JP2002534075A - 医薬的タンパク質のファミリー - Google Patents
医薬的タンパク質のファミリーInfo
- Publication number
- JP2002534075A JP2002534075A JP2000592316A JP2000592316A JP2002534075A JP 2002534075 A JP2002534075 A JP 2002534075A JP 2000592316 A JP2000592316 A JP 2000592316A JP 2000592316 A JP2000592316 A JP 2000592316A JP 2002534075 A JP2002534075 A JP 2002534075A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- protein
- seq
- acid residue
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/463—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from amphibians
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
タンパク質ファミリーはヒト腫瘍細胞系に対して生物活性を示す４種のタンパク質を包含する。これらのタンパク質は Rana pipiens のカエルの卵から誘導され、膵臓リボヌクレアーゼのスーパーファミリーのメンバーである。
Description
【０００１】
本発明は医薬に関し、さらに特定すればヒトにおける腫瘍の処置に使用される
医薬に関する。
医薬に関する。
【０００２】
本発明の１つの目的はヒトにおける腫瘍の処置に使用される医薬のファミリー
を提供することにある。 他の目的は一般的に、ヒトにおける腫瘍の処置のための既知の治療法を改良す
ることにある。
を提供することにある。 他の目的は一般的に、ヒトにおける腫瘍の処置のための既知の治療法を改良す
ることにある。
【０００３】 本発明によれば、高度なホモロジーを有し、密接に関連するタンパク質のファ
ミリーを提供する。このファミリーは、それぞれ ａ) １１４個のアミノ酸長を有するアミノ酸配列、 ｂ) 約１０の等電点、および ｃ) 約１３,０００の分子量 を有する４種の精製タンパク質によって例示される。必須ではないが有利には、
このタンパク質はカエルの卵、好ましくは Rana pipiens frog の卵から誘導さ
れる。
ミリーを提供する。このファミリーは、それぞれ ａ) １１４個のアミノ酸長を有するアミノ酸配列、 ｂ) 約１０の等電点、および ｃ) 約１３,０００の分子量 を有する４種の精製タンパク質によって例示される。必須ではないが有利には、
このタンパク質はカエルの卵、好ましくは Rana pipiens frog の卵から誘導さ
れる。
【０００４】 上述の４種の精製タンパク質は糖タンパク質であり、すなわち共有結合によっ
てタンパク質に連結するグリカン（炭水化物）をそれぞれ含有する。しかしなが
ら、ヒト腫瘍細胞系に対するそのタンパク質の生物活性にはグリカン部分は必要
ではない。
てタンパク質に連結するグリカン（炭水化物）をそれぞれ含有する。しかしなが
ら、ヒト腫瘍細胞系に対するそのタンパク質の生物活性にはグリカン部分は必要
ではない。
【０００５】 米国特許第 5,559,212 および 5,728,805 号には陽イオン交換クロマトグラフ
ィーカラムから溶出される２つのタンパク質ピークが開示されている。米国特許
第 5,559,212 号にはその第一の（大きな）ピークにおけるタンパク質のアミノ
酸配列および組成が記載され、この記載は第二の（小さい）ピークにおけるタン
パク質のアミノ酸配列および組成を記述する米国特許第 5,728,805 号の開示に
よって拡大される。第三のタンパク質ピークもイオン交換カラムから溶出し、こ
の（さらに小さい）ピークには、ファミリーとしてのそれらの命名を正当化する
のに十分類似した４種のタンパク質を含有することが今回示されたのである。第
三のタンパク質ピークは第一および第二のピークの後に溶出されるので、そのピ
ークのタンパク質はさらに塩基性である。
ィーカラムから溶出される２つのタンパク質ピークが開示されている。米国特許
第 5,559,212 号にはその第一の（大きな）ピークにおけるタンパク質のアミノ
酸配列および組成が記載され、この記載は第二の（小さい）ピークにおけるタン
パク質のアミノ酸配列および組成を記述する米国特許第 5,728,805 号の開示に
よって拡大される。第三のタンパク質ピークもイオン交換カラムから溶出し、こ
の（さらに小さい）ピークには、ファミリーとしてのそれらの命名を正当化する
のに十分類似した４種のタンパク質を含有することが今回示されたのである。第
三のタンパク質ピークは第一および第二のピークの後に溶出されるので、そのピ
ークのタンパク質はさらに塩基性である。
【０００６】 試験の結果は、４種のタンパク質のそれぞれが２種のヒト癌細胞系に対する生
物活性を有することを示している。
物活性を有することを示している。
【０００７】 以下の例示的な非限定的図面を参照すれば、本発明をよりよく理解できるもの
と考える。 図１は４種のタンパク質の産生および精製方法を示すフローチャートであり、
図２は陽イオン交換クロマトグラフィー工程の結果を示し、４種のタンパク質が
単離され精製される分画を例示するものであり、図３は逆相高速液体クロマトグ
ラフィー工程の結果を示し、本明細書に記載された４種のタンパク質を含有する
分画を例示するものであり、図４は本明細書に記載の４種のタンパク質の第一の
タンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：１を有するタンパク質
のアミノ酸配列を示し、図５は本明細書に記載の４種のタンパク質の第二のタン
パク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：２を有するタンパク質のア
ミノ酸配列を示し、図６は本明細書に記載の４種のタンパク質の第三のタンパク
質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：３を有するタンパク質のアミノ
酸配列を示し、図７は本明細書に記載の４種のタンパク質の第四のタンパク質、
すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：４を有するタンパク質のアミノ酸配
列を示し、そして図８は本明細書に記載の４種のタンパク質の間のホモロジーを
