 組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、
LMPROの断片を作り出すことができる（例えば、Creighton, 前出 pp.55-60を参
照）。タンパク質合成は手作業又は自動で行なうことができる。自動化された合
成は、例えば、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うこ
とができる。LMPROの種々の断片を個別に合成して、次に結合させて完全長分子
を作り出すことも可能である。

【０１１６】 治療 リンパ球膜タンパク質とLMPROの領域との間には、例えば、配列及びモチーフ
の文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、LMPROの発現は、癌
及び炎症と密接な関係を有する。従って、LMPROは、癌、免疫系異常及び感染症
において一定の役割を果たしていると考えられる。LMPROの発現若しくは活性の
増大に関連する疾患の治療においては、LMPROの発現若しくは活性を低下させる
ことが望ましい。LMPROの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療におい
ては、LMPROの発現若しくは活性を増大させることが望ましい。

【０１１７】 従って、一実施例においては、LMPROの発現若しくは活性の低下に関連する疾
患の治療又は予防のためにLMPRO又はその断片若しくは誘導体を患者に投与する
ことができる。そのような疾患の例には、以下に限定しないが、腺癌、黒色腫、
肉腫及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、
神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、
前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺及び子宮等の癌；並びに炎症、日光性
角化症、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群
、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテロー
ム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液
包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、
糖尿病、肺気腫、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパス
チャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝
炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症
、混合型結合織病（MCTD）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、
骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、
ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナ
フィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血
小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群や、癌、血液透析及び体外循環の
合併症や、外傷や、リンパ腫、白血病及び骨髄腫を含めた造血性の癌等の免疫系
異常；並びにアデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、カリチウイル
ス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、
フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、
パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レ
トロウイルス、ラブドウイルス及びトガウイルスに分類されるウイルス病原体に
よる感染や、肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、コリネバクテリウム、ク
ロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘ
モフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサ
ルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス、ビブリオ属、ブルセラ
、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、norcardium、アクチノミセス、ミコ
バクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジア及びマイコプラズマに
分類される細菌病原体による感染や、コウジカビ、ブラストマイセス、皮膚糸状
菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、malasezzia、ヒストプラスマ及び真
菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類される真菌病原体による感染や、プ
ラスモディウム又はマラリアを引き起こす体内寄生性アメーバ、レーシュマニア
、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジアルジア
属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回虫属など
の腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動物並びに住血吸虫及び条虫（サナ
ダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫による感染等の感染症が含まれる。

【０１１８】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むLMPROの発現若しく
は活性の低下に関連する疾患の治療又は予防のために、LMPRO又はその断片若し
くは誘導体を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。

【０１１９】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むLMPROの発現若
しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防のために、適切な医薬用担体と
共に精製されたLMPROを含む医薬品組成物を患者に投与してもよい。

【０１２０】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むLMPROの発現若
しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防のために、LMPROの活性を調節
するアゴニストを患者に投与してもよい。

【０１２１】 更に別の実施例においては、LMPROの発現若しくは活性の増大に関連する疾患
の治療又は予防のために、LMPROのアンタゴニストを患者に投与してもよい。そ
のような疾患の例には、以下に限定はしないが、上述の癌、免疫系異常及び感染
症が含まれる。一実施態様では、LMPROと特異的に結合する抗体をアンタゴニス
トとして直接用いるか、或いはLMPROを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす送
達機構又はターゲティングとして間接的に用いることができる。

【０１２２】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むLMPROの発現若しく
は活性の増大に関連する疾患の治療又は予防のために、LMPROをコードするポリ
ヌクレオチドの相補配列を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。

【０１２３】 他の実施例においては、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的配列又はベクターの何れかを、他の適切な治療薬と組合せて投与す
ることもできる。当業者は従来の製薬の原理に基づいて併用療法で使用するため
の適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与えるように相乗剤的に機能し得
る。この方法を用いることにより、より少ない各薬剤の投与量で治療効果を上げ
ることができ、従って副作用の可能性を低下させることができる。 LMPROのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができ
る。詳細には、精製されたLMPROを用いて抗体を作り出したり、或いはLMPROに特
異的に結合するものを同定するために、薬剤のライブラリをスクリーニングする
ことができる。LMPROの抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生するこ
とができる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現
ライブラリにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体形
成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。

【０１２４】 抗体を産生するために、LMPROか、免疫学的特性を有するその任意の断片或い
はそのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス
、ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。ラット及びマウスは、モ
ノクロナール抗体生成を含むダウンストリーム適用のための宿主として好ましい
。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増強するために種々のアジュバントを用い
ることができる。そのようなアジュバントには、以下に限定しないが、フロイン
トのアジュバント、アルミニウムの水酸化物ようなミネラルゲル、リゾレシチン
のような界面活性剤、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオ
ン、ペプチド、オイルエマルジョン、KLH及びジニトロフェノールが含まれる。
ヒトで使用するアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びCor ynebacterium parvum が特に好ましい。

【０１２５】 LMPROの抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド又はその
断片は、少なくとも5個のアミノ酸、また一般的には少なくとも10個のアミノ酸
からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプチド、ペプチド、又は
断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で、小形の自然発生の分
子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。LMPROアミノ酸の短い伸展部
が、KLHのような別のタンパク質の伸展部と融合し、キメラ分子の抗体が産生さ
れ得る。

【０１２６】 LMPROのモノクローナル抗体は、培養における持続的な細胞株によって抗体分
子を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限
定しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハ
イブリドーマ技術が含まれる（例えば、Kohler, G.ら(1975) Nature 256:495-49
7；Kozbor, D. ら(1985) Immunol. Methods 81 :31-42；Cote, R.J. ら(1983) P
roc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Cole, S.P. ら(1984) Mol. Cell Biol.
62:109-120参照）。

【０１２７】 更に、適切な抗原特異性及び生物活性を備えた分子を得るために、ヒト抗体遺
伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングする技術のような「キメラ抗体」の
産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Morrison,S.L.ら(
1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855;Neuberger, M.S. ら(1984)Nature
312:604-608;Takeda, S. ら(1985)Nature 314:452-454参照）。或いは、当業者
に周知の方法を用いて単鎖の抗体の生成のための技術を適用して、LMPROに特異
的な単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するがイディオタイ
プ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから
の鎖混合(chain shuffling)によって産生することができる（例えば、Burton D.
R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10134-10137参照）。

【０１２８】 抗体は、免疫グロブリンライブラリ又は高度に特異的な結合試薬のパネルをス
クリーニングすることにより、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘導す
ることにより産生することができる（例えば、Orlandi,R.ら(1989), Proc. Natl
. Acad. Sci. 86:3833-3837；Winter, G.ら(1991) Nature 349:293-299参照）。

【０１２９】 またLMPROに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すこと
ができる。例えばこのような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプ
シン消化により生成することができるF(ab')₂フラグメントや、F(ab')₂フラグメ
ントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメ
ントが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメン
トを迅速かつ容易に同定可能なように、Fab発現ライブラリを構成し得る（例え
ば、Huse,W.D.ら(1989) Science 246:1275-1281参照）。

