JP2002534258A - フッ素部分を含む新しい疎水性のポリマー - Google Patents

フッ素部分を含む新しい疎水性のポリマー

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ドミトリー ヴァレリエヴィッチ カプスティン
ラリッサ レオニドヴナ ザヴァダ
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ニコライ ニコライエヴィッチ ポノマレフ
ロベルト マッティアス ライザー
ルッツ プロプナー
エレーナ マルコヴナ ヤロシェフスカヤ
ヴィタリー パヴロヴィッチ ズボフ
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ミラ ディアグノシュティカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
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Abstract

(57)【要約】 以下のステップを含む方法によって入手可能なフッ素部分を含む疎水性のポリマーによって少なくとも部分的に覆われる支持体を有する複合材料。−前記支持体を、支持体がその表面において少なくとも部分的に、少なくとも1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物で覆われるまで、少なくとも1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物と接触させるステップ、−次いで、少なくとも1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物で少なくとも部分的に覆われた支持体のフッ素処理ステップ、−もしあれば、未反応材料の除去、及びフッ素部分を含む疎水性のポリマーによって少なくとも部分的に覆われる支持体を有する複合材料を回収するステップ。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は、フッ素部分を含む疎水性のポリマーによって少なくとも部分的に被
覆される支持体を有する複合材料、本発明の複合材料を含む疎水性の表面におけ
る分子の分離方法、本発明による複合材料で少なくとも部分的満たされたクロマ
トグラフィーのカラムあるいはカートリッジ、発明の複合材料を含む薄膜状物品
、本発明による複合材料および他の材料を含む物品、並びに本発明の複合材料の
使用に関する。
【0002】 多くのクロマトグラフィーの材料は様々な物質の分離用として知られている。
特に重要なものは、シリカ状(silicacious)の材料に基づいた修飾された表面
およびシリカゲルのような親水性の材料である。
【0003】 通常、親水性の材料の表面はクロマトグラフィーの選択性を得るために疎水性
の部分で修飾される。特に、クロマトグラフィーの工程が組み合わせられる場合
、利用可能なクロマトグラフィーの支持体はいくつかの目的のために使用するこ
とができる。しかしながら、他の特徴的特性を備えた核酸のような生体分子の分
離の分野での新しい材料を得ることは依然として必要である。
【0004】 本発明の目的は、特に蛋白質およびRNAおよびDNAではない他の物質と特異的に
結合することができる材料を提供することである。これはしたがって、DNAの高
速サンプル調製、例えば、PCRのために特に有用である。
【0005】 本発明によれば、以下のステップを含む方法によって入手可能なフッ素部分を
含む疎水性のポリマーによって少なくとも部分的に覆われる支持体を有する複合
材料が提供される。 −前記支持体を、支持体がその表面において少なくとも部分的に、少なくとも1
つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物で覆われるまで、少なくとも
1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物と接触させるステップ、 −次いで、少なくとも1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物で少
なくとも部分的に覆われた支持体のフッ素処理ステップ、 −もしあれば、未反応材料の除去、及びフッ素部分を含む疎水性のポリマーによ
って少なくとも部分的に覆われる支持体を有する複合材料を回収するステップ。
【0006】 蛋白質に対する高い結合能力および複合材料の多孔性の構造を組み合わせるこ
とで、DNAを1ステップで他の物質から分けられる。
