JP2002534096A - マイクロフルイド装置を使用するｄｎａをシークエンシングするための方法 - Google Patents
マイクロフルイド装置を使用するｄｎａをシークエンシングするための方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
- B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
- B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
- B29C59/16—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by wave energy or particle radiation, e.g. infrared heating
Abstract
(57)【要約】
本発明は、マイクロフルイド特性を有する装置およびその使用のための試薬の組においてＤＮＡをシークエンシングするための方法を記載する。このマイクロフルイド装置は、１またはそれ以上のマイクロチャンネル構造について共通であってよい内部アプリケーションを有する、放射状に伸長するマイクロチャンネル構造(ＣＤ形態)を有するディスクの形態であってよい。ディスクをスピンすることによって液体はアプリケーター領域から反応へ駆動され、および／または検出はディスクの辺縁付近である。さらに、液体輸送は、求心力によって駆動され得る。該マイクロフルイド装置は、他の幾何学的な形態であってもよい。本発明によれば、いくつかの方法が、ＤＮＡの配列を決定するために使用されることができるが、ルシフェラーゼルシフェリン反応を使用する放出されたピロフォスフェートのリアルタイムな定量が好ましい。
Description
【０００１】 核酸の高処理量シークエンシングのための方法、装置および試薬。 本発明は、シークエンシング方法がピロシークエンシングに基づく、核酸をシ
ークエンシングするための方法、ＤＮＡ含有サンプルを取り扱う装置、および試
薬キットに基づく。 ＤＮＡシークエンシングは、基礎的な分子生物学の研究に不可欠な手段である
。将来、ＤＮＡシークエンシングは、診断研究および応用ゲノム診断の両方にお
いて使用されることが期待され得る。
ークエンシングするための方法、ＤＮＡ含有サンプルを取り扱う装置、および試
薬キットに基づく。 ＤＮＡシークエンシングは、基礎的な分子生物学の研究に不可欠な手段である
。将来、ＤＮＡシークエンシングは、診断研究および応用ゲノム診断の両方にお
いて使用されることが期待され得る。
【０００２】 新しいＤＮＡシークエンシングの多くは、ショットガンシークエンシングによ
っておよびサンガーの酵素的チェーンターミネーション法によって実施される。
配列は、予め決定したオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることによって
調製したＤＮＡフラグメントの決定によって、ゲル電気泳動を使用してもたらさ
れる。ＤＮＡフラグメントの分離およびその次の分析は厄介であり、これらの段
階を自動化するために多くの努力がなされた。自動化されたＤＮＡシークエンサ
ーが、大規模のゲノムプロジェクトに使用されるという事実にもかかわらず、ゲ
ノムシークエンシングおよび日常的な臨床的応用の両方のために、高処理量のＤ
ＮＡシークエンシング装置の必要性がある。
っておよびサンガーの酵素的チェーンターミネーション法によって実施される。
配列は、予め決定したオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることによって
調製したＤＮＡフラグメントの決定によって、ゲル電気泳動を使用してもたらさ
れる。ＤＮＡフラグメントの分離およびその次の分析は厄介であり、これらの段
階を自動化するために多くの努力がなされた。自動化されたＤＮＡシークエンサ
ーが、大規模のゲノムプロジェクトに使用されるという事実にもかかわらず、ゲ
ノムシークエンシングおよび日常的な臨床的応用の両方のために、高処理量のＤ
ＮＡシークエンシング装置の必要性がある。
【０００３】 ピロシークエンシングは、修飾ピロフォスフェート(ＰＰｉ)に基づいたシーク
エンシング法であり、ＰＰｉはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の
放出によって検出される(例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１３５２３および９
８／２８４４０参照)。１つのヌクレオチド分子が成長しているＤＮＡ鎖に取り
込まれるそれぞれの時間に、ＰＰｉの１つの分子が放出される。検出される光は
、成長したＤＮＡ鎖における取り込まれた塩基の数に直接比例するる。この方法
の主要な欠点は、同時に取り扱うことのできるサンプルの数および検出のスピー
ドである。ゆえに、ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２８４４０は、９６ウェルのマクロタ
イタープレートにおける反応を記載している。各ウェルの体積は、１０−５００
マイクロリットルの間であるので、試薬のコストは高く、該方法の使用は限定さ
れる。
エンシング法であり、ＰＰｉはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の
放出によって検出される(例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１３５２３および９
８／２８４４０参照)。１つのヌクレオチド分子が成長しているＤＮＡ鎖に取り
込まれるそれぞれの時間に、ＰＰｉの１つの分子が放出される。検出される光は
、成長したＤＮＡ鎖における取り込まれた塩基の数に直接比例するる。この方法
の主要な欠点は、同時に取り扱うことのできるサンプルの数および検出のスピー
ドである。ゆえに、ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２８４４０は、９６ウェルのマクロタ
イタープレートにおける反応を記載している。各ウェルの体積は、１０−５００
マイクロリットルの間であるので、試薬のコストは高く、該方法の使用は限定さ
れる。
【０００４】 マイクロタイタープレートにおいてピロシークエンシング法を実施するとき、
反応混合物を反応チャンバーに添加するが、ウェルから溶液を除去しないので、
反応は限られた回数しかできず、それによって短い長さのＤＮＡ配列しか生成し
ない。主要な問題の内の１つは、光発生反応を妨害する、誤った取り込みにつな
がる過剰なｄＮＴＰおよびｄＡＴＰを除去することである。ＷＯ９８／２８４４
０は、これに対処するために、ヌクレオチド分解酵素、例えばアピラーゼの添加
を記載している。
反応混合物を反応チャンバーに添加するが、ウェルから溶液を除去しないので、
反応は限られた回数しかできず、それによって短い長さのＤＮＡ配列しか生成し
ない。主要な問題の内の１つは、光発生反応を妨害する、誤った取り込みにつな
がる過剰なｄＮＴＰおよびｄＡＴＰを除去することである。ＷＯ９８／２８４４
０は、これに対処するために、ヌクレオチド分解酵素、例えばアピラーゼの添加
を記載している。
【０００５】 本発明の目的は、ピロシークエンシングの有するいくつかの以前の問題、例え
ば、マイクロタイタープレート中でピロシークエンシングを実施するときに体積
が大きいこと等を解決し、さらに試薬の消費を減少させ、数百のサンプルの分析
を同時に可能とし、さらに高処理量システムを提供することである。
ば、マイクロタイタープレート中でピロシークエンシングを実施するときに体積
が大きいこと等を解決し、さらに試薬の消費を減少させ、数百のサンプルの分析
を同時に可能とし、さらに高処理量システムを提供することである。
【０００６】 アレイドプライマーエクステンション(ＡＰＥＸ)は、多数のプライマーを固体
表面に固定することにより行い、それにより、ＤＮＡチップを作る。これらのプ
ライマーは、目的の全遺伝子に連続的にオーバーラップするように構築され、し
たがって、該遺伝子におけるすべての塩基は、その５’末端プライマーを有する
。次に、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドを添加することによって、その
プライマーは、テンプレートとしてサンプルＤＮＡを使用して、１ヌクレオチド
ずつ伸長する。こうして、どのヌクレオチドが取り込まれたか確認することが容
易であり、次にサンプルＤＮＡの全配列がわかる。
表面に固定することにより行い、それにより、ＤＮＡチップを作る。これらのプ
ライマーは、目的の全遺伝子に連続的にオーバーラップするように構築され、し
たがって、該遺伝子におけるすべての塩基は、その５’末端プライマーを有する
。次に、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドを添加することによって、その
プライマーは、テンプレートとしてサンプルＤＮＡを使用して、１ヌクレオチド
ずつ伸長する。こうして、どのヌクレオチドが取り込まれたか確認することが容
易であり、次にサンプルＤＮＡの全配列がわかる。
【０００７】 本発明は、マイクロフルイド特性を有する装置においてＤＮＡをシークエンシ
ングするための方法およびその使用のための試薬のセットを記載する。このマイ
クロフルイド装置は、１またはそれ以上のマイクロチャンネル構造について共通
であってよい内部アプリケーション領域を有し、放射状に伸長するマイクロチャ
ンネル構造(ＣＤ形態)を有するディスクの形態であってよい。ディスクをスピン
させることによって、液体はアプリケーター領域から反応へと駆動され、および
／または検出はディスクの辺縁近くである。このように、液体輸送は求心力によ
って駆動され得る。本マイクロフルイド装置は、他の幾何学的な形態であっても
よい。
ングするための方法およびその使用のための試薬のセットを記載する。このマイ
クロフルイド装置は、１またはそれ以上のマイクロチャンネル構造について共通
であってよい内部アプリケーション領域を有し、放射状に伸長するマイクロチャ
ンネル構造(ＣＤ形態)を有するディスクの形態であってよい。ディスクをスピン
させることによって、液体はアプリケーター領域から反応へと駆動され、および
／または検出はディスクの辺縁近くである。このように、液体輸送は求心力によ