例示する。
と考える。 図１は４種のタンパク質の産生および精製方法を示すフローチャートであり、
図２は陽イオン交換クロマトグラフィー工程の結果を示し、４種のタンパク質が
単離され精製される分画を例示するものであり、図３は逆相高速液体クロマトグ
ラフィー工程の結果を示し、本明細書に記載された４種のタンパク質を含有する
分画を例示するものであり、図４は本明細書に記載の４種のタンパク質の第一の
タンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：１を有するタンパク質
のアミノ酸配列を示し、図５は本明細書に記載の４種のタンパク質の第二のタン
パク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：２を有するタンパク質のア
ミノ酸配列を示し、図６は本明細書に記載の４種のタンパク質の第三のタンパク
質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：３を有するタンパク質のアミノ
酸配列を示し、図７は本明細書に記載の４種のタンパク質の第四のタンパク質、
すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：４を有するタンパク質のアミノ酸配
列を示し、そして図８は本明細書に記載の４種のタンパク質の間のホモロジーを
例示する。
【０００８】
【発明の開示】 図１に示す好ましい実施態様によれば、最初に、Rana pipiens の卵を蓄積し
（工程１０）、弱酸性緩衝液中でホモジナイズし（工程２０）、凍結および解凍
を反復し（工程３０）、遠心分離してろ過する（工程４０）。蓄積、ホモジナイ
ゼーション、凍結、および解凍工程は３欄の１〜５４行に記載されている。解凍
した Ranapipiens の卵１０３ｇを室温で ２０６mlの０.１５Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液，ｐＨ５.０と混合した。この混合物をついで Waring ブレンダー中高速
で３分間ホモジナイズした。得られたホモジネートを繰り返し（４回）−２０℃
（±１０℃）に凍結解凍した。解凍したホモジネートをついで１０,０００×ｇ
で２５分間遠心分離し、上清をろ紙（Whatman No.541）を通してろ過すると、澄
明な抽出液２４８mlが得られ、これは２８０nmの波長を有する紫外線の１４５５
吸収単位を示した。
（工程１０）、弱酸性緩衝液中でホモジナイズし（工程２０）、凍結および解凍
を反復し（工程３０）、遠心分離してろ過する（工程４０）。蓄積、ホモジナイ
ゼーション、凍結、および解凍工程は３欄の１〜５４行に記載されている。解凍
した Ranapipiens の卵１０３ｇを室温で ２０６mlの０.１５Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液，ｐＨ５.０と混合した。この混合物をついで Waring ブレンダー中高速
で３分間ホモジナイズした。得られたホモジネートを繰り返し（４回）−２０℃
（±１０℃）に凍結解凍した。解凍したホモジネートをついで１０,０００×ｇ
で２５分間遠心分離し、上清をろ紙（Whatman No.541）を通してろ過すると、澄
明な抽出液２４８mlが得られ、これは２８０nmの波長を有する紫外線の１４５５
吸収単位を示した。
【０００９】 ２４８mlの澄明な抽出液をついで（工程５０）米国特許第 5,728,805 号の６
欄５０〜６４行の記載にほぼ従い、陽イオン交換クロマトグラフィーに付した。
とくに澄明な抽出液を SP Sepharose FF（Pharmacia）樹脂を直径２.５cm、長さ
６.７cmのベッドを形成させて充填したクロマトグラフィーカラム上に負荷した
。充填したカラムを０.１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５.０で平衡化し、ク
ロマトグラフィーは、室温において、抽出液を３ml／分の流速でカラムに負荷し
ながら実施した。充填カラムは最初平衡化緩衝液で洗浄し、ついで（分画７８の
開始時に）、平衡化緩衝液中に作成した連続（０Ｍ〜０.４６Ｍ）の食塩勾配に
より展開した。４.８mlの溶出分画を自動的に集め、この間連続的に２８０nmの
紫外線の吸収をモニタリングした。勾配の総容量は８００mlとした。
欄５０〜６４行の記載にほぼ従い、陽イオン交換クロマトグラフィーに付した。
とくに澄明な抽出液を SP Sepharose FF（Pharmacia）樹脂を直径２.５cm、長さ
６.７cmのベッドを形成させて充填したクロマトグラフィーカラム上に負荷した
。充填したカラムを０.１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５.０で平衡化し、ク
ロマトグラフィーは、室温において、抽出液を３ml／分の流速でカラムに負荷し
ながら実施した。充填カラムは最初平衡化緩衝液で洗浄し、ついで（分画７８の
開始時に）、平衡化緩衝液中に作成した連続（０Ｍ〜０.４６Ｍ）の食塩勾配に
より展開した。４.８mlの溶出分画を自動的に集め、この間連続的に２８０nmの
紫外線の吸収をモニタリングした。勾配の総容量は８００mlとした。
【００１０】 最初に集めた７７分画の溶出液は不活性であり捨てた。分画１２０〜１３３に
溶出した最初の（最大の）タンパク質ピーク中のタンパク質は米国特許第 5,559
,212号に記載され、分画１５８〜１６６に溶出した第二の（小さい）タンパク質
ピーク中のタンパク質は米国特許第 5,728,805 号に記載されている。本明細書
に記載されるタンパク質は、分画１９４〜２１０に溶出した第三（最小の）タン
パク質ピーク中に含有される。分画１９４〜２１０に溶出した「第三のピーク」
の総量は２８０nmの紫外線の１６.６吸収単位（カラムに負荷した物質の約１.１
４％）であり、約２５mgに相当した。
溶出した最初の（最大の）タンパク質ピーク中のタンパク質は米国特許第 5,559
,212号に記載され、分画１５８〜１６６に溶出した第二の（小さい）タンパク質
ピーク中のタンパク質は米国特許第 5,728,805 号に記載されている。本明細書
に記載されるタンパク質は、分画１９４〜２１０に溶出した第三（最小の）タン
パク質ピーク中に含有される。分画１９４〜２１０に溶出した「第三のピーク」
の総量は２８０nmの紫外線の１６.６吸収単位（カラムに負荷した物質の約１.１
４％）であり、約２５mgに相当した。
【００１１】 分画１９４〜２１０に溶出した「第三ピーク」の物質はついで逆相高速液体ク
ロマトグラフィーに付した（図１の工程６０）。クロマトグラフィーは直径９.