【0007】 この新しい材料の主要な利点は取り扱いのしやすさおよび分離プロセスの速度
である。DNAは、フロースルー中に(バッチ方法)、あるいは上澄みの中に(カート
リッジ方法) 含まれている。結合した蛋白質とRNAは、もし必要ならば、勾配に
よって別々に溶出され、続いて分析されることができる。
【0008】 好ましくは、発明の複合材料の支持体は、アルミニウム、チタン、ジルコニウ
ム、シリコンおよび/または鉄の酸化物のような無機の金属酸化物を含むグルー
プから選ばれた多孔性の無機材料である。特に好ましいくは、制御された気孔ガ
ラス(CPG)としての方法で使用される、多孔性ガラスである。 典型的には、これ
は、10〜200nm(中程度気孔サイズ)の範囲の気孔を示す。
【0009】 本発明によれば、少なくとも1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化
合物を使用することができ、例えば、C4からC10のオレフィン性ジエン、特にブ
タジエン、イソプレン、クロロプレンおよび/またはピペリレン(piperilene)の
ような置換された、または未置換のオレフィン性ジエンのオリゴマーである。
【0010】 好ましくは、オリゴマーの平均分子量は、2kDaから300 kDaの範囲にある。
【0011】 支持体材料のフッ素処理は、不活性ガス条件の下でXeF2で任意に実行される。 本発明の別の具体例では、フッ素処理が、フッ素と窒素の混合物あるいは別の
適切なキャリアー・ガスを用いて行われる。キャリアー・ガスの使用は反応条件
を変化させるために有利である。例えば、適度な反応が必要か望ましい場合、フ
ッ素の含有量あるいはキャリアー・ガス中のXeF2を減少させることができる。
反応性の低い有機架橋性化合物が使用される場合、フッ素ガスかXeF2としてのフ
ッ素の濃度は増加させることができる。さらに、窒素のような適切なキャリアー
・ガスとフッ素ガス及びXeF2の使用を組み合わせることも可能である。反応は、
1つの適切な不活性の、特に、揮発性の溶剤中に、オリゴマーのオレフィンのジ
エンを溶かすことにより好ましくは行なわれ、かつ多孔性の無機の支持体にこの
溶液を満たす。溶剤を除去した後に、多孔性無機材料の内部の表面および外部の
表面は、オレフィンの架橋可能化合物によって少なくとも部分的に被覆され、上
記のようにフッ素処理することができる。この発明によって入手可能な複合材料
はクロマトグラフィーの分離のために使用することができる。
【0012】 クロマトグラフィーのカラムかカートリッジ(それは慣例通りに使用される)は
本発明の複合材料で満たすことができる。発明の複合材料は、他の固体のクロマ
トグラフィーの支持体に似た挙動を示し、そのため、クロマトグラフィーのカラ
ムあるいはカートリッジを満たす方法は同様のやり方で使用することができる。
クロマトグラフィーの分離を行なうための支持体は、ナイロン薄膜のような薄膜
に複合材料が埋め込まれている、本発明の複合材料を含む薄膜状の物品の形態と
して提供することもできる。さらに、生体分子の調製、単離あるいは分離におい
て使用される他の薄膜材料は、本発明の複合材料を埋め込むためのマトリックス
として使用することができる。
【0013】 本発明の複合材料は、疎水性の表面において分子を分離するためのクロマトグ
ラフィー方法において使用することができる。特に、核酸、蛋白質、多糖のよう
な生体分子、無機あるいは有機分子のような低い分子量物質、特に抗生物質を分
離することができる。
【0014】 本発明のクロマトグラフィー材料の使用を容易にするために、本発明による複
合材料は、フィルタ材料、試薬および/またはバッファーあるいはサンプル調製
およびクロマトグラフィー分離を行うための他の装置若しくは化学薬品と共に、
バラバラの形態あるいはクロマトグラフィーのカラムか、カートリッジあるいは
薄膜状の物品として提供することが有利である。この物品は特にキットの形式で
提供することができる。クロマトグラフィーの分離はその規模によっては制限さ
れない。それは生体分子、特に、核酸の調製的または分析的な規模での、分離、
単離、識別、精製および/または検知のためのいかなるクロマトグラフィーの操
作においても使用することができる。
【0015】 本発明は以下の実施例においてさらに説明されるが、制限的でないさと理解さ
れるべきである。
【0016】
【実施例】
実施例1: 10から200nmまでの平均気孔直径、および30〜88 m2/gの中程度の表面密度を備
えた多孔性の支持体(例えば、制御された気孔ガラス)が2.5〜15gの量で、ガラス