って駆動され得る。本マイクロフルイド装置は、他の幾何学的な形態であっても
よい。
【０００８】 したがって、本発明の最初の態様において: (i)マイクロフルイド装置のマイクロチャンネル構造における１またはそれ以上
の反応領域上に固定した二本鎖ＤＮＡを形成すること： (ii)添加したデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが、固定した
二本鎖ＤＮＡの一部であるサンプルＤＮＡの鎖と相補性を有するときにのみ、プ
ライマーが伸長するように、既知のデオキシヌクレオチド(または対応するデオ
キシヌクレオチド類似物もしくはジデオキシヌクレオチド)およびＤＮＡポリメ
ラーゼを、それぞれの当該１またはそれ以上の反応領域に添加すること； (iii)段階(ii)において添加したデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド
類似物またはジデオキシヌクレオチドが、当該１またはそれ以上の反応領域にお
いてプライマーＤＮＡに結合されたか否か検出すること、 (iv)異なるデオキシヌクレオチド(または対応するデオキシヌクレオチド類似物
もしくはジデオキシヌクレオチド)を用いて、段階(ii)および段階(iii)を必要な
だけ反復すること： を含むサンプルＤＮＡの一部の配列を同定する方法を提供する。
の反応領域上に固定した二本鎖ＤＮＡを形成すること： (ii)添加したデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが、固定した
二本鎖ＤＮＡの一部であるサンプルＤＮＡの鎖と相補性を有するときにのみ、プ
ライマーが伸長するように、既知のデオキシヌクレオチド(または対応するデオ
キシヌクレオチド類似物もしくはジデオキシヌクレオチド)およびＤＮＡポリメ
ラーゼを、それぞれの当該１またはそれ以上の反応領域に添加すること； (iii)段階(ii)において添加したデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド
類似物またはジデオキシヌクレオチドが、当該１またはそれ以上の反応領域にお
いてプライマーＤＮＡに結合されたか否か検出すること、 (iv)異なるデオキシヌクレオチド(または対応するデオキシヌクレオチド類似物
もしくはジデオキシヌクレオチド)を用いて、段階(ii)および段階(iii)を必要な
だけ反復すること： を含むサンプルＤＮＡの一部の配列を同定する方法を提供する。
【０００９】 段階(i)の後に反応領域に存在する二本鎖ＤＮＡは、一本鎖のプライマーＤＮ
Ａおよび一本鎖のサンプルＤＮＡ(テンプレート)からなる。この鎖の内の１つは
、反応領域に固く結合されている。サンプルＤＮＡおよびプライマーＤＮＡの鎖
の少なくとも１つは、１つの同じマイクロフルイド装置内の少なくとの２つの反
応領域に関して異なる。
Ａおよび一本鎖のサンプルＤＮＡ(テンプレート)からなる。この鎖の内の１つは
、反応領域に固く結合されている。サンプルＤＮＡおよびプライマーＤＮＡの鎖
の少なくとも１つは、１つの同じマイクロフルイド装置内の少なくとの２つの反
応領域に関して異なる。
【００１０】 テンプレートおよびプライマーを含む固定した二本鎖ＤＮＡは、実験の部に記
載したようにマイクロフルイド装置の外部で形成されてもよい。しかし、最も効
率的な変法において、固定された二本鎖は、一本または二本鎖サンプルＤＮＡの
いずれかおよびプライマーＤＮＡを別々に導入することによって、マイクロフル
イド装置内、例えば、反応チャンバー内で形成されると考えられる。二本鎖サン
プルＤＮＡが前記の段階(i)において取り込まれる場合、または後記の好ましい
態様において、それはマイクロフルイド装置内で変性されなければならない。
載したようにマイクロフルイド装置の外部で形成されてもよい。しかし、最も効
率的な変法において、固定された二本鎖は、一本または二本鎖サンプルＤＮＡの
いずれかおよびプライマーＤＮＡを別々に導入することによって、マイクロフル
イド装置内、例えば、反応チャンバー内で形成されると考えられる。二本鎖サン
プルＤＮＡが前記の段階(i)において取り込まれる場合、または後記の好ましい
態様において、それはマイクロフルイド装置内で変性されなければならない。
【００１１】 段階(ii)において添加されたデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド類
似物またはジデオキシヌクレオチドは、標識されても標識されなくてもよい。標
識するならば、標識それ自体測定をする。ポリメラーゼによって核酸鎖に取り込
まれることのできる任意の種類の標識、例えば蛍光標識等が、使用され得る。デ
オキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド類似物またはジデオキシヌクレオチ
ドが標識されないならば、ヌクレオチド取り込みは、放出されたＰＰｉの量を測
定することによって検出されることができる。
似物またはジデオキシヌクレオチドは、標識されても標識されなくてもよい。標
識するならば、標識それ自体測定をする。ポリメラーゼによって核酸鎖に取り込
まれることのできる任意の種類の標識、例えば蛍光標識等が、使用され得る。デ
オキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド類似物またはジデオキシヌクレオチ
ドが標識されないならば、ヌクレオチド取り込みは、放出されたＰＰｉの量を測
定することによって検出されることができる。
【００１２】 固定される一本鎖サンプルＤＮＡの量は、典型的には0.1-200ピコモルである
が、１atomoleぐらい低く、例えば、１フェムトモルであってもよい。反応領域
の数は、２以上であってよい。典型的には、500000未満、例えば100000未満であ
ってよい。 一般的かつ好ましい態様において、プライマーの伸長部分の長さは、１塩基以
上であってよい。該方法がアレイドプライマーエクステンション(ＡＰＥＸ)、Ｗ
Ｏ９５／００６９９の場合に、例えば、標識されたターミネーター、例えば、ジ
デオキシヌクレオチドを使用するとき、プライマーの伸長した部分は１ヌクレオ
チドである。これは、反復する段階(iv)を最大３回実施することを意味する。
が、１atomoleぐらい低く、例えば、１フェムトモルであってもよい。反応領域
の数は、２以上であってよい。典型的には、500000未満、例えば100000未満であ
ってよい。 一般的かつ好ましい態様において、プライマーの伸長部分の長さは、１塩基以
上であってよい。該方法がアレイドプライマーエクステンション(ＡＰＥＸ)、Ｗ
Ｏ９５／００６９９の場合に、例えば、標識されたターミネーター、例えば、ジ
デオキシヌクレオチドを使用するとき、プライマーの伸長した部分は１ヌクレオ
チドである。これは、反復する段階(iv)を最大３回実施することを意味する。
【００１３】 １つの態様において本発明は： (i)マイクロフルイド装置の表面上の予め定められた１から100000の間のそれぞ
れの領域に、0.1-200ピコモルのプライマーまたは一本鎖ＤＮＡサンプルを結合
すること； (ii)少量、例えば、0.1-200ピコモルの一本鎖サンプルＤＮＡまたはプライマー
を、予め定められたそれぞれの領域にハイブリダイズさせること； (iii)サンプルＤＮＡと相補的であるときのみ、プライマーの伸長が起こり、そ
の結果、ピロフォスフェート(ＰＰｉ)の放出が起こるように、既知のデオキシヌ
クレオチド、デオキシヌクレオチド類似物またはジデオキシヌクレオチドおよび
ＤＮＡポリメラーゼを添加すること； (iv)ＰＰｉの放出および該装置上のどの予め定められた領域からそれが放出され
たかを測定すること； (v)伸長したプライマーについて、さらにサンプルＤＮＡの部分について、ＤＮ
Ａ配列を構築する必要に応じて、段階(iii)および(iv)を反復すること を含む。
れの領域に、0.1-200ピコモルのプライマーまたは一本鎖ＤＮＡサンプルを結合
すること； (ii)少量、例えば、0.1-200ピコモルの一本鎖サンプルＤＮＡまたはプライマー
を、予め定められたそれぞれの領域にハイブリダイズさせること； (iii)サンプルＤＮＡと相補的であるときのみ、プライマーの伸長が起こり、そ
の結果、ピロフォスフェート(ＰＰｉ)の放出が起こるように、既知のデオキシヌ
クレオチド、デオキシヌクレオチド類似物またはジデオキシヌクレオチドおよび
ＤＮＡポリメラーゼを添加すること； (iv)ＰＰｉの放出および該装置上のどの予め定められた領域からそれが放出され
たかを測定すること； (v)伸長したプライマーについて、さらにサンプルＤＮＡの部分について、ＤＮ
Ａ配列を構築する必要に応じて、段階(iii)および(iv)を反復すること を含む。
【００１４】 好ましい態様において、本発明は： (i)マイクロフルイド装置上の予め定められた領域にサンプルＤＮＡを添加する
こと； (ii)マイクロフルイド装置上の反応チャンバーにサンプルを移動させること； (iii)サンプルＤＮＡを反応チャンバーの表面に結合させ、あるいは一本鎖形態
のサンプルＤＮＡを反応チャンバーに結合したプライマーにハイブリダイズさせ
ること(次に(v)へ)； (iv)もしサンプルＤＮＡが、反応チャンバーに結合したプライマーに結合しない
ならば、プライマーを一本鎖形態のＤＮＡにハイブリダイズさせること； (v)既知のデオキシヌクレオチド(ｄＮＴＰ)、デオキシヌクレオチド類似物また
はジデオキシヌクレオチド(ｄｄＮＴＰ)の存在下におけるプライマーの伸長であ
って、そのような伸長が伸長反応から放出されたピロフォスフェート(ＰＰｉ)の
検出によって示される伸長を行うこと； (vi)伸長したプライマーの配列を決定するために、段階(v)を必要なだけ反復す
ること を含むサンプルＤＮＡの一部の配列を同定するための方法を提供する。
こと； (ii)マイクロフルイド装置上の反応チャンバーにサンプルを移動させること； (iii)サンプルＤＮＡを反応チャンバーの表面に結合させ、あるいは一本鎖形態
のサンプルＤＮＡを反応チャンバーに結合したプライマーにハイブリダイズさせ
ること(次に(v)へ)； (iv)もしサンプルＤＮＡが、反応チャンバーに結合したプライマーに結合しない
ならば、プライマーを一本鎖形態のＤＮＡにハイブリダイズさせること； (v)既知のデオキシヌクレオチド(ｄＮＴＰ)、デオキシヌクレオチド類似物また
はジデオキシヌクレオチド(ｄｄＮＴＰ)の存在下におけるプライマーの伸長であ
