JP2002534135A - 緑内障および関連疾患の診断、予知および治療のための核酸、キットおよび方法 - Google Patents

緑内障および関連疾患の診断、予知および治療のための核酸、キットおよび方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明の好適態様において、TIGRタンパク質をコードする配列の上流配列を用いて、ステロイドへの感受性ならびに緑内障もしくは高眼内圧疾患の危険性を診断することができる。TIGR遺伝子の上流領域内およびタンパク質をコードする領域内に位置する多形、塩基置換または塩基付加を含む方法、キット、および核酸も提供される。TIGRプロモーター領域、ならびにTIGR遺伝子5'調節領域に付随するか、もしくはこれにより保有される機能的特性を有する領域を含んでいる、開示された上流配列は、多様な診断および予知方法およびキットに有用な細胞、ベクター、トランスジェニック動物および核酸構築物、ならびに治療用化合物、組成物および方法を作製するのに使用することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は診断、緑内障、関連する眼内圧障害、ならびにステロイド感受性を理
解および同定するのに有用な、診断および予知(prognostic 、予後を知る) 方法
およびキット、治療ならびに組成物の分野に関する。
【０００２】
【関連出願の相互参照】
本出願は、1999年１月11日出願の米国特許出願連続番号09/227,881号 (特に参
照のためここに援用する) の一部継続であり、それは1997年９月26日出願の米国
特許出願連続番号08/938,669号 (特に参照のためここに援用する) の一部継続で
あり、それは1997年１月28日出願の米国特許出願連続番号08/791,154号 (やはり
特に参照のためここに援用する) の一部継続である。
【０００３】
【発明の背景】
消耗性眼疾患の１群である「緑内障」は、米国および他の先進国における予防
可能な失明の主な原因となっている。一般に、緑内障は小柱網(trabecular mesh
work) の変質を特徴とし、小柱網(TM)は、分化した内皮細胞とそれに付随する結
合組織とからなる。TM内皮細胞は、眼の房水が正常な生理学的流出中に徐々に移
動する経路の内部を被覆している。この細胞は、その組成が房水の流量を直接コ
ントロールしていると考えられている細胞外分子を産生することによってTMを発
生および調節している。
【０００４】 緑内障の最も普通の形態である原発性開放角緑内障("POAG")において、TMの変
質は、虹彩を包囲している眼房から房水が出るという房水の正常な能力の閉塞を
生ずる。しかし、虹彩角膜角と呼ばれる領域における虹彩と角膜の間の眼房内の
特定の細胞は、房水の排出を可能にし続けるという意味で「開放」状態のままで
ある [Vaughan, D. et al., General Ophthamology中, Appleton & Lange, Norw
alk, CT, pp. 213-230 (1992);およびGray's Anatomy, 37版, Churchill Living
stone, London, pp. 1180-1190 (1989) 参照] 。TMの変質と閉塞の結果として、
眼内圧("IOP") の上昇が見られることがある。IOP は、適切な時期に適切な治療
を行わないと進行性の視力低下から失明に至ることがある。
【０００５】 緑内障は、40才以上の全成人の 0.4〜3.3 ％が罹患していると推定されている [Leske, M.C. et al., Amer. J. Epidemiol. 113:1843-1846 (1986); Bengtsso
n, B., Br. J. Ophthamol. 73:483-487 (1989); Strong, N.P., Ophthal. Physi ol. Opt . 12:3-7 (1992)] 。さらに、この疾患の有病率は、75才以上では６％以
上に達する [Strong, N.P., Ophthal. Physiol. Opt. 12:3-7 (1992)] 。
【０００６】 ステロイド、コルチコステロイドまたはグルココルチコイド治療と、POAG疾患
に見られるIOP 上昇との間の関連性が以前から疑われてきた。正常人の５％しか
局所グルココルチコイド試験に対して高いIOP 上昇を示さないのに対し、同じよ
うに処置されたPOAG患者では40〜50％以上が高いIOP 上昇 (16 mmHg)を示す。加
えて、グルココルチコイドへの露出によって開放角緑内障が誘発されることがあ
る。この知見から、TMの小柱細胞におけるグルココルチコイド応答の増大または
異常がPOAGに関与しているかもしれないことが示唆された [Zhan, G.L. et.al.,
Exper. Eye Res. 54:211-218 (1992); Yun, A.J. et al., Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 30:2012-2022 (1989); Clark, A.F., Exper. Eye Res. 55:265 (199
2); Klemetti, A., Acta Ophthamol. 68:29-33 (1990); Knepper, P.A., 米国特
許 4,617,299号] 。
【０００７】 グルココルチコイドが持つ緑内障様の状態を引き起こす能力から、グルココル
チコイドに応答して小柱網の細胞により誘導されうる遺伝子または遺伝子産物を
同定する研究が行われてきた [Polansky, J.R. et al., Glaucoma Update IV 中
, Springer-Verlag, Berlin, pp. 20-29 (1991); Polansky, J.R. and Weinrob,
R.N., Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.69中, Springer-Verlag,
Berlin, pp. 461-538 (1984)]。デキサメタゾンへの短時間露出を用いた最初の
研究は、特定のタンパク質合成における変化を示しただけであった。しかし、比
較的高濃度のデキサメタゾンへの長時間の露出は、関係する66 kD および55 kD
タンパク質の発現−これはゲル電気泳動により視覚化できた−を誘導することが
認められた [Polansky, J.R. et al., Glaucoma Update IV 中, Springer-Verla
g, Berlin, pp. 20-29 (1991)]。これらのタンパク質の誘導速度ならびにそれら
の用量応答特性は、ヒト被験者におけるステロイド誘導IOP 上昇に必要な誘導速
度に似ていた [Polansky, J.R. et al., Glaucoma Update IV 中, Springer-Ver
lag, Berlin, pp. 20-29 (1991)]。精製過程におけるタンパク質の凝集および明
らかな不安定性または損失の問題は、直接的なタンパク質配列決定を行う際に障
害となった。
【０００８】 1996年５月17日に出願されたNguyenらの米国特許第08/649,432号 (米国特許第
5,789,169 号として登録、その全開示内容をここに十分に述べたものとして参照
のために援用する) は、ヒトの小柱網の内側を覆う内皮細胞においてグルココル
チコイドにより高度に誘導される新規なタンパク質配列 [TIGRと命名、小柱網誘
導性グルココルチコイド応答タンパク質 (trabecular meshwork inducible gluc
ocorticoid response protein)] を開示した。Nguyenらはまた、そのタンパク質
のcDNA配列、タンパク質自身、それに結合する分子、およびそれをコードする核
酸分子も開示しており、また緑内障および関連疾患の診断、ならびに心血管疾患
、免疫疾患または該タンパク質の発現や活性に影響する他の疾患や状態といった
他の疾患または状態の診断、のための改善された方法および試薬を提供した。
【０００９】 高いIOP は緑内障の容易に測定できる特徴であるので、この疾患の診断はほと
んどが眼内圧の測定によりスクリーニングされる (眼内圧測定法)[Strong, N.P.
, Ophthal. Physiol. Opt. 12:3-7 (1992); Greve, M., et al., Can. J. Ophth amol. 28:201-206 (1993)]。残念ながら、緑内障と正常とで眼内圧の範囲が重複
するので、複数の読みが得られない限り、この方法は価値が低い [Hitchings, R
.A., Br. J. Ophthamol. 77:326(1993); Tuck, M.W., et al., Ophthal. Physio l. Opt. 13:227-232 (1993); Vaughan, D. et al., General Ophthamology 中,
Applenton & Lange, Norwalk, CT, pp.213-230 (1992); Vernon, S.A., Eye 7:1
34-137 (1993)]。複数の患者のIOP が同じ値でも、視神経損傷に対する感受性が
異なることもある。このため、視神経円板の直接検査や患者の視野低下の程度の
測定といった追加の方法が、診断の確度を高めるためによく行われている [Grev
e, M., et al., Can. J. Ophthamol. 28:201-206 (1993)]。また、これらの方法
は予知については価値が低い。一部の側面において、本発明は、改善された診断
および予知方法に対する要望を満たす。
【００１０】 局所コルチコステロイド (および他の投与経路) による眼内圧(IOP) の上昇は
、これらの有効な抗炎症剤の臨床使用を制限する重要な臨床上の問題である。十
分な時間のうちに認められない場合、IOP 上昇は (特にステロイド誘導IOP 上昇
の高い終点を示す或る種の患者の場合) 、「ステロイド性緑内障」と呼ばれる視
神経損傷と永久的な視野低下を生ずることがある。吸入、点鼻、直腸および顔面
のステロイド投与を受けた患者でも危険性がある場合がある。本発明は、部分的
には、この臨床上の問題に取り組んだ改善された診断剤、予知剤、治療剤および
方法を提供する
【００１１】
【発明の要約】
本発明は、緑内障、IOP 関連疾患、またはステロイド感受性の治療、診断、予
知および同定に使用することができる核酸、遺伝子、タンパク質および細胞に関
する。本発明は多くの薬剤、組成物および方法を包含し、その一部は後述する本
発明の目的および側面により説明されている。その他は本書の開示の全内容およ
び後述する詳細な説明から導き出すことができる。
【００１２】 １側面において、本発明は、哺乳動物のTIGR (小柱網誘導性グルココルチコイ
ド応答) 遺伝子に関連する非コーディング領域またはプロモーター領域を含む核
酸に関する。これらの核酸は、ステロイド感受性(steroid sensitivity) または
緑内障もしくはIOP の変化に関係する疾患への罹患性(susceptibiltiy)を予測す
る哺乳動物およびヒトのゲノムにおける多形 (性) を同定するのに使用できる。
これらの核酸から多数の診断もしくは予知方法およびキットを設計することがで
きる。
【００１３】 １態様において、この核酸を用いて、ゲノムにおける単塩基多形(single base
polymorphism)を同定することができる。別の態様では、２以上の単塩基多形ま
たは多塩基多形を同定または検出することができる。既知多形の検出は、本発明
の診断および予知方法およびキットの基本となりうる。これらの方法およびキッ
トには核酸を検出する各種の方法が使用でき、そのような方法としては、溶液ハ
イブリッド形成、固定化核酸を含有するマイクロアレイまたは他の固定化核酸へ
のハイブリッド形成、PCR 等の増幅に基づく方法、ならびに核酸と核酸結合試薬
とを含む適当なバイオセンサー装置が挙げられるが、これらに限られない。
【００１４】 別の側面において、本発明は、ヒトTIGR遺伝子のプロモーターまたは5'調節領
域由来の特定の配列および変異物もしくは突然変異物ならびにこれらの配列、変
異物もしくは突然変異物を取り込んだ核酸に関する。この核酸は、本発明の方法
およびキットに組み込むことができ、あるいは関心あるタンパク質もしくはポリ
ペプチドを産生するための発現系、ベクターおよび細胞に使用することができ、
あるいはTIGR遺伝子のプロモーターもしくは調節領域に特異的に結合する調節タ
ンパク質もしくはタンパク質を同定もしくは検出するための方法に使用すること
ができる。後述する具体例の多くがヒト組織由来で作用するが、配列の供給源と
して他の動物を使用してもよい。
【００１５】 本発明のこの側面の１態様において、例えば、核酸は、配列番号１、３もしく
は34のヌクレオチド5113におけるＴからＣへの変化、または配列番号２のヌクレ
オチド5117におけるＴからＣへの変化、により表される、開示されたTIGRmtl1配
列変異物を有する。配列変異物mtl1の存在はステロイド治療に対する高いIOP 応
答に結びついており、この単塩基置換を取り込んだ核酸を用いて、ステロイド治
療療法を受けた場合の緑内障発症の危険性、もしくは高眼内圧状態からの進行性
を持つ患者、またはステロイド感受性を持つ患者を同定および決定することがで
きる。また、ステロイドに対する高いIOP 応答と緑内障の後期進展との間の関連
性のために、TIGRmtl1配列変異物を有する核酸を用いて、POAGのような緑内障の
発症の危険性を同定することも可能になりうる。IOP の変化の同定は任意の既知
の手段により行うことができるが、「Armaly」基準が好ましい [Armaly, M.F., Arch. Ophthalmol. 70:492 (1963); Armaly, M.F., Arch. Ophthalmol. 75:32-3
5 (1966); Kitazawa, Y. et al., Arch. Ophthalmol. 99:819-823 (1981); Lewi
s, J.M. et al., Amer. J. Ophthalmol. 106:607-612 (1988); Becker, B. et a
l., Amer. J. Ophthalmol. 57:543 (1967)を参照、これら全てを参考のためその
全体を特にここに援用する] 。
【００１６】 本発明の目的は、下記工程を含む、患者の緑内障を診断する方法を提供するこ
とである：(A) 核酸ハイブリッド形成を可能にする条件下で、TIGRプロモーター
に連結しているポリヌクレオチドに特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオ
チドのヌクレオチド配列を含むマーカー核酸分子と、該患者の細胞または体液か
ら得た相補的核酸分子とをインキュベーションし、ここで該マーカー核酸分子と
該患者から得た該相補的核酸分子との間の核酸ハイブリッド形成は、その存在が
該患者のTIGR応答に影響する突然変異の予測となる、多形性の検出を可能にする
ものであり；(B) 該マーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子との間
でハイブリッド形成させ；そして(C) 該多形性の存在を検出し、ここで該多形性
の検出が緑内障の診断となる。
【００１７】 本発明の別の目的は、下記工程を含む、患者の緑内障を予知する方法を提供す
ることである：(A) 核酸ハイブリッド形成を可能にする条件下で、TIGRプロモー
ターに連結しているポリヌクレオチドに特異的にハイブリッド形成するポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列を含むマーカー核酸分子と、該患者の細胞または体
液から得た相補的核酸分子とをインキュベーションし、ここで該マーカー核酸分
子と該患者から得た該相補的核酸分子との間の核酸ハイブリッド形成は、その存
在が該患者のTIGR応答に影響する突然変異の予測となる、多形性の検出を可能に
するものであり；(B) 該マーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子と
の間でハイブリッド形成させ；そして(C) 該多形性の存在を検出し、ここで該多
形性の検出が緑内障の予知となる。
【００１８】 本発明の別の目的は、TIGRmt1, TIGRmt2, TIGRmt3, TIGRmt4, TIGRmt5 および
TIGRsv1 を特異的に検出することができるマーカー核酸分子を提供することであ
る。
【００１９】 本発明の別の目的は、下記工程を含む、患者のステロイド感受性の診断方法を
提供することである：(A) 核酸ハイブリッド形成を可能にする条件下で、TIGRプ
ロモーターに連結しているポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むマーカー
核酸分子と、該患者の細胞または体液から得た相補的核酸分子とをインキュベー
ションし、ここで該マーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子との間
の核酸ハイブリッド形成は、その存在が該患者のTIGR応答に影響する突然変異の
予測となる、多形性の検出を可能にするものであり；(B) 該TIGRをコードするマ
ーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子との間でハイブリッド形成さ
せ；そして(C) 該多形性の存在を検出し、ここで該多形性の検出がステロイド感
受性の診断となる。
【００２０】 本発明のさらに別の目的は、配列番号１または34の配列を含む核酸分子、配列
番号１または34に特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む組換え
DNA 分子、および配列番号１または34の配列を含む核酸分子に特異的に結合する
実質的に精製された分子を提供することである。
【００２１】 本発明のさらに別の目的は、配列番号３の配列を含む核酸分子、配列番号３に
特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む組換えDNA 分子、および
配列番号３の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質的に精製された分子を
提供することである。
【００２２】 本発明の別の目的は、配列番号４の配列を含む核酸分子、配列番号４に特異的
にハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む組換えDNA 分子、および配列番
号４の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質的に精製された分子を提供す
ることである。
【００２３】 本発明の別の目的は、配列番号５の配列を含む核酸分子、配列番号５に特異的
にハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む組換えDNA 分子、および配列番
号５の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質的に精製された分子を提供す
ることである。
【００２４】 本発明の別の目的は、緑内障患者に、TIGRタンパク質の合成を阻害する有効量
の薬剤を投与することからなる、緑内障の治療方法を提供することである。 実際、本発明の分子は、細胞外タンパク質の発現の変質を特徴とする疾患また
は状態を診断するのに使用することができる。
【００２５】
【発明の詳しい説明】
Ｉ. 本発明の薬剤 (作用剤) ここで用いた「緑内障」なる用語は、当分野で認められている通りの意味であ
り、原発性緑内障、続発性緑内障、若年性緑内障、先天性緑内障、および家族性
緑内障を包含し、これらは、制限されないが、色素性緑内障、高眼内圧緑内障お
よび低眼内圧緑内障ならびにそれらの関連疾患を含む。本発明の方法は、特にPO
AG、OAG 、若年性緑内障および遺伝性緑内障の診断に関係する。本発明の方法は
また、特にPOAG、OAG 、若年性緑内障および遺伝性緑内障の予知にも関係する。
ある疾患または状態が緑内障の症状 (例えば、眼房水流出抵抗により起こる眼内
圧の上昇) を有するか、または示す場合、それは緑内障に関連すると言える [Va
ughan, D. et al., General Ophthamology中, Appleton & Lange, Norwalk, CT,
pp.213-230 (1992)] 。本発明の好ましい薬剤について以下に詳述する。
【００２６】 本発明の薬剤は、緑内障に罹患した患者 (「緑内障患者」) における緑内障お
よびその関連疾患の存在または重篤度を診断するのに使用することができる。本
発明の薬剤はまた、緑内障の臨床症状の発現をまだ何も示していない人における
緑内障およびその関連疾患の存在または重篤度を予知するのに使用することもで
きる。このような薬剤は、天然と非天然のいずれでもよい。ここでいう天然の分
子とは、所望により「実質的に精製した」ものでもよい。この「実質的に精製し
た」とは、その分子を含んでいる天然製剤中に存在しているか、存在の可能性が
ある１種もしくは２種以上の分子を既に除去したか、あるいは含有量が普通に見
られる含有量より低くなるようにしたものである。
【００２７】 本発明の薬剤は、或る核酸が別の核酸分子とハイブリッド形成する能力といっ
た構造上の属性、または或るタンパク質が抗体で結合される能力（もしくは、こ
のような結合に対して別の分子と競合する能力）、のいずれかに関して「生物学
的に活性」であることが好ましい。あるいは、このような属性は触媒的であって
もよい。即ち、その薬剤が或る化学反応または応答を媒介する能力を含むもので
あってもよい。
【００２８】 ここで用いた「TIGRタンパク質」なる用語は、配列番号32のアミノ酸配列を有
するタンパク質を意味する。ここでいう本発明の薬剤とは、核酸分子、タンパク
質および有機分子を含む。
【００２９】 上に指摘したように、小柱網が眼房水 (房水) の正常な流れにおいて重要な役
割を果たしていることが今までに提案されており、また緑内障の眼における流出
抵抗の主要な部位であることが推定されていた。ヒト小柱網(HTM) 細胞は、房水
が眼から出ていくための流出流路の内面を覆う内皮様細胞であり、この細胞の変
質した合成機能がステロイド緑内障および他の種類の緑内障の病因に関連してい
る可能性がある。このような細胞の持続したステロイド処理は、１〜２日のグル
ココルチコイド(GC)露出に比べた時に大きな違いが認められることを示した点で
、興味深い。この違いは、ステロイド緑内障の臨床症状の始まり (１〜６週間）
に関連するらしい。
【００３０】 小柱網細胞がグルココルチコイドに応答して特定のタンパク質を誘導すること
は既に認められていた [Polansky, J.R., "Basic Aspects of Glaucoma Researc h III "中, Schattauer, New York 307-318 (1993)]が、発現したタンパク質を精
製する研究は、不溶性や他の問題により妨げられていた。Nguyen, T.D.等 ["Bas ic Aspects of Glaucoma Research III "中, Schattauer, New York, 331-343 (1
993): 参考としてここに援用する] は、グルココルチコイド誘導ヒト小柱網細胞
から高度に誘導されたmRNA種を分離するため分子クローニング法を用いた。この
mRNAは、グルココルチコイド誘導タンパク質に似た誘導の時間経過を示した。こ
のクローンは「II.2」と命名された (ATCC No: 97994, American Type Culture
Collection, マナサス、バージニア州) 。
【００３１】 1996年５月17日出願のNguyenらの米国特許出願第08/649,432号は、グルココル
チコイドへの露出により小柱網の細胞内で誘導される新規分泌性タンパク質をコ
ードするII.2クローンを分離した。このタンパク質が小柱網の細胞外空間内に付
着するようになり、小柱網の内面を覆う内皮細胞の表面に結合することにより、
房水の流れの低下を生ずるかもしれないことが提案された。定量的ドットブロッ
ト分析およびPCR 評価では、このmRNAが時間と共に漸増する誘導を示すのに対し
て、HTM 細胞内に存在する他の系由来の他の既知のGC誘導物質 (メタロチオネイ
ン、α-1酸性糖タンパクおよびα-1抗キモトリプシン) は、１日で、またはそれ
より早くに最大濃度に達することを示した。特に興味深いのは、対照レベルはPC
R 法なしでは検出不可能であったのに対し、このクローンの誘導レベルが非常に
高い (全細胞性mRNAの４〜６％）ことであった。35Ｓメチオニン細胞標識の研究
に基づくと、該クローンはこれらの細胞における主要なGC誘導細胞外糖タンパク
(これは推定されているイノシトールリン酸アンカーを持つシアレン化(sialena
ted)Ｎ−グリコシル化分子である) に対して最近発見された特徴を有している。
mRNAの誘導は全細胞性mRNAの４％に達した。mRNAは10日間のデキサメタゾン処理
の間に徐々に増加した。II.2クローンは2.0 Kbであるのに対し、ノーザンブロッ
ティングでは2.5 Kbのバンドを示す。ポリＡテイルを含まないにもかかわらず、
このクローンの3'末端は２つの共通ポリアデニル化シグナルを含んでいる。
【００３２】 あるゲノムクローンを分離し、P1TIGRクローンと命名した (ATCC No: 97570,
American Type Culture Collection, ロックビル、メリーランド州) 。P1TIGRク
ローンを用いたその場ハイブリッド形成は、TIGR遺伝子を示すか、および／また
は染色体１、q21-27に位置するTIGR遺伝子、より好ましくは染色体１、q22-26に
位置するTIGR遺伝子、最も好ましくは染色体１、q24 に位置するTIGR遺伝子、に
特異的にハイブリッド形成する１つまたは複数の配列を示す。クローンP1TIGRは
、ベクターpCYPACのBamHI 部位中にクローニングされたTIGR遺伝子に特異的にハ
イブリッド形成するヒトゲノム配列を含んでいる [Ioannou et al., Nature Gen etics , 6:84-89 (1994) 、ここに参考として援用する] 。
【００３３】 ここで用いた「TIGR遺伝子」なる用語は、TIGRタンパク質を産生するのに関与
するDNA の領域を意味する；これは、制限されないが、コーディング領域の前お
よび後ろにくる領域、ならびに個々のコーディング領域の間の介在配列を包含す
る。
【００３４】 ここで用いた「TIGRエキソン」なる用語は、成熟TIGR mRNA 分子の鋳型として
作用するTIGR遺伝子の任意の分断された領域(interrupted region)を意味する。
ここで用いた「TIGRイントロン」なる用語は、TIGR mRNA 分子の鋳型として作用
する、TIGR遺伝子の非コーディング領域を意味する。
【００３５】 スタンフォードG3放射線ハイブリッドパネルを用いた位置推定(localization)
の研究では、6.0 のLOD スコアでD1S2536 マーカーの近くにTIGR遺伝子がマッピ
ングされた [Richard et al., American Journal of Human Genetics 52.5:915-
921 (1993)、ここに参考として援用する; Frazer et al., Genomics 14.3:574-5
78 (1992) 、ここに参考として援用する; Research Genetics, Huntsville, Ala
bama)]。この領域内の他のマーカーとして次のものも挙げられる：D1S210; D1S1
552; D1S2536; D1S2790; SHGC-12820;およびD1S2558 。
【００３６】 TIGRコーディング領域の上流に位置する配列を緑内障ではない人において分離
し、配列決定する。この上流配列を配列番号１および34に示す。緑内障ではない
人と緑内障の人との上流領域の配列比較により、緑内障の人における多くの突然
変異が同定される。これらの突然変異のいくつかを図２に示す。この配列を用い
て、ここに開示されたTIGR遺伝子 (配列番号１、２、３および34) の上流領域か
らのヒトゲノム配列における正確な変化を同定することができる。配列番号３は
、図面との配列の比較から明らかなように、転写の開始と翻訳の開始を通る領域
を含んでいる。配列番号34は、やはり図面との配列の比較から明らかなように、
転写開始部位の前で終わっている。ここでは６つの突然変異を具体的に開示する
。TIGRmt1 は、4337位置 (配列番号１、配列番号２および配列番号３) でのシト
シンのグアニンによる置換の結果である。TIGRmt2 は、4950位置 (配列番号１、
配列番号２および配列番号３) でのシトシンのチミンによる置換の結果である。
TIGRmt3 は、4998位置 (配列番号１、配列番号２および配列番号３) でのグアニ
ン、チミン、グアニン、およびチミンのこの順序(GTGT)での付加の結果である。
TIGRmt4 は、4256位置 (配列番号１、配列番号２および配列番号３) でのアデニ
ンのグアニンによる置換の結果である。TIGRmt5 は、4262位置 (配列番号１、配
列番号２および配列番号３) でのグアニンのアデニンによる置換の結果である。
TIGRmtl1 (図２には示されていない) は、5113位置 (配列番号１、３または34)
および配列番号２のヌクレオチド5117の等価の位置でのチミンのシトシンによる
置換の結果である。TIGRmt1 、TIGRmt2 、TIGRmt3 、TIGRmt4 、TIGRmt5 、TIGR
mtl1の１または２以上は、ホモ接合性またはヘテロ接合性となりうる。
【００３７】 緑内障ではない人と緑内障の人との上流領域の配列比較により、緑内障の人に
おける少なくとも１つの配列変異が同定される。このような配列変異物を図２に
示す。TIGRsv1 は、4406位置のアデニンのグアニンによる置換の結果である (配
列番号１、配列番号２および配列番号３) 。また、TIGRmtl1の存在は、ステロイ
ド感受性またはステロイドもしくはコルチコステロイド治療中の緑内障もしくは
IOP 関連疾患の発症に対する増大した罹患性と関係する。
【００３８】 TIGRコーディング領域の上流の配列を含む分子は、多形性の研究に対する有用
なマーカーとなる。このような分子としては、一本鎖高次構造多形の研究に適し
たプライマーが挙げられ、その例は次の通りである：フォワード (前進) プライ
マー"Sk-1a": 5'-TGA GGC TTC CTC TGG AAA C-3' (配列番号６);リバース (復帰
) プライマー"ca2":5'-TGA AAT CAG CAC ACC AGT AG-3' (配列番号７);フォワー
ド・プライマー"CA2":5'-GCA CCC ATA CCC CAA TAA TAG-3'(配列番号８);リバー
ス・プライマー"Pr+1":5'-AGA GTT CCC CAG ATT TCA CC-3'(配列番号９);フォワ
ード・プライマー"Pr-1":5'-ATC TGG GGA ACT CTT CTC AG-3'(配列番号10);リバ
ース・プライマー"Pr+2(4A2)":5'-TAC AGT TGT TGC AGA TAC G-3'(配列番号11);
フォワード・プライマー"Pr-2(4A)":5'-ACA ACG TAT CTG CAA CAA CTG-3' (配列
番号12);リバース・プライマー"Pr+3(4A)":5'-TCA GGC TTA ACT GCA GAA CC-3'(
配列番号13);フォワード・プライマー"Pr-3(4A)":5'-TTG GTT CTG CAG TTA AGC
C-3' (配列番号14);リバース・プライマー"Pr+2(4A1)":5'-AGC AGC ACA AGG GCA
ATC C-3'(配列番号15);リバース・プライマー"Pr+1(4A)":5'-ACA GGG CTA TAT
TGT GGG-3' (配列番号16）。
【００３９】 また、TIGRエキソン内の配列を含む分子も多形性の研究に対する有用なマーカ
ーとなる。このような分子としては一本鎖高次構造多形研究に適したプライマー
が挙げられ、その例は次の通りである：フォワード・プライマー"KS1X": 5'-CCT
GAG ATG CCA GCT GTC C-3'(配列番号17);リバース・プライマー"SK1XX":5'-CTG
AAG CAT TAG AAG CCA AC-3' (配列番号18);フォワード・プライマー"KS2a1":5'
-ACC TTG GAC CAG GCT GCC AG-3' (配列番号19);リバース・プライマー"SK3":5'
-AGG TTT GTT CGA GTT CCA G-3'(配列番号20);フォワード・プライマー"KS4":5'
-ACA ATT ACT GGC AAG TAT GG-3' (配列番号21);リバース・プライマー"SK6A":5
'-CCT TCT CAG CCT TGC TAC C-3' (配列番号22);フォワード・プライマー"KS5":
5'-ACA CCT CAG CAG ATG CTA CC-3' (配列番号23);リバース・プライマー"SK8":
5'-ATG GAT GAC TGA CAT GGC C-3'(配列番号24);フォワード・プライマー"KS6":
5'-AAG GAT GAA CAT GGT CAC C-3'(配列番号25）。
【００４０】 プライマー：Sk-1a, ca2, CA2, Pr+1, Pr-1, Pr+2(4A2), Pr-2(4A), Pr+3(4A)
, Pr-3(4A), Pr-3(4A), Pr+2(4A1) 、およびPr+1(4A)の位置を図４に図式的に示
す。プライマー：KS1X, SK1XX, Ks2a1, SK3, KS4, SK6A, KS5, SK8, およびKS6
の位置を図５に図式的に示す。
【００４１】 TIGRコーディング領域の一次構造は、ATG 開始部位 (配列番号３、残基5337-5
339)から始まり、そして20アミノ酸共通シグナル配列と第２のATG(配列番号３、
残基5379-5381)を含み、このタンパク質が分泌タンパク質であることを示してい
