JP4516216B2 - 医薬的タンパク質のファミリー - Google Patents

Description

【０００１】
【技術分野】
本発明は医薬に関し、さらに特定すればヒトにおける腫瘍の処置に使用される医薬に関する。
【０００２】
【背景技術】
本発明の１つの目的はヒトにおける腫瘍の処置に使用される医薬のファミリーを提供することにある。
他の目的は一般的に、ヒトにおける腫瘍の処置のための既知の治療法を改良することにある。
【０００３】
本発明によれば、高度なホモロジーを有し、密接に関連するタンパク質のファミリーを提供する。このファミリーは、それぞれ
ａ) １１４個のアミノ酸長を有するアミノ酸配列、
ｂ) 約１０の等電点、および
ｃ) 約１３,０００の分子量
を有する４種の精製タンパク質によって例示される。必須ではないが有利には、このタンパク質はカエルの卵、好ましくは Rana pipiens frog の卵から誘導される。
【０００４】
上述の４種の精製タンパク質は糖タンパク質であり、すなわち共有結合によってタンパク質に連結するグリカン（炭水化物）をそれぞれ含有する。しかしながら、ヒト腫瘍細胞系に対するそのタンパク質の生物活性にはグリカン部分は必要ではない。
【０００５】
米国特許第 5,559,212 および 5,728,805 号には陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出される２つのタンパク質ピークが開示されている。米国特許第 5,559,212 号にはその第一の（大きな）ピークにおけるタンパク質のアミノ酸配列および組成が記載され、この記載は第二の（小さい）ピークにおけるタンパク質のアミノ酸配列および組成を記述する米国特許第 5,728,805 号の開示によって拡大される。第三のタンパク質ピークもイオン交換カラムから溶出し、この（さらに小さい）ピークには、ファミリーとしてのそれらの命名を正当化するのに十分類似した４種のタンパク質を含有することが今回示されたのである。第三のタンパク質ピークは第一および第二のピークの後に溶出されるので、そのピークのタンパク質はさらに塩基性である。
【０００６】
試験の結果は、４種のタンパク質のそれぞれが２種のヒト癌細胞系に対する生物活性を有することを示している。
【０００７】
以下の例示的な非限定的図面を参照すれば、本発明をよりよく理解できるものと考える。
図１は４種のタンパク質の産生および精製方法を示すフローチャートであり、図２は陽イオン交換クロマトグラフィー工程の結果を示し、４種のタンパク質が単離され精製される分画を例示するものであり、図３は逆相高速液体クロマトグラフィー工程の結果を示し、本明細書に記載された４種のタンパク質を含有する分画を例示するものであり、図４は本明細書に記載の４種のタンパク質の第一のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：１を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、図５は本明細書に記載の４種のタンパク質の第二のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：２を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、図６は本明細書に記載の４種のタンパク質の第三のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：３を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、図７は本明細書に記載の４種のタンパク質の第四のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：４を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、そして図８は本明細書に記載の４種のタンパク質の間のホモロジーを例示する。
【０００８】
【発明の開示】
図１に示す好ましい実施態様によれば、最初に、Rana pipiens の卵を蓄積し（工程１０）、弱酸性緩衝液中でホモジナイズし（工程２０）、凍結および解凍を反復し（工程３０）、遠心分離してろ過する（工程４０）。蓄積、ホモジナイゼーション、凍結、および解凍工程は３欄の１〜５４行に記載されている。解凍した Ranapipiens の卵１０３ｇを室温で ２０６mlの０.１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５.０と混合した。この混合物をついで Waring ブレンダー中高速で３分間ホモジナイズした。得られたホモジネートを繰り返し（４回）−２０℃（±１０℃）に凍結解凍した。解凍したホモジネートをついで１０,０００×ｇで２５分間遠心分離し、上清をろ紙（Whatman No.541）を通してろ過すると、澄明な抽出液２４８mlが得られ、これは２８０nmの波長を有する紫外線の１４５５吸収単位を示した。
【０００９】
２４８mlの澄明な抽出液をついで（工程５０）米国特許第 5,728,805 号の６欄５０〜６４行の記載にほぼ従い、陽イオン交換クロマトグラフィーに付した。とくに澄明な抽出液を SP Sepharose FF（Pharmacia）樹脂を直径２.５cm、長さ６.７cmのベッドを形成させて充填したクロマトグラフィーカラム上に負荷した。充填したカラムを０.１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５.０で平衡化し、クロマトグラフィーは、室温において、抽出液を３ml／分の流速でカラムに負荷しながら実施した。充填カラムは最初平衡化緩衝液で洗浄し、ついで（分画７８の開始時に）、平衡化緩衝液中に作成した連続（０Ｍ〜０.４６Ｍ）の食塩勾配により展開した。４.８mlの溶出分画を自動的に集め、この間連続的に２８０nmの紫外線の吸収をモニタリングした。勾配の総容量は８００mlとした。
【００１０】
最初に集めた７７分画の溶出液は不活性であり捨てた。分画１２０〜１３３に溶出した最初の（最大の）タンパク質ピーク中のタンパク質は米国特許第 5,559,212号に記載され、分画１５８〜１６６に溶出した第二の（小さい）タンパク質ピーク中のタンパク質は米国特許第 5,728,805 号に記載されている。本明細書に記載されるタンパク質は、分画１９４〜２１０に溶出した第三（最小の）タンパク質ピーク中に含有される。分画１９４〜２１０に溶出した「第三のピーク」の総量は２８０nmの紫外線の１６.６吸収単位（カラムに負荷した物質の約１.１４％）であり、約２５mgに相当した。