って、そのような伸長が伸長反応から放出されたピロフォスフェート(ＰＰｉ)の
検出によって示される伸長を行うこと； (vi)伸長したプライマーの配列を決定するために、段階(v)を必要なだけ反復す
ること を含むサンプルＤＮＡの一部の配列を同定するための方法を提供する。
【００１５】 マイクロフルイド装置に充填するサンプルＤＮＡは増幅サンプルであってよく
、および／またはマイクロフルイド装置内で増幅し得る。増幅は、増幅ＤＮＡを
固体支持体へ結合するために適当な標識の導入を含み得る。 本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡがシークエンシングされるすべての分野に適用
し得る。それらは、新しいシークエンシング、突然変異もしくは塩基変化のモニ
タリングのための既知の配列の再シークエンシング、配列多型性のシークエンシ
ングおよびただ１つの塩基が決定されるミニシークエンシング(アレイドプライ
マーエクステンション(ＡＰＥＸ)を含む)である。さらに、本発明は多型性の数
の同一性を同時に決定する状況に適用し得る(例えば、欧州特許出願９９３０３
２１５．０参照)。
、および／またはマイクロフルイド装置内で増幅し得る。増幅は、増幅ＤＮＡを
固体支持体へ結合するために適当な標識の導入を含み得る。 本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡがシークエンシングされるすべての分野に適用
し得る。それらは、新しいシークエンシング、突然変異もしくは塩基変化のモニ
タリングのための既知の配列の再シークエンシング、配列多型性のシークエンシ
ングおよびただ１つの塩基が決定されるミニシークエンシング(アレイドプライ
マーエクステンション(ＡＰＥＸ)を含む)である。さらに、本発明は多型性の数
の同一性を同時に決定する状況に適用し得る(例えば、欧州特許出願９９３０３
２１５．０参照)。
【００１６】 シークエンシングされるＤＮＡは任意の起源:動物、植物、バクテリア、また
はウイルスであることができる。このＤＮＡを、該装置においてまたは該装置に
充填する前に増幅することができる。 本発明のマイクロフルイド装置は、文献(Gamera BioScienceによって出願の特
許出願ＷＯ９７／２１０９０参照)に記載されたそれらと類似していてもよいし
、好ましくは、流体が求心力によって移動する(例えば同時係属出願ＧＢ９８０
９９４３．５参照)ディスクの形態である。装置は、好ましくは１またはより多
い反応チャンバーおよび検出チャンバーを有するサンプルの充填またはアプリケ
ーション領域を有する。したがって、反応は、検出チャンバーにおいて実施する
ことができ、任意の光反応をそれが起こるとき直接的に検出できる。分離された
チャンバーにおいてこれらの間の流動は、狭い輸送チャンネル、様々な機械的バ
リアのような様々なタイプのバリアによって、または壁および溶液の間の表面相
互作用によって導くことができる。これらの相互作用は疎水性−親水性の性質の
ものであることができる。
はウイルスであることができる。このＤＮＡを、該装置においてまたは該装置に
充填する前に増幅することができる。 本発明のマイクロフルイド装置は、文献(Gamera BioScienceによって出願の特
許出願ＷＯ９７／２１０９０参照)に記載されたそれらと類似していてもよいし
、好ましくは、流体が求心力によって移動する(例えば同時係属出願ＧＢ９８０
９９４３．５参照)ディスクの形態である。装置は、好ましくは１またはより多
い反応チャンバーおよび検出チャンバーを有するサンプルの充填またはアプリケ
ーション領域を有する。したがって、反応は、検出チャンバーにおいて実施する
ことができ、任意の光反応をそれが起こるとき直接的に検出できる。分離された
チャンバーにおいてこれらの間の流動は、狭い輸送チャンネル、様々な機械的バ
リアのような様々なタイプのバリアによって、または壁および溶液の間の表面相
互作用によって導くことができる。これらの相互作用は疎水性−親水性の性質の
ものであることができる。
【００１７】 試薬のキット： 増幅のためのバッファー (vii)増幅のための酵素、またはバッファーとの混合 シークエンシングバッファー、ルシフェリン シークエンシング酵素、バッファーと混合されることもできる 別のバッファー中のｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ バッファー中のｄＡＴＰαＳ これらの試薬は、乾燥状態、例えば、結晶として直接ディスクに貯蔵すること
もでき、次に試薬が水の添加の後に最初に活性化される。
もでき、次に試薬が水の添加の後に最初に活性化される。
【００１８】 キットに使用される酵素： 増幅および/またはシークエンシング反応のためのＤＮＡポリメラーゼまたは
他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑまたは他の熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ ＡＴＰスルフリラーゼ(sulphurylase) ルシフェラーゼ 随意の非優先性成分としてアピラーゼ ＤＮＡポリメラーゼの例は、クレノーフラグメントポリメラーゼである。シー
ケナーゼ(Sequenases)および他の３’−５’エキソＤＮＡポリメラーゼ、並びに
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび他の熱安定性ポリメラーゼである。３’−５’
エキソＤＮＡポリメラーゼが好ましい。サンプルＤＮＡにおける増幅反応を、マ
イクロフルイド装置内でまたは該装置にサンプルＤＮＡが充填される前にその外
で実施し得る。
他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑまたは他の熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ ＡＴＰスルフリラーゼ(sulphurylase) ルシフェラーゼ 随意の非優先性成分としてアピラーゼ ＤＮＡポリメラーゼの例は、クレノーフラグメントポリメラーゼである。シー
ケナーゼ(Sequenases)および他の３’−５’エキソＤＮＡポリメラーゼ、並びに
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび他の熱安定性ポリメラーゼである。３’−５’
エキソＤＮＡポリメラーゼが好ましい。サンプルＤＮＡにおける増幅反応を、マ
イクロフルイド装置内でまたは該装置にサンプルＤＮＡが充填される前にその外
で実施し得る。
【００１９】 本発明のキットは、(a)ルシフェラーゼ、(b)ＤＮＡポリメラーゼ、および(c)
ＡＴＰスルフリラーゼ(任意の前記の成分、好ましくは基質として (a)−(b)のい
ずれかに関する１またはそれ以上の成分と合わて)の１、２または３と組み合わ
せて、好ましくは放射状に伸長するマイクロチャンネル構造を有するディスクの
形態でマイクロフルイド装置を含む。
ＡＴＰスルフリラーゼ(任意の前記の成分、好ましくは基質として (a)−(b)のい
ずれかに関する１またはそれ以上の成分と合わて)の１、２または３と組み合わ
せて、好ましくは放射状に伸長するマイクロチャンネル構造を有するディスクの
形態でマイクロフルイド装置を含む。
【００２０】 試薬および液体をマイクロフルイド装置に充填する方法は、ディスペンサー、
または様々なサンプルを「ピッキング」するための機械的な装置を伴うものである
ことができる。充填する装置は、スピンする装置上の様々なアプリケーションス
ポットに、好ましくは装置のスピン中に充填することができるべきである。 サンプルの充填の後、それは求心力によって反応チャンバーに輸送される。反
応チャンバーにおいて、サンプルは反応チャンバーの壁に結合されるべきである
。サンプルがＤＮＡフラグメントである場合、それを後記の方法の１つにおいて
反応チャンバーの表面に結合することができる。
または様々なサンプルを「ピッキング」するための機械的な装置を伴うものである
ことができる。充填する装置は、スピンする装置上の様々なアプリケーションス
ポットに、好ましくは装置のスピン中に充填することができるべきである。 サンプルの充填の後、それは求心力によって反応チャンバーに輸送される。反
応チャンバーにおいて、サンプルは反応チャンバーの壁に結合されるべきである
。サンプルがＤＮＡフラグメントである場合、それを後記の方法の１つにおいて
反応チャンバーの表面に結合することができる。
【００２１】 まず、ＤＮＡを増幅段階中に３’または５’末端において標識する。該標識は
、好ましくはビオチンまたは、文献に記載され標識された物質を固体支持体に結
合するのに適当な任意の他の適当な標識であることができる。該反応チャンバー
中の表面は、物質によって活性化され、速やかに効率的にＤＮＡ標識に結合すべ
きであり、好ましくは標識がビオチンであるとき、ストレプトアビジンを使用す
る。該チャンバーの表面は、ビーズまたは他の表面を拡大する基または構造、例
えば、アガロースまたはポリスチレンジビニルベンゼンビーズ等(それぞれ、Sep
haroseまたはSource, Amersham Pharmacia Biotech AB)の使用によって拡大する
こともでき、それらを、例えば、該反応チャンバーの壁への接着によってチャン
バー内に保持する。次に、該ビーズまたは拡大する基は、標識されたＤＮＡを捕
捉するために適当な親和性の基、例えば、標識がビオチンである場合はストレプ
トアビジン等を担持し得る。
、好ましくはビオチンまたは、文献に記載され標識された物質を固体支持体に結
合するのに適当な任意の他の適当な標識であることができる。該反応チャンバー
中の表面は、物質によって活性化され、速やかに効率的にＤＮＡ標識に結合すべ
きであり、好ましくは標識がビオチンであるとき、ストレプトアビジンを使用す
る。該チャンバーの表面は、ビーズまたは他の表面を拡大する基または構造、例
えば、アガロースまたはポリスチレンジビニルベンゼンビーズ等(それぞれ、Sep
haroseまたはSource, Amersham Pharmacia Biotech AB)の使用によって拡大する
こともでき、それらを、例えば、該反応チャンバーの壁への接着によってチャン
バー内に保持する。次に、該ビーズまたは拡大する基は、標識されたＤＮＡを捕
捉するために適当な親和性の基、例えば、標識がビオチンである場合はストレプ