る。TIGRコーディング領域に対するヌクレオチド配列を図７に示す (配列番号26
) 。このタンパク質は、該分子の最も親水性の領域に位置したＮ連結グリコシル
化部位を含む。このタンパク質のアミノ末端部分は非常に極性化しており、その
ヒドロパシープロフィールおよびガルニエ−ロビンソン(Garnier-Robinson)構造
解析により示される通り、αヘリックス構造をとる。これに対し、このタンパク
質はそのカルボキシ末端近くに25アミノ酸疎水性領域を含む。この領域は、グル
ココルチコイド誘導タンパク質(GIP) アンカリング(anchoring) 配列を含んでい
てもよい。TIGRのアミノ酸配列を図８に示す (配列番号32) 。
【００４２】 GCの不存在下および存在下でのシクロヘキサミド処理の研究は、TIGRの誘導に
はGC受容体以外の因子 (ファクター) がからんでいる可能性があることを示唆し
ている。TIGR遺伝子は、H2O2、 12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテー
ト(TPA) 、および高グルコースのような刺激物質によっても誘導されるので、こ
れが細胞ストレス応答に関与している可能性もあり；この事実は緑内障の病因論
および治療にも関係するかもしれない。
【００４３】 好ましい種類の薬剤は、TIGR核酸分子("TIGR分子")またはその断片を含むもの
である。このような分子はDNA とRNA のいずれでもよい。別の好ましい種類の薬
剤("TIGR分子")はTIGRタンパク質、そのペプチド断片、融合タンパク質、および
構造類似物を含むものである。
【００４４】 TIGR核酸分子またはその断片は、或る種の状況下で他の核酸分子と特異的にハ
イブリッド形成することができる。ここで用いた意味では、２つの核酸分子が逆
平行二本鎖核酸構造を形成することができれば、その２つの核酸分子は互いに特
異的にハイブリッド形成することができると云う。ある核酸分子が別の核酸分子
の「相補物(complement)」であると云うのは、それらの分子が完全な相補性を示
す場合である。ここで用いた意味では、分子の一方の全てのヌクレオチドが他方
の分子の或るヌクレオチドと相補的である場合、これらの分子は「完全な相補性
」を示すと云う。２つの分子が少なくとも通常の「低緊縮性」条件下では互いに
アニールされたままにしておくことができる程度の十分な安定性で互いにハイブ
リッド形成が可能である場合に、これら２分子は「最低限に相補性」であると云
う。また、２つの分子が通常の「高緊縮性」条件下で互いにアニールされたまま
にしておくことができる程度の十分な安定性で互いにハイブリッド形成が可能で
ある場合に、これら２分子は「相補性」であると云う。通常の緊縮性 (stringen
cy) の条件は、Sambrook, J.他 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual第２
版中，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]およ
びHaymes, B.D.他 [Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach中, IR
L Press, Washington, DC (1985)](それらの全体をここに参考のために援用する
) により説明されている。従って、完全な相補性から逸脱することも、その逸脱
により分子の二本鎖構造の形成能が完全に消失することがない限り、許容される
。核酸分子がプライマーまたはプローブとして作用するには、採用する特定の溶
媒および塩濃度の条件下で、これが安定な二本鎖構造を形成することができる程
度に十分な配列の相補性があるだけでよい。
【００４５】 DNA ハイブリッド形成を促進する適当な緊縮性条件、例えば、約45℃の6.0 x
塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC) の後に50℃の2.0 x SSC の洗浄、は
当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, N.Y. (1989)、 6.3.1-6.3.6に見られる。例えば、洗浄工程における塩
濃度は、50℃で約2.0 x SSC という低緊縮性から50℃で約0.2 x SSC という高緊
縮性までの範囲から選択することができる。また、洗浄工程の温度は、室温 (約
22℃) の低緊縮性条件から約65℃の高緊縮性条件まで高めることができる。温度
と塩濃度の両方を変化させてもよく、あるいは温度と塩濃度の一方を一定に保持
し、他方のパラメータだけを変化させてもよい。
【００４６】 １好適態様において、本発明の核酸は、例えば、約2.0 x SSC で約65℃の中程
度の緊縮性条件下で、配列番号１〜５もしくは34に記載の核酸分子の１または２
以上、またはそれらの相補物、またはいずれかの約20〜200 塩基の断片に特異的
にハイブリッド形成する。特に好ましい態様では、本発明の核酸は、高緊縮性条
件下で、配列番号１〜５もしくは34に記載の核酸分子の１または２以上、または
それらの相補物、またはいずれかの断片に特異的にハイブリッド形成する。
【００４７】 本発明の１側面において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号６
〜25もしくは33に記載の配列、またはその相補物、またはいずれかの断片を有す
る。本発明の別の側面では、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号６
〜25もしくは33に記載の核酸配列、またはその相補物、またはいずれかの断片と
、約80％〜100 ％または約90％〜100 ％の配列同一性を共有する。本発明のまた
別の側面では、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号６〜25もしくは
33に記載の核酸配列、またはその相補物、またはいずれかの断片と、約95％〜10
0 ％の配列同一性を共有する。本発明のより好ましい側面では、本発明の好まし
いマーカー核酸分子は、配列番号６〜25もしくは33に記載の核酸配列、またはそ
の相補物、またはいずれかの断片と、約98％〜100 ％の配列同一性を共有する。
【００４８】 調節領域とこの領域に結合する薬剤またはこの領域に結合する分子の結合を変 化させる薬剤 上流領域の配列比較により、多数のDNA モチーフ (シスエレメント) または調
節領域が同定される。これらのDNA モチーフまたはシスエレメントを図１に示す
。これらのモチーフは、制限されないが、グルココルチコイド応答モチーフ、シ
ェアストレス（剪断応力）応答モチーフ、NFκB 認識モチーフ、およびAP1 モチ
ーフを包含する。以下に説明するこれらのモチーフおよび他のモチーフの位置は
図１に図式的に示されている。
【００４９】 ここで用いた意味では、「結合することができるシスエレメント」とは、記載
した１または２以上のシスエレメントがある薬剤 (作用剤) を特異的に結合 (束
縛) する能力を持つことを意味する。このような結合は、シスエレメントとその
薬剤との間の全ての化学的、物理的または生物学的相互作用によるものでよく、
これは、制限されないが、シスエレメントと薬剤との間の全ての共有、立体、ア
ゴスティック(agostic) 、電子およびイオン相互作用を包含する。ここで用いた
意味では、「特異的に結合する」なる用語は、その薬剤が全く関連のない核酸配
列ではなく特定のシスエレメントに結合する能力を持つことを意味する。調節領
域とは、核酸断片、領域または長さがある生物学活性を機能的に実施する能力を
意味する。生物学的活性は、核酸または特定のDNA 配列への結合でよい。生物学
活性はまた、付近のコーディング領域の転写の調節、増進、阻害または変質でも
よい。生物学活性は、核酸断片への結合を検出できるゲルシフトアッセイにより
同定してもよい。核酸調節領域における生物学活性の他の検出方法は、本技術分
野で既知である (例えば、Current Protocols in Molecular Biologyを参照) 。
【００５０】 TIGR遺伝子のプロモーターまたは調節領域に特異的に結合する調節性タンパク
質またはタンパク質または化合物を同定または検出する態様では、リポーター遺
伝子を採用する多数のベクター系が有用となりうる。リポーター遺伝子の存在が
プロモーターまたは5'調節領域からの転写活性を示すように、プロモーターまた
は5'調節領域をリポーター遺伝子の発現の制御と関連づけることができる。本発
明のこの側面に対して作製されたDNA 構築物、ベクターおよび細胞、ならびにこ
れらを用いる方法は、多様なやり方で有用となりうる。例えば、これらはTIGR遺
伝子発現を変調させる組織特異的因子 (ファクター) の有無を検出することがで
きる。発現の変調は、転写の増大もしくは低減、翻訳の増大もしくは低減、また
は細胞中に存在するTIGR mRNAまたはタンパク質の量への他の影響を意味するこ
とができる。これらはまた、TIGR遺伝子発現、IOP 関連疾患またはステロイド感
受性に影響する化合物を同定するのにも使用できる。これらの同定された化合物
はその後、特に緑内障およびIOP 関連疾患の治療または診断処置の開発のために
使用することができる。
【００５１】 使用できるか、または使用に適合できる発現系およびリポーター遺伝子の種類
は、本技術分野では周知である。例えば、ルシフェラーゼ活性、アルカリ性ホス
ファターゼ活性、またはグリーン蛍光タンパク質活性に対する遺伝子を含有する
ベクターが一般に使用される。例えば、Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)および1999年５月までの
追補を参照。この種のベクターへのTIGR遺伝子の5'調節領域の挿入は、リポータ
ー遺伝子の発現をTIGR配列の制御下に置く。その後、１種または複数のベクター
を各種の細胞種に挿入して、組織特異的発現における差を検査することができ、
これからその後に、TIGR発現を変調させる組織特異的因子ならびにこの組織特異
的因子の活性に影響を及ぼす化合物を同定することができる。ベクターは、TIGR
5'調節領域の転写変調活性に影響を及ぼす化合物を検出するのに使用することも
できる。或いは、5'調節領域およびリポーター遺伝子構築物を、相同的組換え法
において細胞を産生するのに使用することもできる。細胞のゲノム内に適切に挿
入した場合、リポーター遺伝子はTIGR調節領域の制御下におかれることになる。
上述したように、その後に相同的組換え細胞を使用して、各種の治療に起因する
または別の細胞中の発現の変化または発現の変調を検出することができる。
【００５２】 例えば、ヒト小柱網細胞(HTM) を、アルカリ性ホスファターゼ活性(AP)の発現
を制御するTIGR遺伝子由来の各種5'調節配列を含有するベクターを用いて、一過
性または恒久的にトランスフェクションすることができる。APの発現または対照
に対する発現の変化は、転写調節配列の存在を意味する。HTM 細胞中での発現を
Cos またはHeLa細胞といった他の細胞中での発現と比べることにより、TIGR遺伝
子由来の転写活性に影響する細胞特異的化合物の存在を検出することが可能とな
る。また、細胞を試験化合物で処理することにより、転写に影響を与える化合物
を検出することができる。
【００５３】 さらに、細胞種が発現変調活性の存在について特性決定されたら、その5'調節
領域をさらに使用して、特定の細胞内の細胞性成分またはタンパク質による特異
的DNA 結合の存在を同定することができる。DNA 結合の検出のためのアッセイお
よび方法としては、これらに制限されないが、ゲルシフトアッセイおよび本技術
分野で公知の均等技術が挙げられる。ゲルシフトアッセイでは、DNA に結合する
化合物の存在が、アガロース、ポリアクリルアミド、または他のゲルマトリック
スを通過するDNA の移動度のシフトを観察することにより検出される。即ち、１
または２以上の細胞成分または細胞抽出物の存在下でDNA をゲルに流し、対照と
比較することにより、そのDNA への特異的結合を検出することができる。同様に
して、DNA をゲルに流す前に１または２以上の試験化合物でサンプルを処理する
ことにより、各種化合物を、このDNA へのある細胞性成分の結合結合に影響を及
ぼす該化合物の能力について試験することができる。もちろん、これらのアッセ
イで使用する細胞は、初代培養細胞または確立された細胞系である必要はない。
あらゆる種類の操作された細胞を使用することができ、細胞に含まれているDNA
結合タンパク質または転写因子に意図的な変化がなされている細胞でも使用でき
る。
【００５４】 DNA 構築物、細胞、ベクターに、またはTIGR遺伝子配列を結合させる有用なプ
ロモーター領域、組織もしくは細胞特異的成分を検出する方法に、またはDNA 結
合またはプロモーター活性に影響を及ぼす化合物を検出する関連の方法に、使用
しうるTIGR遺伝子配列は、例えば、少なくとも1.6 kbといった大きなものでもよ
く、あるいは約10〜300 bp程度のずっと小さなものでもよい。好ましい領域は、
配列番号３の5340から5044までの283 bpの領域 (配列番号37とする) 、または配
列番号34の5044から5271 (末端) までの227 bpの領域 (配列番号38とする) であ
る。
【００５５】 他の好ましい領域は図面または配列表に示されており、あるいは図面と配列表
を比較することにより本質的に表れてくる。例示すると、配列番号３および34の
TATAボックスは、どちらも5232位置から始まる。配列番号３および34からの特定
の領域を、図１における同定された調節領域と相関させることができる。図１に
おいて、TATAボックスは5230から始まる。こうして、さらなる好ましい5'領域は
、ここで同定および説明している１または２以上の調節領域、ならびに図１に列
挙した共通調節配列に示された多くの配列変化を取り込むことができる。例えば
、配列番号37は、配列番号37の塩基39から始まるnGRE-Pr1調節配列における各種
位置で変化させて、図１に示した共通配列と一致させることができる。配列番号
37の塩基67はＴからＧに、塩基57および65はＣからＡに変化させることができる
。これらの変化は、これらの配列の基本的な調節活性に影響しないが、可能な調
節変調の程度に影響を及ぼすかもしれない。いずれか１または２以上の列挙した
調節領域を用いた類似の置換を、配列番号１〜３または34からの領域に対して行
うこともできる。また、ここに同定した１または２以上の突然変異配列を取り込
んだ置換も行うことができる。例えば、配列番号37の塩基69をＴからＣに変化さ
せて、ここに示すTIGR.mtl1 突然変異物と相関させることができる。共通配列変
化および同定されたTIGR突然変異物からの変化の一方または両方を取り込んだ5'
調節領域における多くの変異物を作製することができる。この領域の基本的な発
現変調能力に影響を及ぼさずに、塩基を付加または欠失させることもできる。
【００５６】 以下の説明は、TIGR 5' 領域または他の周知の調節活性において同定された調
節領域のいくつかを同定するものである。言及したように、これらの領域もしく
は配列、またはその変異物は、本発明のDNA 構築物、ベクター、細胞および方法
に取り込むことができる。それらの任意の組合わせ (配列番号37および18の上に
同定した領域またはその変異物を持つか、または持たない) を、付着(attached)
遺伝子の組織特異的または細胞型特異的発現を付与する能力について試験するこ
とができる。後述する実施例５に示すように、配列番号37は、付着リポーター遺
伝子の組織特異的発現を付与する。AP活性の発現は、HeLaまたはCos 細胞に比べ
てHTM 細胞においてずっと高い。こうして、１つの細胞種からの発現レベルの他
のものと比較した変化を検出することにより、組織特異的プロモーターまたは調
節活性を同定することができる。
【００５７】 ラットPRL 遺伝子の発現は下垂体プロラクチン(lactotroph)細胞に高度に制限
され、cAMP依存性プロテインキナーゼＡ経路により誘導される。近位ラットPRL
プロモーターの重複下垂体特異性エレメント(PRL-FP111) の少なくとも１つがこ
のプロテインキナーゼＡ作用に必要である [Rajnarayan et al., Molecular End ochronology 4:502-512 (1995)、ここに参考のため援用する] 。PRL-FP111 に特
有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基370-388
および4491-4502 にそれぞれ示されている。本発明のこの態様によると、PRL-FP
111 上流モチーフまたはシスエレメントを結合する分子の生化学的性質または濃
度を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。
このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では
、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様で
は、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００５８】 ラット肝のグルココルチコイド受容体およびウサギ子宮由来のプロゲステロン
受容体の両方により認識される共通配列(GR/PR) は、グルココルチコイドおよび
プロゲステロン依存性遺伝子発現に関与すると報告されている [Von der Ahe et
al., Nature 313:706-709 (1985) 、ここに参考のため援用する] 。GC/PR 上流
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基433-445 に示され
ている。本発明のこの態様によると、グルココルチコイドもしくはプロゲステロ
ンまたはそれらの相同物(homologue) の生化学的性質または濃度 (これは、制限
されないが、GC/PR 上流モチーフまたはシスエレメントに結合したグルココルチ
コイドもしくはプロゲステロンまたはそれらの相同物の濃度を包含する) を変化
させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このよう
な薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このよ
うな薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、この
ような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００５９】 シェアストレス応答モチーフ(SSRE)またはシスエレメントは、血小板由来増殖
因子Ｂ鎖、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA) 、ICAM-1およびTGF-β1
を含む多数の遺伝子中に同定されている [Resnick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:4591-4595 (1993)、ここに参考のため援用する] 。これらの遺伝
子の転写は、サイトカインおよび細菌産物のような体液性刺激ならびに血流力学
ストレス力と関連づけられてきた。上流シェアストレスモチーフまたはシスエレ
メントに相当する配列が、図１の残基446-451, 1288-1293, 3597-3602, 4771-47
76, および5240-5245 にそれぞれ示されている。本発明のこの態様によると、シ
ェアストレスモチーフを結合することができる分子の生化学的性質または濃度を
変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。この
ような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、こ
のような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、
このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００６０】 グルココルチコイド応答上流モチーフ(GRE) またはシスエレメントの共通配列
が既に決定されている [Beato, Cell 56:335-344 (1989); Becker et al., Natu re 324:686-688 (1986) 、ここに参考のため援用する；Sakai et al., Genes an d Development 2:1144-1154 (1988)、ここに参考のため援用する] 。この上流モ
チーフまたはシスエレメントを含む遺伝子は、グルココルチコイド、プロゲステ
ロン、アンドロゲンおよびミネラルコルチコイドにより調節される [Beato, Cel l 56:335-344 (1989)]。グルココルチコイド応答上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列が、図１の残基574-600, 1042-1056, 2444-2468, 2442-2269
, 3536-3563, 4574-4593, 4595-4614, 4851-4865, 4844-4864, 5079-5084, およ
び5083-5111 にそれぞれ示されている。本発明のこの態様によると、グルココル
チコイド応答上流モチーフまたはシスエレメントを結合することができる分子の
生化学的性質または濃度を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写
を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することが
できる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用すること
ができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができ
る。
【００６１】 野生型の核リンタンパク質, p53 の配列特異的結合部位(CBE) は既に同定され
ており、複製起点と関連づけられているようである [Kern et al., Science 252
:1708-1711 (1991) 、ここに参考のため援用する] 。CBE 上流モチーフまたはシ
スエレメントに相当する配列が、図１の残基735-746 に示されている。本発明の
この態様によると、p53 またはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、
制限されないが、CBE 上流モチーフまたはシスエレメントに結合したp53 または
その相同物の濃度を包含する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子
の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用する
ことができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用す
ることができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用すること
ができる。
【００６２】 p50 およびc-Rel 依存性IgH 3'エンハンサー活性を助長する転写アクチベータ
ーである核因子ets 様(ets-like)(NFE) は、Rel 依存性IgH 3'エンハンサーにお
けるNFE 部位に結合することが示されている [Linderson et al., European J. Immunology 27:468-475 (1997)、ここに参考のため援用する] 。NFE 上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基774-795 に示されている
。本発明のこの態様によると、核因子またはそれらの相同物の生化学的性質また
は濃度 (これは、制限されないが、NFE 上流モチーフまたはシスエレメントに結
合した核因子またはそれらの相同物の濃度を包含する) を変化させることができ
る薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障
の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障
の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内
障の治療に使用することができる。
【００６３】 細胞型および分化特異的発現を調節するヒト・ケラチン１遺伝子に対して3'側
の制御因子の上流モチーフまたはシスエレメント(KTF.1-CS)は、既に同定されて
いる [Huff et al., J. Biological Chemistry 268:377-384 (1993) 、ここに参
考のため援用する] 。KTF.1-CSに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相
当する配列が図１の残基843-854 に示されている。本発明のこの態様によると、
KTF.1-CSまたはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限されないが
、KTF.1-CS上流モチーフまたはシスエレメントに結合したKTF.1-CSまたはその相
同物の濃度を包含する) を変化させることができる薬剤によりTIGR分子の転写を
行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することがで
きる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することが
できる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる
。
【００６４】 ニワトリリゾチームクロマチンの遠上流(far upstream)ステロイド依存性デオ
キシリボヌクレアーゼ(DNase) 過敏性部位にマッピングするプロゲステロン応答
配列(PRE) は既に決定されている [Hecht et al., EMBO J. 7:2063-2073 (1988)
、ここに参考のため援用する] 。この配列 (エレメント) は、異種プロモーター
にホルモン調節を行い、プロゲステロン受容体結合部位のクラスターからなる。
PRE に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基
987-1026に示されている。本発明のこの態様によると、プロゲステロン応答PRE
上流モチーフまたはシスエレメントを結合することができる分子の生化学的性質
または濃度を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことが
できる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に有用となりうる。別の態様で
は、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様
では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００６５】 上皮増殖因子受容体の発現を調節するトランス活性転写因子に対するモチーフ
として作用する配列(ETF-EGFR)は既に決定されている [Regec et al., Blood 85
:2711-2719 (1995) 、ここに参考のため援用する] 。ETF-EGFR上流モチーフまた
はシスエレメントに相当する配列が、図１の残基1373-1388 に示されている。本
発明のこの態様によると、核因子またはそれらの相同物の生化学的性質または濃
度 (これは、制限されないが、ETF-EGFR上流モチーフまたはシスエレメントに結
合した核因子またはそれらの相同物の濃度を包含する) を変化させることができ
る薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障
の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障
の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内
障の治療に使用することができる。
【００６６】 共通トランス作動性因子(SRE-cFos)は、筋肉の骨格筋および心筋αアクチン遺
伝子転写を調節することが示されている [Muscat et al., Molecular and Cellu lar Biology 10:4120-4133 (1988) 、ここに参考のため援用する] 。SRE-cFos上
流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基1447-1456 に示
されている。本発明のこの態様によると、核因子またはそれらの相同物の生化学
的性質または濃度 (これは、制限されないが、SRE-cFos上流モチーフまたはシス
エレメントに結合した核因子またはそれらの相同物の濃度を包含する) を変化さ
せることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような
薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このよう
な薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このよ
うな薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００６７】 Alu 反復配列は霊長類だけにあり、ヒトゲノム内に４Kbの平均間隔で散在して
いる。一部のAlu 配列はポリメラーゼIIIにより活発に転写されるが、正常な転
写産物は5'または3'非翻訳領域にAlu 由来配列を含むこともある [Jurka and Mi
kahanljaia, J. Mol. Evolution 32:105-121 (1991) 、ここに参考のため援用す
る；Claveria and Makalowski, Nature 371:751-752 (1994)、ここに参考のため
援用する] 。Alu 上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の
残基1331-1550 に示されている。本発明のこの態様によると、核因子またはそれ
らの相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限されないが、Alu 上流モチ
ーフまたはシスエレメントに結合した核因子またはそれらの相同物の濃度を包含
する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができ
る。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様
では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態
様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００６８】 ビテロゲニン遺伝子結合性タンパク質(VBP) 上流モチーフまたはシスエレメン
トの共通配列は既に決定されている [Iyer et al., Molecular and Cellular Bi ology 11:4863-4875 (1991) 、ここに参考のため援用する] 。VBP 遺伝子の発現
は肝個体発生の初期に始まり、日周期コントロールを受けない。VBP を結合する
ことができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基
1786-1797 に示されている。本発明のこの態様によると、VBP またはその相同物
の生化学的性質または濃度 (これは、制限されないが、VBP 上流モチーフまたは
シスエレメントに結合したVBP またはその相同物の濃度を包含する) を変化させ
ることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬
剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような
薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このよう
な薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００６９】 大腸菌(Escherichia coli)および肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) のマルト
ースオペロンの全プロモーターの活性化に関与する構造モチーフ(Malt-CS) また
はシスエレメントは既に決定されている [Vidal-Ingigliardi et al., J. Mol. Biol. 218:323-334 (1991)、ここに参考のため援用する] 。上流Malt-CS モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基1832-1841 に示されてい
る。本発明のこの態様によると、上流Malt-CS モチーフまたはシスエレメントを
結合することができる分子の生化学的性質または濃度を変化させることができる
薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の
病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の
予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障
の治療に使用することができる。
【００７０】 エストロゲン受容体上流モチーフまたはシスエレメントの共通配列は既に決定
されている(ERE) [Forman et al., Mol. Endocrinology 4:1293-1301 (1990) 、
