JP2002526100A - アルファ−２／デルタ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、多くのカルシウムチャンネルにサブユニットとして存在する、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコードする３つの新規遺伝子およびこれに由来するポリペプチドに関する。本発明はまた、遺伝子の遺伝子欠損、ポリペプチドの細胞内における局在の検出、化学データベースを伴っての結合アッセイ、遺伝子治療における、新規遺伝子およびポリペプチドの使用方法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、電位感受性のカルシウムチャンネルのサブユニットであるアルファ
−２−デルタ（α２δ）タンパク質に関連するポリペプチドをコードする新規遺
伝子、およびこれから誘導され且つ特定されるポリペプチドに関する。特に、α
２δタンパク質に関連する３つのヒトポリペプチドをコードする３つのヒト新規
遺伝子およびこれから誘導され且つ特定されるポリペプチドを開示する。本発明
はまた、新規遺伝子を構築するベクターと宿主細胞を記載する。本発明はまた、
遺伝子の遺伝的変異、ポリペプチドの細胞内局在の検出、遺伝子治療用途、α２
δ発現の変化に関連する症候群、例えば神経学的疾病や障害、糖尿病、癌および
α２δ発現が関与する他の病気の診断、並びに化学データベースを伴うバインデ
ィングアッセイ、特にα２δタンパク質活性を変更する分子のための独特なスク
リーニング方法の開発における、新規遺伝子、ポリペプチドおよび当該ポリペプ
チドを特異的に標的とする抗体の使用方法を記載するものである。

【０００２】

【従来の技術】

脊椎動物の電位活性化カルシウムチャンネル（“ＶＳＣＣ"）は、筋肉の収縮
、膵臓から放出するインスリン、神経系から遊離する神経伝達物質を含む、多様
な異なった生理学的な過程に関連することが示されてきた（Greenberg D. Annal
s of Neurology. 1997; 42: 275-82; Catterall W.A., Trends in Neuroscience
s. 1993; 16:500-506; Catterall W, Epstein P.N, Diabetologia.35(Suppl 2:S
23-33) 1992; Birnbaumer L., et al.. Neuron., 1994: 13; Rorsman P., et al
., Diabete. Metab., 1994; 20:1 38-145）。

【０００３】 ＶＳＣＣsは、脳、骨格筋、そして心臓を含む興奮性の組織で最も高く発現さ
れる。それらは、ベータ、ガンマ、および／またはα２δサブユニットに不定に
付随しているセントラルα１ポア−フォーミングサブユニットを構成している多
タンパク質複合体である。生物物理学や薬理学的研究を基盤として、ＶＳＣＣs
の９つの異なった機能上の分類が記述されてきた。これらの機能上の分類は、主
にα１サブユニットの構造によって決定されている。ベータ、ガンマやα２δサ
ブニットは活性化や不活性化のキネティクス、電位依存性、ピークの振幅、およ
び、リガンドのバインディングに影響して、チャンネル機能を調節している（Wa
lker N., De Waard M.. Trends in Neurosciences, 1998;21(4): 148-154）。

【０００４】 ヒトを含め動物において様々な病気を治療するのに有用な化合物の多くは、電
位依存性カルシウムチャンネルの機能を調節することによって、その有益な効果
を発揮すると考えられている。これらの化合物の多くはカルシウムチャンネルに
結合し、脱分極するシグナルに応答して、細胞内のカルシウムの流束を変化させ
る。しかしながら、チャンネルのサブユニット構造やそれらをコードする遺伝子
の理解の欠如は、科学者が、カルシウムチャンネルと相互作用する化合物の薬理
学を認識することと、求められた治療上の効果を持つカルシウムチャンネルと相
互作用する化合物を合理的にデザインする可能性両方を妨害してきた。その理解
の欠如は、一部には分子レベルでそのサブユニットの性質やお互いの相互作用、
チャンネルがカルシウムイオンを通すことができる細胞膜との相互作用、カルシ
ウムと他のイオンとの相互作用、および、チャンネル機能に影響を及ぼす低分子
化合物との相互作用を理解するのに要求される多量で高い純度に精製されたチャ
ンネルサブユニットを得ることが可能ではなかったという事実のためである。

【０００５】 さらには、カルシウムチャンネルサブユニットをコードする遺伝子における情
報の欠如は成熟したカルシウムチャンネルサブユニットとその前駆体タンパク質
の分子的特性（すなわち、アミノ末端に付くシグナルペプチドをもつ成熟したサ
ブユニット）とカルシウムチャンネルサブユニットの発現の調節の理解を妨げて
きた。これらの特性および、カルシウムチャンネルサブユニット遺伝子の発現が
どのように制御されているかについて理解することは、カルシウムチャンネル機
能は、あるいは濃度に影響を及ぼすことを通して有益な効果を持つ治療薬をデザ
インする基礎を提供するであろう。さらには、カルシウムチャンネルサブユニッ
トをコードする遺伝子の配列を利用することにより、このようなサブユニットを
コードしている遺伝子における欠損症、これは数多くの病気の基盤となっている
と思われるが、その診断が可能となる。

【０００６】 Xenopusの卵母細胞における発現実験は、十分に機能的なカルシウムチャンネ
ルをつくるためにα１とα２δサブユニットは両方とも発現されなければならな
いことを示してきた。α２δサブユニットがないことでイオンが流出するα１サ
ブユニットは十分に発現しているにもかかわらず、結果として機能しないチャン
ネルとなる。実際、これらのチャンネルを通るイオンの流出だけでなく、α1の
薬理学的性質もまた、α２δサブユニットがない場合とは異なっている。これゆ
え、α２δサブユニットは、ＶＳＣＣsの重要な構成成分であり、もしも、より
ＶＳＣＣ機能を十分に特徴づけるためならば研究されなければならないものであ
る。

【０００７】 ＶＳＣＣsのはたらきの詳細な理解は、異常なＶＳＣＣ機能に関連する病気の
進行をくい止めるためのいくつかのメカニズムを明らかにしつつある。1997年４
月８日発行の米国特許第5,618,720号はα１とα２δサブユニットとそのサブユ
ニットをコードするポリヌクレオチドの配列について参考として引用している。
その出版物はさらなるα２δサブユニットについては少しも開示していないけれ
ども、α２δサブユニットの重要性を考慮に入れて、新しいα２δサブユニット
やそれらのサブユニットをコードする遺伝子の同定と特徴づけがＶＳＣＣsの構
造と機能の間の関係を理解する分子遺伝学的、薬理学的研究を進めることは理解
されうる。

【０００８】 また、このサブユニットに隠れている生化学的メカニズムや哺乳類におけるそ
の効果のさらなる理解は、通常ではない（高いかあるいは低い）ＶＳＣＣsの働
きに関連する病気の処置や診断のための新しい機会を導くに違いない。他の言い
方をすれば、ＶＳＣＣの働きの分子のメカニズムのより深い理解によって、通常
でないＶＳＣＣ発現、特に、通常でないα２δ発現に関連する病気を処置する治
療薬のデザインの改良が可能となる。

【０００９】 α２δタンパク質に対するcDNA、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、そし
てそれは、この発明の課題であるのだが、これらは、様々な細胞や組織における
ＶＳＣＣの働きを研究するための、および診断のため、およびさまざまな変化し
たα２δ発現に結びつけられる障害または病気に介入できる可能性を持った阻害
剤または薬を選択するための手段の大部分を提供する。少なくても一つのα２δ
遺伝子が重要な腫瘍抑制遺伝子が存在すると考えられているゲノムのある部位に
位置するゆえに（Kok K., et al., Adv Cancer Res 1997;71:27-92）、このよう
に発症する病気の症状は、てんかんと他の発作に関連する症候群、偏頭痛、失調
症と他の前庭の欠損症（概説として、Terwindt, GM et. al., Eur J Hum Genet
1998 Jul-Aug; 6(4):297-307)、慢性痛（Backonja M, JAMA 1998 Dec 2;280(21)
:1831-6）、感情障害、睡眠干渉（Rowbotham M, JAMA 1998 Dec2;280(21):1837
-42）、不安（Singh et al., Psychopharmocology 1996 Sep. 127(1): 1-9）、A
LS（Mazzini L et. al., J Neurol Sci 1998 Oct, 160 Suppl 1:S57-63）、多発
性硬化症（Metz L, Semin Neurol 1998;18(3):389-95）、躁病（Erfurth A, et
al., J Psychiatr Res 1998 Sep-0ct;32(5):261-4）、ふるえ（Evidente VG, et
al., Mov Disord 1998 Sep;13(5):829-31）、パーキンソン症（Olson WL, et a
l.. Am J Med 1997 Jan; 102(1): 60-6）、物質の乱用/中毒症候群（Watson, WP
et al., Neuropharmacology 1997 Oct;36(10): 1369-75）、鬱病、および癌を
含んでいる。

【００１０】 α２δ遺伝子はまた、癌のほかに、炎症のような増殖性の病気にも役割を果た
すと考えられている。α２δに結合する化合物での処理はあるタンパク質のシグ
ナル伝達機構において変化を引き起こす。これはＭＡＰキナーゼを活性化するＭ
ＥＫ（すなわち、ＭＥＫ１とＭＥＫ２）の変化したレベルを含んでいる。ＭＥＫ
の阻害剤は、α２δへのガバペンチンの結合に連動した鎮痛性の活性によく似て
いるように見える。分裂促進因子によるＭＡＰキナーゼの活性化は、増殖に必須
であることは明らかであり、そして、このキナーゼの恒常的な活性は細胞の形質
転換を誘導するのに十分である。

【００１１】

【発明の概要】

α１サブユニットは、９つの遺伝子によってコードされ、ベータサブユニット
は４つの遺伝子によってコードされ、ガンマサブユニットは２つの遺伝子によっ
てコードされることは知られているが、以前は２つのヒトのα２δ遺伝子だけが
知られていた。α２δ−Ａ（ｃＤＮＡ Accession No. M76559.1 )および (タン
パク質 Accession No. P54289.1）とα２δ−Ｂ（ｃＤＮＡ SEQ ID NO:１および
タンパク質 SEQ ID NO:２）である。α２δ−Ａ遺伝子は、組織特異性の発現を
示す少なくとも５つの異なったスプライス変異体をコードしている（Angelotti
T., Hoffman F., FEBS. 1996;397:331-337）。α２δ−Ａ遺伝子の翻訳は翻訳後
にα２サブユニットとδサブユニットに切断されるポリペプチドをつくる。α２
とδはそれからジスルフィド結合によってつながる（De Jongh K., JBC. 1990;2
65(25): 14738-14741; Jay S., JBC. 1991; 266(5): 3287-3293）。δは５つの
細胞内のアミノ酸とそのアミノ酸Ｃ末端で単一の膜貫通のドメインを形成してい
る可能性があるが、α２は完全に細胞外にあると考えられ、多量にグリコシル化
されている（Brickley K., FEBS. 1995; 364: 129-133）。この膜貫通のドメイ
ンがタンパク質を膜に固定している。α２δ−Ｂは、α２δ−Ａと同類で、公の
データベースであるGENBANKから入手可能である。

【００１２】 しかしながら、本発明者はこのあと、“α２δ−Ｃ”および“α２δ−Ｄ”遺
伝子（遺伝子名、CACNA2C および CACNA2D）として引用される、２つの新しいヒ
トα２δ遺伝子の存在を発見した。従って、本発明は様々な細胞や組織で発現さ
れる新しいα２δに関連するタンパク質（特に、α２δ−Ｃとα２δ−Ｄタンパ
ク質）を同定し、コードしているポリヌクレオチド配列の単離、および、完全長
遺伝子のポリヌクレオチド配列といくつかのスプライス変異体両方、並びにそれ
らのコードされるタンパク質に関するものである。そのポリヌクレオチドの配列
はSEQ ID NO. 3-4で同定され、３つの新しい遺伝子によってコードされるα２δ
タンパク質のアミノ酸配列は SEQ ID NO.５−６にて示される。