トアビジン等を担持し得る。
【００２２】 ＤＮＡを該表面に結合する第２の方法は、増幅の前にプライマーを結合し、次
に、サンプルＤＮＡの増幅を反応チャンバー内で実施することによる。このアプ
ローチによって、付加的な結合化学を、プライマーを該表面に連結させるために
使用することができ、例えばエポキシシラン処理表面とプライマーにおけるアミ
ノリンカー等である。
に、サンプルＤＮＡの増幅を反応チャンバー内で実施することによる。このアプ
ローチによって、付加的な結合化学を、プライマーを該表面に連結させるために
使用することができ、例えばエポキシシラン処理表面とプライマーにおけるアミ
ノリンカー等である。
【００２３】 第３の方法は、結合したプライマー(複数を含む)を有する所望のＤＮＡサンプ
ルを選択することである。こうして、これらのプライマーは、同時に、結合し、
シークエンシングプライマーとして作動することの両方のために使用することが
できる。このアプローチにおいて、反応チャンバー内でプライマーにハイブリダ
イズする前に、該サンプルＤＮＡをフラグメント化する必要があり、このハイブ
リダイゼーションに続いてプライマーを伸長させる。この方法の利点は、いくつ
かのまたは何百もの様々なプライマーを反応チャンバー内で結合することができ
、これらを所望のＤＮＡフラグメントの様々な部分をカバーするように作成する
ことができ、それによって全ＤＮＡ断片を１段階でシークエンシングできること
である。異なるプライマーに結合している配列間の、フラグメント化されていな
いＤＮＡ分子上の距離は、１ないし５００塩基の間で変化させることができ、最
も好ましくは５ないし５０塩基離れている。
ルを選択することである。こうして、これらのプライマーは、同時に、結合し、
シークエンシングプライマーとして作動することの両方のために使用することが
できる。このアプローチにおいて、反応チャンバー内でプライマーにハイブリダ
イズする前に、該サンプルＤＮＡをフラグメント化する必要があり、このハイブ
リダイゼーションに続いてプライマーを伸長させる。この方法の利点は、いくつ
かのまたは何百もの様々なプライマーを反応チャンバー内で結合することができ
、これらを所望のＤＮＡフラグメントの様々な部分をカバーするように作成する
ことができ、それによって全ＤＮＡ断片を１段階でシークエンシングできること
である。異なるプライマーに結合している配列間の、フラグメント化されていな
いＤＮＡ分子上の距離は、１ないし５００塩基の間で変化させることができ、最
も好ましくは５ないし５０塩基離れている。
【００２４】 ＤＮＡの反応領域への結合は、直接的に反応領域の表面へ、または特異的吸着
、例えば、前記記載のビオチン−アビジンおよび互いの十分な結合を提供する他
の親和性の組を通じて、鎖の１つ、好ましくはプライマーを共有結合させること
によってもよい。ＤＮＡの固体支持体への共有結合のためのいくつかの技術が科
学および特許文献において既知である。
、例えば、前記記載のビオチン−アビジンおよび互いの十分な結合を提供する他
の親和性の組を通じて、鎖の１つ、好ましくはプライマーを共有結合させること
によってもよい。ＤＮＡの固体支持体への共有結合のためのいくつかの技術が科
学および特許文献において既知である。
【００２５】 サンプルＤＮＡを表面に結合するとき、それを変性すべきであり、これは、い
くつかの方法、例えば、水素結合破壊物質、高ｐＨまたは高温等によって達成す
ることができる。本発明において、好ましい方法は、好ましくは水酸化ナトリウ
ムの使用によって、高ｐＨでＤＮＡを変性することである。変性はマイクロフル
イド装置の外部または内部のいずれでもよい。
くつかの方法、例えば、水素結合破壊物質、高ｐＨまたは高温等によって達成す
ることができる。本発明において、好ましい方法は、好ましくは水酸化ナトリウ
ムの使用によって、高ｐＨでＤＮＡを変性することである。変性はマイクロフル
イド装置の外部または内部のいずれでもよい。
【００２６】 本発明の次の段階は、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーと共に添加される場合
の伸長である；所望により、該プライマーを、他の化合物の前に添加することが
できる。他の試薬は、ＡＴＰスルフリアーゼ、ルシフェラーゼ、Ｌ−およびＤ−
ルシフェリン並びにＡＰＳ並びにヌクレオチドトリフォスフェート、ｄＡＴＰα
Ｓ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰの１つである。これらは逐次的に添加さ
れ、すなわちｄＡＴＰαＳおよび他の試薬との混合、続いて検出段階、さらに最
終的に洗浄、これに、ｄＣが続き、次にｄＧ、次にｄＴまたは他の任意の予め決
定された順序である。ヌクレオチドが取り込まれると、ルシフェラーゼ反応にお
いてシグナルが検出され、その塩基であるとして点数化される。ここに含まれる
洗浄段階によって、１つのウェルに反応混合物を何回も充填すること、およびそ
れによって体積がますます増大することによる問題は解決される。ここでの洗浄
段階は、スピンする装置に含まれるので、特許出願ＷＯ９８／２８４４０に記載
のようなアピラーゼの使用の必要はない。
の伸長である；所望により、該プライマーを、他の化合物の前に添加することが
できる。他の試薬は、ＡＴＰスルフリアーゼ、ルシフェラーゼ、Ｌ−およびＤ−
ルシフェリン並びにＡＰＳ並びにヌクレオチドトリフォスフェート、ｄＡＴＰα
Ｓ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰの１つである。これらは逐次的に添加さ
れ、すなわちｄＡＴＰαＳおよび他の試薬との混合、続いて検出段階、さらに最
終的に洗浄、これに、ｄＣが続き、次にｄＧ、次にｄＴまたは他の任意の予め決
定された順序である。ヌクレオチドが取り込まれると、ルシフェラーゼ反応にお
いてシグナルが検出され、その塩基であるとして点数化される。ここに含まれる
洗浄段階によって、１つのウェルに反応混合物を何回も充填すること、およびそ
れによって体積がますます増大することによる問題は解決される。ここでの洗浄
段階は、スピンする装置に含まれるので、特許出願ＷＯ９８／２８４４０に記載
のようなアピラーゼの使用の必要はない。
【００２７】 ＰＰｉは、多くの様々な方法によって測定することができ、いくつかの酵素的
方法が文献に記載された(Reeves et al.,(1969), Anal. Biochem., 28, 282-287
; Guilory et al., (1971),Anal. Biochem., 39, 170-180; Johnson et al.,(19
68), Anal. Biochem., 15, 273; Cook et al., (1978), Anal. Biochem., 91, 5
57-565;およびDrake et al., (1979), Anal Biochem., 94, 117-120)。
方法が文献に記載された(Reeves et al.,(1969), Anal. Biochem., 28, 282-287
; Guilory et al., (1971),Anal. Biochem., 39, 170-180; Johnson et al.,(19
68), Anal. Biochem., 15, 273; Cook et al., (1978), Anal. Biochem., 91, 5
57-565;およびDrake et al., (1979), Anal Biochem., 94, 117-120)。
【００２８】 ピロフォスフェートの放出を定量するために、ルシフェラーゼおよびルシフェ
リンを組み合わせて使用するのが好ましい。なぜなら、発生する光の量は、次に
、取り込まれた塩基の量に直接的に比例して放出されるピロフォスフェートの量
に実質的に比例して発生するからである。光の量は適当な光感受性装置、例えば
、ルミノメーター、または本発明の装置に非常に接近した光増幅装置等によって
容易に評価することができる。
リンを組み合わせて使用するのが好ましい。なぜなら、発生する光の量は、次に
、取り込まれた塩基の量に直接的に比例して放出されるピロフォスフェートの量
に実質的に比例して発生するからである。光の量は適当な光感受性装置、例えば
、ルミノメーター、または本発明の装置に非常に接近した光増幅装置等によって
容易に評価することができる。
【００２９】 ＰＰｉの放出を検出するルシフェリン−ルシフェラーゼ反応は、当技術分野で
周知である。特に、酵素ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼに基づくＰ
Ｐｉ放出の継続的モニタリングのための方法は、NyrenおよびLundin(Anal. Bioc
hem., 151, 504-509, 1985)によって開発され、ＥＬＩＤＡ(酵素的ルミノメトリ
ック無機ピロフォスフェート検出検定)と称される。しかし、該方法は、例えば
、より熱安定的なルシフェラーゼ(Kaliyama et al., 1994, Biosci., Biotech.
Biochem., 58:1170-1171)および／またはＡＴＰスルフリラーゼ(Onda et al., 1
996, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 60:10, 1740-42)の使用に
よって修飾し得る。この方法は後記の反応に基づく: ＡＴＰスルフリラーゼ ＰＰｉ＋ＡＰＳ――――――――――→ＡＴＰ＋ＳＯ２− ４ ルシフェラーゼ ＡＴＰ＋ルシフェリン＋Ｏ２――――――――――→ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋オキシル
シフェリン＋ＣＯ２＋ｈν (ＡＰＳ＝アデノシン５’−フォスフォサルフェート)
周知である。特に、酵素ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼに基づくＰ
Ｐｉ放出の継続的モニタリングのための方法は、NyrenおよびLundin(Anal. Bioc
hem., 151, 504-509, 1985)によって開発され、ＥＬＩＤＡ(酵素的ルミノメトリ
ック無機ピロフォスフェート検出検定)と称される。しかし、該方法は、例えば
、より熱安定的なルシフェラーゼ(Kaliyama et al., 1994, Biosci., Biotech.