【００１１】
分画１９４〜２１０に溶出した「第三ピーク」の物質はついで逆相高速液体クロマトグラフィーに付した（図１の工程６０）。クロマトグラフィーは直径９.４mm，長さ２５０mmの Zorbax SB300 C18 カラム上で実施した。カラムは Hewlett-Packard Series 1090 Liquid Chromatograph に結合させた。
【００１２】
溶出した「第三ピーク」の物質を５mgのアリコートで温度３５℃においてカラムに負荷した。カラムは０.１％（v/v）トリフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）に平衡化し、アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ｂ）の勾配で展開した。負荷後は以下の溶出方法を採用した。すなわち、クロマトグラフィーの開始から６分後まで勾配の傾斜は２０％緩衝液Ｂから２４.４％緩衝液Ｂに増大させた。ついで、６分から２４分まで勾配の傾斜は２４.４％緩衝液Ｂから３０％緩衝液Ｂに増大させた。タンパク質のピークは手動で集めた。５回の異なる試行（すなわち、各５mgの５つのアリコート）からの相当するピークを合わせた。
【００１３】
クロマトグラフィーパターンの例を図３に示す。試行の 4.5分から１３.５分の間に溶出した物質は細胞毒性を示さないので捨てた。１３.５〜２１分の間に溶出した５つの主要なピークに含まれるタンパク質は以下に述べる生物活性を有することが証明された。これらのタンパク質を図３に太線で指示したように集め、さらに精製した。
【００１４】
１６〜１７分に溶出した主要ピーク（図３には 2325p4 と命名）はソース中に存在する大部分のタンパク質（配列番号：１）を含有した。約１４分に溶出した小さいピーク（図３には 2325p4a と命名）は、わずか１個のアミノ酸残基のみでそれと異なる高度に類似したタンパク質（配列番号:２）を含有した。１４.５〜１５.５分に溶出したピークは、これらの２つのタンパク質の混合物を含有した。それぞれ１７〜１８.５分および１９.５〜２０.５分に溶出した残った２つのピーク（図３にはそれぞれ 2325p6 および 2728と命名）は他の２種のタンパク質（それぞれ配列番号：３および配列番号：４）を含有した。
【００１５】
単離されたすべてのタンパク質を同じカラム上、同じ条件下に再クロマトグラフィー（図１における工程７０）に付し（パターンは示していない）、凍結乾燥した（工程８０）。それぞれのタンパク質の最終的な収量（５回の試行から）は次の通りであった。すなわち配列番号：１、５.７mg（１４分〜１６分に溶出したピークから）；配列番号：２、１mg（約１４分に溶出したピークから）；配列番号：３、６.５mg；配列番号：４。１.３mgであった。配列番号：１および配列番号：２の混合物を含むピークからは、タンパク質４.６mgが生成した。
【００１６】
上述の操作によって単離されたタンパク質はアミノ酸配列および細胞毒性試験を用いて化学的および生物学的に特性を解析した。上述の規模で精製操作を数回反復し、十分量の物質を生成させた。
【００１７】
図４〜７は上述のように単離され、精製された４種のタンパク質アミノ酸配列を示す。図８から明らかなように、４種のタンパク質はきわめて類似しているので、それらはファミリーの定義で呼ぶことができる。４種のタンパク質すべてにおいて９５個の残基（すなわち、１１４すべての残基の８３.３％）は同一である。残りの１９の位置、すなわち６、９、１３、２７、２８、３２、３４、３５、４４、５１、５７、６３、７５、８０、８１、８３、９２、９５および１１１は多型である。2325p4 と 2325p4a（配列番号：１および配列番号：２）の間は１個の残基しか違わないので、これらのタンパク質は９９.１％のホモロジーを有する。他の二者間の比較で次のホモロジーが明らかになった。
2325p6 と 2728 ：８９.５％
2325p4 と 2325p6：８７.７％
2325p4a と 2728 ：８８.６％
2325p4 と 2728 ：８７.７％
2325p4a と 2325p6：８６.８％
【００１８】
この４種のタンパク質と National Center for Biotechnology Information において既知の３００,８０６のタンパク質配列の間の関係をチェックするために、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）のバージョンＢＬＡＳＴＰプログラムを使用した。この検索により、これらの４種の各タンパク質したがってそれらが包含されるファミリーは、膵臓リボヌクレアーゼＡのスーパーファミリーに属することが明らかになった。
【００１９】
以下の表１〜５には上記４種のタンパク質のアミノ酸組成を示す。すなわち、表１〜４は加水分解後のモル百分率を示し、一方、表５は１分子あたりのアミノ酸残基数を示す。
【００２０】
これらの４種のタンパク質の組成分析は６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートによるプレカラム誘導体化法を用いて実施した。誘導体化されたアミノ酸は、Hewlett-Packard Series 1090 Liquid Chromatographを用いＣ８カラム（Zorbax, Eclipse XDB 2.1×150 mm）上、逆相クロマトグラフィーによって同定され、定量された。６.０Ｍ塩酸中（空気を除去したチューブ中、１０５〜１１０℃で21時間）手作業による加水分解の前に、タンパク質サンプルを変性し、それらのジスルフィド結合を還元して新たに形成したスルフヒドリル基を 4-ビニルピリジンでアルキル化した。このサンプル調製の目的は、酸加水分解中に大部分が破壊されるシステインを保護するためであった。アルキル化は完全には進行しないので、見かけ上のシステイン含量は通常アルキル化サンプル中でも若干低くなる。トリプトファンは酸加水分解によって破壊される他のアミノ酸であり、測定しなかった。すべて酸加水分解中に部分的な分解を受けるセリン、スレオニンおよびメチオニンの値は補正しなかった。イソロイシン（このアミノ酸により形成されたペプチド結合は通常のペプチド結合に比べて加水分解への抵抗性が強い）の値も補正しなかった。
【００２１】
【表１】