ここに参考のため援用する；de Verneuil et al., Nucleic Acid Res. 18:4489-
4497 (1990) 、ここに参考のため援用する；Gaub et al., Cell 63:1267-1276 (
1990) 、ここに参考のため援用する] 。エストロゲン受容体を結合することがで
きる上流モチーフまたはシスエレメントの半分に相当する配列が、図１の残基21
66-2195, 3413-3429および3892-3896 にそれぞれ示されている。本発明のこの態
様によると、上流モチーフまたはシスエレメントに結合したエストロゲン受容体
またはその相同物の生化学的性質または濃度を変化させることができる薬剤によ
り、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研
究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研
究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に
使用することができる。
【００７１】 転写活性および誘導性を決定するIg遺伝子エンハンサーのある種のタンパク質
結合部位 (NF変異原) が核因子と相互作用することは既に示されている [Lenard
o et al., Science 236:1573-1577 (1987)、ここに参考のため援用する] 。NF変
異原上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基2329-233
8 に示されている。本発明のこの態様によると、核因子またはそれらの相同物の
生化学的性質または濃度 (これは、制限されないが、NF変異原上流モチーフまた
はシスエレメントに結合した核因子またはそれらの相同物の濃度を包含する) を
変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。この
ような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、こ
のような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、
このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００７２】 c-myc (myc-PRF) 上流モチーフまたはシスエレメントの転写リプレッサーの共
通配列は既に決定されている [Kakkis et al., Nature 339:718-719 (1989)、こ
こに参考のため援用する] 。Myc-PRF は別の広く分布するタンパク質であるmyc-
CF1(共通因子１) と相互作用し、後者は近くで結合し、そしてこの会合はmyc-PR
F リプレッションにおいて重要である。myc-PRF を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基2403-2416 に示され
ている。本発明のこの態様によると、myc-PRF またはその相同物の生化学的性質
または濃度 (これは、制限されないが、myc-PRF 上流モチーフまたはシスエレメ
ントに結合したmyc-PRF またはその相同物の濃度を包含する) を変化させること
ができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、
緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を
緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤
を緑内障の治療に使用することができる。
【００７３】 ヒト転写因子アクチベータータンパク質２(AP2) は Sp1、核因子１(NF1) 、お
よびシミアンウイルス40移植(SV40 T)抗原結合部位に結合することが示された。
これは発展的に調節される [Williams and Tijan, Gene Dev. 5:670-682 (1991)
、ここに参考のため援用する；Mitchell et al., Gene Dev. 5:105-119 (1991)
、ここに参考のため援用する；Coutois et al., Nucleic Acid Research 18:57-
64 (1990) 、ここに参考のため援用する；Comb et al., Nucleic Acid Research 18:3975-3982 (1990)、ここに参考のため援用する；Winings et al., Nucleic Acid Research 19:3709-3714 (1991) 、ここに参考のため援用する] 。AP2 を結
合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１
の残基2520-2535 および5170-5187 にそれぞれ示されている。本発明のこの態様
によると、AP2 またはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限され
ないが、上流モチーフまたはシスエレメントに結合したAP2 またはその相同物の
濃度を包含する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行う
ことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に有用となりうる。別の
態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別
の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００７４】 ショウジョウバエRNA ポリメラーゼII熱ショック転写因子(HSTF)は、hsp 70遺
伝子の活性な転写に必要であることが示された転写因子である [Parker and Top
ol, Cell 37:273-283 (1984)、ここに参考のため援用する] 。HSTFを結合するこ
とができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基26
22-2635 および5105-5132 にそれぞれ示されている。本発明のこの態様によると
、HSTFまたはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限されないが、
HSTF上流モチーフまたはシスエレメントに結合したHSTFまたはその相同物の濃度
を包含する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うこと
ができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に有用となりうる。別の態様
では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態
様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００７５】 SBF に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残
基2733-2743 に示されている [Shore et al., EMBO J. 6:461-467 (1987)、ここ
に参考のため援用する] 。本発明のこの態様によると、SBF 上流モチーフまたは
シスエレメントを結合する分子の生化学的性質または濃度を変化させることがで
きる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内
障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内
障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑
内障の治療に使用することができる。
【００７６】 少なくとも六つのタンパク質からなるファミリーを認識するNF1 モチーフまた
はシスエレメントが既に同定されている [Courtois et al., Nucleic Acid Res. 18:57-64 (1990)、ここに参考のため援用する；Mul et al., J. Virol. 64:551
0-5518 (1990) 、ここに参考のため援用する；Rossi et al., Cell 52:405-414
(1988)、ここに参考のため援用する；Gounari et al., EMBO J. 10:559-566 (19
90) 、ここに参考のため援用する；Goyal et al., Mol. Cell Biol. 10:1041-10
48 (1990) 、ここに参考のため援用する；Mermond et al., Nature 332:557-561
(1988) 、ここに参考のため援用する；Gronostajski et al., Molecular and C ellular Biology 5::964-971 (1985) 、ここに参考のため援用する；Henninghau
sen et al., EMBO J. 5:1367-1371 (1986) 、ここに参考のため援用する；Chod
osh et al., Cell 53:11-24 (1988)、ここに参考のため援用する] 。NF1 タンパ
ク質は二量体として (該モチーフがパリンドローム＜回文構造＞である場合) ま
たは単一分子として (該モチーフがパリンドロームではない場合) NF1モチーフ
またはシスエレメントに結合しよう。NF1 タンパク質は TGFβにより誘導される
[Faisst and Meyer, Nucleic Acid Research 20:3-26 (1992)、ここに参考のた
め援用する] 。NF1 を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメント
に相当する配列が、図１の残基2923-2938, 4143-4176, および4886-4900 にそれ
ぞれ示されている。本発明のこの態様によると、NF1 またはその相同物の生化学
的性質または濃度 (これは、制限されないが、上流モチーフまたはシスエレメン
トに結合したNF1 またはその相同物の濃度を包含する) を変化させることができ
る薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障
の病因の研究に有用となりうる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知
の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治
療に使用することができる。
【００７７】 ウサギ主要組織適合遺伝子複合体(MHC) クラスII遺伝子の保存調節配列(NF-MH
CIIA/B) は２つの別個の核因子NF-MHCIIA とNF-MHCIIB を結合する責務を果たし
、クラスII遺伝子−例、Ｂリンパ球のMHC クラスII遺伝子−の共役発現(coordin
ate expression) の調節に関与すると考えられている [Sittisombut, Molecular and Cellular Biology 5:2034-2041 (1988)、ここに参考のため援用する] 。NF
-MHCIIA/B 上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基29
36-2944 に示されている。本発明のこの態様によると、NF-MHCIIA もしくはNF-M
HCIIB またはそれらの相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限されない
が、NF-MHCIIA/B 上流モチーフまたはシスエレメントに結合したNF-MHCIIA もし
くはNF-MHCIIB またはそれらの相同物の濃度を包含する) を変化させることがで
きる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内
障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内
障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑
内障の治療に使用することができる。
【００７８】 PEA 1 結合性モチーフまたはシスエレメントは既に同定されている [Piette a
nd Yaniv, EMBO J. 5:1331-1337 (1987)、ここに参考のため援用する] 。PEA1タ
ンパク質はポリオーマウイルスとc-fos エンハンサーの両方に結合すると報告さ
れている転写因子である。PEA1を結合することができる上流モチーフまたはシス
エレメントに相当する配列が、図１の残基3285-3298 に示されている。本発明の
この態様によると、PEA1またはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、
制限されないが、上流モチーフまたはシスエレメントに結合したPEA1またはその
相同物の濃度を包含する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転
写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用すること
ができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障予知の研究にも使用すること
ができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができ
る。
【００７９】 保存シス作動性調節エレメント(ICS) はMHC クラスＩおよび他の遺伝子のイン
ターフェロン(IFN) 媒介転写増進に関与するリンパ球および繊維芽細胞に存在す
るトランス作動性構成的核因子を結合することが示されている [Shirayoshi et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5884-5888 (1988) 、ここに参考のため
援用する] 。ICS 上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の
残基3688-3699 に示されている。本発明のこの態様によると、核因子またはそれ
らの相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限されないが、ICS 上流モチ
ーフまたはシスエレメントに結合した核因子またはそれらの相同物の濃度を包含
する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができ
る。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様
では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態
様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００８０】 ISGF2 上流モチーフまたはシスエレメントの共通配列は既に決定されている [
Iman et al., Nucleic Acids Res. 18:6573-6580 (1990) 、ここに参考のため援
用する；Harada et al., Cell 63:303-312 (1990) 、ここに参考のため援用する
；Yu-Lee et al., Mol. Cell Biol. 10:3087-3094 (1990)、ここに参考のため援
用する；Pine et al., Mol. Cell Biol. 10:2448-2457 (1990)、ここに参考のた
め援用する] 。ISGF2 はインターフェロンαおよびγ、プロラクチンならびにウ
イルス感染により誘導される。ISGF2 を結合することができる上流モチーフまた
はシスエレメントに相当する配列が、図１の残基4170-4179 に示されている。本
発明のこの態様によると、ISGF2 またはその相同物の生化学的性質または濃度 (
これは、制限されないが、上流モチーフまたはシスエレメントに結合したISGF2
またはその相同物の濃度を包含する) を変化させることができる薬剤により、TI
GR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使
用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも
使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用す
ることができる。
【００８１】 亜鉛を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配
列が、図１の残基4285-4292 に示されている。本発明のこの態様によると、亜鉛
の生化学的性質または濃度を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転
写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用すること
ができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用するこ
とができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することがで
きる。
【００８２】 CAP/CRP-galOに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、
図１の残基4379-4404 に示されている [Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:5090-5094 (1979)、ここに参考のため援用する] 。本発明のこの
態様によると、CAP/CRP-galO上流モチーフまたはシスエレメントを結合する分子
の生化学的性質または濃度を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転
写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用すること
ができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用するこ
とができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することがで
きる。
【００８３】 ヒト転写因子アクチベータータンパク質１(AP1) は、ストロメライシン、c-fo
s 、α1-抗トリプシンおよびコラゲナーゼのような形質転換細胞中に高度に発現
する遺伝子を調節することが示されている転写因子である [Gutman and Wasylyk
, EMBO J. 9.7 2241-2246 (1990)、ここに参考のため援用する；Martin et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5839-5843 (1988) 、ここに参考のため援用
する；Jones et al., Genes and Develpment 2:267-281 (1988) 、ここに参考の
ため援用する；Faisst and Meyer, Nucleic Acid Research 20:3-26 (1992)、こ
こに参考のため援用する；Kim et al., Molecular and Cellular Biology 10:14
92-1497 (1990)、ここに参考のため援用する；Baumhueter et al., EMBO J. 7:2
485-2493 (1988) 、ここに参考のため援用する] 。AP1 転写因子は 12-O-テトラ
デカノイルホルボール-13-アセテート(TPA) により活性化される遺伝子と関連づ
けられてきた [Gutman and Wasylyk, EMBO J. 7:2241-2246 (1990)] 。AP1 を結
合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１
の残基4428-4434 および4627-4639 にそれぞれ示されている。本発明のこの態様
によると、AP1 またはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限され
ないが、上流モチーフまたはシスエレメントに結合したAP1 またはその相同物の
濃度を包含する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行う
ことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる
。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができ
る。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００８４】 Ｙ染色体遺伝子の性決定領域、sry は、精巣分化直前の短期間だけマウス胎児
に発現する。SRY はsry 遺伝子のCACAリッチ領域に結合することが知られている
DNA 結合性タンパク質である [Vriz et al., Biochemistry and Molecular Biol ogy International 37:1137-1146 (1995) 、ここに参考のため援用する] 。SRY
を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、
図１の残基4625-4634 に示されている。本発明のこの態様によると、SRY または
その相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限されないが、上流モチーフ
またはシスエレメントに結合したSRY またはその相同物の濃度を包含する) を変
化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このよ
うな薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、この
ような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、こ
のような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００８５】 GC2-GHに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の
残基4689-4711 に示されている [West et al., Molecular and Cellular Biolog y 7:1193-1197 (1987)、ここに参考のため援用する] 。本発明のこの態様による
と、GC2-GHまたはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限されない
が、上流モチーフまたはシスエレメントに結合したGC2-GHまたはその相同物の濃
度を包含する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うこ
とができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。
別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる
。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００８６】 PEA 3 結合性モチーフまたはシスエレメントは既に同定されている [Martin e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5839-5843 (1988) 、ここに参考のた
め援用する；Gutman and Wasylyk, EMBO J. 7:2241-2246 (1990)、ここに参考の
ため援用する] 。PEA3タンパク質はAP1 様タンパク質と相互作用することが報告
されている転写因子である [Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85
:5839-5843 (1988) 、ここに参考のため援用する] 。PEA3を結合することができ
る上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基4765-4769
に示されている。本発明のこの態様によると、PEA3またはその相同物の生化学的
性質または濃度 (これは、制限されないが、上流モチーフまたはシスエレメント
に結合したPEA3またはその相同物の濃度を包含する) を変化させることができる
薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の
病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障予
知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の
治療に使用することができる。
【００８７】 哺乳動物散在性反復(MIR) は、哺乳動物遺伝子のコーディングおよびプロセシ
ング配列に関与するエレメントである。MIR エレメントは少なくとも長さが260
bpで哺乳動物ゲノム内のコピー数が約105 である [Murnane et al., Nucleic Ac ids Research 15:2837-2839 (1995)、ここに参考のため援用する] 。MIR 上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基4759-4954 に示され
ている。本発明のこの態様によると、核因子またはそれらの相同物の生化学的性
質または濃度 (これは、制限されないが、MIR 上流モチーフまたはシスエレメン
トに結合した核因子またはそれらの相同物の濃度を包含する) を変化させること
ができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、
緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を
緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤
を緑内障の治療に使用することができる。
【００８８】 正常な肝臓および分化肝ガンの細胞系は、フィブリノーゲンのαおよびβ鎖な
らびにα1 抗トリプシンのプロモーター内のシス作動性エレメント配列を結合す
る肝細胞特異的核因子(HNF-1) を含んでいる [Baumhueter et al., EMBO J. 8:2
485-2493、ここに参考のため援用する] 。HNF-1 上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列が、図１の残基4923-4941 に示されている。本発明のこの態
様によると、HNF-1 またはその相同物の生化学的性質または濃度 (これは、制限
されないが、HNF-1 上流モチーフまたはシスエレメントに結合したHNF-1 または
その相同物の濃度を包含する) を変化させることができる薬剤により、TIGR分子
の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用する
ことができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障予知の研究にも使用する
ことができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することが
できる。
【００８９】 多くのシスエレメントまたは上流モチーフがステロイドおよび甲状腺ホルモン
による遺伝子調節と関連づけられてきた (例、グルココルチコイドおよびエスト
ロゲン)[Beato, Cell 56:335-344 (1989) 、ここに参考のため援用する；Brent
et al., Molecular Endocrinology 89:1996-2000 (1989) 、ここに参考のため援
用する；Glass et al., Cell 54:313-323 (1988)、ここに参考のため援用する；
Evans, Science 240:889-895 (1988) 、ここに参考のため援用する] 。
【００９０】 甲状腺受容体上流モチーフまたはシスエレメントに対する共通配列(TRE) は既
に決定されている [Beato, Cell 56:335-344 (1989) 、ここに参考のため援用す
る] 。甲状腺受容体上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列が、図１
の残基5151-5156 に示されている。甲状腺ホルモンは甲状腺受容体上流モチーフ
またはシスエレメントを含む遺伝子を調節することができる [Glass et al., Ce ll 54:313-323 (1988)、ここに参考のため援用する] 。甲状腺ホルモンはTIGRの
負の調節を行うことができる。本発明のこの態様によると、甲状腺受容体上流モ
チーフまたはシスエレメントを結合することができる分子の生化学的性質または
濃度を変化させることができる薬剤により、TIGR分子の転写を行うことができる
。このような薬剤は、緑内障の病因の研究に使用することができる。別の態様で
は、このような薬剤を緑内障の予知の研究にも使用することができる。別の態様
では、このような薬剤を緑内障の治療に使用することができる。
【００９１】 NFκB はＴ細胞活性化およびサイトカイン調節を始めとする多くの生物学的プ
ロセスに関連づけられると報告されている転写因子である [Lenardo et al., Ce ll 58:227-229 (1989)、ここに参考のため援用する] 。NFκB を結合することが
できる共通上流モチーフまたはシスエレメントは既に報告されている [Lenardo
et al., Cell 58:227-229 (1989)] 。NFκB を結合することができる上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列が、図１の残基5166-5175 に示されてい
る。本発明のこの態様によると、NFκB またはその相同物の生化学的性質または
濃度 (これは、制限されないが、上流モチーフまたはシスエレメントに結合した
NFκB またはその相同物の濃度を包含する) を変化させることができる薬剤によ
り、TIGR分子の転写を行うことができる。このような薬剤は、緑内障の病因の研
究に使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の予知の研
究にも使用することができる。別の態様では、このような薬剤を緑内障の治療に
使用することができる。
【００９２】 本発明の核酸の使用例 １または２以上の薬剤が核酸分子である場合、かかる核酸分子はTIGRプロモー
ター、TIGR cDNA 、TIGRイントロン、TIGRエキソンまたはTIGR遺伝子の任意の部
分に対応するセンス、アンチセンスまたはトリプレックス (三重らせん) オリゴ
ヌクレオチドでよい。一部の態様では、これらの核酸は、例えば、配列番号６〜
25または33のように、約20塩基の長さでよい。別の状況では、核酸はわずか約８
塩基の長さでもよい。短い核酸は、既知のハイブリッド形成による配列決定法に
よる場合のように、特定の配列の存在を決定するために固定化した核酸へのハイ
ブリッド形成において特に有用なことがある。
【００９３】 本発明のTIGRプロモーター、またはその断片は、適当なベクター中にクローニ
ングして、マーカー遺伝子 [例、ホタル・ルシフェラーゼ (de Wet, Mol. Cell Biol. 7:725-737 (1987)、ここに参考のため援用する) またはGUS (Jefferson e
t al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987) 、ここに参考のため援用する] の発現を促
進するのに利用できる。
【００９４】 本発明の別の態様では、TIGRプロモーターを適当なベクター中にクローニング
して、適当な真核または原核宿主細胞 [例、ヒト小柱網細胞、チャイニーズ・ハ
ムスター細胞、大腸菌(E. coli)]中でのTIGR遺伝子の発現を促進するのに利用で
きる。本発明の別の態様では、TIGRプロモーターを適当なベクター中にクローニ
ングして、適当な真核または原核宿主細胞 [例、ヒト小柱網細胞系、チャイニー
ズ・ハムスター細胞、大腸菌] 中での同種 (ホモローガス) または異種遺伝子の
発現を促進するのに利用できる。
【００９５】 また、TIGRプロモーター、約10 bp から約1.6 kbまでのTIGR 5' 調節領域の領
域、または組織特異的発現を付与するTIGR 5' 調節領域の領域を、DNA 構築物、
ベクター、および細胞中で使用して、操作可能に連結した遺伝子を発現すること
ができる。例えば、これらのTIGR配列は、トランスジェニック動物を作製するの
に使用するベクター中の連結された遺伝子の発現を制御することができる。この
ようにして、組織特異的に遺伝子を発現する細胞または動物を作製することがで
きる。１態様は、TIGR 5' 調節配列を有する導入遺伝子を用いて、小柱網内また
は小柱網細胞内への治療遺伝子の発現を命令するという、緑内障またはIOP 疾患
の治療に対する遺伝子治療手法を含む。トランスジェニック技術を用いて実験動
物モデルを作製することもできる。これらの動物モデル、またはそれから得たか
若しくはこれらのTIGR配列を含む細胞は、TIGRの発現を変調させる化合物、特に
TIGR発現のステロイド調節に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法に使
用することができる。これらの方法は、治療用または診断用薬剤を生じ、これら
の薬剤も特に本発明に包含される。