４mm，長さ２５０mmの Zorbax SB300 C18 カラム上で実施した。カラムは Hewle
tt-Packard Series 1090 Liquid Chromatograph に結合させた。
ロマトグラフィーに付した（図１の工程６０）。クロマトグラフィーは直径９.
４mm，長さ２５０mmの Zorbax SB300 C18 カラム上で実施した。カラムは Hewle
tt-Packard Series 1090 Liquid Chromatograph に結合させた。
【００１２】 溶出した「第三ピーク」の物質を５mgのアリコートで温度３５℃においてカラ
ムに負荷した。カラムは０.１％（v/v）トリフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）に平衡化
し、アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ｂ）の勾配で展開した
。負荷後は以下の溶出方法を採用した。すなわち、クロマトグラフィーの開始か
ら６分後まで勾配の傾斜は２０％緩衝液Ｂから２４.４％緩衝液Ｂに増大させた
。ついで、６分から２４分まで勾配の傾斜は２４.４％緩衝液Ｂから３０％緩衝
液Ｂに増大させた。タンパク質のピークは手動で集めた。５回の異なる試行（す
なわち、各５mgの５つのアリコート）からの相当するピークを合わせた。
ムに負荷した。カラムは０.１％（v/v）トリフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）に平衡化
し、アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ｂ）の勾配で展開した
。負荷後は以下の溶出方法を採用した。すなわち、クロマトグラフィーの開始か
ら６分後まで勾配の傾斜は２０％緩衝液Ｂから２４.４％緩衝液Ｂに増大させた
。ついで、６分から２４分まで勾配の傾斜は２４.４％緩衝液Ｂから３０％緩衝
液Ｂに増大させた。タンパク質のピークは手動で集めた。５回の異なる試行（す
なわち、各５mgの５つのアリコート）からの相当するピークを合わせた。
【００１３】 クロマトグラフィーパターンの例を図３に示す。試行の 4.5分から１３.５分
の間に溶出した物質は細胞毒性を示さないので捨てた。１３.５〜２１分の間に
溶出した５つの主要なピークに含まれるタンパク質は以下に述べる生物活性を有
することが証明された。これらのタンパク質を図３に太線で指示したように集め
、さらに精製した。
の間に溶出した物質は細胞毒性を示さないので捨てた。１３.５〜２１分の間に
溶出した５つの主要なピークに含まれるタンパク質は以下に述べる生物活性を有
することが証明された。これらのタンパク質を図３に太線で指示したように集め
、さらに精製した。
【００１４】 １６〜１７分に溶出した主要ピーク（図３には 2325p4 と命名）はソース中に
存在する大部分のタンパク質（配列番号：１）を含有した。約１４分に溶出した
小さいピーク（図３には 2325p4a と命名）は、わずか１個のアミノ酸残基のみ
でそれと異なる高度に類似したタンパク質（配列番号:２）を含有した。１４.５
〜１５.５分に溶出したピークは、これらの２つのタンパク質の混合物を含有し
た。それぞれ１７〜１８.５分および１９.５〜２０.５分に溶出した残った２つ
のピーク（図３にはそれぞれ 2325p6 および 2728と命名）は他の２種のタンパ
ク質（それぞれ配列番号：３および配列番号：４）を含有した。
存在する大部分のタンパク質（配列番号：１）を含有した。約１４分に溶出した
小さいピーク（図３には 2325p4a と命名）は、わずか１個のアミノ酸残基のみ
でそれと異なる高度に類似したタンパク質（配列番号:２）を含有した。１４.５
〜１５.５分に溶出したピークは、これらの２つのタンパク質の混合物を含有し
た。それぞれ１７〜１８.５分および１９.５〜２０.５分に溶出した残った２つ
のピーク（図３にはそれぞれ 2325p6 および 2728と命名）は他の２種のタンパ
ク質（それぞれ配列番号：３および配列番号：４）を含有した。
【００１５】 単離されたすべてのタンパク質を同じカラム上、同じ条件下に再クロマトグラ
フィー（図１における工程７０）に付し（パターンは示していない）、凍結乾燥
した（工程８０）。それぞれのタンパク質の最終的な収量（５回の試行から）は
次の通りであった。すなわち配列番号：１、５.７mg（１４分〜１６分に溶出し
たピークから）；配列番号：２、１mg（約１４分に溶出したピークから）；配列
番号：３、６.５mg；配列番号：４。１.３mgであった。配列番号：１および配列
番号：２の混合物を含むピークからは、タンパク質４.６mgが生成した。
フィー（図１における工程７０）に付し（パターンは示していない）、凍結乾燥
した（工程８０）。それぞれのタンパク質の最終的な収量（５回の試行から）は
次の通りであった。すなわち配列番号：１、５.７mg（１４分〜１６分に溶出し
たピークから）；配列番号：２、１mg（約１４分に溶出したピークから）；配列
番号：３、６.５mg；配列番号：４。１.３mgであった。配列番号：１および配列
番号：２の混合物を含むピークからは、タンパク質４.６mgが生成した。
【００１６】 上述の操作によって単離されたタンパク質はアミノ酸配列および細胞毒性試験
を用いて化学的および生物学的に特性を解析した。上述の規模で精製操作を数回
反復し、十分量の物質を生成させた。
を用いて化学的および生物学的に特性を解析した。上述の規模で精製操作を数回
反復し、十分量の物質を生成させた。
【００１７】 図４〜７は上述のように単離され、精製された４種のタンパク質アミノ酸配列
を示す。図８から明らかなように、４種のタンパク質はきわめて類似しているの
で、それらはファミリーの定義で呼ぶことができる。４種のタンパク質すべてに
おいて９５個の残基（すなわち、１１４すべての残基の８３.３％）は同一であ
る。残りの１９の位置、すなわち６、９、１３、２７、２８、３２、３４、３５
、４４、５１、５７、６３、７５、８０、８１、８３、９２、９５および１１１
は多型である。2325p4 と 2325p4a（配列番号：１および配列番号：２）の間は
１個の残基しか違わないので、これらのタンパク質は９９.１％のホモロジーを
有する。他の二者間の比較で次のホモロジーが明らかになった。 2325p6 と 2728 ：８９.５％ 2325p4 と 2325p6：８７.７％ 2325p4a と 2728 ：８８.６％ 2325p4 と 2728 ：８７.７％ 2325p4a と 2325p6：８６.８％
を示す。図８から明らかなように、４種のタンパク質はきわめて類似しているの
で、それらはファミリーの定義で呼ぶことができる。４種のタンパク質すべてに
おいて９５個の残基（すなわち、１１４すべての残基の８３.３％）は同一であ
る。残りの１９の位置、すなわち６、９、１３、２７、２８、３２、３４、３５
、４４、５１、５７、６３、７５、８０、８１、８３、９２、９５および１１１
は多型である。2325p4 と 2325p4a（配列番号：１および配列番号：２）の間は
１個の残基しか違わないので、これらのタンパク質は９９.１％のホモロジーを
有する。他の二者間の比較で次のホモロジーが明らかになった。 2325p6 と 2728 ：８９.５％ 2325p4 と 2325p6：８７.７％ 2325p4a と 2728 ：８８.６％ 2325p4 と 2728 ：８７.７％ 2325p4a と 2325p6：８６.８％