【００２２】
【表２】

【００２３】
【表３】

【００２４】
【表４】

【００２５】
【表５】

【００２６】
上述のように、これらのタンパク質はポリアクリルアミドゲル電気泳動では不均一な糖タンパク質である。この理由から、ポリアクリルアミドゲル電気泳動はそれらの見かけ上の分子量の範囲のみを生じることができる。
【００２７】
１０％〜２０％勾配ゲルおよび Tricine 緩衝系を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって見かけ上の分子量範囲は１３,０００〜２０,０００と評価された。この範囲は各タンパク質の全分子の分子量を表す。すなわち、タンパク質それ自体のみでなく、それに結合するグリカンを含めた分子量を表す。
【００２８】
各タンパク質のタンパク質部分の分子量の値を、８個のすべてのシステイン残基が対になって４個のジスルフィド結合を形成するものと仮定して、その完全なアミノ酸配列から計算した（図４〜７）。
【００２９】
各タンパク質の等電点も、システインの対合についての同じ仮定を用いてそれぞれの配列から計算した。分子量および等電点は、Protein Tools Version 5.04コンピュータープログラム（1996）, Window Chem Software, Inc. を用いて計算した。値は表６に示す。
【００３０】
表６からわかるとおり、各タンパク質の分子量は約１３,０００である。これらのタンパク質の各々の等電点は約１０であり、それは陽イオン交換カラムでのそれらの挙動によく一致する（図２）。
【００３１】
【表６】