【０１３０】 種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体
又はポリクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射線
測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイムノアッ
セイには、一般にLMPROとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が含ま
れる。2つの非干渉LMPROエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用い
る2部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ(two sites monoclonal b
ased immunoassay)が通常は用いられるが、競合的結合アッセイも用いられ得る
（Pound, 前出）。

【０１３１】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析等の種々の方法を用いて、LMP
RO抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態
におけるOP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったもの
として定義される。多数のLMPROエピトープに対して親和性が不均一なポリクロ
ナール抗体試薬に対して測定されたKaは、LMPRO抗体の平均親和性又は結合活性
を表す。特定のLMPROエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬に対し
て測定されたKaは、親和性の真の測定値を表す。Kaの値が10⁹〜10¹²L/molの高い
親和性の抗体試薬は、LMPRO抗体複合体が厳密な操作に耐えなければならないイ
ムノアッセイに用いるのが好ましい。Kaの値が10⁶〜10⁷L/molの低い親和性の抗
体試薬は、最終的にLMPROが活性化状態で抗体から解離する必要がある免疫精製(
immunopurification)及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Catty, D. (1988
) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC;
Liddell, J. E.及びCryer, A. (1991) A Practical Guide to Monocional Anti bodies , John Wiley & Sons, New York NY）。

【０１３２】 ポリクロナール抗体試薬のタイター及び結合活性を更に評価して、ある一定の
ダウンストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適合性を判定する。例
えば、少なくとも1〜2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的な
抗体を含むポリクロナール抗体試薬が、LMPRO抗体複合体の沈殿を必要とする方
法に通常は使用される。種々の適用における抗体の特異性、タイター、及び結合
活性に対する処理、並びに抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である
（例えば、Catty, 前出、及びColiganら, 前出を参照）。

【０１３３】 本発明の別の実施例では、LMPROをコードするポリヌクレオチド、又はその任
意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、mR
NAの転写を阻害することが望ましい状況において、LMPROをコードするポリヌク
レオチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、LMPROをコードす
るポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って
、LMPROの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分
子又は断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又
はアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片を、LMPROをコード
する配列のコード領域や調節領域に従って様々な位置から設計可能である。

【０１３４】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニアウイルスに由来す
る、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、組
織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に周
知の方法を用いて、LMPROをコードするポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を
発現するためのベクターを産生することができる（例えば、Sambrook, 前出、及
びAusubel, 1995, 前出 参照）。

【０１３５】 LMPROをコードするポリヌクレオチド又はその断片を高レベルで発現する発現
ベクターで細胞又は組織を形質転換させることによって、LMPROをコードする遺
伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或い
はアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。DNAへ組み込
みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアー
ゼにより無能となるまで、RNA分子を転写し続け得る。一過性の発現は、非複製
ベクターでも1ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合
にはさらに長い期間持続し得る。

【０１３６】 前述のように、LMPROをコードする遺伝子の制御、5’、又は調節領域に対する
相補配列、つまりアンチセンス分子（DNA、RNA又はPNA）を設計することによっ
て、遺伝子発現を変更することができる。転写開始点（例えば、開始部位から+1
0〜-10の位置）に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、三重らせん
体の塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラーゼ、
転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける能力
を阻害するので、三重らせん対合は有用である（例えば、Gee, J.E.ら(1994)In:
Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura
Publishing Co.,Mt.Kisco,NY,pp.163-177参照）。転写物のリボソームへの結合
を阻止することによりmRNAの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチセ
ンス分子を設計し得る。

【０１３７】 リボザイム、つまり酵素RNA分子を用いてRNAの特異的切断を触媒することがで
きる。リボザイム作用機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列の特異
的ハイブリダイゼーションに関与し、その後のヌクレオチド鎖切断が行なわれる
。例えば、操作されたハンマーヘッド・モチーフ・リボザイム分子は、LMPROを
コードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。

【０１３８】 任意の潜在的なRNA標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続す
る配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査す
ることによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、そのオリゴヌ
クレオチドを動作不能(inoperable)とする2次の構造的特徴について評価するこ
とができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(ribon
uclease protection assay)を用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションに対する接触性(accessibility)の検査により評価することがで
きる。

【０１３９】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための
当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含
まれる。或いは、RNA分子は、LMPROをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo の転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6のよう
な適切なRNAポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことが
できる。或いは、構成的又は誘導的に相補的なRNAを合成するこれらのcDNA作製
物は、株化細胞、細胞又は組織内に導入することができる。

【０１４０】 細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、RNA分子は修飾するこ
とができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の5′末端及
び／又は3’末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけ
るホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは2′O-メチルを
使用を含む。この概念はPNA生成において固有のものであり、内在性エンドヌク
レアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及
びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく
、イノシン、クエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)のような従
来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子に拡張可
能である。

【０１４１】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様
にin vivo、in vitro、及びex vivoでの使用にも適している。ex vivoでの治療
法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ
患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクショ
ンによるデリバリー、或いはリポソーム注入又はポリカチオンアミノポリマーに
よるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することができ
る（例えば、Goldman, C.K.ら(1997) Nature Biotechnology 15:462-466参照）
。

【０１４２】 前述の治療法は何れも、例えばヒト、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ及び
サル等の哺乳類を含む、治療が必要な任意の対象に適用することができる。

【０１４３】 本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤
上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、LMPRO、LMPRO
の抗体、LMPROの模倣体、アゴニスト、アンタゴニスト又はインヒビターからな
るものであり得る。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような1以上
の他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、その担
体には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖或いは
水が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホルモン
と結合した形で患者に投与されうる。

【０１４４】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経
口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、
脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的
投与、舌下投与又は直腸投与が含まれ得る。

【０１４５】 有効成分に加えて、これらの医薬成分は、有効成分を医薬上使用できる製剤に
するための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認め
られる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Remingto ns Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton, PA）の最新版に
記載されている。

【０１４６】 経口投与のための医薬品組成物は、当技術分野でよく知られる医薬上認められ
る担体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により
、医薬品組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に調剤できる。

【０１４７】 経口投与用の医薬製剤は、有効成分と固形の賦形剤とを配合して、（所望によ
り、粉砕した後に）得られた顆粒の混合物を処理して錠剤或いは糖衣剤コア(dra
gee core)を作ることによって得られる。必要ならば、適切な添加物が加えるこ
とができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは
ソルビトールを含む砂糖のような糖質又はタンパク質賦形剤や、トウモロコシ、
コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプンや、メチルセルロース、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのよ
うなセルロースや、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴムや、並び
にゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、架橋
したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムのよ
うなその塩のような崩壊剤又は可溶化剤を加えてもよい。

【０１４８】 糖衣錠コアは、濃縮糖液のような適切な剤皮と共に用いられるが、それらには
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤(carbopol ge
l)、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適
切な有機溶剤或いは溶剤の混合物等が含まれる。錠剤の識別のため、或いは有効
成分の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣
錠皮に加えることができる。