・アンプルに移送される。アンプルは、真空源に、および25ml n-ヘキサン中の
ブタジエンオリゴマーの溶液(MW=10,000; 40.1%の1.2-リンク; 0.06〜1.7g/支持
体gの塊を有するη50°=12.2Pa・s)を含んでいる貯蔵容器へのバルブを介して接
続される。支持体における重量計測の後に、アンプルを真空にする。支持体粒子
の移動(約20分後)が止まった時、真空を閉じつつ、底からアンプルへオリゴマー
溶液が満たされる。このステップの間、オリゴマー溶液は支持体を湿らせており
、支持体粒子の気孔に入り込んでいる。オリゴマー貯蔵容器へのバルブは閉じら
れ、そして、粒子表面上へのオリゴマーの吸着が継続される。その後、溶剤(n-
ヘキサン)は、(75−80℃の水浴)中で真空蒸発させる。乾燥品は、アンプルから
取り出され、次に、フッ素で処理される。フッ素処理は、ガス状のキセノンジフ
ルオライド(XeF2)でオリゴマー被覆した支持体の表面を処理することにより実行
される。
【0017】 これは次の方法で実行される:乾燥した、オリゴマー被覆した支持体5gは、円
筒状の反応容器に満たされる。この容器はフッ素樹脂-4mbで作られている。 そ
れは、1mmの壁厚さおよび0.15 リットルの容積を有する。底において、および頂
上において、反応器は、ニッケル・ネットで密閉される接続を有している。この
ネットは、支持体粒子を通過させないために低いメッシュ開口を有する。同じ寸
法を有する別の反応容器は1gのXeF2で満たされる。この容器の頂上の開口は、フ
ッ素樹脂-4mbで作られていたチューブによって容器の底開口にオリゴマー被覆し
た支持体と接続する。底出口はアルゴン源に接続される。システムに、被覆した
オリゴマー含んでいる容器の頂上の出口に接続されたポンプによって真空が適用
される。残存圧力は総計13.3 kPaまでになる。アルゴンは固体のXeF2とともに容
器を通過して、通過することによりXeF2で豊富化される。
【0018】 オリゴマー被覆した支持体をアルゴン-XeF2混合物が流れ、それにより、フッ
素で処理される。フッ素処理プロセスは20〜50℃で0.25〜3時間継続される。そ
の後、アルゴン-XeF2混合物が空気でシステムから洗い流される。 フッ素で処理された吸着剤は、反応容器から流出され、フローボックスの下で
脱ガスされる。その後、調製された材料は、1グラム当たり20mlのメタノール(p.
a.)で洗われ、最終的に真空乾燥オーブン中で70℃で乾燥する。
【0019】 実施例2: 気孔制御ガラス(CPG)MPS-2000 GC(中程度気孔サイズ200nm、中程度表面密度30
m2/g) 10gは、アンプル中に満たされ、20分排気される。n-ヘキサン中のオリゴ
マー溶液(0.06g/g MPSキャリアー)が加えられ、かつ溶剤を蒸発させる。 フッ素
処理のため、オリゴマーで覆われたCPGが、反応容器へ移送され、アルゴンの下
のガス状XeF2で2時間処理された。 吸着剤はガラス・フィルタ・ディスクを備えた漏斗へ移送され、200mlのメタ
ノール(p.a. 等級)で洗浄される。洗浄溶剤は、(水ジェット)ポンプによって吸
引される。 洗浄された吸着剤は、真空乾燥オーブン中70℃で乾燥される。それ
は白く疎水性である。
【0020】 実施例3: 被覆は、実施例2に上述された方法と同様に行われる。フッ素処理のための時
間は3時間である。
【0021】 実施例4: 実施例3と同様に操作する。キャリアー; 10gのMPS-1150 GC(中程度気孔サイズ
100nmおよび中程度表面密度39 m2/g) n-ヘキサン中のオリゴマーの量: 0.08g/g
キャリアー。
【0022】 実施例5: 実施例3と同様に操作する。キャリアー; 10gのMPS-250 GC(中程度気孔サイズ2
4nmおよび中程度表面密度34 m2/g) n-ヘキサン中のオリゴマーの量; 0.069g/gキ
ャリアー。
【0023】 実施例6: 実施例3と同様に操作する。キャリアー: 10gのCPG-10-240(Fluka、中程度気孔
サイズ24.2nm、中程度表面密度88(1 m2/g)) n-ヘキサン中のオリゴマーの量: 1. 7g/gキャリアー。
【0024】 実施例7: 実施例3と同様に操作する。キャリアー; 10gのCPG-10-500(フルーク、中程度
気孔サイズ520nm、中程度表面密度48.6 m2/g) n-ヘキサン中のオリゴマーの量;
0.1g/gキャリアー。
【0025】 実施例8: 実施例3と同様に操作する。キャリアー: 10gのCPG-10-1000(Fluka、中程度気
孔サイズ972nm、中程度表面密度37.9 m2/g) n-ヘキサン中のオリゴマーの量; 0.
