JP2002532388A - 生物学的分子を細胞中へ移入させやすくする新規なオリゴマーコンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、重合度（ＰＤ）が５〜５０、好ましくは１０〜４０、より好ましくは２０であり、前記重合度の５０％と等しいか、又はそれ以上の数の遊離のＮＨ ₃ ⁺を有するモノマー成分から形成されたオリゴマーを含有する、正の電荷を帯びたオリゴマーコンジュゲートに関する。特に、本発明は、オリゴヌクレオチド、ペプチド及びオリゴシドが、細胞の中へ移入することを可能にする傾向をもつ、ヒスチジル化オリゴリシンの新規なオリゴマーコンジュゲートを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、オリゴヌクレオチド、ペプチド及びオリゴシド（oligosides）とい
った生物学的分子が、細胞の中へ移入するのに好都合になるような新規なオリゴ
マーコンジュゲート（oligomeric conjugates）に関する。

【０００２】 そのような分子の細胞の中への導入は、治療的に非常に重要である。

【０００３】 アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）及び三重鎖形成オリゴヌクレオチ
ド（ＴＦＯ）は、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞における遺伝子発現を阻害又は
制御するための魅力的な推定薬物の例である。

【０００４】 腫瘍及びウイルス由来のペプチドも、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞と
いった抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）による提示の後、細胞傷害性Ｔリンパ球が関与
する、腫瘍及びウイルスに対しての細胞防御を刺激又は誘発する魅力的な分子で
ある。

【０００５】 しかし、これらの分子は、有効となるためには、適正な細胞内区画にあるこれ
らの標的に到達しなければならず、その細胞内区画とはサイトゾル又は核のいず
れかである。

【０００６】 現在までに、オリゴヌクレオチドの細胞内位置の研究では、大半の細胞におい
て、オリゴヌクレオチドの大部分が、いったん取り込まれると内部小胞に制限さ
れ、サイトゾル中及び細胞核中にあるこれらのＲＮＡ標的及びＤＮＡ標的への到
達に成功するのは、少量のみであることが指摘されている。

【０００７】 いったんサイトゾルの中に入ると、オリゴヌクレオチドは迅速に核へと侵入す
るため、細胞取り込みの際の、サイトゾルの中へのオリゴヌクレオチドの輸送の
増強は、それらの生物学的活性を増大させることが予想される。

【０００８】 リポソーム内へのオリゴヌクレオチドのカプセル化は、これらのサイトゾルの
中への輸送を増加させるが、血清の存在下では、効率が劇的に減少する。

【０００９】 抗原性ペプチドは、サイトゾルに位置するプロテアソームによりプロセシング
を受けると、ＭＨＣクラスＩ分子と結合することができ、そしてＡＰＣｓの細胞
表面に提示されうる。

【００１０】 通常、ペプチドは、ＡＰＣｓの内部小胞により取り込まれ、リソソームへと輸
送され、そこで、ＭＨＣクラスＩＩ分子提示のため分解されるか、又はプロセシ
ングを受ける。ＡＰＣｓによる制限処理されたＭＨＣクラスＩ分子提示は、ペプ
チドがサイトゾルの中へ導入されることを必要とする。

【００１１】 フランス特許第９６１３９９０号及びＰＣＴ／ＦＲ９７／０２０２２には、核
酸と複合体化したヒスチジル化ポリリシンが、細胞トランスフェクションのため
の系となることが示されている。核酸は、１０⁶〜１０⁸の分子量を有する。ポリ
リシンは、少なくとも１０％、有利には１５％〜３５％で、酸性ｐＨにおいて膜
不安定化を誘導する分子（主に、ヒスチジル残基）で置換されており、そしてポ
リリシンは１５〜９００、特に２００の重合度を有する。

【００１２】 しかし、さらなる研究では、前記複合体が、ＤＮＡによる細胞トランスフェク
ションを可能にするが、ＯＤＮ（オリゴヌクレオチド）の移入を可能にしないこ
とが示されている。

【００１３】 本発明の目的の一つは、オリゴヌクレオチド、ペプチド及びオリゴシドといっ
た水溶性オリゴマーが、サイトゾルの中へ膜通過することを可能にする、新規な
正の電荷を帯びたオリゴマーコンジュゲートを提供することである。

【００１４】 本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチド、ペプチド及びオリゴシドが、細胞
の中へ移入することを可能にしやすい、オリゴリシンの置換体である新規なオリ
ゴマーコンジュゲートを提供することである。

【００１５】 本発明の利点の一つは、新規なオリゴマーコンジュゲートと、オリゴアニオン
（例えば、オリゴヌクレオチド、アニオン性ペプチド又はアニオン性オリゴシド
）との複合体の形成が、これらがサイトゾル及び／又は細胞核の中へ移入するこ
とができるようにするために必要とされないという点である。

【００１６】 本発明のもう一つの利点は、新規な正の電荷を帯びたオリゴマーコンジュゲー
トとの静電複合体の形成は、排除されるわけではないが、オリゴアニオン（例え
ば、オリゴヌクレオチド、アニオン性ペプチド、アニオン性オリゴシド（即ち、
硫酸化、リン酸化、スクシニル化又はシアリル化（sialytaded）されたオリゴシ
ド）又はそれらの混合物）の移入にとって、必要でないという点である。

【００１７】 本発明のもう一つの目的は、インビトロ、エクスビボ又は又はインビボでの移
入法を提供することである。

【００１８】 本発明のもう一つの目的は、モノマー化合物の性質が相互に異なっていてもよ
い、特定のオリゴマー化合物を提供することである。

【００１９】 これは、本発明により達成された。

【００２０】 重合度（ＰＤ）が５〜５０、好ましくは１０〜４０、より好ましくは２０であり
、該重合度の５０％と等しいか、又はそれ以上の数の遊離のＮＨ₃ ⁺を有するモノ
マー成分から形成されたオリゴマーを含有する、正の電荷を帯びたオリゴマーコ
ンジュゲートであって、 該オリゴマーが、 − 少なくとも５０％、有利には６０％〜９５％、特に８０％〜９０％の比率
（この比率は、核磁気共鳴により決定される）で、前記成分である遊離のＮＨ₃ ⁺ が、弱酸性培地中で細胞膜の不安定化を導く、弱酸性培地中のプロトン付加可能
（protonable）な残基により置換されている、 − 前記プロトン付加可能な残基が、 → それらが、前記オリゴマーとの結合を可能にする官能基を含有する、 → それらが、細胞膜受容体により認識される認識シグナルに相当しない、 → それらが、少なくとも一つの遊離のＮＨ₃ ⁺基を含むことができる、 という特性をさらに有する、 − 前記モノマーの遊離のＮＨ₃ ⁺が、置換前の同オリゴマーと比較して、正の
電荷数の減少を導く、電荷を帯びていない残基により置換されていてもよい、 − 膜細胞受容体により認識される認識シグナルを構成する分子が → 前記モノマーの遊離のＮＨ₃ ⁺のうちのいくつかの置換によって、又は
、 → 電荷の数の減少を導く、電荷を帯びていない残基のうちのいくつかに
あることで、又は、 → 細胞膜の不安定化を導く、前記プロトン付加可能な残基のうちのい くつかにあることで、又は → 遊離のＮＨ₃ ⁺（存在する場合に）が、細胞膜の不安定化を導く、前記
プロトン付加可能な残基に置換されていることによって、 存在してもよい、 ものであり、 １）非置換のＮＨ₃ ⁺基の総数が、重合度の少なくとも５０％であること、 ２）遊離のＮＨ₃ ⁺を最初に保持しているモノマーの数が、重合度の少なくとも
５０％の比率で、細胞膜の不安定化を導く残基により置換されていること を条件とする、 オリゴマーコンジュゲートに関する。

【００２１】 下記から生ずることであるが、第一の条件は、ｍ≧ｉ／２に相当し、第二の条
件は、ｕ≧ｉ／２に相当する。

【００２２】 本発明の前記オリゴマーコンジュゲートは、膜の不安定化を引き起こし、サイ
トゾル及び／又は細胞核の中への、前記生体分子の移入を可能にする。

【００２３】 全く予想しなかった効果により、本発明のオリゴマーコンジュゲートは、ＤＮ
Ａによる細胞のトランスフェクションを可能にすることなく、ＯＤＮのサイトゾ
ル及び核の中への移入を可能にする。

【００２４】 本発明の独創性は、５０％未満のレベルで置換されたオリゴマーコンジュゲー
トは細胞傷害性であるため、本発明のオリゴマーは、５０％超のレベルで、酸性
ｐＨで膜不安定化を誘導する分子（そのような分子にはヒスチジル残基が含まれ
る）で置換されていなければならないという事実にある（下記表１参照）。さら
に、５０％未満のレベルで置換されたオリゴマーコンジュゲートの傷害性は、置
換されていないリシル残基の遊離のＮＨ₃ ⁺の数と共に増加する。

【００２５】 例えば、ＤＰが２０であり、膜の不安定化を導くヒスチジル残基を保持するリ
シンのオリゴマーの場合、前記の条件は下記： − αＮＨ₃ ⁺及び／又はεＮＨ₃ ⁺に由来する、少なくとも１０個の遊離のＮＨ₃ ⁺ が存在しなければならない。 − リシン残基の側鎖によって保持される少なくとも１０個のヒスチジル残基、
さらには最大２０個のヒスチジル残基が存在する（これは、後者の場合、必要と
される遊離のＮＨ₃ ⁺の最少量、即ち「少なくとも」１０個の遊離ＮＨ₃ ⁺が、ヒス
チジル残基のαＮＨ₃ ⁺官能基のみに由来することを意味する） で表すことができる。

【００２６】 膜の不安定化とは、溶液中の低分子量（高分子量であってもよい）の分子にと
っては透過性の増加を、又は他の膜との融合を導く膜の修飾を意味する。

【００２７】 膜の透過性は、下記のようにして測定することができる。

【００２８】 ０．５mg／mlの蛍光標識デキストラン（Ｍｗ４０００）を存在させて、オリゴ
マーコンジュゲートの非存在下又は存在下で、血清を含まないＤＭＥＭ培地中、
３７℃で３０分間、細胞をインキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、１０％
血清を含有する培養培地中で、３７℃で３０分間インキュベートする。４％パラ
ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で５分間、細胞を固定し、蛍光共焦点顕微
鏡下で細胞の蛍光の局在位置を分析する。

【００２９】 膜の融合は、下記のようにして測定することができる。

【００３０】 膜の融合は、Struckら（膜融合への共鳴エネルギー転移の使用（Use of reson
ance energy transfer to membrane fusion）1981 Biochemistry ２０：４０９
３−４０９９）に従い、リポソームの使用により、測定することができる。

【００３１】 Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１
，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｎ
ＢＤ−ＰＥ）及びオクタデシルローダミン（Ｒ１８）を、それぞれ蛍光エネルギ
ー転移のドナー脂質プローブ及びアクセプター脂質プローブとして含有するジオ
レオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）リポソームを、非蛍光リポソームと
混合し、オリゴマーコンジュゲートの非存在下又は存在下で、様々なｐＨでイン
キュベートする。膜融合は、膜融合により誘導された平均の空間的な間隙が増加
する際の、ＮＢＤとローダミン間の共鳴エネルギー転移が減少した結果として、
４７０nmでの励起時の５８５nmにおけるローダミン蛍光放出の減少により明示さ
れる。