Biochem., 58:1170-1171)および／またはＡＴＰスルフリラーゼ(Onda et al., 1
996, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 60:10, 1740-42)の使用に
よって修飾し得る。この方法は後記の反応に基づく: ＡＴＰスルフリラーゼ ＰＰｉ＋ＡＰＳ――――――――――→ＡＴＰ＋ＳＯ２− ４ ルシフェラーゼ ＡＴＰ＋ルシフェリン＋Ｏ２――――――――――→ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋オキシル
シフェリン＋ＣＯ２＋ｈν (ＡＰＳ＝アデノシン５’−フォスフォサルフェート)
【００３０】 次に、ＰＰｉ検出反応に含まれる好ましい検出酵素は、ＡＴＰスルフリラーゼ
およびルシフェラーゼである。 本発明の方法は、例えば、ＷＯ９３／２３５６４およびＷＯ８９／０９２８３
に記載のように，２つの段階において実施し得る。第一に、ヌクレオチド(複数
を含む)を取り込むポリメラーゼ反応段階、すなわち、プライマー伸長段階、続
いて、ＰＰｉの放出をモニターおよび検出しヌクレオチド取り込みが起こったか
否か検出する第二検出段階である。次に、ポリメラーゼ反応が起こった後に、ポ
リメラーゼ反応混合物からのサンプルを除去し、例えば、等量のサンプルをＥＬ
ＩＤＡ酵素および反応物を含む反応混合物に添加することによるようなＥＬＩＤ
Ａによって分析し得る。
およびルシフェラーゼである。 本発明の方法は、例えば、ＷＯ９３／２３５６４およびＷＯ８９／０９２８３
に記載のように，２つの段階において実施し得る。第一に、ヌクレオチド(複数
を含む)を取り込むポリメラーゼ反応段階、すなわち、プライマー伸長段階、続
いて、ＰＰｉの放出をモニターおよび検出しヌクレオチド取り込みが起こったか
否か検出する第二検出段階である。次に、ポリメラーゼ反応が起こった後に、ポ
リメラーゼ反応混合物からのサンプルを除去し、例えば、等量のサンプルをＥＬ
ＩＤＡ酵素および反応物を含む反応混合物に添加することによるようなＥＬＩＤ
Ａによって分析し得る。
【００３１】 しかし、前記のように、本発明の方法は、容易に修飾し、シークエンシング(
すなわち、塩基取り込み)反応を可能とし、リアルタイムで継続的にモニターし
得る。これは、鎖伸長させて検出すること、またはシグナル生成、鎖伸長反応混
合物中に「検出酵素」を含ませることによって実質的に同時に反応させることを
実施することによって容易に達成し得る。
すなわち、塩基取り込み)反応を可能とし、リアルタイムで継続的にモニターし
得る。これは、鎖伸長させて検出すること、またはシグナル生成、鎖伸長反応混
合物中に「検出酵素」を含ませることによって実質的に同時に反応させることを
実施することによって容易に達成し得る。
【００３２】 したがって、ポリメラーゼ反応のための該反応混合物は、少なくともヌクレオ
チド(デオキシまたはジデオキシ)、ポリメラーゼ、ルシフェリン、ＡＰＳ、ＡＴ
Ｐスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを、所望のヌクレオチド分解酵素、例え
ばアピラーゼと共に含み得る。該ポリメラーゼ反応を、ポリメラーゼ、またはよ
り好ましくはヌクレオチドの添加によって開始し得る。好ましくは、検出酵素は
、反応が開始するときにすでに存在する。またはそれらを、反応を開始する試薬
と共に添加してもよい。 マイクロフルイドシステムの使用によって試薬の体積はナノリットルの範囲で
あり、これに対し、９６ウェル型においてはマイクロリットルである。これは、
試薬の消費を１０００倍またはそれ以上減少させる。
チド(デオキシまたはジデオキシ)、ポリメラーゼ、ルシフェリン、ＡＰＳ、ＡＴ
Ｐスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを、所望のヌクレオチド分解酵素、例え
ばアピラーゼと共に含み得る。該ポリメラーゼ反応を、ポリメラーゼ、またはよ
り好ましくはヌクレオチドの添加によって開始し得る。好ましくは、検出酵素は
、反応が開始するときにすでに存在する。またはそれらを、反応を開始する試薬
と共に添加してもよい。 マイクロフルイドシステムの使用によって試薬の体積はナノリットルの範囲で
あり、これに対し、９６ウェル型においてはマイクロリットルである。これは、
試薬の消費を１０００倍またはそれ以上減少させる。
【００３３】 本発明を後記の例のみのためのものである図面によって図示し、図中: 図１：スピニング装置におけるフルイドチャンネルの概略図。サンプルを機械
的装置または圧電ディスペンサーのいずれかによって充填する。反応チャンバー
および検出チャンバーは、同じであってよい。チャンバー(複数を含む)からの出
口はいくつかのバリアーを有しスピン中の流体の移動を止める。このバリアーは
疎水性表面であることができる。 図２：液体のトレインからＣＤへの充填。トレインはＭＴＰ(マイクロタイタ
ープレート)から充填され、それぞれのサンプル(ダイヤグラム中黒)は空気また
は不活性溶液で分離され、洗浄溶液も含まれ得る。プレート全体が、細管チュー
ブに充填されるとき、高圧が同じまたは反対の流動方向に適用され、次に、サン
プルは圧電ディスペンサーを通して、ＣＤ表面のアプリケーション領域に分配さ
れる。 図３：スピニング装置に充填するための機械的装置の概略図。左にマイクロタ
イタープレート、中央に洗浄ステーション、並びにサンプル、試薬および液体が
適用されるべきＣＤ。1)開始位置およびＣＤへの移送、2)アプリケーター手段の
洗浄、並びに3)新しいサンプルのピックアップ。該アプリケーター手段は、ペン
またはシリンジの形態であってよい。 図４ａ−ｄは：マイクチャンネル構造の様々なパーツおよび拡大図を示し、本
発明に利用した原理を示すために使用した。 図４ａは：円形ディスクの辺縁部分を示す。示した部分は、放射状に外側に伸
長する５つのマイクロチャンネル構造を有する。 図４ｂは：マイクロチャンネル構造Ｋ９の拡大図を示す。 図４ｃは：マイクロチャンネル構造のサンプル体積定義単位の拡大図を示す。 図４ｄは：反応チャンバー領域に加えて廃液の処分のためのチャンバーの拡大
図を示す。特に、この図は深さの変化を示す(影部分I、II、IIIおよびIV)。
的装置または圧電ディスペンサーのいずれかによって充填する。反応チャンバー
および検出チャンバーは、同じであってよい。チャンバー(複数を含む)からの出
口はいくつかのバリアーを有しスピン中の流体の移動を止める。このバリアーは
疎水性表面であることができる。 図２：液体のトレインからＣＤへの充填。トレインはＭＴＰ(マイクロタイタ
ープレート)から充填され、それぞれのサンプル(ダイヤグラム中黒)は空気また
は不活性溶液で分離され、洗浄溶液も含まれ得る。プレート全体が、細管チュー
ブに充填されるとき、高圧が同じまたは反対の流動方向に適用され、次に、サン
プルは圧電ディスペンサーを通して、ＣＤ表面のアプリケーション領域に分配さ
れる。 図３：スピニング装置に充填するための機械的装置の概略図。左にマイクロタ
イタープレート、中央に洗浄ステーション、並びにサンプル、試薬および液体が
適用されるべきＣＤ。1)開始位置およびＣＤへの移送、2)アプリケーター手段の
洗浄、並びに3)新しいサンプルのピックアップ。該アプリケーター手段は、ペン
またはシリンジの形態であってよい。 図４ａ−ｄは：マイクチャンネル構造の様々なパーツおよび拡大図を示し、本
発明に利用した原理を示すために使用した。 図４ａは：円形ディスクの辺縁部分を示す。示した部分は、放射状に外側に伸
長する５つのマイクロチャンネル構造を有する。 図４ｂは：マイクロチャンネル構造Ｋ９の拡大図を示す。 図４ｃは：マイクロチャンネル構造のサンプル体積定義単位の拡大図を示す。 図４ｄは：反応チャンバー領域に加えて廃液の処分のためのチャンバーの拡大
図を示す。特に、この図は深さの変化を示す(影部分I、II、IIIおよびIV)。
【００３４】 実験 １)材料／調査単位 ポリメラーゼ：クレノーフラグメント(３’−５’エキソ)New England Biolabs(
貯蔵バッファー：１０ｍＭのトリス(ｐＨ７．４)１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤ
ＴＴ、５０％のグリセロール)５Ｕ／μｌまたは５０Ｕ／μｌ： Pyrosequencing AB ルシフェラーゼ：Promega(13,33mg/ml) スルフリラーゼ：Sigma(50mU/μl) ポリビニルピロリドンＰＶＰ：Sigma ＭｇＡｃ２：Merck Ｄ−ルシフェリン：BioThema ＤＴＴ：Sigma アデノシン５’フォスフォサルフェート(ＡＰＳ)：Sigma ｄＡＴＰαＳ：Amersham Parmacia Biotech ＰＰアーゼピロフォスファターゼ：Sigma ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ：Amersham Parmacia Biotech(ＰＰｉフリー)
貯蔵バッファー：１０ｍＭのトリス(ｐＨ７．４)１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤ
ＴＴ、５０％のグリセロール)５Ｕ／μｌまたは５０Ｕ／μｌ： Pyrosequencing AB ルシフェラーゼ：Promega(13,33mg/ml) スルフリラーゼ：Sigma(50mU/μl) ポリビニルピロリドンＰＶＰ：Sigma ＭｇＡｃ２：Merck Ｄ−ルシフェリン：BioThema ＤＴＴ：Sigma アデノシン５’フォスフォサルフェート(ＡＰＳ)：Sigma ｄＡＴＰαＳ：Amersham Parmacia Biotech ＰＰアーゼピロフォスファターゼ：Sigma ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ：Amersham Parmacia Biotech(ＰＰｉフリー)