【０１４９】 経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプ
セル、ゼラチンからなる軟性のシールされたカプセル及びグリセロール或いはソ
ルビトールのような錠皮が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース
或いはデンプンのような賦形剤又は結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシ
ウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された有効成分を含みうる。
軟性カプセルにおいて、有効成分は、安定剤とともに或いは安定剤なしに、脂肪
性の油、液体又は液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは
懸濁される。

【０１５０】 非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好適にはハンク溶液、リンゲル
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中で配合す
ることができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウ
ム、ソルビトール又はデキストランのような懸濁液の粘性を高める物質を含みう
る。更に、有効成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい。
適切な親油性の溶媒或いは賦形剤には、胡麻油のような脂肪性の油や、オレイン
酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルが含ま
れる。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。所
望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可能
にする適切な安定剤又は薬剤を含んでもよい。

【０１５１】 局所又は経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合に
用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。

【０１５２】 本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理(levigating)、乳化処理、カプセル化処理、
エントラップ処理(entrapping)或いは凍結乾燥処理により製造される。 この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに
形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊
離塩基形態よりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースでは、好適な製剤と
しては、使用前に緩衝剤配合したpH4.5〜5.5の範囲にある1mM〜50mMのヒスチジ
ン、0.1%〜2%のショ糖、2%〜7%のマンニトールの何れか、或いは全てを含む凍結
乾燥粉末でもよい。

【０１５３】 医薬組成物は調製された後に適切な容器内に入れられて、指示された状態の治
療のためにラベル付けできる。LMPROの投与の場合では、このようなラベルには
、投与量、投与頻度、投与方法が表示される。

【０１５４】 本発明において使用するのに適する医薬品組成物は、所望の目的を達成するた
めに有効成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者
の能力の範囲内で十分行うことができる。

【０１５５】 任意の化合物の場合、治療に有効な量は、最初は例えばマウス、ウサギ、イヌ
、ブタのような動物モデル又は腫瘍性細胞の何れかの細胞培養のアッセイにおい
て見積もることができる。また、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために
動物モデルを用いることができる。次にこのような情報を利用して、ヒトにおけ
る投与量や投与経路を決定することができる。

【０１５６】 治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるLMPRO又はその断片
、LMPROの抗体、LMPROのアゴニスト、LMPROのアンタゴニスト、又はLMPROのイン
ヒビターの有効成分の量を指す。治療的な効力及び毒性は、細胞培養或いは実験
動物における標準的な製薬方法により、例えばED₅₀(母集団の50%における治療的
な有効投与量)又はLD₅₀(母集団の50%の致死投与量)統計量を計算することによっ
て決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、LD ₅₀ / ED₅₀比として表すことができる。医薬品組成物は大きな治療指数を示すこ
とが好ましい。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの
使用のための投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分
の投与量は、毒性が少ないか或いは全く毒性がなく、ED₅₀を含む循環する濃度の
範囲内にあることが好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応
じて、投与量はこの範囲内で変化する。

【０１５７】 正確な用量は、治療が必要な患者に関連する要因を考慮して医師が決定する。
投与及び投薬量は、十分なレベルの有効成分を与える、即ち所定の効果を維持す
るために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、全般的な患
者の健康、年齢、体重、性別や、食餌、投与の時間及び頻度や、併用する薬剤、
反応感受性、及び治療への反応が含まれる。長時間作用性の医薬品組成物は、半
減期及び特定の製剤のクリアランス率に応じて3〜4日毎に、1週間毎に、或いは2
週間に1度投与してもよい。

【０１５８】 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲であり、最大約1gの総投与量まで、投
与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献に
おいて提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオ
チドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用する
ことができる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細
胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。

【０１５９】 診断 別の実施例においては、LMPROに特異的に結合する抗体を、LMPROの発現によっ
て特徴づけられる疾患の診断や、LMPRO又はLMPROのアゴニスト、アンタゴニスト
若しくはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイ
に用いることができる。診断目的に対して有用な抗体は、前述の治療のためのも
のと同様の方法で作製することができる。LMPROの診断のアッセイには、ヒトの
体液、細胞或いは組織の抽出物においてLMPROを検出するために抗体及び標識を
用いる方法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、ま
た共有結合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標
識することができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、そのう
ちの幾つかについては前述の通りである。

【０１６０】 ELISA、RIA及びFACSを含む、LMPROを測定するための種々のプロトコルが当技術
分野では周知であり、またこれによりLMPRO発現の変化や異常性のレベルを診断
するための基礎が得られる。LMPROの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成
に適した条件下で、哺乳類（例えば、人間の被検者）の正常な患者から得られる
体液或いは細胞抽出物とLMPROの抗体を結合させることによって確立できる。標
準の複合体形成量は、測光手段等の種々の方法を用いて定量化できる。患者の生
検組織からの対照サンプル及び患部サンプルにおいて発現されたLMPROの量を、
標準値と比較する。標準値と患者の値との偏差によって疾病診断のためのパラメ
ータを確立する。

【０１６１】 本発明の別の実施例において、LMPROをコードするポリヌクレオチドを、診断
の目的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレ
オチド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチ
ドは、LMPROの発現が疾病と関連するであろう生検組織における遺伝子発現の検
出や定量のために用いられる。診断アッセイは、LMPROが存在、非存在、過剰発
現の何れの状態かを識別したり、治療の処置の際にLMPROレベルの調節をモニタ
リングするために用いることができる。

【０１６２】 一実施態様では、LMPRO又は密接に関連分子をコードする、ゲノム配列を含む
ポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを
用いて、LMPROをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの
特異性、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、5’調節領
域）に由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、保存された
モチーフ）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増
幅の（最大の、高い、中程度の、或いは低い）厳密性によって、そのプローブが
LMPROをコードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する
配列も同定するかが決定される。

【０１６３】 プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましく
はLMPROをコードする任意の配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有するべ
きである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNA若しくはRNAか、ま
たSEQ ID NO:3-4の配列に由来するものか、或いはLMPRO遺伝子のイントロン、エ
ンハンサー、及びプロモータを含むゲノムの配列に由来するものでもよい。

【０１６４】 LMPROをコードするDNAのための特異的なハイブリダイゼーションプローブを作
製するための手段には、mRNAプローブを作り出すためにLMPRO又はLMPRO誘導体を
コードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。
このようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、適切なRNAポリメ
ラーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、in vitroでRNA
プローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプロー
ブは種々のリポータグループにより標識され、例えば、その標識は、³²Pや³⁵Sの
ような放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに
結合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等である。