【００９６】 このように、TIGR 5' 調節領域の少なくとも一部を含む導入DNA を有するトラ
ンスジェニック動物は、本発明に特に包含される。好ましい態様は、配列番号37
もしくは38、またはその変異物、または配列番号３もしくは34の領域、の5'調節
配列、特に組織特異的発現を付与する配列を有する。当業者はトランスジェニッ
ク構築物、ベクターおよび動物の作製について熟知している (Ausubel et al.,
Current Protocols in Molecular Biologyを参照) 。
【００９７】 また、言及したように、5'調節領域はDNA 結合タンパク質のスクリーニングお
よび同定にも使用することができる。5'調節領域へのタンパク質または細胞成分
の特異的結合を検出することができる。実施例５を参照。結合を変調させる化合
物のスクリーニング法も、本発明の5'調節領域、またはこの領域を含むベクター
もしくは細胞を用いて作製することができる。発現を増加または低下させるDNA
結合タンパク質を同定することができる。例えば、HeLa細胞のように、TIGRの自
然の発現を示さない細胞は、TIGRの発現を阻害するタンパク質または細胞成分を
有している可能性がある。TM細胞のような細胞は、TIGRの発現を可能にするか、
またはステロイドもしくはデキサメタゾンのような他の薬剤に応答してTIGR発現
のレベルを増大させるDNA 結合タンパク質または細胞成分を有している可能性が
ある。このように、本発明は、TIGRの発現、またはTIGR 5' 調節領域の制御下で
の遺伝子の発現を変調させるタンパク質または細胞成分を検出および同定する多
数の方法を包含する。また、その変調に影響を与える化合物を検出する方法、な
らびにこれらの方法から同定される治療用および診断用薬剤、も同様に包含され
る。
【００９８】 専門家は、巨大分子 (例、DNA 分子、プラスミド等) の構築、操作および分離
、組換え生物の発生、ならびにクローンのスクリーニングおよび分離のための具
体的条件および手法を説明した標準的な情報源について熟知している (例えば、
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 中, Cold Spring
Harbor Press (1989) 、ここにその全体を参考のために援用する；Old and Prim
rose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engine ering 中, Blackwell (1994)、ここに参考のために援用する) 。
【００９９】 本発明のTIGRプロモーター、またはその任意の部分、またはその約10〜約500
塩基の断片は、ゲルシフト (ゲル遅延) もしくはバンドシフトアッセイ [Old an
d Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering 中, Blackwell (1994)] に使用してもよい。本発明で同定された任
意のシスエレメントを含む核酸または断片を、このシスエレメントを結合するこ
とができるタンパク質を分離するためにゲルシフトもしくはバンドシフトアッセ
イに使用することができる。
【０１００】 適当なDNA 断片または分子は、下記の１または２以上の配列を含むか、または
該配列からなる：図１の残基 370-388および4491-4502 にそれぞれ示されるよう
なPRL-FP111 に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１
の残基433-445 に示されるようなGR/PR を結合することができる上流モチーフま
たはシスエレメントに相当する配列、図１の残基 446-451, 1288-1293, 3597-36
02, 4771-4776,および5240-5245 にそれぞれ示されるような上流シェアストレス
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基574-600, 1042-1056
, 2444-2468, 2442-2469, 3536-3563, 4574-4593, 4595-4614, 4851-4865, 4844
-4864, 5079-5084, 5083-5111 にそれぞれ示されるようなグルココルチコイド応
答上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基735-746 に示
されるようなCBE を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに
相当する配列、図１の残基774-795 に示されるようなNFE を結合することができ
る上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基843-854 に示
されるようなKTF.1-CSを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメン
トに相当する配列、図１の残基987-1026に示されるようなPRE を結合することが
できる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1373-138
8 に示されるようなETF-EGFRを結合することができる上流モチーフまたはシスエ
レメントに相当する配列、図１の残基1447-1456 に示されるようなSRE-cFosを結
合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の
残基1331-1550 に示されるようなAlu を結合することができる上流モチーフまた
はシスエレメントに相当する配列、図１の残基1786-1797 に示されるようなVBP
を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図
１の残基1832-1841 に示されるようなMalt-CS を結合することができる上流モチ
ーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2167-2195, 3413-3429,
および3892-3896 にそれぞれ示されるようなERE を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2329-2338 に示される
ようなNF変異原を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相
当する配列、図１の残基2403-2416 に示されるようなmyc-PRF を結合することが
できる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2520-253
5 および5170-5187 にそれぞれ示されるようなAP2 を結合することができる上流
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2622-2635 および51
05-5132 にそれぞれに示されるようなHSTFを結合することができる上流モチーフ
またはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2733-2743 に示されるような
SBF に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基29
23-2938, 4144-4157, および4887-4900 にそれぞれに示されるようなNF-1を結合
することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残
基2936-2944 に示されるようなNF-MHCIIA/B を結合することができる上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基3285-3298 に示されるよう
なPEA1を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配
列、図１の残基3688-3699 に示されるようなICS を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4170-4179 に示される
ようなISGF2 を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当
する配列、図１の残基4285-4293 に示されるような亜鉛を結合することができる
上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4379-4404 に示
されるようなCAP/CRP-galOに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当す
る配列、図１の残基4428-4434 および4627-4639 にそれぞれ示されるようなAP1
を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図
１の残基4625-4634 に示されるようなSRY を結合することができる上流モチーフ
またはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4678-4711 に示されるような
GC2 に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基47
65-4769 に示されるようなPEA3を結合することができる上流モチーフまたはシス
エレメントに相当する配列、図１の残基4759-4954 に示されるようなMIR を結合
することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残
基4923-4941 に示されるようなNF-HNF-1を結合することができる上流モチーフま
たはシスエレメントに相当する配列、図１の残基5151-5156 に示されるような甲
状腺受容体上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、ならびに図１の
残基5166-5175 に示されるようなNFκB を結合することができる上流モチーフま
たはシスエレメントに相当する配列。
【０１０１】 本発明の好ましい種類の薬剤は、「TIGRプロモーター」または5'フランキング
遺伝子配列の全部または断片を包含する核酸分子を含む。ここで用いた意味では
、「TIGRプロモーター」または「プロモーター」なる用語は、mRNA産生を制御す
る調節配列を意味するという、拡張された意味で使用している。従って、TIGRプ
ロモーター配列は、TIGR遺伝子産物mRNAの転写の開始、速度または量に機能的に
影響する配列により同定することができる。かかる配列としては、RNA ポリメラ
ーゼ結合性部位、グルココルチコイド応答エレメント、エンハンサー等が挙げら
れる。これらの配列は、ここに開示した具体的に開示された5'上流領域配列の範
囲内に見出されるのが好ましく、最も好ましくは転写開始より5'側の約500 塩基
の領域の範囲内または転写開始部位の5'側の約300 塩基の領域の範囲内に見出さ
れうる。しかし、他のゲノム配列がTIGRプロモーターであってもよい。離れたプ
ロモーターエレメントを同定するための本技術分野で公知の方法を、開示された
配列および核酸と共に使用して、これらの離れたTIGRプロモーター配列を同定お
よび規定することができる。緑内障の存在ならびに緑内障の重篤度もしくはそれ
に対する罹患性を診断するのに、このようなTIGR分子を使用することができる。
かかる分子はDNA とRNA のいずれでもよい。
【０１０２】 TIGR遺伝子の機能的調節領域は、TIGRプロモーター配列であってもよい。これ
は、転写に影響することが実証された多数の既知タンパク質または分子に対する
転写エンハンサー部位および転写阻害剤部位または結合部位を含んでいてもよい
。多数の調節エレメントが後で説明されており、それらの活性の同等なものが、
TIGR遺伝子の機能的調節領域を表すことができる。これらの調節領域の活性およ
び機能を同定および検出する方法は本技術分野では知られている。
【０１０３】 断片核酸分子は、配列番号１または配列番号３または配列番号４または配列番
号５のかなりの部分か、さらには大部分、をコードするものでよい。或いは、断
片は、より小さなオリゴヌクレオチド (ヌクレオチド残基数が約15〜約250 、よ
り好ましくは約15〜約30) を含むものでもよい。かかるオリゴヌクレオチドとし
ては、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番
号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番
号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番
号23、配列番号24、配列番号25が挙げられる。
【０１０４】 或いは、このようなオリゴヌクレオチドは、下記の１または２以上の配列を含
むか、または該配列からなる、TIGRプロモーター、TIGRイントロン、TIGRエキソ
ン、TIGR cDNA およびTIGR下流配列のいずれかに由来するものでもよい：図１の
残基 370-388および4491-4502 にそれぞれ示されるようなPRL-FP111 に特有の上
流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基433-445 に示され
るようなGR/PR を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相
当する配列、図１の残基 446-451, 1288-1293, 3597-3602, 4771-4776,および52
40-5245 にそれぞれ示されるような上流シェアストレスモチーフまたはシスエレ
メントに相当する配列、図１の残基574-600, 1042-1056, 2444-2468, 2442-2469
, 3536-3563, 4574-4593, 4595-4614, 4851-4865, 4844-4864, 5079-5084, 5083
-5111 にそれぞれ示されるようなグルココルチコイド応答上流モチーフまたはシ
スエレメントに相当する配列、図１の残基735-746 に示されるようなCBE を結合
することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残
基774-795 に示されるようなNFE を結合することができる上流モチーフまたはシ
スエレメントに相当する配列、図１の残基843-854 に示されるようなKTF.1-CSを
結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１
の残基987-1026に示されるようなPRE を結合することができる上流モチーフまた
はシスエレメントに相当する配列、図１の残基1373-1388 に示されるようなETF-
EGFRを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列
、図１の残基1447-1456 に示されるようなSRE-cFosを結合することができる上流
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1331-1550 に示され
るようなAlu を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当
する配列、図１の残基1786-1797 に示されるようなVBP を結合することができる
上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1832-1841 に示
されるようなMalt-CS を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメン
トに相当する配列、図１の残基2167-2195, 3413-3429, および3892-3896 にそれ
ぞれ示されるようなERE を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列、図１の残基2329-2338 に示されるようなNF変異原を結合す
ることができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基
2403-2416 に示されるようなmyc-PRF を結合することができる上流モチーフまた
はシスエレメントに相当する配列、図１の残基2520-2535 および5170-5187 にそ
れぞれ示されるようなAP2 を結合することができる上流モチーフまたはシスエレ
メントに相当する配列、図１の残基2622-2635 および5105-5132 にそれぞれに示
されるようなHSTFを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに
相当する配列、図１の残基2733-2743 に示されるようなSBF に特有の上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2923-2938, 4144-4157, お
よび4887-4900 にそれぞれに示されるようなNF-1を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2936-2944 に示される
ようなNF-MHCIIA/B を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメント
に相当する配列、図１の残基3285-3298 に示されるようなPEA1を結合することが
できる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基3688-369
9 に示されるようなICS を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列、図１の残基4170-4179 に示されるようなISGF2 を結合する
ことができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基42
85-4293 に示されるような亜鉛を結合することができる上流モチーフまたはシス
エレメントに相当する配列、図１の残基4379-4404 に示されるようなCAP/CRP-ga
lOに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4428
-4434 および4627-4639 にそれぞれ示されるようなAP1 を結合することができる
上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4625-4634 に示
されるようなSRY を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに
相当する配列、図１の残基4678-4711 に示されるようなGC2 に特有の上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4765-4769 に示されるよう
なPEA3を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配
列、図１の残基4759-4954 に示されるようなMIR を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4923-4941 に示される
ようなNF-HNF-1を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相
当する配列、図１の残基5151-5156 に示されるような甲状腺受容体上流モチーフ
またはシスエレメントに相当する配列、ならびに図１の残基5166-5175 に示され
るようなNFκB を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相
当する配列。このような目的にとって、オリゴヌクレオチドは、TIGR遺伝子に遺
伝的または物理的に連結した核酸分子に特異的にハイブリッド形成することがで
きるものでなければならない。ここで用いた「連結」なる用語は、遺伝的、物理
的または操作可能に(operably)連結していることを意味する。
【０１０５】 ここで用いた意味では、２つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成する
ことができるが、非TIGR核酸分子とインキュベーションした時には二本鎖構造を
形成することができない場合、これら２つの核酸分子は互いに特異的にハイブリ
ッド形成が可能であるという。ある核酸分子が別の核酸分子の「相補物」である
というのは、それらが完全な相補性を示す場合である。ここで使った意味では、
分子の一方の全てのヌクレオチドが他方の或るヌクレオチドと相補的である場合
に、これらの分子は「完全な相補性」を示すという。２つの分子が少なくとも通
常の「低緊縮性」条件下では互いにアニールされたままにしておくことができる
程度の十分な安定性で互いにハイブリッド形成が可能である場合に、これら２分
子は「最低限に相補性」であるという。また、２つの分子が通常の「高緊縮性」
条件下では互いにアニールされたままにしておくことができる程度の十分な安定
性で互いにハイブリッド形成が可能である場合に、これら２分子は「相補性」で
あるという。通常の緊縮性の条件は、Sambrook, J.他 [Molecular Cloning, a L aboratory Manual 第２版中，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
New York (1989)]およびHaymes, B.D.他 [Nucleic Acid Hybridization, A Prac tical Approach 中, IRL Press, Washington, DC (1985)](両者ともここに参考の
ために援用する) により説明されている。従って、完全な相補性から逸脱するこ
とも、その逸脱により分子の持つ二本鎖構造の形成能が完全に消失することがな
い限り、許容される。即ち、オリゴヌクレオチドがプライマーとして作用するに
は、採用する特定の溶媒および塩濃度の条件下で、これが安定な二本鎖構造を形
成することができる程度に十分な配列の相補性があるだけでよい。
【０１０６】 診断および予知の用途に加え、かかるオリゴヌクレオチドは他のTIGR核酸分子
を得るために使用することもできる。このような分子としては、ヒト以外の動物
(特に、ネコ、サル、齧歯動物およびイヌ) のTIGRをコードする核酸分子、その
断片、ならびにそれらのプロモーターおよびフランキング配列が挙げられる。こ
のような分子は、上記プライマーを用いて、ヒト以外の種から得たcDNAもしくは
ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより容易に得ることができる。
このようなライブラリーを作成する方法は当分野でよく知られている。
【０１０７】 安定なハイブリッド形成には完全な相補性は必要ないので、上記の構造類似体
は、それらのヌクレオチド配列が下記の配列番号のヌクレオチド配列から、また
は下記の図１に示す配列からなる分子から異なっていてもよい：配列番号１、配
列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配
列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配
列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配
列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、ま
たは図１の残基 370-388および4491-4502 にそれぞれ示されるようなPRL-FP111
に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基433-44
5 に示されるようなGR/PR を結合することができる上流モチーフまたはシスエレ
メントに相当する配列、図１の残基 446-451, 1288-1293, 3597-3602, 4771-477
6,および5240-5245 にそれぞれ示されるような上流シェアストレスモチーフまた
はシスエレメントに相当する配列、図１の残基574-600, 1042-1056, 2444-2468,
2442-2469, 3536-3563, 4574-4593, 4595-4614, 4851-4865, 4844-4864, 5079-
5084, 5083-5111 にそれぞれ示されるようなグルココルチコイド応答上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基735-746 に示されるような
CBE を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列
、図１の残基774-795 に示されるようなNFE を結合することができる上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基843-854 に示されるような
KTF.1-CSを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する
配列、図１の残基987-1026に示されるようなPRE を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1373-1388 に示される
ようなETF-EGFRを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相
当する配列、図１の残基1447-1456 に示されるようなSRE-cFosを結合することが
できる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1331-155
0 に示されるようなAlu を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列、図１の残基1786-1797 に示されるようなVBP を結合するこ
とができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1832
-1841 に示されるようなMalt-CS を結合することができる上流モチーフまたはシ
スエレメントに相当する配列、図１の残基2167-2195, 3413-3429, および3892-3
896 にそれぞれ示されるようなERE を結合することができる上流モチーフまたは
シスエレメントに相当する配列、図１の残基2329-2338 に示されるようなNF変異
原を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、
図１の残基2403-2416 に示されるようなmyc-PRF を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2520-2535 および5170
-5187 にそれぞれ示されるようなAP2 を結合することができる上流モチーフまた
はシスエレメントに相当する配列、図１の残基2622-2635 および5105-5132 にそ
れぞれに示されるようなHSTFを結合することができる上流モチーフまたはシスエ
レメントに相当する配列、図１の残基2733-2743 に示されるようなSBF に特有の
上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2923-2938, 414
4-4157, および4887-4900 にそれぞれに示されるようなNF-1を結合することがで
きる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2936-2944
に示されるようなNF-MHCIIA/B を結合することができる上流モチーフまたはシス
エレメントに相当する配列、図１の残基3285-3298 に示されるようなPEA1を結合
することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残
基3688-3699 に示されるようなICS を結合することができる上流モチーフまたは
シスエレメントに相当する配列、図１の残基4170-4179 に示されるようなISGF2
を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図
１の残基4285-4293 に示されるような亜鉛を結合することができる上流モチーフ
またはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4379-4404 に示されるような
CAP/CRP-galOに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１
の残基4428-4434 および4627-4639 にそれぞれ示されるようなAP1 を結合するこ
とができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4625
-4634 に示されるようなSRY を結合することができる上流モチーフまたはシスエ
レメントに相当する配列、図１の残基4678-4711 に示されるようなGC2 に特有の
上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4765-4769 に示
されるようなPEA3を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに
相当する配列、図１の残基4759-4954 に示されるようなMIR を結合することがで
きる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4923-4941
に示されるようなNF-HNF-1を結合することができる上流モチーフまたはシスエレ
メントに相当する配列、図１の残基5151-5156 に示されるような甲状腺受容体上
流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、ならびに図１の残基5166-517
5 に示されるようなNFκB を結合することができる上流モチーフまたはシスエレ
メントに相当する配列。このように、本発明のTIGR核酸分子は、TIGR核酸分子と
は特異的にハイブリッド形成することができるが「完全な相補性」は持たなくて
もよい分子、をも包含するものである。
【０１０８】 上記の核酸分子を得るには多様な方法のどれを用いてもよい [Elles, Methods
in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana
Press (1996)、ここに参考のため援用する] 。下記の配列を用いて、TIGRプロモ
ーターまたは任意のTIGR上流モチーフもしくはTIGR cDNA の部分の全部もしくは
任意の部分を合成することができる [Zamechik et al., Proc. Natl. Acad. Sci . (U.S.A.) 83:4143 (1986); Goodchild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S .A.) 85:5507 (1988); Wickstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 8
5:1028; Holt, J.T. et al., Molec. Cell. Biol. 8:963 (1988); Gerwirtz, A.
M. et al., Science 242:1303 (1988); Anfosssi, G. et al., Proc. Natl. Aca d. Sci. (U.S.A.) 86:3379 (1989); Becker,D. et al., EMBO J. 8:3679 (1989)
; これら文献の全部を参考のためここに援用する］：配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、
配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、
配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、
配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号33、
図１の残基 370-388および4491-4502 にそれぞれ示されるようなPRL-FP111 に特
有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基433-445 に
示されるようなGR/PR を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメン
トに相当する配列、図１の残基 446-451, 1288-1293, 3597-3602, 4771-4776,お
よび5240-5245 にそれぞれ示されるような上流シェアストレスモチーフまたはシ
スエレメントに相当する配列、図１の残基574-600, 1042-1056, 2444-2468, 244
2-2469, 3536-3563, 4574-4593, 4595-4614, 4851-4865, 4844-4864, 5079-5084
, 5083-5111 にそれぞれ示されるようなグルココルチコイド応答上流モチーフま
たはシスエレメントに相当する配列、図１の残基735-746 に示されるようなCBE
を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図
１の残基774-795 に示されるようなNFE を結合することができる上流モチーフま
たはシスエレメントに相当する配列、図１の残基843-854 に示されるようなKTF.