【００３５】 作業溶液 １０×ストックＡ：ＰＶＰ(４ｍｇ／ｍｌ)；ＭｇＡｃ２(１０．７ｍｇ／ｍｌ)；
Ｄ−ルシフェリン(１．０μｇ／ｍｌ)；ＤＴＴ(１．０ｍＭ)；トリス−Ａｃ ｐ
Ｈ７．６(０．０１Ｍ)ＡＰＳ(１０ｍＭ) ヌクレオチド：ｄＡＴＰαＳ(１．２５ｍＭ)、ｄＣＴＰ(０．５ｍＭ)、ｄＧＴＰ
(０．５ｍＭ)、ｄＴＴＰ(１．２５ｍＭ) バッファー：Binding Washing Buffer(ＢＷ)：１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのトリス
−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．５ｍＭのＥＤＴＡ ＴＥバッファー：１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、１ｍＭのＥＤＴＡ(ｐＨ７．６) ＴＡＥバッファー：０．０４Ｍのトリス−アセテート(ｐＨ７．８)、ｍＭのＥＤ
ＴＡ 微粒子：ストレプトアビジンが結合されたSourceビーズ；１５μｍ(ＡＰＢ) ストレプトアビジン(ＳＡ)：１０ｍｇ／ｍｌ テンプレート／オリゴ テンプレート：３’末端にビオチンで標識された既知の配列を有する５０量体の
オリゴヌクレオチド。 プライマー：テンプレートの一部に相補的な２４量体のオリゴヌクレオチド。
Ｄ−ルシフェリン(１．０μｇ／ｍｌ)；ＤＴＴ(１．０ｍＭ)；トリス−Ａｃ ｐ
Ｈ７．６(０．０１Ｍ)ＡＰＳ(１０ｍＭ) ヌクレオチド：ｄＡＴＰαＳ(１．２５ｍＭ)、ｄＣＴＰ(０．５ｍＭ)、ｄＧＴＰ
(０．５ｍＭ)、ｄＴＴＰ(１．２５ｍＭ) バッファー：Binding Washing Buffer(ＢＷ)：１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのトリス
−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．５ｍＭのＥＤＴＡ ＴＥバッファー：１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、１ｍＭのＥＤＴＡ(ｐＨ７．６) ＴＡＥバッファー：０．０４Ｍのトリス−アセテート(ｐＨ７．８)、ｍＭのＥＤ
ＴＡ 微粒子：ストレプトアビジンが結合されたSourceビーズ；１５μｍ(ＡＰＢ) ストレプトアビジン(ＳＡ)：１０ｍｇ／ｍｌ テンプレート／オリゴ テンプレート：３’末端にビオチンで標識された既知の配列を有する５０量体の
オリゴヌクレオチド。 プライマー：テンプレートの一部に相補的な２４量体のオリゴヌクレオチド。
【００３６】 マイクロフルイド装置の材料および処理： 図４ａ−ｄのマイクロチャンネル構造(Ｋ７−Ｋ１２)を、マイクロフルイドデ
ィスク上に放射状に配置する。それらは、共通の環状の内部アプリケーションチ
ャンネル(１)から始まり、チャンネル(１)と同軸の、共通の環状の外部廃液チャ
ンネル(２)に至る。該マイクロチャンネル構造のそれぞれの入り口開口部(３)を
、アプリケーション領域として使用し得る。各マイクロチャンネル構造は、外部
廃液チャンネル(２)に開く廃液チャンバー(４)を備える。流動方向は、入り口開
口部(１)から廃液チャンバー(４)である。流動を、毛管作用および求心力の両方
によって、すなわち、ディスクのスピンによって駆動する。環状外部廃液チャン
ネル(２)を有し、環状内部チャンネル(１)に直接結合している放射状の廃液チャ
ンネル(５)も示す。
ィスク上に放射状に配置する。それらは、共通の環状の内部アプリケーションチ
ャンネル(１)から始まり、チャンネル(１)と同軸の、共通の環状の外部廃液チャ
ンネル(２)に至る。該マイクロチャンネル構造のそれぞれの入り口開口部(３)を
、アプリケーション領域として使用し得る。各マイクロチャンネル構造は、外部
廃液チャンネル(２)に開く廃液チャンバー(４)を備える。流動方向は、入り口開
口部(１)から廃液チャンバー(４)である。流動を、毛管作用および求心力の両方
によって、すなわち、ディスクのスピンによって駆動する。環状外部廃液チャン
ネル(２)を有し、環状内部チャンネル(１)に直接結合している放射状の廃液チャ
ンネル(５)も示す。
【００３７】 液体は、入り口開口部(３)から入り口ポート(６)を通して体積定義単位(７)に
、さらにそこから反応チャンバー(１０)に移動する。該体積定義単位(７)は、過
剰の液体を、例えば、環状外部廃液チャンネル(２)へ除去するための廃液チャン
ネルへの通路(８)、および外部空気へ開口する通風孔(９)を有する。該反応チャ
ンバー(１０)は、出口においてより浅くなってもよい(I、II、III、IV)(図４ｄ
および表)。制限チャンネル(１１)は、反応チャンバー(１０)および排液チャン
バー(４)の間に提供される。廃液チャンバー(４)の相対的に大きい幅のために、
好ましくは１またはそれ以上の支持(１２)を有し、チャンバーの硬さを確保する
。
、さらにそこから反応チャンバー(１０)に移動する。該体積定義単位(７)は、過
剰の液体を、例えば、環状外部廃液チャンネル(２)へ除去するための廃液チャン
ネルへの通路(８)、および外部空気へ開口する通風孔(９)を有する。該反応チャ
ンバー(１０)は、出口においてより浅くなってもよい(I、II、III、IV)(図４ｄ
および表)。制限チャンネル(１１)は、反応チャンバー(１０)および排液チャン
バー(４)の間に提供される。廃液チャンバー(４)の相対的に大きい幅のために、
好ましくは１またはそれ以上の支持(１２)を有し、チャンバーの硬さを確保する
。
【００３８】 体積定義単位(７)は、図４ａ−ｃに示すようにＵ字形状であり、Ｕ字の一方の
脚の頂部に開口する入り口ポート(６)およびＵ字の他方の脚から始まる廃液チャ
ンネル(８)を有し、この他方の脚の頂部に位置する通風孔(９)を有する。Ｕ字形
状の体積定義単位(７)の底は、反応チャンバー(１０)に結合されている。 該構造の入り口(３)のアプリケーション領域に加えて、入り口ポート(６)に結
合された付加的なアプリケーション領域(１３)もあってよい。 好ましくは、反応チャンバー(１０)に外気への通風孔(１４)もある。好ましく
は、反応チャンバー(１０)の体積定義単位(７)への結合部に疎水性ブレーキ(bre
ak)もある。
脚の頂部に開口する入り口ポート(６)およびＵ字の他方の脚から始まる廃液チャ
ンネル(８)を有し、この他方の脚の頂部に位置する通風孔(９)を有する。Ｕ字形
状の体積定義単位(７)の底は、反応チャンバー(１０)に結合されている。 該構造の入り口(３)のアプリケーション領域に加えて、入り口ポート(６)に結
合された付加的なアプリケーション領域(１３)もあってよい。 好ましくは、反応チャンバー(１０)に外気への通風孔(１４)もある。好ましく
は、反応チャンバー(１０)の体積定義単位(７)への結合部に疎水性ブレーキ(bre
ak)もある。
【００３９】 外部環状廃液チャンネル(２)を、予め決定した数の接近して位置するマイクロ
チャンネル構造から廃液を集めるために区分化し得る。 疎水性ブレーキをオーバーヘッドペン(パーマネントインク)(Snowman pen, Ja
pan)によってマークすることによって導入した：(a)内部の環状アプリケーショ
ンチャンネル(１)におけるマイクロチャンネル構造入り口(３)の間、(b)外部環
状廃液チャンネルへの各開口部(１５)(すなわち廃液チャンバーの開口部)並びに
、(c)存在するなら、内部環状アプリケーションチャンネル(１)および外部環状
廃液チャンネル(２)に結合している放射状の廃液チャンネル(５)、並びに過剰の
液体を体積定義単位(７)から導く廃液チャンネル(８)。
チャンネル構造から廃液を集めるために区分化し得る。 疎水性ブレーキをオーバーヘッドペン(パーマネントインク)(Snowman pen, Ja
pan)によってマークすることによって導入した：(a)内部の環状アプリケーショ
ンチャンネル(１)におけるマイクロチャンネル構造入り口(３)の間、(b)外部環
状廃液チャンネルへの各開口部(１５)(すなわち廃液チャンバーの開口部)並びに
、(c)存在するなら、内部環状アプリケーションチャンネル(１)および外部環状
廃液チャンネル(２)に結合している放射状の廃液チャンネル(５)、並びに過剰の
液体を体積定義単位(７)から導く廃液チャンネル(８)。
【００４０】 実施例１．表面拡大およびプライマーにハイブリダイズされる一本鎖ＤＮＡのた
めの担体としてのビーズ 被覆物質の合成(ＰＥＧ−ＰＥＩ付加物)：０．４３ｇのポリエチレンイミン(B
ASFからのPolymin SN)を４５ｍｌの５０ｍＭナトリウムボレートバッファー(ｐ
Ｈ９．５)に４５℃で溶解した。５ｇのモノメトキシポリエチレングリコールの
グリシジルエーテル(分子量５０００)を撹拌中に添加し、混合物を継続して３時
間４５℃で撹拌した。
めの担体としてのビーズ 被覆物質の合成(ＰＥＧ−ＰＥＩ付加物)：０．４３ｇのポリエチレンイミン(B
ASFからのPolymin SN)を４５ｍｌの５０ｍＭナトリウムボレートバッファー(ｐ
Ｈ９．５)に４５℃で溶解した。５ｇのモノメトキシポリエチレングリコールの
グリシジルエーテル(分子量５０００)を撹拌中に添加し、混合物を継続して３時
間４５℃で撹拌した。
【００４１】 表面処理：ポリカーボネート(ビスフェノールAのポリカーボネート。Macrolon DP-1265, Bayer AG, Germany)の前記記載のようなディスクを、プラズマリアク
ター(Plasma Science PS0500, BOC Coating Technology, USA)中に置き、オキシ