08g/gキャリアー。
【0026】 実施例9: 03〜0.5gの量の吸着剤は、室温で50%のメタノールの中で一晩インキュベート
される。混合物はカートリッジへ移送され、少なくとも20容量TEバッファー(0.0
2Mのトリス-HCl、pH 7.5、1mM EDTA)で平衡に保たれる。 TEバッファーにプラス
ミドpBR322、RNAおよび蛋白質を含んでいるサンプルの200μlが、カートリッジ
上に置かれる。カートリッジはTEバッファーで溶離され、かつ溶離液の400μlの
フラクションが集められる。分光法により及びゲル電気泳動的に(0.8%のアガロ
ース・ゲル)証明することができるように、清浄なDNAは第1のフラクションにあ
る。 RNAと蛋白質はカートリッジから50%のメタノールで溶離することができる
【0027】 実施例10: 実施例9でのように、ポリマーで覆われた吸着剤が準備されており、カラム(長
さ10mm、内部の直径40mm)に満たされる。2mgのpBR322、RNAおよび蛋白質を含ん
でいるサンプル200μlがカラム上に置かれ、クロマトグラフィーで分離される(
流速1ml/mm)。 溶離剤はA-B勾配である: A: 10のmMトリスHCI pH 7.5 B: A+アセトニトリル(1:1 v/v)以下のスキームが続く: 0〜7.5min: 100%のA、0%のB 7.5〜15min: 80%のA、20%のB 15〜20min: 0%のA、100%のB
【0028】 実施例11: プラスミドDNAは、実施例10に記述されるような吸着剤で満たされたカラムを
備えたクロマトグラフィー分離によって精製される。しかしながら、使用される
勾配は10mMトリスHCI pH 7.5の中の0〜70%のイソプロピルアルコールである。
【0029】 実施例12: 上記のように準備された吸着剤は、分離されることになっているか精製される
ことになっている生物学上重要な巨大分子を拘束する特異的結合剤として使用す
ることができる。同じ目的のために、混合物(例えば、RNA、 蛋白質)の望まれな
いコンポーネントは特異的に結合できる。 安定な無機キャリアーによる吸着剤の機械的な安定性は、カートリッジとカラ
ム中の充てん剤として、およびバッチで行われる(粒子分散)での精製のための使
用の可能性を提示する。
【0030】 吸着剤の試験 A. 水銀細孔測定 MPS-2000、MPS-1150およびMPS-250に基づいた吸着剤のテストにより得られた
細孔測定結果は、原料の気孔サイズに依存する気孔の分配さえも示す。重合体層
の中程度コーティング厚さは50-75オングストロームである。 B. 加水分解安定性の決定 ポリフルオロブタジエンで覆われたMPSに基づいた吸着剤のサンプル、および
プロトタイプ(PTFEで覆われていたMPS)のサンプルは、基礎的な条件(pH 11)およ
び遠心分離(3000rpm、1min)の下で16時間でインキュベートされた。上澄みの一
部が取り出され、モリブデン酸アンモニウム塩および硫酸の溶液と混合された。
スペクトルはこれらの混合物から記録された。λ=360nmにおけるピークは、シリ
コンイオンが基礎的な条件の下で、粒子から再溶解したときに形成される、モリ
ブデン酸シリコン塩の存在を示す。未修飾キャリアー粒子は最も高いピークを示
した。最も小さなピークは、アルゴン雰囲気中で3時間フッ素処理された、表面
修飾粒子を示した。これらの吸着剤の加水分解安定性は2倍〜34倍に増加された
【0031】 記述された修飾済吸着剤(MPS-250、MPS-1150、MPS-2000およびCPG 10-240に基
づいた)は、大腸菌の溶解物からのゲノムDNAの精製のために使用された。 1. 一晩培養物は、大腸菌LM 109株(50μ1のバクテリア細胞、10mlの培地、37