【０１６５】 LMPROをコードするポリヌクレオチド配列を、LMPROの発現に関連する疾患の診
断のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下に限定はし
ないが、腺癌、黒色腫、肉腫及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、
脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、
膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺及び子宮等の
癌；並びに炎症、日光性角化症、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不
全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動
脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲
状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピ
ー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、
糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発
作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素
性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病（MCTD）、多発性硬化症、重症筋無力
症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血
症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグ
レン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症
、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群や、癌、
血液透析及び体外循環の合併症や、外傷や、リンパ腫、白血病及び骨髄腫を含め
た造血性の癌等の免疫系異常；並びにアデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤ
ウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイル
ス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイル
ス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイ
ルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトガウイルスに分類
されるウイルス病原体による感染や、肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、
コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラ
クセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸
内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス
、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、norcardium
、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジ
ア及びマイコプラズマに分類される細菌病原体による感染や、コウジカビ、ブラ
ストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、malasezzia
、ヒストプラスマ及び真菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類される真菌
病原体による感染や、プラスモディウム又はマラリアを引き起こす体内寄生性ア
メーバ、レーシュマニア、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチ
ス‐カリニ、ジアルジア属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組
織線形動物、回虫属などの腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動物並びに
住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫による感染
等の感染症が含まれる。LMPROをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の生
検組織や体液を利用するサザンブロット法又はノーザン解析、ドットブロット法
或いは他の膜をベースとした技術や、PCR技術や、ディップスティック試験法(di
pstick)、ピン及びマルチフォーマットELISA様アッセイや、マイクロアレイにお
いて用いて、LMPRO発現の変化を検出することができる。このような定性的又は
定量的試験法は当業者に周知のものである。

【０１６６】 特定の態様では、特に上述のような関連疾患の存在を検出するアッセイにおい
て、LMPROをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。LMPROをコードする
ヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、またハイブリダイゼーション複合体
の形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることができる
。適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、シグナルを定量
して標準値と比較する。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、対照サンプル
に比べて有意に変化している場合、サンプルのなかのLMPROをコードするヌクレ
オチド配列のレベルの変化は、関連する疾患の存在を示している。また、このよ
うなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、又は個々の患者の治療のモニタリ
ングにおける特定の治療学的な処置法の有効性を評価することもできる。

【０１６７】 LMPROの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、
即ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或
いは増幅に適した条件下で、動物又はヒト何れかの正常な患者から採取された体
液或いは細胞抽出物をLMPROをコードする配列又はその断片と結合させることに
より達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な患者から得られる値
と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いる実験から得られる
値とを比較することにより定量することができる。このように正常なサンプルか
ら得られた標準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較す
ることができる。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。

【０１６８】 一旦疾患の存在が確認されて治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼ
ーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者で観
察されるレベルに近づき始めたか否かを評価できる。連続的なアッセイから得ら
れる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示すことができる。

【０１６９】 癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（不十分若しく
は過剰に発現されたもの）の存在が、疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨
床的症状が現れる前に疾病を検出するための手段となり得る。このタイプのより
決定的な診断により、健康の専門家が予防的処置を講じたり、より早期に積極的
な治療を行なうことが可能となり、故に癌の発生や更なる進行を予防することが
できる。

【０１７０】 LMPROをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの更なる診断のた
めの使用法には、PCR法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成
されるか、酵素を用いて作製されるか、或いはin vitroで作製されてもよい。オ
リゴマーは、好ましくはLMPROをコードするポリヌクレオチドの断片、又はLMPRO
をコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定
の遺伝子或いは状態を同定するための最適化された条件の下で用いられる。また
密接に関連するDNA又はRNA配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩
やかな厳密性の条件で用いることができる。

【０１７１】 またLMPRO発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチ
ン化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅(coamplification)の利用、
及び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（例えば、Melby, P.C.
ら(1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244；Duplaa, C. ら(1993) Anal. Bio
chem. 229-236参照）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが種
々の希釈溶液中に存在し、分光光度法又は比色定量応答により迅速に定量するEL
ISA形式のアッセイを実施することによって加速することができる。

【０１７２】 別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来す
るオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベ
ルをモニタし、また遺伝子の変異配列、変異及び多形性を同定することができる
。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、並び
に治療薬の開発及びその活性のモニタリングにおいて有用である。

【０１７３】 マイクロアレイが準備され、それを用いて当業者に周知の方法で分析してもよ
い（例えば、Brennan, T.M.ら(1995) U.S. Patent NO. 5,474,796; Schena, M.
ら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweilerら(1995) P
CT application WO95/251116; Shalom D.ら (1995) PCT application WO95/355
05: Heller. R.A. ら(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 並びにHel
ler. M.J.ら(1997) U.S. Patent No.5,605,662を参照）。

【０１７４】 本発明の別の実施例においては、LMPROをコードする核酸配列を用いて、自然
発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ
を作り出すことができる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の部分、又
は人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、
例えば、ヒト人工染色体（HACs）、酵母菌人工染色体（YACs）、細菌人工染色体
（BACs）、細菌性P1作製物又は一本鎖染色体cDNAライブラリがある（例えば、Ha
rrington. J.J.ら(1997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood R
ev. 7:I27-134; 並びにTrask. B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照）
。

【０１７５】 蛍光性in situハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的な染色体マッ
ピング技術や遺伝地図データと関連し得る（例えば、Heinz-Ulrichら(1995)in M
eyers, 前出, pp.965-968を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、又
はOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）World Wide Webサイトに見ら
れる。物理的な染色体地図上のLMPROをコードする配列の位置及び特定の疾病、
若しくは特定の疾病の素因との関連性が、疾患に関係するDNAの領域の範囲を定
めるのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、また
発症した個体との間の遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１７６】 遺伝地図を拡大するために、染色体作製物のin situハイブリダイゼーション
及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術
を用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知であ
っても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連するマ
ーカーが明らかになる。物理的マッピングによって、新たな配列を染色体のアー
ム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニング又
は別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値ある情報を
提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域（例えば、11q22-
23に対する毛細血管拡張性運動失調 ）への遺伝連鎖による不完全な位置ぎめが
なされると、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための
関連する遺伝子又は調節遺伝子を表し得る（例えば、Gatti, R.A.ら（1988）Nat
ure 336:577-580参照）。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者の
染色体の位置と、キャリア、又は発症した個体の、転座、逆位等によって生じた
染色体の位置との違いを検出することもできる。

【０１７７】 本発明の別の実施例においては、LMPROや、その触媒作用性又は免疫原性断片
、又はそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリのスクリーニングのために用いることができる。そのようなスク
リーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体へ
付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているもの
であり得る。LMPROと試験する薬剤との結合複合体の形成を測定することができ
る。

【０１７８】 別の薬物スクリーニング技術によって、目的のタンパク質に対する適切な結合
親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される（例えば、
Geysenら(1984) PCT出願WO84/03564参照）。この方法においては、多くの異なる
小形の試験化合物が固体基板において合成される。試験化合物をLMPRO又はその
断片と反応させ、そして洗浄する。次に、当技術分野で周知の方法で結合LMPRO
を検出する。また、前述の薬剤スクリーニング技術において使用するために、精
製されたLMPROをプレート上に直接コーティングすることもできる。或いは、非
中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉して固体支持体上に固定することができる
。

【０１７９】 別の実施例においては、LMPROの結合のためにLMPROと結合可能な中和抗体が試
験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることが
できる。この方法において、抗体を用いて、1以上の抗原決定基をLMPROと共有す
る任意のペプチドの存在を検出することができる。