ゲンプラズマと５ｓｃｃｍガスフローおよび５００ＷのＲＦパワーで１０分間処
理した。リアクターを通気した後、ディスクをＰＥＧ−ＰＥＩ付加物のボレート
バッファーｐＨ９．５における０．１％の溶液に１時間浸した。次に該ディスク
を、蒸留水でリンスし、窒素の風で乾燥させ、水接触角(定着水滴)をRame-Hart
マニュアルゴニメーターベンチ(manual gonimeter 0bench)において測定した。
６回の平衡測定(３の小滴)の平均は２４度であった。処理表面のＸＰＳスペクト
ルから、次のモル元素組成：７３．２％Ｃ、３．７％Ｎ、２３．１％Ｏを取得し
、吸着されたＰＥＧ−ＰＥＩ付加物によって、該表面が本質的にカバーされたこ
とを示した。
ター(Plasma Science PS0500, BOC Coating Technology, USA)中に置き、オキシ
ゲンプラズマと５ｓｃｃｍガスフローおよび５００ＷのＲＦパワーで１０分間処
理した。リアクターを通気した後、ディスクをＰＥＧ−ＰＥＩ付加物のボレート
バッファーｐＨ９．５における０．１％の溶液に１時間浸した。次に該ディスク
を、蒸留水でリンスし、窒素の風で乾燥させ、水接触角(定着水滴)をRame-Hart
マニュアルゴニメーターベンチ(manual gonimeter 0bench)において測定した。
６回の平衡測定(３の小滴)の平均は２４度であった。処理表面のＸＰＳスペクト
ルから、次のモル元素組成：７３．２％Ｃ、３．７％Ｎ、２３．１％Ｏを取得し
、吸着されたＰＥＧ−ＰＥＩ付加物によって、該表面が本質的にカバーされたこ
とを示した。
【００４２】 マイクロチャンネル構造をシリコンゴムのふたでカバーした。 ストレプトアビジン−Sourceの１５μｍの微粒子：Sourceの１５μｍ微粒子をペ
リオデートでオキシダイズし(oxidised)、６−アミノヘキサン酸と結合し、さら
にＮ−ヒドロキシスクシニミドと反応させた。ストレプトアビジン(８ｍｇ／ｍ
ｌ微粒子)をＮＨＳ活性化微粒子とｐＨ８で結合させた。ビオチンキャパシティ
ー：０．４ｎモル／ｍｌ。 マイクロチャンネル構造にＳＡビーズを置く： ２０μｌの１０％Source−ＳＡスラリーを、０．５μｌのチューブに添加し、
ビーズを１×ＢＷで洗浄した。２０μｌのＢＷバッファー；２,５μｌの二本鎖
ＤＮＡ(テンプレートをプライマー、(５ｐモル／μｌ)とハイブリダイズさせ、
７．５μｌのＴＥを添加し、ビーズと混合し、６５℃で１０分間インキュベート
した。次にビーズをＴＥ中で１回洗浄し、ＴＥを２０μｌの最終体積まで添加し
た。各段階の後、チューブを遠心分離し(３０秒;１０，０００ｒｐｍ)、上清を
捨てた。 固定されたＤＮＡを有する粒子を、図４に記載のマイクロチャンネル構造の反
応チャンバー(１０)のセクションＩ(約８ｎｌ)の直前に、２％のスラリーとして
カラムに適用した。
リオデートでオキシダイズし(oxidised)、６−アミノヘキサン酸と結合し、さら
にＮ−ヒドロキシスクシニミドと反応させた。ストレプトアビジン(８ｍｇ／ｍ
ｌ微粒子)をＮＨＳ活性化微粒子とｐＨ８で結合させた。ビオチンキャパシティ
ー：０．４ｎモル／ｍｌ。 マイクロチャンネル構造にＳＡビーズを置く： ２０μｌの１０％Source−ＳＡスラリーを、０．５μｌのチューブに添加し、
ビーズを１×ＢＷで洗浄した。２０μｌのＢＷバッファー；２,５μｌの二本鎖
ＤＮＡ(テンプレートをプライマー、(５ｐモル／μｌ)とハイブリダイズさせ、
７．５μｌのＴＥを添加し、ビーズと混合し、６５℃で１０分間インキュベート
した。次にビーズをＴＥ中で１回洗浄し、ＴＥを２０μｌの最終体積まで添加し
た。各段階の後、チューブを遠心分離し(３０秒;１０，０００ｒｐｍ)、上清を
捨てた。 固定されたＤＮＡを有する粒子を、図４に記載のマイクロチャンネル構造の反
応チャンバー(１０)のセクションＩ(約８ｎｌ)の直前に、２％のスラリーとして
カラムに適用した。
【００４３】 ＣＤ装置におけるピロシークエンシング反応 ピロシークエンシング混合物におけるＰＰｉ汚染のリスクを最小化するために
、混合物の調製に使用した試験チューブを、９９％のＥｔＯＨに続いてｍｉｌｌ
ｉＱで洗浄し、上下逆にして一晩乾燥した。 ピロシークエンシング混合物(５０μｌ)を以下から調製した： ３３．５μｌの１×ＴＡＥ ５μｌのストックＡ １μｌの１×ＴＥ ４μｌのルシフェラーゼ(１５０ｎｇ／μｌ) ２．５μｌのスルフリラーゼ(２０ｍＵ／μｌ)
、混合物の調製に使用した試験チューブを、９９％のＥｔＯＨに続いてｍｉｌｌ
ｉＱで洗浄し、上下逆にして一晩乾燥した。 ピロシークエンシング混合物(５０μｌ)を以下から調製した： ３３．５μｌの１×ＴＡＥ ５μｌのストックＡ １μｌの１×ＴＥ ４μｌのルシフェラーゼ(１５０ｎｇ／μｌ) ２．５μｌのスルフリラーゼ(２０ｍＵ／μｌ)
【００４４】 段階を追ったプライマー伸長およびヌクレオチド挿入の検出 テンプレート配列と一致する順序のヌクレオチドでのピロシークエンシング混
合物を、中間のＴＡＥ洗浄でアプリケーター領域(３)に分配した。試薬の置換を
ディスクをスピンさせることによって実施した。ＣＤ装置におけるピロシークエ
ンシング反応を検出器Ｐｐｙ１：１において測定した。反応チャンバーは検出チ
ャンバーとして機能した。 ヌクレオチドの各添加に対応するシグナルを取得し、それはバックグラウンド
ノイズから区別できた。
合物を、中間のＴＡＥ洗浄でアプリケーター領域(３)に分配した。試薬の置換を
ディスクをスピンさせることによって実施した。ＣＤ装置におけるピロシークエ
ンシング反応を検出器Ｐｐｙ１：１において測定した。反応チャンバーは検出チ
ャンバーとして機能した。 ヌクレオチドの各添加に対応するシグナルを取得し、それはバックグラウンド
ノイズから区別できた。
【００４５】 実施例２．プライマーにハイブリダイズされる一本鎖ＤＮＡの担体としての反応
チャンバーの表面 表面処理およびＤＮＡの固定：各反応チャンバー(１０)の表面を、Owoco Rosa(O
woco AB, Stockholm-Trangsund, Sweeden)でマスクした。次に該構造を実施例１
に記載のようにプラズマ処理し、これはマスクされなかった領域が親水化された
ことを意味する。Owoco Roseの除去の後、前記で記載の疎水性ブレーキをオーバ
ーヘッドペン(パーマネントインク)(Snowman, Japan)によって作成した。次にマ
イクロチャンネル構造をシリコンラバーのふたでカバーし、該チャンネルを実施
例１に記載のＰＥＩ−ＰＥＧ付加物で流し、それはプラズマ処理した表面に固着
した。その後ストレプトアビジン(strepavidin)を反応チャンバーの表面に吸収
し(３×)、続いてＴＥで洗浄した。次に、該反応チャンバーを二本鎖ＤＮＡ(テ
ンプレートＤＮＡにハイブリダイズしたプライマーＤＮＡ、５ピコモル／μｌ)
の溶液で満たし、２０−３０分間インキュベートし、二本鎖ＤＮＡを固定した。
次に該チャンネルをＴＡＥで２回洗浄した。 段階を追ったプライマー伸長およびヌクレオチド挿入の検出：実施例１参照。
チャンバーの表面 表面処理およびＤＮＡの固定：各反応チャンバー(１０)の表面を、Owoco Rosa(O
woco AB, Stockholm-Trangsund, Sweeden)でマスクした。次に該構造を実施例１
に記載のようにプラズマ処理し、これはマスクされなかった領域が親水化された
ことを意味する。Owoco Roseの除去の後、前記で記載の疎水性ブレーキをオーバ
ーヘッドペン(パーマネントインク)(Snowman, Japan)によって作成した。次にマ
イクロチャンネル構造をシリコンラバーのふたでカバーし、該チャンネルを実施
例１に記載のＰＥＩ−ＰＥＧ付加物で流し、それはプラズマ処理した表面に固着
した。その後ストレプトアビジン(strepavidin)を反応チャンバーの表面に吸収
し(３×)、続いてＴＥで洗浄した。次に、該反応チャンバーを二本鎖ＤＮＡ(テ
ンプレートＤＮＡにハイブリダイズしたプライマーＤＮＡ、５ピコモル／μｌ)
の溶液で満たし、２０−３０分間インキュベートし、二本鎖ＤＮＡを固定した。
次に該チャンネルをＴＡＥで２回洗浄した。 段階を追ったプライマー伸長およびヌクレオチド挿入の検出：実施例１参照。
【図１】 図１：スピニング装置におけるフルイドチャンネルの概略図。サ
ンプルを機械的装置または圧電ディスペンサーのいずれかによって充填する。反
応チャンバーおよび検出チャンバーは、同じであってよい。チャンバー(複数を
含む)からの出口はいくつかのバリアーを有しスピン中の流体の移動を止める。
このバリアーは疎水性表面であることができる。
ンプルを機械的装置または圧電ディスペンサーのいずれかによって充填する。反
応チャンバーおよび検出チャンバーは、同じであってよい。チャンバー(複数を
含む)からの出口はいくつかのバリアーを有しスピン中の流体の移動を止める。
このバリアーは疎水性表面であることができる。
【図２】 図２：液体のトレインからＣＤへの充填。トレインはＭＴＰ(マ
イクロタイタープレート)から充填され、それぞれのサンプル(ダイヤグラム中黒
)は空気または不活性溶液で分離され、洗浄溶液も含まれ得る。プレート全体が
、細管チューブに充填されるとき、高圧が同じまたは反対の流動方向に適用され
、次に、サンプルは圧電ディスペンサーを通して、ＣＤ表面のアプリケーション
領域に分配される。
イクロタイタープレート)から充填され、それぞれのサンプル(ダイヤグラム中黒
)は空気または不活性溶液で分離され、洗浄溶液も含まれ得る。プレート全体が
、細管チューブに充填されるとき、高圧が同じまたは反対の流動方向に適用され
、次に、サンプルは圧電ディスペンサーを通して、ＣＤ表面のアプリケーション
領域に分配される。