【００１８】 この４種のタンパク質と National Center for Biotechnology Information
において既知の３００,８０６のタンパク質配列の間の関係をチェックするため
に、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）のバージョンＢＬＡＳ
ＴＰプログラムを使用した。この検索により、これらの４種の各タンパク質した
がってそれらが包含されるファミリーは、膵臓リボヌクレアーゼＡのスーパーフ
ァミリーに属することが明らかになった。
において既知の３００,８０６のタンパク質配列の間の関係をチェックするため
に、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）のバージョンＢＬＡＳ
ＴＰプログラムを使用した。この検索により、これらの４種の各タンパク質した
がってそれらが包含されるファミリーは、膵臓リボヌクレアーゼＡのスーパーフ
ァミリーに属することが明らかになった。
【００１９】 以下の表１〜５には上記４種のタンパク質のアミノ酸組成を示す。すなわち、
表１〜４は加水分解後のモル百分率を示し、一方、表５は１分子あたりのアミノ
酸残基数を示す。
表１〜４は加水分解後のモル百分率を示し、一方、表５は１分子あたりのアミノ
酸残基数を示す。
【００２０】 これらの４種のタンパク質の組成分析は６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジルカルバメートによるプレカラム誘導体化法を用いて実施した。
誘導体化されたアミノ酸は、Hewlett-Packard Series 1090 Liquid Chromatogra
phを用いＣ８カラム（Zorbax, Eclipse XDB 2.1×150 mm）上、逆相クロマトグ
ラフィーによって同定され、定量された。６.０Ｍ塩酸中（空気を除去したチュ
ーブ中、１０５〜１１０℃で21時間）手作業による加水分解の前に、タンパク質
サンプルを変性し、それらのジスルフィド結合を還元して新たに形成したスルフ
ヒドリル基を 4-ビニルピリジンでアルキル化した。このサンプル調製の目的は
、酸加水分解中に大部分が破壊されるシステインを保護するためであった。アル
キル化は完全には進行しないので、見かけ上のシステイン含量は通常アルキル化
サンプル中でも若干低くなる。トリプトファンは酸加水分解によって破壊される
他のアミノ酸であり、測定しなかった。すべて酸加水分解中に部分的な分解を受
けるセリン、スレオニンおよびメチオニンの値は補正しなかった。イソロイシン
（このアミノ酸により形成されたペプチド結合は通常のペプチド結合に比べて加
水分解への抵抗性が強い）の値も補正しなかった。
スクシンイミジルカルバメートによるプレカラム誘導体化法を用いて実施した。
誘導体化されたアミノ酸は、Hewlett-Packard Series 1090 Liquid Chromatogra
phを用いＣ８カラム（Zorbax, Eclipse XDB 2.1×150 mm）上、逆相クロマトグ
ラフィーによって同定され、定量された。６.０Ｍ塩酸中（空気を除去したチュ
ーブ中、１０５〜１１０℃で21時間）手作業による加水分解の前に、タンパク質
サンプルを変性し、それらのジスルフィド結合を還元して新たに形成したスルフ
ヒドリル基を 4-ビニルピリジンでアルキル化した。このサンプル調製の目的は
、酸加水分解中に大部分が破壊されるシステインを保護するためであった。アル
キル化は完全には進行しないので、見かけ上のシステイン含量は通常アルキル化
サンプル中でも若干低くなる。トリプトファンは酸加水分解によって破壊される
他のアミノ酸であり、測定しなかった。すべて酸加水分解中に部分的な分解を受
けるセリン、スレオニンおよびメチオニンの値は補正しなかった。イソロイシン
（このアミノ酸により形成されたペプチド結合は通常のペプチド結合に比べて加
水分解への抵抗性が強い）の値も補正しなかった。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
【表３】
【００２４】
【表４】
【００２５】
【表５】
【００２６】 上述のように、これらのタンパク質はポリアクリルアミドゲル電気泳動では不
均一な糖タンパク質である。この理由から、ポリアクリルアミドゲル電気泳動は
それらの見かけ上の分子量の範囲のみを生じることができる。
均一な糖タンパク質である。この理由から、ポリアクリルアミドゲル電気泳動は
それらの見かけ上の分子量の範囲のみを生じることができる。
【００２７】 １０％〜２０％勾配ゲルおよび Tricine 緩衝系を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（
ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動）に
よって見かけ上の分子量範囲は１３,０００〜２０,０００と評価された。この範
囲は各タンパク質の全分子の分子量を表す。すなわち、タンパク質それ自体のみ
でなく、それに結合するグリカンを含めた分子量を表す。
ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動）に
よって見かけ上の分子量範囲は１３,０００〜２０,０００と評価された。この範
囲は各タンパク質の全分子の分子量を表す。すなわち、タンパク質それ自体のみ
でなく、それに結合するグリカンを含めた分子量を表す。
【００２８】 各タンパク質のタンパク質部分の分子量の値を、８個のすべてのシステイン残
基が対になって４個のジスルフィド結合を形成するものと仮定して、その完全な
アミノ酸配列から計算した（図４〜７）。
基が対になって４個のジスルフィド結合を形成するものと仮定して、その完全な
アミノ酸配列から計算した（図４〜７）。
【００２９】 各タンパク質の等電点も、システインの対合についての同じ仮定を用いてそれ
ぞれの配列から計算した。分子量および等電点は、Protein Tools Version 5.04
コンピュータープログラム（1996）, Window Chem Software, Inc. を用いて計
算した。値は表６に示す。
ぞれの配列から計算した。分子量および等電点は、Protein Tools Version 5.04
コンピュータープログラム（1996）, Window Chem Software, Inc. を用いて計
算した。値は表６に示す。
【００３０】 表６からわかるとおり、各タンパク質の分子量は約１３,０００である。これ
らのタンパク質の各々の等電点は約１０であり、それは陽イオン交換カラムでの
それらの挙動によく一致する（図２）。
らのタンパク質の各々の等電点は約１０であり、それは陽イオン交換カラムでの
それらの挙動によく一致する（図２）。
【００３１】
【表６】
【００３２】 表６から明らかなように、４つのすべてのタンパク質は糖タンパク質であり、
すなわちそれぞれタンパク質に共有結合で連結するグリカン（炭水化物）を含有
する。これらのグリカン部分は生物活性には必須ではない。グリカンの含量は、
タンパク質間で、ならびに同じタンパク質のタンパク質分子間で明らかに変動す