℃)で作られた。 2. この培養物から、1mlはミクロの遠心分離機チューブの中で遠心分離された
。 3. 上澄みの除去の後に、バクテリアのペレットが100μ1のバッファー1(2mg/m
lのリゾチーム、2mM CaCL2、100のmMトリスHCl、4%のスークロース pH 7.9)に懸
濁された。 4. 細胞分解のために、懸濁液が60℃で8分インキュベートされた。 5. 100μlのバッファー2が加えられ(1%のMIRA Tensid-ミックス(1.5のmM EDTA
))、室温に冷やされた。 6. その混合物は、室温に10分震盪され、室温で震盪なしにさらに5minインキ
ュベットされた。 7. この混合物は、13,000rpmに2分遠心分離された。 8. 上澄みは吸着剤充填塔上に供給され、TE-バッファーで溶出された。
【0032】 吸着剤の調製および使用 吸着剤はメタノールの中で24時間湿らせる。その後、メタノール上澄みがデカ
ンテーションで取られ、さらに、吸着剤はTEバッファーで4回洗浄される。撹拌
しながら、TEバッファー中の吸着剤は乾燥器中で真空下、脱ガスされる。カート
リッジに、この吸着剤懸濁物(120mg/ml)が詰められる。
【0033】 1mlの一晩培養物からバクテリア溶解物(上記ステップ8参照)が準備され、カー
トリッジ上にピペットで移され、TEバッファーで溶出される。カートリッジが落
ち始めた直後に、500μl容量の6つのフラクションが集められる。 フラクション
は、100mAの定電流において、アガロース・ゲル電気泳動(89mMトリスの中の0.8%
のアガロース;89 mMのホウ酸;2mM EDTA)によってさらに分析される。
【0034】 ゲルはエチジウム臭化物で染色される。RNAではなくゲノムDNAは第2のフラク
ションで見つかる。DNAを含んでいるフラクションは、分光測光器で測定される
。そのようなフラクションの吸収A260:A280の比率は、1.65〜1.75の範囲にある
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 15/09 G01N 30/48 C G01N 30/48 30/88 E 30/88 C12N 15/00 A (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 ザヴァダ ラリッサ レオニドヴナ ロシア連邦 117261 モスコウ レニンス キー プロスペクト デー70 ケーヴィー 552 ベー261 (72)発明者 バルサミアン グリゴリー ボリソヴィッ チ ロシア連邦 123310 モスコウ ノヴォテ ュスチンスキー プロエズド デー6 コ ルプス1 ケーヴィー344 (72)発明者 ポノマレフ ニコライ ニコライエヴィッ チ ロシア連邦 123298 モスコウ ウリッサ マルシャラ ビリューソヴァ デー9 ケーヴィー39 (72)発明者 ライザー ロベルト マッティアス ドイツ連邦共和国 デー42697 ゾーリン ゲン ドゥンケルンベルガー シュトラー セ 30 (72)発明者 プロプナー ルッツ ドイツ連邦共和国 デー40699 エルクラ ート ベックハウザー シュトラーセ 9 (72)発明者 ヤロシェフスカヤ エレーナ マルコヴナ ドイツ連邦共和国 デー50858 ケルン オーシュトラントシュトラーセ 51 (72)発明者 ズボフ ヴィタリー パヴロヴィッチ ロシア連邦 121433 モスコウ ズヴェニ ゴロドスカヤ ストリート ベー12 アー ペー8 Fターム(参考) 4B024 AA20 CA01 CA11 HA20 4D017 AA03 AA13 BA04 BA11 DA03 DB02 4G066 AA08A AA10D AA20C AA22C AA23C AA27C AA32A AC13B AC15B AE04B AE19C BA23 CA20 CA54 DA07 EA01 FA14 FA17 GA11 4H045 AA20 GA25