【図３】 図３：スピニング装置に充填するための機械的装置の概略図。左
にマイクロタイタープレート、中央に洗浄ステーション、並びにサンプル、試薬
および液体が適用されるべきＣＤ。1)開始位置およびＣＤへの移送、2)アプリケ
ーター手段の洗浄、並びに3)新しいサンプルのピックアップ。該アプリケーター
手段は、ペンまたはシリンジの形態であってよい。
にマイクロタイタープレート、中央に洗浄ステーション、並びにサンプル、試薬
および液体が適用されるべきＣＤ。1)開始位置およびＣＤへの移送、2)アプリケ
ーター手段の洗浄、並びに3)新しいサンプルのピックアップ。該アプリケーター
手段は、ペンまたはシリンジの形態であってよい。
【図４】 図４ａ−ｄは：マイクチャンネル構造の様々なパーツおよび拡大
図を示し、本発明に利用した原理を示すために使用した。 図４ａは：円形ディスクの辺縁部分を示す。示した部分は、放射状に外側に伸
長する５つのマイクロチャンネル構造を有する。 図４ｂは：マイクロチャンネル構造Ｋ９の拡大図を示す。 図４ｃは：マイクロチャンネル構造のサンプル体積定義単位の拡大図を示す。 図４ｄは：反応チャンバー領域に加えて廃液の処分のためのチャンバーの拡大
図を示す。特に、この図は深さの変化を示す(影部分I、II、IIIおよびIV)。
図を示し、本発明に利用した原理を示すために使用した。 図４ａは：円形ディスクの辺縁部分を示す。示した部分は、放射状に外側に伸
長する５つのマイクロチャンネル構造を有する。 図４ｂは：マイクロチャンネル構造Ｋ９の拡大図を示す。 図４ｃは：マイクロチャンネル構造のサンプル体積定義単位の拡大図を示す。 図４ｄは：反応チャンバー領域に加えて廃液の処分のためのチャンバーの拡大
図を示す。特に、この図は深さの変化を示す(影部分I、II、IIIおよびIV)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ケルスティン・エリクソン スウェーデン、エス−756 52ウプサラ、 ダグハンマルフォルズフ245ベー番 (72)発明者 エスフィル・ロフマン スウェーデン、エス−753 13ウプサラ、 ボルイェガット１ベー番 (72)発明者 ペール・アンデッション スウェーデン、エス−117 34ストックホ ルム、ホルンスガータン147番 (72)発明者 ペール・ヨハン・ウルフェンダール スウェーデン、エス−756 53ウプサラ、 ラップホンスバーゲン10ベー番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA11 CA20 HA11 HA19 4B029 AA07 AA21 BB20 CC03 CC08 CC13 FA15 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR02 QR06 QR08 QR32 QR38 QR42 QR62 QR82 QR83 QS12 QS28 QS36 QS39 QX02
Claims (8)
- 【請求項１】 (i)核酸サンプルをプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオ
キシヌクレオチドトリフォスフェート、または対応するデオキシヌクレオチドト
リフォスフェート類似物またはジデオキシヌクレオチドトリフォスフェートと共
にインキュベートすること (ii)段階(i)において放出されたピロフォスフェートを測定すること (iii)どのヌクレオチドが段階(ii)においてＰＰｉの放出をもたらしたか測定す
ることによって、添加した塩基の性質を同定すること： の段階を含む核酸サンプルにおけるヌクレオチド塩基を決定する方法であって、
段階(i)ないし(iii)がマイクロフルイド装置において実施されることを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】 (i)マイクロフルイド装置のマイクロチャンネル構造におけ
る１またはそれ以上の反応領域上に固定した二本鎖ＤＮＡを形成すること： (ii)添加したデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが、固定した
二本鎖ＤＮＡの一部であるサンプルＤＮＡの鎖と相補性を有するときにのみ、プ
ライマーが伸長するように、既知のデオキシヌクレオチド(または対応するデオ
キシヌクレオチド類似物もしくはジデオキシヌクレオチド)およびＤＮＡポリメ
ラーゼを、それぞれの当該１またはそれ以上の反応領域に添加すること； (iii)段階(ii)において添加したデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレ
オチドが、当該１またはそれ以上の反応領域においてプライマーＤＮＡに結合さ
れたか否か検出すること、 (iv)異なるデオキシヌクレオチド(または対応するデオキシヌクレオチド類似物
もしくはジデオキシヌクレオチド)を用いて、段階(ii)および段階(iii)を必要な
だけ反復すること： を含むサンプルＤＮＡの一部の配列を同定する方法。 - 【請求項３】 (i)マイクロフルイド装置の表面上の予め定められた１から1
00000の間のそれぞれの領域に、0.1-200ピコモルのプライマーまたは一本鎖ＤＮ
Ａサンプルを結合すること； (ii)少量、例えば、0.1-200ピコモルの一本鎖サンプルＤＮＡまたはプライマー
を、予め定められたそれぞれの領域にハイブリダイズさせること； (iii)サンプルＤＮＡと相補的であるときのみ、プライマーの伸長が起こり、そ
の結果、ピロフォスフェート(ＰＰｉ)の放出が起こるように、既知のデオキシヌ
クレオチド、デオキシヌクレオチド類似物またはジデオキシヌクレオチドおよび
ＤＮＡポリメラーゼを添加すること； (iv)ＰＰｉの放出および該装置上のどの予め定められた領域からそれが放出され
るかを測定すること； (v)伸長したプライマーについて、さらにサンプルＤＮＡの部分について、ＤＮ
Ａ配列を構築する必要に応じて、段階(iii)および(iv)を反復すること： の段階を含む請求項１または２に記載の核酸におけるヌクレオチド塩基を決定す
る方法。 - 【請求項４】 (i)マイクロフルイド装置上の予め定められた領域にサンプ
ルＤＮＡを添加すること (ii)マイクロフルイド装置上の反応チャンバーにサンプルを移動させること (iii)サンプルＤＮＡを反応チャンバーの表面に結合させ、あるいは一本鎖形態
のサンプルＤＮＡを反応チャンバーに結合したプライマーにハイブリダイズさせ
ること(次に(v)へ) (iv)もしサンプルＤＮＡが、反応チャンバーに結合したプライマーに結合しなか
ったならば、プライマーを一本鎖形態のＤＮＡにハイブリダイズさせること (v)ＤＮＡポリメラーゼの存在下、既知のデオキシヌクレオチド(ｄＮＴＰ)、デ
オキシヌクレオチド類似物またはジデオキシヌクレオチド(ｄｄＮＴＰ)によるプ
ライマーの伸長であって、そのような伸長が、伸長反応から放出されたピロフォ
スフェート(ＰＰｉ)の検出によって示される伸長を行うことこと (vi)伸長したプライマーの配列を決定するために、段階(v)を必要なだけ反復す
ること： を含むサンプルＤＮＡの一部の配列を同定するための方法。 - 【請求項５】 ピロフォスフェート放出が、ルシフェリン・ルシフェラーゼ
反応から放射される光によって検出される、請求項１、３または４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】 検出段階が標識されたターミネーターを含む、請求項２に記
載の方法。 - 【請求項７】 デオキシヌクレオチド／ジデオキシヌクレオチド取り込みの
検出が、リアルタイムで実施される、請求項１−６の方法。 - 【請求項８】 マイクロフルイド装置がディスクであって、流体が求心力に
よって移動され得る、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9828785.7A GB9828785D0 (en) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | Sequencing systems |
| GB9828785.7 | 1998-12-30 | ||
| PCT/EP1999/010347 WO2000040750A1 (en) | 1998-12-30 | 1999-12-23 | Method for sequencing dna using a microfluidic device |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002534096A true JP2002534096A (ja) | 2002-10-15 |
Family
ID=10845136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000592442A Pending JP2002534096A (ja) | 1998-12-30 | 1999-12-23 | マイクロフルイド装置を使用するｄｎａをシークエンシングするための方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1141401A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002534096A (ja) |
| AU (1) | AU1983800A (ja) |
| CA (1) | CA2357775A1 (ja) |
| GB (1) | GB9828785D0 (ja) |
| WO (1) | WO2000040750A1 (ja) |
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