る。糖タンパク質炭水化物評価キット（Pierce）を用いて評価すると、各タンパ
ク質は少なくとも数％のグリカンを含有する。
すなわちそれぞれタンパク質に共有結合で連結するグリカン（炭水化物）を含有
する。これらのグリカン部分は生物活性には必須ではない。グリカンの含量は、
タンパク質間で、ならびに同じタンパク質のタンパク質分子間で明らかに変動す
る。糖タンパク質炭水化物評価キット（Pierce）を用いて評価すると、各タンパ
ク質は少なくとも数％のグリカンを含有する。
【００３３】 各タンパク質は２個以上の部位でグリコシル化されている。グリカン部分は、
アスパラギン残基に結合していることが分かった（Ｎ−グリコシル化）。今日ま
で、２個のグリコシル化部位が各タンパク質について決定されている。それらは
、タンパク質 2325p4、2325p4a および 2728（それぞれ配列番号：１、配列番号
；２および配列番号：４）ではＡｓｎ 27 および 91 である。タンパク質 2325p
6（配列番号：３）ではグリコシル化残基はＡsn 25 および 91 である。グリカ
ン部分のサイズおよび化学的本質は特定のタンパク質の分子間で変動することが
明らかである。
アスパラギン残基に結合していることが分かった（Ｎ−グリコシル化）。今日ま
で、２個のグリコシル化部位が各タンパク質について決定されている。それらは
、タンパク質 2325p4、2325p4a および 2728（それぞれ配列番号：１、配列番号
；２および配列番号：４）ではＡｓｎ 27 および 91 である。タンパク質 2325p
6（配列番号：３）ではグリコシル化残基はＡsn 25 および 91 である。グリカ
ン部分のサイズおよび化学的本質は特定のタンパク質の分子間で変動することが
明らかである。
【００３４】 本明細書に記載のタンパク質は、２つのヒト癌細胞系、すなわちヒト顎下腺癌
（Ａ-253）およびヒト膀胱癌（Ｔ-24）に対する生物活性について試験された。
これらの試験結果は表７および８に示す。ラニピルナーゼ（登録商標 ONCONASE
によって知られ、米国特許第 5,559,212 号に開示されている）およびウシリボ
ヌクレアーゼＡはそれぞれ陽性および陰性対照として働く。
（Ａ-253）およびヒト膀胱癌（Ｔ-24）に対する生物活性について試験された。
これらの試験結果は表７および８に示す。ラニピルナーゼ（登録商標 ONCONASE
によって知られ、米国特許第 5,559,212 号に開示されている）およびウシリボ
ヌクレアーゼＡはそれぞれ陽性および陰性対照として働く。
【００３５】 表７および８から明らかなように、それぞれのタンパク質は各細胞系の増殖を
強力に阻害した。Ａ-253 ヒト顎下腺癌細胞はより応答性であることが分かった
。タンパク質の抗増殖／細胞傷害活性は、ラニピルナーゼの場合に匹敵するもの
であった。リボヌクレアーゼＡは実質的に高い濃度で使用しても、無視できる作
用しか示さなかった。
強力に阻害した。Ａ-253 ヒト顎下腺癌細胞はより応答性であることが分かった
。タンパク質の抗増殖／細胞傷害活性は、ラニピルナーゼの場合に匹敵するもの
であった。リボヌクレアーゼＡは実質的に高い濃度で使用しても、無視できる作
用しか示さなかった。
【００３６】
【表７】
【００３７】
【表８】
【００３８】 以上、本発明の好ましい実施態様について説明したが、本発明の範囲は本明細
書に記載の特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。
書に記載の特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。
【配列表】
【図１】 ４種のタンパク質の産生および精製方法を示すフローチャートである。
【図２】 陽イオン交換クロマトグラフィー工程の結果を示し、４種のタンパク質が単離
され精製される分画を例示する。
され精製される分画を例示する。
【図３】 逆相高速液体クロマトグラフィー工程の結果を示し、本明細書に記載された４
種のタンパク質を含有する分画を例示する。
種のタンパク質を含有する分画を例示する。
【図４】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第一のタンパク質、すなわちそのアミノ
酸配列として配列番号：１を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
酸配列として配列番号：１を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第二のタンパク質、すなわちそのアミノ
酸配列として配列番号：２を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
酸配列として配列番号：２を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第三のタンパク質、すなわちそのアミノ
酸配列として配列番号：３を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
酸配列として配列番号：３を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第四のタンパク質、すなわちそのアミノ
酸配列として配列番号：４を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
酸配列として配列番号：４を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８】 本明細書に記載の４種のタンパク質の間のホモロジーを例示する。
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
- 【請求項２】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
- 【請求項３】 配列番号：３に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
- 【請求項４】 配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
- 【請求項５】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の精製
変異体であり、その変異体はヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、その変異体は配列番
号：１のタンパク質とは単に位置６、９、１３、２７、２８、３２、３４、３５
、４４、５１、５７、６３、７５、８０、８１、８３、９２、９５および１１１
におけるアミノ酸残基の１個または２個以上の任意のアミノ酸による置換によっ
て相異する精製変異体。 - 【請求項６】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の精製
変異体であり、その変異体はヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、その変異体は配列番