1-CSを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列
、図１の残基987-1026に示されるようなPRE を結合することができる上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1373-1388 に示されるよう
なETF-EGFRを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当す
る配列、図１の残基1447-1456 に示されるようなSRE-cFosを結合することができ
る上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1331-1550 に
示されるようなAlu を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメント
に相当する配列、図１の残基1786-1797 に示されるようなVBP を結合することが
できる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1832-184
1 に示されるようなMalt-CS を結合することができる上流モチーフまたはシスエ
レメントに相当する配列、図１の残基2167-2195, 3413-3429, および3892-3896
にそれぞれ示されるようなERE を結合することができる上流モチーフまたはシス
エレメントに相当する配列、図１の残基2329-2338 に示されるようなNF変異原を
結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１
の残基2403-2416 に示されるようなmyc-PRF を結合することができる上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2520-2535 および5170-518
7 にそれぞれ示されるようなAP2 を結合することができる上流モチーフまたはシ
スエレメントに相当する配列、図１の残基2622-2635 および5105-5132 にそれぞ
れに示されるようなHSTFを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列、図１の残基2733-2743 に示されるようなSBF に特有の上流
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2923-2938, 4144-41
57, および4887-4900 にそれぞれに示されるようなNF-1を結合することができる
上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2936-2944 に示
されるようなNF-MHCIIA/B を結合することができる上流モチーフまたはシスエレ
メントに相当する配列、図１の残基3285-3298 に示されるようなPEA1を結合する
ことができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基36
88-3699 に示されるようなICS を結合することができる上流モチーフまたはシス
エレメントに相当する配列、図１の残基4170-4179 に示されるようなISGF2 を結
合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の
残基4285-4293 に示されるような亜鉛を結合することができる上流モチーフまた
はシスエレメントに相当する配列、図１の残基4379-4404 に示されるようなCAP/
CRP-galOに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残
基4428-4434 および4627-4639 にそれぞれ示されるようなAP1 を結合することが
できる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4625-463
4 に示されるようなSRY を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列、図１の残基4678-4711 に示されるようなGC2 に特有の上流
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4765-4769 に示され
るようなPEA3を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当
する配列、図１の残基4759-4954 に示されるようなMIR を結合することができる
上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4923-4941 に示
されるようなNF-HNF-1を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメン
トに相当する配列、図１の残基5151-5156 に示されるような甲状腺受容体上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、ならびに図１の残基5166-5175 に
示されるようなNFκB を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメン
トに相当する配列。
【０１０９】 この目的のために自動核酸合成機を使用してもよい。このような合成の代わり
に、下記の開示された配列を用いて、任意の所望のTIGR遺伝子DNA 分子または断
片を増幅して得るため、ポリメラーゼ連鎖反応 [Mullis, K. et al., Cold Spri ng Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich H. et al., EP 50
,424; EP 84,796; EP 258,017, EP 237,362; Mullis K., EP 201,184; Mullis K
., et al., US 4,683,202; Erlich H., US 4,582,788; およびSaiki, R. et al.
, US 4,683,194)]で使用できる一対のプライマーを決めてもよい：配列番号１、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、
配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、
配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、
配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、
配列番号33、または図１の残基 370-388および4491-4502 にそれぞれ示されるよ
うなPRL-FP111 に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図
１の残基433-445 に示されるようなGR/PR を結合することができる上流モチーフ
またはシスエレメントに相当する配列、図１の残基 446-451, 1288-1293, 3597-
3602, 4771-4776,および5240-5245 にそれぞれ示されるような上流シェアストレ
スモチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基574-600, 1042-10
56, 2444-2468, 2442-2469, 3536-3563, 4574-4593, 4595-4614, 4851-4865, 48
44-4864, 5079-5084, 5083-5111 にそれぞれ示されるようなグルココルチコイド
応答上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基735-746 に
示されるようなCBE を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメント
に相当する配列、図１の残基774-795 に示されるようなNFE を結合することがで
きる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基843-854 に
示されるようなKTF.1-CSを結合することができる上流モチーフまたはシスエレメ
ントに相当する配列、図１の残基987-1026に示されるようなPRE を結合すること
ができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1373-1
388 に示されるようなETF-EGFRを結合することができる上流モチーフまたはシス
エレメントに相当する配列、図１の残基1447-1456 に示されるようなSRE-cFosを
結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１
の残基1331-1550 に示されるようなAlu を結合することができる上流モチーフま
たはシスエレメントに相当する配列、図１の残基1786-1797 に示されるようなVB
P を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、
図１の残基1832-1841 に示されるようなMalt-CS を結合することができる上流モ
チーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2167-2195, 3413-3429
, および3892-3896 にそれぞれ示されるようなERE を結合することができる上流
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2329-2338 に示され
るようなNF変異原を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに
相当する配列、図１の残基2403-2416 に示されるようなmyc-PRF を結合すること
ができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2520-2
535 および5170-5187 にそれぞれ示されるようなAP2 を結合することができる上
流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2622-2635 および
5105-5132 にそれぞれに示されるようなHSTFを結合することができる上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基2733-2743 に示されるよう
なSBF に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基
2923-2938, 4144-4157, および4887-4900 にそれぞれに示されるようなNF-1を結
合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の
残基2936-2944 に示されるようなNF-MHCIIA/B を結合することができる上流モチ
ーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基3285-3298 に示されるよ
うなPEA1を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する
配列、図１の残基3688-3699 に示されるようなICS を結合することができる上流
モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4170-4179 に示され
るようなISGF2 を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相
当する配列、図１の残基4285-4293 に示されるような亜鉛を結合することができ
る上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4379-4404 に
示されるようなCAP/CRP-galOに特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当
する配列、図１の残基4428-4434 および4627-4639 にそれぞれ示されるようなAP
1 を結合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、
図１の残基4625-4634 に示されるようなSRY を結合することができる上流モチー
フまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基4678-4711 に示されるよう
なGC2 に特有の上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の残基
4765-4769 に示されるようなPEA3を結合することができる上流モチーフまたはシ
スエレメントに相当する配列、図１の残基4759-4954 に示されるようなMIR を結
合することができる上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、図１の
残基4923-4941 に示されるようなNF-HNF-1を結合することができる上流モチーフ
またはシスエレメントに相当する配列、図１の残基5151-5156 に示されるような
甲状腺受容体上流モチーフまたはシスエレメントに相当する配列、ならびに図１
の残基5166-5175 に示されるようなNFκB を結合することができる上流モチーフ
またはシスエレメントに相当する配列。
【０１１０】 TIGRプロモーター配列およびTIGRフランキング配列は、TIGRオリゴヌクレオチ
ドのオリゴヌクレオチドプローブを、ヒトゲノムライブラリーのメンバーと共に
インキュベーションし、このプローブにハイブリッド形成するクローンを回収す
ることにより得ることができる。別の態様では、「染色体歩行」または3'もしく
は5'RACE [Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:8998-
9002 (1988) 、ここに参考のため援用する; Ohara, O. et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. (U.S.A.) 86:5673-5677 (1989) 、ここに参考のため援用する] を使用
して、このような配列を得てもよい。
【０１１１】 II．本発明の分子を使用した緑内障および関連疾患の診断と予知 本発明の特に望ましい用途は、緑内障、POAG、色素性緑内障、高眼圧緑内障お
よび低眼圧緑内障ならびにそれらの関連疾患の診断に関係する。本発明の別の特
に望ましい用途は、緑内障、POAG、色素性緑内障、高眼圧緑内障および低眼圧緑
内障ならびにそれらの関連疾患の予知または予後に関係する。ここで用いた「緑
内障」なる用語は、原発性緑内障、続発性緑内障、若年性緑内障、先天性緑内障
、および家族性緑内障を包含し、これらは、制限されなないが、色素性緑内障、
高眼圧緑内障および低眼圧緑内障ならびにそれらの関連疾患を含む。上述したよ
うに、緑内障の診断または予知方法は不正確であるという欠点があるか、または
何回もの検査が必要である。本発明の分子を用いて緑内障の優れたアッセイ法を
規定することができる。このような用途とは全く離れて、本発明の分子は、グル
ココルチコイドまたはコルチコステロイドのようなステロイド、即ち、抗炎症ス
テロイド、の投与による眼内圧上昇に対する個人の感受性を診断または予測する
のにも使用できる。デキサメタゾン、コルチゾールおよびプレドニゾロンがこの
用途に好ましいステロイドである。炎症性およびアレルギー性の障害といった医
学症状、ならびに臓器移植を受けた患者は、グルココルチコイドによる治療が有
効である。しかし個人によっては、かかるステロイドに対して高いIOP 応答 (即
ち、ステロイド感受性) を示し、これは望ましくない眼内圧上昇となって現れる
。本発明を利用して、かかる感受性ならびに緑内障および関連疾患を診断または
予測することができる。
【０１１２】 第１の態様では、本発明のTIGR分子を用いて、個人が、TIGR発現のレベル (即
ち、検体のTIGR mRNA もしくはタンパク質の濃度等) またはパターン (即ち、発
現の動的速度、分解の速度、安定性プロファイル等)(これらを細胞または体液の
「TIGR応答」と総称する) に影響する突然変異 (例えば、TIGR遺伝子の突然変異
、またはTIGRの発現を制御するか、これに影響する調節領域もしくは他の遺伝子
の突然変異) を持っているか否かを決定し、そして (予知として) 緑内障、関連
疾患もしくはステロイド感受性に対する疾病素質を持っているかも知れない個人
を予測する。ここで用いた意味では、細胞または体液に現れるTIGR応答が、正常
な個人の細胞または体液のTIGR応答と異なっているなら「変質」していると言え
る。かかる変質は、異常に高いか、または異常に低いTIGR応答として現れること
がある。TIGR応答が変質しているか否かを決定するには、患者の細胞または体液
に現れるTIGR応答を正常な個人の類似の細胞検体 (または体液検体) のそれと比
較する。承知のように、かかる比較を行うたび毎に正常な個人の細胞検体 (また
は体液検体) のTIGR応答を再測定する必要はなく、被験者個人のTIGR応答を既に
得られた正常な個人の値と比較すればよい。
【０１１３】 １つの下位態様において、かかる分析は、緑内障に関連する、または緑内障、
関連疾患、もしくはステロイド感受性に対する素因 (予知) に関連する、TIGR遺
伝子またはそのフランキング領域における多形性の存在および／または実体を決
定することにより行われる。ここで用いた「TIGRフランキング領域」という用語
は、TIGRコーディング領域の上流または下流のいずれかに位置する領域を意味す
る。
【０１１４】 多様な分子のいずれもこのような多形性を同定 (決定) するのに使用できる。
１態様において、下記の配列を、かかる多形性を同定するためのマーカー核酸分
子として使用することができる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番
号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番
号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番
号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号33、図１の残基 370-388
および4491-4502 にそれぞれ示されるようなPRL-FP111 に特有の上流モチーフも
しくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基433-445 に示されるよう
なGR/PR を結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相
当する配列、図１の残基 446-451, 1288-1293, 3597-3602, 4771-4776,および52
40-5245 にそれぞれ示されるような上流シェアストレスモチーフもしくはシステ
ムエレメントに相当する配列、図１の残基574-600, 1042-1056, 2444-2468, 244
2-2469, 3536-3563, 4574-4593, 4595-4614, 4851-4865, 4844-4864, 5079-5084
, 5083-5111 にそれぞれ示されるようなグルココルチコイド応答上流モチーフも
しくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基735-746 に示されるよう
なCBE を結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当
する配列、図１の残基774-795 に示されるようなNFE を結合することができる上
流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基843-854 に
示されるようなKTF.1-CSを結合することができる上流モチーフもしくはシステム
エレメントに相当する配列、図１の残基987-1026に示されるようなPRE を結合す
ることができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１
の残基1373-1388 に示されるようなETF-EGFRを結合することができる上流モチー
フもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基1447-1456 に示され
るようなSRE-cFosを結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメ
ントに相当する配列、図１の残基1331-1550 に示されるようなAlu を結合するこ
とができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残
基1786-1797 に示されるようなVBP を結合することができる上流モチーフもしく
はシステムエレメントに相当する配列、図１の残基1832-1841 に示されるような
Malt-CS を結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相
当する配列、図１の残基2167-2195, 3413-3429, および3892-3896 にそれぞれ示
されるようなERE を結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメ
ントに相当する配列、図１の残基2329-2338 に示されるようなNF変異原を結合す
ることができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１
の残基2403-2416 に示されるようなmyc-PRF を結合することができる上流モチー
フもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基2520-2535 および51
70-5187 にそれぞれ示されるようなAP2 を結合することができる上流モチーフも
しくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基2622-2635 および5105-5
132 にそれぞれに示されるようなHSTFを結合することができる上流モチーフもし
くはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基2733-2743 に示されるよう
なSBF に特有の上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１
の残基2923-2938, 4144-4157, および4887-4900 にそれぞれに示されるようなNF
-1を結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する
配列、図１の残基2936-2944 に示されるようなNF-MHCIIA/B を結合することがで
きる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基3285
-3298 に示されるようなPEA1を結合することができる上流モチーフもしくはシス
テムエレメントに相当する配列、図１の残基3688-3699 に示されるようなICS を
結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列
、図１の残基4170-4179 に示されるようなISGF2 を結合することができる上流モ
チーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基4285-4293 に示
されるような亜鉛を結合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメ
ントに相当する配列、図１の残基4379-4404 に示されるようなCAP/CRP-galOに特
有の上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基4428
-4434 および4627-4639 にそれぞれ示されるようなAP1 を結合することができる
上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基4625-463
4 に示されるようなSRY を結合することができる上流モチーフもしくはシステム
エレメントに相当する配列、図１の残基4678-4711 に示されるようなGC2 に特有
の上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基4765-4
769 に示されるようなPEA3を結合することができる上流モチーフもしくはシステ
ムエレメントに相当する配列、図１の残基4759-4954 に示されるようなMIR を結
合することができる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、
図１の残基4923-4941 に示されるようなNF-HNF-1を結合することができる上流モ
チーフもしくはシステムエレメントに相当する配列、図１の残基5151-5156 に示
されるような甲状腺受容体上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する
配列、ならびに図１の残基5166-5175 に示されるようなNFκB を結合することが
できる上流モチーフもしくはシステムエレメントに相当する配列 (またはその下
位配列) 。
【０１１５】 或いは、かかる多形性の検出は、上記の多形性に遺伝的に連結した(genetical
ly linked)マーカー核酸分子またはマーカータンパク質 [即ち、この多形性と共
分離(co-segregate)するポリヌクレオチド] を用いて行うこともできる。上述し
たように、TIGR遺伝子、および／またはTIGR遺伝子に特異的にハイブリッド形成
する１もしくは２以上の配列は、染色体１、q21-32に、より好ましくは染色体１
、q21-27に位置するTIGR遺伝子に、より好ましくは染色体１、q22-26に位置する
TIGR遺伝子に、最も好ましくは染色体１、q24 に位置するTIGR遺伝子に、マッピ
ングされてきた。この態様の好ましい側面では、かかるマーカー核酸分子は上記
の多形性に密接に遺伝的に連結したポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を有し
ていよう (例、染色体１、q19-25、より好ましくは染色体１、q23-25、最も好ま
しくは染色体１、q24 に位置するマーカー) 。
【０１１６】 スタンフォードG3放射線ハイブリッドパネルを用いた位置推定(localization)
の研究では、6.0 のLOD スコアでD1S2536 遺伝子座にD1S2536 マーカー核酸分子
によりTIGR遺伝子がマッピングされた。この領域内の他のマーカー核酸分子とし
て、D1S210; D1S1552; D1S2536; D1S2790; SHGC-12820;およびD1S2558 が挙げら
れる。このような位置をマッピングする他のポリヌクレオチドマーカーも既知で
あって、上記の多形性を同定するために採用することができる。
【０１１７】 動物および植物のゲノムは、その継続的な進化の過程で当然に自然の突然変異
を受ける [Gusella,J.F., Ann. Rev. Biochem. 55:831-854 (1986)] 。TIGR遺伝
子またはそのフランキング領域における「多形性」は、或る１つの種の構成体の
一部に生ずるTIGR遺伝子またはそのフランキング領域の配列の変異または変化で
ある。この変異配列と「元の」配列がその種の集団内で共存している。場合によ
っては、このような共存は安定または準安定な平衡状態にある。
【０１１８】 このように、多形性の存在によって、或る１つの種の一部の構成体は元の配列
[即ち、元の「対立遺伝子」(allele)] を持ち、別の構成体は変異配列 (即ち、
変異「対立遺伝子」) を持つことがある点で、多形性はアレリック (対立遺伝子
性) であるといわれる。最も単純な場合には、変異配列が１つだけ存在すること
ができ、従って多形性はジアレリック(di-allelic)といわれる。別の場合には、
その種の集団が複数の対立遺伝子 (アレレ) を含むことがあり、多形性はトリア
レリック等と呼ばれる。１つの遺伝子が関連性のない複数の異なる多形性を持つ
ことがある。例えば、この遺伝子が一つの部位ではジアレリックの多形性を、別
の部位ではマルチアレリックな多形性を持つことがある。
【０１１９】 多形性を規定する変異は、一つのヌクレオチドの変異から、１遺伝子内の長い
領域の挿入または欠失までの範囲に及びうる。場合により、DNA 配列の変異はヌ
クレオチドの縦列(tandem)ジまたはトリ−ヌクレオチド反復モチーフを含む短い
縦列反復(STR) を特徴とするゲノムの領域内にある。かかる縦列反復を特徴とす
る多形性は、可変数縦列反復(variable number tamdem repeat, "VNTR") 多形性
と呼ばれる。VNTR多形性は、アイデンティティーおよびパターニティー (父系)
分析に使用されてきた [Weber, J.L.,米国特許 5,075,217; Armour, J.A.L. et
al., FEBS Lett. 307:113-115 (1992); Jones, L. et al., Eur. J. Haematol.
39:144-147 (1987); Horn, G.T. et al., PCT 出願WO91/14003; Jeffreys, A.J.
, 欧州特許出願370,719; Jeffreys, A.J.,米国特許 5,175,082; Jeffreys, A.J.
et al., Amer. J. Hum. Genet. 39:11-24 (1986); Jeffreys, A.J. et al., Nat ure 316:76-79 (1985); Gray, I.C. et al., Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243:2
41-253 (1991); Moore, S.S. et al., Genomics 10:654-660 (1991); Jeffreys,
A.J. et al., Anim. Genet. 18:1-15 (1987); Hillel, J. et al., Anim. Gene t. 20:145-155 (1989); Hillel, J. et al., Genet. 124:783-789(1990)]。
【０１２０】 別の態様において、上記の多形性の検出は、このような多形性に物理的に連結
したマーカー核酸分子を使用することにより行うことができる。この目的には、
１mbの多形性範囲内、より好ましくは100 kbの多形性範囲内、最も好ましくは10
kb の多形性範囲内に位置する１つのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を含
むマーカー核酸分子を使用することができる。このようなマーカー核酸の例は、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、
配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、
配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、
配列番号25に示されている。
【０１２１】 別の態様では、TIGRmt1, TIGRmt2, TIGRmt3, TIGRmt4, TIGRmt5, TIGRmtl1, T
IGRsv1、またはこれらの突然変異の組合わせを特異的に検出することができるマ
ーカー核酸が使用されよう。塩基置換、塩基欠失および塩基付加を検出するため
の方法 (即ち、個体の遺伝子型を決定する方法) は当分野では知られている。例
えば、「遺伝子ビット分析[Genetic Bit Analysis ("GBA")]法が、Goelet, P. e
t al., WO92/15712(ここに参考のため援用する) に開示されており、この方法を
本発明の単一ヌクレオチド多形性を検出するのに使用してもよい。GBA は標的DN
A 配列の変異部位を取り囲むヌクレオチド配列情報を用いて、標的DNA の変異性
ヌクレオチドにすぐ隣接しているが、このヌクレオチドを含まない領域に相補性
のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する、多形性部位質問法である。標的DN
A 鋳型を生物学的検体から選び、質問用プライマーにハイブリッド形成する。こ
のプライマーを、２個、好ましくは４個全部の連鎖停止ヌクレオシド三リン酸前
駆体の存在下で、DNA ポリメラーゼを用いて単一標識ジデオキシヌクレオチドに
より連鎖伸長する。Cohen, D. et al., (PCT出願 WO91/02087)に関連する遺伝子
型決定方法が説明されている。
【０１２２】 DNA の多形性部位をアッセイするための他のプライマー案内型のヌクレオチド
組込み手法も報告されている [Komher, J.S. et al., Nucl. Acids Res. 17:777
9-7784 (1989) 、ここに参考のため援用する；Sokolov, B.P. Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990) 、ここに参考のため援用する；Syvaenen, A.C. et al., Genom ics 8:684-692 (1990)、ここに参考のため援用する；Kuppuswamy, M.N. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)、ここに参考のため援
用する；Prezant, T.R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992)、ここに参考の
ため援用する；Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992)、ここに参考のた
め援用する；Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993) 、ここに
参考のため援用する] 。
【０１２３】 DNA 検体中の多形性部位の検出は、核酸増幅法を使用すると容易になることが
ある。かかる方法は、多形性部位にまたがるポリヌクレオチドか、または多形性
部位とその遠位または近位のいずれかに位置する配列とを含むポリヌクレオチド
の濃度を特異的に増大させる。こうした増幅された分子は、ゲル電気泳動または
他の手段により容易に検出することができる。
【０１２４】 このような増幅を達成する別の好ましい方法は、その二本鎖形態における１つ
の多形性を規定している近位配列にハイブリッド形成することができるプライマ
ー対を使用した、ポリメラーゼ連鎖反応("PCR") を採用する [Mullis, K. et al
., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich H. et
al., 欧州特許出願50,424; 欧州特許出願84,796; 欧州特許出願258,017;欧州特
許出願237,362; Mullis, K. 欧州特許出願201,184; Mullis, K. et al., 米国特
許No.4,683,202; Erlich, H.米国特許No.4,582,788; およびSaiki, R. et al.,
米国特許No.4,683,194] 。
【０１２５】 PCR の代わりに、「リガーゼ連鎖反応」("LCR") のような別の方法を使用する
こともできる[Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:189-193 (199
1)] 。LCR は、特定の標的を指数的に増幅させるために２対のオリゴヌクレオチ
ドプローブを使用する。オリゴヌクレオチドの各対の配列は、その対が標的の同
じ鎖の隣接する配列にハイブリッド形成することができるように選択する。かか
るハイブリッド形成は鋳型依存性リガーゼに対する基質を形成する。PCR の場合
と同様に、得られた産物は次のサイクルで鋳型として作用し、所望の配列の指数
増幅が得られる。
【０１２６】 LCR は、ある多形性部位の同じ鎖の近位および遠位配列を有するオリゴヌクレ
オチドを用いて行うことができる。１態様において、いずれかのオリゴヌクレオ
チドは、その多形性の実際の多形性部位を含むように設計されよう。かかる態様
では、標的分子がそのオリゴヌクレオチドに存在する多形性部位に対して相補性
の特定のヌクレオチドを含有するか、または欠損するかのいずれかの場合だけに
２つのオリゴヌクレオチドを一体に連結することができるように、反応条件を選
択する。或いは、２つのオリゴヌクレオチドはこれらが多形性部位を含まないよ
うに選択することもできる(Segev, D., PCT 出願 WO 90/01069を参照) 。
【０１２７】 「オリゴヌクレオチド連結アッセイ」("OLA") も別の方法として採用すること
ができる [Landegren, U. et al., Science 241:1077-1080 (1988)] 。このOLA
プロトコルは、標的の一本鎖の隣接配列にハイブリッド形成することができるよ
うに設計された２つのオリゴヌクレオチドを使用する。LCR と同様、OLA も特に
点突然変異の検出に適している。しかし、LCR と異なり、OLA は標的配列の指数
増幅ではなく「直線的」増幅を生ずる。
【０１２８】 Nickerson, D.A. らは、PCR とOLA の属性を組合わせた核酸検出アッセイ法を
報告した [Nickerson, D.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:892
3-8927 (1990)]。この方法では、PCR を用いて標的DNA の指数増幅を行った後、
このDNA をOLA を用いて検出する。複数の別個の処理工程が必要となる上、この
組合わせに伴う１つの問題点は、PCR とOLA に付随する問題点の全てを引き継い
でいることである。
【０１２９】 ２ (またはそれ以上) のオリゴヌクレオチドの連結を、得られる「ジオリゴヌ
クレオチド」の配列を持った核酸の存在下で行って、ジオリゴヌクレオチドを増
幅させることに基づくスキームも公知であり [Wu, D.Y. et al., Genomics 4:56
0 (1989)] 、これを本発明の目的に容易に応用することができる。
【０１３０】 対立遺伝子特異的オリゴマー、分岐DNA 法、転写型増幅システム、または等温
増幅法といった他の公知の核酸増幅法も、上記の多形性の増幅および分析に使用
することができる [Malek, L.T. et al., 米国特許5,130,238; Davey, C. et al
.,欧州特許出願329,822; Schuster et al., 米国特許5,169,766; Miller, H.I.
eta al., PCT出願 WO89/06700; Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S .A.) 86:1173 (1989); Gingeras, T.R. et al., PCT 出願 WO88/10315; Walker,
G.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 89:392-396(1992)]。前述した
全ての核酸増幅法を緑内障の予測または診断に使用することができよう。
【０１３１】 TIGR遺伝子、またはそのコーディング領域のいずれかの末端から約5,000 塩基
までのフランキング配列における多形性の同定は、多様な方法で決定することが
できる。個人における緑内障の有無をTIGR遺伝子またはそのフランキング領域に
おける多形性の有無と相関させることにより、緑内障、関連疾患またはステロイ
ド感受性に対する無症候性患者の素因 (予後) を診断することが可能となる。あ
る多形性が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を創出もしくは破壊するか、または
その多形性がDNA の欠損または挿入を生ずる (例、VNTR多形性) なら、その多形
性はその制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成したDNA 断片のサイズま
たはプロファイルを変化させよう。その結果、制限断片分析により、変異配列を
有する個人を、元の配列を有する個人から識別することができる。このようにし
て同定できる多形性は、「制限断片長多形性」(restriction fragment length p
olymorphisms)("RFLP") と呼ばれる。RFLPはヒトおよび動物の遺伝子分析に広く
使用されてきた [Glassberg, J.,英国特許出願2135774; Skolnick, M.H. et al.