【００１３】 本発明は、また、精製または単離された少なくとも SEQ ID NO.３−４のヌク
レオチド配列の20の連続したヌクレオチドを構成している核酸、あるいはこれに
対して相補的なヌクレオチドの配列についても関わっている。 SEQ ID NO.５のα２δタンパク質は、タンパク質のレベルでα２δ−Ａタンパ
ク質と２８％同一で、４８％類似している。α２δ−Ｃタンパク質はα２δ−Ｂ
と２８％同一で、４７％類似している。SEQ ID NO.３のα２δ−Ｃ遺伝子はヒト
染色体3p21.1に位置づけられているそのヌクレオチド配列の中にマップマーカー
（ＳＴＳとして知られている）を含んでいる。ヒトゲノムのこの部分は重要な腫
瘍抑制遺伝子を持っていると考えられる。これゆえ、α２δ−Ｃ遺伝子は腫瘍抑
制遺伝子の候補である（Kersemaekers AM, et al., Br J Cancer 1998;77(2); 1
92-200）。

【００１４】 SEQ ID NO.６のα２δ−Ｄタンパク質はタンパク質レベルでα２δ−Ａタンパ
ク質と２８％同一で、４７％類似している。α２δ−Ｄタンパク質は、α２δ−
Ｂタンパク質と２８％同一で４６％類似している。SEQ ID NO.４のα２δ−Ｄ遺
伝子は以前に発表された、ヒト染色体12p13.3上のコスミドコンティグに位置す
る。

【００１５】 本発明の独特な完全長ポリヌクレオチドは、最初はα２δとの類似性を持った
配列を既知のヌクレオチド配列および、当該技術分野で知られるコンピュージェ
ンシステム社で供給されている道具類を含む、様々な方法を使って、GENBANKの
データベースにて検索することによって発見された。Sequence Analysis Primer
by Michael Gribskkov, John Devereux, Oxford University Press, 1994を参
照。発現配列タグ（ＥＳＴs）とα２δ−Ａと関係のある完全長の配列の同定後
、クローニング法はα２δ−Ｃとα２δ−Ｄに対する完全長の配列を得るために
用いられた。実施例１、２および３を参照せよ。要するに、オリジーンから得ら
れた分析されるヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーはデータベースの配列から由来す
るオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによってスクリーニングされ
る。ライブラリースクリーニングから同定されたクローンは、検証のための標準
的な方法によってシークエンスされる。シークエンスの報告の概要は実施例３に
ある。

【００１６】 α２δ−Ｂ、α２δ−Ｃ、並びにα２δ−Ｄのクローン化された配列の解析は
保存されているドメイン、および数多くのスプライス変異体の同定を導いた。保
存されているドメインは、フォンウィルブランド因子Ａ３ドメインとして知られ
ている（Huizinga, EG, et. al, Structure 1997, Sept 15;5(9):1147-56)。こ
のドメインは非常に多くのタンパク質で述べられていて、細胞接着を媒介すると
考えられている。興味深いα２δ−Ｃとα２δ−Ｄのスプライス変異体もまた、
同定された。これらの変異体はそれぞれのタンパク質の配列のｃ末端切断を結果
として生む。ｃ末端の切断は過去に述べられていたα２δ以上に新しい機能を持
つ可溶性で分泌性のα２δ−Ｃあるいはα２δ−Ｄタンパク質の生産を導く。

【００１７】 α２δタンパク質は多くの病気の容態に重要な役割を果たすので、興味深い。
ひとつの例として、α２δ−Ａは、抗痙攣薬であるガバペンチン（ニューロンテ
ィン）の高い親和性をもつバインディングターゲットとなることが示されている
（Gee N., JBC 1996; 271: 5768-5776）。α２δ−Ａタンパク質のこの特性は絶
大な生理学的な効果がある可能性を持っている。これゆえ、α２δ−Ｃおよび／
または、α２δ−Ｄタンパク質のレベル、あるいは活性を制御すること、または
、これらの機能を調節することによって、所望の生理学的効果が得られるかも知
れない。このような効果はα２δの異常な発現、あるいはＶＳＣＣs（すなわち
、てんかん、慢性痛、不安、糖尿病、ＡＬＳ、躁病、癌、ふるえ、パーキンソン
症、偏頭痛、失調症、感情障害、睡眠干渉、鬱病、多発性硬化症、炎症を含む病
気の症状、しかし、これらに限らない）の異常な発現を含む様々な病気を治療す
ることに用いられる可能性がある。

【００１８】 これらの病気に対する治療を計画または、発見するためのα２δ−Ｃおよび／
または、α２δ−Ｄタンパク質の治療上の利用の原理は、ガバペンチンがてんか
ん、慢性痛、およびALSを治療するためにうまく使われてきたことおよび、躁病
、ふるえ、パーキンソン症、偏頭痛、失調症、感情障害、炎症、睡眠干渉および
／または、多発性硬化症の治療上の利用のために意味を有するという事実が基盤
となっている。ガバペンチンは、高い親和性でα２δ−Ａに結合することが知ら
れている。そしてこの結合はガバペンチンの作用のメカニズムを表すものと考え
られている。これゆえ、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質に結合
するガバペンチンおよび／または他の化合物はガバペンチンで見られる効果と同
一、あるいは類似の治療上の効果を持っている可能性がある。さらに、カルシウ
ムチャンネルにおいて治療上の効果を持つことが知られている化合物もまた、α
２δの存在によってその親和性が調節されている。これゆえ、この不足を軽減す
るための薬理学的あるいは遺伝学的アプローチは上述した病気において大きな影
響を持つ。

【００１９】 本発明の一つの態様は精製されたα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパ
ク質を提供することである。精製されたタンパク質は、組み換えられた細胞かあ
るいは自然に存在する細胞のどちらから得ることができる。この発明で精製され
たα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質は、起源は哺乳類にある。ヒ
ト由来α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質を含む霊長類は、特異的
に供与されるさまざまなタンパク質の例となる。本発明はまた、アレル変異体、
および天然に生じるα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の生物学的
に活性のある誘導体を提供する。

【００２０】 本発明のもう一つの態様は、本発明のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供すること、および、ポリヌクレオ
チドのコード鎖と相補的なポリヌクレオチドを提供することである。本発明のポ
リヌクレオチドは、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の組み換え
体の発現のために供与されることに用いられる。本発明のポリヌクレオチドはま
た、１）α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子の変異または、α２δ−Ｃ
および／またはα２δ−Ｄに関連する細胞の経路の変異から結果的に生じる病気
の治療、２）α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄの変異あるいは欠失のための
病気の存在、または病気の罹患率に対する検査、３）α２δ−Ｃおよび／または
α２δ−Ｄポリペプチドの細胞内局在性の解析あるいは変化、４）α２δ−Ｃお
よび／またはα２δ−Ｄ遺伝子と類似の別の種類のRNAのクローニングと単離、
５）α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子のレベルを変えるための別の種
類のＲＮＡを発現する、というような、遺伝子治療の目的にも使われる。

【００２１】 本発明はまた、プローブまたは、プライマーとして有用なオリゴヌクレオチド
分子とも関係がある。この中の前記オリゴヌクレオチド分子はα２δ−Ｃおよび
／またはα２δ−Ｄ遺伝子を構成しているか、あるいは関連しているあらゆるヌ
クレオチド配列と、特にSEQ ID NO.３−４の配列と、特異的にハイブリダイズす
る。これらのヌクレオチドはDNA増幅およびマイクロシークエンスのような様々
な過程で利用するためのプライマーとして、または、ハイブリダイゼーション解
析におけるＤＮＡ認識のために用いられるプローブとしてのどちらかに有用であ
る。

【００２２】 本発明による、核酸のプローブあるいはプライマーは、SEQ ID NO.３−４のポ
リヌクレオチドの少なくとも８の連続したヌクレオチドから成る。好ましくは８
から２００の連続したヌクレオチド、より特異的には、１０、１５、２０または
３０から１００の連続したヌクレオチド、もっと好ましくは、１０から９０のヌ
クレオチド、最も好ましくは、２０から８０の連続したヌクレオチドから成る。
本発明で好ましいプローブあるいはプライマーは、以下に述べられる例に示され
るオリゴヌクレオチド構成のグループから選択されたオリゴヌクレオチドから成
る。

【００２３】 本発明はまた、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子の一部分を増幅す
るための方法についても関わっている。その方法は以下の段階を踏む。望まれる
α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ配列あるいはそのなかの一部分を含むと思
われる検査試料を増幅反応試薬と接触させる。上述したもののような一対の増幅
プライマーを構成する。そのプライマーは、増幅されるためのα２δ−Ｃおよび
／またはα２δ−Ｄヌクレオチド部分のどちらかの側に位置している。その方法
は増幅産物を検出する段階をさらに含む。たとえば、増幅産物は、増幅された配
列のなかの部分とハイブリダイズすることができる検出プローブを用いて検出さ
れるであろう。その代わりに、増幅産物は増幅反応それ自身で用いられたプライ
マーのどれも随意にラベルされた形で検出するだろう。

【００２４】 本発見はまた、検査試料においてα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ ＤＮ
Ａの少なくとも一つのコピーの存在を検出するための診断上のキットについても
関わっている。前記キットは本発明の一対のプライマーあるいはプローブである
プライマーを含んでいる。

【００２５】 第１の態様としては、キットは上述されたもののようなプライマー、好ましく
はα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子あるいはその断片を増幅するのに
用いた正方向および逆向きのプライマーからなる。 ２番目の態様は、そのキットはハイブリダイゼーションＤＮＡプローブを構成
し、もしくは、最終的には固相に固定化される。そして、それは、α２δ−Ｃお
よび／またはα２δ−Ｄ遺伝子かそのなかの断片とハイブリダイズする能力を持
っている。固相におけるヌクレオチドプライマーあるいはプローブを固定化する
技術は当業者に周知である。

【００２６】 本発明のキットは、このキットがプライマー、ハイブリダイゼーション反応に
有用な試薬、並びにラベルされたハイブリダイゼーションプローブとα２δ−Ｃ
および／またはα２δ−Ｄ遺伝子の間のハイブリダイゼーション反応の存在を明
らかにするために有用な試薬から構成される場合に、DNAポリメラーゼのような
適切な増幅試薬を含む選択可能な成分を含むこともできる。

【００２７】 本発明のもう一つの態様は、本発明のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質に結合可能な抗体を提供することである。抗体はポリクローナルかまた
はモノクローナルとなるであろう。本発明はインビトロあるいはインビボどちら
かでα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の発現を検出および測定す
るための対象となる抗体を用いる方法、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質、あるいはなんらかのα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質
の活性を調節している分子と相互に作用するタンパク質を検出するための方法を
も提供する。

【００２８】 本発明のもう一つの態様は、遺伝的アプローチを使って、α２δ−Ｃあるいは
α２δ−Ｄと相互に作用するタンパク質の検出のためのアッセイを提供する。好
ましい態様は、このスクリーニングのための酵母二重ハイブリッド法の使用を含
む (Bartel and Fields, The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Pr
ess, 1997)。 本発明のもう一つの態様は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質
とα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質と結合するリガンドとの間の
相互作用を妨害する、あるいは何らかのやり方で模倣する治療上の化合物の検出
あるいはスクリーニングのためのアッセイを提供することである。