号:１のタンパク質とは 位置６のアミノ酸残基はＡｒｇまたはＬｙｓであり、 位置９のアミノ酸残基はＧｌｕまたはＶａｌであり、 位置１３のアミノ酸残基はＴｈｒ、またはＶａｌまたはＡｌａであり、 位置２７のアミノ酸残基はＡｓｎまたはＴｈｒであり、 位置２８のアミノ酸残基はＡｒｇまたはＳｅｒまたはＬｙｓであり、 位置３２のアミノ酸残基はＡｓｐまたはＡｓｎであり、 位置３４のアミノ酸残基はＡｌａまたはＡｓｐであり、 位置３５のアミノ酸残基はＴｙｒまたはＰｈｅであり、 位置４４のアミノ酸残基はＩｌｅまたはＶａｌであり、 位置５１のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＡｓｎであり、 位置５７のアミノ酸残基はＧｌｕまたはＡｓｐであり、 位置６３のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＳｅｒであり、 位置７５のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＰｒｏであり、 位置８０のアミノ酸残基はＬｙｓまたはＡｓｎであり、 位置８１のアミノ酸残基はＡｓｎまたはＬｙｓであり、 位置８３のアミノ酸残基はＩｌｅまたはＬｙｓであり、 位置９２のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＧｌｕであり、 位置９５のアミノ酸残基はＰｈｅまたはＴｙｒであり、 位置１１１のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＩｌｅである点で異なっている精製
変異体。 - 【請求項７】 配列番号：１に示すアミノ酸配列の保存的に修飾された変異
体。 - 【請求項８】 配列番号：２に示すアミノ酸配列の保存的に修飾された変異
体。 - 【請求項９】 配列番号：３に示すアミノ酸配列の保存的に修飾された変異
体。 - 【請求項１０】 配列番号：４に示すアミノ酸配列の保存的に修飾された変
異体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/223,118 US6239257B1 (en) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | Family of proteins belonging to the pancreatic ribonuclease a superfamily |
| US09/223,118 | 1998-12-30 | ||
| PCT/US1999/030799 WO2000040608A1 (en) | 1998-12-30 | 1999-12-24 | Proteins from rana pipiens and their use in the treatment of tumors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002534075A true JP2002534075A (ja) | 2002-10-15 |
| JP4516216B2 JP4516216B2 (ja) | 2010-08-04 |
Family
ID=22835123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000592316A Expired - Lifetime JP4516216B2 (ja) | 1998-12-30 | 1999-12-24 | 医薬的タンパク質のファミリー |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6239257B1 (ja) |
| EP (1) | EP1141004B1 (ja) |
| JP (1) | JP4516216B2 (ja) |
| AT (1) | ATE433461T1 (ja) |
| DE (1) | DE69940980D1 (ja) |
| WO (1) | WO2000040608A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007530002A (ja) * | 2003-07-17 | 2007-11-01 | アルフアセル・コーポレイシヨン | リボヌクレアーゼ及び組換えによるその作成方法 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2354280T3 (es) | 2005-06-16 | 2011-03-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Variantes de ribonucleasa citotóxica. |
| JP2008546391A (ja) | 2005-06-16 | 2008-12-25 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 細胞傷害性リボヌクレアーゼ変異株 |
| CN100372869C (zh) * | 2006-04-18 | 2008-03-05 | 河北师范大学 | 棕点湍蛙抗微生物多肽及其在制药中的应用 |
| HUE032166T2 (en) | 2009-11-02 | 2017-09-28 | Univ Washington | Therapeutic nuclease preparations and methods |
| KR102428875B1 (ko) | 2011-04-29 | 2022-08-05 | 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 | 치료적 뉴클레아제 조성물 및 방법 |
| US10988745B2 (en) | 2013-10-31 | 2021-04-27 | Resolve Therapeutics, Llc | Therapeutic nuclease-albumin fusions and methods |
| CA2942706C (en) | 2014-03-28 | 2020-01-14 | Tamir Biotechnology, Inc. | Rnase for use in treating or preventing viral infections |
| US9919034B2 (en) | 2014-03-28 | 2018-03-20 | Tamir Biotechnology, Inc. | Methods of treating and prophylactically protecting mammalian patients infected by viruses classified in Baltimore group V |
| US9642794B2 (en) | 2014-08-18 | 2017-05-09 | Tamir Biotechnology, Inc. | Antiviral pharmaceutical for topical administration |
| US10835598B2 (en) | 2014-08-18 | 2020-11-17 | Orgenesis Inc. | Prophylactic protection against viral infections, particularly HIV |