, Cytogen. Cell Genet. 32:58-67 (1982); Botstein, D. et al., Ann. J. Hum . Genet. 32:314-331 (1980); Fischer, S.G. et al., PCT 出願 WO90/13668; U
hlen, M., PCT 出願 WO90/11369]。緑内障の病因におけるTIGRの役割は、TIGR応
答に影響する遺伝子変質 (例、DNA 多形性) の存在を緑内障の予測に採用できる
ことを示唆している。
【０１３２】 このような同定を行う１つの好ましい方法は、一本鎖高次構造多形(SSCP)法を
採用する。SSCP法は、典型的には、長さ 150〜250 ヌクレオチドの一本鎖のDNA
における大部分の変異を同定することができる方法である [Elles, Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases , Humana Pres
s (1996)、ここに参考のため援用する；Orita et al., Genomics 5:874-879 (19
89) 、ここに参考のために援用する] 。変性条件下では、一本鎖のDNA はその配
列高次構造にだけ依存した高次構造 (コンホメーション) をとるであろう。この
高次構造は、１個の塩基が変化しただけでも通常は異なるであろう。大部分の高
次構造は、電気泳動で十分に検出可能な程度に物理的形態またはサイズを変化さ
せることが報告されている。SSCPについては多数のプロトコルが説明されており
、制限されないが、Lee et al., Anal. Biochem. 205:289-293 (1992)(ここに参
考のため援用する); Suzuki et al., Anal. Biochem. 192:84-85 (1991)(ここに
参考のため援用する); Lo et al., Nucleic Acids Research 20:1005-1009 (199
2) (ここに参考のため援用する); Sarkar et al., Genomics 13:441-443 (1992)
(ここに参考のため援用する) が挙げられる。
【０１３３】 本発明のこの態様によると、患者から検体DNA を得る。好適態様においては、
DNA 検体を患者の血液から得る。しかし、任意のDNA 供給源を使用できるこのDN
A を制限エンドヌクレアーゼ消化に付す。上述したRFRP法に従ってTIGRをプロー
ブとして使用する。正常人と緑内障患者から得られたTIGR遺伝子のRFLPパターン
を比較することにより、患者の緑内障に対する素因 (予後) を決定することがで
きる。この方法で得られた多形を次いでクローニングして、タンパク質構造を変
質させるコーディング領域またはその発現レベルに影響する遺伝子の調節領域に
おける突然変異を同定することができる。他の調節タンパク質とのプロモーター
相互作用を含む変化を、例えば、HTM 細胞抽出液、前眼房液、血清等を使用した
ゲルシフトアッセイ、により同定することができる。緑内障性の細胞抽出液、前
眼房液、血清等に含まれるTIGRタンパク質の相互作用を、対照検体と比較するこ
とにより、緑内障の病因に関連するTIGRの特性における変化を同定することがで
きる。また、このような抽出液および体液ならびにその他 (血液等) を用いてス
テロイド感受性を診断または予測することもできる。
【０１３４】 このような方法により、いくつかの異なる種類の多形性を同定することができ
る。このような種類の例としては、(1) 異なる個人のTIGR cDNA に存在する多形
性、(2) TIGR遺伝子のプロモーターまたは他の調節領域を含めた、非翻訳TIGR遺
伝子配列における多形性、(3) その産物がTIGR調節配列と相互作用する遺伝子に
おける多形性、(4) その産物がTIGRタンパク質と相互作用するか、それにTIGRタ
ンパク質が結合する遺伝子配列における多形性、が挙げられる。
【０１３５】 別の下位態様において、その配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配
列番号４、または配列番号５の一部の配列と相補性であるオリゴヌクレオチドの
「プローブ」を使用して評価を行う。このような分子を次いで、患者の細胞抽出
液と共に、核酸ハイブリッド形成を可能にするのに十分な条件下でインキュベー
ションする。
【０１３６】 本発明のこの側面の１つの下位態様において、生検 (もしくはマクロファージ
もしくは他の血液細胞検体) 中、または他の細胞検体中、或いはより好ましくは
体液 (特に、血液、血清、血漿、涙液、口腔前庭液等) の検体中、におけるTIGR
応答を確認することにより、緑内障、関連疾患およびステロイド感受性を診断ま
たは予測することができる。TIGR遺伝子はグルココルチコイドの存在に応答して
誘導されるので、この方法の非常に好ましい１態様は、グルココルチコイドの投
与前、投与中、および／または投与後に、かかるTIGR応答を確認することを含む
。例えば、例として、グルココルチコイドの投与 (局所、眼内、筋肉内、全身ま
たは他の経路から投与) が、特定の個人のTIGR応答を、正常人のそれに対して変
質させるか否かを決定することにより、緑内障を診断または予測することができ
よう。この目的にとって、少なくとも「TIGR遺伝子誘導量」のグルココルチコイ
ドを投与することが最も好ましい。ここで用いた、TIGR遺伝子誘導量のグルココ
ルチコイドとは、緑内障に罹患した人または罹患していない人の細胞におけるTI
GR発現の検出可能な誘導を生ずるのに十分なグルココルチコイドの量のことであ
る。
【０１３７】 本発明の剤を用いた細胞、ベクター、および発現タンパク質の作製 本発明はまた、本発明の核酸を含む外生遺伝物質を宿主細胞に導入することを
含む、組換え宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞を得る方法にも関する。本発明は
また、本発明の核酸を有する組換えベクターを有する昆虫細胞にも関する。本発
明はまた、相同的組換えにより本発明の核酸を含む外生遺伝物質を導入すること
を含む、組換え宿主細胞を得る方法にも関する。相同的組換えにより、ここに説
明したTIGR遺伝子のプロモーターおよび5'フランキング配列は、宿主細胞におけ
る所望の遺伝子産物を産生するための遺伝子活性化法に使用できる (例えば、米
国特許第5,733,746 号を参照、これを参考のためにここに特に援用する) 。TIGR
プロモーター領域DNA により付与されたTM細胞中でのTIGR遺伝子の特異的発現は
、こうして相同的組換えにより、同様のやり方で他の遺伝子産物を発現するよう
に移転させることができる。これらの他の遺伝子産物のあるものは、IOP 上昇ま
たは緑内障に関係する疾患を対象とする治療用タンパク質であってもよい。遺伝
子活性化法に含まれる遺伝子標的技術のためのプロモーターおよび5'フランキン
グ配列の選択および使用方法は、本技術分野では既知である。修飾および付随す
る標的化構築物の性質に応じて、各種の技法を標的化された組込みを同定するた
めに採用しうる。好都合な方法は、１種もしくは２種以上の制限酵素でDNA を切
断し、得られた断片を、組込みに付随する適正なサイズの制限断片を同定する適
宜のDNA 断片でプローブ処理する。
【０１３８】 宿主に組込まれる配列は任意の好都合な手段で導入するのでよく、そのような
手段には、カルシウム沈殿DNA 、スフェロプラスト融合、形質転換、電気穿孔、
バイオリスティックス(biolistics)、リポフェクション、微量注入、または他の
好都合な手段が包含される。増幅可能な遺伝子が使われている場合には、その増
幅可能な遺伝子を、この増幅可能遺伝子が導入された宿主を選択するための選択
マーカーとして使用してもよい。或いは、その増幅可能な遺伝子と共に、例えば
、ネオマイシン耐性 (哺乳動物細胞におけるG418) 、ハイグロマイシン耐性等の
薬剤耐性マーカー、または酵母細胞中で使用するための栄養要求性マーカー (HI
S3, TRP1, LEU2, URA3, ADE2, LYS2等) といった別のマーカーを含有させてもよ
い。
【０１３９】 例えば、増幅可能な遺伝子の隣り、普通は両側に、標的領域 (ここではTIGR配
列) のDNA と相同性のDNA が位置している相同的組換構築物を作製することがで
きる。組込むDNA の性質および組込みの目的に応じて、相同的DNA は一般に標的
遺伝子の転写された領域の100 kb、通常は50 kb 、好ましくは約25 kb の範囲内
、より好ましくは標的遺伝子の2 kbの範囲内であろう。相同的DNA は、転写調節
領域もしくはエンハンサー配列の外側の5'上流領域、転写開始配列、隣接配列等
を包含しうる。相同的領域は、コーディング領域の一部を包含してもよく、この
コーディング領域はオープンリーディングフレームのみ、またはエキソンとイン
トロンの組合わせのみからなるものでもよい。相同的領域は、イントロンの全部
または一部含むものでもよく、その場合、１または２以上のエキソンの全部また
は一部も存在しうる。或いは、相同的領域は、転写終結領域の全部もしくは一部
を含むように、3'領域を、またはこの領域より3'側の領域を含んでいてもよい。
相同的領域は、標的遺伝子の全部もしくは一部を超えて伸長してもよく、または
転写調節領域の全部もしくは一部を含む標的遺伝子および／または構造遺伝子の
外側にあるものでもよい。
【０１４０】 組込み構築物は、配列の合成、天然供給源からの分離、操作、クローニング、
連結、in vitro突然変異処理、プライマー修復その他を包含する常法に従って作
製することができる。各種段階で、結合された配列のクローニング、制限解析に
よる解析、配列決定等を実施しうる。通常は、各種断片を結合する構築物の作製
時に、断片、中間構築物および構築物を、原核生物宿主 (例、大腸菌) 内で機能
する複製システムと選択のためのマーカー (例、殺生物耐性、栄養要求性宿主に
対する相補性等) を含むクローニングベクター上に送り込む。他の機能的な配列
、例えば、構築物またはその一部の導入および切り出しを容易にするためのポリ
リンカー、も存在させうる。pBR322およびpUC シリーズ等といった多数のクロー
ニングベクターが入手可能である。その後、これらの構築物を主宿主への組込み
のために使用してもよい。
【０１４１】 本発明の核酸を含むDNA は、リン酸カルシウム／DNA 共沈、核へのDNA の微量
注入、電気穿孔、無傷細胞による酵母プロトプラスト融合、トランスフェクショ
ン、ポリカチオン (例、ポリブレン、ポリオルニチン等) 等を包含するたような
技法により宿主細胞に導入することができる。DNA は直鎖または環状の一本鎖ま
たは二本鎖DNA でよい。細胞を形質転換する各種技法が周知である (例、Keown
et al., Methods Enzymol. (1989), Keown et al., Methods Enzymol. 185:527-
537 (1990); Mansour et al., Nature 36:348-352 (1988)を参照; これら全ての
全体を参考のためここに援用する) 。
【０１４２】 好ましい側面において、本発明は、本発明の核酸を含む組換え昆虫ベクターお
よび昆虫細胞に関する。特に好ましい側面では、バキュロウイルス発現ベクター
を用いて、昆虫細胞に導入し、組換えTIGRタンパク質を発現させる。組換えTIGR
タンパク質は、ヒトTM内皮細胞由来の全長タンパク質、この全長タンパク質の実
質的な断片、例えば、全長タンパク質の少なくとも約20連続アミノ酸から約100
連続アミノ酸まで、を含む融合タンパク質、または位置指定突然変異誘発、DNA
シャフリングもしくは類似の技法により産生させた変異TIGRタンパク質もしくは
融合タンパク質でよい。一般に、変異TIGRタンパク質および融合タンパク質は、
全長TIGRタンパク質の少なくとも１つの構造上または機能上の特徴、例えば、同
じ抗体を結合させる能力、実質的に類似のロイシンジッパー領域の存在、または
TM細胞上で同じリガンドもしくは受容体を結合させる能力を保持していよう (Ng
uyen et al., J. Biol. Chem. 273:6341-6350 (1998)を参照、特に参考としてこ
こに援用する) 。TIGR遺伝子のロイシンジッパーをコードする領域を含む核酸は
、本技術分野で公知の方法により同定することができ、これをリガンド−受容体
アッセイの創出のために組換えまたは合成方法と併用することができる。
【０１４３】 本発明の好ましい組換え昆虫ベクター、宿主細胞、およびTIGRタンパク質の例
は、PVL 1393ベクター [InVitrogen] にTIGR cDNA を連結することによって作製
した。このベクターをSf9 細胞に導入し、TIGRタンパク質を発現させた後、精製
した (米国特許第5,789,169 号およびNguyen et al., J. Biol. Chem. 273:6341
-6350 (1998)を参照、その両者を特に参考としてその全体をここに援用する) 。
得られたタンパク質のSDS-PAGEゲルは、55 kDa範囲にタンパク質バンドを示し、
これを配列決定して正確な正体を確認した。
【０１４４】 本発明のベクター、細胞および関連方法の好ましい態様において、GFP(グリー
ン蛍光タンパク質) とのTIGR融合タンパク質をTM細胞系において発現させること
ができる (初代TM細胞培養物およびトランスフェクション方法についてはNguyen
et al., J. Biol. Chem. 273:6341-6350 (1998)およびそこに引用された文献を
参照) 。形質転換され、培養された対数期のTM細胞を、TIGR-GFP融合タンパク質
をコードするベクターでトランスフェクションする。このベクターは、高い発現
を可能にするCMV プロモーター、最初のATG からタンパク質をコードする領域の
最後までのTIGR cDNA 、TIGRをコードする配列のカルボキシ末端に融合させた蛍
光タンパク質タグ(GFP) 、およびG418耐性遺伝子を含んでいる。これらのエレメ
ントとそれらの使用は、本技術分野で既知であるか、この開示およびその援用文
献により提供される。この構築物をTIGR1-GFP と呼ぶ。トランスフェクションは
、本技術分野で公知のリン酸カルシウム法またはリポフェクチン法を用いて実施
した。37℃、８％CO2 の増殖条件で６〜18時間の培養がこれに続いた。トランス
フェクション後、DNA 培地はG418を含む新鮮な増殖培地と置換し、この培地を週
に２回交換して、細胞の耐性コロニーが単層細胞を超えて増殖するまで培養を続
けた (約10〜15日) 。細胞コロニーを集め、耐性の形質転換細胞を選択するため
に数継代の増殖を行った。数継代後に蛍光TIGR-GFP融合タンパク質の発現を試験
した。選択した20のコロニーからの１つが高レベルのTIGR-GFP融合タンパク質を
発現した。
【０１４５】 本発明の細胞および方法の別の好ましい態様において、SV40由来のベクターを
用いて、形質転換した不死化TM細胞系を作製することができる。初代培養TM細胞
を、本技術分野で公知のように、PsvOriを欠損したSV40ベクターでトランスフェ
クションする。簡単に説明すると、対数期の初代培養細胞を、リン酸カルシウム
またはリポフェクチンを用いてPsvOri DNAでトランスフェクションし、37℃、８
％CO2 の増殖条件で６〜18時間培養する。DNA 培地を新鮮な増殖培地と置換し、
不死化細胞のコロニーが死滅する単層を超えて増殖するまで、週に２回の培地交
換を行う (約10〜15日) 。細胞コロニーを集め、形質転換細胞を選択するために
数継代の増殖を行う。
【０１４６】 III. 投与方法 本発明の薬剤の一部は、薬理学的に許容されうる組成物を調製するために既知
の方法に従って処方することができ、この処方により、所望の程度の純度を有す
るこの材料またはその官能性誘導体を、生理学的に許容しうる担体、賦形剤、ま
たは安定剤と一緒に混合する。かかる材料は、採用する用量および濃度では受容
者 (レシピエント) に無毒である。このような組成物の有効成分は、前述した分
子の薬剤、類似物もしくは模擬物(mimetic) であってもよい。核酸分子を使用す
る場合、この分子はTIGRプロモーター、TIGR cDNA 、TIGRイントロン、TIGRエキ
ソンまたはTIGR遺伝子のセンス、アンチセンスまたはトリプレックス・オリゴヌ
クレオチドでよい。
【０１４７】 組成物は、その投与を受容者の患者が耐えることができれば、「薬理学的に許
容されうる」といえる。薬剤は、その存在が受容者の患者の生理に検出可能な変
化を生じる場合には生理学的に意味がある。
【０１４８】 他のヒトタンパク質 (例、ヒト血清アルブミン) を含む適当なビヒクルおよび
その処方が、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences[第16版, Osol, A.編
, Mack, Easton PA (1980)] に記載されている。
【０１４９】 組成物を水溶性にしたい場合には、好ましくはpHが約７〜８のリン酸塩または
他の有機酸塩などの緩衝液中に処方してもよい。組成物が部分的にしか水溶性で
ない場合には、その溶解度を増大させるために、例えば0.04〜0.05%(w/v)、の量
のTween, PluronicsまたはPEG(例、Tween 80) といったノニオン系界面活性剤と
一緒に処方することにより、マイクロエマルションとして製剤してもよい。多糖
類やポリエチレングリコールに適用した場合の「水溶性」なる用語は、コロイド
溶液および分散液を包含する意味である。一般に、セルロース誘導体の溶解度は
エーテル基の置換度により決まり、ここで有用な安定化用誘導体は、この誘導体
を水溶性にするのに十分な量のこのようなエーテル基を、そのセルロース連鎖内
のアンヒドログルコース単位当たりで有しているべきである。アンヒドログルコ
ース単位当たり少なくとも0.35エーテル基というエーテル置換度で一般に十分で
ある。また、このセルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えば、Li、Na、Ｋまた
はCs塩の形態でもよい。
【０１５０】 酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量 (約10残基以下) のポリペプ
チド、例えば、ポリアルギニンもしくはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチ
ン、もしくはイムノグロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水
性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはアルギニン等
のアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、もしく
はデキストリン等を含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；EDTAのようなキ
レート化剤；ならびにマンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコールとい
った他の成分も任意に添加しうる。
【０１５１】 作用の持続時間を制御するために別の製剤法を採用してもよい。薬剤放出が制
御または持続された製剤は、組成物のTIGR分子と複合体形成するか、これを吸収
するポリマーの使用により達成しうる。制御された薬剤供給は、放出を制御する
のに適した高分子の種類 (例、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリ
ドン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロース、または硫酸プロタミン) と高分子の濃度ならびに薬剤の混入方法を
選択することより達成することができる。
【０１５２】 持効性処方剤を調製してもよく、これにはマイクロカプセル状粒子や移植 (体
内埋め込み) 可能な製品の形成が包含される。持効性組成物を調製するには、組
成物のTIGR分子を好ましくは生分解性のマトリックスまたはマイクロカプセル中
に混入する。この目的に適した材料はポリラクチドであるが、ポリ-D-(-)-3-ヒ
ドロキシ酪酸(EP 133,988A) のようなポリ−(a-ヒドロキシカルボン酸) の他の
ポリマーも使用できる。他の生分解性ポリマーとしては、ポリ (ラクトン) 、ポ
リ (オルトエステル) 、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、またはポリ (オルトカーボ
ネート) ポリ (アセタール) が挙げられる。このポリマー材料はまたポリエステ
ル、ポリ (乳酸) 、またはエチレン−酢酸ビニル共重合体を含むものでもよい。
持効性組成物の例については、米国特許No.3,773,919, EP 58,481A, 米国特許No
.3,887,699, EP 158,277A, カナダ特許No.1176565, Sidman, U. et al., Biopol ymers 22:547 (1983), およびLanger, R. et al., Chem. Tech. 12:98 (1982)
を参照。
【０１５３】 或いは、組成物のTIGR分子をポリマー粒子中に混入する代わりに、例えば、コ
アセルベーション法または界面重合法により製造されたマイクロカプセル [例え
ば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル
と、ポリ (メチルメタクリレート) マイクロカプセル] 中、或いはコロイド状薬
剤供給システム (例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョ
ン、ナノ粒子、およびナノカプセル) 中またはマクロエマルジョン中に、上記材
料を封入することができる。かかる製剤法は、Remington's Pharmaceutical Sci
ences (1980)に開示されている。
【０１５４】 別の態様では、この分子の細胞内取り込みが可能なリポソーム処方および方法
が採用されよう。適当な方法はこの分野で公知であり、例えば、Chicz, R.M. et
al. (PCT 出願WO94/04557), Jaysena, S.D. et al. (PCT出願WO93/12234), Yor
osh, D.B.(米国特許No.5,190,762), Callahan, M.V. et al. (米国特許No.5,270
,052) およびGonzalezro, R.J. (PCT 出願WO91/05771) を参照 (これら全部を参
考のためここに援用する) 。
【０１５５】 以上に本発明を一般的に説明したが、以下の実施例を参照すると本発明がより
容易に理解されよう。以下の実施例は例示のために示すのであり、特に記載がな
い限り、本発明を制限する意図はない。
【０１５６】
【実施例１】一本鎖高次構造多形のアッセイ例 一本鎖高次構造多形(SSCP)スクリーニングを、Hue et al., The Journal of I nvenstigative Ophthalmology 105.4:529-632 (1995)、ここに参考のため援用す
る、の操作に従って実施する。TIGRプロモーターとTIGRのエキソンの２つの中に
見いだされた配列に対応するSSCPプライマーを作成する。下記のプライマーを作
成する：フォワードプライマー"Sk-1a": 5'-TGA GGC TTC CTC TGG AAA C-3' (配
列番号６);リバースプライマー"ca2":5'-TGA AAT CAG CAC ACC AGT AG-3' (配列
番号７);フォワードプライマー"CA2":5'-GCA CCC ATA CCC CAA TAA TAG-3'(配列
番号８);リバースプライマー"Pr+1":5'-AGA GTT CCC CAG ATT TCA CC-3'(配列番
号９);フォワードプライマー"Pr-1":5'-ATC TGG GGA ACT CTT CTC AG-3'(配列番
号10);リバースプライマー"Pr+2(4A2)":5'-TAC AGT TGT TGC AGA TAC G-3'(配列
番号11);フォワードプライマー"Pr-2(4A)":5'-ACA ACG TAT CTG CAA CAA CTG-3'
(配列番号12);リバースプライマー"Pr+3(4A)":5'-TCA GGC TTA ACT GCA GAA CC
-3'(配列番号13);フォワードプライマー"Pr-3(4A)":5'-TTG GTT CTG CAG TTA AG
C C-3' (配列番号14);リバースプライマー"Pr+2(4A1)":5'-AGC AGC ACA AGG GCA
ATC C-3'(配列番号15);リバースプライマー"Pr+1(4A)":5'-ACA GGG CTA TAT TG
T GGG-3' (配列番号16);フォワードプライマー"KS1X": 5'-CCT GAG ATG CCA GCT
GTC C-3'(配列番号17);リバースプライマー"SK1XX":5'-CTG AAG CAT TAG AAG C
CA AC-3' (配列番号18);フォワードプライマー"KS2a1":5'-ACC TTG GAC CAG GCT
GCC AG-3' (配列番号19);リバースプライマー"SK3":5'-AGG TTT GTT CGA GTT C
CA G-3'(配列番号20);フォワードプライマー"KS4":5'-ACA ATT ACT GGC AAG TAT
GG-3' (配列番号21);リバースプライマー"SK6A":5'-CCT TCT CAG CCT TGC TAC
C-3' (配列番号22);フォワードプライマー"KS5":5'-ACA CCT CAG CAG ATG CTA C
C-3' (配列番号23);リバースプライマー"SK8":5'-ATG GAT GAC TGA CAT GGC C-3
'(配列番号24);フォワードプライマー"KS6":5'-AAG GAT GAA CAT GGT CAC C-3'(
配列番号25）。
【０１５７】 プライマー：Sk-1a, ca2, CA2, Pr+1, Pr-1, Pr+2(4A2), Pr-2(4A), Pr+3(4A)
, Pr-3(4A), Pr-3(4A), Pr+2(4A1), およびPr+1(4A)の位置を図４に図式的に示
す。プライマー：KS1X, SK1XX, Ks2a1, SK3, KS4, SK6A, KS5, SK8, およびKS6
の位置を図５に図式的に示す。
【０１５８】 米国オレゴン州クラマスフォール(Klamath Falls) のPOAGの病歴を持つ家族を
、Hue et al., The Journal of Invenstigative Ophthalmology 105.4:529-632
(1995) (ここに参考のため援用する) の方法に準じたSSCPによりスクリーニング
する。SSCPプライマーSk-1a, ca2, CA2, Pr+1, Pr-2(4A), Pr+3(4A), SK1XX, お