【０１８０】 更に別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレット
遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含め現在周知のヌクレオチ
ド配列の特性に基づくものであれば、LMPROをコードするヌクレオチド配列を、
未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。

【０１８１】 当業者は、更なる説明がなくても前述の説明によって本発明を十分に利用でき
るであろう。従って、以下に記す特定の好適実施例は、単なる例示であって本発
明を限定するものではない。

【０１８２】 本明細書に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、並びに米国特許出願第09
/216,384号については、ここで言及することにより本明細書の一部とする。

【０１８３】

【実施例】

１ cDNAライブラリの作製 UTRSNOT08 cDNAライブラリは、35歳の白人女性の子宮内膜掻爬術を伴う膣式子
宮摘出術の際に採取された子宮組織から単離したRNAを用いて作製した。病変は
、子宮内膜が直径1cmの良性の子宮内膜ポリープを伴い分泌期にあることを示し
ていた。子宮頚は、軽度の慢性的子宮頸炎を示していた。家族歴には、アテロー
ム性冠状動脈疾患及びII型糖尿病が含まれていた。

【０１８４】 PENGNOT01 cDNAライブラリは、3歳の黒人男児の陰茎から採取された亀頭組織
から単離したRNAを用いて作製した。関連する腫瘍組織の病変は、陰茎の海綿体
に浸潤して両方の精巣を囲む軟部組織の陰嚢の腫瘤を形成する浸潤性グレード4
の尿路上皮癌を示していた。

【０１８５】 UTRSNOT08 cDNAライブラリの作製の場合、凍結組織を、POLYTRON PT-3000 hom
ogenizer（Brinkmann Instruments, Westbury NY）を用いて、グアニジニウムイ
ソチオシアネート溶液中にホモジナイズ及び溶解した。その溶解物を塩化セシウ
ム勾配遠心法で遠心分離してRNAを単離した。そのRNAを酸性フェノールで抽出し
、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈澱させ、RNアーゼを含まない水に再懸濁さ
せ、DNアーゼで処理した。RNAの抽出及び沈澱を上述のように繰返し実施した。

【０１８６】 PENGNOT01 cDNAライブラリの作製の場合、凍結組織を、POLYTRON PT-3000 hom
ogenizer（Brinkmann Instruments）を用いて、TRIZOL試薬（1g tissue/10 ml T
RIZOL; Life Technologies）、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノー
ルの単相溶液中にホモジナイズ及び溶解した。氷上で短時間インキュベートした
後、クロロホルムを加え（1:5 v/v）、その混合物を遠心分離して相分離した。
上側の水性相を新しい管に移し、イソプロパノールを加えてRNAを沈澱させた。
そのRNAをRNアーゼを含まない水に再懸濁させ、DNアーゼで処理した。そのRNAを
酸性フェノール-クロロホルムで再抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで再
沈澱させた。

【０１８７】 OLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN, Chatsworth CA）を用いて上述の双方のRN
A試料からポリ（A+）RNAを単離した。ポリ（A+）RNAは、SUPERSCRIPT plasmid s
ystem（Life Technologies）の推奨プロトコルに従ってcDNAライブラリの作製及
び合成に用いた。そのcDNAをSEPHAROSE CL4B column（Amersham Pharmacia Biot
ech）上で分画し、400bpを超えるそれらのcDNAをpINCY1（Incyte Pharmaceutica
ls, Palo Alto CA）に結合させた。組換えプラスミドをDH5aコンピテント細胞（
Life Technologies）に形質転換した。

【０１８８】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）又は細胞溶解を利用して、in vivoで
の切除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。Magic若しくはWIZARD Mini
preps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosyste
ms, Gaithersburg MD）、及びQIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus P
lasmid、QIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム又はREAL Prep 96プラスミドキ
ット（QIAGEN）のうちの少なくとも1つを用いてプラスミドを精製した。沈殿の
後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保
管した。

【０１８９】 或いは、高スループットフォーマットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解
産物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Blochem. 216:1-1
4）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で実施した。サ
ンプルを処理して384-ウエルプレートで保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度
をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）及びFluoroskan II蛍
光スキャナー（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光定量的に測定
した。

【０１９０】 ３ 配列決定及び分析 cDNAシークエンシング反応は、標準的な方法或いはABI CATALYST 800 （Perki
n-Elmer）thermal cycler若しくはPTC-200 thermal cycler（MJ Research）等の
高スループットの機器とHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）
若しくはMICROLAB 2200（Hamilton）liquid transfer systemとを共に用いて処
理した。cDNAシークエンシング反応は、Amersham Pharmacia Biotech社によって
提供された試薬か、又はABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready
reaction kit（Perkin-Elmer）のようなABIシークエンシングキットに供給され
た試薬を用いて準備した。cDNAシークエンシング反応の電気泳動的な分別及び標
識したポリヌクレオチドの検出は、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステ
ム（Molecular Dynamics）；ABI PRISM 373若しくは377シークエンシングシステ
ム（Perkin-Elmer）と標準的なABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェア
との組合せ；又は当業者に周知の他の配列分析システムを用いて実施した。cDNA
配列中の読み枠は、標準的な方法を用いて識別した（Ausubel, 1997, 前出, uni
t 7.7のレビュー）。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方
法で伸長した。

【０１９１】 周知のアルゴリズムを利用するソフトウェアプログラムを組合せて用いて、cD
NAシークエンシングから得られたポリヌクレオチド配列を構築及び分析した。表
１は、利用したツール、プログラム、及びアルゴリズムの概要、並びに適切な説
明、引用文献、及び閾値パラメータを示す。表１の第1列は用いたツール、プロ
グラム、及びアルゴリズムであり、第2列はそれらの簡単な説明であり、第3列は
引用文献（それらの全てはここで言及することにより本明細書の一部とする）で
あり、第4列は2つの配列間の一致の程度の評価に用いた適切なスコア、確率値、
及び他のパラメータである（スコアが高いほど2つの配列間の相同性が高い）。
配列は、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineering, South S
an Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析した。
ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アライメントは、整列した配列間の同一
性%を計算するMEGALIGNマルチシーケンス・アライメント・プログラム（DNASTAR
）に組込まれたclustalアルゴリズムによって指定されたデフォルトのパラメー
タを用いて作成した。

【０１９２】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST、動的計画法及びジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー及
びポリA配列を取除き、多義性の塩基対をマスクすることによって実施した。次
に、配列をBLAST、FASTA及びBLIMPSに基づくプログラムを用いてGenBankの霊長
類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物及び真核生物のデータベースや、BLOCKS、PRIN
TS、DOMO、PRODOM及びPFAM等の公共のデータベースでから選択した配列に対して
問合わせて注釈を得た。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて配
列を完全長のポリヌクレオチドに構築し、GeneMark、BLAST及びFASTAに基づいた
プログラムを用いて読み枠にスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配
列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、続いてその完全長のポ
リヌクレオチド配列をGenBankデータベース（前述）、SwissProt、BLOCKS、PRIN
TS、DOMO、PRODOM、Prosite及び隠れマルコフモデル（HMM）に基づくPFAMなどの
タンパク質ファミリーデータベースに問い合わせることによって分析した。HMM
は、遺伝子ファミリーの共通一次構造を解析する確率的アプローチである（例え
ば、Eddy, S.R. (1996) Cur. Opin. Str. Biol. 6:361-365を参照）。