| AU2016277827B2 (en) | 2015-06-15 | 2021-04-29 | Orgenesis Inc. | Pharmaceuticals for treatment of viral infections of the eye |
| MX2018003528A (es) | 2015-09-25 | 2018-11-09 | Okogen Inc | Tratamiento de conjuntivitis viral utilizando ranpirnasa y/o anfinasa. |
| WO2017142807A1 (en) | 2016-02-16 | 2017-08-24 | Tamir Biotechnology, Inc. | Treatment or prevention of zika virus infections by administration of a ribonuclease |
| EP3490587B1 (en) | 2016-07-26 | 2021-06-16 | Squiquera, Luis | Prophylactic protection against viral infections |
| US11331378B2 (en) | 2016-07-26 | 2022-05-17 | Orgenesis Inc. | Prophylactic protection against viral infections |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03503530A (ja) * | 1988-04-06 | 1991-08-08 | アルフアセル・コーポレイシヨン | ヒト腫瘍治療薬およびその製造方法 |
| JPH05501548A (ja) * | 1989-11-13 | 1993-03-25 | アルフアセル・コーポレイシヨン | 精製された蛋白質および生物活性治療薬 |
| WO1997031116A2 (en) * | 1996-02-21 | 1997-08-28 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF H EALTH AND HUMAN SERVICES | Recombinant ribonuclease proteins |
| JPH11507041A (ja) * | 1995-06-06 | 1999-06-22 | アルフアセル・コーポレイシヨン | ラナ・ピピエンス卵母細胞からの抗腫瘍タンパク質 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5559212A (en) * | 1988-04-06 | 1996-09-24 | Alfacell Corporation | Frog embryo and egg-derived tumor cell anti-proliferation protein |
-
1998
- 1998-12-30 US US09/223,118 patent/US6239257B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-12-24 DE DE69940980T patent/DE69940980D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-24 JP JP2000592316A patent/JP4516216B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-24 AT AT99968949T patent/ATE433461T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-12-24 EP EP99968949A patent/EP1141004B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-24 WO PCT/US1999/030799 patent/WO2000040608A1/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03503530A (ja) * | 1988-04-06 | 1991-08-08 | アルフアセル・コーポレイシヨン | ヒト腫瘍治療薬およびその製造方法 |
| JPH05501548A (ja) * | 1989-11-13 | 1993-03-25 | アルフアセル・コーポレイシヨン | 精製された蛋白質および生物活性治療薬 |
| JPH11507041A (ja) * | 1995-06-06 | 1999-06-22 | アルフアセル・コーポレイシヨン | ラナ・ピピエンス卵母細胞からの抗腫瘍タンパク質 |
| WO1997031116A2 (en) * | 1996-02-21 | 1997-08-28 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF H EALTH AND HUMAN SERVICES | Recombinant ribonuclease proteins |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6009043702, Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, 1991, Ｖｏｌ．２６６， Ｎｏ．１, ｐ．２４５−２５１ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007530002A (ja) * | 2003-07-17 | 2007-11-01 | アルフアセル・コーポレイシヨン | リボヌクレアーゼ及び組換えによるその作成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1141004B1 (en) | 2009-06-10 |
| US6239257B1 (en) | 2001-05-29 |
| EP1141004A1 (en) | 2001-10-10 |
| DE69940980D1 (de) | 2009-07-23 |
| WO2000040608A1 (en) | 2000-07-13 |
| ATE433461T1 (de) | 2009-06-15 |
| JP4516216B2 (ja) | 2010-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4516216B2 (ja) | 医薬的タンパク質のファミリー | |
| Corder et al. | Purification and characterization of human neuropeptide Y from adrenal-medullary phaeochromocytoma tissue | |
| Simpson et al. | Rat epidermal growth factor: complete amino acid sequence: Homology with the correspondence murine and human proteins; isolation of a form truncated at both ends with full in vitro biological activity | |