【００２９】 最初の態様として、このような候補となる物質のスクリーニングの方法は、以
下の工程から成る： (ａ) SEQ ID NO.５および／またはNO.６のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドまたは、ペプチド断片もしくはその変異体を供給し、 (ｂ) 候補の物質を得て、 (ｃ) 前記ポリペプチドを前記候補の物質と接触させ、 (ｄ) 前記ポリペプチドと前記候補の物質とで形成された複合体を検出する。

【００３０】 既に定義したスクリーニング法の一つの態様として、ポリペプチドと候補とな
る物質との間で形成された複合体はさらに本発明のα２δ−Ｃおよび／またはα
２δ−Ｄタンパク質または、ペプチド断片もしくはその変異体と特異的に結合す
るポリクローナルあるいはモノクローナル抗体の存在下でインキュベートされる
。 α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄポリペプチドと相互に作用してアッセイ
される候補となる物質あるいは分子は、天然か合成の有機化合物であるとか、ポ
リペプチドのように生物学的起源をもつ分子であるといったことに限らず、多様
な性質を持っている。

【００３１】 本発明のスクリーニング法のもう一つの態様としては、前述の方法の段階ｃ）
を行う際に、候補となる物質あるいは分子の添加と同時、あるいは添加の前に、
考えられる候補となる物質とα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質と
の結合をめぐる競争で濃度が上昇している物質を添加させる。この手法によって
、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質または、そのペプチド断片、
もしくはそれの変異体の間に形成された複合体の検出および随意の定量化および
スクリーニングされる候補の物質または分子は、当業者が前述のα２δ−Ｃおよ
び／またはα２δ−Ｄタンパク質または、そのペプチド断片、もしくはそれの変
異体に対する前述の物質あるいは分子のアフィニティー値を決定できるようにし
ている。

【００３２】 本発明はまた、上に述べてきたスクリーニング方法を行うに当たって有用であ
るキットにも関する。好ましくは、このキットはSEQ ID NO.５および／またはNO
.６のアミノ酸配列をもつα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質、ま
たはペプチド断片もしくはその変異体から成り、そして、α２δ−Ｃおよび／ま
たはα２δ−Ｄタンパク質またはそのペプチド断片もしくはその変異体の間で形
成された複合体および候補の物質を検出するのに有用な選択可能な方法を含んで
いる。好ましい態様として、検出法は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質またはペプチド断片もしくはその変異体に対して作られたモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体から成っている。

【００３３】 これゆえ、本発明のアッセイはα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク
質とα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質に結合するリガンドとの間
の結合において興味のある化合物の効果を測定する段階から構成されている。結
合はラベルされたα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質または、ラベ
ルされたリガンドの使用を含め、様々な方法で測定されうる。これらのリガンド
は中性のα-アミノ酸、これは、α２δ−Ａとの結合が示されてきたものである
が、または、ガバペンチンあるいは同類のアナログといった治療上の化合物に制
限されるものではないが、これを含んでいる。

【００３４】 本発明のもう一つの態様は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質
と直接あるいは間接的に相互に作用するタンパク質の発見のためのアッセイを提
供することである。本発明のアッセイはこのような細胞内、もしくは生化学的ア
ッセイのなかの相互作用を検出するための方法で成り立っている。このような相
互作用はα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコードしているｃＤ
ＮＡまたは、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質それ自身もしくは
その断片あるいはその修飾の使用を含む、多様な方法で検出される。そのアッセ
イはまた、α２δサブユニットとα１サブユニットのようなカルシウムチャンネ
ルの他のサブユニット間の相互作用を検出するための方法をも含む。これらのア
ッセイはタンパク質間の相互作用を直接的に測定すること、あるいは十分に構築
されたカルシウムチャンネルの活性をアッセイすることを含む。

【００３５】 本発明の配列、ポリペプチド、作成ならびに使用のための方法が述べられるに
あたって、本発明はある特別な配列、ポリペプチドおよび述べられた方法だけに
限定されるものではないと理解される。その配列、ポリペプチドおよび、方法論
は多様であり、本明細書で用いられた用語は特定の態様を記載するためのもので
ある。上述のものは保護される範囲は最終的には特許請求の範囲次第であり、ど
ちらにしても本発明を限定するものとして意図してはいないし、解釈すべきでは
ない。もしも別の定義がなければ、ここに用いたすべての技術および科学用語は
本発明に属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有
する。すべての米国特許およびここに挙げられた刊行物は引用することにより組
み入れる。

【００３６】

【発明の詳述】

本明細書中で、もしも別な方法で述べられていなければ、利用された技術はい
くつかのよく知られた、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook,
et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Tech
nology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Aca
demic Press, San Diego, CA), “Guide to Protein Purification" in Methods
in Enzymology (M.P Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Pr
otocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academ
ic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Tec
hnique, 2nd Ed. (R.I. Freshney 1987. Liss, Inc. New York, NY), および、
Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, Th
e Humana Press Inc., Clifton, N.J.) Sequence Analysis Primer (Gribskov,
et al., 1994, Oxford University Press)といった参考文献のうち、いずれにも
見つけられる。

【００３７】 一つの態様として、本発明はこの中で後に、アルファ−２−デルタ−Ｃとアル
ファ−２−デルタ−Ｄ（“α２δ−Ｃ”、“α２δ−Ｄ”）遺伝子として引用さ
れ、α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄタンパク質をコードしている、新しい単離、精
製されたポリヌクレオチドを供与している。そして、この中で、そのポリヌクレ
オチド配列は、実質的にSEQ ID NO.３−４で示されているものと同じであり、お
よび、そのポリペプチド配列はSEQ ID NO.5-6で示されたものと実質的に同じで
ある。“α２δ−Ｃ”および“α２δ−Ｄ”という用語はこの中で広く使われる
。もしも別に注釈がなければ、“α２δ−Ｃ”および“α２δ−Ｄ”という用語
は、α２δ−Ｃおよび、α２δ−Ｄの天然の哺乳類由来の形態どれでも、または
、その他同種類のものを含む。α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄという用語は霊長類
やヒトに限定されず、すべての哺乳類を含むことのほうが選ばれている。

【００３８】 供与されたポリヌクレオチドは完全なα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質あるいはその一部分をコードしている。本発明のポリヌクレオチドは、
よく知られている固相法を使ったインビトロでの化学的合成を含む多様な方法、
および、クローニングや、その組み合わせによって産出される。本発明のポリヌ
クレオチドはｃＤＮＡあるいはゲノムライブラリーから由来するものである。当
業者は、遺伝暗号の縮重度に精通しており、天然に生じる、α２δ−Ｃおよび／
またはα２δ−Ｄタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列と相補性を
もつポリヌクレオチド配列の一部かポリヌクレオチド配列どちらかを持っている
α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコードしているポリヌクレオ
チドをすぐにデザインできる。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖あるいは二
本鎖となる。α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコードしている
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもまた供与される。

【００３９】 α２δ−Ｃあるいはα２δ−Ｄタンパク質をコードしているポリヌクレオチド
は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質あるいはmRNAを持っており
、検出できるレベルで発現すると信じられている組織から調製されたｃＤＮＡラ
イブラリーから得られる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーは、α２δ−Ｃおよ
び／またはα２δ−Ｄタンパク質を発現することが知られている細胞系からポリ
アデニル化したｍＲＮＡを得て、二本鎖ｃＤＮＡを合成するための鋳型としてｍ
ＲＮＡを使うことによって構築され得る。

【００４０】 ｃＤＮＡかゲノムどちらかのライブラリーは、目的の遺伝子、あるいはその遺
伝子によってコードされるタンパク質を同定するためにデザインされたプローブ
を用いてスクリーニングされる。ｃＤＮＡ発現ライブラリーのためには、適した
プローブは、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質を認識し、特異的
に結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含んでいる。ｃＤＮＡラ
イブラリーのためには、適したプローブは、同じ、あるいは異なった種からのα
２δ−Ｃあるいはα２δ−Ｄタンパク質の知られている、または考えられている
部分をコードしている注意深く選択されたオリゴヌクレオチドプローブ（通常、
約２０−８０塩基対の長さ）および／または、同じか同様の遺伝子をコードして
いる相補的あるいは相同のcDNAまたはその断片、および／または、相同のゲノム
DNAまたはその断片を含んでいる。選択されたプローブを用いたcDNAまたはゲノ
ムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)
の10−12章に述べてあるような標準的な手順を使って行われる。

【００４１】 本発明を実践するのに好ましい方法は、多様な組織からcDNAライブラリーをス
クリーニングするために注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を使うこと
である。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、長さが十分にあ
り、偽陽性は最小化されるように十分明白でなくてはならない。実際のヌクレオ
チド配列は通常、コドンの重複が最小のα２δタンパク質の領域を基盤としてデ
ザインされている。オリゴヌクレオチドは、一カ所かあるいはもっと多くの箇所
で変性している可能性がある。変性したオリゴヌクレオチドの使用は、ライブラ
リーが優先的なコドンの使用が知られていない種からスクリーニングされたとい
う、特別な重要性がある。

【００４２】 オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされたライブラリーのなかの、DNAと
のハイブリダイゼーションで検出されるためにラベルされなければならない。ラ
ベルするための好まれる方法は、オリゴヌクレオチドの5’末端を放射能ラベル
するためにＡＴＰ（すなわち、Ｔ３２Ｐ）とポリヌクレオチドキナーゼを使うも
のである。しかしながら、他の方法は、ビオチン標識または酵素標識に限らない
が、これらを含む、オリゴヌクレオチドをラベルするものが使用される。

【００４３】 α２δタンパク質をコードするｃＤＮＡもまた、米国特許第4,683,195号、Sam
brookらのセクション14., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second e
dition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, または Chap
ter 15 of Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al. eds.. G
reen Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991において述べられて
いるような直接発現させるクローニング、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）法を用いることによる他のよく知られる組み換えDNA技術によって、同定
され、単離される。この方法はα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質
をコードするＤＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用が
必要とされる。

【００４４】 この中で定義されるように、「実質的に同様」ということは、ＤＮＡもしくは
ＲＮＡまたはタンパク質配列に対する欠損、置換、あるいは付加はもちろん、同
一の配列を含んでいることである。そしてその同一の配列は、そのタンパク質生
成物のその何らかの生物学的活性のある部分を維持しており、保存されたモチー
フのいずれかを保持している。これは存在が認められているα２δ−Ｃおよび／
またはα２δ−Ｄのスプライス変異体に限定はされないが、これを含む。むしろ
、本発明によるＤＮＡ配列は本質的にはSEQ ID NO.３−４のＤＮＡ配列から成る
。これらの新しい精製され単離されたDNA配列は、α２δ−Ｃおよび／またはα
２δ−Ｄタンパク質の直接の発現および、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ
タンパク質機能の変異の解析のために用いられうる。

【００４５】 本発明によれば、突然変異した配列は、当業者によってここで示された手法お
よび、当該技術分野でよく知られている技術を使って、日常的な方法で同定され
うる。 好ましい態様として、本発明はSEQ ID NO.３−４に示されるヌクレオチド配列
と高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件下で、ハイブリダイ
ズするヌクレオチド配列から成る。この中で使われる、「高いストリンジェンシ
ーのハイブリダイゼーションの条件」という用語は、関心のあるプローブが２×
１０⁸cpm／μｇの割合になるように低い塩濃度のハイブリダイゼーションバッフ
ァー中、６５℃で約８時間から２４時間、フィルターサポート上でハイブリダイ
ゼーションし、次に１％ＳＤＳ、２０mMリン酸バッファーおよび１mM ＥＤＴＡ
中で６５℃で約３０分から４時間の間で洗浄することを指す。好ましい態様とし
て、低い塩濃度のハイブリダイゼーションバッファーは、０.５−１０％ＳＤＳ
と０.０５Ｍおよび０.５Ｍのリン酸ナトリウムから成る。最も好ましい態様とし
ては、低い塩濃度のハイブリダイゼーションバッファーは、７％ＳＤＳと０.１
２５Ｍのリン酸ナトリウムから成る。