【０１９３】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析のための上述
のプログラムは、SEQ ID NO:3-4からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも
使用した。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約20から約4000までのヌク
レオチドの断片については、前述の「発明」の部分で説明した。

【０１９４】 ４ ノーザン解析 ノーザン解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するRNAが結合しているメンブレンと
、標識されたヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションに関わる（例えば、
Sambrookら、前出, ch.7；並びにAusubel, F.M.ら前出, ch.4及び16参照）。

【０１９５】 BLASTを使用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（I
ncyte Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連す
る分子を検索する。この分析は、多くのメンブレンをベースとしたハイブリダイ
ゼーションに比べてより高速である。さらにコンピュータ検索の感度を変更して
、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは類似の何れとして分類されるかを決定
することができる。 検索の基準は、以下で定義される積スコア(product score
)である。 （配列一致%×最大BLASTスコア%）／100 積スコアは、2つの配列間の類似の程度及び配列一致の長さの両方を考慮に入れ
る。例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり、
積スコア70の場合は正確な一致となる。類似の分子は通常15〜40間の積スコアを
示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでは関連した
分子として同定される。

【０１９６】 ノーザン解析の結果は、LMPROをコードする転写物が発生したライブラリの割
合の分布として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるcDNAライブラ
リの分類が含まれる。器官／組織の分類には、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃
腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器が含まれる。疾病／症状の分類
には、癌、炎症／心的外傷、細胞増殖、神経及び貯留(pooled)が含まれる。各カ
テゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリを数えて、カテゴリー全体
にわたるライブラリの合計数で割った。各組織に特異的な発現ならびに疾病、疾
患若しくは症状に特異的な発現の割合を表３に示した。

【０１９７】 ５ LMPROをコードするポリヌクレオチドの伸長 SEQ ID NO:3-4の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片を伸長してこ
の断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて生成した。一方のプ
ライマーは既知の断片の5'の伸展を開始するために合成し、他方のプライマーは
既知の断片の3'の伸展を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGO 4.
06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他の適切なプログラムを用いて
、約22〜30個のヌクレオチドからなる長さであって50%以上のGC含有物を有し、
且つ約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにcDNAから設計した。
ヘアピン構造及びプライマー−プライマー2量体を生ずるようなヌクレオチドの
如何なる伸長も回避した。

【０１９８】 選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を伸長した。2段階以上の伸
長が必要であるか、又は望ましい場合には、プライマーの付加的な或いはネスト
した(nested)組を設計する。

【０１９９】 当業者に周知の方法を利用したPCR法で高い忠実度の増幅を実施した。PCRは、
PTC-200 thermal cycler（MJ Research, Inc.）用いて96ウェルプレートにおい
て行った。反応混合液には、DNA鋳型、200nmolの各プライマーと、Mg²⁺、(NH₄)₂ SO₄及びβ−メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Taq DNAポリメラーゼ（
Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Technologies）と、Pfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）とが含まれる。プライマーの組PCI A及びPCI B
に対して以下のパラメータを用いた。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 60℃で1分間 ステップ4 68℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す ステップ6 68℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 或いは、プライマーの組T7及びSK+に対して以下のパラメータを用いた。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 57℃で1分間 ステップ4 68℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す ステップ6 68℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 各ウェルのDNA濃度は、0.5μlの希釈していないPCR生成物及び1X TEに溶解し
た100μlのPICOGREEN定量試薬（0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eu
gene OR）を不透明な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各ウェ
ルに分配し、DNAが試薬と結合可能なようにして測定した。このプレートをFluor
oskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンして、サンプルの
蛍光を計測し、またDNA濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlの一定分量を1
%のアガロースミニゲル上での電気泳動法によって解析し、何れの反応物が配列
の伸長に成功したかを決定する。

【０２００】 伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮し、384ウェルプレートに移し、CviJIコ
レラウィルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）
で消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結する前に音
波処理又はせん断を実施した。ショットガン配列決定のために、消化したヌクレ
オチドを低濃度（0.6〜0.8%）のアガロースゲル上に分離し、断片を切除し、寒
天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New Eng
land Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Bio
tech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位の
オーバーハングを満たし、更にコンピテントE.coli細胞に形質移入した。形質移
入した細胞を抗生物質を含む培地において選択し、個々のコロニーを選択してLB
/2X carb培養液の384ウェルプレートに37℃で終夜培養した。

【０２０１】 細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）及びPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した
。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で１５秒 ステップ3 60℃で1分間 ステップ4 72℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す ステップ6 72℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 前述のようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）でDNAを定量化した。DNA回収
率の低いサンプルは、上記の条件で再度増幅した。サンプルを20%のジメチルス
ルホキシド(dimethysulphoxide)（1:2, v/v）で希釈し、DYENAMIC energy trans
fer sequencingプライマー並びにDYENAMIC DIRECTキット（Amersham Pharmacia
Biotech）若しくはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reac
tion kit（Perkin-Elmer）を用いて配列決定した。

【０２０２】 同様に、SEQ ID NO:3-4のヌクレオチド配列を使用し、上記手順、5’伸長用に
設計されたオリゴヌクレオチド、及び適切なゲノムライブラリを用いて5’調節
配列が得られる。

【０２０３】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:3-4から得られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA
、ゲノムDNA又はmRNAをスクリーニングする。約20の塩基対からなるオリゴヌク
レオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片にも概ね
同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェア（National
Biosciences）のような当技術分野のソフトウエアを用いて設計し、50pmolの各
オリゴマー、250μCiの[γ-³²P]アデノシン3リン酸 （Amersham Pharmacia Biot
ech）及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を結びつける
ことにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SEPHADEX G-25超微細
分子サイズ排除デキストランビーズカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用
いて実質的に精製する。毎分10⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコッ
トを、以下のエンドヌクレアーゼ、即ちAse I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1又
はPvu II（DuPont NEN）の中の1つで消化されたヒトゲノムDNAの典型的なメンブ
レンに基づくハイブリダイゼーション解析に用いる。

【０２０４】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロンメンブ
レン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイ
ゼーションは40℃で16時間かけて実施する。非特異的シグナルを除去するために
、0.1xクエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に
厳密性を増す条件下で、ブロットを室温にて順次洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー若しくは代替イメージング手段を用いて
視覚化して比較する。

【０２０５】 ７ マイクロアレイ 化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることにより、基板の
表面上でアレイエレメントを合成することができる。（例えば、Baldeschweiler
, 前出 参照）。また、ドットブロット又はスロットブロット法に類似の所定の
アレイを用いて、熱、UV、化学的若しくは機械的結合プロシージャを利用して、
基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。標準的なアレイは、手製
で或いは手近な方法及び機械を用いて製作でき、また任意の適切な数のエレメン
トを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを取
除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを判定する。マイクロアレ
イ上のエレメントとハイブリダイズする各プローブの相補性の度合及び相対的な
存在量は、スキャナーで読取られた画像を解析することにより評価する。