よびKS6 がこの集団における一本鎖高次構造多形を検出する。最初のSSCPを、SS
CPプライマーPr+3(4A)とPr-2(4A)を用いて検出する。オレゴン州クラマスフォー
ルの70名の家族メンバーについて、これらのプライマーによりスクリーニングし
、得られた結果を表１に示す。
【０１５９】
【表１】 合計 SSCP＋ SSCP− 緑内障陽性の人1 12 12 0 緑内障陰性の人 13 0 13 配偶者 (緑内障陰性) 16 2 14 その他2 29 6 23 １＝IOP が25 mmHg より大の人を緑内障陽性と判定、 ２＝本人の年齢のため緑内障について判定せず。
【０１６０】 第２のSSCPをSSCPプライマーPr+1およびCA2 を用いて検出する。オレゴン州ク
ラマスフォールの14名の家族メンバーをこれらのプライマーによりスクリーニン
グする。特有の多形性が、６名の罹患した家族メンバーには見られるが、８名の
非罹患メンバーでは存在しない。第３のSSCPをSSCPプライマーca2 およびsk-1a
を用いて検出する。Pr+1およびCA2 でスクリーニングしたのと同じオレゴン州ク
ラマスフォールの14名の家族メンバーを、ca2 およびsk-1a プライマーによりス
クリーニングする。特有の多形性が、６名の罹患した家族メンバーには見られる
が、８名の非罹患メンバーでは存在しない。第４のSSCPをSSCPプライマーKS6 お
よびSK1XX を用いて検出する。オレゴン州クラマスフォールの22名の家族メンバ
ーとオレゴン州ポートランド家系の10名の家族メンバーをこれらのプライマーで
スクリーニングする。多形性がエキソン３に見られる。結果を次の表２に示す。
【０１６１】
【表２】 合計 SSCP＋ SSCP− オレコ゛ン州クラマスフォールス゛ 緑内障陽性の人1 3 3 0 緑内障陰性の人 6 0 6 その他2 13 6 7 オレコ゛ン州ホ゜ートラント゛ 緑内障陽性の人1 6 6 0 緑内障陰性の人 4 0 4 その他2 0 0 0 １＝IOPが25 mmHgより大の人を緑内障陽性と判定、 ２＝本人の年齢のため緑内障について判定せず。
【０１６２】
【実施例２】TIGR相同性 ミオシリン(myocilin)と命名されたミオシンに似た新規な酸性タンパク質が主
に網膜の光受容体細胞中に発現し、特に睫毛を結合している細根(rootlet) と基
底体(basal body)に局在化している [Kubota et al., Genomics 41:360-369 (19
97) 、ここに参考のため援用する] 。ミオシリン遺伝子はヒト染色体Iq23-q24に
マッピングされている。ミオシリンのコーディング領域はTIGRと100 ％相同性で
ある。
【０１６３】 相同性サーチをGCG (Genetics Computer Group, Madison, WI)により実施し、
これはGenBank, EMBL, Swiss-Prot データベースおよびEST 解析を含む。ブラス
ト(Blast) サーチを用いて、嗅覚器の細胞外粘液タンパク質のオルファクトメジ
ン(olfactomedin)と三つのオルファクトメジンに似た種について、カルボキシ末
端の177 アミノ酸範囲で最良のフィットが見られる。図６に示した整列配列は、
ヒト脳由来の発現配列タグ(tag)(EST)配列 (ym08h12.r1)(配列番号28)(The Wash
U-Merck EST Project, 1995); ラット脳由来のオルファクトメジン関連糖タンパ
ク質のＺドメイン (1B426bAMZ) (配列番号29)[Danielson et al., Journal of N euroscience Research 38:468-478 (1994)、ここに参考のため援用する] および
ウシガエルの嗅覚組織由来のオルファクトメジン (ranofm)(配列番号30)[Yokoe
and Anholt, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:4655-4659 (1993)、ここに参考のため
援用する；Snyder and Anholt, Biochemistry 30:9143-9153 (1991) 、ここに参
考のため援用する] に対するTIGR相同性 (配列番号27) を示す。これらのドメイ
ンは、図６の共通相同性 (配列番号31) に示したように、非常に似たアミノ酸位
置を共有し、例外はその全長配列に対する位置がまだ確定していない切断(trunc
ated) ヒトクローンである。これらの分子のアミノ末端については意味ある相同
性は見られない。
【０１６４】
【実施例３】TIGRml1 の同定 局所コルチコステロイドの投与に応答したIOP 上昇を示すことが認められた被
験者からDNA サンプル (検体) を得た。典型的には、「アーマリ(Armaly)」基準
を用いてIOP 変化を記録した。
【０１６５】 血液またはバッカルスワッブ (頬内ぬぐい液) 由来のゲノムDNA をPCR 増幅に
用いた。PCR 反応は、95℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、そして72
℃で30秒の合成を含む。反応を30サイクル行った後、最後に72℃で５分の１サイ
クルを行った。
【０１６６】 PCR 反応のプライマー対は、突然変異物または多形を分析するために標的化さ
れた特定領域を増幅する任意の対を含むことができる。好ましくは、増幅領域は
転写開始より5'側の約500 塩基対から翻訳開始までであろう。より好ましくは、
これは、転写開始より5'側の約200 bpから、翻訳開始より5'側の約10塩基対まで
の増幅領域を含んでいよう。既知の配列領域内部からの増幅プライマー配列を決
定する方法は本技術分野では周知である。典型的な方法としては、それらに限ら
れないが、Primer3 (www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer.cgi) 、ST
SPipeline (www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS Pipeline)、またはGeneUp
[Pesole et al., BioTechniques 25:112-113 (1998)] といったプログラムを用
いたコンピュータ利用サーチがある。
【０１６７】 特に好ましい態様では、この増幅領域は配列番号３の5044位置から配列番号３
の約5327位置までであろう。従って、これは、配列番号３の約5044から約5066ま
での配列と、約5309から約5327までの配列、または相補物、のプライマーを使用
することになろう。１態様において、約5309から約5327までの配列の相補物をプ
ライマーの一方として使用し、約5044から約5066までの配列を他方のプライマー
として使用する。
【０１６８】 この例に対して、下記のプライマーを使用した：フォワードプライマー CA-2R
(配列番号35−5' AACTATTATT GGGGTATGGG) およびリバースプライマー Sk-la (
配列番号36−5' TTGGTGAGGC TTCCTCTGC)。プライマーはLi-Cor法により蛍光染料
IRD-800 で標識し、PCR 産物 (約300 bp) を熱により変性させ、BESSアッセイを
受けさせて突然変異を検出した。
【０１６９】 BESS、即ち、塩基切り出し配列走査 (Base Excision Sequence Scanning)は、
一本鎖DNA のＴ位置を切断する特定の制限酵素を用いた。この切断はアクリルア
ミドゲルにより観察可能なDNA 断片を作り出すであろう。これに基づいて、「Ｔ
突然変異」は、正常なDNA 鎖に比べて、突然変異したDNA 鎖に対して異なる切断
パターンを生ずるであろう。突然変異の95％はＴ突然変異を含んでいるので、こ
の方法は非常に実際的である。BESSに加えて、増幅された断片を、本技術分野で
既知のように、正確なヌクレオチド配列を決定するために、ハイブリッド形成法
(マイクロアレイ<microarray>ハイブリッド形成法またはハイブリッド形成によ
る配列決定法) により配列決定するか、比較することもできる。
【０１７０】 このアッセイを用いて、局所コルチコステロイド治療に応答してIOP 上昇を示
す患者は、TIGRコーディング領域の開始に対して5'側の約160 塩基の１つの特定
の位置で、増大したレベルのＴ突然変異を有していた。従って、この特定の突然
変異 (TIGRmtl1と名づける) の存在は、ステロイド治療に応答してIOP 上昇、従
って緑内障の少なくともより高い危険性を示すステロイド感受性に対して、特異
的な遺伝子関連性を表示していた。
【０１７１】
【表３】被験者 CS治療期間 IOP (OD/OS) 遺伝型(mt.l1) １ １年 38／30 ＋／− ２ ３週 25／28 ＋／＋ ３ ２週 28／28 ＋／＋ CS＝コルチコステロイド、局所治療 (１年) CS治療38/30 mmHg, OD/OS; (３週) CS治療25/28 mmHg, OD/OS; (２週)
CS治療28/38 mmHg, OD/OS 。
【０１７２】 配列番号33の配列 (CAAACAGACT TCCGGAAGGT)は、単一の塩基多形にすぐ隣接す
る塩基を同定するものであり、これは、配列番号１に見られる「野生型」Ｔが、
TIGRmtl1配列変異物における下線を引いたＣで置換されていることを除いて、配
列番号１の塩基5101〜5120を表している。
【０１７３】
【実施例４】TIGRmtl1と緑内障の危険性との関連性の証明 被験者には、標準的な局所デキサメタゾン点眼剤 (0.1 ％) を１日に４回、４
週間にわたって投与する。治療前および治療後のIOP 測定を行い、患者を「アー
ミー」基準により、高 (＞16 mmHg)、中 (６〜16 mmHg)、または低 (＜６mmHg)
IOP 応答に分類する。高または中IOP 変化を示す４名の被験者からDNA サンプル
を得る。不応答の数名の患者からのサンプルも採取した。これらのDNA サンプル
を、上述したようにして、TIGRmtl1変異配列の存在について解析した。結果を表
４に示す。
【０１７４】
【表４】被験者 年齢 分 類 CS-IOP応答 遺伝子型(mt.l1) １ 47 OHT 中 ＋／＋ ２ 28 POAG 高 ＋／＋ ３ 46 POAG/OHT 高 ＋／＋ ４ 15 Stevens-Johnson 高 ＋／＋ ５ 不明 正常 低 −／− ６ 不明 正常 低 −／− ７ 不明 正常 低 −／− OHT＝高眼内圧 (温和なIOP 上昇が始まるが、POAGなし) 、 POAG＝最初の診断が原発性開放角緑内障である、 POAG/OHT＝最初のOHT の診断からPOAGに転化。
【０１７５】 上で得られたデータは、TIGRmt.l1 と局所CSへの応答との関連を示している。
明らかに、CS治療に対して臨床的に同定可能な応答を示す全ての被験者がTIGRmt
l1変異配列を有していたのに対し、「野生型」配列、即ち、TIGRmtl1変異配列を
有していない配列を有する被験者はいずれもそうではなかった。
【０１７６】 以上に本発明をそのいくつかの特定の態様に関して説明したが、さらなる変更
が可能であることは理解されよう。この出願は、本開示からの逸脱が、本発明が
属する技術分野では既知または常套的な実施の範囲内に相当する場合、および本
明細書で前述し、かつ特許請求の範囲に述べた必須の構成要素に該当しうる場合
を包含する、一般に本発明の原理に従った、本発明のあらゆる変更、使用、また
は応用をカバーすることを意図している。
【０１７７】
【実施例５】TIGR遺伝子配列に結合する細胞成分を検出するためのTIGR 5' 領域／プロモータ ー活性アッセイおよび方法 TIGR 5' 領域の283 塩基5'断片 (配列番号37) を、実施例３に記載したような
正常なヒトの被験者のゲノムDNA から増幅する。このDNA を、転写がTIGR配列の
制御下におかれるようにpSEAP ベクター (Clontech, CA) にクローニングする。
より具体的には、pSEAP2エンハンサーベクターをSrf1で切断して、平滑末端を生
じさせる。この283 bpの断片を、T4リガーゼを用いて２時間該ベクターに平滑末
端連結する。ベクターをDH5 細胞中にトランスフェクションして、プラスミドク
ローンTMRE-1/pSEAPを確立する。PCR 配列決定を用いて、このクローン配列が正
しいことを検証する。同様に、TIGR.mtl1 変異物と名づけたステロイド応答性の
被験者のサンプルから増幅した等価の (対応する) ゲノム断片をpSEAP2エンハン
サー中でクローニングして、TIGR.mtl1/pSEAP クローンと名づける。
【０１７８】 HTM 細胞、Cos 細胞 (COS-7)およびHeLa細胞 (HeLa 229) を、１ウェル当たり
106 細胞ずつ接種し、１μg の前記プラスミドDNA と共にインキュベーションし
て、リポフェクチン試薬 (GIBCO, Life Technologies, MD) を用いてトランスフ
ェクションする。一部の細胞サンプルは、デキサメタゾン(DEX) による処理も行
った。その後、トランスフェクションから24、48および72時間後に、AP活性を測
定した。細胞を、L-ホモアルギニンを含有する緩衝液を用いて集め、サンプルに
化学発光基質CSPDおよび化学発光エンハンサーを添加した。その後、照度計を用
いるか、またはＸ線フィルムへの短時間露光により発現レベルを記録する。結果
は、トランスフェクションしたHTM 細胞では24時間以内にAP活性が現れ、発現レ
ベルはトランスフェクションから48および72時間後には50倍以上に増大すること
を示す。これに対して、HeLaおよびCos 細胞は、同じ時点でごく僅かのAP活性を
示す。
【０１７９】 TIGR配列に特異的に結合する細胞成分を検出するために、増幅したゲノム断片
を、T4キナーゼを用いた32PdATP による末端標識等により適当に標識する。標識
した断片を次いで、DEX (500 nM)による＋／−処理のTM細胞の核抽出物と共に10
日間、およびHeLa細胞抽出物 (Stratagene, CA) と共に０℃で15分間、インキュ
ベーションする。サンプルをその後、低イオン強度の非変性ポリアクリルアミド
ゲルに流す。ゲルをその後、乾燥し、Ｘ線フィルムに一晩露出する。図９に現れ
た移動度のシフトは、HTM 細胞由来のDNA 結合成分の存在と、DEX による処理が
結合の量または強度を変化させることを実証している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1A, 1B, 1C, 1Dおよび1Eは、緑内障のない人から得たTIGRプロモーター領域
の核酸配列 (配列番号１) を提示する。
【図２】 図2A, 2B, 2Cおよび2Dは、緑内障変異遺伝子のTIGRmt1, TIGRmt2, TIGRmt3, T
IGRmt4, TIGRmt5 、TIGRmtl1およびTIGRsv1(配列番号２) に関係する、太字で目
立たせた位置および配列変化を提示する。
【図３】 図3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3Fおよび3Gは、TIGRプロモーター、ならびにTIGRエキ
ソン、TIGRイントロンおよびTIGR下流配列の核酸配列 (配列番号３、配列番号４
、および配列番号５) を提示する。
【図４】 一本鎖高次構造多形(SSCP, Single Strand Conformational Polymorphism) 解
析のためのTIGR遺伝子プロモーター上のプライマー位置を図式的に示す図を提示
する。
【図５】 TIGRエキソンとSSCPプライマーの配置を図式的に示す図を提示する。
【図６】 オルファクトメジン(olfactomedin)およびオルファクトメジン関連タンパク質
とのTIGR相同性のホモロジー解析を提示する。
【図７】 TIGRのヌクレオチド配列 (配列番号26) を示す。
【図８】 TIGRのアミノ酸配列 (配列番号32) を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ポランスキー、ジョン・アール アメリカ合衆国、カリフォルニア州94941、 ミル・バレー、スタントン・ウェイ15 (72)発明者 チェン、プー アメリカ合衆国、バーモント州05495、ビ リストン、セス・サークル60 (72)発明者 チェン、ファー アメリカ合衆国、カリフォルニア州94121、 サンフランシスコ、トゥエンティース・ア ベニュー371 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA04 CA09 DA02 EA04 FA01 GA11 HA12 4B063 QA01 QA17 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR56 QR60 QR62 QR77 QR80 QS16 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 BA02 CA44 CA46 4C084 AA17 NA05 ZA331 ZA332 ZB212 ZC082 4C086 AA01 AA02 DA10 MA01 MA04 NA05 ZA33

Claims (111)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記工程を含む、患者の緑内障を診断する方法： (A) 核酸ハイブリッド形成を可能にする条件下で、TIGRプロモーターに連結し
    ているポリヌクレオチドに特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドのヌ
    クレオチド配列を含む第１のマーカー核酸分子と、該患者の細胞または体液から
    得た相補的核酸分子とをインキュベーションし、ここで該マーカー核酸分子と該
    患者から得た該相補的核酸分子との間の核酸ハイブリッド形成は、その存在が該
    患者のTIGR応答に影響する突然変異の予測となる多形性の検出を可能にするもの
    であり； (B) 該マーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子との間でハイブリ
    ッド形成させ；そして (C) 該多形性の存在を検出し、ここで該多形性の検出が緑内障の診断となる。
  2. 【請求項２】 該マーカー核酸分子がTIGRmt1 を特異的に検出することがで
    きる、請求項１記載の患者の緑内障を診断する方法。
  3. 【請求項３】 該マーカー核酸分子がTIGRmt2 を特異的に検出することがで
    きる、請求項１記載の患者の緑内障を診断する方法。
  4. 【請求項４】 該マーカー核酸分子がTIGRmt3 を特異的に検出することがで
    きる、請求項１記載の患者の緑内障を診断する方法。
  5. 【請求項５】 該マーカー核酸分子がTIGRmt4 を特異的に検出することがで
    きる、請求項１記載の患者の緑内障を診断する方法。
  6. 【請求項６】 該マーカー核酸分子がTIGRmt5 を特異的に検出することがで
    きる、請求項１記載の患者の緑内障を診断する方法。
  7. 【請求項７】 該マーカー核酸分子がTIGRsv1 を特異的に検出することがで
    きる、請求項１記載の患者の緑内障を診断する方法。
  8. 【請求項８】 第２のマーカー核酸分子をさらに含む、請求項１記載の患者
    の緑内障を診断する方法。
  9. 【請求項９】 該第１のマーカー核酸分子と該第２のマーカー核酸分子が、
    配列番号６の配列を含む核酸分子、配列番号７の配列を含む核酸分子、配列番号
    ８の配列を含む核酸分子、配列番号９の配列を含む核酸分子、配列番号10の配列
    を含む核酸分子、配列番号11の配列を含む核酸分子、配列番号12の配列を含む核
    酸分子、配列番号13の配列を含む核酸分子、配列番号14の配列を含む核酸分子、
    配列番号15の配列を含む核酸分子、配列番号16の配列を含む核酸分子、配列番号
    17の配列を含む核酸分子、配列番号18の配列を含む核酸分子、配列番号19の配列
    を含む核酸分子、配列番号20の配列を含む核酸分子、配列番号21の配列を含む核
    酸分子、配列番号22の配列を含む核酸分子、配列番号23の配列を含む核酸分子、
    配列番号24の配列を含む核酸分子、および配列番号25の配列を含む核酸分子より
    なる群から選ばれる、請求項８記載の患者の緑内障を診断する方法。
  10. 【請求項１０】 該第１のマーカー核酸分子と該第２のマーカー核酸分子が
    、配列番号６の配列を含む核酸分子、配列番号７の配列を含む核酸分子、配列番
    号８の配列を含む核酸分子、配列番号９の配列を含む核酸分子、配列番号12の配
    列を含む核酸分子、配列番号13の配列を含む核酸分子、配列番号18の配列を含む
    核酸分子、および配列番号25の配列を含む核酸分子よりなる群から選ばれる、請
    求項９記載の患者の緑内障を診断する方法。
  11. 【請求項１１】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号13の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号12の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項10記載の患者の緑内障を診断する方法。
  12. 【請求項１２】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号９の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号８の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項10記載の患者の緑内障を診断する方法。
  13. 【請求項１３】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号７の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号６の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項10記載の患者の緑内障を診断する方法。
  14. 【請求項１４】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号18の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号25の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項10記載の患者の緑内障を診断する方法。
  15. 【請求項１５】 下記工程を含む、患者のステロイド感受性を診断する方法
    ： (A) 核酸ハイブリッド形成を可能にする条件下で、TIGRプロモーターに連結し
    ているポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第１のマーカー核酸分子と、
    該患者の細胞または体液から得た相補的核酸分子とをインキュベーションし、こ
    こで該マーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子との間の核酸ハイブ
    リッド形成は、その存在が該患者のTIGR応答に影響する突然変異の予測となる多
    形性の検出を可能にするものであり； (B) 該TIGRをコードするマーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子
    との間でハイブリッド形成させ；そして (C) 該多形性の存在を検出し、ここで該多形性の検出がステロイド感受性の診
    断となる。
  16. 【請求項１６】 該マーカー核酸分子がTIGRmt1 を特異的に検出することが
    できる、請求項15記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  17. 【請求項１７】 該マーカー核酸分子がTIGRmt2 を特異的に検出することが
    できる、請求項15記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  18. 【請求項１８】 該マーカー核酸分子がTIGRmt3 を特異的に検出することが
    できる、請求項15記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  19. 【請求項１９】 該マーカー核酸分子がTIGRmt4 を特異的に検出することが
    できる、請求項15記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  20. 【請求項２０】 該マーカー核酸分子がTIGRmt5 を特異的に検出することが
    できる、請求項15記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  21. 【請求項２１】 該マーカー核酸分子がTIGRsv1 を特異的に検出することが
    できる、請求項15記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  22. 【請求項２２】 第２のマーカー核酸分子をさらに含む、請求項15記載の患
    者のステロイド感受性を診断する方法。
  23. 【請求項２３】 該第１のマーカー核酸分子と該第２のマーカー核酸分子が
    、配列番号６の配列を含む核酸分子、配列番号７の配列を含む核酸分子、配列番
    号８の配列を含む核酸分子、配列番号９の配列を含む核酸分子、配列番号10の配
    列を含む核酸分子、配列番号11の配列を含む核酸分子、配列番号12の配列を含む
    核酸分子、配列番号13の配列を含む核酸分子、配列番号14の配列を含む核酸分子
    、配列番号15の配列を含む核酸分子、配列番号16の配列を含む核酸分子、配列番
    号17の配列を含む核酸分子、配列番号18の配列を含む核酸分子、配列番号19の配
    列を含む核酸分子、配列番号20の配列を含む核酸分子、配列番号21の配列を含む
    核酸分子、配列番号22の配列を含む核酸分子、配列番号23の配列を含む核酸分子
    、配列番号24の配列を含む核酸分子、および配列番号25の配列を含む核酸分子よ
    りなる群から選ばれる、請求項22記載の患者のステロイド感受性を診断する方法
    。
  24. 【請求項２４】 該第１のマーカー核酸分子と該第２のマーカー核酸分子が
    、配列番号６の配列を含む核酸分子、配列番号７の配列を含む核酸分子、配列番
    号８の配列を含む核酸分子、配列番号９の配列を含む核酸分子、配列番号12の配
    列を含む核酸分子、配列番号13の配列を含む核酸分子、配列番号18の配列を含む
    核酸分子、および配列番号25の配列を含む核酸分子よりなる群から選ばれる、請