【００４６】 当該技術分野で知られるように、数多くの等しい条件が、低いあるいは高いス
トリンジェンシー条件のどちらかを構成することに使用されてきた。配列の長さ
や性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）および、ターゲット（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩
基組成、溶液中の存在あるいは固定化、等）の性質並びに、塩や他の成分の濃度
（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、および／またはポリエチレングリ
コールの有無）が考慮され、ハイブリダイゼーション溶液は、上に挙げた条件と
同等であるが、異なっている低いか高いかのストリンジェンシーの条件を作るた
めに多様化される。

【００４７】 ここで用いられている「ストリンジェントな条件」という用語は、約Ｔｍ−５
℃（プローブの溶融温度(Tm)より５℃下）からTmより約２０℃から２５℃下の範
囲内で生じる「ストリンジェンシー」である。当業者によって理解されるように
、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、同一あるいは関連するポリ
ヌクレオチド配列を同定あるいは検出するために変わる可能性がある。

【００４８】 本発明のポリヌクレオチドは多様な用途があり、そのなかのいくつかはこれま
で示されて来ているか、あるいは、以下に、もっと詳しく取り組まれることとな
る。与えられたポリヌクレオチドの特定の用途は、一部分、関心のある特異的な
ポリヌクレオチドの態様に依存している。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム
ライブラリーからα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質を回収するた
めのハイブリダイゼーションプローブとして用いられている。本発明のポリヌク
レオチドはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、他の同様の増幅法を通
してα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドあるいはその一部の増幅のためのプライマーとしても用いられる。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、病気に関連がある、特に、α２δ−Ａタンパク質の変
化した機能に関連する病気に関連するα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタン
パク質をコードする遺伝子の変異を検出するためのプローブ並びに増幅プライマ
ーとしても用いられる。上述した病気に限らないが、これらを含む。

【００４９】 本発明はまた、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ、あるいは、染色体外の
ベクターにサブクローニングされたものと実質的に同様の配列を構成する、多様
なポリヌクレオチド発現ベクターを提供する。本発明のこの態様は、α２δ−Ｃ
および／またはα２δ−Ｄ遺伝子のインビトロでの発現を可能とし、これゆえ、
α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子の制御並びにα２δ−Ｃおよび／ま
たはα２δ−Ｄタンパク質の構造と機能の解析が可能となる。ここで使われてい
る「染色体外のベクター」という用語は、プラスミド、バクテリオファージ、コ
スミド、レトロウィルスならびに人工的な染色体に限らないが、これらを含む。
好ましい態様として、染色体外ベクターは、組み換えＤＮＡ分子が宿主細胞に挿
入される時に、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の生産ができる
発現ベクターから成っている。このようなベクターは当該技術分野で周知であり
、Ｔ３あるいはＴ７ポリメラーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ
プロモーターあるいは、遺伝子発現を支配できるかあるいは遺伝子発現支配の可
能性を確かめたいと望まれている何らかのプロモーターを伴うベクターに限られ
はしないが、これらを含む。

【００５０】 好ましい態様として、対象となる発現ベクターはα２δ−Ｃおよび／またはα
２δ−Ｄタンパク質の発現を与えるような一つ、またはそれ以上のプロモーター
配列と機能的に併用して、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコ
ードしているポリヌクレオチド配列（あるいは、内在性の遺伝子の発現の抑制に
適している配列のアンチセンスコピー）から成っている。そのベクターは、遺伝
子発現、調節、あるいはベクターの簡便な操作に必要な付加的なポリヌクレオチ
ド配列を構成している。そして、その付加的な配列というものは、ターミネータ
ー、レポーター、エンハンサー、選択マーカー、パッケージサイトなどを含む。
詳しいポリヌクレオチドの発現ベクターや、その使用についてはとりわけ以下の
もので見ることができる。 Gene Expression Technology: Methods in Enzymolo
gy Volume 185 Goeddel ed. Academic Press Inc., San Diego, CA (1991), Pro
tein Expression in Animal Cells Roth ea.. Academic Press，San Diego, CA
(1994)。

【００５１】 本発明のポリヌクレオチドの発現ベクターには多様な用途がある。このような
用途は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質を発現する宿主細胞の
遺伝子工学を含む。さらなる態様として、本発明は、染色体外ベクターへサブク
ローニングされたα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄを構成する組み換えDNA
分子を安定に形質移入する組み換え宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は細
菌、酵母、哺乳類の細胞、アフリカツメガエルの卵母細胞に限らないが、これら
を含む、なんらかの形である。組み換えDNA分子の宿主細胞への形質移入は当該
技術分野でよく知られており（Sambrook et al.. Molecular Cloning, A Labora
tory Manual, 2nd ed.. Cold Spring Harbor Press, 1989）、および、ここで使
われているように、リン酸カルシウム形質移入、デキストラン硫酸トランスフェ
クション、エレクトロポレーション、リポフェクション、および、ウイルス感染
に限らないが、これらを含む。発明のこの態様はα２δ−Ｃおよび／またはα２
δ−Ｄのインビトロおよびインビボでの発現とその遺伝子産物について考慮に入
れており、これゆえ、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の高いレ
ベルの発現が可能となる。本発明のさらなる態様として、α２δ−Ｃおよび／ま
たはα２δ−Ｄを含んでいるRNA分子は、他のカルシウムチャンネルサブユニッ
トクローンと一緒にアフリカツメガエルの卵母細胞へインジェクションされ、卵
母細胞の細胞膜を横切るカルシウムの流束は、標準的な電気生理学的技術を使っ
て測定される。

【００５２】 本発明のもう一つの態様は、遺伝子組み換え動物が、適切な発現ベクターでク
ローン化されたα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄのヌクレオチド配列が生殖細胞へイ
ンジェクションされることによって、構築されうることである。

【００５３】 後に詳しく考察されるが、ポリヌクレオチドの発現ベクターの他の用途は、病
気や状態に対する遺伝的治療としての利用である。そこでは、自然界で起こるα
２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の発現レベルよりも高いレベルで
α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質が発現することが望ましい利用
である。代わりになるものとして、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパ
ク質の自然に生じるレベルを減少させるアンチセンスの発現のための対象となる
ベクターを使うことが望ましい。

【００５４】 α２δ−Ｃとα２δ−Ｄは、α２δ−Ａとアミノ酸の相同性を分担している。
これゆえ、α２δ−Ｃとα２δ−Ｄは、α２δ−Ａの持っているなんらかの構造
的および機能的特徴を分担していることは大いに考えられる。α２δ−Ａは、α
1とベータのような電位感受性カルシウムチャンネルのほかのサブユニットと相
互に作用することが知られている。カルシウムチャンネルは、卵母細胞で発現さ
れるとき、α２δサブユニットが存在しているときだけ、機能的なチャンネルが
生じる。これゆえ、α２δは、カルシウムチャンネル機能に必要である。加えて
、α２δ−Ａは、てんかん、慢性痛、ALS、および、潜在的なほかの神経学的な
病気の治療に使われる薬である、ガバペンチンと結合することが示されてきてい
る。ガバペンチンの作用のメカニズムは、α２δとの相互作用を通してであると
考えられている。α２δタンパク質間の相同性を考えると、α２δ−Ｃとα２δ
−Ｄもまた、これらの機能を分担しているようである。

【００５５】 SEQ ID NO.３−４のポリヌクレオチド配列はプローブを作るためのライブラリ
ーソース（実施例２−３参照）からのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を用いてヒト
染色体に遺伝子座が決定された。配列は、よく知られる技術を用いて、特定の染
色体に、あるいは染色体のある特異的な部分に位置づけられた。これは、染色体
のひろがりに対する in situ ハイブリダイゼーションと標準的な照射雑種細胞
系から増幅したDNAによるPCRを基にしたマッピングを含む（Verma et al (1988)
Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, NYC.）
。SEQ ID NO.３のα２δ−Ｃは、ヒト染色体3p21.1に位置する。SEQ ID NO.４の
α２δ−Ｄは、以前発表された、ヒト染色体12p13.3上のコスミドコンティグに
位置する。

【００５６】 他の態様として、本発明は、SEQ ID NO.５−６で示されたα２δ−Ｃおよび／
またはα２δ−Ｄポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドから成る実質的に
精製された組み換えタンパク質を提供する。さらに、本発明のこの態様は、以下
に述べられるいくつかのインビトロアッセイでα２δタンパク質の利用を可能に
している。ここで用いられる「実質的に同一」という用語は、なんらかのインビ
トロでの手法、あるいはインビボで自然に見られる遺伝子変異で生じるSEQ ID N
O.５−６の配列の欠損、置換、付加を含む。ここで用いられる「実質的に精製さ
れた」という用語は、精製するタンパク質は明らかに混入しているタンパク質を
取り除かなければならないが、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質
は、相互に作用しているタンパク質と一緒に精製されているか、あるいはオリゴ
マーとして精製されているかもしれないということを意味している。最も好まし
い態様は、本発明に従ったタンパク質配列は、SEQ ID NO.５−６のアミノ酸配列
から成ることである。本発明による変異された配列はここで与えられる技術と当
該技術分野で周知の技術を使って当業者によって日常的な手法で同定されうる。
本発明のこの態様は、インビトロアッセイのため、および医薬品の組成成分とし
て用いられることが可能な新しい精製されたタンパク質を供与している。

【００５７】 α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質は、その活性を妨げる分子を
発見するためにも使うことができる。例として、中性のα−アミノ酸（たとえば
、（Ｌ)−ロイシン）のようなリガンド、あるいは電位感受性カルシウムチャン
ネルのほかのサブユニットのようなほかの分子とα２δ−Ｃおよび／またはα２
δ−Ｄとの結合を妨げる分子がある。加えて、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ
−Ｄタンパク質は、直接、相互作用する、および潜在的にＶＳＣＣ輸送の付加的
な重要な制御因子をしめす他のタンパク質を見つけることに用いられる。

【００５８】 本発明のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質は、細胞内、および
細胞外のカルシウムの貯蔵を潜在的に含む、カルシウムの細胞での流束を調節す
るという推定上の生物学的活性を持っている。発明のα２δ−Ｃおよび／または
α２δ−Ｄタンパク質は、多様な哺乳動物種から単離されている。単離に好まし
い哺乳類の種は、霊長類およびヒトである。本発明はまた、α２δ−Ｃおよび／
またはα２δ−Ｄタンパク質のアレルの変異体についても考えに入れている。α
２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質は、多様な哺乳類の組織から調製
されている。好ましくは、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質が有
意な量で発現するように遺伝学的に操作された組み換え宿主細胞からα２δ−Ｃ
および／またはα２δ−Ｄタンパク質が得られることである。α２δ−Ｃおよび
／またはα２δ−Ｄタンパク質は、当業者によく知られるさまざまな方法で組み
換えされていない、あるいは組み換え型細胞から単離される。