【００３２】 細胞膜の不安定化の原因となる残基は、弱酸性培地においてプロトン付加可能
であるという特性を介して機能する。

【００３３】 「弱酸性培地」という表現は、血漿又は血清のｐＨよりも低いｐＨ、即ち７．
４未満のｐＨを有する培地をさす。

【００３４】 前記培地は、細胞外培地であってもよいし、エンドソーム又はリソソームのよ
うな細胞内区画の内腔であってもよい。

【００３５】 前記培地は、天然に酸性であるものでもよく、酸性化されたものであってもよ
い。

【００３６】 例えば、前記培地のｐＨは、約５〜約７、特に５．５〜６．５の範囲内である
ことができる。

【００３７】 サイトゾル及び／又は細胞核の中への前記生体分子の移入は、膜の不安定化を
導くオリゴマーコンジュゲート及び前記生体分子の両方が、前記培地中に存在す
ることを必要とする。

【００３８】 本発明において、オリゴマーコンジュゲート及び前記生体分子は、遊離してい
てもよいし、又は複合体化されていてもよい。

【００３９】 本発明の前記の正の電荷を帯びたオリゴマーコンジュゲートは、負の電荷を帯
びたオリゴアニオンの少なくとも一つと複合体を形成する傾向をもち、そのオリ
ゴアニオンとオリゴマーコンジュゲートとの会合は静電的な性質のものである。

【００４０】 プロトン付加可能な残基が、細胞膜受容体により認識される認識シグナルに相
当しないという表現は、これらの残基がリガンドとして使用されないことを意味
する。

【００４１】 分子又は分子複合体は、受容体により選択的に認識されうる場合に、認識シグ
ナルとしての活性を有し、これは、即ちリガンド、アゴニスト、又はアンタゴニ
ストとしての役割を果たすということである。細胞膜受容体により認識される認
識シグナルとは、前記受容体により選択的に認識される傾向をもつリガンド（分
子又は分子複合体）をさす。

【００４２】 有利な実施態様によると、本発明は、細胞膜の不安定化を引き起こすプロトン
付加可能な残基が、さらに以下の特性： − これらが、水性培地中で、ｐＫが８未満の弱塩基であるため、陽イオン性オ
リゴマーと結合したこれらの塩基が、５０％超の割合で、ｐＨ７．４でプロトン
を付加しない、 を示す、オリゴマーコンジュゲートに関する。

【００４３】 もう一つの有利な実施態様によると、本発明のオリゴマーコンジュゲートにお
いて、細胞膜の不安定化を導くプロトン付加可能な残基は、さらに以下の特性： − イミダゾール環を含む化合物の群に属する、 − キノリンの群に属する、 − プテリンの群に属する、 − ピリジンの群に属する、 を示す。

【００４４】 キノリンの一例は、下記式：

【００４５】

【化２５】

【００４６】 〔式中、Ｒ＝ （ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｈ〔ｎは、１〜１０、好ましくは１〜３で変動
する〕である〕

【００４７】 キノリンのもう一つの例は、

【００４８】

【化２６】

【００４９】 である。

【００５０】 プテリンの一例は、下記式：

【００５１】

【化２７】

【００５２】 で表される。

【００５３】 ピリジンの例は、下記式：

【００５４】

【化２８】

【００５５】 で表される。

【００５６】 有利な実施態様によると、本発明のオリゴマーコンジュゲートにおいて、細胞
膜の不安定化を導くプロトン付加可能な残基は、 − アルキル基が１〜１０個、特に２〜６個の炭素原子を含み、イミダゾール環
の窒素原子のうち一つのみが置換されているアルキルイミダゾール、 である。

【００５７】 有利な実施態様によると、本発明のオリゴマーコンジュゲートにおいて、細胞
膜の不安定化を導くプロトン付加可能な残基は、ヒスチジン、４−カルボキシメ
チルイミダゾール、３−（１−メチルイミダゾール−４−イル）アラニン、３−
（３−メチルイミダゾール−４−イル）アラニン、２−カルボキシイミダゾール
、ヒスタミン、３−イミダゾール−４−イル−Ｌ−乳酸、２−（１−メチルイミ
ダゾール−４−イル）エチルアミン、２−（３−メチル−イミダゾール−４−イ
ル）エチルアミン、β−アラニルヒスチジンカルノシン、７−クロロ−４−（ア
ミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン、Ｎ⁴−（７−クロロ−４−キノリニ
ル）−１，４−ペンタンジアミン、８−（４−アミノ−１−メチルブチルアミノ
）−６−メトキシキノリン（プリマキン（primaquine））、Ｎ⁴−（６−メトキ
シ−８−キノリニル）−１，４−ペンタンジアミン、キニン酸（quininic acid
）、キノリンカルボン酸、プテロイン酸、ニコチン酸、キノリン酸から選択され
る。

【００５８】 もう一つの有利な実施態様によると、本発明のオリゴマーコンジュゲートは、
下記式：

【００５９】

【化２９】

【００６０】 〔式中、 ＊ ａｉは、０〜１０で変動する整数であり、 ＊ ｂｉは、０〜１０で変動する整数であり、 ＊ ｉ＝ ５〜５０、特に１０〜４０まで、好ましくは２０の重合度であり、 ＊ ｎ＝ １〜６で変動する整数、好ましくは４であり、 ＊ Ｒは、５０％〜１００％の比率（数ｕに相当）で、

【００６１】

【化３０】

【００６２】 〔式中、 ｍは、１〜６で変動する整数であり、 ｎ′は、０〜６で変動する整数であり、 ｎ″は、０〜６で変動する整数であり、 Ｂは、前記で定義した弱塩基であり、 Ｒ′は、ＮＨ₃ ⁺（数ｐに相当）を表すか、 又はＮＨ（数ｑに相当）であって、 −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは２〜７である
〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
１〜７であり、ｓは、１〜６、好ましくは４である〕

【００６３】

【化３１】

【００６４】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたものを表す〕 を表し、 ＊ Ｒは、０％〜５０％の比率（ｆに相当：０＜ｆ≦ｕ）で、 − ＮＨ₃ ⁺（数ｊに相当）、 −ＮＨ（数ｋに相当）であって、 −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは１〜７である
〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
１〜７であり、ｓは、１〜６、好ましくは４である〕

【００６５】

【化３２】

【００６６】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたもの）、 − Ｈ（数ｈに相当） − （ＣＨ₂）_nＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）_n−ＯＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）ｎ−ＳＡ′（数ｈに相当）〔Ａ′＝ Ｈ、ＣＨ₃、又は

【００６７】

【化３３】

【００６８】 であり、ｎは、１〜６の整数である〕を表し、 ここで、・ｉ＝ ｕ＋ｊ＋ｋ＋ｈ ・αＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｐ＝ ｕ−ｑ ・ωＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｊ＝ ｆ−（ｋ＋ｈ） ・ＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｍ＝ ｐ＋ｊ＋１ であり、 １）ｕ≧ｉ／２ ２）ｍ≧ｉ／２ を条件とする〕で示されるオリゴマーを含有する。

【００６９】 もう一つの有利な実施態様によると、本発明のオリゴマーコンジュゲートは、
下記式：

【００７０】

【化３４】

【００７１】 〔式中、 ＊ ｉ＝ ５〜５０、特に１０〜４０、好ましくは２０の重合度であり、 ＊ ｎ＝ １〜６で変動する整数、好ましくは４であり、 ＊ Ｒは、５０％〜１００％の比率（数ｕに相当）で、

【００７２】

【化３５】

【００７３】 〔式中、 ｍは、１〜６で変動する整数であり、 ｎ′は、０〜６で変動する整数であり、 ｎ″は、０〜６で変動する整数であり、 Ｂは、前記で定義した弱塩基であり、 Ｒ′は、ＮＨ₃ ⁺（数ｐに相当）を表すか、 又はＮＨ（数ｑに相当）であって、 −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは１〜７である
〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
１〜７であり、ｓは、１〜６、好ましくは４である〕

【００７４】

【化３６】

【００７５】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたものを表す〕 を表し、 ＊ Ｒは、０％〜５０％の比率（ｆに相当：０＜ｆ≦ｌ）で、 − ＮＨ₃ ⁺（数ｊに相当）、 − ＮＨ（数ｋに相当）であって、 −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは１〜７である
〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
１〜７であり、ｓは、１〜６、好ましくは４である〕

【００７６】

【化３７】

【００７７】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたもの、 − Ｈ（数ｈに相当） − （ＣＨ₂）_nＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）_n−ＯＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）_n−ＳＡ′（数ｈに相当）〔Ａ′＝ Ｈ、ＣＨ₃、又は

【００７８】

【化３８】

【００７９】 であり、ｎは、１〜６の整数である〕を表し、 ここで、・ｉ＝ ｕ＋ｊ＋ｋ＋ｈ ・αＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｐ＝ ｕ−ｑ ・ωＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｊ＝ ｆ−（ｋ＋ｈ） ・ＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｍ＝ ｐ＋ｊ＋１ であり、 １）ｕ≧ｉ／２ ２）ｍ≧ｉ／２ であることを条件とする〕で示されるオリゴマーを含む。

【００８０】 もう一つの有利な実施態様によると、本発明のオリゴマーコンジュゲートは、
前記式 〔式中、ｉ＝ １９ ｎ＝ ４

【００８１】

【化３９】

【００８２】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０ Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃ ｍ＝ １ Ｂ＝ イミダゾール

【００８３】

【化４０】

【００８４】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃ ｕ＝ １２ ｊ＝ ７ であるか、又は ｉ＝ １９ ｎ＝ ４

【００８５】

【化４１】

【００８６】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０ Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃ ｍ＝ １ Ｂ＝ イミダゾール

【００８７】

【化４２】

【００８８】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃ ｕ＝ １６ ｊ＝ ３ であるか、又は ｉ＝ １９ ｎ＝ ４

【００８９】

【化４３】

【００９０】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０ Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃ ｍ＝ １ Ｂ＝ イミダゾール

【００９１】

【化４４】

【００９２】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃ ｕ＝ １９ ｊ＝ ０ であるか、又は ｉ＝ １９ ｎ＝ ４

【００９３】

【化４５】

【００９４】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０ Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃ ｍ＝ １ Ｂ＝ イミダゾール

【００９５】

【化４６】

【００９６】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＣＯ−ＣＨ₃ ｕ＝ １１ ｋ＝ ８ であるか、又は ｉ＝ １９ ｎ＝ ４

【００９７】

【化４７】

【００９８】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０ Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃ ｍ＝ １ Ｂ＝ イミダゾール

【００９９】

【化４８】

【０１００】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＣＯ−ＣＨ₃ ｕ＝ １５ ｋ＝ ４ であるか、又は ｉ＝ １９ ｎ＝ ４

【０１０１】

【化４９】

【０１０２】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０ Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃ ｍ＝ １ Ｂ＝ イミダゾール

【０１０３】

【化５０】

【０１０４】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ ｒ＝ ５ ｕ＝ １２ ｋ＝ ３ であるか、又は ｉ＝ １９ ｎ＝ ４

【０１０５】

【化５１】

【０１０６】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０ （ｑ）Ｒ′＝ ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ₃ ｍ＝ １ Ｂ＝ イミダゾール

【０１０７】

【化５２】

【０１０８】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃ ｕ＝ １６ ｆ＝ ４ ｋ＝ ３ である〕で示されるオリゴマーを含有する。

【０１０９】 混合されたオリゴマーの例は、下記式：

【０１１０】

【化５３】

【０１１１】 〔式中、 ｎ＝ ４ Ｒ′＝ Ｈ、ＣＨ₃、ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、ＣＨ（ＣＨ₃）
−ＣＨ₂−ＣＨ₃、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨＯＨ−ＣＨ₃、ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₃、（
ＣＨ₂）_nＨ、（ＣＨ₂）_n−ＯＨ、（ＣＨ₂）_n−ＳＡ′

【０１１２】

【化５４】

【０１１３】 であり、 ｔは、１〜６で変動する〕

【０１１４】 例えば、前記式において、ｎ＝ ４、ａｉ＝ ｂｉ＝ ０、ｔ＝ １、Ｒ′＝ Ｈである場合、モノマーはリシン及びバリンである。

【０１１５】 本発明は、前記で定義したオリゴマーコンジュゲートの少なくとも一つと、生
物学的分子（例えば、ペプチド、オリゴシド若しくはオリゴヌクレオチド誘導体
又はそれらの混合物）の少なくとも一つとの混合物を含有する組成物にも関する
。

【０１１６】 本発明の組成物において、オリゴマーコンジュゲートは、静電的相互作用を介
して、生物学的分子、特にオリゴアニオン、例えば、オリゴヌクレオチド、アニ
オン性ペプチド又はアニオン性オリゴシドと会合していてもよい。

【０１１７】 アニオン性オリゴシドは、硫酸化オリゴシド、スクシニル化オリゴシド、リン
酸化オリゴシド、シアリル化オリゴシド又はピルビリデニル（pyruvilidenyl）
基含有オリゴシドであることができる。

【０１１８】 本発明は、同時、別個又は連続的な使用のための、パーツキット（ｋｉｔ−ｏ
ｆ−ｐａｒｔｓ）の形態で、下記の個々の成分： − 前記で定義したオリゴマーコンジュゲートの少なくとも一つ − 少なくとも一つの生物学分子（例えば、ペプチド、オリゴシド若しくはオリ
ゴヌクレオチド又はそれらの混合物） を活性成分として含有する、サイトゾル及び／又は細胞核中への生物学的分子の
インビトロ、インビボ又はエクスビボ移入のための組み合わせた調製物にも関す
る。

【０１１９】 本発明は、少なくとも一つのオリゴアニオン（例えば、アニオン性ペプチド、
アニオン性オリゴシド若しくはオリゴヌクレオチド又はそれらの混合物であるか
、一つの負の電荷を帯びた生物学的分子の少なくとも一つとオリゴアニオンの少
なくとも一つの混合物であることができる）と、少なくとも一つの前記で定義し
た正の電荷を帯びたオリゴマーコンジュゲートとの複合体〔ここで、オリゴアニ
オンとオリゴマーコンジュゲートとの会合は静電的な性質のものである〕にも関
する。

【０１２０】 もう一つの有利な実施態様によると、生物学的分子は、オリゴヌクレオチド、
ペプチド、オリゴ糖又はそれらの混合物の中から選択される。

【０１２１】 本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、下記式：

【０１２２】

【化５５】

【０１２３】 〔式中、 ｉは、１０〜３０で変動し、 Ｘは、Ｏ又はＳを表し、 Ｂは、核酸塩基Ｕ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はビオチン若しくは蛍光で標識された塩
基のような修飾型であって、α若しくはβアノマー位でありうる、 Ｒ₁及びＲ₂は、相互に独立に、Ｈ、ＯＨ、（ＣＨ₂）_n−Ａ、〔（ＣＨ₂）₂−Ｏ〕 _n −ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ａ〔Ａは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、ＣＯＯＨ、

【０１２４】

【化５６】

【０１２５】 であり、ｎは、１〜６の整数である〕を表し、 Ｅは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）₂ＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）₃Ｃ
Ｈ₃、Ｏ（ＣＨ₂）₄ＣＨ₃、Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃を表す〕で示すことが
できる。

【０１２６】 オリゴヌクレオチドの例として、下記： ＧＥＭ９１ ｇａｇ ＨＩＶ−１遺伝子のＡＵＧ開始部位と相補的な、ホスホロチオアート（
Ｘ＝ Ｓ）オリゴヌクレオチド ｉ＝ ２５ ＣＴＣ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＴＣ Ｔ ＩＳＩＳ１９３９ ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの３′非コーディング領域と相補的な、ホスホロチオア
ート（Ｘ＝ Ｓ）オリゴヌクレオチド ｉ＝ １９ ＣＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＣＣ ＣＴＣ Ｔ をあげることができる。

【０１２７】 オリゴヌクレオチドとペプチドとの混合物は、ペプチドと結合したオリゴヌク
レオチドと定義され、オリゴヌクレオチドとオリゴシドとの混合物は、オリゴシ
ドと結合したオリゴヌクレオチドと定義される。

【０１２８】 オリゴシドとペプチドとの混合物は、ペプチドと結合したオリゴシドと定義さ
れる。

【０１２９】 本発明において使用されるオリゴヌクレオチドとペプチドとの混合物又はオリ
ゴヌクレオチドとオリゴシドとの混合物は、下記式：

【０１３０】

【化５７】

【０１３１】 〔式中、 ｉは、１０〜３０で変動し、 Ｘは、Ｏ又はＳを表し、 Ｂは、核酸塩基Ｕ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はビオチン若しくは蛍光で標識された塩
基のような修飾型であって、α若しくはβアノマー位でありうる、 Ｒ₁及びＲ₂は、相互に独立に、Ｈ、ＯＨ、（ＣＨ₂）ｎ−Ａ、〔（ＣＨ₂）₂−Ｏ
〕_n−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ａ〔Ａは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、ＣＯＯＨ、

【０１３２】

【化５８】

【０１３３】 であり、ｎは、１〜６の整数である〕、又はペプチド若しくはオリゴシドを表し
、 Ｅは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）₂ＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）₃Ｃ
Ｈ₃、Ｏ（ＣＨ₂）₄ＣＨ₃、Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃を表す〕

【０１３４】 Ｒ₁及び／又はＲ₂がペプチドを表す場合、混合されたオリゴアニオンはペプチ
ド−オリゴヌクレオチドであり、Ｒ₁及び／又はＲ₂がオリゴシドを表す場合、混
合されたオリゴアニオンはグリコ−オリゴヌクレオチドを表す。

【０１３５】 オリゴヌクレオチドの一例は、ペプチド核酸（peptide nucleic acid）（ＰＮ
Ａ）であり、下記式：

【０１３６】

【化５９】

【０１３７】 〔式中、Ｒ₁及びＲ₂は、相互に独立に、Ｈ、ＯＨ、（ＣＨ₂）_n−Ａ、〔（ＣＨ₂
）₂−Ｏ〕_n−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ａ〔Ａは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、ＣＯＯＨ、

【０１３８】

【化６０】

【０１３９】 であり、ｎは、１〜６の整数である〕を表し、ｉは、１０〜３０で変動する整数
である〕で表される。

【０１４０】 本発明の組成物において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖であ
ってもよいし、又は三重鎖（三本鎖）若しくは四重鎖（四本鎖）を形成してもよ
い。

【０１４１】 本発明は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで、サイトゾル及び／又は
細胞核の中へ生物学的分子を細胞内移入するための、前記で定義したオリゴマー
コンジュゲートの使用にも関する。

【０１４２】 本発明は、細胞のサイトゾル又は／及び細胞核の中への、ペプチド、オリゴシ
ド若しくはオリゴヌクレオチド又はそれらの混合物を細胞内インビトロ、エクス
ビボ、又はインビボ移入するための、前記で定義したオリゴマーコンジュゲート
、前記で定義した組成物、又は前記で定義した組み合わせた調製物の使用にも関
する。

【０１４３】 本発明は、細胞が、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞、例えば単球、
マクロファージ、繊維芽細胞、白血球及び顆粒球、骨芽細胞、並びに樹状細胞、
幹細胞、ニューロン細胞又は皮膚細胞の中から選択される、前記で定義したなオ
リゴマーコンジュゲート、前記で定義した組成物、又は前記で定義した組み合わ
せた調製物の使用にも関する。

【０１４４】 本発明は、オリゴヌクレオチドのインビボ、インビトロ、又はエクスビボ移入
のための方法であって、下記： − 相補的ｍＲＮＡ配列と結合し、それを阻止するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの、サイトゾル及び／又は細胞核の中への移入、 − サイトゾル内の二次メッセンジャー又は核内の対応する遺伝子を抑制若しく
は活性化する、活性化因子としてのオリゴヌクレオチドの、サイトゾルの中への
移入、 − 刺激活性、又は免疫抑制活性を有する反復性細菌型ＤＮＡ配列に相当するオ
リゴヌクレオチドの、サイトゾル及び／又は細胞核の中への移入、 のような条件下で、オリゴヌクレオチドと、前記で定義したオリゴマーコンジュ
ゲート、前記で定義した組成物、又は前記で定義した組み合わせた調製物とを、
移入される細胞を含有する培地と接触させる方法にも関する。

【０１４５】 サイトゾルの中への、相補的ｍＲＮＡ配列と結合し、その翻訳（traduction）
を阻止し、遺伝子産物の合成の阻害を引き起こすアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの移入は、下記の図１、２及び３の説明のようにして実施することができる。

【０１４６】 本発明は、オリゴヌクレオチドのインビボ、インビトロ、又はエクスビボ移入
のための方法であって、下記： − 制御因子と真正ＤＮＡ領域との結合を阻止することにより遺伝子発現を阻害
するデコイとして機能するＲＮＡオリゴヌクレオチド又はＤＮＡオリゴヌクレオ
チド（例えば、ＴａｔにおけるＨＩＶ制御タンパク質のＴＡＲ領域との結合を阻
止することによりＨＩＶの発現及び複製を阻害するＨＩＶ−ＴＡＲ配列に相当す
る短いＲＮＡ配列）の、サイトゾル及び／又は細胞核の中への移入、 − ｍＲＮＡを切断することにより遺伝子発現を阻害するリボザイム（ＲＮＡオ
リゴヌクレオチド）の、サイトゾル及び／又は細胞核の中への移入 のような条件下で、オリゴヌクレオチドと、前記で定義したオリゴマーコンジュ
ゲート、前記で定義した組成物、又は前記で定義した組み合わせた調製物とを、
移入される細胞を含有する培地と接触させる方法にも関する。

【０１４７】 核の中への、オリゴプリン部位の標的ＤＮＡと結合し、三重らせん構造を形成
し、遺伝子発現の阻害を引き起こす、オリゴヌクレオチド（三重らせん形成ＯＤ
Ｎ、ＴＦＯ）の移入は、後述のようにして処理されうる。

【０１４８】 特異的ＴＦＯの一例は、ＮＥＦ−ＨＩＶ−１遺伝子内のポリプリントラック（
polypurine track）（ＰＰＴ）に対するオリゴヌクレオチド５′−Ａ₄ＧＡ₄Ｇ₆
Ａ−３′である。

【０１４９】 免疫反応の活性化因子としてのオリゴヌクレオチドの移入は、下記のようにし
て実施することができる。

【０１５０】 一例として、マクロファージの殺腫瘍活性の増大、又はナチュラルキラーリン
パ球の細胞傷害性の刺激のための、二本鎖ＲＮＡポリイノシン酸−ポリシチジル
酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））がある。

【０１５１】 免疫反応の活性化因子としての二本鎖ポリヌクレオチドの移入は、下記により
例示することができる。

【０１５２】 ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、ＴＮＦ−α媒介細胞
溶解を介してマクロファージの殺腫瘍活性を増大させることが知られている。

【０１５３】 チオグリコラート（thioglycolate）により誘発された腹腔内マクロファージ
（２．５×１０⁵）を、無血清ＲＰＭＩ培地中で、直径１６mmのウェルのマルチ
ウェルプレートに置く。３７℃で２時間のインキュベーションの後、非接着細胞
を廃棄する。接着細胞を、ポリ（Ｉ：Ｃ）の非存在下若しくは存在下で、かつヒ
スチジル化オリゴリシンの非存在下若しくは存在下で、０．５mlの無血清ＲＰＭ
Ｉ培地中で培養する。３７℃で２４時間、インキュベーションをした後、培養上
清を収集する。試験の前に、２０００ｇで１０分間の遠心分離により、上清を無
細胞にする。３７℃で２時間、２μg／mlのアクチノマイシンＤで前処理された
Ｌ９２９細胞を使用して、マクロファージ培養上清の細胞傷害活性を決定する。
アクチノマイシンＤで前処理されたＬ９２９細胞を、９６ウェルマイクロプレー
トに播く（１ウェル当たり４×１０⁴細胞（０．０５mlの無血清ＲＰＭＩ培地中
））。３７℃で３〜４時間の後、刺激されたマクロファージ由来の希釈上清を添
加し（０．０５ml）、細胞を３７℃で１８〜２０時間、インキュベートする。マ
イクロプレートをＰＢＳで洗浄し、細胞を０．０５mlのクリスタルバイオレット
（２％エタノール中の０．２％）で染色した後、細胞溶解の百分率を決定する。
プレートを水道水で洗浄し、１ウェル当たり０．０６mlの０．３％ドデシル硫酸
ナトリウムを添加することにより色素を可溶化する。各ウェルの吸光度を５７０
nmで読み取る。細胞傷害性（％）を、（Ａ_NS−Ａ_S）／Ａ_NS×１００〔ここで、
Ａ_NS及びＡ_Sは、それぞれ刺激されていないマクロファージ及び刺激されたマク
ロファージの上清希釈物と共にインキュベートされた標的細胞を含有するウェル
の吸光度である〕に従い計算する。

【０１５４】 本発明は、サイトゾルの中へペプチドが移入するような条件下で、ペプチドと
、前記で定義したオリゴマーコンジュゲート、前記で定義した組成物、又は前記
で定義した組み合わせ調製物とを、移入される細胞を含有する培地と接触させる
、ペプチドのインビボ、インビトロ、又はエクスビボ移入のための方法にも関す
る。

【０１５５】 ペプチドの移入は、下記により例示することができる。

【０１５６】 Ａ）細胞を、ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下又は存在下で、１μＭ蛍光
標識ペプチド（Ｆ−Ｓ−ＣＧＥＥＤＴＳＥＫＤＥＬ）と共に３７℃で４時間イン
キュベートする。細胞を２％のｐ−ホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、１０mg
／ml ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアゾビシクロ−（２，２，２）−オクタン）を抗
退色剤として含有するＰＢＳ／グリセロール混合物（１：１容積／容積）中でス
ライドに乗せる。ニコンオプチフォトエピ蛍光（Nikon Optiphot epifluorescen
ce）顕微鏡が装備された共焦点顕微鏡イメージングシステム（MRC-1024,Bio-Rad
）を用いて、細胞を分析する。

【０１５７】 Ｂ）樹状細胞を、ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下又は存在下で、１μＭ
ｃ−ｍｙｃエピトープペプチド（ＳＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＦＥＬＤＥＡ）
と共に３７℃で４時間インキュベートする。細胞を、０．５％サポニンの存在下
で２％のｐ−ホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、次いで、１０mg／ml ＢＳＡ
及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中の抗ｃ−ｍｙｃエピトープモノクロー
ナル抗体（９Ｅ１０）と共に１時間インキュベートする。細胞を洗浄し、１０mg
／ml ＢＳＡ及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中の蛍光標識抗マウスＩｇ
Ｇ Ｆ（ａｂ）′断片の存在下で、１時間さらにインキュベートする。細胞を洗
浄し、１０mg／ml ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアゾビシクロ−（２，２，２）−オ
クタン）を抗退色剤として含有するＰＢＳ／グリセロール混合物（１：１ 容積
／容積）中でスライドに乗せる。ニコンオプチフォトエピ蛍光顕微鏡が装備され
た共焦点顕微鏡イメージングシステム（MRC-1024,Bio-Rad）を用いて、細胞を分
析する。

【０１５８】 ペプチドの細胞内補因子への固定は、下記の例に記載のようにして実施するこ
とができる。

【０１５９】 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）エピトープに相当するオリゴペプチドを、オリゴ
マーコンジュゲートと混合して、マクロファージの細胞質へ移入する。

【０１６０】 オリゴペプチドは、そこで、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０
）に固定され、ＨＳＰ−ペプチド複合体を形成し、次いでそれがマクロファージ
の表面に再発現される。ＨＳＰ補因子と共に形成されたこの複合体は、マクロフ
ァージを刺激し、ＰＳＡ抗原に対する免疫反応を増強する。

【０１６１】 本発明は、ペプチドのインビトロ、インビボ、又はエクスビボ移入のための方
法であって、抗原性ペプチドが、ＭＨＣＩ上に固定された抗原性エピトープの提
示を可能とするＭＨＣＩ分子と結合するためにプロテオソーム内でプロセスされ
る抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞）のサイトゾルの中への
、抗原体ペプチドの移入があるような条件下で、ペプチド〔特に抗原性ペプチド
である〕と、前記で定義したオリゴマーコンジュゲート、前記で定義した組成物
、又は前記で定義した組み合わせた調製物とを、移入される細胞を含有する培地
と接触させる方法にも関する。

【０１６２】 抗原提示のインビトロにおける評価は、下記により例示することができる。

【０１６３】 樹状細胞を、ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下又は存在下で、ナノペプチ
ド（１９０−１９８）（ＡＦＨＨＶＡＲＥＬ）を含有するＨＩＶ−１ Ｎｅｆタ
ンパク質のＣ末端部分由来のナノデカペプチド（１８５−２０３）と共に、３７
℃で４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ペプチド及びヒスチジル化オリ
ゴリシンの非存在下で、３７℃で２４時間さらにインキュベートした。ペプチド
抗原のＭＨＣクラスＩ提示を、ペプチドに対して感受性のあるＣＴＬクローンを
使用して、Ｃｒ⁵¹細胞傷害アッセイにより評価した。ＤＣをＣｒ⁵¹で標識し（標
的細胞：Ｔ）、次いで、１〜１００の範囲のＥ／Ｔ比で、ＣＴＬクローン（エフ
ェクター細胞：Ｅ）の存在下で、３７℃で４時間インキュベートした。上清を収
集し、上清中の放射能を記録した。特異的なＣｒ⁵¹放出の％を、（Ａ_NS−Ａ_S）
／Ａ_NS×１００〔ここで、Ａ_NS及びＡ_Sは、それぞれＣＴＬ細胞の非存在下及び
存在下でインキュベートされた樹状細胞の上清希釈物中の放射能である〕に従い
計算する。

【０１６４】 本発明は、オリゴシドのインビボ、インビトロ、又はエクスビボ移入のための
方法であって、サイトゾル及び／又は細胞核の中へ、オリゴシドが移入すること
があるような条件下で、オリゴシドと、前記で定義したオリゴマーコンジュゲー
ト、前記で定義した組成物、又は前記で定義した組み合わせた調製物とを、移入
をうける細胞を含有する培地と接触させる方法にも関する。

【０１６５】 オリゴシドの移入の例は、下記により例示することができる。

【０１６６】 細胞を、オリゴマーコンジュゲートの非存在下又は存在下で、０．５mg／ml蛍
光標識デキストラン（Ｍｗ４０００又はＭｗ７００００のいずれか）と共に３７
℃で４時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％のｐ−ホルムアル
デヒドで固定し、洗浄し、１０mg／ml ＤＡＢＣＯ（１，４ジアゾビシクロ−（
２，２，２）−オクタン）を抗退色剤として含有するＰＢＳ／グリセロール混合
物（１：１ｖ／ｖ）中でスライドに乗せる。ニコンオプチホトエピ蛍光顕微鏡（
Nikon、東京、日本）及びプラナポ（planapo）対物レンズ（開口数１．４）が装
備された共焦点顕微鏡イメージングシステム（MRC-1024,Bio-Rad）を用いて、細
胞を分析する。

【０１６７】 負の電荷を帯びたオリゴシドの移入の一例は、下記により例示することができ
る。

【０１６８】 細胞を、オリゴマーコンジュゲートの非存在下又は存在下で、０．５mg／ml蛍
光標識ポリアニオン性デキストラン（Ｍｗ３０００又はＭｗ７００００のいずれ
か）と共に、３７℃で４時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％
のｐ−ホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、１０mg／ml ＤＡＢＣＯ（１，４ジ
アゾビシクロ−（２，２，２）−オクタン）を抗退色剤として含有するＰＢＳ／
グリセロール混合物（１：１ 容積／容積）中でスライドに乗せる。ニコンオプ
チホトエピ蛍光顕微鏡（Nikon、東京、日本）及びプラナポ対物レンズ（開口数
１．４）が装備された共焦点顕微鏡イメージングシステム（MRC-1024,Bio-Rad）
を用いて、細胞を分析する。

【０１６９】 オリゴシドの細胞内補因子への固定は、下記の例に記載のようにして実施する
ことができる。

【０１７０】 本発明に従い、シリカ含有糖成分（silicated saccharidic components）と複
合体化したオリゴアニオンを、細胞内補因子又はＮＦカッパＢのような二次メッ
センジャーと結合するよう、ヒト細胞の細胞質中へ輸送する。この結合は、サイ
トカイン（例えば、ＩＬ１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２）をコードする遺伝子を抑
制又は刺激する補因子の核移入を引き起こす。

【０１７１】 これは、結果として、複合体の存在下で培養されたヒト細胞に、顕著な刺激を
もたらす。

【０１７２】 本発明は、活物質として、前記で定義したオリゴマーコンジュゲート、前記で
定義した組成物、又は前記で定義した組み合わせた調製物を少なくとも一つ、あ
るいは医薬的に許容される媒体と共に含有する医薬組成物にも関する。

【０１７３】 本発明は、癌、（移植片拒絶、アレルギー、自己免疫のような）炎症性若しく
は免疫学的な疾患又は感染性疾患の処置において使用するための薬物の調製用の
、前記で定義したオリゴマーコンジュゲート、前記で定義した組成物、又は前記
で定義した組み合わせた調製物の使用にも関する。

【０１７４】 本発明は、 − 前記のコンジュゲート上に予め固定された、又は固定されていない認識シグ
ナル〔認識シグナルは、標的とする細胞に依存している〕を含むことができる、
弱酸性培地における細胞膜の不安定化を引き起こすプロトン付加可能な残基によ
り置換された、前記で定義したオリゴマーコンジュゲート、 − 移入する少なくとも一つの生物学的分子、 − 場合により、前記のオリゴマーコンジュゲート上の認識シグナルの可能性の
ある結合を可能にする試薬、 − 場合により、前記で定義した組成物、又は前記で定義した組み合わせた調製
物の形成を可能にする試薬、 − サイトゾル及び／又は細胞核の中への、生物学的分子の移入を可能にする試
薬 を含有するキット又はケースにも関する。

【０１７５】 実施例 ヒスチジル化オリゴリシンの調製： オリゴリシン（ポリ−Ｌ−リシン、ＨＢｒ；平均分子量３９５０；平均重合度
１９）（Bachem Feinchemikalien,Bubendorf,Switzerland）（水２００ml中に１
ｇ）を、臭素イオンを除去するため、陰イオン交換カラム（Dowex ２×８、Ｏ
Ｈ型、２０〜５０メッシュ）に通した。溶出物を１０％ｐ−トルエン硫酸水溶液
で中和し、凍結乾燥させた。

【０１７６】 実施例１：ＨｏＫ１の調製 ジイソプロピルエチルアミン（５０μl；３４４μmol）（Aldrich）を存在さ
せて、ジメチルスルホキシド（Aldrich,Strasbourg,France）２ml中のオリゴリ
シンｐ−トルエン硫酸塩（５０mg；８．６μmol）を、ベンゾトリアゾール−１
−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート（ＢＯＰ）（Richelieu Biotechnologies,Saint Hyacinthe,Canada）（
１５９mg；３５８μmol）の存在下で（Ｂｏｃ）Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（６４m
g；１４６μmol）（Novabiochem,Bad Soden,Germany）と２０℃で２０時間反応
させた。次いで、オリゴリシンの残りのεアミノ基を、グルコノイル残基（Ｇｌ
ｃＡ）で置換：即ち、δ−グルコノラクトン（８６mg；４８μmol）（Aldrich）
及びジイソプロピルエチルアミン（１３４μl；９２１μmol）を添加し、溶液を
２０℃で２０時間攪拌した。２０℃で２４時間にわたり、１０容量のＨ₂Ｏ／ト
リフルオロ酢酸混合物（１：１ 容積／容積）を添加することによる酸性処理に
より、Ｎ保護Ｂｏｃ基を除去した。水及びトリフルオロ酢酸を減圧下で除去した
。ＨｏＫ１を、１０容量のイソプロパノールを添加して沈殿させ、遠心分離（１
８００ｇ、１５分間）により沈降させた。ペレットをイソプロパノールで洗浄し
、遠心分離（１８００ｇ、１５分間）により収集し、蒸留水で可溶化し、そして
凍結乾燥させた。オリゴリシン１分子当たりの平均ヒスチジル残基数を、３００
ＭＨｚでＤ₂Ｏ中での¹Ｈ−ＮＭＲ分光法により、ｘ＝ ６．（ｈ_8.7／ｈ_Lys）．
ＤＰ〔ここで、ｈ_8.7は、ヒスチジル残基のプロトン（１Ｈ Ｃ₁₂）に相当する
８．７ppmのシグナルの積分値であり、ｈ_Lysは、リシル残基の６個のメチレンの
プロトン（Ｃ₃、Ｃ₄及びＣ₅）に相当する１．３〜１．９ppmの範囲のシグナルの
積分値であり、ＤＰはオリゴリシンの重合度である〕に従い決定した。オリゴリ
シン１分子当たりのヒスチジル残基数は１２であった。オリゴリシン１分子当た
りの平均グルコノイル残基数を、¹Ｈ−ＮＭＲ分光法により、ｘ＝ ３／２．（
ｈ_G／ｈ_Lys）．ＤＰ〔ここで、ｈ_Gは、グルコノイル残基の４個のプロトン（１
Ｈ Ｃ₁₀、１Ｈ Ｃ₁₁及び２Ｈ Ｃ₁₂）の３．６〜３．９ppmの範囲の積分値で
あり、ｈ_Lysはリシル残基の６個のメチレンのプロトン（Ｃ₃、Ｃ₄及びＣ₅）の１
．３〜１．９ppmの範囲の積分値であり、ＤＰはｐＬＫの重合度である〕から決
定した。オリゴリシン１分子当たりの結合グルコノイル残基数は３であった。オ
リゴリシン１分子当たりの遊離のεアミノ基の数は４であった。

【０１７７】 実施例２：ＨｏＫ２の調製 ジイソプロピルエチルアミン（９０μl；６２０μmol）の存在下で、ジメチル
スルホキシド３ml中のオリゴリシンｐ−トルエン硫酸塩（８０mg；１３．７μmo
l）を、（Ｂｏｃ）Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（９２mg；２０４μmol）（Bachem F
einchemikalien）のＮ−ヒドロキシスクシニミジル誘導体と２０℃で６時間反応
させた。次いで、オリゴリシンの残りのεアミノ基を、アセチル化（Ａｃ）：即
ち、酢酸無水物（１３μl；１０９μmol）（Aldrich）及びジイソプロピルエチ
ルアミン（５μl；３５μmol）を添加し、溶液を２０℃で３０分攪拌した。２０
℃で２時間にわたり、１０容量のＨ₂Ｏ／トリフルオロ酢酸混合物（１：１ 容
積／容積）を添加することによる酸性処理で、Ｎ保護Ｂｏｃ基を除去した。水及
びトリフルオロ酢酸を減圧下で除去した。ＨｏＫ２を、１０容量のイソプロパノ
ールを添加することにより沈殿させ、遠心分離（１８００ｇ、１５分間）により
沈降させた。ペレットをイソプロパノールで洗浄し、遠心分離（１８００ｇ、１
５分間）により収集し、蒸留水で可溶化し、そして凍結乾燥させた。オリゴリシ
ン１分子当たりの平均ヒスチジル残基数を、３００ＭＨｚでＤ₂Ｏ中での¹Ｈ−Ｎ
ＭＲ分光法により、ｘ＝ ６．（ｈ_8.7／ｈ_Lys）．ＤＰ〔ここで、ｈ_8.7は、ヒ
スチジル残基のプロトン（１Ｈ Ｃ₁₂）に相当する８．７ppmのシグナルの積分
値であり、ｈ_Lysはリシル残基の６個のメチレンのプロトン（Ｃ₃、Ｃ₄及びＣ₅）
に相当する１．３〜１．９ppmの範囲のシグナルの積分値であり、ＤＰはオリゴ
リシンの重合度である〕に従い決定した。オリゴリシン１分子当たりの結合ヒス
チジル残基数は１５であった。オリゴリシン１分子当たりの平均アセチル残基数
を、¹Ｈ−ＮＭＲ分光法により、ｘ＝ （ｈ_A／ｈ_Lys）．ＤＰ〔ここで、ｈ_Aは、
アセチル残基の３個のプロトンの２．０４ppmの積分値であり、ｈ_Lysはリシル残
基の６個のメチレンのプロトン（Ｃ₃、Ｃ₄及びＣ₅）の１．３〜１．９ppmの積分
値であり、ＤＰはｐＬＫの重合度である〕から決定した。オリゴリシン１分子当
たりの結合アセチル残基数は３であった。オリゴリシン１分子当たりの遊離のε
アミノ基の数は１であった。

【０１７８】 実施例３：ＨｏＫ３の調製 ジイソプロピルエチルアミン（８０μl；５５５μmol）の存在下で、ジメチル
スルホキシド３ml中のオリゴリシンｐ−トルエン硫酸塩（８５mg；１４．６μmo
l）を、ＢＯＰ（２６５mg；５９７μmol）の存在下で、Ｎ−アセチル−Ｈｉｓ−
ＯＨ（２８８mg；３０７μmol）（Sigma）と２０℃で２０時間反応させた。次い
で、オリゴリシンの残りのεアミノ基を、２０℃で３０分間、酢酸無水物でアセ
チル化（Ａｃ）した。ＨｏＫ３を、１０容量のイソプロパノールを添加して沈殿
させ、遠心分離（１８００ｇ、１５分間）により沈降させた。ペレットをイソプ
ロパノールで洗浄し、遠心分離（１８００ｇ、１５分間）により収集し、蒸留水
で可溶化し、そして凍結乾燥させた。オリゴリシン１分子当たりの平均結合ヒス
チジル残基数を、前記のような¹Ｈ−ＮＭＲ分光法により決定した。オリゴリシ
ン１分子当たりのヒスチジル残基数は１５であった。オリゴリシン１分子当たり
の遊離のεアミノ基の数は１であった。

【０１７９】 実施例４：オリゴマーコンジュゲートの合成のためのシントンの調製

【０１８０】

【化６１】

【０１８１】 〔式中、Ｒ及びＲ′は、アミノ保護基を表し、ａｉは、０〜６で変動する整数で
あり、ｂｉは、０〜６で変動する整数であり、ｎは、１〜６で変動する整数であ
り、ｎ′は、０〜６で変動する整数であり、ｎ″は、０〜６で変動する整数であ
り、ｍは、１〜６で変動する整数である〕

【０１８２】 シントンの一例：Ｌｙｓ（Ｈｉｓ）シントンであり、 式中、ａｉ＝ ｂｉ＝ ０ ｎ＝ ４ Ｒ₁＝ Ｆｍｏｃ ｎ′＝ ｎ″＝ ０ ｍ＝ １ Ｒ′＝ Ｂｏｃ Ｂ＝ （ＮＢｏｃ）イミダゾール である。

【０１８３】 （Ｂｏｃ）₂−Ｈｉｓ−ＯＨのＮ−ヒドロキシスクシニミジル誘導体〔（Ｂｏ
ｃ）₂−Ｈｉｓ−ＯＳｕ〕（１ｇ；２．２mmol）を、ジメチルホルムアミド（ml
）中で２０℃で２４時間にわたり、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（７２２mg；２．２
mmol）とカップリングさせた。Ｌｙｓ（Ｈｉｓ）シントンをイソプロパノールで
沈殿させ、遠心分離により収集し、エーテルで洗浄し、そして真空で乾燥させた
。Ｌｙｓ（Ｈｉｓ）シントンを結晶化により精製した。

【０１８４】 実施例５： ２０個のリシン残基及び２０個のヒスチジル残基を含有するヒスチジル化オリ
ゴリシン（ＨｏＫ）の調製 ２０個のリシル残基及び２０個のヒスチジル残基を正確に含有するＨｏＫは、
前記のＬｙｓ（Ｈｉｓ）シントンを使用することにより、完全に合成することが
できた。簡単に説明すると、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を使用することによる伝導度
モニタリング（conductimetric monitoring）を用いて、アプライドバイオシス
テムズ（Applied Biosystems）４３３Ａ合成機上で、２０個のＬｙｓ（Ｈｉｓ）
シントンを連続的に組み立てた。Ｌｙｓ（Ｈｉｓ）シントンは、ＨＢＴＵ活性化
法によりカップリングさせた。ＨｏＫを樹脂から切り離し、室温で３時間、トリ
フルオロ酢酸／水混合物（５０％：５０％ 容積／容積）で側鎖保護Ｂｏｃ基を
除去した。粗ＨｏＫをイソプロパノールで沈殿させ、遠心分離により収集した。
ＨｏＫをイソプロパノールで３回洗浄し、蒸留水に再懸濁させ、凍結乾燥させた
。

【０１８５】 実施例６ １７個のヒスチジル残基で置換された１７個のリシル残基及びｈｙｓ（Ｈｉｓ
）配列中の任意の場所に挿入された３個のロイシル残基を含有するオリゴマーコ
ンジュゲートの調製 正確に１７個のヒスチジル残基で置換された１７個のリシル残基及びＬｙｓ（
Ｈｉｓ）配列中の任意の場所に挿入された３個のロイシル残基からなるオリゴマ
ーは、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を使用することによる伝導度モニタリングを用いて
、アプライドバイオシステムズ４３３Ａ合成機上で、前記のＬｙｓ（Ｈｉｓ）シ
ントン及びＦｍｏｃ Ｌｅｕを使用することにより、完全に合成することができ
た。Ｌｙｓ（Ｈｉｓ）シントンとＬｅｕは、ＨＢＴＵ活性化法によりカップリン
グさせた。オリゴマーを樹脂から切り離し、室温で３時間、トリフルオロ酢酸／
水混合物（５０％：５０％ 容積／容積）で側鎖保護Ｂｏｃ基を除去した。オリ
ゴマーをイソプロパノールで沈殿させ、遠心分離により収集した。オリゴマーを
イソプロパノールで３回洗浄し、蒸留水に再懸濁させ、凍結乾燥させた。

【０１８６】 実施例７：（Ｋ（Ｈｉｓ）−ＫＬ（Ｈｉｓ）−Ｌ）₇の調製 オリゴマー（Ｋ（Ｈｉｓ）−ＫＬ（Ｈｉｓ）−Ｌ）₇は、Ｆｍｏｃ保護アミノ
酸を使用することによる伝導度モニタリングを用いて、アプライドバイオシステ
ムズ４３３Ａ合成機上で、前記のＬｙｓ（Ｈｉｓ）シントン及びＦｍｏｃ Ｌｅ
ｕを使用することにより完全に合成することができた。Ｌｙｓ（Ｈｉｓ）シント
ンとＬｅｕは、ＨＢＴＵ活性化法によりカップリングさせた。オリゴマー（Ｋ（
Ｈｉｓ）−ＫＬ（Ｈｉｓ）−Ｌ）₇を樹脂から切り離し、室温で３時間、トリフ
ルオロ酢酸／水混合物（５０％：５０％ 容積／容積）で側鎖保護Ｂｏｃ基を除
去した。ポリマーをイソプロパノールで沈殿させ、遠心分離により収集した。オ
リゴマーをイソプロパノールで３回洗浄し、蒸留水に再懸濁させ、凍結乾燥させ
た。

【０１８７】 実施例８：（Ｋ（Ｈｉｓ）−Ｌ−Ｋ（Ｈｉｓ））₇の調製 オリゴマー（Ｋ（Ｈｉｓ）−Ｌ−Ｋ（Ｈｉｓ））₇は、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸
を使用することによる伝導度モニタリングを用いて、アプライドバイオシステム
ズ４３３Ａ合成機上で、前記のＬｙｓ（Ｈｉｓ）シントン及びＦｍｏｃ Ｌｅｕ
を使用することにより完全に合成することができた。Ｌｙｓ（Ｈｉｓ）シントン
とＬｅｕは、ＨＢＴＵ活性化法によりカップリングさせた。オリゴマーを樹脂か
ら切り離し、室温で３時間、トリフルオロ酢酸／水混合物（５０％：５０％ 容
積／容積）で側鎖保護Ｂｏｃ基を除去した。オリゴマーをイソプロパノールで沈
殿させ、遠心分離により収集した。オリゴマーをイソプロパノールで３回洗浄し
、蒸留水に再懸濁させ、凍結乾燥させた。

【０１８８】 表Ｉは、４５％未満のヒスチジル残基で置換された、１９０、７２又は３６の
ＤＰを有するオリゴリシンが、小さな核酸、特にオリゴヌクレオチドの移入を可
能にしないことを示す。実際には、ヒスチジル化オリゴリシンのサイズを適合さ
せることが必要である。逆に、５０％超のヒスチジル残基により置換された小さ
いヒスチジル化オリゴリシン（３６又は１９のＤＰ）は、ヒスチジル化オリゴリ
シン／プラスミド複合体による効率的な遺伝子移入を可能にしない（表Ｉ）。さ
らに、５０％未満のヒスチジル残基で置換されたオリゴリシンは、細胞傷害性を
有する。

【０１８９】

【表１】

【０１９０】 ＤＰはオリゴリシンの重合度である。ＤＮＡは、ヒスチジル化オリゴリシン／
ｐＣＭＶＬＵＣを使用することによるトランスフェクションに相当する。トラン
スフェクション効率は、０〜１００のスケールで点数化されている。トランスフ
ェクション効率は、化学発光により測定される細胞中のルシフェラーゼ活性から
決定されたものである。ＯＤＮは、共焦点顕微鏡下で評価された、ヒスチジル化
オリゴリシンの存在下での蛍光標識オリゴヌクレオチドのサイトゾル及び核への
中への移入に相当する。細胞傷害性は、比色ＭＴＴアッセイを使用することによ
り評価された（ＭＴＴ＝ ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２
，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）。

【０１９１】 ＧＥＭ−９１によるルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害 図１は、ｇａｇ ＨＩＶ−１遺伝子のＡＵＧ開始部位と相補的な、アンチセン
スホスホロチオアートオリゴヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤＮ）（ＣＴＣ ＴＣＧ
ＣＡＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＴＣ Ｔ）であるＧＥＭ−９１の
活性を示す図である。ヒスチジル化オリゴリシンの効果は、ｐＲＥＴ−Ｌｕｃ細
胞（ウサギ平滑筋細胞系）を使用して評価した。これらの細胞は、ヒトホスホグ
リセリン酸キナーゼプロモーターの調節下で、内因性のルシフェラーゼを産生し
、ＡＵＧコドンの周辺のルシフェラーゼ遺伝子配列が、ｇａｇＨＩＶ−１遺伝子
の開始ＡＵＧコドン及びいくつかの下流コドンに交換されていた。結果は、ＧＥ
Ｍ−９１の活性（ＩＣ₅₀＞５μＭ）が、２０μＭ ＨｏＫ２（ＩＣ₅₀０．２５μ
Ｍ）の存在下で、１０倍超増加したことを示した。一方、αＮＨ₂ヒスチジル残
基がアセチル化されているＨｏＫ３の存在下では、有意な阻害が得られず、この
ことはＯＤＮとヒスチジル化オリゴリシンとの相互作用が関与していたことを示
している。ｐＲＥＴ−Ｌｕｃ細胞を、２４ウェルプレート（２×１０⁵細胞／ウ
ェル）に播き、ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下（黒四角）、２０μＭ Ｈ
ｏＫ２の存在下（黒丸）、又は２０μＭ ＨｏＫ３の存在下（白丸）で、様々な
濃度のＧＥＭ−９１を含有する２％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で、３７℃で４
時間処理した。ＨｏＫ２及びＨｏＫ３は、上述のようにして調製されたヒスチジ
ル化オリゴリシンである。次いで、ＦＢＳを６％に上昇させ、細胞をさらに１８
時間インキュベートした。ルシフェラーゼ遺伝子発現を、４秒間の化学発光を記
録することにより測定した。ルシフェラーゼ阻害百分率は、〔（ＲＬＵ^ODN−Ｒ
ＬＵ）／ＲＬＵ〕×１００〔ここで、ＲＬＵ^ODN及びＲＬＵは、それぞれＯＤＮ
の非存在下及び存在下でインキュベートされた細胞の細胞溶解物中のルシフェラ
ーゼ活性である〕を使用して計算した。示された結果は、トリプリケートで実施
し、少なくとも２回繰り返した実験の典型的な結果である。データは、平均±標
準偏差である。

【０１９２】 ＴＮＦ−αが誘導するＩＣＡＭ−１発現のＩＳＩＳ１９３９による阻害 図２は、ＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの３′非コーディング領域を標的とするアン
チセンスホスホロチオアートオリゴヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤＮ）であるＩＳＩ
Ｓ１９３９（ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴ）によって、ＴＮＦ−α
が誘導するＩＣＡＭ−１発現の阻害効果を示す図である。結果は、ＴＮＦ−αが
誘導するＩＣＡＭ−１発現が、２０μＭヒスチジル化オリゴリシンの存在下で、
ＩＳＩＳ１９３９により阻害されたことを示した。ＨｏＫ２（ＩＣ₅₀０．２５μ
Ｍ）はＨｏＫ１（ＩＣ₅₀０．５μＭ）より効率的であると考えられ、それは、お
そらく、ＨｏＫ２がＨｏＫ１よりも少ないヒスチジル残基を保有しているためで
ある（１５対１２）。ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下では、最大の１μＭ
ＯＤＮ（２０％阻害）ですら、阻害が極めて低かった。Ａ５４９細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ１８５、ＡＴＣＣ Rockville、ＭＤ）を９６ウェルマイクロタイタ
ープレートに播いた（１ウェル当たり１０⁴細胞）。翌日、培養培地を除去し、
細胞を洗浄した。ＨｏＫ１又はＨｏＫ２の非存在下（黒四角）、２０μＭ Ｈｏ
Ｋ１の存在下（黒丸）、又は２０μＭ ＨｏＫ２の存在下（白丸）で、ＩＳＩＳ
１９３９ＯＤＮを含有する１００μlのＤＭＥＭ無血清培地中で、３７℃で４時
間、細胞をインキュベートした。ＨｏＫ２及びＨｏＫ３は、上述のようにして調
製されたヒスチジル化オリゴリシンである。１容量の１０ng／ml ＴＮＦ−αを
含有する新たな培地を添加し、細胞をさらに１８時間インキュベートした。抗Ｉ
ＣＡＭ−１抗体を使用したＥＬＩＳＡにより、ＩＣＡＭ−１発現を定量した。細
胞を２００μlのＰＢＳで３回洗浄し、２０mg／mlのパラホルムアルデヒドを含
有するＰＢＳ中で室温で２０分間固定した。次いで、細胞を、２０mg／ml ＢＳ
Ａを含有するＰＢＳで２０倍希釈された抗ＩＣＡＭ１マウス抗体（Becton Dicki
nson）と共に、３７℃で９０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄
し、次いで２０mg／ml ＢＳＡを含有するＰＢＳで２０００倍希釈された抗マウ
ス西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Becton Dickinson）と共に、３
７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、１００μlのｏ−フェニレン
ジアミンジヒドロクロリドペルオキシダーゼ基質タブレットセット（Sigma）を
使用することにより、ペルオキシダーゼ活性を査定した。３７℃でＸ分間のイン
キュベーションの後、２５μlの３ＮのＨ₂ＳＯ₄を添加することにより反応を停
止させ、４９２nmで吸光度を読み取った。全ての計算は、ＴＮＦ−αの非存在下
又は存在下での未処理対照と比較してなされた。ＴＮＦ−αが誘導するＩＣＡＭ
−１の発現の百分率は、下記のようにして計算された。〔（Ａ_TNF-α^ODN−Ａ₀）
／（Ａ_TNF-α−Ａ₀）〕×１００〔ここで、Ａ_TNF-α^ODNは、ＯＤＮで処理され、
サイトカインで誘導された細胞の吸光度、Ａ₀はＯＤＮ及びＴＮＦ−αなしでイ
ンキュベートされた細胞の吸光度、Ａ_TNF-αは、ＯＤＮなしでサイトカインによ
り誘導された細胞の吸光度であった〕。示された結果は、トリプリケートで実施
し、少なくとも２回繰り返した実験の典型的な結果である。データは、ＴＮＦ−
αにより誘導される対照ＩＣＡＭ−１発現に対する百分率の平均±標準偏差であ
る。

【０１９３】 ＰＳ−ＯＤＮの細胞内局在位置に対するヒスチジル化ポリマーの効果 図３は、ヒスチジル化オリゴリシンが、ＯＤＮのサイトゾル及び核の中への輸
送を誘導したことを示す図である。ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下で、０
．１２５μＭ Ｆ−ＰＳ−ＯＤＮと共に、３７℃で４時間インキュベートしたＡ
５４９細胞は、弱い小胞染色を示した（図３−ａ）。ＨｏＫ１（図３−ｂ）又は
ＨｏＫ２（図３−ｃ）の存在下では、フローサイトメトリー分析と一致して蛍光
染色が比較的強かった。ＨｏＫ２及びＨｏＫ３は、上述のようにして調製された
ヒスチジル化オリゴリシンである。さらに、小胞は比較的大きく、サイトゾル及
び核も標識されていたが、ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下では、小胞は比
較的小さく、サイトゾルも核も染色されなかった（図３−ａ）。サイトゾル及び
核の染色は、ＨｏＫ２存在下の方が、ＨｏＫ１存在下よりも大きかったが、それ
は、おそらく、ＨｏＫ２がＨｏＫ１よりも多いヒスチジル残基を含有していたた
めである（１５対１２）。対照的に、ＨｏＫ３の存在下では、細胞と関連した蛍
光は低く、このことはＯＤＮとＨｏＫ１及びＨｏＫ２との相互作用がＯＤＮ取り
込みにとって好都合である可能性を示唆している（図３−ｃ）。置換されていな
いオリゴリシンは、ＯＤＮ取り込み及びＯＤＮ蓄積に対する効果を有しなかった
（図３−ｄ）。Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５、ＡＴＣＣ Rockville
、ＭＤ）を、２０mmウェル内の無菌のカバースリップ上に播き（１ウェル当たり
２×１０⁵細胞）、接着させた。２０μＭの（ｂ）ＨｏＫ１、（ｃ）ＨｏＫ２、
（ｄ）ＨｏＫ３又は（ｅ）Ｐｌｋ（対照として使用されたヒスチジンにより置換
されていない１９個のリシル残基を含有するオリゴリシン）の存在下、又はそれ
らの（ａ）非存在下で、０．１２５μＭ蛍光標識ＰＳ−ＯＤＮの存在下で３７℃
で４時間細胞をインキュベートした。細胞を２％のｐ−パラホルムアルデヒドで
固定し、洗浄し、１０mg／ml ＤＡＢＣＯ（１，４ジアゾビシクロ−（２，２，
２）−オクタン）を抗退色剤として含有するＰＢＳ／グリセロール混合物（１：
１ 容積／容積）中でスライドに乗せた。細胞を、ニコンオプチフォトエピ蛍光
顕微鏡（Nikon、東京、日本）及びプラナポ（planapo）対物レンズ（開口数１．
４）が装備された共焦点顕微鏡イメージングシステム（ＭＲＣ−１０２４、Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＧＥＭ−９１によるルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害を示す図である。 黒四角：ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下 黒丸：２０μＭ ＨｏＫ２の存在下 白丸：２０μＭ ＨｏＫ３の存在下

【図２】 ＴＮＦ−αが誘導するＩＣＡＭ−１発現のＩＳＩＳ１９３９による阻害を示す
図である。 黒四角：ＨｏＫ１又はＨｏＫ２の非存在下 黒丸：２０μＭ ＨｏＫ１の存在下 白丸：２０μＭ ＨｏＫ２の存在下

【図３】 ＰＳ−ＯＤＮの細胞内局在位置に対するヒスチジル化ポリマーの効果を示す図
である。 （ａ）：ヒスチジル化オリゴリシンの非存在下 （ｂ）：ＨｏＫ１の存在下 （ｃ）：ＨｏＫ２の存在下 （ｄ）：ＨｏＫ３の存在下 （ｅ）：Ｐ１Ｋの存在下

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/06 ４Ｊ００１ 37/06 37/08 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０８Ｇ 69/02 Ｃ０８Ｇ 69/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベロ−ルファイ，マジュブ フランス国、エフ−45072 オルレアン・ セデクス 02、レジダンス・レ・ゼトル、 リュ・ドゥ・トゥール ５ (72)発明者 モンスィニ，ミッシェル フランス国、エフ−45590 サン−シル− アン−ヴァル、リュ・デ・ブヴリュイユ 341 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA01 CA11 CA20 DA02 EA10 GA11 HA17 HA20 4C076 AA95 CC04 CC07 CC27 CC29 CC35 CC41 EE41A EE59 4C084 AA02 AA03 BA01 BA03 BA18 CA59 MA05 NA13 ZB082 ZB112 ZB132 ZB262 ZB332 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 NA13 ZB07 ZB08 ZB11 ZB13 ZB26 ZB33 4H045 AA10 AA20 AA30 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 EA20 EA50 EA61 EA65 FA20 4J001 DA01 DB01 DD14 DD15 EA37 JA20

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 重合度（ＰＤ）が５〜５０、好ましくは１０〜４０、より好
   ましくは２０であり、該重合度の５０％と等しいか、又はそれ以上の数の遊離の
   ＮＨ₃ ⁺を有するモノマー成分から形成されたオリゴマーを含有する、正の電荷を
   帯びたオリゴマーコンジュゲート（oligomeric conjugate）であって、 該オリゴマーが、 − 少なくとも５０％、有利には６０％〜９５％、特に８０％〜９０％の比率
   （この比率は、核磁気共鳴により決定される）で、前記成分である遊離のＮＨ₃ ⁺ が、弱酸性培地中で細胞膜の不安定化を導く、弱酸性培地中のプロトン付加可能
   （protonable）な残基により置換されている、 − 前記プロトン付加可能な残基が、 → それらが、前記オリゴマーとの結合を可能にする官能基を含有する、 → それらが、細胞膜受容体により認識される認識シグナルに相当しない、 → それらが、少なくとも一つの遊離のＮＨ₃ ⁺基を含むことができる、 という特性をさらに有する、 − 前記モノマーの遊離のＮＨ₃ ⁺が、置換前の同オリゴマーと比較して、正の
   電荷数の減少を導く、電荷を帯びていない残基により置換されていてもよい、 − 膜細胞受容体により認識される認識シグナルを構成する分子が → 前記モノマーの遊離のＮＨ₃ ⁺のうちのいくつかの置換によって、又は
   、 → 電荷の数の減少を導く、電荷を帯びていない残基のうちのいくつかに
   あることで、又は、 → 細胞膜の不安定化を導く、前記プロトン付加可能な残基のうちのい くつかにあることで、又は、 → 遊離のＮＨ₃ ⁺（存在する場合に）が、細胞膜の不安定化を導く、前記
   プロトン付加可能な残基に置換されていることによって、 存在してもよい、 ものであり、 １）非置換のＮＨ₃ ⁺基の総数が、重合度の少なくとも５０％であること、 ２）遊離のＮＨ₃ ⁺を最初に保持しているモノマーの数が、重合度の少なくとも
   ５０％の比率で、細胞膜の不安定化を導く残基により置換されていること、 を条件とする、 オリゴマーコンジュゲート。
2. 【請求項２】 細胞膜の不安定化を導くプロトン付加可能な残基が、 − これらが水性溶媒中でｐＫが８未満の弱塩基であるため、陽イオン性オリゴ
   マーと結合したこれらの塩基が、５０％超の割合で、ｐＨ７．４の中性溶媒中で
   プロトンを付加しない、 というさらなる特性を示す、請求項１記載のオリゴマーコンジュゲート。
3. 【請求項３】 細胞膜の不安定化を導くプロトン付加可能な残基が、 − イミダゾール環を含む化合物の群に属する、 − キノリンの群に属する、 − プテリンの群に属する、 − ピリジンの群に属する、 というさらなる特性を示す、請求項１記載のオリゴマーコンジュゲート複合体。
4. 【請求項４】 細胞膜の不安定化を導くプロトン付加可能な残基が、 − アルキル基が、１〜１０個、特に２〜６個の炭素原子を含み、イミダゾール
   環の窒素原子のうち一つのみが置換されているアルキルイミダゾール である、請求項１〜３のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲート。
5. 【請求項５】 細胞膜の不安定化を導くプロトン付加可能な残基が、ヒスチ
   ジン、４−カルボキシメチルイミダゾール、３−（１−メチルイミダゾール−４
   −イル）アラニン、３−（３−メチルイミダゾール−４−イル）アラニン、２−
   カルボキシイミダゾール、ヒスタミン、３−イミダゾール−４−イル−Ｌ−乳酸
   、２−（１−メチルイミダゾール−４−イル）エチルアミン、２−（３−メチル
   イミダゾール−４−イル）エチルアミン、β−アラニルヒスチジンカルノシン、
   ７−クロロ−４−（アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン、Ｎ⁴−（７−
   クロロ−４−キノリニル）−１，４−ペンタンジアミン、８−（４−アミノ−１
   −メチルブチルアミノ）−６−メトキシキノリン（プリマキン（primaquine））
   、Ｎ⁴−（６−メトキシ−８−キノリニル）−１，４−ペンタンジアミン、キニ
   ン酸（quininic acid）、キノリンカルボン酸、プテロイン酸、ニコチン酸、キ
   ノリン酸から選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載のオリゴマーコンジ
   ュゲート。
6. 【請求項６】 オリゴマーコンジュゲートが、下記式： 【化１】 〔式中、 ＊ ａｉは、０〜１０で変動する整数であり、 ＊ ｂｉは、０〜１０で変動する整数であり、 ＊ ｉ＝ ５〜５０、特に１０〜４０、好ましくは２０の重合度であり、 ＊ ｎ＝ １〜６で変動する整数、好ましくは４であり、 ＊ Ｒは、５０％〜１００％の比率（数ｕに相当）で、 【化２】 〔式中、 ｍは、１〜６で変動する整数であり、 ｎ′は、０〜６で変動する整数であり、 ｎ″は、０〜６で変動する整数であり、 Ｂは、請求項２〜４のいずれかで定義された弱塩基であり、 Ｒ′は、ＮＨ₃ ⁺（数ｐに相当）を表すか、又はＮＨ（数ｑに相当）であって −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは１〜７の整数
   である〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
   １〜７の整数であり、ｓは、１〜６の整数、好ましくは６である〕 【化３】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたものを表す〕 を表し、 ＊ Ｒは、０％〜５０％の比率（ｆに相当：０＜ｆ≦ｕ）で、 − ＮＨ₃ ⁺（数ｊに相当）、 − ＮＨ（数ｋに相当）であって、 −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは１〜７の整数
   である〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
   １〜７の整数であり、ｓは、１〜６の整数、好ましくは６である〕 【化４】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたもの − Ｈ（数ｈに相当） − （ＣＨ₂）_nＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）_n−ＯＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）_n−ＳＡ′（数ｈに相当）〔Ａ′＝ Ｈ、ＣＨ₃、又は 【化５】 であり、ｎは、１〜６の整数である〕 を表し、 ここで、・ｉ＝ ｕ＋ｊ＋ｋ＋ｈ ・αＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｐ＝ ｕ−ｑ ・ωＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｊ＝ ｆ−（ｋ＋ｈ） ・ＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｍ＝ ｐ＋ｊ＋ｌ であり、 １）ｕ≧ｉ／２ ２）ｍ≧ｉ／２ であることを条件とする〕 で示されるオリゴマーを含有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のオリゴマ
   ーコンジュゲート。
7. 【請求項７】 オリゴマーコンジュゲートが、下記式： 【化６】 〔式中、 ＊ ｉ＝ ５〜５０、特に１０〜４０、好ましくは２０の重合度であり、 ＊ ｎ＝ １〜６で変動する整数、好ましくは４であり、 ＊ Ｒは、５０％〜１００％までの比率（数ｕに相当）で、 【化７】 〔式中、 ｍは、１〜６で変動する整数であり、 ｎ′は、０〜６で変動する整数であり、 ｎ″は、０〜６で変動する整数であり、 Ｂは、請求項２〜４のいずれかで定義された弱塩基であり、 Ｒ′は、ＮＨ₃ ⁺（数ｐに相当）を表すか、又はＮＨ（数ｑに相当）であって、 −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは１〜７の整数
   である〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
   １〜７の整数であり、ｓは、１〜６の整数、好ましくは６である〕 【化８】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたものを表す〕 を表し、 ＊ Ｒは、０％〜５０％の比率（ｆに相当：０＜ｆ≦１）で、 − ＮＨ₃ ⁺（数ｊに相当）、 − ＮＨ（数ｋに相当）であって、 −ＣＯ−ＣＨ₃ −ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは１〜７の整数
   である〕 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_s−（ＣＨＯＨ）_rＨ〔ｒは、１〜１５、好ましくは
   １〜７の整数であり、ｓは、１〜６の整数、好ましくは６である〕 【化９】 −ＳＯ₂−Ｆｌｕ −ＣＯ−Ｆｌｕ −ＣＳ−ＮＨ−Ｆｌｕ〔Ｆｌｕは、蛍光分子である〕 により置換されたもの − Ｈ（数ｈに相当） − （ＣＨ₂）_nＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）_n−ＯＨ（数ｈに相当）〔ｎは、１〜６の整数である〕 − （ＣＨ₂）_n−ＳＡ′（数ｈに相当）〔Ａ′＝ Ｈ、ＣＨ₃、又は 【化１０】 であり、ｎは、１〜６の整数である〕 を表し、 ここで、・ｉ＝ ｕ＋ｊ＋ｋ＋ｈ ・αＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｐ＝ ｕ−ｑ ・ωＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｊ＝ ｆ−（ｋ＋ｈ） ・ＮＨ₃ ⁺の総数＝ ｍ＝ ｐ＋ｊ＋１ であり、 １）ｕ≧ｉ／２ ２）ｍ≧ｉ／２ であることを条件とする〕で示されるオリゴマーを含有する、請求項１〜６のい
   ずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲート。
8. 【請求項８】 オリゴマーコンジュゲートが、請求項７記載の式で示される
   オリゴマー 〔式中、ｉ＝ １９、ｎ＝ ４ 【化１１】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０、Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃、ｍ＝ １、Ｂ＝ イミダゾール 【化１２】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃、ｕ＝ １２、ｊ＝ ７ であるか、又は ｉ＝ １９、ｎ＝ ４ 【化１３】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０、Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃、ｍ＝ １、Ｂ＝ イミダゾール 【化１４】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃、ｕ＝ １６、ｊ＝ ３ であるか、又は ｉ＝ １９、ｎ＝ ４ 【化１５】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０、Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃、ｍ＝ １、Ｂ＝ イミダゾール 【化１６】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃、ｕ＝ １９、ｊ＝ ０ であるか、又は ｉ＝ １９、ｎ＝ ４ 【化１７】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０、Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃、ｍ＝ １、Ｂ＝ イミダゾール 【化１８】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＣＯ−ＣＨ₃、ｕ＝ １１、ｋ＝ ８ であるか、又は ｉ＝ １９、ｎ＝ ４ 【化１９】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０、Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃、ｍ＝ １、Ｂ＝ イミダゾール 【化２０】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＣＯ−ＣＨ₃、ｕ＝ １５、ｋ＝ ４ であるか、又は ｉ＝ １９、ｎ＝ ４ 【化２１】 〔式中、ｎ′＝ ｎ″＝ ０、Ｒ′＝ ＮＨ⁺ ₃、ｍ＝ １、Ｂ＝ イミダゾール 【化２２】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＣＯ−（ＣＨＯＨ）_rＨ、ｒ＝ ５、ｕ＝ １２、ｋ＝ ３ であるか、又は ｉ＝ １９、ｎ＝ ４ 【化２３】 〔式中、（ｑ）ｎ′＝ ｎ″＝ ２０、Ｒ′＝ ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ₃、 ｍ＝ １、Ｂ＝ イミダゾール 【化２４】 である〕 （ｆ）Ｒ＝ ＮＨ⁺ ₃、ｕ＝ １６、ｆ＝ ４、ｋ＝ ３ である〕を含有する、請求項１〜７のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲ
   ート。
9. 【請求項９】 少なくとも一つの生物学的分子（例えば、ペプチド、オリゴ
   シド（oligoside）若しくはオリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物）と会合
   している、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲートを、少
   なくとも一つ含有する組成物。
10. 【請求項１０】 サイトゾル及び／又は細胞核の中への、生物学的分子のイ
    ンビトロ、インビボ、又はエクスビボ移入のための、同時、別個、又は連続的な
    使用のためのパーツキット（kit-of-parts）の形態で、下記の個々の成分： − 請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲート − 少なくとも一つの生物学分子（例えば、ペプチド、オリゴシド若しくはオリ
    ゴヌクレオチド、又はそれらの混合物）と会合している、少なくとも一つの請求
    項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲート、 を活性物質として含有する組み合わせた調製物。
11. 【請求項１１】 インビトロ、インビボ、又はエクスビボでの、サイトゾル
    及び／又は細胞核の中への生物学的分子の細胞内移入のための、請求項１〜８の
    いずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲートの使用。
12. 【請求項１２】 サイトゾル及び／又は細胞核の中への、ペプチド、オリゴ
    シド若しくはオリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物の細胞内インビトロ、イ
    ンビボ、又はエクスビボ移入のための、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリ
    ゴマーコンジュゲート、請求項９記載の組成物、又は請求項１０記載の組み合わ
    せた調製物の使用。
13. 【請求項１３】 細胞が、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞、例え
    ば単球、マクロファージ及び繊維芽細胞、白血球及び顆粒球、骨芽細胞、並びに
    樹状細胞、幹細胞、ニューロン細胞又は皮膚細胞の中から選択される、請求項１
    〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲート、請求項９記載の組成物、
    又は請求項１０記載の組み合わせた調製物の使用。
14. 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドのインビトロ、インビボ、又はエクス
    ビボ移入のための方法であって、 − 相補的ｍＲＮＡ配列と結合し、それを阻止するアンチセンスオリゴヌクレオ
    チドの、サイトゾル及び／又は細胞核の中への移入、 − あるいは、サイトゾル内の二次メッセンジャー、又は核内の対応する遺伝子
    を抑制若しくは活性化する、活性化因子としてのオリゴヌクレオチドの、サイト
    ゾルの中への移入、 − あるいは、刺激活性、又は免疫抑制活性を有する反復性細菌型ＤＮＡ配列に
    相当するオリゴヌクレオチドの、サイトゾル及び／又は細胞核の中への移入、 − あるいは、ＤＮＡと結合し、遺伝子発現の阻害を導く三重らせんを形成する
    オリゴヌクレオチドの、細胞核の中への移入、 − あるいは、制御因子と真正ＤＮＡ領域との結合を阻止することにより、遺伝
    子発現を阻害するデコイとして機能するＲＮＡオリゴヌクレオチドの、サイトゾ
    ル及び／又は細胞核の中への移入、 − あるいは、ｍＲＮＡを切断することにより遺伝子発現を阻害するリボザイム
    （ＲＮＡオリゴヌクレオチド）の、サイトゾル及び／又は細胞核の中への移入、
    のような条件下で、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲー
    ト、請求項９記載の組成物、又は請求項１０記載の組み合わせた調製物と、オリ
    ゴヌクレオチドとを、移入される細胞を含有する培地と接触させる方法。
15. 【請求項１５】 ペプチドのインビトロ、インビボ、又はエクスビボ移入の
    ための方法であって、抗原性ペプチドが、ＭＨＣＩ上に固定された抗原性エピト
    ープの提示を可能とするＭＨＣＩ分子と結合するためにプロテオソーム内でプロ
    セスされる抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞）のサイトゾル
    の中への、該抗原性ペプチドの移入があるような条件下で、ペプチド〔特に抗原
    性ペプチドである〕と、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュ
    ゲート、請求項９記載の組成物、又は請求項１０記載の組み合わせた調製物とを
    、移入される細胞を含有する培地と接触させる方法。
16. 【請求項１６】 オリゴシドのインビトロ、インビボ、又はエクスビボ移入
    の方法であって、サイトゾル及び／又は細胞核の中へオリゴシドが移入すること
    があるような条件下で、オリゴシドと、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリ
    ゴマーコンジュゲート、請求項９記載の組成物、又は請求項１０記載の組み合わ
    せた調製物とを、移入される細胞を含有する培地と接触させる方法。
17. 【請求項１７】 少なくとも請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマー
    コンジュゲート、請求項９記載の組成物、又は請求項１０記載の組み合わせた調
    製物を活性物質として、あるいは医薬的に許容される媒体と共に含む医薬組成物
    。
18. 【請求項１８】 癌、炎症性若しくは免疫学的な疾患（例えば、移植片拒絶
    、アレルギー、自己免疫）、又は感染性疾患の処置における使用のための薬物の
    調製用の、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲート、請求
    項９記載の組成物、又は請求項１０記載の組み合わせた調製物の使用。
19. 【請求項１９】 キット又はケースであって、 − 前記コンジュゲート上に予め固定された、又は固定されていない認識シグナ
    ル〔該認識シグナルは、標的とする細胞に依存している〕を含むことができる、
    弱酸性培地における細胞膜の不安定化を引き起こすプロトン付加可能な残基によ
    り置換された、請求項１〜８のいずれか１項記載のオリゴマーコンジュゲート、 − 移入する少なくとも一つの生物学的分子、 − 場合により、前記オリゴマーコンジュゲート上の認識シグナルの可能性のあ
    る結合を可能にする試薬、 − 場合により、請求項９記載の組成物、又は請求項１０記載の組み合わせた調
    製物の形成を可能にする試薬、 − サイトゾル及び／又は細胞核への、生物学的分子の移入を可能にする試薬、 を含有するキット又はケース。