【０２０６】 完全長cDNA、発現された配列タグ（ESTs）、又はそれらの断片は、マイクロア
レイのエレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、当業者
に周知のLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）のようなソフトウェアを用いて選択
可能である。本発明のヌクレオチド配列の1つに対応する完全長cDNA、EST、若し
くはそれらの断片を、又は本発明に関連するcDNAライブラリから無作為に選択さ
れたものを、例えばスライドガラスのような適切な基板に配置する。そのcDNAを
、例えばUV架橋の後に熱的及び化学的に処置し、さらに乾燥することによって、
スライドガラスに固定する（例えば、Schena, M.ら (1995) Science 270:467-47
0; 並びにShalon, D.ら(1996) Genome Res. 6:639-645参照）。蛍光プローブを
作製し、基板上のエレメントとのハイブリダイゼーションに用いる。基板は前述
の方法によって解析する。

【０２０７】 ８ 相補的ポリヌクレオチド LMPROをコードする配列に相補的な配列、或いはその任意の一部を、自然発生L
MPROの発現を検出し、低下させる、即ち抑制するために用いる。約15〜30塩基対
を含むオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより
大きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法が用いられる。OLIGO 4.06
ソフトウェア及びLMPROのコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチド
を設計する。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特な5’
配列から設計してコーディング配列へのプロモーターの結合を防止するために用
いる。翻訳を抑制するために、相補的なオリゴヌクレオチドを設計してLMPROを
コードする転写物へのリボソームの結合を防ぐ。

【０２０８】 ９ LMPROの発現 LMPROの発現及び精製は、細菌又はウイルスに基づく発現系を用いて実施され
る。細菌におけるLMPROの発現の場合、抗菌性の耐性遺伝子とcDNAの転写レベル
を高める誘導性のプロモーターとを含む適切なベクターにcDNAをサブクローニン
グする。このようなプロモーターの例としては、以下に限定しないが、lacオペ
レーター調節エレメントに関連するT5又はT7バクテリオファージプロモーター及
びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが挙げられる。組換えベクターを、BL
21(DE3)などの適切な細菌性の宿主に形質転換する。抗生物質耐性菌が、イソプ
ロピルβ−Dチオガラクトピラノシド（IPTG）での誘発によりLMPROを発現する。
真核生物の細胞におけるLMPROの発現は、昆虫又は哺乳動物の細胞株に、一般に
バキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体ウイ
ルス（AcMNPV）を感染させることによって行う。バキュロウイルスの非必須ポリ
ヘドリン遺伝子を、相同的組換え又は転移プラスミド中間体を含む細菌媒介の遺
伝子転移の何れかによって、LMPROをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感
染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高レベルのcDNAの転写
が行われる。多くの場合、組換え型バキュロウイルスは、Spodoptera frugiperda （Sf9）昆虫細胞の感染に用いられるが、場合によっては、ヒト肝細胞の感染に
も用いられる。後者の感染には、バキュロウイルスに対する更なる遺伝的変更が
必要となる。（例えば、Engelhard. E. K.ら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 91:3224-3227; Sandig, V.ら(1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945を参照）。

【０２０９】 殆どの発現系において、LMPROは、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ（
GST）、又はFLAG若しくは6-His等のペプチドエピトープ標識で融合タンパク質と
して合成され、粗製の細胞溶解物からの組換え型融合タンパク質の親和性ベース
の精製を迅速に1段階で行うことができる。Schistosoma japonicumからの26キロ
ダルトンの酵素のGSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した条件の
下で固定化されたグルタチオにおける融合タンパク質の精製が可能となる（Amer
sham Pharmacia Biotech）。精製の後に、特定の操作部位においてLMPROからGST
部分をタンパク分解的に切断可能である。8個のアミノ酸のペプチドであるFLAG
により、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いて免疫親和
性の精製が可能となる（Eastman Kodak）。6個の連続したヒスチジン残基のスト
レッチである6-Hisによって、金属キレート樹脂（QIAGEN）における精製が可能
となる。タンパク質の発現及び精製の方法については、Ausubelが（1995年, 前
出, ch 10 and 16）論じている。これらの方法によって得られた精製されたLMPR
Oを、以下のアッセイで直接用いることができる。

【０２１０】 １０ LMPRO活性の実証 LMPRO活性のアッセイでは、細胞表面におけるLMPROの発現を測定する。LMPRO
をコートするcDNAを、高レベルのcDNAの発現に適した哺乳類の発現ベクターにサ
ブクローニングする。結果としてえられた作製物を非白血球の細胞株に形質移入
する。細胞表面タンパク質を当業者に周知の方法でビオチン標識する。LMPRO特
異性の抗体を用いて免疫沈降を実施し、免疫沈降させたサンプルをSDS-PAGE及び
免疫ブロット法を用いて分析する。標識された免疫沈降物の標識されていないも
のに対する割合は、細胞表面において発現されたLMPROの量に比例する。

【０２１１】 別法として、LMPRO活性のアッセイでは、ERにおけるLMPROの量を測定する。前
述のように形質移入した細胞を回収して溶解させる。その溶解物を、例えばショ
糖密度勾配超遠心分離法のような周知の方法で分別する。そのような方法によっ
て、ERのような細胞下膜結合区画の単離が可能となる。LMPRO特異性の抗体を用
いて分別された細胞溶解物及び全ての細胞溶解物からの免疫沈降を実施し、免疫
沈降したサンプルをSDS-PAGE及び免疫ブロット法を用いて分析する。全ての細胞
溶解物のLMPROに対するERのLMPROの濃度は、LMPROの活性に比例する。

【０２１２】 １１ 機能的アッセイ LMPROの機能は、哺乳類細胞培養系における生理学的に高められたレベルでのL
MPROをコードする配列の発現によってアッセイする。高レベルでcDNAを発現する
強力なプロモーターを含む哺乳類の発現ベクターにcDNAをサブクローニングする
。選り抜きのベクターには、pCMV SPORT（Life Technologie）及びpCR3.1 （Inv
itrogen, Carlsbad, CA）が含まれ、その各々にはサイトメガロウイルスプロモ
ーターが含まれる。5〜10μgの組換えベクターを、リポソーム製剤或いは電気穿
孔法によって、例えば内皮若しくは造血細胞株に瞬間的に形質移入する。また、
標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgの付加的なプラスミドを同時形
質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入され
ていない細胞とを区別することができ、また組換えベクターからのcDNAの発現を
確実に予測できる。選り抜きの標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（GFP;
Clontech）、CD64、又はCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。自動化されたレ
ーザー光学に基づいた技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFP又
はCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、また細胞の特性（例えば、
アポトーシスの状態）を評価する。FCMによって、先行する或いは同時の細胞死
の現象を診断する蛍光分子の取込みを検出及び定量化する。これらの現象には、
プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって測定される核DNA内容物の変化、ブ
ロモデオキシウリジンの取込み量の低下によって測定されるDNA合成の下方制御
、特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面及び細胞内のタンパンク質
の発現の変化、並びにフルオレセイン結合アネキシンVタンパク質の細胞表面へ
の結合によって測定される原形質膜組成の変化が含まれる。フローサイトメトリ
ーの方法については、Ormerod, M. G.の (1994) Flow Cytometry, Oxford, New
York, NYに記載されている。