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】以下のステップを含む方法によって入手可能なフッ素部分を含む疎
    水性のポリマーによって少なくとも部分的に覆われる支持体を有する複合材料。
    −前記支持体を、支持体がその表面において少なくとも部分的に、少なくとも1
    つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物で覆われるまで、少なくとも
    1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物と接触させるステップ、 −次いで、少なくとも1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合物で少
    なくとも部分的に覆われた支持体のフッ素処理ステップ、 −もしあれば、未反応材料の除去、及びフッ素部分を含む疎水性のポリマーによ
    って少なくとも部分的に覆われる支持体を有する複合材料を回収するステップ。
  2. 【請求項2】前記支持体がアルミナ、チタン、ジルコニウムの酸化物のような無
    機金属酸化物、シリコン酸化物および/または酸化鉄を含むグループから選択さ
    れた多孔性の無機の材料である請求項1に記載の材料。
  3. 【請求項3】前記少なくとも1つのオレフィン性二重結合を有する架橋可能化合
    物は、C4からC10のオレフィン性ジエン、特に、ブタジエン、イソプレン、クロ
    ロプレンおよび/またはピペリレンのような置換または未置換オレフィン性ジエ
    ンのオリゴマーである請求項1に記載の材料。
  4. 【請求項4】前記オリゴマーの平均分子量が2Daから300Daまでの範囲にある請求
    項3に記載の材料。
  5. 【請求項5】前記フッ素処理はXeF2および/またはフッ素と窒素の混合物を用い
    て行われる請求項1に記載の材料。
  6. 【請求項6】請求項1に記載されたフッ素部分を含む疎水性のポリマーによって
    少なくとも部分的に覆われる支持体を有する複合材料の使用を含む疎水性の表面
    での分子の分離のための方法。
  7. 【請求項7】分離されるべき分子がDNA/RNAタイプからの核酸、蛋白質、多糖の
    ような生体分子、無機または有機分子、特に抗生物質、洗剤、塩類のような低分
    子量物質である請求項6に記載の方法。
  8. 【請求項8】少なくとも部分的に、請求項1に記載された複合材料で充満された
    クロマトグラフィーのカラムまたはカートリッジ。
  9. 【請求項9】前記複合材料は、ナイロン薄膜のような重合体マトリックスに埋め
    込まれている、請求項1の複合材料を含む薄膜状の物品。
  10. 【請求項10】任意に、フィルタ材料、試薬および/若しくはバッファー、また
    はサンプル調製若しくはクロマトグラフィーの分離を実行するための他の装置若
    しくは化学薬品、との組み合わせである、請求項9に記載の薄膜状の物品、また
    は請求項8に記載のクロマトグラフィーのカラム若しくはカートリッジまたはバ
    ラバラの形態である請求項1に記載の複合材料を含む物品。
  11. 【請求項11】調製または分析的な規模での、生体分子、特に核酸の分離、単離
    、識別、精製および/または検知のためのクロマトグラフィー操作における、請
    求項1に記載のフッ素部分を含む疎水性のポリマーによって少なくとも部分的に
    覆われる支持体を有する複合材料の使用。
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