【００５９】 ここで使われている「α２δ−Ｃタンパク質」および「α２δ−Ｄタンパク質
」という用語は、天然で生じるα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質
のアミノ酸残基の配列を持っているタンパク質であるのみならず、天然で生じる
α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の機能的誘導体および変異体に
もあてはまる。天然のポリペプチドのなかで「機能的な誘導体」は、天然のα２
δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質と同じような定性的な生物学的活性
を持つ化合物である。これゆえ、天然のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質の機能的誘導体は、天然のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパ
ク質と同じような定性的（質的）生物学的活性を持つ化合物である。そしてそれ
は、他のカルシウムチャンネルサブユニットと結合し、細胞内のカルシウムの流
束を調節すること、あるいは、中性のα-アミノ酸およびほかの類縁のリガンド
と結合することである。「機能性誘導体」とは、限定はされないが、それぞれの
天然ポリペプチドに共通の生物学的活性を有するということが規定されたヒトを
含むあらゆる動物由来の天然のポリペプチド断片およびヒトとヒト以外の天然ポ
リペプチドの誘導体およびその断片を含む。「断片」とは、成熟した天然ポリペ
プチドの配列内の領域を意味する。“誘導体”という用語は、通常、天然ポリペ
プチドのアミノ酸配列とグリコシル化による変異体、および、共有結合による修
飾と定義されるのに対して、“変異体”という用語は、この定義のなかのアミノ
酸配列とグリコシル化による変異形に適用される。好ましくは、その機能性誘導
体とは、対応する天然ポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列の類似
性を、より好ましくは約８０％アミノ酸配列の類似性を、いっそうより好ましく
は少なくとも９０％のアミノ酸配列の類似性を、最も好ましくは少なくとも約９
９％のアミノ酸配列の類似性を有するポリペプチドである。最も好ましくは、そ
の天然のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の機能性誘導体は、リ
ガンドの結合に直接的に関与する天然のポリペプチド配列内の特定の領域あるい
は複数の領域を保持、あるいは、模倣する。「機能性誘導体」という熟語は、天
然のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質に共通する定性的な生物学
的活性を持つペプチドおよび低分子の有機化合物を特異的に含んでいる。

【００６０】 ある天然ポリペプチドおよびその機能性誘導体に関する「同一性」あるいは「
相同性」は、対応する天然ポリペプチドと候補となる配列をアライン（整列化）
し、そして最高パーセントの相同性に達するために必要に応じてギャップ（間隙
）を入れた後のこれらの配列内での類似するアミノ酸残基のパーセンテージとこ
こでは定義される。NあるいはC末端の延長、挿入、オルタナティブスプライシン
グによる変異体のいずれも、同一性あるいは相同性を減少するものと解釈すべき
ではない。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当
該技術分野においてよく知られている。

【００６１】 天然のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質、および、天然のα２
δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質断片のアミノ酸配列変異体は、天然
、あるいは変異体のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコードす
るＤＮＡに適切なヌクレオチド変換を導入することによって、あるいは、所望の
ポリペプチドのインビトロ合成によって、当該技術分野において既知の方法で調
整される。アミノ酸配列変異体の構築には、変異箇所の位置と変異の性質という
二つの主要な変数がある。α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列の操作を必要としない、自然に生じるアレルという例外と共
に、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質のアミノ酸配列変異体は、
自然に生じることのないアレルかアミノ酸配列変異体のいずれかができるように
DNAを変異させることによって選択的に構築される。

【００６２】 その代わりにあるいは加えて、多様な種由来のα２δ−Ｃおよび／またはα２
δ−Ｄタンパク質において異なっている位置あるいは高度に保存された領域にお
いて、到達する目的に応じてアミノ酸変換が作成可能である。 そのような部位の位置は一般的に連続的に、すなわち（１）達成される結果に
応じて、初めに控えめな選択で、その後にはより過激な選択での置換によって、
（２）一つのあるいは複数の標的残基の削除によって、（３）設定された位置に
隣接して同じかあるいは異なる種類の残基を挿入することによって、あるいは１
−３の選択肢の組み合わせによって改変される。

【００６３】 一つの役に立つ技術は「アラニンスキャンニング」（Cunningham and Wells, Science 244 , 1081-1085 (1989)）と呼ばれる。この方法では、一つの残基ある
いは一群の標的残基が確認され、アラニンあるいはポリアラニンによって置換さ
れる。さらに、そのアラニン置換に機能的な感受性を示すこれらのドメインは、
さらなる、あるいは他の置換をアラニン置換の位置に、あるいは、アラニン置換
のために導入することにあって精製される。 目的とする変異を確認した後、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク
質変異体をコードするDNAは、たとえば、化学合成によって得られる。

【００６４】 より好ましくは、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質アミノ酸配
列変異体をコードするDNAは、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質
の初めに調製された変異体あるいは非変異体のバージョンをコードするＤＮＡの
位置指定変異誘発法（site-directed mutagenesis）によって調製される。位置
指定（位置特異的）変異誘発法は、交差している欠失の結合部位両端での安定な
二重鎖を形成するための十分なサイズと配列の複雑さを持つプライマー配列を提
供するために十分な数の隣接するヌクレオチドはもちろん、目的とする変異のDN
A配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の利用によって、α２δ−
Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質変異体を生成させる。一般的には改変さ
れる配列の結合部の両端のおよそ5〜10残基を含むおよそ20から25ヌクレオチド
の長さのプライマーが好まれる。概して、位置特異的変異誘導法は、Edelmanら
（DNA 2: 183 (1983)）のような誌上発表によって例示されているように当該技
術分野においてよく知られている。高い評価を得るために、位置特異的変異誘導
法（site-specific mutagenesis）は、一般的に一本鎖および二本鎖型として存
在するファージベクターを採用する。位置指定変異誘導法において有用な典型的
ベクターは、Ｍ１３ファージのようなベクターを含んでいる。これと他のファー
ジベクターは市販されており、その利用は当業者においてよく知られている。Ｍ
１３由来のベクターを用いたＤＮＡ断片のオリゴデオキシヌクレオチドによって
指定される位置特異的変異の構築のための融通がきき、効果的な手法は、Zoller
, M.J.とSmith, M, (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500[1982]）によって誌上
発表されている。さらに、一本鎖ファージ複製開始点を含むプラスミドベクター
（Veiraら、Meth.Enzymol. 153:3 (1987)）は、一本鎖DNAを得るために用いられ
る。他にはヌクレオチド置換はインビトロでの適切なDNA断片の合成および当業
者に既知であるＰＣＲ法による増幅によって導入される。

【００６５】 一般的に、位置指定変異誘導法は、関連したタンパク質をコードするDNAをそ
の配列中に含む二本鎖か一本鎖のベクターのいずれかを得ることによって達成さ
れる。目的とする変異配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーは、一般にたと
えばCreaら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978)）の方法によって合
成的に調製される。それから、このプライマーは、変異を含む鎖を合成するため
に、一本鎖のタンパク質配列を含むベクターとアニールし、大腸菌のポリメラー
ゼＩ Klenow断片のようなＤＮＡ重合酵素に供される。これゆえ、一方の鎖には
オリジナルの無変異配列がコードされ、もう一方には目的の変異が含まれるヘテ
ロ二本鎖が形成される。次にこのヘテロ二本鎖ベクターは、HB101細胞のような
適切な宿主細胞の形質転換に用いられ、変異配列の構成を持つ組み換えベクター
を含むクローンが選抜される。その後、変異領域は取り除かれ、タンパク質生産
のための適切な発現ベクターに据えられる。

【００６６】 α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質のアミノ酸配列変異体を創生
するためにPCR技術も用いられる。ＰＣＲにおける初発材料として少量の鋳型Ｄ
ＮＡが用いられる場合、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域由来の配列と若干異なるプ
ライマーは、プライマーが鋳型と異なる場所でのみ鋳型配列と異なる比較的大量
の特異的ＤＮＡ断片を生成するために用いることができる。プラスミドＤＮＡに
変異を導入するために、プライマーの一方は変異箇所をオーバーラップし、変異
を含むようにデザインされる。すなわち、もう一方のプライマーの配列はプラス
ミドの反対鎖の一連の配列と同一であるはずであるが、しかし、この配列はプラ
スミドＤＮＡのどこに位置していてもよい。しかしながら、その二番目のプライ
マーは、プライマーが境界になっているＤＮＡの全増幅領域が容易にシークエン
スできるように、一番目のプライマーから５００〜５０００ヌクレオチド以内に
位置していた方が好ましい。鋳型をコピーするときのように、プライマーによっ
て特定される変異位置とおそらく他の位置で異なるＤＮＡ断片のポピュレーショ
ンを生じる前述したような一組のプライマーを用いたPCR増幅は、多少エラーを
起こしやすい。

【００６７】 前述したおよび同様の突然変異誘発の技術のさらなる詳細は、一般的なテキス
トブックでも見つけられる。たとえば、Sambrook et aL, Molecular Cloning: H
Laboratory Manual 2nd edition. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Ha
rbor (1989), and Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al.
eds., John Wiley and Sons (1995)がその例である。

【００６８】 天然に生じるアミノ酸は共通の側鎖の特性を基盤としてグループに分けられる
。 (１) 疎水性：ノルロイシン（norleucine）、メチオニン（met）、アラニン
（ala）、バリン（val）、ロイシン（leu）、イソロイシン（ile） (２) 中性の疎水性：システイン（cys）、セリン（ser）、スレオニン（thr
） (３) 酸性：アスパラギン酸（asp）、グルタミン酸（glu） (４) 塩基性：アスパラギン（asn）、グルタミン（gln）、ヒスチジン（his
）、 リジン（lys）、アルギニン（arg） (５) 鎖の配向に影響する残基：グリシン（gly）、プロリン（pro） (６) 芳香族：トリプトファン（trp）、チロシン（tyr）、フェニルアラニン
（phe）

【００６９】 保存された置換は一つのグループ内の仲間が同じグループ内の他の仲間と交換
することを伴うが、これに対して、保存されない置換は、これらの分類の一つの
グループの仲間が他のグループと交換することを意味する。保存されない置換に
よって得られた変異体は、その得られた変異体の生物学的特性／機能において明
らかな変化が結果として得られることが予想される。そしてその変異体は、α２
δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質のカルシウムの流束を調節する、あ
るいは、中性のα-アミノ酸に結合するという、生物学的活性をブロックするα
２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質変異体に結果としてなるだろう。
さまざまな種間で保存されているアミノ酸の位置はもしもその目的が生物学的機
能を保持することであれば、比較的保存された方法で一般的には置換される。

【００７０】 アミノ酸配列の欠損は、一般的に約１から３０残基の範囲である。より好まし
くは、約１から１０残基であり、典型的には近接している。欠損はリガンドの結
合に直接的には関係なく、領域に導入される。

【００７１】 アミノ酸の挿入は、単一、あるいは複数のアミノ酸残基の配列内での挿入はも
ちろん、長さが1残基から１００、あるいはもっと多数の残基を含むポリペプチ
ドの範囲で、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合を含んでいる。
配列内の挿入（すなわち、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質のア
ミノ酸配列内での挿入のこと）は、一般的におよそ１から１０残基、好ましくは
１から５、より好ましくは１から３残基の範囲である。末端挿入の例として、N
末端のメチオニン残基を持つα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質、
天然で生じるＮ末端のシグナル配列、バクテリアの組み換え細胞培養における直
接的発現による人工産物、および、組み換え宿主細胞から成熟したα２δ−Ｃお
よび／またはα２δ−Ｄタンパク質の分泌を促進するためのヘテロなＮ末端シグ
ナル配列とα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質のＮ末端との融合体
を含む。このようなシグナル配列は、一般に導入予定の宿主細胞由来であり、し
たがって相同性である。適切な配列は、大腸菌のためのSTIIやIpp、酵母のため
のα因子、哺乳類細胞のためのヘルペスｇＤのようなウイルスのシグナルが含ま
れる。公開されたＰＣＴ特許出願 WO 89／02922に詳述されているように、天然
のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質分子の他の挿入変異体は、α
２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端と、た
とえば、βラクタマーゼや大腸菌ｔｒｐ遺伝子座がコードする酵素などの細菌性
ポリペプチド、あるいは酵母タンパク質のような免疫原性のポリペプチドとの融
合体、およびイムノグロブリン領域（好ましくはイムノグロブリン安定領域）、
アルブミン、あるいはフェリチンのように半減期の長いタンパク質とのＣ末端融
合体を含む。