【０２１３】 遺伝子発現におけるLMPROの影響は、LMPROをコードする配列並びにCD64若しく
はCD64-GFPの何れかが形質移入された高度に精製された細胞集合を用いて評価す
ることができる。CD64及びCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト
免疫グロブリンG（IgG）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞を、
ヒトIgG若しくはCD64の抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて、形質転
換されていない細胞から分離することができる（DYNAL, Lake Success, NY）。m
RNAは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。LMPRO及び目的と
する他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン解析やマイクロアレイ技術
で解析することが可能である。

【０２１４】 １２ LMPRO特異的抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990
) Methods Enzymol. 182:488-495参照）、或いは他の精製技術を使用して実質的
に精製されたLMPROを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化して
抗体を生成する。

【０２１５】 或いは、LMPROのアミノ酸配列をLASERGENE software（DNASTAR）を用いて解析
して免疫原性の高い領域を判定し、対応するオリゴポリペプチドを合成し、これ
を用いて当業者に知られた方法により抗体を産生させる。C-末端付近又は親水性
領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択方法の詳細については当業
者の文献に記載されている（例えば、Ausubel, 1995, 前出, ch.11参照）。

【０２１６】 通常、15残基の長さのオリゴペプチドを、fmoc法の化学作用を利用するABI 431
A Peptide Synthesizer（Perkin-Elmer）を用いて合成し、MBS（N-maleimidoben
zoyl-N-hydroxysuccinimide ester）を用いた反応によりKLH(Sigma, St.Louis,
MO)に結合させて免疫抗原性を増強させる（例えば、Ausubel前出 参照）。ウサ
ギをフロイント完全アジュバントにおけるオリゴペプチド-KLH複合体で免疫化す
る。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、1%
BSAでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素
標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検
査される。

【０２１７】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生LMPROの精製 LMPROに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより
、自然発生或いは組換えLMPROを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、LMPRO抗体を、CNBr-活性化セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）
のような活性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作
製する。結合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。

【０２１８】 LMPROを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、LMPROを優先的に吸
着させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファ
ー）でそのカラムを洗浄する。抗体／LMPRO結合を分裂させる条件下（例えば、p
H2〜3のバッファー、又は尿素若しくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度の
カオトロープ(chaotrope)）でカラムを溶出させ、LMPROを回収する。

【０２１９】 １４ LMPROと相互作用する分子の同定 ¹²⁵I Bolton-Hunter試薬を用いて、LMPRO或いはその生物学的に活性な断片を
標識する（例えば、Bolton A.E. 及びW. M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:52
9-539）。マルチウエルプレートのウエル内に予め配置した候補分子を、標識し
たLMPROと共にインキュベートし、洗浄し、標識したLMPRO複合体を有する任意の
ウエルをアッセイする。種々のLMPRO濃度で得られたデータを用いて、LMPROと候
補分子との結合、親和性及び数についての値を計算する。

【０２２０】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に記載した方
法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を特定の好適
実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実施例に過度
に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本発明の実施
のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明ら
かであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。

【０２２１】 表の簡単な説明 表１には、LMPROの解析に用いたツール、プログラム及びアルゴリズム並びに
適切な説明、引用文献及びパラメーター閾値を示す。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 LMPRO-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO software（Hitachi Software Enginee
ring, South San Francisco CA）を使用した。

【図１Ｂ】 LMPRO-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO softwareを使用した。

【図１Ｃ】 LMPRO-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO softwareを使用した。

【図１Ｄ】 LMPRO-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO softwareを使用した。

【図１Ｅ】 LMPRO-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO softwareを使用した。

【図２】 LMPRO-1（Incyte Clone ID 2083433; SEQ ID NO:1）の1番目から75番目の残基
及びヒトJaw1（GI 544492; SEQ ID NO:5）の307番目から381番目までの残基の間
のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはLASERGEN
Eソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラム（DNASTAR, Madiso
n WI）を使用した。

【図３Ａ】 LMPRO-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO softwareを使用した。

【図３Ｂ】 LMPRO-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO softwareを使用した。

【図３Ｃ】 LMPRO-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
。アライメントの作成にはMACDNASIS PRO softwareを使用した。

【図４】 LMPRO-2（Incyte Clone ID 3378920; SEQ ID NO:2）及びラットLy-6B（GI 205
248; SEQ ID NO:6）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメ
ントの作成にはLASERGENEソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプロ
グラムを使用した。

【表１】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｈ０４５ 1/18 7/04 3/10 7/06 7/04 7/08 7/06 9/10 7/08 １０１ 9/10 11/06 １０１ 17/00 11/06 17/06 17/00 19/02 17/06 19/06 19/02 19/10 19/06 21/02 19/10 21/04 21/02 25/00 １０１ 21/04 29/00 25/00 １０１ １０１ 29/00 31/04 １０１ 31/10 31/04 31/12 31/10 33/00 31/12 35/00 33/00 35/02 35/00 37/08 35/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/08 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 AA13 BA80 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ52 QR56 QS34 QX07 4B064 AG01 AG27 AG31 CA10 CA19 CC24 CE13 DA01 DA05 DA14 DA15 4B065 AA90X AA94Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA16 CA53 NA14 ZA02 ZA37 ZA38 ZA40 ZA45 ZA53 ZA55 ZA59 ZA66 ZA68 ZA75 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB05 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB32 ZB33 ZB35 ZB37 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA22 EA28 EA29 EA51 EA52 GA26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1及びそれらの断片からなる群より選択された
   アミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のア
   ミノ酸配列の同一性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドに対して少なくとも70%以上
   のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド
   の変異配列。
5. 【請求項５】 ストリンジェントな条件の下で請求項３のポリヌクレオチ
   ドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有す
   る単離され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルの少なくとも1つの核酸とハイ
   ブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
   ブリダイゼーション複合体の存在が前記サンプルにおけるポリヌクレオチドの存
   在と相関性を有するような検出過程とを含むことを特徴とするポリヌクレオチド
   の検出方法。
8. 【請求項８】 前記ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増
   幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 SEQ ID NO:3及び4並びにそれらの断片からなる群より選択
   されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドに対して少なくとも70%以
    上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチ
    ド変異配列。
11. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有
    する単離され精製されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
15. 【請求項１５】 適切な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された
    抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 LMPROの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療
    又は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請
    求項１５の医薬品組成物を投与する過程を含む方法。
20. 【請求項２０】 LMPROの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療
    又は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請
    求項１８のアンタゴニストを投与する過程を含む方法。