    求項23記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  25. 【請求項２５】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号13の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号12の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項24記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  26. 【請求項２６】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号９の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号５の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項24記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  27. 【請求項２７】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号７の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号６の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項24記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  28. 【請求項２８】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号18の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号25の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項24記載の患者のステロイド感受性を診断する方法。
  29. 【請求項２９】 該患者の細胞または体液から得た該相補的核酸分子が拡散
    増幅法を用いて増幅されたものである、請求項10項または第24記載の方法。
  30. 【請求項３０】 該マーカー核酸分子がD1S2536 マーカー核酸、D1S210マー
    カー核酸、D1S1552 マーカー核酸、D1S2536 マーカー核酸、D1S2790 マーカー核
    酸、SHGC-12820マーカー核酸、およびD1S2558 マーカー核酸よりなる群から選ば
    れる、請求項１記載の方法。
  31. 【請求項３１】 該マーカー核酸分子がD1S2536 マーカー核酸である、請求
    項30記載の方法。
  32. 【請求項３２】 該マーカー核酸分子がD1S2536 マーカー核酸、D1S210マー
    カー核酸、D1S1552 マーカー核酸、D1S2536 マーカー核酸、D1S2790 マーカー核
    酸、SHGC-12820マーカー核酸、およびD1S2558 マーカー核酸よりなる群から選ば
    れる、請求項15記載の方法。
  33. 【請求項３３】 該マーカー核酸分子がD1S2536 マーカー核酸である、請求
    項32記載の方法。
  34. 【請求項３４】 配列番号１の配列を含む核酸分子。
  35. 【請求項３５】 配列番号１に特異的にハイブリッド形成するポリペプチド
    を含んでいる組換えDNA 分子。
  36. 【請求項３６】 配列番号１の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質
    的に精製された分子。
  37. 【請求項３７】 配列番号３の配列を含む核酸分子。
  38. 【請求項３８】 配列番号３に特異的にハイブリッド形成するポリペプチド
    を含んでいる組換えDNA 分子。
  39. 【請求項３９】 配列番号３の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質
    的に精製された分子。
  40. 【請求項４０】 配列番号４の配列を含む核酸分子。
  41. 【請求項４１】 配列番号４に特異的にハイブリッド形成するポリペプチド
    を含んでいる組換えDNA 分子。
  42. 【請求項４２】 配列番号４の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質
    的に精製された分子。
  43. 【請求項４３】 配列番号５の配列を含む核酸分子。
  44. 【請求項４４】 配列番号５に特異的にハイブリッド形成するポリペプチド
    を含んでいる組換えDNA 分子。
  45. 【請求項４５】 配列番号５の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質
    的に精製された分子。
  46. 【請求項４６】 配列番号26の配列を含む核酸分子。
  47. 【請求項４７】 配列番号26に特異的にハイブリッド形成するポリペプチド
    を含んでいる組換えDNA 分子。
  48. 【請求項４８】 配列番号26の配列を含む核酸分子に特異的に結合する実質
    的に精製された分子。
  49. 【請求項４９】 PRL-FP111 に特有のシスエレメントを含む核酸分子、グル
    ココルチコイド応答シスエレメントを含む核酸分子、GR/PR に特有のシスエレメ
    ントを含む核酸分子、シェアストレス応答シスエレメントを含む核酸分子、グル
    ココルチコイド応答シスエレメントを含む核酸分子、CBE に特有のシスエレメン
    トを含む核酸分子、NFE を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子
    、KTF.1-CSを結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、PRE に特有
    のシスエレメントを含む核酸分子、ETF-EGFRに特有のシスエレメントを含む核酸
    分子、SRE-cFosを結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、Alu に
    特有のシスエレメントを含む核酸分子、VBP を結合することができるシスエレメ
    ントを含む核酸分子、Malt-CS に特有のシスエレメントを含む核酸分子、ERE を
    結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、NF変異原に特有のシスエ
    レメントを含む核酸分子、myc-PRF を結合することができるシスエレメントを含
    む核酸分子、AP2 を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、HSTF
    を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、SBF に特有のシスエレ
    メントを含む核酸分子、NF-1を結合することができるシスエレメントを含む核酸
    分子、NF-MHCIIA/B を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、PE
    A1を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、ICS に特有のシスエ
    レメントを含む核酸分子、ISGF2 を結合することができるシスエレメントを含む
    核酸分子、亜鉛を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、CAP/CR
    P-galOに特有のシスエレメントを含む核酸分子、AP1 を結合することができるシ
    スエレメントを含む核酸分子、SRY を結合することができるシスエレメントを含
    む核酸分子、GC2 に特有のシスエレメントを含む核酸分子、PEA3を結合すること
    ができるシスエレメントを含む核酸分子、MIR に特有のシスエレメントを含む核
    酸分子、NF-HNF-1を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、甲状
    腺受容体シスエレメントを含む核酸分子、およびNFκB を結合することができる
    シスエレメントを含む核酸分子よりなる群から選ばれた核酸分子に特異的に結合
    する、実質的に精製された分子。
  50. 【請求項５０】 配列番号１内に位置するシスエレメントを結合することが
    できる有効量の薬剤を緑内障患者に投与することを含む、緑内障の治療方法。
  51. 【請求項５１】 該薬剤がTIGR mRNA の発現を阻害する、請求項50記載の方
    法。
  52. 【請求項５２】 該薬剤が配列番号１内のDNA 配列を結合する、請求項50記
    載の方法。
  53. 【請求項５３】 該薬剤が、PRL-FP111 に特有のシスエレメントを含む核酸
    分子、グルココルチコイド応答シスエレメントを含む核酸分子、GR/PR に特有の
    シスエレメントを含む核酸分子、シェアストレス応答シスエレメントを含む核酸
    分子、グルココルチコイド応答シスエレメントを含む核酸分子、CBE に特有のシ
    スエレメントを含む核酸分子、NFE を結合することができるシスエレメントを含
    む核酸分子、KTF.1-CSを結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、
    PRE に特有のシスエレメントを含む核酸分子、ETF-EGFRに特有のシスエレメント
    を含む核酸分子、SRE-cFosを結合することができるシスエレメントを含む核酸分
    子、Alu に特有のシスエレメントを含む核酸分子、VBP を結合することができる
    シスエレメントを含む核酸分子、Malt-CS に特有のシスエレメントを含む核酸分
    子、ERE を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、NF変異原に特
    有のシスエレメントを含む核酸分子、myc-PRF を結合することができるシスエレ
    メントを含む核酸分子、AP2 を結合することができるシスエレメントを含む核酸
    分子、HSTFを結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、SBF に特有
    のシスエレメントを含む核酸分子、NF-1を結合することができるシスエレメント
    を含む核酸分子、NF-MHCIIA/B を結合することができるシスエレメントを含む核
    酸分子、PEA1を結合することができるシスエレメントを含む核酸分子、ICS に特
    有のシスエレメントを含む核酸分子、ISGF2 を結合することができるシスエレメ
    ントを含む核酸分子、亜鉛を結合することができるシスエレメントを含む核酸分
    子、CAP/CRP-galOに特有のシスエレメントを含む核酸分子、AP1 を結合すること
    ができるシスエレメントを含む核酸分子、SRY を結合することができるシスエレ
    メントを含む核酸分子、GC2 に特有のシスエレメントを含む核酸分子、PEA3を結
    合することができるシスエレメントを含む核酸分子、MIR に特有のシスエレメン
    トを含む核酸分子、NF-HNF-1を結合することができるシスエレメントを含む核酸
    分子、甲状腺受容体シスエレメントを含む核酸分子、およびNFκB を結合するこ
    とができるシスエレメントを含む核酸分子、を結合する、請求項50記載の方法。
  54. 【請求項５４】 下記工程を含む、患者の緑内障を予知する方法： (A) 核酸ハイブリッド形成を可能にする条件下で、TIGRプロモーターに連結し
    ているポリヌクレオチドに特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドのヌ
    クレオチド配列を含む第１のマーカー核酸分子と、該患者の細胞または体液から
    得た相補的核酸分子とをインキュベーションし、ここで該マーカー核酸分子と該
    患者から得た該相補的核酸分子との間の核酸ハイブリッド形成は、その存在が該
    患者のTIGR応答に影響する突然変異の予測となる多形性の検出を可能にするもの
    であり； (B) 該マーカー核酸分子と該患者から得た該相補的核酸分子との間でハイブリ
    ッド形成させ；そして (C) 該多形性の存在を検出し、ここで該多形性の検出が緑内障の予知となる。
  55. 【請求項５５】 該マーカー核酸分子がTIGRmt1 を特異的に検出することが
    できる、請求項54記載の患者の緑内障を予知する方法。
  56. 【請求項５６】 該マーカー核酸分子がTIGRmt2 を特異的に検出することが
    できる、請求項54記載の患者の緑内障を予知する方法。
  57. 【請求項５７】 該マーカー核酸分子がTIGRmt3 を特異的に検出することが
    できる、請求項54記載の患者の緑内障を予知する方法。
  58. 【請求項５８】 該マーカー核酸分子がTIGRmt4 を特異的に検出することが
    できる、請求項54記載の患者の緑内障を予知する方法。
  59. 【請求項５９】 該マーカー核酸分子がTIGRmt5 を特異的に検出することが
    できる、請求項54記載の患者の緑内障を予知する方法。
  60. 【請求項６０】 該マーカー核酸分子がTIGRsv1 を特異的に検出することが
    できる、請求項54記載の患者の緑内障を予知する方法。
  61. 【請求項６１】 第２のマーカー核酸分子をさらに含む、請求項54記載の患
    者の緑内障を予知する方法。
  62. 【請求項６２】 該第１のマーカー核酸分子と該第２のマーカー核酸分子が
    、配列番号６の配列を含む核酸分子、配列番号７の配列を含む核酸分子、配列番
    号８の配列を含む核酸分子、配列番号９の配列を含む核酸分子、配列番号10の配
    列を含む核酸分子、配列番号11の配列を含む核酸分子、配列番号12の配列を含む
    核酸分子、配列番号13の配列を含む核酸分子、配列番号14の配列を含む核酸分子
    、配列番号15の配列を含む核酸分子、配列番号16の配列を含む核酸分子、配列番
    号17の配列を含む核酸分子、配列番号18の配列を含む核酸分子、配列番号19の配
    列を含む核酸分子、配列番号20の配列を含む核酸分子、配列番号21の配列を含む
    核酸分子、配列番号22の配列を含む核酸分子、配列番号23の配列を含む核酸分子
    、配列番号24の配列を含む核酸分子、および配列番号25の配列を含む核酸分子よ
    りなる群から選ばれる、請求項61記載の患者の緑内障を予知する方法。
  63. 【請求項６３】 該第１のマーカー核酸分子と該第２のマーカー核酸分子が
    、配列番号６の配列を含む核酸分子、配列番号７の配列を含む核酸分子、配列番
    号８の配列を含む核酸分子、配列番号９の配列を含む核酸分子、配列番号12の配
    列を含む核酸分子、配列番号13の配列を含む核酸分子、配列番号18の配列を含む
    核酸分子、および配列番号25の配列を含む核酸分子よりなる群から選ばれる、請
    求項62記載の患者の緑内障を予知する方法。
  64. 【請求項６４】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号13の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号12の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項63記載の患者の緑内障を予知する方法。
  65. 【請求項６５】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号９の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号８の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項63記載の患者の緑内障を予知する方法。
  66. 【請求項６６】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号７の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号６の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項63記載の患者の緑内障を予知する方法。
  67. 【請求項６７】 該第１のマーカー核酸分子が配列番号18の配列を含む核酸
    分子であり、該第２のマーカー核酸分子が配列番号25の配列を含む核酸分子であ
    る、請求項63記載の患者の緑内障を予知する方法。
  68. 【請求項６８】 該マーカー核酸分子がD1S2536 マーカー核酸、D1S210マー
    カー核酸、D1S1552 マーカー核酸、D1S2536 マーカー核酸、D1S2790 マーカー核
    酸、SHGC-12820マーカー核酸、およびD1S2558 マーカー核酸よりなる群から選ば
    れる、請求項54記載の方法。
  69. 【請求項６９】 該マーカー核酸分子がD1S2536 マーカー核酸である、請求
    項68記載の方法。
  70. 【請求項７０】 配列番号33およびその相補物、mtl1配列変異物の特徴的な
    ＣからＴの置換を有する核酸に特異的にハイブリッド形成する配列番号33の領域
    もしくはその相補物、ならびにTIGRmtl1配列変異物の特徴的なＣからＴの置換を
    有する核酸に特異的にハイブリッド形成するが、高緊縮性条件下でTIGRmtl1配列
    変異物を有しない核酸に特異的にハイブリッド形成しない配列番号33の領域もし
    くはその相補物、よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列を含む核酸。
  71. 【請求項７１】 請求項70の核酸に特異的にハイブリッド形成する核酸。
  72. 【請求項７２】 請求項70の核酸を含むベクター。
  73. 【請求項７３】 請求項70の核酸を含む細胞。
  74. 【請求項７４】 DNA を含有するサンプル中の特徴的TIGRmtl1配列変異の有
    無を検出する方法であって、標識された請求項70記載の核酸を、ハイブリッド形
    成条件下でサンプルのDNA と接触させ、標識された核酸を含むハイブリッド核酸
    分子の存在を決定することを含む方法。
  75. 【請求項７５】 請求項74記載の方法を含む、患者における緑内障もしくは
    視野の低下を生ずる進行性高眼内圧障害への増大した罹患性の存在、またはステ
    ロイド感受性の存在を決定する方法であって、DNA を含有するサンプルが該患者
    に由来するものである方法。
  76. 【請求項７６】 患者をステロイド化合物で治療する間または後に行われる
    、請求項75記載の方法。
  77. 【請求項７７】 ステロイド化合物の投与前に行われる、請求項75記載の方
    法。
  78. 【請求項７８】 患者における緑内障もしくは視野の低下を生ずる進行性高
    眼内圧障害への増大した罹患性の存在、またはステロイド感受性の存在を決定す
    るためのキットであって、標識された請求項70記載の核酸と、この標識された核
    酸とのハイブリッド形成を検出する手段とを含んでいるキット。
  79. 【請求項７９】 配列番号１〜３もしくは34の１つ、ならびに機能的調節領
    域を有する配列番号１〜３もしくは34の断片、よりなる群から選ばれたヌクレオ
    チド配列を含む核酸。
  80. 【請求項８０】 請求項79記載の配列の導入核酸を含む細胞。
  81. 【請求項８１】 請求項79記載の核酸を含むベクター。
  82. 【請求項８２】 核酸への分子の特異的結合を検出する方法であって、請求
    項79記載の核酸を用意し、この核酸を試験すべき分子を含有するサンプルと接触
    させ、そして核酸への分子の結合を同定することを含む方法。
  83. 【請求項８３】 同定工程がゲルシフトアッセイを含む、請求項82記載の方
    法。
  84. 【請求項８４】 核酸が標識されている、請求項82記載の方法。
  85. 【請求項８５】 DNA を含有するサンプル中のTIGRmtl1配列変異の存在を検
    出する方法であって、TIGRmtl1配列変異物のＴからＣの置換を含有する選択され
    た核酸領域の増幅を命令する増幅反応プライマーを用意し、この増幅反応プライ
    マーにより規定される核酸を増幅し、増幅された核酸中のＴからＣへの置換の有
    無を決定することを含む方法。
  86. 【請求項８６】 ＴからＣへの置換の有無を決定することが増幅された核酸
    を配列決定することを含む、請求項85記載の方法。
  87. 【請求項８７】 ＴからＣへの置換の有無を決定することがハイブリッド形
    成アッセイを含む、請求項86記載の方法。
  88. 【請求項８８】 請求項85記載の方法を含む、患者における緑内障もしくは
    視野の低下を生ずる進行性高眼内圧障害への増大した罹患性の存在、またはステ
    ロイド感受性の存在を決定する方法であって、DNA を含有するサンプルが該患者
    に由来するものである方法。
  89. 【請求項８９】 患者における緑内障もしくは視野の低下を生ずる進行性高
    眼内圧障害への増大した罹患性の存在、またはステロイド感受性の存在を決定す
    るためのキットであって、TIGRmtl1配列変異物のＴからＣの置換を含有する選択
    された核酸領域の増幅を命令する増幅反応プライマーと、ＴからＣの置換を含有
    する領域を増幅するための酵素とを含んでいるキット。
  90. 【請求項９０】 TIGR遺伝子の5'フランキング領域における多形を検出する
    方法であって、配列番号６〜25もしくは35のヌクレオチド配列もしくはその相補
    物、配列番号６〜25もしくは35の断片由来のヌクレオチド配列もしくはその相補
    物、ならびに配列番号１〜３もしくは34における5'フランキング配列の約18〜約
    60ヌクレオチド断片由来のヌクレオチド配列もしくはその相補物よりなる群から
    増幅反応プライマーを選択し、DNA のサンプル中で増幅反応プライマーにより規
    定される5'フランキング領域の選択された核酸領域を増幅し、そして増幅された
    核酸の配列の少なくとも一部を配列番号１〜３に記載された配列と比較すること
    を含む方法。
  91. 【請求項９１】 配列番号37または配列番号38を含む実質的に精製された核
    酸分子。
  92. 【請求項９２】 組織特異的プロモーター活性を付与することができる請求
    項91記載の核酸分子。
  93. 【請求項９３】 請求項91記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
  94. 【請求項９４】 請求項91記載の核酸分子を含むベクター。
  95. 【請求項９５】 導入された核酸分子を含む細胞であって、導入された核酸
    分子が請求項91記載の核酸分子を含む細胞。
  96. 【請求項９６】 配列番号37または配列番号38に対して約95％の同一性を有
    する配列を含む実質的に精製された核酸分子。
  97. 【請求項９７】 組織特異的プロモーター活性を付与することができる請求
    項96記載の核酸分子。
  98. 【請求項９８】 請求項96記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
  99. 【請求項９９】 請求項96記載の核酸分子を含むベクター。
  100. 【請求項１００】 導入された核酸分子を含む細胞であって、導入された核
    酸分子が請求項96記載の核酸分子を含む細胞。
  101. 【請求項１０１】 組織特異的発現を付与することができる、配列番号37も
    しくは配列番号38またはその変異物を含む実質的に精製された核酸分子。
  102. 【請求項１０２】 請求項101 記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
  103. 【請求項１０３】 請求項101 記載の核酸分子を含むベクター。
  104. 【請求項１０４】 導入された核酸分子を含む細胞であって、導入された核
    酸分子が請求項101 記載の核酸分子を含む細胞。
  105. 【請求項１０５】 TIGR遺伝子の配列に結合するタンパク質または第１の化
    合物を同定する方法であって、配列番号37もしくは38、またはそのどちらかの変
    異物、または配列番号３もしくは34の領域、を含む核酸分子を、該タンパク質ま
    たは第１の化合物を含有する組成物と共にインキュベーションし、該核酸分子へ
    の結合の存在を検出することを含む方法。
  106. 【請求項１０６】 TIGR遺伝子配列へのタンパク質または第１の化合物の結
    合を変調させる第２の化合物を同定する方法であって、請求項105 の各工程を含
    み、さらに該核酸分子に第２の化合物を添加する工程と、検出された結合を対照
    と比較する工程とを含む方法。
  107. 【請求項１０７】 TIGR遺伝子の発現を変調させるタンパク質または化合物
    を同定する方法であって、配列番号37もしくは38、またはそのどちらかの変異物
    、または配列番号３もしくは34の領域、を含む核酸分子を、該タンパク質または
    化合物を含有する組成物と共にインキュベーションし、該核酸分子への結合の存
    在を対照と比較して検出することを含む方法。
  108. 【請求項１０８】 核酸分子が細胞内に含有されている請求項107 記載の方
    法。
  109. 【請求項１０９】 TIGR遺伝子の発現を変調させる細胞成分を同定する方法
    であって、配列番号37もしくは38、またはそのどちらかの変異物、または配列番
    号３もしくは34の領域、を含む核酸分子を、細胞の抽出物と共にインキュベーシ
    ョンし、該核酸分子への特異的結合の存在を検出することを含む方法。
  110. 【請求項１１０】 TIGR遺伝子のステロイド誘導を変調させる化合物を同定
    する方法であって、TIGR5'調節領域を含む導入された核酸分子を含有す細胞を、
    該化合物と共にインキュベーションし、TIGR 5' 調節領域に連結した遺伝子の発
    現を検出するすることを含む方法。
  111. 【請求項１１１】 5'調節領域配列が配列番号37もしくは38、またはそのど
    ちらかの変異物、または配列番号３もしくは34の領域を含む、請求項110 記載の
    方法。
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