【００３２】
表６から明らかなように、４つのすべてのタンパク質は糖タンパク質であり、すなわちそれぞれタンパク質に共有結合で連結するグリカン（炭水化物）を含有する。これらのグリカン部分は生物活性には必須ではない。グリカンの含量は、タンパク質間で、ならびに同じタンパク質のタンパク質分子間で明らかに変動する。糖タンパク質炭水化物評価キット（Pierce）を用いて評価すると、各タンパク質は少なくとも数％のグリカンを含有する。
【００３３】
各タンパク質は２個以上の部位でグリコシル化されている。グリカン部分は、アスパラギン残基に結合していることが分かった（Ｎ−グリコシル化）。今日まで、２個のグリコシル化部位が各タンパク質について決定されている。それらは、タンパク質 2325p4、2325p4a および 2728（それぞれ配列番号：１、配列番号；２および配列番号：４）ではＡｓｎ 27 および 91 である。タンパク質 2325p6（配列番号：３）ではグリコシル化残基はＡsn 25 および 91 である。グリカン部分のサイズおよび化学的本質は特定のタンパク質の分子間で変動することが明らかである。
【００３４】
本明細書に記載のタンパク質は、２つのヒト癌細胞系、すなわちヒト顎下腺癌（Ａ-253）およびヒト膀胱癌（Ｔ-24）に対する生物活性について試験された。これらの試験結果は表７および８に示す。ラニピルナーゼ（登録商標 ONCONASEによって知られ、米国特許第 5,559,212 号に開示されている）およびウシリボヌクレアーゼＡはそれぞれ陽性および陰性対照として働く。
【００３５】
表７および８から明らかなように、それぞれのタンパク質は各細胞系の増殖を強力に阻害した。Ａ-253 ヒト顎下腺癌細胞はより応答性であることが分かった。タンパク質の抗増殖／細胞傷害活性は、ラニピルナーゼの場合に匹敵するものであった。リボヌクレアーゼＡは実質的に高い濃度で使用しても、無視できる作用しか示さなかった。
【００３６】
【表７】

【００３７】
【表８】

【００３８】
以上、本発明の好ましい実施態様について説明したが、本発明の範囲は本明細書に記載の特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ４種のタンパク質の産生および精製方法を示すフローチャートである。
【図２】 陽イオン交換クロマトグラフィー工程の結果を示し、４種のタンパク質が単離され精製される分画を例示する。
【図３】 逆相高速液体クロマトグラフィー工程の結果を示し、本明細書に記載された４種のタンパク質を含有する分画を例示する。
【図４】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第一のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：１を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第二のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：２を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第三のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：３を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７】 本明細書に記載の４種のタンパク質の第四のタンパク質、すなわちそのアミノ酸配列として配列番号：４を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８】 本明細書に記載の４種のタンパク質の間のホモロジーを例示する。
【配列表】

Claims (5)

1. 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
2. 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
3. 配列番号：３に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
4. 配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する精製タンパク質。
5. 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の精製変異体であり、その変異体はヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、その変異体は配列番号:１のタンパク質とは
   位置６のアミノ酸残基はＡｒｇまたはＬｙｓであり、
   位置９のアミノ酸残基はＧｌｕまたはＶａｌであり、
   位置１３のアミノ酸残基はＴｈｒ、またはＶａｌまたはＡｌａであり、
   位置２７のアミノ酸残基はＡｓｎまたはＴｈｒであり、
   位置２８のアミノ酸残基はＡｒｇまたはＳｅｒまたはＬｙｓであり、
   位置３２のアミノ酸残基はＡｓｐまたはＡｓｎであり、
   位置３４のアミノ酸残基はＡｌａまたはＡｓｐであり、
   位置３５のアミノ酸残基はＴｙｒまたはＰｈｅであり、
   位置４４のアミノ酸残基はＩｌｅまたはＶａｌであり、
   位置５１のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＡｓｎであり、
   位置５７のアミノ酸残基はＧｌｕまたはＡｓｐであり、
   位置６３のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＳｅｒであり、
   位置７５のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＰｒｏであり、
   位置８０のアミノ酸残基はＬｙｓまたはＡｓｎであり、
   位置８１のアミノ酸残基はＡｓｎまたはＬｙｓであり、
   位置８３のアミノ酸残基はＩｌｅまたはＬｙｓであり、
   位置９２のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＧｌｕであり、
   位置９５のアミノ酸残基はＰｈｅまたはＴｙｒであり、
   位置１１１のアミノ酸残基はＴｈｒまたはＩｌｅである点で異なっている精製変異体。

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