| AU620346B2 (en) | Follistatin and method of purifying same | |
| Miranda et al. | Purification of animal neurotoxins: isolation and characterization of eleven neurotoxins from the venoms of the scorpions Androctonus australis Hector, Buthus occitanus tunetanus and Leiurus quinquestriatus quinquestriatus | |
| Odani et al. | Purification and complete amino acid sequence of novel β2-microglobulin | |
| EP0220241B1 (en) | Purified protein having angiogenic activity and methods of preparation | |
| JP2007084554A (ja) | 新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法 | |
| US3948875A (en) | Process for the preparation of epidermal growth factor and new derivative using cross-linked polyacrylamide gel at a pH of 1-3 | |
| EP0100641A2 (en) | Human lymphotoxin and derivatives thereof, process for its preparation, and pharmaceutical composition containing it | |
| US4740587A (en) | Inhibin and method of purifying same | |
| Eylar et al. | Allergic encephalomyelitis: Cleavage of the C-tryptophyl bond in the encephalitogenic basic protein from bovine myelin | |
| JPH11508223A (ja) | 塩基性線維芽細胞増殖因子の精製法 | |
| US4765903A (en) | Purification of monomeric interferon | |
| Crabb et al. | Characterization of multiple forms of prostatropin (prostate epithelial cell growth factor) from bovine brain | |
| US5728805A (en) | Pharmaceuticals and method for making them | |
| US4920196A (en) | Human lymphotoxin | |
| Gennaro et al. | C5a fragment of bovine complement: Purification, bioassays, amino‐acid sequence and other structural studies | |
| Minchiotti et al. | Two alloalbumins with identical electrophoretic mobility are produced by differently charged amino acid substitutions | |
| Uyemura et al. | Purifications and properties of basic proteins in pig spinal cord and peripheral nerve | |
| Croguennec et al. | Two-step chromatographic procedure for the preparation of hen egg white ovotransferrin | |
| CA2128215C (en) | Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy | |
| Cui et al. | Primary structure and functional characterization of rat C5a: an anaphylatoxin with unusually high potency | |
| Simpson et al. | Complete amino acid sequence of a new murine T‐cell growth factor P40 | |
| Welling et al. | Isolation of Sendai virus F protein by anion-exchange high-performance liquid chromatography in the presence of Triton X-100 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061130 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090901 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090929 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091130 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091207 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100224 |
|
| RD12 | Notification of acceptance of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7432 Effective date: 20100224 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100224 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100420 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100514 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4516216 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130521 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |