JP2002531116A - 不飽和化酵素、およびそれらを多価不飽和脂肪酸の合成のために用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素をコードするアミノ酸配列および核酸配列が開示される。本核酸配列は組換えDNA構築物およびベクターの設計に用いられうる。その後これらのベクターを用いて、例えば植物および酵母を含む種々の生物の形質転換を行うことができる。形質転換された生物は多価不飽和脂肪酸を産生すると考えられる。本アミノ酸配列は、不飽和化酵素の同定に有用な酵素特異的抗体の作製に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、食品面で重要な用途をもつ多価不飽和脂肪酸の作製のために用いら
れうる不飽和化酵素に関する。

【０００２】背景 脂肪酸は生体システムの基本的な構成要素である。植物、動物および原生生物
にも同様に共通して、それらは細胞膜の主要な構成要素である。

【０００３】 炭素20個を有し、炭化水素鎖の方向に沿って複数の炭素-炭素不飽和結合があ
る脂肪酸は特に重要であることが知られている。アラキドン酸（20:4）（Heinz
、「植物における脂質代謝（Lipid Metabolism in Plants）」、pp.33〜89、199
3；Yamazakiら、Biochim Biophys. Acta 1123：18〜26、1992；Ulsamerら、J. C
ell Biol. 43：105〜114、1969；およびAlbertら、Lipids 14：498〜500、1979
）、および一般にEPAと呼ばれているエイコサペンタエン酸（20:5）（Heinz、「
植物における脂質代謝（Lipid Metabolism in Plants）」、pp.33〜89、1993；Y
amazakiら、Biochim. Biophys. Acta 1123：18〜26、1992；Ulsamerら、J. Cell
Biol. 43：105〜114、1969；Albertら、Lipids 14：498〜500、1979；およびCo
okら、J. Lipid Res. 32：1265〜1273、1991）は哺乳動物細胞膜の重要な構成要
素であり、またプロスタグランジンを含むシグナル分子の前駆体でもある。脳（
Naughton、J. Biochem. 13：21〜32、1981）、精巣（WilderおよびConiglio、Pr
oc. Soc. Exp. Biol. Med. 177：399〜405、1984）および網膜（Aveldano de Ca
ldironiら、Prog. Lipid Res. 20：49〜57、1981）などのある種の特殊化した哺
乳動物の組織では、不飽和脂肪酸が特に豊富である。

【０００４】 アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸はいずれも、C２２（22-carbon）多
価不飽和脂肪酸の合成のための前駆体として、およびジホモ-γ-リノール酸（20
:3）（Yamazakiら、Biochim. Biophys. Acta 1123：18〜26、1992；Ulsamerら、
J. Cell Biol. 43：105〜114、1969；およびAlbertら、Lipids 14：498〜500、1
979）とともに、エイコサノイド代謝調節因子の合成のための前駆体としての役
割を果たす（Hwang、「食物中の脂肪酸およびその健康への影響（Fatty Acids i
n Foods and Their Health Implications）」、545〜557、1992）。C２０脂肪酸
の合成において重要な酵素は不飽和化酵素であり、これは脂肪族炭化水素鎖の方
向に沿った特定の位置で2つの水素原子を除去することによって、シス二重結合
を導入する。不飽和化酵素は、標的脂肪酸にすでに存在する二重結合の位置、数
および立体化学に特異的である（Heinz、「植物における脂質代謝（Lipid Metab
olism in Plants）」、33〜89、1993）。

【０００５】 C２０多価不飽和脂肪酸を合成するために、哺乳動物は、必須脂肪酸18:2（Bre
nner、「ヒトの栄養における脂肪の役割（The Role of Fats in Human Nutritio
n）、pp.45〜79、1989）」および18:3（Nelson、「食物中の脂肪酸およびその健
康への影響（Fatty Acids in Foods and Their Health Implications）」、pp.4
37〜471、1992；Brenner、「ヒトの栄養における脂肪の役割（The Role of Fats
in Human Nutrition）」、pp.45〜79、1989；およびHulanickaら、J. Biol. Ch
em. 239：2778〜2787、1964）を食物から得なければならない（Nelson、「食物
中の脂肪酸およびその健康への影響（Fatty Acids in Foods and Their Health
Implidations）」、437〜471、1992）。これらの食物性多価不飽和脂肪酸は、小
胞体内で、交互の位置特異的不飽和化およびマロニル-CoA依存性連鎖伸長段階の
連続（図1A）によって代謝され、その結果、特徴的なメチレン断続性二重結合パ
ターンが生じる。ヒト脂質代謝の主要臓器である肝臓において、C２０脂肪酸生
合成における第一段階は必須脂肪酸のΔ^６位での不飽和化である。不飽和化産物
は伸長され20:3および20:4となる（Cookら、J. Lipid Res. 32：1265〜1273、19
91）。次に、これらのC２０産物はΔ^５-不飽和化酵素によって不飽和化され、ア
ラキドン酸およびエイコサペンタエン酸を産生する。Δ^６-不飽和化段階は該代
謝経路における律速段階であり（BernetおよびSprecher、Biochim. Biophys. Ac
ta 398：354〜363、1975；ならびにYamazakiら、Biochim. Biophys. Acta 1123
：18〜26、1992）、また、驚くまでもなく、食事およびホルモンの変化による調
節を受ける（Brenner、「ヒトの栄養における脂肪の役割（The Role of Fats in
Human Nutrition）」、pp.45〜79、1989）。

【０００６】 肝臓とは異なり、少数の生物および組織においてC２０多価不飽和脂肪酸の生
合成のための代替経路が示されている（図1B）。代替経路における第一段階は不
飽和化ではなく、必須C１８脂肪酸のC２０鎖長への伸長であり、これにより20:2
（Ulsamerら、J. Cell Biol. 43：105〜114、1969；およびAlbertら、Lipids 14
：498〜500、1979）および20:3が生じる。続いて、Δ^８-不飽和化酵素を介した
不飽和化が起こる（図1）。この伸長-不飽和化の産物である20:3および20:4は、
より一般的な不飽和化-伸長経路のものと同じである。Δ^８経路は土壌アメーバ
のアカントアメーバ属（Acanthamoeba sp.）（Ulsamerら、J. Cell Biol. 43：1
05〜114、1969）およびユーグレナ属（Euglenoid sp.）に存在しており、C２０
多価不飽和脂肪酸の形成のための主要経路となっている（Hulanickaら、Journal
of Biological Chemistry 239：2778〜2787、1964）。

【０００７】 このΔ^８-不飽和化経路は哺乳類に存在し、ラット精巣（AlbertおよびConigli
o、Biochim. Biophys. Acta 489：390〜396、1977）およびヒト精巣（Albertら
、Lipids 14：498〜500、1979）の両方に存在する。Δ^８活性は、乳癌細胞株（G
rammatikosら、Br. J. Cancer 70：219〜227、1994；およびBardonら、Cancer L
ett. 99：51〜 58、1996）およびグリオーム（Cook ら、J. Lipid Res. 32：126
5〜1273、1991）においてみられるが、対応する非癌性の乳腺細胞株（Grammatik
osら、Br. J. Cancer 70：219〜227、1994）または脳（DhopeshwarkarおよびSub
ramanian、J. Neurochem. 36：1175〜1179、1976）においてはΔ^８活性は検出さ
れない。組織内の脂肪酸基質の競合性Δ^６反応および連鎖短縮性逆転換（retroc
onversion）の存在により、哺乳動物の器官系における不飽和化酵素活性の分析
がしばしば複雑化されるため（SprecherおよびLee、Biochim. Biophys. Acta 38
8：113〜125、1975；Geigerら、Biochim. Biophys. Acta 1170：137〜142、1993
）に、正常細胞または癌細胞の代謝に対するΔ^８-不飽和化の意義は明確でない
。

【０００８】 上記に概述した理由のために、多価不飽和C２０脂肪酸はヒトの食事において
重要であり、このような脂肪酸を、乳児食、乳児用調整乳（baby formula）、栄
養補助食品および機能性栄養補助製剤（nutriceutical formulation）に取り入
れることに対する近年の関心は相当なものである。

【０００９】 このため、多価不飽和C２０脂肪酸の産生能力が増強された新規のトランスジ
ェニック植物およびトランスジェニック動物を産生することは望ましいと考えら
れる。

【００１０】開示の概要 本発明は、C２０多価不飽和脂肪酸を産生するために、クローニングされるこ
とができ、植物を含む種々の生物の細胞内で発現させることができる、新規のΔ ^５ -不飽和化酵素（図6A）およびΔ^８-不飽和化酵素（図7A）を提供する。このよ
うな脂肪酸の発現は、このような生物の栄養品質を向上させる。例えば、脂肪種
子植物は、本発明のΔ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素を組み入れるよ
うに操作されうる。このような脂肪種子植物は、20:3、20:4、20:5、22:4および
22:5多価不飽和脂肪酸に富む種子油を生じると考えられた。このような脂肪酸は
、乳児用調整乳、全ての種類の食品、栄養補助食品、機能性栄養補助製剤および
薬学的製剤に、有用に組み入れられることが可能であった。

【００１１】 本発明はまた、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換がある点で、図6Aおよび
図7Aの蛋白質とは異なる蛋白質も提供する。図6Aおよび図7Aの蛋白質と「実質的
な類似性（substantial similarity）」（「定義」の項で定義される）を示す蛋
白質もまた提供される。

【００１２】 本発明は、上述の蛋白質をコードする、単離された新規核酸、該核酸および細
胞を含む組換え核酸、ならびに該組換え核酸を含む植物および生物を提供する。

【００１３】 20:3、20:4、20:5、22:4および22:5脂肪酸などの多価不飽和脂肪酸を産生する
ために、例えば代謝経路において、新規Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化
酵素を個別に用いることもでき、または互いに組み合わせて用いることもできる
。

【００１４】 本発明の範囲にはまた、新規Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素をコ
ードする核酸の部分、該新規酵素と実質的に類似したポリペプチドをコードする
核酸の部分、ならびに、図6Aおよび図7Aの蛋白質とは1つまたは複数の保存的ア
ミノ酸置換という点で異なるポリペプチドをコードする、核酸の部分も含まれる
。核酸のこのような部分は、例えば、研究および診断目的のためのプライマーお
よびプローブとして用いられうる。このようなプローブおよびプライマーの研究
的用途には、ヒトを含む他の生物における、関連したΔ^５-不飽和化酵素および
Δ^８-不飽和化酵素の同定およびクローニングが含まれる。

【００１５】 本発明にはまた、本発明のΔ^５-不飽和化酵素および／またはΔ^８-不飽和化酵
素を利用する方法も含まれる。この態様の一例は、本発明の一方または両方の不
飽和化酵素の遺伝子を有し、該不飽和化酵素の特徴によって、アラキドン酸およ
び／もしくはEPAを産生しうる酵母または植物細胞である。

【００１６】配列表 添付する配列表に挙げた核酸配列およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に
ついては標準的な略記文字、アミノ酸については三文字コードを用いて示してい
る。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみを示しているが、相補鎖は、表示した鎖
の任意の参照に含まれるものと解釈される。 配列番号：1は、センチュウ（Caenorhabditis elegans）由来の脂肪酸Δ^５-不
飽和化酵素のオープンリーディングフレームに対応するヌクレオチド配列である
。 配列番号：2は、センチュウ由来の脂肪酸Δ⁵-不飽和化酵素の一次アミノ酸配
列である。 配列番号：3は、原生生物ミドリムシ（Euglena gracilis）由来の脂肪酸Δ^８-
不飽和化酵素のオープンリーディングフレームに対応するヌクレオチド配列であ
る。 配列番号：4は、原生生物ミドリムシ由来の脂肪酸Δ^８-不飽和化酵素の一次ア
ミノ酸配列である。 配列番号：5〜配列番号：8は、Δ^８-不飽和化酵素をコードする核酸配列の増
幅およびクローニングに用いたプライマーである。 配列番号：9は、ポリアデニル化シグナルである。 配列番号：10は、Δ^５-不飽和化酵素をコードする核酸配列の増幅およびクロ
ーニングに用いたプライマーである。 配列番号：11は、短いRNAリーダー配列である。 配列番号：12は、ヒスチジンボックスモチーフのアミノ酸配列である。 配列番号：13は、ヒスチジンボックスモチーフのアミノ酸配列である。

【００１７】発明の説明 以下の定義および方法は、本発明をより良く定義するため、および当業者を本
発明の実践に向けて導くために提供される。特に言及する場合を除き、用語は関
連する技術分野の当業者による従来の用法に従って理解されるものとする。分子
生物学における一般的用語の定義は、リーガー（Rieger）ら、「遺伝学用語集：
古典的および分子的（Glossary of Genetics：Classical and Molecular）」、
第5版、Springer-Verlag：New York、1991；ならびにレビン（Lewin）、「遺伝
子VI（Genes VI）」、Oxford University Press：New York、1997に見出される
。37 C.F.R.§1.822に記載されたようなDNA塩基の命名法を用いる。アミノ酸残
基については標準的な一文字命名法および三文字命名法を用いる。

【００１８】 定義 部分（portion）：核酸分子の部分とは、該分子の配列に対応する一続きの連
続した核酸であり、長さは約15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、30ヌクレオチド
、40ヌクレオチド、50ヌクレオチドまたは60ヌクレオチドでありうる。このよう
なヌクレオチド部分はプローブまたはプライマーとして用いられうる。蛋白質の
部分とは、該蛋白質のアミノ酸配列に対応する一続きの連続したアミノ酸であり
、長さは約5残基、10残基、20残基、30残基、40残基または50残基でありうる。
本明細書で用いる場合、このような部分は、核酸分子の任意の区間に対応してよ
く、例えばこのような部分は図6Bに示された配列の1ヌクレオチド〜500ヌクレオ
チド、501ヌクレオチド〜1000ヌクレオチドもしくは1001ヌクレオチド〜1451ヌ
クレオチド、または図7Bに示された配列の1ヌクレオチド〜400ヌクレオチド、40
1ヌクレオチド〜800ヌクレオチド、801ヌクレオチド〜1251ヌクレオチドからな
る区間に対応しうる。

【００１９】 不飽和化酵素：不飽和化酵素とは、炭化水素分子における炭素-炭素二重結合
の形成を促進する酵素である。

【００２０】 酵素を含む調製物を、適当な形態の基質脂肪酸と共にインキュベートし、該基
質の、予想される脂肪酸産物への転換を分析するアッセイ法によって、不飽和化
酵素の活性が示されうる。または、不飽和化酵素蛋白質をコードするように計画
されたDNA配列を適したベクター構築物に組み入れることができ、それによって
、特定の脂肪酸基質を不飽和化する能力を通常は持たない種類の細胞内で発現さ
せることができる。その後、不飽和化酵素をコードするDNA配列を含むベクター
により形質転換された細胞および適当な対照細胞（例えば、空ベクターのみによ
り形質転換されたもの）に、適当な形態の基質脂肪酸を供給することにより、該
DNA配列によってコードされる不飽和化酵素の活性を示すことができる。このよ
うな実験では、予想される脂肪酸産物が、不飽和化酵素をコードするDNA配列を
含む細胞内では検出され対照細胞では検出されないことにより、不飽和化酵素活
性が立証される。この種のアッセイ法の例は、例えば、リー（Lee）ら、Science
280：915〜918、1998；ネイピア（Napier）ら、Biochem. J. 330：611〜614、1
998；およびミカエルソン（Michaelson）ら、J. Biol. Chem. 273：19055〜1905
9、1998に記載されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。

【００２１】 Δ^５-不飽和化酵素活性は、例えば、20:3Δ^{８，１１，１４}を基質として用い
、20:4Δ^{５，８，１１，１４}を産物として検出する技法により、アッセイされう
る（Michaelsonら、J. Biol. Chem. 273：19005〜19059、1998）。Δ^５活性アッ
セイ法における使用のための潜在的な他の基質には、これらに限定されないが、
10:2Δ^{１１，１４}（20:5Δ^{５，１１，１４}を産物として生じる）および20:3Δ^{１ １，１４，１２} （20:4Δ^{５，１１，１４，１７}が産物をして生じる）が含まれる
。

【００２２】 Δ^８-不飽和化酵素は、例えば、20:3Δ^{１１，１４，１７}を基質として用い、2
0:4Δ^{８，１１，１４，１７}を産物として検出する同様の技法によってアッセイ
されうる。

【００２３】 ORF：オープンリーディングフレーム。ORFとは、アミノ酸をコードする連続し
た一連のヌクレオチドトリプレットである。通常、これらの配列はペプチドに翻
訳されうる。

【００２４】 ホモログ：共通の祖先配列を有し、該祖先配列を有する種が2つの種に分かれ
た際に分岐した、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列。ホモログはしばしば
、かなりの程度の配列同一性を示す。

【００２５】 形質転換された（transformed）：形質転換細胞とは、分子生物学の技法によ
って核酸分子が内部に導入された細胞である。この用語は、核酸分子をこのよう
な細胞に導入しうる、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミ
ドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクショ
ンおよびパーティクルガン加速による裸の（naked）DNAの導入を含む、すべての
技法を含む。

【００２６】 精製された（purified）：精製されたという用語は、絶対的な純度を必要とは
せず、むしろ相対的な用語として意図されている。このため、例えば、精製され
た蛋白質調製物とは、対象蛋白質または他の基質において、細胞内の自然環境下
よりも純粋な蛋白質調製物である。一般に、蛋白質調製物は、該蛋白質が調製物
の総蛋白質含有量の少なくとも50％を占めるように精製される。

【００２７】 動作可能的に結合した（operably linked）：第1の核酸配列が第2の核酸配列
と機能的に関係して位置している場合に、第1の核酸配列は第2の核酸配列と動作
可能的に結合している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に
影響を及ぼす場合には、該プロモーターは該コード配列と動作可能的に結合して
いる。一般に、動作可能的に結合したDNA配列は隣接しており、2つの蛋白質のコ
ード領域を連結する必要がある場合には、同じ読みとり枠内に存在する。イント
ロンが存在する場合には、動作可能的に結合したDNA配列は隣接しなくてもよい
。

【００２８】 細胞：植物、動物、原生生物、細菌または真菌の細胞。

【００２９】 配列類似性：2つの核酸または2つのアミノ酸の間の類似性は、配列同一率によ
って示される。2つの配列間で配列同一率が高いほど、2つの配列の類似性は高い
。

【００３０】 蛋白質の整列化の場合には、類似性は同一率によってだけでなく、保存的アミ
ノ酸置換も考慮に入れて計測される。一般に、このような保存的置換では置換さ
れた残基の疎水性および酸性度が保持され、したがって折りたたまれた蛋白質の
構造（およびその結果機能も）が保持される。蛋白質の類似性を算出するために
用いたコンピュータプログラムでは標準化アルゴリズムを用いており、標準化さ
れた状況で用いた場合には、蛋白質の異なる対の間の類似性の、意味のある比較
が可能である。

【００３１】 アラインメント中のギャップを許可して配列の整列化を行い、コンピュータ化
アルゴリズムを用いて、同一性のある領域を定量化する。一般に、ギャップ許容
度および他の変数の設定にはコンピュータプログラム中のデフォルトパラメータ
ーを用いる。

【００３２】 比較のための配列の整列化の方法は当技術分野では周知である。種々のプログ
ラムおよび整列化アルゴリズムが、ピアソン（Pearson）ら、Methods in Molecu
lar Biology 24：307〜331、1994およびアルチュール（Altschul）ら、Nature G
enet. 6：119〜129、1994により記載されている。アルチュール（Altschul）ら
は、配列の整列化法および相同性算出の詳細な考察を示した。

【００３３】 NCBIの基本的局所整列化検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool）
（BLAST（登録商標））（Altschulら、J. Mol. Biol. 215：403〜410、1990）は
、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnol
ogy Information）（NBCI、Bethesda、MD）を含むいくつかの入手元およびイン
ターネット上から入手可能であり、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx
、tblastnおよびtblastxと関係して用いられる。BLAST（登録商標）にはhttp://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてアクセス可能である。このプログラムを
用いて配列同一性を決定する方法の説明はウェブサイトで入手可能である。本明
細書中で用いられるように、配列同一性は一般に、デフォルトパラメーターを設
定されたBLAST（登録商標）ソフトウエアを用いて決定される。例えば、2つの核
酸配列間の配列同一性を決定するために、デフォルトパラメーター（期待値（ex
pect）＝10、行列（matrix）＝BLOSUM62、フィルター（filter）＝DUST（Tatuso
vおよびLipmann、1999年12月1日時点で出版準備中；ならびにHancockおよびArms
trong、Comput. Appl. Biosci. 10：67〜70、1994）、ギャップ存在コスト（gap
existence cost）＝11、1残基当たりのギャップコスト（per residue gap cost
）＝1、およびラムダ比（lambda ratio）＝0.85）を用いたblastn（バージョン2
.0）ソフトウエアを使用することができる。2つのポリペプチドの比較のために
は、デフォルトパラメーター（期待値＝10、フィルター＝SEG（WoottonおよびFe
derhen、Computers in Chemistry 17：149〜163、1993）、行列＝BLOSUM62、ギ
ャップ存在コスト＝11、1残基当たりのギャップコスト＝1、ラムダ比＝0.85）に
よるblastp（バージョン2.0）ソフトウエアが用いられる。

【００３４】 短いペプチド（ほぼ30アミノ酸未満）の整列化を行う場合には、デフォルトパ
ラメーター（オープンギャップペナルティー9、エクステンションギャップペナ
ルティー1）に設定したPAM30行列セットを用いたBlast 2配列機能を用いて、整
列化を行わねばならない。

【００３５】 代替整列化ツールの一つに、バイオロジーワークベンチ（Biology Workbench
）（http://biology.ncsa.uiuc.edu）から入手可能なALIGNグローバル最適整列
化ツール（Global Optimal Alignment tool）（バージョン3.0）がある。このツ
ールを、2つの既知の配列を整列化するために、デフォルトパラメーターに設定
された設定値と共に用いることができる。このツールに関する参考文献には、マ
イヤース（Meyers）およびミラー（Miller）、CABIOS 4：11〜17、1989が含まれ
る。

【００３６】 保存的アミノ酸置換とは、起こった場合に元の蛋白質の特性をほとんど妨げな
いような置換、すなわち蛋白質の構造および特に機能が保存されており、該置換
によって著しく変化しないような置換のことである。以下の表には、蛋白質中の
元のアミノ酸と置換されることができ、それが保存的置換とみなされるようなア
ミノ酸を示している。

【表１】

【００３７】 保存的置換では一般に、（a）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例
えばシート状もしくはヘリックス状のコンフォメーション；（b）標的部位にお
ける分子の電荷もしくは疎水性；または（c）側鎖の容積（bulk）が維持される
。

【００３８】 蛋白質の特性に重大な変化をもたらすと一般に予想される置換、例えば（a）
セリルもしくはトレオニルなどの親水性残基によって、ロイシル、イソロイシル
、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルなどの疎水性残基が置換される（
またはその逆）、（b）システインもしくはプロリンによって任意の他の残基が
置換される（またはその逆）、（c）リシル、アルギニルもしくはヒスチジルな
どの陽性荷電側鎖を有する残基によって、グルタミルもしくはアスパルチルなど
の陰性荷電側鎖が置換される（またはその逆）、または（d）フェニルアラニン
など容積の大きい側鎖を有する残基によってグリシンなどの側鎖を持たない残基
が置換される（またはその逆）などの場合における変化は、非保存的であると考
えられる。

【００３９】 プローブ：検出可能な標識またはレポーター分子が結合した、単離された核酸
。典型的な標識には放射性同位元素、リガンド、化学発光剤および酵素が含まれ
る。

【００４０】 プライマー：核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的DNA鎖とアニ
ーリングしてプライマーと標的DNA鎖とのハイブリッドを形成することができ、
続いてDNAポリメラーゼによって標的DNA鎖に沿って伸長できる短い核酸、好まし
くは10ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのDNA オリゴヌクレオチド。プライマ
ー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または当技術分野において公知
の他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅に用いることができる。

【００４１】 本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、少なくとも15個の連続した
ヌクレオチドを含む。特異性を増大するために、開示された核酸配列の少なくと
も20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個または150個の連続
したヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーのように、さらに長いプロー
ブおよびプライマーが用いられうる。

【００４２】 または、このようなプローブおよびプライマーは、開示された配列の1つと規
定レベルの配列同一性を有する、例えば、少なくとも50％、60％、70％、80％、
90％または95％の配列同一性を有する、少なくとも15個、20個、30個、40個、50
個、60個、70個、80個、90個、100個または150個の連続したヌクレオチドを含ん
でもよい。

【００４３】 または、このようなプローブおよびプライマーは、以下に提示するような、特
定の条件下でハイブリダイズし、特定の洗浄条件下でハイブリダイズし続けるヌ
クレオチド分子であってもよい。これらの条件を、不飽和化酵素の変異体を同定
するために用いることができる。不飽和化酵素のcDNAおよび遺伝子配列由来の核
酸分子には、開示された不飽和化酵素の核酸分子またはその断片と、種々の条件
下でハイブリダイズする分子が含まれる。一般にハイブリダイゼーション条件は
、例えば、極めて高いストリンジェンシー、高ストリンジェンシーおよび低スト
リンジェンシーといった型に分類される。長さが約600塩基対またはそれ以上の
プローブのための条件を、3つの対応する型別に提供する。

【表１２−１】 極めて高いストリンジェンシー（配列同一性が90％の配列を検
出）

【表１２−２】 高ストリンジェンシー（配列同一性が80％またはそれ以上の配
列を検出）

【表１２−３】 低ストリンジェンシー（配列同一性が50％を上回る配列を検出
）

【００４４】 プローブおよびプライマーの調製および使用のための方法は、例えば、サムブ
ルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cl
oning：A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss、NY、1989；アウスユーベル（Ausubel）ら、「分子生物学における最新プロ
トコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Greene Publishing
Associates and Wiley-Intersciences、1987；およびイニス（Innis）ら、「」P
CRプロトコール、方法および応用の手引き（PCR Protocols、A Guide to Method
s and Applications）」、Academic Press, Inc.、San Diego、California、199
0などの参照に記載されている。例えば、Primer（バージョン0.5、1991、Whiteh
ead Institute for Biomedical Research、Cambridge、MA）などのその目的のた
めのコンピュータプログラムを用いることによって、PCRプライマー対を既知の
配列から得ることができる。

【００４５】 組換え核酸：天然に存在しない配列、または隔たった2つの異なる区間の人為
的組み合わせによって作製される配列を有する配列。この人為的組み合わせはし
ばしば化学的合成によって、またはより一般的には、例えばサムブルック（Samb
rook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Lab
oratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、1989
に記載されたものなどの遺伝子操作技法による、核酸分子の単離された区間の人
為的操作によって行われる。組換えという用語には、単に核酸の一部の付加、置
換または欠失のみによって改変された核酸も含まれる。

【００４６】 天然の（native）：「天然の」という用語は、天然に存在する（「野生型」）
核酸またはポリペプチドを指す。天然の核酸または蛋白質は、天然に存在する特
定の生物から物理的に採取してもよく、天然に存在する核酸または蛋白質と同一
な、人工的に構築された核酸もしくは蛋白質でもよい。

【００４７】 単離された（isolated）：「単離された」核酸とは、該核酸が天然に存在する
生物の細胞内の他の核酸配列、すなわち、他の染色体DNAおよび染色体RNA、なら
びに染色体外DNAおよび染色体外RNAから、従来の核酸精製法によって実質的に分
離または精製されたものである。この用語にはまた、組換え核酸および化学合成
された核酸も含まれる。

【００４８】 植物（plant）：「植物」という用語には、単子葉植物（例えば、トウモロコ
シ、イネ、コムギ、オオムギ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリなど）、双子葉植物（
例えば、ジャガイモ、トマトなど）を含む任意の高等植物およびその子孫が含ま
れ、さらに種子、果実、塊茎などを含む植物の部分も含まれる。

【００４９】 本発明は本明細書中の実施例を参照することによってさらに良く理解されると
考えられる。しかし、本発明の範囲がそれに制限されるとみなされるべきではな
い。

【００５０】 発明の説明および一般的方法 本発明では、別に明記する場合を除き、核酸のクローニング、操作およびシー
クエンシング、蛋白質の精製および分析、ならびに他の分子生物学的技法および
生化学的技法に関して標準的な実験方法を用いる。このような技法は、サムブル
ック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press
、NY、1989；およびアウスユーベル（Ausubel）ら、「分子生物学における最新
プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Green and Wile
y lnterscience、NY、1987などの標準的な実験マニュアルにおいて詳細に説明さ
れている。

【００５１】 本発明者らは、共に多価不飽和脂肪酸を産生するために用いられうる、原生生
物ミドリムシ（Euglena gracilis）由来の新規な脂肪酸Δ^８-不飽和化酵素、お
よびセンチュウ（Caenorhabditis elegans）由来の新規な脂肪酸Δ^５-不飽和化
酵素の同定、クローニングおよび発現を行った。

【００５２】 本発明は、精製された新規Δ^５蛋白質およびΔ^８蛋白質（それぞれ図6Aおよび
図7A）を提供する。また、本発明は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換の点
で図6Aおよび図7Aの蛋白質とは異なる蛋白質、ならびに図6Aおよび図7Aの蛋白質
と「実質的な類似性」を示す蛋白質も提供する。実質的な類似性は「定義」の項
で定義される。本発明の蛋白質には、図6Aおよび図7Aに示した蛋白質と少なくと
も50％のアミノ酸類似性を示す蛋白質が含まれる。「50％のアミノ酸類似性」と
いう用語は、デフォルトパラメーターに設定されたblastp配列解析ソフトウエア
を用いることによって客観的に、一貫して定義される。本発明の蛋白質には、bl
astpをデフォルトパラメーターで用いて（図6Aまたは図7Aの配列と）少なくとも
60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％および少なくとも95％
の類似性を示す蛋白質も含まれる。

【００５３】 本発明は、前述の蛋白質をコードする単離された新規核酸、該核酸を含む組換
え核酸、および該組換え核酸を含む細胞を提供する。したがって、本発明の核酸
には、以下をコードする核酸が含まれる： （1）図6Aおよび図7Aに示されたアミノ酸配列；（2）1つまたは複数の保存的ア
ミノ酸置換の点で図6Aおよび図7Aに示された配列とは異なるアミノ酸配列；なら
びに（3）図6および図7Aの配列と（デフォルトパラメーターのblastpによる計測
により）少なくとも50％の類似性を示すアミノ酸配列。

【００５４】 本発明の核酸には、図6Bおよび図7Bに示された核酸と少なくとも「50％の類似
性」を示す核酸も含まれる。「50％の類似性」という用語は、デフォルトパラメ
ーターに設定されたblastnソフトウエアの使用により客観的に定義される。本発
明の核酸にはまた、blastnをデフォルトパラメーターで用いて（図6Bおよび図7B
の配列と）少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％
および少なくとも95％の類似性を示す配列も含まれる。

【００５５】 例えば代謝経路において20:3脂肪酸および20:4脂肪酸などの多価不飽和脂肪酸
を産生させるために、新規Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素を個別に
用いることもでき、または互いに組み合わせて用いることもできる。図1Bは、こ
のような代謝経路の一例を示している。適切な発現系を用いることにより、任意
の細胞内でこのような経路を操作することができる。このような要素を提供する
簡単なやり方の一つは、以下で詳細に考察される、市販の発現系を用いるもので
ある。

【００５６】 本発明の範囲には、新規Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素（ならび
にこのような酵素に実質的に類似した誘導体）をコードする核酸全体のみでなく
、このような核酸の「部分」（本明細書の「定義」の項に定義されている）も含
まれる。このような、請求された部分は、それらが図6Bおよび図7Bのヌクレオチ
ドの同様の大きさの部分と一定の程度の類似性を有することにより同定され、長
さは約15個、20個、30個、40個または50個の連続したヌクレオチドであってよい
。類似性は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for
Biotechnology Information）（NBCI、Bethesda、MD）およびインターネットのh
tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から入手されうる「blastn」および「blastp
」ソフトウエアなどの配列比較ソフトウエアによって客観的に計測される。請求
された核酸の部分と、図6Bおよび図7Bの核酸配列の同様の大きさの部分との類似
性は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％でよく、98％でもよい。
核酸のこのような部分は、例えば、研究目的および診断目的のプライマーおよび
プローブとして用いられうる。図6Bまたは図7Bに示された配列の任意の領域、例
えば図中で番号が振られた100個の核酸の第1、第2、第3の群などから、核酸の部
分を選択してもよい。

【００５７】 例えば組換え核酸は、前述の通り、例えば蛋白質を発現するように設計された
クローンの一部としてのプロモーターなど、別の核酸要素と動作可能的に結合し
た、開示された核酸の全体または一部を含みうる。このような目的のためのクロ
ーニング系および発現系は市販されている。

【００５８】 蛋白質の発現および精製のために種々の酵母株および酵母由来ベクターが一般
的に用いられており、例えば、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）発現系
はインビトロゲン（Invitrogen）社（Carlsbad、CA）から入手可能である。この
ような系は、適当なピヒア・パストリス株、ベクター、試薬、シークエンシング
用プライマーおよび培地を含む。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）における蛋白質発現のための同様の系もまたインビトロゲン社から
入手可能であり、これにはベクター、試薬および培地が含まれる。例えば、ヌク
レオチド配列（例えば、本発明のΔ^５-不飽和化酵素またはΔ^８-不飽和化酵素を
コードする遺伝子）を酵母発現ベクターpYES2中にクローニングし、ガラクトー
ス誘導性プロモーター（GAL1）などの誘導性プロモーターの制御下で発現させる
ことができる。

【００５９】 本発明の不飽和化酵素の発現のために非酵母の真核生物ベクターもまた用いら
れうる。このような系の例は、公知のバキュロウイルス系、遺伝子発現の制御を
可能にするためにキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来の
調節因子を用いるエクジソン誘導性哺乳動物発現系、および種々の哺乳動物細胞
系における高レベルの発現を可能にするシンドビスウイルス発現系がある。これ
らの発現系もまたインビトロゲン（Invitrogen）社から入手可能である。

【００６０】 例えば、サムブルック（Sambrook）ら、1989に記載されたpBR322、pUC18また
はpUC19などの、標準的な原核生物クローニングベクターもまた用いられうる。
本発明の不飽和化酵素をコードする核酸をこのようなベクター中にクローニング
し、続いて大腸菌（E. coli）などの細菌をこれで形質転換し、関心対象の蛋白
質を発現させるためにそれを培養することができる。他の原核生物発現系には、
例えば、厳密に制御された発現調節を可能にするアラビノース誘導性pBAD発現系
、組換え蛋白質の迅速精製を容易にするIPTG誘導性pRSET系、および真核生物遺
伝子の最適な翻訳のために構築されたIPTG誘導性pSE402系が含まれる。これらの
3つの系はインビトロゲン（Invitrogen）社から市販されており、製造者の指示
に従って用いれば、蛋白質の定常的な発現および精製が可能になる。

【００６１】 または、本発明には特に重要であるが、植物発現系を用いることができた。植
物発現系は市販されている。本発明の関心対象の遺伝子をベクター中にクローニ
ングでき、その構築物を植物細胞の形質転換に用いることができる。例えば、パ
ウエルズ（Pouwels）ら、「クローニングベクター：実験室マニュアル（Cloning
Vectors：A Laboratory Manual）」、1985、補遺（supp）、1987；ワイスバハ
（Weissbach）およびワイスバハ（Weissbach）、「植物分子生物学の方法（Meth
ods for Plant Moledular Biology）」、Academic Press、1989；ならびにゲル
ビン（Gelvin）ら、「植物分子生物学マニュアル（Plant Molecular Biology Ma
nual）」、Kluwer Academic Publishers、1990に記載されたものを含む、植物細
胞の安定的形質転換および／またはトランスジェニック植物の確立のために適し
た任意の周知のベクターを用いることができる。このような植物発現ベクターは
、発現制御配列（例えば、誘導性もしくは構成性の、環境的もしくは発生的な調
節を受ける、または細胞特異的な発現制御配列もしくは組織特異的な発現制御配
列）を含むことができる。

【００６２】 植物内での不飽和化酵素の発現に有用な構成性植物プロモーターの例には、こ
れらに限定されないが、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモータ
ー（例えば、Odelら、Nature 313：810、1985；Dekeyserら、Plant Cell 2：591
、1990；ならびにTeradaおよびShimamoto、Mol. Gen. Genet. 220：389、1990を
参照）、ノパリンシンターゼプロモーター（Anら、Plant Physiol. 88：547、19
88）およびオクトピンシンターゼプロモーター（Frommら、Plant Cell 1：977、
1989）が含まれる。

【００６３】 環境的、ホルモン的、化学的および／または発生的なシグナルに応じて調節さ
れる種々の植物遺伝子プロモーターもまた植物細胞における蛋白質発現のために
用いることができ、これには、以下によって調節されるプロモーターが含まれる
：（1）熱（Callisら、Plant Physiol. 88：965、1988）；（2）光（例えば、エ
ンドウマメrbcS-3Aプロモーター、Kuhlemeierら、Plant Cell 1：471、1989；ト
ウモロコシrbcSプロモーター、SchaffnerおよびSheen、Plant Cell 3：997、199
1；または葉緑素a／b結合蛋白質プロモーター、Simpsonら、EMBO J. 4：2723、1
985）；（3）アブシジン酸（Marcotteら、Plant Cell 1：969、1989）などのホ
ルモン；（4）損傷（例えば、wunl、Siebertzら、Plant Cell 1：961、1989）；
または（5）ジャスモン酸メチル、サリチル酸もしくは毒性緩和剤（safener）な
どの化学物質。また、（6）器官特異的プロモーター（例えば、Roshalら、EMBO
J. 6：1155、1987；Schernthanerら、EMBO J. 7：1249、1988；Bustosら、Plant
Cell 1：839、1989；Zhengら、Plant J. 4：357〜366、1993）を用いることも
有用と思われる。組織特異的な発現はある種のプロモーターの使用によって容易
になると思われ、例えば、ナピン（napin）プロモーターはアブラナ属由来の種
子貯蔵蛋白質プロモーターであり、種子の発生に対して特異的である。β-コン
グリシニンプロモーターは組換え核酸の発現を引き起こし、従って本発明のΔ^５ 蛋白質またはΔ^８蛋白質を、例えば種子組織など特定の組織のみで発現させるこ
とが可能となる。

【００６４】 植物発現ベクターには、植物遺伝子の3-非翻訳領域由来の調節配列（Thornbur
gら、Proc. NatI. Acad. Sci. USA 84：744、1987；Anら、Plant Cell 1：115、
1989）、例えば、ジャガイモのPI〜PIIターミネーター領域またはオクトピンシ
ンターゼ3'ターミネーター領域もしくはノパリンシンターゼ3'ターミネーター領
域など、mRNAのmRNA安定性を高める3'ターミネーター領域が含まれうる。

【００６５】 植物細胞における発現のために有用な優性選択マーカー遺伝子には、これらに
限定されないが抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン
、ブレオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対す
る耐性）をコードする遺伝子；および除草剤耐性遺伝子（例えば、フォスフィノ
スリシンアセチルトランスフェラーゼ）が含まれる。有用でスクリーニング可能
なマーカーには、β-グルクロニダーゼおよび緑色蛍光蛋白質が含まれるが、こ
れらに限定されない。

【００６６】 また、本発明は、新規のΔ^５-不飽和化酵素および／またはΔ^８-不飽和化酵素
をコードする、新規に発見されたポリヌクレオチドの全体または一部を含む組換
え核酸構築物により形質転換された細胞または植物または生物を提供する。この
ような形質転換植物または生物の一例は、ジャガイモ、トマト、ナタネ、ヒマワ
リ、ダイズ、コムギまたはトウモロコシであると考えられる。食用キノコなどの
多細胞真菌もまた形質転換されうる。形質転換された脂肪種子植物は、種子油中
にC２０多価不飽和脂肪酸が蓄積すると考えられるため、特に関心がもたれる。

【００６７】 本発明による核酸を発現する核酸構築物は、脂肪酸生合成を変化させるために
種々の宿主細胞または生物に導入されうる。高等植物細胞、真核生物宿主細胞お
よび原核生物宿主細胞はすべて、前述の適切な発現系により形質転換されうる。

【００６８】 不飽和化酵素をコードするcDNA（または遺伝子）が単離された後、植物の特定
の性質を改変するために、標準的な技法を用いてトランスジェニック植物細胞に
おいて該cDNAを発現させることができる。基本的なアプローチは、植物細胞にお
けるcDNAの発現を指示する制御配列（例えば、プロモーター）にcDNAが動作可能
的に結合するように、cDNAを形質転換ベクター中にクローニングすることである
。続いて、任意の種々の技法、例えばアグロバクテリウムを介した植物もしくは
植物組織の形質転換により、またはプロトプラストのエレクトロポレーションに
より、植物細胞に形質転換ベクターを導入し、導入したcDNAを含む子孫植物を選
抜する。形質転換ベクターの全体または一部は植物細胞のゲノム中に安定的に組
み込まれる。植物細胞に組み込まれ、導入したcDNAおよび発現制御のための関連
配列（導入された「導入遺伝子（transgene）」）を含む形質転換ベクターの部
分を、「組換え発現カセット」と呼ぶことができる。

【００６９】 導入された導入遺伝子を含む子孫植物の選抜は、改変された表現型の検出に基
づいて行うことができる。このような表現型は、形質転換ベクター中にクローニ
ングされたcDNAに直接起因してもよく、形質転換ベクターに組み入れられた優性
選択マーカー遺伝子の含有の結果としての化学物質（抗生物質など）に対する耐
性の増大によって明らかになってもよい。

【００７０】 クローニングされたcDNAを用いた形質転換による植物の性質の改変が成功した
例は、技術文献および科学文献中に満載されている。この技術分野における知識
を例示する一助となる主な例には以下が含まれる： 米国特許第5,571,706号（「植物ウイルス耐性遺伝子および方法（Plant Virus
Resistance Gene and Methods）」）； 米国特許第5,677,175号（「植物病原体誘導性蛋白質（Plant Pathogen Induce
d Proteins）」）； 米国特許第5,510,471号（「植物の形質転換のためのキメラ遺伝子（Chimeric
Gene for the Transformation of Plants）」）； 米国特許第5,750,386号（「病原体耐性トランスジェニック植物（Pathogen-Re
sistant Transgenic Plants）」）； 米国特許第5,597,945号（「疾患抵抗性が遺伝的に高められた植物（Plants Ge
netically Enhanced for Disease Resistance）」）； 米国特許第5,589,615号（「改変型2S貯蔵アルブミンの発現によって栄養価が
増大したトランスジェニック植物の生産方法（Process for the Production of
Transgenic Plants with Increased Nutritional Value Via the Expression of
Modified 2S Storage Albumins）」）； 米国特許第5,750,871号（「アブラナ属における形質転換および外来遺伝子の
発現（Transformation and Foreign Gene Expression in Brassica Species）」
）； 米国特許第5,268,526号（「トランスジェニック植物におけるフィトクロムの
過剰発現（Overexpression of Phytochrome in Transgenic Plants）」）； 米国特許第5,262,316号（「遺伝的に形質転換されたコショウ植物体およびそ
の作出方法（Genetically Transformed Pepper Plants and Methods for their
Production）」）； 米国特許第5,569,831号（改変型ポリガラクツロナーゼアイソフォームを有す
るトランスジェニックトマト（Transgenic Tomato Plants with Altered Polyga
lacturonase Isoforms）」）。

【００７１】 これらの例には、形質転換ベクターの選択、形質転換の技法、および導入した
cDNAを過剰発現するように設計された構築物の構築に関する記載が含まれる。前
述の、ならびに不飽和化酵素のアミノ酸配列および核酸配列に関する本明細書の
規定を考慮に入れることにより、当業者が不飽和化酵素活性が強化された植物を
産生するために、cDNAまたはこれらの分子のホモログもしくは誘導体を植物に誘
導することができると考えられる。さらに、植物における1つまたは複数の不飽
和化酵素の発現は、多価不飽和脂肪酸の生産性が強化された植物の元となりうる
。

【００７２】 本発明は、不飽和化酵素に対する抗体およびその断片にも関し、これらの抗体
は不飽和化酵素の精製および検出のために有用であることができる。不飽和化酵
素の配列を提供することにより、該酵素に対する、特異的抗体による結合剤の生
産が可能になる。

【００７３】 不飽和化酵素、不飽和化酵素の部分またはその変異体に対するモノクローナル
抗体またはポリクローナル抗体が作製されうる。最適には、これらの抗原上のエ
ピトープに対して産生された抗体は、本酵素を特異的に検出すると考えられる。
すなわち、不飽和化酵素に対して産生された抗体は、不飽和化酵素を認識してそ
れと結合するが、他の蛋白質には実質的に認識も結合もしないと考えられる。抗
体が抗原と特異的に結合するという確認は、例えばウエスタンブロット法、サム
ブルック（Sambrook）ら（編）、「分子クローニング：実験室マニュアル（Mole
cular Cloning：A Laboratory Manual）」、第2版、第1〜3巻、Cold Spring Har
bor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989などの、数多くの標準的
な免疫測定法の任意の1つを用いて行われる。

【００７４】 所定の抗体調製物（Δ^５-不飽和化酵素に対してマウスで産生された調製物な
ど）が不飽和化酵素を特異的に検出することをウエスタンブロット法によって確
認するためには、細胞から全細胞蛋白質を抽出し、SDS-ポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動する。続いて蛋白質をウエスタンブロット法によって膜（例えば、
ニトロセルロース）に転写し、抗体調製物を膜とともにインキュベートする。非
特異的に結合した抗体を除去するために膜を洗浄した後、特異的に結合した抗体
の存在を、アルカリホスファターゼなどの酵素を接合させた抗マウス抗体を用い
ることによって検出する。5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルリン酸／ニトロブル
ーテトラゾリウムを適用すると、免疫局在性のアルカリホスファターゼにより、
濃青色の化合物が生成される。

【００７５】 不飽和化酵素を特異的に検出する抗体は、この技法により、不飽和化酵素のバ
ンド（ゲル上の、不飽和化酵素の分子量によって決定される位置にある）のみと
実質的に結合することが示されると考えられる。抗体の他の蛋白質との非特異的
結合が生じたり、ウエスタンブロット上で弱いシグナル（自動X線撮影によって
定量化可能）として検出されうる。特異的抗不飽和化酵素結合による強い主要シ
グナルと比較して、ウエスタンブロットにおけるシグナルが弱いことから、この
結合の非特異的な性質が当業者により認識されると考えられる。不飽和化酵素と
特異的に結合する抗体は、本明細書で「特異的結合剤」と呼ばれる一群の分子に
属する。本発明の不飽和化酵素と特異的に結合できる特異的結合剤には、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにFab、F(ab')2およびFv断片などの
モノクローナル抗体の断片、さらには蛋白質の1つまたは複数のエピトープと特
異的に結合できる任意の他の薬剤が含まれうる。

【００７６】 免疫原としての使用に適した実質的に純粋な不飽和化酵素は、トランスフェク
トされた細胞、形質転換細胞または野生型細胞から単離されうる。最終調製物に
おける蛋白質の濃度は、例えば、アミコン（Amicon）濾過装置において数μg／m
lのレベルに濃縮することによって調節される。または、不飽和化酵素のペプチ
ド断片を免疫原として用いてもよい。このような断片を標準的な方法を用いて化
学的に合成することができ、または完全な不飽和化酵素を切断した後に所望のペ
プチド断片を精製することによって得ることができる。長さが3アミノ酸または4
アミノ酸の短いペプチドは、MHCクラスIまたはMHCクラスIIなどの主要組織適合
遺伝子複合体（MHC）分子と関連した免疫系に供されると免疫原性を持つ。従っ
て、開示された不飽和化酵素のアミノ酸配列の少なくとも3個、好ましくは少な
くとも4個、5個、6個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含むペプチドは、抗
体産生のための免疫原として用いられうる。

【００７７】 ペプチド配列を線状分子として見ると、蛋白質上の天然に存在するエピトープ
はしばしばペプチド内で隣接して並んでいないアミノ酸残基を含むので、抗体産
生のために不飽和化酵素のアミノ酸配列からのより長いペプチド断片を用いるこ
とが有益と思われる。したがって、例えば、アミノ酸配列の少なくとも10個、15
個、20個、25個または30個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドを用いるとよ
い。無傷の不飽和化酵素またはそのペプチド断片に対するモノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体は以下に述べる通りに調製しうる。

【００７８】 本明細書に記載されたように同定および単離された不飽和化酵素の任意の様々
なエピトープに対するモノクローナル抗体は、ケーラー（Kohler）およびミルス
タイン（Milstein）、Nature 256：495、1975の古典的方法またはその派生的な
方法に従って、マウスハイブリドーマから調製されうるる。簡潔に述べると、数
μgの選抜された蛋白質を、数週間にわたってマウスに反復接種する。その後に
マウスを殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾細胞をポリエチレングリコー
ルを用いてマウス骨髄腫細胞と融合させ、この系をアミノプテリンを含む選択培
地（HAT培地）上で増殖させることにより、過剰な非融合細胞を破壊する。うま
く融合した細胞を希釈し、希釈アリコートをマイクロタイタープレートのウェル
に入れて培養物の増殖を続ける。エングバル（Engvall）、Enzymol. 70：419、1
980によって最初に記載されたELISA法、またはその派生的方法などの免疫測定法
によってウェルの上清液中の抗体を検出することにより、抗体産生性クローンを
同定する。選抜された陽性クローンを増殖させ、モノクローナル抗体産物を使用
のために収集する。モノクローナル抗体の産生のための詳細な方法は、ハーロウ
（Harlow）およびレーン（Lane）、「抗体、実験室マニュアル（Antibodies、A
Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1988に記
載されている。

【００７９】 単一の蛋白質の不均一なエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清
は、免疫原性を高めるために、適当な動物を発現蛋白質（改変していないもので
もよく、改変したものでもよい）で免疫化することによって調製されうる。効果
的なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の双方に関連した多くの要素
により影響を受ける。例えば、小さな分子は他の分子よりも免疫原性が弱い傾向
があり、担体およびアジュバントの使用が必要になると思われる。また、接種部
位および投与量に応じて宿主動物も一様ではなく、抗原の投与量が不十分でも過
剰でも力価の低い抗血清が生じる。低用量（ng程度）の抗原を皮内部位に多回投
与することが最も確実と思われる。ウサギの効果的な免疫化プロトコールは、バ
イツカイティス（Vaitukaitis）ら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 33：988〜99
1、1971において見出される。

【００８０】 追加免疫注射を定期的に行うことができ、既知の濃度の抗原に対する寒天中で
の二重免疫拡散法などにより半定量的に測定された抗体力価が低下し始めた時点
で、抗血清を収集する。例えば、オクタロニー（Ouchterlony）ら、「実験免疫
学ハンドブック（Handbook of Experimental Immunology）」、ウィア（Wier, D
.）（編）、第19章、Blackwell、1973を参照のこと。抗体のプラトー濃度は通常
、0.1mg／血清ml〜0.2mg／血清ml（約12μM）の範囲である。抗原に対する抗血
清の親和性は、従来の方法を用いた競合結合曲線の調製により決定される。

【００８１】 本酵素を発現するDNAベクターをマウスなどの実験動物に皮下注射することに
よって、本発明の不飽和化酵素に対する抗体が産生されうる。動物の体内への組
換えベクターの送達を、手持ち式の微粒子銃システム（Sanfordら、Particulate
Sci. Technol. 5：27〜37、1987、Tangら、Nature（London）356：153〜154、1
992に記載）を用いて行うことができる。この目的に適した発現ベクターには、
ヒトβ-アクチンプロモーターまたはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター
の転写制御下において酵素のcDNAを発現するものが含まれうる。DNAが動物の体
内で発現するような様式で裸DNAを動物に投与する方法は公知であり、例えば、
米国特許第5,620,896号（「ロタウイルス感染に対するDNAワクチン（DNA Vaccin
es Against Rotavirus Infections）」）；米国特許第5,643,578号（「DNA転写
ユニットの接種による免疫化（Immunization by Inoculation of DNA Transcrip
tion Unit）」）；および米国特許第5,593,972号（「遺伝子的免疫化（Genetic
Immunization）」）、ならびにそれらに引用された参考文献に記載されている。

【００８２】 完全な抗体の代わりに抗体断片を用いてもよく、それは原核宿主細胞内で容易
に発現させることができる。「抗体断片」とも呼ばれる、モノクローナル抗体の
、免疫学的に有効な部分の作製および使用の方法は周知であり、ベター（Better
）およびホロビッツ（Horowitz）、Methods Enzymol. 178：476〜496、1989；グ
ロックシューバー（Glockshuber）ら、Biochemistry 29：1362〜1367、1990；な
らびに米国特許第5,648,237号（「機能性抗体断片の発現（Expression of Funct
ional Antibody Fragments）」）；米国特許第4,946,778号（「単鎖ポリペプチ
ド結合分子（Single Polypeptide Chain Binding Molecules）」）；および米国
特許第5,455,030号（「単鎖ポリペプチド結合分子を用いた免疫療法（Immunothe
rapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules）」）、ならびにそ
れらに記載された参考文献に記載されたものがこれに含まれる。

【００８３】実施例 実施例1：生物の系統および培養 ミドリムシ（Euglena gracilis）Z株を、コロンビアサイエンティフィック（C
olumbia Scientific）社から入手した。炭素源としてスクロースを加えたクラメ
ール・マイヤーズ培地（CramerおよびMeyers、Archiv fur Mikrobiologie 17：3
84〜402、1952）でこの生物を培養した。培養物は完全暗黒下で25℃で維持した
。

【００８４】 センチュウ（C. elegans）は線虫遺伝学センター（Caenorhabditis Genetics
Center）、St. Paul、Minnesotaから入手し、標準的な条件下で育生した（Sulst
onら、「線虫セノラブディティス・エレガンス（Nematode Caenorhabditis eleg
ans）」（Wood, W.B.編）、pp.587〜606、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s、Cold Spring Harbor、NY、1988）。

【００８５】実施例2：センチュウ（C. elegans）遺伝子ホモログに関するデータベース検索 サンガーセンター（The Sanger Center）（http://www.sanger.ac.uk/project
s/c_elegans/blast_server.shtml）のセンチュウ・ゲノムデータベースで、BLAS
T（登録商標）を用いて、ルリヂサ（B. officinalis）Δ^６-不飽和化酵素（GenB
ankアクセッション番号U79010）を含む植物不飽和化酵素の配列を検索した。最
も高いスコアが得られた2つのセンチュウ（C. elegans）ポリペプチドは、コス
ミドW08D2（ハイスコア163）およびT13F2（ハイスコア121）に存在するペプチド
であった。

【００８６】実施例3：RNA単離、逆転写PCR、およびRACE（cDNA末端の迅速増幅） ミドリムシ（E. gracilis）Δ^８遺伝子に関しては、フェノール-SDSプロトコ
ール（Ausubel、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols I
n Molecular Biology）」、1988）を用いて、ミドリムシの従属栄養培養物から
全RNAを単離した。ポリA-トラクトシステム（polyA-tract system）（Promega S
cientific、Madison、Wisconsin）を用いて、全RNAからメッセンジャーRNAを精
製した。逆転写反応はスーパースクリプトII（Superscript II）（Life Technol
ogies、Rockville、Maryland）を用いて行った。初期反応における一本目の鎖の
合成のプライミングには、アンカー（anchored）ポリTプライマー（Clontech、P
alo Alto、California）を用いた。二本目の鎖の合成は記載された通りに行い（
Life Technologies）、遺伝子のコア領域のポリメラーゼ連鎖反応増幅は、セン
チュウΔ^６-不飽和化酵素遺伝子の第1および第3のHis-ボックス領域に重複する
配列が完全に縮重するように設計したプライマー（GGCTGGCTGACNCAYGARTTYTGYCA
Y；配列番号：5）および（CATCGTTGGAAANARRTGRTGYTCDATYTG；配列番号：6）を
用いて行った。

【００８７】 縮重プライマーの使用に関して公知のガイドライン（Compton、「PCRプロトコ
ール：方法および応用の手引き（PCR Protocols：A Guide To Methods and Appl
ications）」、1990）を用いて増幅プロトコールを開発した。増幅は、極めて低
いアニーリング温度での5つの予備的段階（94℃で30秒 、1分間で37℃まで下降
、37℃で45秒、3分間で72℃まで上昇）に続いて、高温での30サイクル（94℃で3
0秒、1分間で50℃まで下降、50℃で45秒、3分間で72℃まで上昇）を行うことか
らなる。熱サイクリングのパラメーターを最適化するための予備的増幅にはPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、California）を用いた。3mMマグネシ
ウムおよび4μMの各プライマーの下で増幅が成功した。その後の同一条件下での
増幅にはTaqポリメラーゼを用いた。

【００８８】 350bp〜750bpのポリメラーゼ連鎖反応産物を市販の試薬（Qiagen、Valencia、
California）を用いてアガロースゲルから単離し、縮重プライマーおよびダイタ
ーミネーションシークエンシング技術（dye-termination sequencing technolog
y）（Applied Biosystems、Foster City、California）を直接用いてシークエン
シングを行った。BLAST（登録商標）検索（Altschulら、Nucleic Acids Res. 25
：3389〜3402、1997）によって解析したところ、同一の増幅産物の一群は既知の
不飽和化酵素と相同なオープンリーディングフレームを含んでいた。コア配列の
内部から増幅するように設計された入れ子状（nested）プライマーの対を用いて
、マラソンRACEシステム（Marathon RACE system）（Clontech）により、完全mR
NAの5'配列および3'配列を得た。遺伝子の完全な5'末端をクローニングするため
には、オープンリーディングフレームの配列に特異的なプライマーを用いた逆転
写を反復し、5' RACE増幅を反復することが必要であった。

【００８９】 センチュウ（C. elegans）Δ^５遺伝子に関しては、以下の通りにRNAの単離お
よび逆転写PCRを行った。RT-PCRは、2つの推定不飽和化酵素遺伝子のコード配列
を増幅するために用いた。さまざまな段階のセンチュウからの全RNAをRT-PCRの
鋳型として用いた。記載された通りに寒天平板上で線虫を生育させ、フェノール
／SDS法（Sluderら、Dev. Biol. 184：303〜319、1997）を用いてRNAを単離した
。RT-PCRはスーパースクリプト（Superscript）（登録商標）ワンステップRT-PC
Rシステム（One-Step RT-PCR system）（Gibco-BRL／Life Technologies）を用
いて行った。0.2mMの各dNTP、1.2mM MgSO4、スーパースクリプトII（Superscrip
t II）（登録商標）RT／Taqポリメラーゼ混合物、ならびに200μMの適切な下流
プライマーおよび上流プライマーからなる反応混合物に約1mgの全RNAを添加した
。反応物を50℃で30分間インキュベートした後、35サイクルのPCR増幅に供した
。T13F2.1遺伝子（fat-4）に関しては、コスミドT13F2の34339塩基〜34361塩基
に対応する5'プライマーを用いた。クローニングを容易にするために、これらの
配列にSmaI、HindIIIおよびXhol制限酵素部位を付加した。その結果得られたプ
ライマー［CCCGGGAAGCTTCTCGAGGAATTTTCAATCCTCCTTGGGTC；配列番号：7］は、fa
t-4遺伝子の推定開始コドンATGの19塩基対〜42塩基対上流でコスミドT13F2とア
ニーリングする。fat-4遺伝子の3'末端を増幅するために、関心対象のポリヌク
レオチドのクローニングを容易するためにSmaI部位およびBamHI部位を付加した
、コスミドT13F2の37075塩基〜37095塩基の逆相補物に対応するプライマー：［C
CCGGGTGGATCCGGAACATATCACACGAAACAG；配列番号：8］を用いた。このプライマー
は推定停止コドンTAGの93塩基対下流から始まり、fat-4遺伝子の推定ポリアデニ
ル化シグナル（AAUAAA；配列番号：9）の20塩基対上流で終わる。

【００９０】 特定のリーダー配列のトランススプライシングを決定するために、T13F2.1に
関して、T13F2の35009塩基〜35028塩基の相補物に対応する下流プライマー（TCT
GGGATCTCTGGTTCTTG；配列番号：10）を用いた。上流PCRプライマーはSL1-20また
はSL2-20のいずれかとした（Spiethら、Cell 73：521〜532、1993）。リボソー
ム蛋白質L37のセンチュウ（C. elegans）ホモログをSL1特異的対照として用い、
K06H7.3をSL2特異的対照として用いた（Zorioら、Nature 372：270〜272、1994
）。SL1-20、SL2-20および対照プライマーはディエゴ・A・R・ゾリオ（Diego A.
R. Zorio）氏から寄贈を得た。ゲル電気泳動によって可視化されたRT-PCR産物を
、ゲルのブロッティングおよび以前に記載された適切な遺伝子（Spiethら、Cell
73：21〜532、1993）に対応する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドによるプロー
ブ検索によって確認した。

【００９１】実施例4：Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素をコードする遺伝子のPCR 増幅 DNAおよび蛋白質の配列はウィスコンシン（Wisconsin）-GCGプログラムパッケ
ージ（Devereuxら、Nucleic Acids Res. 12：387〜95、1984）を用いて解析され
た。

【００９２】 ミドリムシ（E. gracilis）（Δ^８）オープンリーディングフレームを単一のD
NA断片としてクローニングするために、一組のプライマーを用いて、オープンリ
ーディングフレームに特異的な逆転写のプライミングを行った。遺伝子の5'末端
のためのプライマーは開始コドンの3ヌクレオチド前から始まり、オープンリー
ディングフレームの最初の26ヌクレオチドを含んでいた。3'プライマーは、予想
停止コドンの下流22ヌクレオチド〜52ヌクレオチドの配列に相補的であった。増
幅の誤りの可能性を最小化するために、Pfuポリメラーゼを用いてPCR増幅を行っ
た。アガロースゲル電気泳動により分析したところ、PCR反応から予想されるサ
イズの単一のバンドが得られた。このバンドをベクターpCR-Script Cam（登録商
標）（Stratagene）中にクローニングし、pJW541と命名した単一クローンを分析
用に選抜した。

【００９３】 センチュウ（C. elegans）Δ^５-不飽和化酵素を発現させるためには、fat-4 c
DNA増幅産物（実施例3参照）をHindIIIおよびBamHIで消化し、HindIIIおよびBam
HIで切断された酵母発現ベクターpYES2（Invitrogen）と連結した。得られたプ
ラスミドをpYFAT4と命名した。

【００９４】実施例5：Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素の発現 ミドリムシ（E. gracilis）に関して、ニューイングランドバイオラブス（New
England Biolabs）社、Beverly、Massachusettsから入手した酵素を用いる標準
的なクローニング法（Ausubel、「分子生物学における最新プロトコール（Curre
nt Protocols In Molecular Biology）」、1988）により、クローニングされた
Δ^８遺伝子を酵母発現ベクターpYES2（Invitrogen、Carlsbad、California）に
移行させた。得られた、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にあるオープ
ンリーディングフレームを含む酵母発現構築物を、pYES2-541と命名した。

【００９５】 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1株（Invitr
ogen）をpYES2-541で形質転換し、標準的な方法（Ausubel、「分子生物学におけ
る最新プロトコール（Current Protocols In Molecular Biology）」、1988）を
用いて培養した。2％ガラクトースを含む液体培地に、脂肪酸石けん（NuCheck P
rep、Elysian MN）を最終濃度0.2mMとなるように添加した。脂肪酸の取り込みを
増大するため（Stukeyら、J. Biol. Chem. 264：16537〜16544、1989）、酵母培
養物にタージトール（Tergitol）（1％、NP40）を添加したが、20:1を含む培養
物に限っては5％DM50を代用した。酵母を28℃で一晩インキュベートし、遠心分
離法によって回収し、1％タージトールで1回、0.5％タージトールで1回、最後に
蒸留水で1回洗浄した。

【００９６】 センチュウ（C. elegans）Δ^５遺伝子に関しては、S.c.イージーコンプ（S.c.
EasyComp）形質転換キット（Invitrogen）を用いて、構築物をサッカロミセス
・セレビシエINVSc1株に導入した。FAT-4ペプチドを用いる実験に関しては、形
質転換された酵母を、2％ガラクトース、0.2mM脂肪酸および1％NP-40を含むウラ
シル欠乏培地で一晩増殖させた。これらの条件下においては、添加された脂肪酸
が酵母脂質中に取り込まれた割合は、総酵母脂肪酸の14％〜28％の範囲であった
。20:1Δ^１１を基質として用いた実験に関しては、脂肪酸がより取り込まれるよ
うに、1％NP-40の代わりに5％DMSOを用いた。

【００９７】実施例6：ガスクロマトグラフィーおよびGC-質量分析法を用いた脂肪酸の分析 脂質の抽出および脂肪酸メチルエステルの調製を、標準的な方法によって行っ
た（MiquelおよびBrowse、J. Biol. Chem. 267：1502〜1509、1992）。メチルエ
ステルのガスクロマトグラフィーを、確立された方法により行った（Spychalla
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：1142〜1147、1997）。酵母脂質抽出物の
脂肪酸4,4-ジメチルオキサゾリン（DMOX）誘導体を、標準的な方法を用いて調製
した（FayおよびRichli、J. Chromatogr. 541：89〜98、1991）。GC-質量分析は
、30m×0.25μmのHP5MSカラムを装着したヒューレット・パッカード（Hewlett-P
ackard）6890シリーズGC-MSを、イオン化電圧70eVおよびスキャン範囲50Da〜550
Daで動作させて行った。脂肪酸およびそれらの誘導体を、可能なものについては
、基準試料（NuCheck Prep）との比較によって同定した。

【００９８】実施例7：ミドリムシΔ^８-不飽和化酵素遺伝子の同定および増幅 従属栄養培養物から単離したメッセンジャーRNAを逆転写の鋳型として用い、
続いてミクロソーム不飽和化酵素蛋白質の第1保存的ヒスチジンリッチ領域およ
び第3保存的ヒスチジンリッチ領域の範囲に及ぶ縮重プライマーを用いるPCR増幅
を行った。センチュウΔ^６-不飽和化酵素遺伝子であるFAT-3をプライマー設計の
主な基盤とした。プライマー対に必要な高い縮重性を補うため、増幅反応を低温
アニーリングの5回のサイクルから始め、アニーリングと重合ステップの間には
長い温度上昇期間（ramp）をおいた。熱サイクリングのパラメーターを最適化す
るための予備的増幅には、校正Pfu DNAポリメラーゼを用いた。高濃度のプライ
マーおよびマグネシウムを用いたPfu増幅反応がうまく行われた後に、検出可能
な多数のバンドがアガロースゲル上に生成されるようにTaqポリメラーゼを用い
た。

【００９９】 このうち約650bpのバンドのいくつかは同一の配列を有していた。DNA配列は、
予想アミノ酸配列が他の膜不飽和化酵素と相同であるようなオープンリーディン
グフレームを含んでおり、中央部に特徴的なHisボックスを含んでいた。増幅配
列に特異的であるように設計されたプライマーを用い、3'RACE法および5'RACE法
を用いてcDNA末端を増幅した。この遺伝子のcDNAの完全長は1745bpであった。12
72bpのオープンリーディングフレームおよび472bpの3'非翻訳領域が含まれた。
ほとんどのミドリムシのメッセンジャーRNAは、短い5' RNAリーダー配列である
トランススプライストリーダー（trans-spliced leader）（Tessierら、Embo. J
. 10：2621〜2625、1991）の付加を通じて処理される。RNAプロセシング段階に
おいて、各メッセージの開始部に保存的配列（TTTTTTTCG；配列番号：11）が残
される（Cuiら、J. Biochem.（Tokyo）115：98〜107、1994）。cDNA配列におけ
るリーダー配列の存在により、該メッセージが5'末端では完全長であることが立
証された。5'末端および3'末端でオープンリーディングフレームと隣接するプラ
イマーを用いたRT-PCRによって単一のバンドが得られたため、これをベクターpC
R-Script Cam（登録商標）（Stratagene）中にクローニングし、pJW541と命名し
た。このORFに対応する遺伝子をEFD1（Euglena fatty acid desaturase 1）と命
名した。

【０１００】実施例8：ミドリムシΔ^８-不飽和化酵素と他の蛋白質との類似性 翻訳されたオープンリーディングフレームから、422アミノ酸からなり、推定
分子量が48.8kDaである蛋白質が示された（図3）。配列データベースのBLAST（
登録商標）検索により、推定蛋白質配列には、高度に保存されたヒスチジンリッ
チ領域（Shanklinら、Biochemistry 33：12787〜12794、1994）において特に、
膜脂肪酸不飽和化酵素の既知の一群との相同領域が存在することが明らかになっ
た。

【０１０１】 個々のHisボックスモチーフはEFD1蛋白質中に存在する。第1のもの（HXXXH）
はアミノ酸146位から始まり、第2のもの（HXXHH；配列番号：12）はアミノ酸183
位から始まる（図3）。さらにEFD1はアミノ酸361位から始まる変異型の第3のHis
ボックスQXXHH（配列番号：13）を含んでおり、これはクローニングされたΔ^５-
不飽和化酵素およびΔ^６-不飽和化酵素と類似している。EFD1は、高度に保存さ
れた領域の周辺領域において、特にセンチュウのΔ^６-不飽和化酵素およびΔ^５-
不飽和化酵素であるFAT-3およびFAT-4と蛋白質配列の保存性を示す（図3）。高
度に保存された領域の外側では、他の不飽和化酵素とのアミノ酸配列の類似性は
非常に低い。全体的には、FAT-3およびFAT-4とのアミノ酸の同一性は33％であり
、一方、ルリヂサΔ^６-不飽和化酵素との同一性は28％である。

【０１０２】 EFD1はまた、N末端にシトクロムb₅様モチーフを含む。この蛋白質は、ヘム結
合に寄与する、シトクロムb₅に特徴的な最も高度に保存された8つのアミノ酸の
うち7つをコードしている（図3）。類似のモチーフは、FAT-3およびFAT-4のN末
端領域（図3）、ならびにルリヂサΔ^６蛋白質、さらには酵母Δ^９蛋白質のカル
ボキシ末端にも見出される。

【０１０３】 このミドリムシ蛋白質の構造はまた、既知の不飽和化酵素との類似性も示す。
膜不飽和化酵素はII型多重膜貫通型蛋白質であり、クローニングされたミドリム
シ遺伝子のヒドロパシー分析により、予想される蛋白質には、膜二重層を2回貫
通するだけの長さが十分にある有意な疎水性領域が少なくとも3つあることが示
された。ほとんどの不飽和化酵素にとって、第1の2つのHisボックスの間には31
個のアミノ酸残基が存在する。第2のHisボックスおよび第3のHisボックスの間の
距離は173残基であり、これは以前に観察されている範囲内である（Shanklinお
よびCahoon、Annu. Rev.植物Physiol.植物Mol. Biol. 48：611〜641、1998）。

【０１０４】実施例9：ミドリムシΔ^８-不飽和化酵素蛋白質の活性 酵素の活性を確認するため、EFD1 cDNAをpJW541から、ガラクトース誘導性プ
ロモーターの制御下にある酵母発現ベクターpYES2に移行させた。得られた構築
物pYES2-541をS.セレビシエ（S. cerevisiae）に導入した。酵母膜はC２０脂肪
酸を含まないが、培地からそれらを取り込む。このため、対照として空ベクター
を含む酵母株を用いて、酵母培養物に種々の脂肪酸石けんを添加し、培養物の脂
肪酸をメチルエステル誘導体化およびガスクロマトグラフィーによって分析した
。

【０１０５】 これらの実験における不飽和化活性のパターンから、pYES2-541はΔ^５活性お
よびΔ^６活性を持たないΔ^８-不飽和化酵素を発現することが示された。実験酵
母株がΔ^８-不飽和化を生成する能力は培養培地に20:2を添加した場合に示され
た（図4）。保持時間が20:3基準試料と同一な不飽和化のピークが得られた。ベ
クターのみの対照培養物は20:2を不飽和化しなかった（図4）。ミドリムシ遺伝
子を発現する酵母株もまた20:3および20:1を不飽和化し（図4）、対照培養物に
は不飽和化活性はみられなかった。クローニングされたミドリムシ蛋白質は20:3
および20:2を基質とした場合に最も活性が高く、取り込まれた総C２０脂肪酸の7
0％および73％を不飽和化した。EFD1は20:1に対する活性が最も低く、不飽和化
産物に転換された基質は32％であった（図4）。

【０１０６】 培養培地にΔ^５-不飽和化のための基質である20:4を添加した場合には、脂肪
酸は酵母に取り込まれたが、20:5不飽和化産物は産生されなかった。同様に、培
地に18:2および18:3を添加した場合にも不飽和化は起こらず、このことからクロ
ーニングされた遺伝子はΔ^６-不飽和化酵素を発現しないことが示された。

【０１０７】 不飽和化がΔ^８位で起こったことを確認するために、酵母脂肪酸の4,4-ジメチ
ルオキサゾリン（DMOX）誘導体をGC-MSによって分析した。DMOX誘導体の質量ス
ペクトルは、メチルエステルのスペクトルよりも解析が容易であり、多価不飽和
脂肪酸における二重結合の位置の明確な決定を可能にする（Christie、Lipids 3
3：343〜353、1998）。脂肪酸20:2を不飽和化した実験において、GC-MS装置にお
ける産物の保持時間は16.8分であり、20:3基準試料のDMOX誘導体と同一であった
。不飽和化産物およびその分子イオン（m／z 359）の質量スペクトルから、それ
が20:3化合物であることが示された。m／z 182およびm／z 194における2つのス
ペクトル周波数ピークの差はわずか12 a.m.u.で、導入された二重結合がΔ^８位
にあることが示された（図5）（基質20:2は8位で飽和しており、ピークは182お
よび196で、差が14 a.m.u.である）。この産物のスペクトルは、不飽和化ピーク
も含め、20:3基準試料のものと同一であった（LuthriaおよびSprecher、Lipids
28：561〜564、1993）。他の基質20:1および20:3もまた、EFD1によってΔ^８位で
不飽和化された。それぞれのスペクトルにおいて、m／z 182およびm／z 194にお
けるピークが見られ、いずれの場合も分子イオンは基質のものより2小さかった
（図5）。

【０１０８】実施例10：2種類のセンチュウ（C. elegans）不飽和化酵素遺伝子の同定および
クローニング ルリヂサΔ^６-不飽和化酵素 の蛋白質配列を用いたセンチュウ（C. elegans）
ゲノムDNAデータベースの検索により、高スコアのオープンリーディングフレー
ムが2つ同定された。オープンリーディングフレームから予想された蛋白質W08D2
.4およびT13F2.1はいずれも、特徴的な（HPGG）ヘム結合ドメインおよび第3のヒ
スチジンボックスにおけるH→Q置換を含む、シトクロムb₅と類似したN末端配列
を含んでいた。いずれも脂肪酸不飽和化酵素をコードすることが示されたため、
W08D2.4遺伝子をfat-3と表記し、T13F2.1遺伝子をfat-4と表記した。興味深いこ
とに、fat-3遺伝子およびfat-4遺伝子は重複するコスミド上で同じ5'→3'方向に
互いに隣接して存在しており、fat-4遺伝子のポリアデニル化シグナルと推定さ
れるものとfat-3遺伝子のATG開始コドンとの隔たりは858ヌクレオチド塩基対に
過ぎなかった（図8）。この遺伝子構成は、2つまたは複数の遺伝子が、単一のプ
ロモーターおよび調節領域の制御下で転写される、オペロンに類似している。

【０１０９】 センチュウにおいて、多シストロン性前（pre-）mRNAが、上流遺伝子の3'末端
での切断およびポリアデニル化ならびに、下流遺伝子の5'末端でのSL2配列との
トランススプライシングによって単シストロン性mRNAに変換され、その後、2つ
のmRNAは別々に翻訳される。しかし、30種以上のこのようなオペロンの分析から
、上流遺伝子の3'末端と下流遺伝子の5'末端の間の距離は一般に約100塩基対で
あり、300塩基対〜400塩基対離れていたものは少数であった（Blumenthalら、線
虫II（C. elegans II）、pp.117〜145、Cold Spring Harbor Laboratory Press
、Cold Spring、NY、1997）。

【０１１０】 センチュウfat-3遺伝子およびfat-4遺伝子が単一のオペロンにおいて同時転写
されるかどうかを明らかにする目的で、それらがSL1またはSL2とトランススプラ
イシングするか否かを明らかにするための試験を行った。fat-4遺伝子はSL1とト
ランススプライシングするが、fat-3遺伝子はいずれのスプライストリーダー配
列ともトランススプライシングしないことが見出された。従って、各遺伝子は自
身の5'プロモーターおよび調節領域を含むことが結論づけられた。

【０１１１】 これらの遺伝子の双方を、RT-PCRを用いてクローニングした。fat-4遺伝子の
配列はT13F2ゲノム配列と正確に一致した。しかし、cDNAによってコードされた
遺伝子産物は、ジーンファインダー（Genefinder）により推定されたT13F2.1（G
enBankアクセッション番号Z81122）の予測よりも7アミノ酸短かったが、これは
アミノ酸残基198位〜204位をコードするDNA配列がfat-4 cDNAに存在しなかった
ためである。結果として生じたペプチドの長さは、事前に推定された454アミノ
酸ではなく447アミノ酸であった。fat-3 cDNAにコードされた遺伝子産物もまた
、W08D2.4のゲノム配列（GenBankアクセッション番号Z70271）と完全に一致した
。しかし、この遺伝子産物も推定蛋白質配列より短かった。cDNAにはW08D2.4の
アミノ酸残基38位〜67位のコドンが存在しなかった。両方の場合において、ゲノ
ム配列決定プロジェクトに用いられた遺伝子予測ソフトウエアは、いくつかのイ
ントロンDNAをコード配列と誤認したと考えられた。

【０１１２】実施例11：センチュウ（C. elegans）Δ^５に関する配列比較 センチュウFAT-3蛋白質およびFAT-4蛋白質、モルティエラ・アルピナ（Mortie
rella alpina）Δ^５-不飽和化酵素、ならびにルリヂサ（B. officinails）Δ^６-
不飽和化酵素はいずれも、N末端シトクロムb₅ドメイン、3つのヒスチジンボック
スおよび、デンマーク工科大学（Technical University of Denmark）生物学的
配列解析センター（Center for Biological Sequence Analysis）（http://www.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM-1.0/）のTMHMMプログラムによって推定された独特
な疎水性膜貫通ドメインを含むという点で、類似した構造をもつ蛋白質であると
考えられる。推定構造は、不飽和化酵素の構造モデルとして提唱されたものと一
致する（Stukeyら、J. Biol. Chem.、265：20144〜20149、1990）。このような
類似性にもかかわらず、この4種類の蛋白質の全体的な配列同一性は非常に低い
。例えば、FAT-3 Δ^６-不飽和化酵素とルリヂサΔ^６-不飽和化酵素は、アミノ酸
レベルで28％の同一性しか持たない。fat-4遺伝子産物のルリヂサΔ^６-不飽和化
酵素とのアミノ酸配列同一性は25％であり、モルティエラ・アルピナΔ^５-不飽
和化酵素とのアミノ酸同一性は19％である。FAT-4蛋白質の、M.アルピナΔ^５-不
飽和化酵素と高い相同性を示す部分は、実際には第3のHisボックスが組み入れら
れた36残基の配列のみであり、44％の同一性および56％の類似性を有する。最も
密接な関連がみられる配列の対はfat-3およびfat-4であり、アミノ酸レベルでの
同一性は46％、全cDNA配列を通じての同一性は54％である。

【０１１３】 図9は、ルリヂサΔ^６-不飽和化酵素、センチュウFAT-3、センチュウFAT-4、お
よびモルティエラ・アルピナΔ^５-不飽和化酵素の配列比較を示す。類似したヘ
ム結合ドメイン（HPGG）および3つのヒスチジンボックス領域に下線を施してい
る。保存的モチーフの存在は、fat-4遺伝子が不飽和化酵素または関連した脂肪
酸修飾酵素をコードする可能性を示す。しかし、配列比較のみでは、この遺伝子
がΔ^６-不飽和化酵素、Δ^５-不飽和化酵素またはより関連性の低い酵素をコード
するか否かを推定することはできない。

【０１１４】実施例12：センチュウ（C. elegans）Δ^５の、酵母における脂肪酸不飽和化酵素 活性および基質特異性 FAT-4不飽和化酵素様蛋白質の酵素活性を決定するために、サッカロミセス・
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）内で該蛋白質を発現させ、該酵母内に
通常は存在しない多価不飽和脂肪酸基質を添加した。FAT-4蛋白質を、ガラクト
ースおよび種々の脂肪酸の存在下で細胞を育成することによって、GAL1プロモー
ターから酵母発現ベクターpYES2において発現させた。16時間増殖させた後に、
ガスクロマトグラフィー（GC）によって全脂肪酸組成について細胞を分析した。
fat-4コード配列を含むpYES2を有するジホモ-γ-リノレン酸（20:3Δ^{８，１１， １４} ）を添加した細胞とベクターのみを有する細胞を比較したところ、FAT-4を
発現する細胞において14.49分の時点に溶出する、新たな大きいピークが存在す
ることが明らかになった（図10B）。この新規ピークの保持時間はアラキドン酸
メチルエステル（20:4Δ^{５，８，１１，１４}）基準試料のものと同一であり、m
／z 318に質量イオンピークがあることを含め、その質量スペクトルがアラキド
ン酸メチルエステル基準試料のものと同一であったことから、アラキドン酸（20
:4Δ^{５，８，１１，１４}）であることが確定された。

【０１１５】 炭化水素鎖における二重結合の位置の決定を簡単にする構造特異的質量スペク
トルを作製するために、酵母脂肪酸メチルエステルをオキサゾリン誘導体に転換
することにより、この化合物の特徴がさらに立証された。新規20:4成分のDMOX誘
導体の質量スペクトルは、アラキドン酸に関して公知のスペクトルと一致し、Δ ^５ 位の二重結合の指標となるm／z 153において顕著なピークを含んでいた。した
がって、fat-4遺伝子がジ-ホモ-γ-リノレン酸基質からアラキドン酸を合成しう
るΔ^５-不飽和化酵素をコードすることが結論づけられた。これに対して、FAT-4
蛋白質はリノール酸（18:2Δ^９，１２）またはγ-リノレン酸（18:3Δ^{９，１２
，１５}）を基質として供した場合に全く活性を示さず、このことからΔ^６-不飽
和化酵素活性をもたないことが示された。

【０１１６】 fat-4を発現する酵母細胞の全脂肪酸のGC図面をさらに分析したところ、空ベ
クター対照細胞には存在しない、12.91分の時点で溶出する第2の新規ピークが存
在することが明らかになった。新規ピークの質量スペクトルの分析により、二重
結合が2つあるC１８脂肪酸のメチルエステル（18:2）のものと同じ294単位の分
子イオン種の存在が明らかになったが、その保持時間および質量スペクトルは一
般的な共通異性体18:2Δ^９，１２とは同一でなかった。

【０１１７】 哺乳動物肝臓のミクロソーム抽出物において、Δ^５-不飽和化酵素活性は多数
のC１８およびC２０前駆体に対して作用し、18:2Δ^５，１１、20:3Δ^{５，１１， １４} および20:4Δ^{５，１１，１４，１７}（28, 29）などの稀な脂肪酸を生成する
ことが報告されている。2種類の粘菌も18:2Δ^５，９、18:2Δ^５，１１、20:3Δ
^{５，１１，１４}および20:4Δ^{５，１１，１４，１７}を少量産生することが報告さ
れている（Rezanka、Phytochemistry、33：1441〜1444、1993）。二重結合が、
メチレン断続性の通常のパターン（3つの炭素ごとに1つの二重結合が存在する）
に従わない、点でこれらの脂肪酸は特殊である。

【０１１８】 従って、GCスペクトルにおいて示された新規ピークは、センチュウΔ^５-不飽
和化酵素が18:1Δ^９ ［または、サッカロミセス・セレビシエの18:1全体の15％
〜20％を占める18:1Δ^１１］化合物に作用し、特殊な異性体18:2Δ^５，９または
18:2Δ^５，１１を生成した結果であると推定された。これらの酵母脂肪酸メチル
エステルはオキサゾリン誘導体に変換された。新規18:2成分のDMOX誘導体の質量
スペクトルが、m／z 153におけるΔ^５特異的ピークを含むことが見出された。し
かし、酵母全抽出物中にこの分子が少量しか存在しなかったため、Δ^９位または
Δ^１１位での二重結合に特徴的なさらに大きいイオンピークは検出されなかった
。

【０１１９】 センチュウΔ^５-不飽和化酵素が他の基質を不飽和化して他の稀な、メチレン
非断続性の脂肪酸を生成しうるかどうかを試験するため、FAT-4-不飽和化酵素を
発現する酵母に、20:1Δ^１１、20:2Δ^{１１，１４}および20:3Δ^{１１，１４，１７} などの特殊なΔ^５基質を添加した。基質20:1Δ^１１を酵母に供給した場合には、
新規ピークは検出されなかった。しかし、20:2Δ^{１１，１４}および20:3Δ^{１１， １４，１７} を基質として与えた場合には、それぞれ14.62分および14.69分に溶出
する新規ピークが検出された（それぞれ図11Aおよび11B）。これらの分子のDMOX
誘導体の質量スペクトル分析を行ったところ、m／z 153に顕著なイオンピークが
あること（これはΔ^５位における二重結合の指標である）を含め、20:3Δ^{５，１ １，１４} および20:4Δ^{５，１１，１４，１７}に関して公知の値と一致する結果が
得られた。しかし、これらの脂肪酸はアラキドン酸（20:4Δ^{５，８，１１，１４} ）と同じ程度には産生されないことが見出された（図12）。これらの実験では、
外因性の供給ジホモ-γ-リノレン酸（20:3Δ^{８，１１，１４}）の55％がアラキド
ン酸に転換されたが、18:1基質、20:3Δ^{１１，１４}基質および20:2Δ^{１１，１４ ，１７} 基質は5％、27％および26％しか転換されなかった（図12）。

【０１２０】 構成性ADHプロモーターを含む酵母発現ベクターpMK195においてfat-3遺伝子を
発現させた。公知の結果と一致して（Napierら、Biochem. J. 330：611〜614、1
998）、FAT-3蛋白質はリノール酸（18:2Δ^９，１２）を不飽和化してγ-リノレ
ン酸（18:3Δ^{６，９，１２}）を生成することが可能である。また、FAT-3がα-リ
ノレン酸（18:3Δ^{９，１２，１５}）を不飽和化して18:4Δ^{６，９，１２，１５}を
生成するという、哺乳動物における一般的な反応を生じうることも明らかになっ
た。FAT-3蛋白質は、20:1Δ^１１、20:2Δ^{１１，１４}、20:3Δ^{８，１１，１４}ま
たは20:3Δ^{１１，１４，１７}における活性は示さなかった。このため、センチュ
ウΔ^５-不飽和化酵素およびΔ^６-不飽和化酵素の基質特異性は特異的であり、重
複しないことが明らかにされた。

【０１２１】実施例13：ミドリムシΔ^８-不飽和化酵素に関する考察 これまでにクローニングされたどの遺伝子についても、Δ^８位での不飽和化は
報告されていない（Tocherら、Prog. Lipid Res. 37：73〜117、1998）。

【０１２２】 推定EFD1蛋白質は、FAT-3およびFAT-4といずれも33％のアミノ酸同一性を有し
（図9）、クローニングされたルリヂサΔ^６-不飽和化酵素との同一性は28％であ
った。最も高度な配列保存性が認められたのは、不飽和化酵素活性に重要なHis
ボックスモチーフにおいてであり、これは活性部位のオキソ二鉄（diiron-oxo）
成分として働くためである可能性が高い（Shanklinら、Biochemistry 33：12787
〜12794、1994）。FAT-3およびFAT-4に保持されているシトクロムb₅の必須残基
（Lederer、Biochimie 76：674〜692、1994）の大部分がEFD1蛋白質にも存在し
ている場合、配列保存性はまたN末端シトクロムb₅様ドメインににおいても明ら
かであった（図3）。

【０１２３】 酵母におけるEFD1遺伝子の発現を用いて、活性の特徴を調べた。Δ^１１位に二
重結合を有する3つの異なるC２０基質を不飽和化し（図4）、産物を分析したと
ころ、それぞれについて不飽和化がΔ^８位で生じたことが示された（図5）。ク
ローニングされたミドリムシ不飽和化酵素は代謝的に重要な基質に明らかな偏好
性を示し、20:2および20:3に対する偏好性は20:1よりも2倍以上高かった（Ulsam
erら、J. Cell Biol. 43：105〜114、1969）。EFD1が他のミクロソームの不飽和
化酵素と極めて類似しているにもかかわらず、Δ^５-不飽和化およびΔ^６-不飽和
化における基質の不活性に証明されるように、その活性は特殊であった（図12）
。

【０１２４】 Δ^８-不飽和化のためのC２０基質は、従属栄養的に増殖したミドリムシにおい
て入手されうる（図2）。典型的なΔ^６-不飽和化と競合して、20:2および20:3は
18:2および18:3の伸長によって産生されることから、同様の基質はまた哺乳動物
にもみられる（図1）。ラット肝臓ホモジネートを用いた標識化実験から、C１８
脂肪酸の伸長はそれと競合する不飽和化よりも5倍以上速いことが示されている
（Pawloskyら、J. Lipid Res. 33：1711〜1717、1992）。

【０１２５】 現在の理解に事実上含まれているC２０多価不飽和脂肪酸の生合成のΔ^６経路
とは、経路の流れを制御するための不飽和化と伸長の繰り返しに依ったものであ
る。伸長はしばしば非特異的であると考えられるが、不飽和化のほとんどは基質
の鎖長および脂肪酸の不飽和化パターンの双方に関して特異的である（Heinz、
植物における脂質代謝（Lipid Metabolism in Plants）、pp.33〜89、1993）。
しかし、哺乳動物組織（BernertおよびSprecher、Biochim. Biophys. Acta. 398
：354〜363、1975；Albertら、Lipids 14：498〜500、1979）およびセンチュウ
Δ^５-不飽和化酵素遺伝子を発現する酵母（図12）を用いた実験によるデータか
らは、Δ^５酵素が、Δ^８位ではなくΔ^１１位に二重結合をもつ脂肪酸を不飽和化
し、メチレン非断続性の20:3化合物および20:4化合物を有意な速度で産生するこ
とが示されている。Δ^８経路の場合、Δ^８-不飽和化は20:2基質および20:3基質
におけるΔ^５活性と競合して起こる。Δ^５酵素の乱交雑にかかわらず、哺乳動物
組織の脂質プロフィールにはΔ^５，１１（Heinz、植物における脂質代謝（Lipid
Metabolism in Plants）、pp.33〜89、1993；およびUlsamerら、J. Cell Biol.
43：105〜114、1969）不飽和化パターンを有する脂肪酸は含まれず、それらは
ミドリムシにおいても見られない。

【０１２６】 一つの説明として、一般的な基質のΔ^８-不飽和化は非常に速く起こるが、Δ⁵ -不飽和化の進行はそれよりも遅いため、Δ^５，１１産物はほとんど形成されな
いといえる。この説明を裏づけるように、酵母で発現した場合、同様に発現した
Δ^５-不飽和化酵素と比べてミドリムシΔ^８は非常に活性な不飽和化酵素である
と考えられる（図4）。ミドリムシ不飽和化酵素は、急速に増殖するミドリムシ
培養物の長鎖多価不飽和脂肪酸のすべてを担うだけの十分な活性を有する必要が
ある（図2）。これに対して、哺乳動物組織における既知のΔ^８-不飽和化の速度
は比較的遅い。Δ^６活性のない癌性組織において見かけの速度が最も高く、Δ^８ -不飽和化は、Δ^６活性を有する同等の正常組織のレベルのわずか17％のアラキ
ドン酸の産生を可能にする（Grammatikosら、Br. J. Cancer 70：219〜227、199
4）。

【０１２７】 または、膜におけるΔ^５，１１不飽和脂肪酸の欠乏は、Δ^８-不飽和化酵素が
これらの脂肪酸を不飽和化に利用すると仮定すれば説明されうる。Δ^８-不飽和
化がΔ^５活性に先行するという従来の決まり（図1）は、不飽和化反応が脂肪酸
の炭化水素鎖に沿って連続して進行するという観察に基づく。Δ^５-飽和がΔ^８-
不飽和化に先行するという逆の順序の不飽和化も主張されており（Takagi、J. C
hem. Bull. Japan 38：2055〜2057、1965）、哺乳動物の肝臓においては否定さ
れ（Schlenkら、Lipids 5：575〜577、1970）、重水素化基質を用いた神経膠腫
細胞における実験に基づいて、可能性の高い経路であると提唱されている（Cook
ら、J. Lipid Res. 32：1265〜1273、1991）。

【０１２８】 ミドリムシにおいては、Δ^８-不飽和化の産物である20:3Δ^{８，１１，１４}お
よび20:4Δ^{８，１１，１４，１７}は、膜に直接取り込まれることができ、または
アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸を産生するために、Δ^５位における不
飽和化に供されることができる（Hulanickaら、J. Biol. Chein. 239：2778〜27
87、1964）。さらなる伸長および不飽和化によって、いくつかのC２２多価不飽
和脂肪酸がもたらされる（図2）。哺乳動物では、産物がΔ^８活性またはΔ^６活
性のいずれに由来するかにかかわらず、類似の過程によってほとんどはアラキド
ン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸（22:6（Hwang、「食物
中の脂肪酸およびその健康への影響（Fatty Acids in Foods and Their Health
Implications）」、pp.545〜557、1992；BernertおよびSprecher、Biochim. Bio
phys. Acta 398：354〜363、1975；LeesおよびKorn、Biochemistry 5：1475〜14
81、1966；AlbertおよびConiglio、Biochim. Biophys. Acta 489：390〜396、19
77；Bardonら、Cancer Lett. 99：51〜58、1996；ならびにSprecherおよびLee、
Biochim. Biophys. Acta. 388：113〜125、1975）が産生されるが、いくつかの2
0:3はシリーズ1（series 1）エイコサノイド代謝調節因子へと直接代謝される（
Hwang、「食物中の脂肪酸およびその健康への影響（Fatty Acids in Foods and
Their Health Implidations）」、pp.545〜557、1992）。

【０１２９】 興味深いことに、Δ^８-不飽和化の代替経路は伸長段階から始まる。ミドリム
シにおいては、伸長は標準的な経路であり、これによってかなりの量の20:2（7.
4％）および20:3（1.4％）が産生される（図2）。Δ^６活性がほとんどまたは全
くない哺乳動物組織においては（Grammatikosら、Br. J. Cancer 70：219〜227
、1994）、これは必須脂肪酸18:2および必須脂肪酸18:3がそれぞれのC２０誘導
体に代謝される最初の段階と考えられる。最近、脂肪酸鎖伸長が脂肪酸生合成に
おける調節段階として作用することが新たに重要視されている（Garciaら、Lipi
ds 25：211〜215、1990；Sprecherら、Prostag. Leukot. Essent. Fatty Acids
52：99〜101、1995）。乳癌細胞は18:2よりも18:3を選択的に伸長させることが
でき、この伸長に続いてΔ^８-不飽和化が起こるという証拠（Bardonら、Cancer
Lett. 99：51〜58、1996）は、Δ^８-不飽和化がある種の癌細胞では重要な役割
を果たしうることが示される。

【０１３０】 Δ^８-不飽和化酵素遺伝子の同定およびクローニングによって、C２０多価不飽
和脂肪酸の生合成のための代替経路の試験が可能になり、Δ^８-不飽和化の予想
される機構に関する洞察も得られると考えられる。哺乳動物においては、この代
替経路の作用は、多価不飽和脂肪酸に対する需要が律速段階であるΔ^６-不飽和
化を介した供給を上回るような、特殊化された組織に限定されると思われる。Δ ^６ -不飽和化がわずかであるか存在しない場合には、この経路は非常に重要であ
りうる。脂肪酸不飽和化酵素の代謝は、形質転換株（Grammatikosら、Ann. N. Y
Acad. Sci. 745：92〜105、1994）および非形質転換株（Rosenthal、Prog. Lip
id Res. 26：87〜124、1987）の双方の多くの細胞株で乱されることから、Δ^８
活性はΔ^６活性がない場合にのみ現れることができる。一方、細胞の腫瘍化に伴
ってΔ^８活性が出現または上昇することができる。Δ^８遺伝子の単離および試験
、ならびにその基質特異性の分析により、哺乳動物の正常組織および癌性組織の
双方におけるΔ^８活性の役割の決定が容易になると思われる。

【０１３１】実施例14：センチュウΔ^５-不飽和化酵素に関する考察 本実施例において、本発明者らは、Δ^５-不飽和化酵素遺伝子およびΔ^６-不飽
和化酵素遺伝子を含むことが記載されている染色体IVの4.88位に位置するセンチ
ュウ（C. elegans）ゲノムの領域について記載する。この2つの遺伝子によって
コードされるアミノ酸配列は互いに46％の同一性をもち、それぞれが電子伝達体
であるシトクロムb₅に典型的なN末端ヘム結合ドメイン、および3つのヒスチジン
ボックスを含む。両方の遺伝子が、9位以下の炭素での二重結合挿入に関与する
ミクロソーム性不飽和化酵素に特有なことがこれまでに示されている、第3のHis
ボックスの共通配列（QXXHH；配列番号：11）を含む。

【０１３２】 このような類似性があるにもかかわらず、これら2つのミクロソーム性不飽和
化酵素が示す基質特異性は全く重複しない。酵母サッカロミセス・セレビシエ（
Saccharomyces cerevisiae）において過剰発現させた場合、センチュウΔ^６-不
飽和化酵素（FAT-3）は、リノール酸およびγ-リノレン酸という2種類のC１８基
質に特異的に作用し、常にメチレン断続性パターン（3つの炭素ごとに1つの二重
結合が存在）で不飽和化を行う。哺乳動物Δ^６-不飽和化酵素系も同様に、メチ
レン断続性パターンにおいて二重結合を厳密に挿入し、C２０基質に対する活性
をもたないことが示されている（Schmitzら、Lipids 12：307〜313、1997）。こ
れに対して、センチュウΔ^５-不飽和化酵素（FAT-4）は酵母の内因性18:1脂肪酸
と同様多くのC２０基質にも作用し、メチレン非断続性パターンにおいて二重結
合を挿入することができる。

【０１３３】 20:2Δ^５，１１、20:3Δ^{５，１１，１４}および18:2Δ^５，１１などのメチレン
非断続性脂肪酸は、脂肪欠乏食で育てたラットに^１４C標識基質を与えることに
より、哺乳動物細胞で検出される（Ulmanら、Biochem. Biophys. Acta 248：186
〜197、1971）。しかし、これらは、プロスタグランジンなどのシグナル伝達分
子に対する前駆体となることが示されておらず、脂肪欠乏食により前条件付け（
preconditioned）されていないラットの組織脂質中にも検出されないため、「行
き止まりの（dead end）」代謝産物と考えられる（本発明者らもまたセンチュウ
脂質抽出物においてこれらの脂肪酸を検出しなかった）。

【０１３４】 センチュウΔ^５-不飽和化酵素遺伝子を発現する酵母において、転換された基
質の量は代謝的に意味のある基質20:3Δ^{８，１１，１４}で最も多かった（図13）
。不飽和化された20:2Δ^{１１，１４}および20:3Δ^{１１，１４，１７}の量は、不飽
和化された通常の基質の量の半分以下だった。これは哺乳動物肝臓のミクロソー
ム抽出物における不飽和化の速度と一致しており、標識化20:2Δ^{１１，１４}の20
:3Δ^{５，１１，１４}への転換速度は、標識化20:3Δ^{８，１１，１４}の20:4Δ^{５， ８，１１，１４} への転換速度の41％である（Bernetら、Biochem. Biophys. Acta
398：354〜313、1975）。

【０１３５】 センチュウfat-3遺伝子およびfat-4遺伝子は1つの遺伝子クラスター中に同じ5
'→3'方向で存在する。しかし、センチュウにおけるこの種の他の遺伝子クラス
ターとは異なり、下流のfat-3遺伝子はSL2とトランススプライシングしないため
、従って上流のfat-4遺伝子と同時転写される可能性は低いと思われる。この2つ
の遺伝子は太古の遺伝子重複事象の結果として互いに隣接して位置できたと考え
られる。cDNAコード配列全体を通じてのDNA配列の同一性は54％である；しかし
、これらの遺伝子は共通のイントロン／エクソン境界を全く持たない（図8）。

【０１３６】 これは、動物由来の初めて開示されたΔ^５-不飽和化酵素遺伝子の配列である
。センチュウΔ^５-不飽和化酵素の配列は、すでに報告されている細菌および真
菌のΔ^５-不飽和化酵素とは大きく隔たっており、該動物性配列は、ヒトおよび
他の哺乳動物由来の不飽和化酵素をコードする配列の検索を容易にするはずであ
る。Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^６-不飽和化酵素はいずれもヒトにおいて重要な
調節酵素である。それらは、食物性必須脂肪酸であるリノール酸およびリノレン
酸から、ホルモン様エイコサノイド分子を合成するための前駆体を産生する経路
における決定的な段階にかかわっている。これらの不飽和化酵素の活性はホルモ
ン的制御下および栄養的制御下にあることが示されているが、制御機構は未だ未
知である。

【０１３７】 糖尿病などのある種の疾患はΔ^５-不飽和化酵素活性の低下をもたらし、一方
、固形肝癌由来の腹水腫瘍から単離したHTC細胞ではΔ^５-不飽和化酵素活性の上
昇が認められる。センチュウでは変異および逆遺伝学のツールを用いることがで
き、細胞生物学および発生生物学の知見も増加しつつあることから、センチュウ
は発生、生殖および動物のその他の細胞段階における多価不飽和脂肪酸およびそ
の代謝産物の役割を研究する上で魅力的な系となっている。

【０１３８】実施例15：本発明のΔ^５-不飽和化酵素遺伝子およびΔ^８-不飽和化酵素遺伝子に より形質転換された植物細胞 本明細書に記載した方法を用いることにより、C２０多価不飽和脂肪酸の量が
増大した植物を作出する目的で、本発明のΔ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和
化酵素を植物中にクローニングして発現させることができる。このような植物は
、容易に収穫可能で食用に適した形態での、これらの重要な脂肪酸の安価で便利
な供給源を提供する。

【０１３９】 例えば、本発明のΔ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素を、トウモロコ
シ、コムギ、ジャガイモ、トマト、ヤマノイモ（yams）、リンゴ、ナシなどの一
般的な食用作物、またはヒマワリ、ナタネ、ダイズもしくはラッカセイ植物体な
どの脂肪種子植物中にクローニングすることができる。得られる植物は、C２０
多価不飽和脂肪酸の形成を触媒すると思われる適切な酵素を発現すると考えられ
る。脂肪種子植物の場合には、種子油はC２０多価不飽和脂肪酸の豊富な供給源
になると考えられる。

【０１４０】 Δ^５-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化酵素遺伝子の宿主植物細胞におけるク
ローニングおよび発現は個別に行ってもよく、または一緒に行ってもよい。対応
する不飽和化酵素を、プロモーター、エンハンサーおよび3'終止配列などの種々
の異なる制御配列を用いて発現させることが可能である。これらの制御配列は、
それぞれの不飽和化酵素の発現を個別に制御するために用いられうる。例えば、
Δ^５-不飽和化酵素を強力なプロモーターの制御下におかれるようにクローニン
グでき、Δ^８-不飽和化酵素が弱いプロモーターの制御下におかれるようにクロ
ーニングできることにより、結果としてΔ^５-不飽和化酵素をΔ^８-不飽和化酵素
よりも多く発現するトランスジェニック植物が得られる。さらに、誘導物質、リ
プレッサー、抑制解除物質（de-repressor）または阻害物質などの適切な調節剤
への植物細胞の曝露によって、1つまたは複数の関心対象の不飽和化酵素遺伝子
を活性化されるプロモーターへ動作可能的に結合させることで、発現を制御する
こともできる。このような調節については前述で考察している。または、第1の
遺伝子の発現を、第2の遺伝子の発現を誘導または抑制解除する誘導物質または
抑制解除物質分子の発現と連結することにより、隣接していない遺伝子の発現を
協調させることもできる。

【０１４１】 本発明の遺伝子を、植物（例えば、アグロバクテリウムを介したT-DNA導入に
よる）または動物（例えば、アデノウイルスベクターなどの広宿主域レトロウイ
ルスの使用による）のゲノム中に組み込み、本発明のΔ^５-不飽和化酵素および
Δ^８-不飽和化酵素をゲノムの一部として発現させることができる。トランスジ
ェニック植物については、導入遺伝子（Δ^５および／またはΔ^８）の宿主細胞ゲ
ノムへの組み込みをもたらすと考えられるT-DNAベクターを用いてもよい。

【０１４２】 例えば、アラビドプシス（Arabidopsis）などの植物におけるΔ^５-不飽和化酵
素およびΔ^８-不飽和化酵素の発現は、それぞれの不飽和化酵素のcDNAを植物に
導入するための植物形質転換ベクター構築によって達成されうる。ベクターは、
不飽和化酵素蛋白質が種子成長中に発現されるように組織特異的プロモーターを
含むことができる。種子特異的プロモーターの例には、ファゼオリンに対するプ
ロモーター（van der GeestおよびHall、Plant Mol. Biol. 32：579〜88、1996
）またはナピン（napin）に対するプロモーター（Stalbergら、Plant Mol. Biol
. 23：671〜83、1993）が含まれる。用いられうるその他の種子特異的プロモー
ターは、アラビドプシス・ゲノムのゲノムBACクローンT24A18（遺伝子座ATT24A1
8.（1999）45980bp シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）DNA 第4染色体、
アクセッション番号AL035680、NID g4490701）上に位置するものである。これら
のプロモーターはアラビドプシスにおける種子貯蔵蛋白質の発現を調節する。（
Parcyら、Plant Cell 6：1567〜1582、1994）に記載されているもののような、
種子において遺伝子を特異的に発現させるその他のプロモーターも用いられうる
。その後、不飽和化酵素コード配列およびプロモーター配列を含む構築物を、pA
RT27（Gleave、Plant Mol. Biol. 20：1203〜1207、1992）、pGPTV（Beckerら、
Plant Mol. Biol. 20：1195〜7、1992）またはpJIT119（Guerineauら、Plant Mo
l. Biol. 15：127〜136、1992）に類似した標準的な植物形質転換T-DNAベクター
に移行させることができる。2種類の構築物、すなわち一方がΔ^８-不飽和化酵素
をコードし、もう一方がΔ^５-不飽和化酵素をコードする構築物で植物を形質転
換する場合には、二重形質転換体のみが再生するように2つの異なる選抜マーカ
ーを選択することが好ましい。例えば、カナマイシン（nptII）遺伝子を含むよ
うにΔ^５-不飽和化酵素を有するベクターを構築し、フォスフィノスリシン（bar
）遺伝子を含むようにΔ^８-不飽和化酵素を有するベクターを構築することがで
きる。その後、カナマイシンおよびフォスフィノスリシンを含む培地で形質転換
体を選抜する。アグロバクテリウムを介した減圧浸潤法（Katavicら、Mol. Gen.
Genet. 245：363〜70、1994）またはそのフローラルディップ変法（Cloughおよ
びBent、Plant J. 16：735〜43、1998）によって、アラビドプシスの形質転換を
容易に行うことができるが、いくつかの他の方法もまた一般に用いられている。
トランスジェニック子孫は、カナマイシンもしくはフォスフィノスリシンのいず
れかまたはその両方などの 、適切な抗生物質または除草剤を用いた選抜によって同定されると考えられる。
Δ^８構築物およびΔ^５構築物は異なる選抜マーカーを用いているため、二重形質
転換体は容易に単離される。トランスジェニック選抜で生き残った植物を成熟す
るまで育成し、種子を収集する。脂肪酸メチルエステルの単離およびその後の脂
肪酸組成を決定するためのガスクロマトグラフィーによって、形質転換植物の種
子を分析する。

【０１４３】 Δ^８-不飽和化酵素のみを発現する植物は、アラビドプシス種子に天然に存在
する20:1Δ^１１脂肪酸を20:2Δ^８，１１へと不飽和化すると考えられる。さらに
、両方の不飽和化酵素により二重形質転換された植物から収穫した種子は、Δ^５ -不飽和化酵素の発現の結果、Δ^８-不飽和化酵素植物の20:2Δ^８，１１産物を20
:3Δ^{５，８，１１}に変換すると考えられる。これらの変化は脂肪酸メチルエステ
ルの分析によって容易に検出されうると考えられる。

【０１４４】実施例16：本発明のΔ^５-不飽和化酵素遺伝子およびΔ^８-不飽和化酵素遺伝子に よる形質転換がなされた酵母細胞 ミドリムシΔ^８-不飽和化酵素を含むpJW541（WallisおよびBrowse、Arch. Bio
chem. Biophys. 365：307〜316、1999）のcDNA部分を、制限酵素EcoRIおよびSpe
Iを用いて該プラスミドから切り出した。挿入物を表す精製されたDNA断片を、適
合性のある付着末端を得るためにEcoRI消化およびNheI消化により調製された酵
母発現ベクターpYX232（R&D Systems, Inc.）に連結した（プラスミドpYX232は
トリプトファンに対する原栄養性（TRP1変異）を酵母に付与するマーカーを有し
、挿入DNAの構成性発現のためのトリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）プロモー
ターを用いる）。得られたプラスミドpYX232-541を、サッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）の、ウラシルに対する原栄養性を酵母に付与す
るΔ⁵-不飽和化酵素（pYFAT4；WattsおよびBrowse、Arch. Biochem. Biophys. 3
62：175〜182、1999）プラスミドをすでに有している株に、酢酸リチウム形質転
換法（Invitrogen）を用いて導入した。ウラシル原栄養性およびトリプトファン
原栄養性に関して形質転換体の同時選抜を行った。形質転換後に生じた選択コロ
ニーを、ウラシルおよびトリプトファンの両方を含まない酵母最小培地に播種し
た。

【０１４５】 活性の分析に関しては、ナトリウム塩として提供された3種類の脂肪酸基質の
うち1つを別々の培養物に対して、記載の通りに添加した（WallisおよびBrowse
、Arch. Biochem. Biophys. 365：307〜316、1999）。28℃で一晩培養した後、
培養物を遠心分離によって回収し、洗浄した。ミケル（Miquel）およびブラウズ
（Browse）、J. Biol. Chem. 267：1502〜1509、1992に記載された標準的な方法
を用いて、脂肪酸メチルエステルを調製した。

【０１４６】 ガスクロマトグラフィーによる分析から、各基質が2回不飽和化されたことが
示された。3種類の基質の取り込みには差がみられ、他の実験で示された通り（W
allisおよびBrowse、Arch. Biochem. Biophys. 365：307〜316、1999およびWatt
sおよびBrowse、Arch. Biochem. Biophys. 362：175〜182、1999）、不飽和度の
高い基質ほど細胞の脂肪酸組成物の主要な部分を占めた。不飽和部位が3つある
基質20:3Δ^{１１，１４，１７}についてはC２０脂肪酸が全細胞脂肪酸の37％を占
め、20:2Δ^{１１，１４}ではC２０脂肪酸レベルは21％であり、20:1Δ^１１ではC２
０脂肪酸レベルは13％にしか達しなかった。しかし、不飽和化酵素の活性は3種
類の基質すべてに対して実質的に同一であった。70％〜72％の間の基質は転換さ
れず、17％または18％は一方の酵素のみによる単一の不飽和化を受けた。しかし
、各基質において、11％〜13％の間の基質は、共同作用する両方の酵素によって
不飽和化され、供給した基質の分子よりも多い、2つの二重結合を持つ脂肪酸が
生成された。

【０１４７】

【表２】 ＊細胞の脂肪酸全体に占める質量％ ＃取り込まれたC₂₀脂肪酸の質量％

【０１４８】 前述の態様および実施例は例として提供されたものに過ぎず、決して特許請求
される本発明の範囲を制限するためのものではない。

【０１４９】 本発明の範囲または精神を逸脱することなく、本明細書に記載された発明が手
順および詳細の点で改変されうることは、当業者には明らかであると考えられる
。本発明者らはこのような改変のすべてを特許請求する。

【０１５０】 本明細書で参照した参考文献および刊行物は参照として本明細書に組み入れら
れる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 C１８脂肪酸のΔ^６-不飽和化から始まり、続いてC２伸長が起
こり、その後さらに不飽和化および伸長が起こる、C２０多価不飽和脂肪酸の合
成のための共通経路を示す。

【図１Ｂ】 C１８脂肪酸のC２０脂肪酸への伸長から始まり、続いてΔ^８-
不飽和化およびΔ^５位での第2の不飽和化が起こる代替経路を示す。

【図１Ｃ】 Δ^５-不飽和化酵素、Δ^６-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化
酵素を用いてアラキドン酸およびEPAを産生する、多価不飽和脂肪酸の合成の代
替経路を示す。

【図２】 シュークロスを炭素源として、暗所で（従属栄養的に）育成した
ミドリムシ（E. gracilis）由来の脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフ
ィー（GC）分析を示す。既知の標準との保持時間の比較によって、脂肪酸を同定
した。重要なピークには番号を付し、保持時間および総脂肪酸に占める比率とと
もに示した。

【図３】 ミドリムシΔ^８-不飽和化酵素蛋白質（EFD1）とセンチュウ（C.
elegans）の不飽和化酵素の間のアミノ酸配列の類似性を示す。EFD1遺伝子の推
定アミノ酸配列は、センチュウΔ^６（FAT-3）-不飽和化酵素およびΔ^５（FAT-4
）-不飽和化酵素との類似性を示す（Napierら、Biochem. J. 330：611〜614、19
98）。この類似性は機能保存領域で最も高い。N末端領域にはシトクロムb₅様ド
メイン（Lederer、Biochimie 76：674〜692、1994）を形成するアミノ酸が示さ
れる。同定された他の膜不飽和化酵素には、下線を施した文字で示されたHis-ボ
ックスモチーフが存在する（Napierら、Biochem. J. 330：611〜614、1998；Mic
haelsonら、J. Biol. Chem. 273：19055〜19059、1998；ならびにShanklinおよ
びCahoon、Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48：611〜641、1998
）。

【図４】 組換え酵母由来の脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィ
ーの結果を示す。対照pYES2、またはミドリムシΔ^８-不飽和化酵素（EFD1）遺伝
子を発現するpYES2-541のいずれかを含む酵母の培養物に、表記のC２０脂肪酸を
添加した。対照株は外因性脂肪酸を不飽和化しなかった。実験株では、不飽和化
ピークを矢印で示す。

【図５】 不飽和化産物の質量分析（MS）の結果を示す。EFD1不飽和化産物
のDMOX誘導体をGC-質量分析法によって分析した。各脂肪酸の分子イオンは、二
重結合の挿入により予想された通り、供給した基質よりも2 a.m.u.（原子質量単
位）小さかった。Δ^８位における不飽和化は、括弧によって示した各産物の特徴
的なm／z 182およびm／z 194のピークによって確認された。

【図６Ａ】 センチュウ（Caenorhabditis elegans）由来の脂肪酸Δ^５-不
飽和化酵素の一次アミノ酸配列を示す。

【図６Ｂ】 センチュウ由来の脂肪酸Δ^５-不飽和化酵素をコードするORF（
オープンリーディングフレーム）を含むヌクレオチド配列を示す。

【図７Ａ】 原生生物ミドリムシ（Euglena gracilis）由来の脂肪酸Δ^８-
不飽和化酵素の一次アミノ酸配列を示す。

【図７Ｂ】 原生生物ミドリムシ由来のΔ^８-不飽和化酵素をコードするORF
を含むヌクレオチド配列を示している。

【図８】 センチュウ（C. elegans）Δ^５-不飽和化酵素遺伝子およびΔ^６-
不飽和化酵素遺伝子の構造のいくつかの特徴を示す。上方に遺伝子産物T13F2.1
およびW08D2.4の相対位置をそれぞれのコスミド上に示した。下方に、SL1スプラ
イス部位、シトクロムb₅（cyt b₅）のヘム結合モチーフおよび3つの保存的ヒス
チジンボックスモチーフ（HBX）をコードする配列の部位を示すT13F2.1（fat-4
）およびW08D2.4（fat-3）のエクソン構造を示している。

【図９】 ルリヂサ（borage）Δ^６-不飽和化酵素（bord6）、センチュウFA
T-3（fat3）、センチュウFAT-4（fat4）およびモルティエラ・アルピナ（Mortie
rella alpina）Δ^５-（mord5）不飽和化酵素の推定アミノ酸配列の比較を示す。
同一または保存的な残基には蔭をつけ、保存的なHPGGヘム結合ドメインおよび保
存的なヒスチジンボックスには下線を施した。略記：bord6＝ルリヂサ（Borago
officinalis）Δ^６-不飽和化酵素（GenBankアクセッション番号U79010）；fat4
＝センチュウFAT-4不飽和化酵素；fat3＝cDNA配列に基づいて編集され、アミノ
酸38位〜67位が除去されたW08D2.4のセンチュウΔ^６-不飽和化酵素配列（GenBan
kアクセッション番号Z70271）；mord5＝モルティエラ・アルピナΔ^５-不飽和化
酵素（GenBankアクセッション番号AF054824）。

【図１０Ａ〜１０Ｃ】 ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）による、
トランスジェニック酵母におけるアラキドン酸の同定を示す。0.2mMジホモ-γ-
リノレン酸を添加した誘導条件（2％ガラクトース）下で16時間育成したサッカ
ロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）の総脂質の脂肪酸メチルエステルをGC-
MSによって分析した。（A）（空）ベクターpYES2により形質転換された酵母。（
B）fat-4を有するpYES2ベクターにより形質転換された酵母。共通ピークは16:0
（11.19分〜11.12分）、16:1（11.38分）、18:0（13.07分〜13.08分）、18:1（1
3.29分）、20:3（11.64分〜11.65分）と同定された。新規ピークはアラキドン酸
（14.49分）および18:2（12.91分）である。（C）14.49分に溶出するピークの質
量スペクトル。このスペクトルはメチル-アラキドン酸基準試料のものと区別不
能である。

【図１１Ａおよび１１Ｂ】 Δ^８-二重結合をもたない基質由来の新規不飽
和化産物を示す。（A）20:2Δ^{１１，１４}（14.81分）が添加された、fat-4 Δ^５ -不飽和化酵素を発現する酵母由来の脂肪酸メチルエステルの部分GC図面。この
基質の不飽和化産物は14.62分において溶出し、20:3Δ^{５，１１，１４}と同定さ
れた。（B）20:3Δ^{１１，１４，１７}（14.87分）が添加された、fat-4 Δ^５-不
飽和化酵素を発現する酵母の部分GC図面。この基質の不飽和化産物は14.69分に
おいて溶出し、20:4Δ^{５，１１，１４，１７}と同定された。

【図１２】 センチュウΔ^５-不飽和化酵素およびΔ^６-不飽和化酵素の基質
特異性を比較した表である。

【図１３】 対照構築物pYES、およびミドリムシΔ^８-不飽和化酵素遺伝子E
GD1を含むクローンであるpYES-541による形質転換を受けた酵母株による脂肪酸
の取り込みおよび不飽和化を比較した表である。対照ベクター（pYES）を含む、
またはEFD1を発現する（pYES-541）サッカロミセス・セレビシエ株を、表記の脂
肪酸の存在下で培養した。この培養物を収集、洗浄し、全細胞からメチルエステ
ルを調製してGCによって分析した。総脂肪酸メチルエステルに占める重量％を示
している。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年２月１９日（２００２．２．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５０

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１５０】 本明細書で参照した参考文献および刊行物は参照として本明細書に組み入れら
れる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１５１】 本研究は、NRICGP契約番号95-37301-2287および97-35301-4426のもと、米国農 務省からの基金により支援された。政府は本発明において一定の権利を有すると 考えられる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 C１８脂肪酸のΔ^６-不飽和化から始まり、続いてC２伸長が起
こり、その後さらに不飽和化および伸長が起こる、C２０多価不飽和脂肪酸の合
成のための共通経路を示す。

【図１Ｂ】 C１８脂肪酸のC２０脂肪酸への伸長から始まり、続いてΔ^８-
不飽和化およびΔ^５位での第2の不飽和化が起こる代替経路を示す。

【図１Ｃ】 Δ^５-不飽和化酵素、Δ^６-不飽和化酵素およびΔ^８-不飽和化
酵素を用いてアラキドン酸およびEPAを産生する、多価不飽和脂肪酸の合成の代
替経路を示す。

【図２】 シュークロスを炭素源として、暗所で（従属栄養的に）育成した ミドリムシ（E. gracilis）由来の脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフ
ィー（GC）分析を示す。既知の標準との保持時間の比較によって、脂肪酸を同定 した。重要なピークには番号を付し、保持時間および総脂肪酸に占める比率とと もに示した。

【図３】 ミドリムシΔ^８-不飽和化酵素蛋白質（EFD1）とセンチュウ（C. elegans）の不飽和化酵素の間のアミノ酸配列の類似性を示す。EFD1遺伝子の推
定アミノ酸配列は、センチュウΔ^６（FAT-3）-不飽和化酵素およびΔ^５（FAT-4
）-不飽和化酵素との類似性を示す（Napierら、Biochem. J. 330：611〜614、19 98）。この類似性は機能保存領域で最も高い。N末端領域にはシトクロムb₅様ド
メイン（Lederer、Biochimie 76：674〜692、1994）を形成するアミノ酸が示さ
れる。同定された他の膜不飽和化酵素には、下線を施した文字で示されたHis-ボ ックスモチーフが存在する（Napierら、Biochem. J. 330：611〜614、1998；Mic haelsonら、J. Biol. Chem. 273：19055〜19059、1998；ならびにShanklinおよ
びCahoon、Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48：611〜641、1998
）。

【図４】 組換え酵母由来の脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィ ーの結果を示す。対照pYES2、またはミドリムシΔ^８-不飽和化酵素（EFD1）遺伝 子を発現するpYES2-541のいずれかを含む酵母の培養物に、表記のC２０脂肪酸を 添加した。対照株は外因性脂肪酸を不飽和化しなかった。実験株では、不飽和化 ピークを矢印で示す。

【図５】 不飽和化産物の質量分析（MS）の結果を示す。EFD1不飽和化産物 のDMOX誘導体をGC-質量分析法によって分析した。各脂肪酸の分子イオンは、二
重結合の挿入により予想された通り、供給した基質よりも2 a.m.u.（原子質量単 位）小さかった。Δ^８位における不飽和化は、括弧によって示した各産物の特徴 的なm／z 182およびm／z 194のピークによって確認された。

【図６Ａ】 センチュウ（Caenorhabditis elegans）由来の脂肪酸Δ^５-不
飽和化酵素の一次アミノ酸配列を示す。

【図６Ｂ】 センチュウ由来の脂肪酸Δ^５-不飽和化酵素をコードするORF（ オープンリーディングフレーム）を含むヌクレオチド配列を示す。

【図７Ａ】 原生生物ミドリムシ（Euglena gracilis）由来の脂肪酸Δ^８-
不飽和化酵素の一次アミノ酸配列を示す。

【図７Ｂ】 原生生物ミドリムシ由来のΔ^８-不飽和化酵素をコードするORF を含むヌクレオチド配列を示している。

【図８】 センチュウ（C. elegans）Δ^５-不飽和化酵素遺伝子およびΔ^６- 不飽和化酵素遺伝子の構造のいくつかの特徴を示す。上方に遺伝子産物T13F2.1
およびW08D2.4の相対位置をそれぞれのコスミド上に示した。下方に、SL1スプラ イス部位、シトクロムb₅（cyt b₅）のヘム結合モチーフおよび3つの保存的ヒス
チジンボックスモチーフ（HBX）をコードする配列の部位を示すT13F2.1（fat-4
）およびW08D2.4（fat-3）のエクソン構造を示している。

【図９】 ルリヂサ（borage）Δ^６-不飽和化酵素（bord6）、センチュウFA T-3（fat3）、センチュウFAT-4（fat4）およびモルティエラ・アルピナ（Mortie rella alpina）Δ^５-（mord5）不飽和化酵素の推定アミノ酸配列の比較を示す。 同一または保存的な残基には蔭をつけ、保存的なHPGGヘム結合ドメインおよび保 存的なヒスチジンボックスには下線を施した。略記：bord6＝ルリヂサ（Borago officinalis）Δ^６-不飽和化酵素（GenBankアクセッション番号U79010）；fat4
＝センチュウFAT-4不飽和化酵素；fat3＝cDNA配列に基づいて編集され、アミノ
酸38位〜67位が除去されたW08D2.4のセンチュウΔ^６-不飽和化酵素配列（GenBan kアクセッション番号Z70271）；mord5＝モルティエラ・アルピナΔ^５-不飽和化
酵素（GenBankアクセッション番号AF054824）。

【図１０Ａ〜１０Ｃ】 ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）による、
トランスジェニック酵母におけるアラキドン酸の同定を示す。0.2mMジホモ-γ-
リノレン酸を添加した誘導条件（2％ガラクトース）下で16時間育成したサッカ
ロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）の総脂質の脂肪酸メチルエステルをGC- MSによって分析した。（A）（空）ベクターpYES2により形質転換された酵母。（ B）fat-4を有するpYES2ベクターにより形質転換された酵母。共通ピークは16:0
（11.19分〜11.12分）、16:1（11.38分）、18:0（13.07分〜13.08分）、18:1（1 3.29分）、20:3（11.64分〜11.65分）と同定された。新規ピークはアラキドン酸 （14.49分）および18:2（12.91分）である。（C）14.49分に溶出するピークの質 量スペクトル。このスペクトルはメチル-アラキドン酸基準試料のものと区別不
能である。

【図１１Ａおよび１１Ｂ】 Δ^８-二重結合をもたない基質由来の新規不飽
和化産物を示す。（A）20:2Δ^{１１，１４}（14.81分）が添加された、fat-4 Δ^５ -不飽和化酵素を発現する酵母由来の脂肪酸メチルエステルの部分GC図面。この
基質の不飽和化産物は14.62分において溶出し、20:3Δ^{５，１１，１４}と同定さ
れた。（B）20:3Δ^{１１，１４，１７}（14.87分）が添加された、fat-4 Δ^５-不
飽和化酵素を発現する酵母の部分GC図面。この基質の不飽和化産物は14.69分に
おいて溶出し、20:4Δ^{５，１１，１４，１７}と同定された。

【図１２】 センチュウΔ^５-不飽和化酵素およびΔ^６-不飽和化酵素の基質 特異性を比較した表である。

【図１３】 対照構築物pYES、およびミドリムシΔ^８-不飽和化酵素遺伝子E GD1を含むクローンであるpYES-541による形質転換を受けた酵母株による脂肪酸
の取り込みおよび不飽和化を比較した表である。対照ベクター（pYES）を含む、 またはEFD1を発現する（pYES-541）サッカロミセス・セレビシエ株を、表記の脂 肪酸の存在下で培養した。この培養物を収集、洗浄し、全細胞からメチルエステ ルを調製してGCによって分析した。総脂肪酸メチルエステルに占める重量％を示 している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｂ０６５ 1/21 9/02 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/64 9/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ワッツ ジェニファー エル． アメリカ合衆国 アイダホ州 モスコー ノース ヴァン ビューレン ストリート 304 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 4B024 AA05 BA08 CA04 CA09 CA12 DA01 DA02 DA12 HA14 HA17 4B050 CC03 DD11 LL02 LL05 4B063 QA01 QA11 QQ08 QQ09 QQ22 QQ43 QQ73 QR02 QR32 QR40 QR47 QR55 QR62 QS02 QS34 4B064 AD88 BH07 CA19 CB14 CD07 DA10 4B065 AA80X AA86Y AB01 CA28

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不飽和化酵素（desaturase）活性を有する精製された蛋白質
   であって、以下のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む蛋
   白質： （a）配列番号：4に示されたアミノ酸配列； （b）（a）で規定されたものとは1つまたは複数の保存的アミノ酸置換の点で
   異なるアミノ酸配列；および （c）（a）または（b）で規定された配列と、少なくとも60％の配列同一性を
   有するアミノ酸配列。
2. 【請求項２】 請求項1記載の蛋白質をコードする、単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 配列番号：2に示された配列を含む、請求項2記載の単離され
   た核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項2記載の核酸配列と動作可能的に結合した制御配列を
   含む、組換え核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項4記載の組換え核酸分子により形質転換された細胞。
6. 【請求項６】 請求項4記載の組換え核酸分子、ならびに、 （a）配列番号：1に示された核酸分子；および （b）（a）に示された核酸分子と60％の配列同一性を有する核酸分子； からなる群より選択される核酸分子により、形質転換された細胞。
7. 【請求項７】 植物細胞である、請求項5記載の細胞。
8. 【請求項８】 （a）配列番号：3に示された配列およびその断片を含むプロ
   ーブである核酸プローブと、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし；
   且つ （b）不飽和化酵素活性を有する蛋白質をコードする； 単離された核酸分子。
9. 【請求項９】 請求項8記載の核酸分子によってコードされる不飽和化酵素
   。
10. 【請求項１０】 請求項8記載の核酸分子と動作可能的に結合したプロモー
    ター配列を含む、組換え核酸分子。
11. 【請求項１１】 請求項10記載の組換え核酸分子により形質転換された細胞
    。
12. 【請求項１２】 植物、細菌、昆虫、真菌および哺乳動物からなる群より選
    択される、請求項11記載の形質転換細胞を含むトランスジェニック生物。
13. 【請求項１３】 請求項9記載の不飽和化酵素と結合する特異的結合剤（spe
    cific binding agent）。
14. 【請求項１４】 （a）配列番号：3に示された核酸配列と少なくとも60％の
    配列同一性を有し；且つ （b）不飽和化酵素活性を有する蛋白質をコードする； 単離された核酸分子。
15. 【請求項１５】 核酸配列を同定する方法であって、以下の段階を含む方法
    ： （a）核酸配列を、配列番号：3に示された配列の少なくとも10個の連続したヌ
    クレオチドとハイブリダイズさせる段階；および （b）核酸配列を、不飽和化酵素をコードするものとして同定する段階。
16. 【請求項１６】 請求項15記載の方法によって同定される核酸分子。
17. 【請求項１７】 核酸配列のハイブリダイゼーションが低ストリンジェント
    な条件下で行われる、請求項15記載の方法。
18. 【請求項１８】 請求項15記載の核酸分子によってコードされる不飽和化酵
    素。
19. 【請求項１９】 請求項18記載の不飽和化酵素と結合する特異的結合剤。
20. 【請求項２０】 段階（a）がPCR反応において行われる、請求項15記載の方
    法。
21. 【請求項２１】 段階（a）がライブラリーのスクリーニングの際に行われ
    る、請求項15記載の方法。
22. 【請求項２２】 脂肪酸において2つの炭素間に二重結合を形成する方法で
    あって、以下の段階を含む方法； 脂肪酸を、少なくとも1つの精製された請求項17記載の不飽和化酵素と接触さ
    せる段階；および 不飽和化酵素に2つの炭素間の二重結合を形成させる段階。
23. 【請求項２３】 不飽和化酵素がトランスジェニック生物において発現し、
    二重結合の形成がインビボで起こる、請求項22記載の方法。
24. 【請求項２４】 不飽和化酵素が真核生物および原核生物からなる群より選
    択される生物において発現する、請求項23記載の方法。
25. 【請求項２５】 不飽和化酵素がインビトロで発現し、二重結合の形成がイ
    ンビトロで起こる、請求項22記載の方法。
26. 【請求項２６】 さらに第2の不飽和化酵素の発現を含む、請求項22記載の
    方法。
27. 【請求項２７】 第2の不飽和化酵素が、以下のアミノ酸配列からなる群よ
    り選択される、請求項26記載の方法： （a）配列番号：2に示されたアミノ酸配列； （b）（a）に規定されたものとは1つまたは複数の保存的アミノ酸置換の点で
    異なるアミノ酸配列；および （c）（a）または（b）に規定された配列と少なくとも60％の配列同一性を有
    するアミノ酸配列。