【００７２】 多くの場合、変異体のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の性質
を前もって予測する事は困難であるので、最適な変異体を選抜するためのスクリ
ーニングが必要とされることが認識される。この目的においては、ここで以下に
記載したような生化学的スクリーニングアッセイは、直ちに利用できる。

【００７３】 さらに進んだ態様では、本発明は抗体とSEQ ID NO.５−６のアミノ酸配列と実
質的に同様のアミノ酸配列を持つポリペプチドと選択的に結合する抗体を検出す
る方法を供与している。以下にさらに詳しく考察するように、本発明の抗体は標
準的な技術（Harlow and Lane (1988), eds. Antibody: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press）に従って宿主動物内での免疫応答を誘発するために
、SEQ ID NO.５−６の配列全部あるいは一部、あるいはその修飾された部分を使
うことによって調製されたポリクローナルあるいは、モノクローナル抗体と成り
うる。望ましい具体例として、SEQ ID N O.５−６のポリペプチド配列全体が宿
主の動物内でポリクローナル抗体の生産を誘発することに用いられる。

【００７４】 α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ抗体を検出する方法は、α２δ−Ｃおよ
び／またはα２δ−Ｄタンパク質を認識する抗体と細胞との接触、そして、その
細胞のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質-抗体複合体の検出に必
要ないくらかの培養から成る。抗原を検出する抗体の標準的な条件は、本発明の
この態様を成し遂げることに用いられ得る（Harlow and Lane, 1988）。本発明
のこの態様は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質インビトロおよ
びインビボ両方で検出することを可能にした。

【００７５】 本発明は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄの望まれない異常な細胞内の
レベルによって特徴づけられる多様な病気の治療のための方法を供与している。
病気はインビボあるいはインビトロの遺伝学的治療、どちらかを通じて処置され
る。ウイルスのベクターを使った遺伝学的治療のプロトコールは他の業界でも見
られる（Viral Vector Gene Therapy and Neuroscience Applications, Kaplit
and Lowry, Academic Press, San Diego (1995)）。遺伝子治療の適用は、標的
となる宿主細胞あるいは治療を必要としている組織の同定、および、同定された
細胞内で求められている遺伝子産物を発現できる能力のあるベクター構築物のデ
ザイン、並びに、構築物の標的細胞の有効な形質導入が結果として得られる方法
で細胞への搬送を含む。遺伝子治療によって標的とされた細胞あるいは組織は、
典型的にベクター構築物が治療のためにデザインされている病気によって冒され
たものである。たとえば、癌の場合、標的となる組織は悪性腫瘍である。

【００７６】 本発明の遺伝子治療法はα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質（ま
たは阻害性アンチセンスＲＮＡ）を発現するためのベクターを患者細胞に導入す
る工程を含む。患者細胞は患者内にある、即ちインビボ遺伝子治療であるか、ま
たは患者外にあり、次いで患者に再導入される、即ちインビトロ遺伝子治療のい
ずれかである。本発明の遺伝子治療法により治療される疾患は、てんかん、慢性
痛、ＡＬＳ、躁病、癌、不安、糖尿病、ふるえ、パーキンソン氏病、偏頭痛、運
動失調、感情障害、睡眠干渉、多発性硬化症、炎症を含むが、これらに限られる
ものではない。

【００７７】 本発明の好ましい態様において、ＤＮＡ配列の発現を促進するＤＮＡ配列に作
動的に連結されたSEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４に示されるＤＮＡ配列に実質
的に類似するＤＮＡ配列を含む発現ベクターを哺乳類細胞に導入すること、哺乳
類細胞内でSEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４のＤＮＡ配列が高レベルで発現する
条件下にて細胞をインキュベートすることからなる、細胞中における異常なレベ
ルのα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄから哺乳類細胞を保護するための方法
が提供される。適切な発現ベクターは前述したものである。好ましい態様におい
て、ヒトα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子のコード領域がサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写調節下においてα２δ−Ｃおよび／ま
たはα２δ−Ｄ遺伝子を構成的に発現させる発現ベクターにサブクローニングさ
れている。

【００７８】 本発明の他の好ましい態様において、アンチセンスＤＮＡ配列の発現を促進す
るＤＮＡ配列に作動的に連結されたSEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４に示される
ＤＮＡ配列に実質上類似する配列に対してアンチセンスであるＤＮＡを含む発現
ベクターを哺乳類腫瘍細胞に導入することを含む、ＶＳＣＣs内の異常なレベル
のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄを治療または予防するための方法が提供
される。細胞はその後SEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４のアンチセンスＤＮＡ配
列が哺乳類細胞内で高発現するであろう条件下で生育する。

【００７９】 最も好ましい態様において、ＤＮＡ配列は本質的にSEQ ID NO:３またはSEQ ID
NO:４からなる。さらに好ましい態様において、発現ベクターは、宿主細胞中に
てα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−ＤアンチセンスｃＤＮＡが構成的に発現す
るように、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−ＤのｃＤＮＡがサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）プロモータにアンチセンスの向きで作動的に連結されているアデ
ノウイルスベクターを含む。好ましい態様において、α２δ−Ｃおよび／または
α２δ−Ｄのアデノウイルス発現ベクターは、哺乳類に注射することにより細胞
に導入される。

【００８０】 本発明の別の態様は、対象化合物がα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタン
パク質と結合できるかどうかを決定するのに有用なアッセイを提供する。この結
合は、リガンドとＶＳＣＣsとの結合を干渉するかまたはこれを模倣する、ある
いはこの結合はカルシウム流出の調節におけるα２δ−Ｃおよび／またはα２δ
−Ｄの機能に作用しうる。アッセイは、対象化合物とα２δ−Ｃおよび／または
α２δ−Ｄタンパク質との結合を測定する工程を含む。α２δ−Ｃおよび／また
はα２δ−Ｄタンパク質、あるいはアッセイすべき対象化合物のいずれかは、検
出可能な標識、例えば放射線標識または蛍光標識で標識して、対象化合物とα２
δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質との間の複合体形成を検出すること
ができる。本アッセイの別の態様において、アッセイは、α２δ−Ｃおよび／ま
たはα２δ−Ｄタンパク質とすでにα２δ−Ａタンパク質と結合することが知ら
れているリガンドとの間の結合の相互作用に対する、対象化合物の干渉、即ち拮
抗的結合を測定することを含む。例えば、放射性標識されたリガンドとα２δ−
Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の間の複合体形成において対象化合物の
増加量が与える効果は、ラベルされたリガンド−α２δ−Ｃおよび／またはα２
δ−Ｄタンパク質複合体の形成を定量することによって測定することができる。
本アッセイにおける他の態様において、アッセイはα２δ−Ｃおよび／またはα
２δ−Ｄタンパク質（α２δの異なる領域に結合し、α２δの活性を阻害するが
、ガバペンチンなどリガンドの結合は妨げない）の活性により、対象化合物の変
化（すなわち、非拮抗阻害）を測定することを含む。

【００８１】 α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質に対するポリクローナル抗体
は、一般的にα２δタンパク質とアジュバントを多数回皮下または腹腔内へ注入
することにより、動物内で産生される。α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質または標的とするアミノ酸配列を含む断片を、二種間で機能するかある
いは誘導性のある物質、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエス
テル（システイン残基を介してコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（リジン残基を介してコンジュゲート）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸
、ＳＯＣｌ₂、またはＲ₁〜Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ₁は異なるアルキル
基を表す］を利用して、免役される種に免疫原性のあるタンパク質、例えばキー
ホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリン、またはダ
イズトリプシンインヒビターとコンジュゲートさせるのが有用である。

【００８２】 動物は、免疫原性のコンジュゲートまたはその誘導体に対して、１mgもしくは
１figのコンジュゲート（それぞれウサギまたはマウスに対して）を、３倍量の
完全フロイントアジュバントと組み合わせて、皮下の多部位にその溶液を注入す
ることにより免疫される。一ヶ月後、動物は、完全フロイントアジュバント中の
コンジュゲートの元の量の５分の１〜１０分の１の量を皮下注入により多部位に
追加免疫する。７〜１４日後、動物を採血し、抗α２δ−Ｃおよび／またはα２
δ−Ｄタンパク質抗体の抗体価をアッセイする。動物は抗体価がプラトーに達す
るまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じα２δ−Ｃおよび／またはα２
δ−Ｄタンパク質のコンジュゲートを用いてブーストするが、異なるタンパク質
に対しておよび／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲートさせることがで
きる。コンジュゲートはまた、融合タンパク質として組換え細胞の培養液で作ら
せることも可能である。また、ミョウバンなどの沈殿試薬は免疫反応を強めるた
めに使われる。

【００８３】 モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られるもの、即ち集団
に含まれる各抗体は少量存在しうる自然発生的に起こりうる変異を除いて同一で
ある。このように、改変“モノクローナル”は関連のない抗体の混合物として存
在しないという抗体の特徴を示す。例えば、本発明の抗α２δ−Ｃおよび／また
はα２δ−Ｄタンパク質モノクローナル抗体はKohler & Milstein, Nature256:
495 (1975) により最初に記述されたハイブリドーマ法、または、組み換えＤＮ
Ａ法［Cabilly等, 米国特許第4,816,567号］によって作製することができる。

【００８４】 抗体はファージディスプレーを使って作製することもできる。この手法におい
て、このランダム配列のペプチドのライブラリーは、ファージにクローン化され
た抗体遺伝子中に作成される。これらのファージライブラリーは、固定されたタ
ンパク質に対するスクリーニングにより抗体についてスクリーニングされる (Ho
ogenboom-HR, Trends-Biotechnol. 1997 Feb;15(2): 62-70)。

【００８５】 ハイブリドーマ法において、マウスまたはハムスターなどの他の適当な宿主動
物は、免疫に使われたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を生産するか
または生産する能力のあるリンパ球を誘導するために、上述したように免疫され
る。また、リンパ球はインビトロで免疫させてもよい。その後リンパ球は、ポリ
エチレングリコールなどの適切な融合試薬を使って、ハイブリドーマ細胞を形成
するためにミエローマ細胞と融合させる［Coding, Monoclonal Antibodies: Pri
nciples and Practice, pp.59-103 (academic Press, 1986)］。

【００８６】 本発明の抗α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質特異的抗体はいく
つかの使用法がある。抗体を用いて、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタン
パク質を組み換えまたは非組み換え細胞から精製することができる。本抗体を用
いて、例えば血液、皮膚、その他同種の組織試料中のα２δ−Ｃおよび／または
α２δ−Ｄタンパク質の存在を検出および／または定量することができる。α２
δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタンパク質の定量は、α２δ−Ｃおよび／また
はα２δ−Ｄタンパク質の特定の発現レベルと相関する病気、生理学的または遺
伝的な状態の診断に用いることができる。

【００８７】 別の態様において、本発明は、細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、SEQ ID NO:
３またはSEQ ID NO:４のＤＮＡ配列由来のプライマーを使用してゲノムＤＮＡを
ＰＣＲ増幅に供することからなる、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄの欠失
を包含する細胞を検出する診断アッセイを提供する。

【００８８】 本発明のこの態様は、いずれのタイプの細胞内中のα２δ−Ｃおよび／または
α２δ−Ｄの欠失の検出も可能にし、遺伝学的な試験または研究の道具として用
いることができる。ＰＣＲプライマーは、ゲル電気泳動で検出されるのに十分な
大きさのα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子断片が増幅されるいずれの
方法においても選択することができる。検出方法はアガロースまたはポリアクリ
ルアミドゲルの臭化エチジウム染色、放射線で標識されたα２δ−Ｃおよび／ま
たはα２δ−Ｄ遺伝子断片のオートラジオグラフ検出、サザンブロットハイブリ
ダイゼーション、ＤＮＡ配列解析を含むいずれの方法でも検出することができる
が、これに限定されるものではない。好ましい態様において、検出はポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後、欠失の同一性を確かめるためにＤＮＡ配列解析を行う
ことにより達成される。ＰＣＲの条件は、当該分野でよく知られた技術に従って
選択されたプライマーの長さおよび塩基含量に基づいて慣例的に決定される（Sa
mbrook et al. ,1989）。

【００８９】 本発明の別の態様は、全細胞ＲＮＡを単離し、SEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:
４のＤＮＡ配列に由来のプライマーを使用する逆転写ＰＣＲ増幅にＲＮＡを供す
ることからなる、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄの欠失を包含する細胞を
検出する診断アッセイを提供する。本発明のこの態様は、いずれのタイプの細胞
内のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ欠失の検出も可能にし、また遺伝学的
な試験または研究の道具として使われることを可能にする。

【００９０】 逆転写は慣例的に標準技術（Ausubel et al.,in Current Protocols in Molec
ular Biology, ed. John Wiley and Sons, Inc., 1994）によって行われ、ＰＣ
Ｒは上述のように行われる。

【００９１】 本発明は、添付の実施例を参照することにより、より理解することができるが
、これは本発明を説明するためのものであり、添付した特許請求の範囲にて定義
した本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【００９２】

【実施例】

実施例１ ヒトα２δ−Ａの配列（ｃ−ＤＮＡ Accession No. M76559.1）を用いて、Gen
bankの非重複タンパク質データベースに対する標準BLASTPサーチおよび発現した
配列タグデータベース（dbEST）対するTBLASTNサーチを実施した。α２δ−Ａに
対して相同性が高い４つの全長ＲＮＡ配列を特定した（ｃ−ＤＮＡ Accession N
o. AF040709.1, AF042792.1, AF042793.1, およびAB011130.1）。α２δ−Ｂの
ＤＮＡ配列はSEQ ID NO:１により規定され、α２δ−Ｂのアミノ酸配列はSEQ ID
NO:２により規定される。標準アライメントツールを使用すると、これら４つの
配列が同じ遺伝子の４つの異なる変異体を表すことが見出された。この遺伝子を
α２δ−Ｂと名付けた。配列データベースの別のサーチおよびCompugenソフトウ
ェアを用いて作成される専用クラスター配列の分析は、α２δ−Ｂに関連する別
の配列の特定を導いた。これはヒトＥＳＴ（Accession No. T80372.1, AA360556
.1, AI563965.1, N53512.1）、マウスEST（Accession No. AA000341.1）およびC
. elegansの配列（Accession No. CAA90091.1）に包含される。このため、最初
に特定されたα２δ−Ｂ、別の関連する配列がGenbankデータベースに寄託され
た。これらは次のAccession No.に対応する（ヒト：AI027237.1, AI026646.1, A
A994701.1, AA887514.1, AI275868.1, AI675521.1, AA906993.1, AA301068.1, A
I884536.1, AI862563.1, AI191453.1, AI241832.1, AA534927.1, AA329137.1, A
I586961.1, AA394008.1, AW007700.1, R38827.1, AA255807.1, H11152.1, R6073
6.1, T16903.1, AA435601.1,AI094263.1; マウス: AA008996.1；ラット：AI1050
56.1, AI502878.1）。

【００９３】 α２δ−Ｂは、アミノ酸レベルでα２δ−Ａと５３％一致および６９％で類似
している。α２δ−ＢのｍＲＮＡは５４８２bpの長さで、１１４５アミノ酸のタ
ンパク質をコードしている。特定されているα２δ−Ｂの３つのスプライシング
変異体は５′非翻訳領域においてのみ相違し、アミノ酸配列は変化していない。
α２δ−Ｂは既に公開されているヒト染色体3p21.3におけるコスミドコンティグ
からのゲノム配列とアラインさせる。このＤＮＡコンティグは、６００kb以上の
配列をカバーする。これらゲノムの配列のAccession No．は、Z84493.1、Z84494
.1、Z75743.1、Z75742.1、およびZ84492.1である。α２δ−Ｂの側にあるＤＮＡ
配列の分析は、ヒトとマウスの両方においてマッピングされているヒト染色体3p
213におけるα２δ−Ｂの側にある遺伝子の特定をもたらす。これらフランキン
グ遺伝子には、CIS、ＨｙaL1、GNAI-2 および GNAT-1 が包含される。マウスに
おいて、全てのフランキング遺伝子はマウス染色体9, 60cMに局在する。Jackson
Laboratoryによるマウス・ゲノム・データベースに蓄積されているマッピング
データの分析は、同じマウス染色体9, 60cM領域に遺伝的にマッピングされてい
た３つのマウスの神経の表現型の特定をもたらした。これらの表現型は、癲癇１
［epilepsy 1］、ダッキー［ducky］およびチッピー［tippy］が包含される。癲
癇１とダッキーは共に、癲癇を構成するスパイク波活性を有している。これは試
験的にα２δ−Ｂをマウスにおいて染色体9, 60cM領域にマップ化し、α２δ−
Ｂをマウスのダッキー、チッピーおよびEl1の変異体の遺伝子の候補として特定
する（マッピングデータの概略について図１を参照）。

【００９４】 ヒトα２δ−ＢのＲＮＡ発現レベルのノーザンおよびＲＴ−ＰＣＲ分析を実施
して、α２δ−Ｂの発現パターンを分析した。ノーザン分析のために、複数の組
織ノーザンブロットおよび脳ブロットをClontechから得た。α２δ−Ｂに対する
非アイソトープＤＮＡプローブは、鋳型としてSEQ ID NO:７−８およびSEQ ID N
O:１を用いるＰＣＲにより作成した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は
製品説明書に従った(Boehringer Mannheim）。α２δ−Ｂは、肺においてもっと
も高い発現を有することが見出され、そして脳、心臓、骨格筋において検出され
、試験したすべての組織において低レベルで検出された（図２）。ヒトの脳の異
なる領域を調査するノーザンブロットにおいては、α２δ−Ｂは大脳皮質におい
て最も高レベルで発現しているが、ヒトの脳のすべての領域において検出された
（図２）。α２δ−ＢのＲＴ−ＰＣＲ発現分析もまた実施した。ＲＴ−ＰＣＲ分
析は、ＰＣＲに基づく遺伝子増幅（サイクル：１×９４℃ １′；３５×９４℃
０.５′，５５℃ １′，７２℃ ２′；１×７２℃ １０′）においてClontechか
ら得たｃＤＮＡ組織パネルおよびSEQ ID NO:７−８を使用したが、ノーザンブロ
ット分析の結果と一致するα２δ−Ｂの発現パターンを得た。全体的には、α２
δ−Ｂの発現パターンは、癲癇におけるα２δ−Ｂの提案された役割と一致して
いる。

【００９５】 α２δ−Ｂがα２δ−Ａと類似する機能特性を有してるかを決定するために、
α２δ−Ｂのアミノ酸およびガバペンチンへの結合能を測定した。この分析にお
いて、ＣＯＳ−７細胞をリポフェタミン媒介トランスフェクション法により、そ
れぞれベクター pcDNA３（Invitrogen）（α₂δ−Ｂ用には pcDNA3.1）中におけ
るブタのα₂δ−Ａの全長とヒトα₂δ−Ｂ遺伝子で一時的にトランスフェクショ
ンした。細胞をトランスフェクションし、下記の概略の一般的方法により膜を収
集した。α２δ−Ｂへの［³Ｈ］ガバペンチンの結合に対するＫＤをα２δ−Ａ
と比較し、これを表１に示す。別の結合試験をそれら下記の概略と類似する技術
を使用して実施した。別法のプロトコルを副題「［³Ｈ］ガバペンチン結合を測
定するための別法」において下に列記した。これら結合の研究のデータを図３に
示す。全体的に、結合およびウェスタンのデータは、ＣＯＳ−７系にて一時的に
発現したブタα₂δ−Ａとヒトα₂δ−Ｂの全長遺伝子の産物は高い親和性にて［ ³ Ｈ］ガバペンチンと結合することを示した。

【００９６】

【表１】

【００９７】 一過性トランスフェクション法（１５０mmプレート） １：３.９×１０₆個のＣＯＳ−７細胞／１５０mmプレートを１５０mmプレート
における４２ml ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋５ｕ/mlペニシリン／５μｇ/mlスト
レプトマイシンに播種した。増殖Ｏ／Ｎ。

【００９８】 ２：セットアップ 試験管Ａ − ３００μｌ ＴＥ中の３０μｇ ＤＮＡ＋１.８ml Optimem (５ｕ/
mlペニシリン／５μｇ/mlストレプトマイシン) 試験管Ｂ − １５０μｌ Lipofectamine＋１.９５ml Optimem (５ｕ/mlペニシ
リン／５μｇ/mlストレプトマイシン)

【００９９】 ３：時間＝０にて試験管ＡおよびＢを混合し、ＲＴにて４５分間静置した。 ４：細胞を３０mlのOptimem（５ｕ/mlペニシリン／５μｇ/mlストレプトマイ
シン）で２回洗浄し、１６.８mlのOptimem（５ｕ/mlペニシリン／５μｇ/mlスト
レプトマイシン）をプレートに添加。ｔ＝４５分にて、Ａ／Ｂ混合物をプレート
に添加。 ５：ｔ＝６時間にて、２１mlのOptimem（５ｕ/mlペニシリン／５μｇ/mlスト
レプトマイシン）を添加。 ６：ｔ＝２４時間にて、培地を４２mlのOptimem（５ｕ/mlペニシリン／５μｇ
/mlストレプトマイシン)と置換。 ７：ｔ＝４８時間にて、細胞を２０mlのＰＢＳですすぎ、次いで収集。

【０１００】 膜の調製（４℃にて実施） １．セルスクレーパを用いて細胞を２mlのエッペンドルフ中の１.５mlの１mM
ＥＤＴＡ／１mM ＥＧＴＡ／０.１mM ＰＭＳＦ（使用する直前に１０００倍スト
ックから添加する）／２０％グリセロール／１０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４＠４
℃に収集する。 ２．細胞を４℃で３０分間混合し、次いで２０,０００×ｇにて５分間遠心分
離する。 ３．ペレットを１.５mlの１mM ＥＤＴＡ／１mM ＥＧＴＡ／２０％グリセロー
ル／１０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４＠４℃に再懸濁し、直ぐに再度２０,０００
×ｇにて５分間遠心分離する。 ４．〜１mg／ml（Bradford タンパク質アッセイにより測定したタンパク質濃
度）になるようにペレットを１mM ＥＤＴＡ／１mM ＥＧＴＡ／２０％グリセロー
ル／１０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４＠４℃中に再懸濁する。

【０１０１】 全［Ｈ³］結合について、細胞を３０〜４０秒間超音波処理し、７５０−１Ｏ
ＯＯ×ｇにて１０分間遠心分離し、上清を５０,ＯＯＯ×ｇにて３０分間遠心分
離した。得られたペレットを５mM中に再懸濁した。

【０１０２】 ［³Ｈ］ガバペンチン飽和結合アッセイ法およびデータ分析 アッセイを９６ウェル−ディープウェルプレート中に２５０μｌの最終容量に
て２１℃で実施した。二重のウェルを“全”結合および“非特異的”結合のため
にセットアップした。特異的結合は、“全”結合の値から“非特異的”結合の値
を差し引いた残りとして特定した。アッセイ成分は、次の順で添加した（全ての
試薬は１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４ ２１℃）中に希釈した）。

【０１０３】 全結合 ２００μｌ １０mM ＨＥＰＥＳ pH７.４ 非特異的結合 １７５μｌ １０mM ＨＥＰＥＳ pH７.４および１００μＭ (Ｓ+)−３−イソブチルＧＡＢＡ ２５μｌ 適当なＣＯＳ膜試料 ２５μｌ [３Ｈ]ガバペンチン

【０１０４】 反応は２１℃にて４５分間インキュベートし、５０mM Tris−Ｃｌ pH７.４＠
４℃にて湿らせたＧＦ／Ｂフィルターで濾過し、フィルターを洗浄緩衝液で３回
洗浄した。 次いでフィルターをシンチレーションカウンターで計測した。 飽和実験は、１２の二重データポイントおよび〜１から４００nMの範囲の［³
Ｈ］ガバペンチン濃度を用いて実施（“全”結合および“非特異的”結合を試験
した［³Ｈ］ガバペンチンの各濃度について２重にて測定）した。データはWindo
ws用のKEL-RADLIGを用いて分析した。

【０１０５】 ［³Ｈ］ガバペンチン結合を測定するための別法 下記の点をのぞいて上述の方法に従った。 １) ＣＯＳ７トランスフェクション：２０μｇのα２δ−Ａまたはα２δ−Ｂプ
ラスミドＤＮＡを３０μｌのリポフェクタミンと共にインキュベートした。混合
物を１.５mlの血清不含培地中の細胞上に塗布し、５時間インキュベートした。
次いで、ＦＢＳを最終濃度が１０％になるようにディッシュに添加した。翌朝、
培地を交換した。トランスフェクション後４８時間、膜の調製のために細胞を収
集した。

【０１０６】 ２) 膜の調製：細胞を冷ＰＢＳにて２回洗浄し、次いで冷やしたＰＭＳＦ（０.
１mM）、ロイペプチン（０.０２mM）およびペプスタチン（０.０２mM）を含有す
る５mM Ｔｒｉｓ／５mM ＥＤＴＡ（pH７.４）中に組織培養プレートを削り落と
した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いで３０〜４０秒間超音波処
理した。ホモゲネートを７５０〜１０００×ｇにて１０分間遠心分離し、次いで
上清を５０,０００×ｇにて３０分間遠心分離した。生じたペレットを上述した
同じ緩衝液中に再懸濁した。

【０１０７】 ３) 結合アッセイ：ラジオリガンド結合アッセイは、２０nMの［³Ｈ］ガバペン
チンの存在下にてインキュベートした０.０５mgの膜タンパク質を用いて行った
。膜は、１０mM ＨＥＰＥＳ（pH７.４）中で室温にて４０〜５０分間インキュベ
ートし、次いで予め湿らせたＧＦ／Ｃ膜でろ過し、直ぐに３mlの氷冷５０mM Ｔ
ｒｉｓ緩衝液 pH７.４で５回洗浄した。フィルターを乾燥し、液体シンチレーシ
ョンカウンターで計測した。結合のバックグラウンドを測定するため、１０μＭ
のイソブチルＧＡＢＡを用いて、得られたカウント数を各試料の全カウント数か
ら差し引いた。

【０１０８】 抗α₂ポリクローナル抗体を用いたα２δ−Ａおよびα２δ−Ｂ発現の検出 精製した抗α₂ポリクローナル抗体（ブタα₂δ−Ａ由来の抗原，詳細なｐＡｂ
の生成についてBrown and Gee (1998) JBC 273 p.25458-25465を参照）との親和
性を用いて、ブタα₂δ−Ａタンパク質およびヒトα２δ−Ｂタンパク質の発現
（コントロールのレベル−元のpcDNA３ベクターでトランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞-を越えるか）を確かめた。ｐＡｂのα₂δ−ＢとのN.B.交叉反応はアミ
ノ酸配列の〜５０％の一致が与えられると予期させる。さらに、実施例２を参照
すると、α₂δ−Ｃの発現は、この抗体を用いても検出されなかった（α₂δ−Ａ
との配列一致性 〜３０％）。

【０１０９】 実施例２ ヒトα₂δ−Ａの配列（Accession No. M76559.1）を用いて、Genbankの非重複
タンパク質データベースに対する標準BLASTPサーチおよび発現した配列タグデー
タベース（dbEST）対するTBLASTNサーチを実施した。ＥＳＴ配列が特定され（Ac
cession No. AA815447.1, AA190607.1, AI223142.1, AA188635.1, R43629.1, R2
0288.1, AA459684.1, AA662058.1, Z44942.1, Z40693.1, AI051759.1）、これを
α₂δ−Ａに類似する新規遺伝子に相当するα₂δ−Ｃと名付けた。配列データベ
ースの別のサーチは、α₂δ−Ｃに関連する他の配列の同定をもたらした。これ
にはマウスEST（Accession No. AU022914.1, AI843362.1）およびヒト染色体3p2
1.1に位置するSTS（Accession No. G36524.1）が包含される。α₂δ−Ｂの最初
の特定のため、追加の関連する配列はGenbankデータベースに寄託した。これら
は次のアクセス番号に相当する（ヒトEST：AA459804.1, AI696320.1, AI051759.
1, AI696214.1；ヒトゲノム配列：AC010180.1；マウスEST：AA445859.1；マウス
ＲＮＡ：AJ010949.1）。

【０１１０】 α₂δ−Ｃの全長をクローニングするために、Accession No. AA190607.1のＥ
ＳＴクローン由来の配列に基づき、２７３bpの断片が増幅されるように設計した
プライマー（SEQ ID NO:９−10）を使用するOrigeneにより、ＰＣＲベースｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングを実施した。陽性クローンが腎臓ライブラリ
ーにて特定された。配列決定後、このクローンは新規な３′スプライス変異体（
SEQ ID NO:43）として特定された。この新規なスプライス変異体の SEQ ID NO:4
3由来のタンパク質の配列はトランケートされたα２δ−Ｃの潜在的に分泌可溶
性型である。プライマー（SEQ ID NO:９および11）および鋳型としてLTIからの
ヒト成人の脳のライブラリーを使用してＰＣＲを実施し、２４８bpの得られた断
片をｐＢＳ中にクローン化して、配列を確かめた。腎臓クローンからのSacI-Nco
Ｉ断片、ＰＣＲセンタークローンからのNcoＩ−KpnＩ断片およびIMAGE協会から
得たクローン（Accession No. R43629.1に相当）からのKpnＩ−NotＩ断片は、当
該技術分野における標準的方法を使用して互いに連結して、全長のクローンを作
成した。各クローンおよび全長のクローン（SEQ ID NO:３）は配列の確認をした
。また、IMAGE協会から他のESTクローンを多数得て配列決定した。これらのクロ
ーンの１つ（Accession No. AI051759.1に相当）は、トランケートされたα₂δ
−Ｃの潜在的に分泌可溶性型（SEQ ID NO:44）である、２つの新規なスプライス
変異体を包含していた。

【０１１１】 全長のα₂δ−Ｃは、アミノ酸レベルでα₂δ−Ａと２８％と一致、そして４８
％が類似している。α₂δ−ＣのｍＲＮＡ配列（SEQ ID NO:３）は３７７０bpの
長さであり、１０８５アミノ酸（SEQ ID NO:５）のタンパク質をコードする。ま
た、α₂δ−Ｃの３つのスプライス変異体が同定されている。変異体のうち２つ
は、内部エクソンの欠失を包含している。３つ目の変異体は、新規な３′末端を
含有する。これらのスプライス変異体のうち２つは、膜結合デルタサブユニット
を欠失したトランケートされたタンパク質を生成する。これらの変異体は、電圧
感受性カルシウムチャンネルの制御の域を超えた付加的な機能を有し得る、分泌
されるα２タンパク質を示している。

【０１１２】 他の種由来のα₂δ−Ｃの配列を特定するため、ヒトおよびマウスに特異的な
プライマー（それぞれ、SEQ ID NO:９−10およびSEQ ID NO:12−13）を用いて、
α₂δ−ＣのＲＴ−ＰＣＲ産物を増幅した。ヒトの脳由来のＲＮＡは、Invitroge
n, Carlsbad, CA (catalog ＃D6030-15)から購入した。ラットおよびマウスの脳
由来のＲＮＡは、標準的な社内プロトコルを用いて単離した。第１ストランドの
ｃＤＮＡ合成は、Superscript 選択システム（LTI, Bethesda, MD, catalog ＃1
8090-019）を用いて達成した。エタノール沈殿したｃＤＮＡは、１×ＰＣＲ緩衝
液（０.２mM ｄＮＴＰ，１０pmol／ウェル フォワードプライマー，１０pmol／
ウェル リバースプライマーおよび０.５単位 プラチナ TAQ High Fidelity (LTI
, Bethesda, MD)）を含有するＰＣＲ混合物に添加した。。生成物は、９５℃で
５分間、次いで９５℃で１分間、５８℃で１分間、６８℃で２分間を３５サイク
ル繰り返し、最後に７２℃で１０分間伸長させて増幅した。ＰＣＲ産物は、１％
アガロースゲル（ＴＡＥ）ゲルにおいて１００ボルトで４５分間にてアッセイし
た。ゲルはＵＶ下で可視化し、写真を撮影した。生成物は、ＤＮＡ配列分析の前
にMillipore Ultrafree-MC ＰＣＲ精製フィルターユニット（catalog ＃UFC3LT
KOO）を用いて精製した。この手法を使用したのは、３セットのプライマー（SEQ
ID NO:36, 37; SEQ ID NO:12, 13; SEQ ID NO:38, 39）で、これらはラットα
２δ−ＣのＰＣＲ増幅に用いたものである。α２δ−Ｃにおける３つの部分的な
ラットの配列は一致していた（SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:41)。

【０１１３】 ＲＮＡ発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、α₂δ−Ｃの発現パターン
を分析した。ｃＤＮＡ発現パネルは、OriGene Technologies, Inc.（Rockville,
Maryland）から購入した。２４組織由来のヒトｃＤＮＡ（catalog ＃ HSC-101
）およびマウスｃＤＮＡ（catalog ＃ MSCB-101）を９６ウェルＰＣＲフォーマ
ットに予め配列させた。１×ＰＣＲ緩衝液（０.２mM ｄＮＴＰ，１０pmol／ウェ
ル フォワードプライマー，１０pmol／ウェル リバースプライマーおよび０.５
単位 プラチナ ＴＡＱ(LTI, Bethesda, MD)）を含有するＰＣＲ混合物を、各ウ
ェルに添加した。生成物は、９５℃で５分間、次いで９５℃で１分間、５８℃で
１分間、６８℃で２分間を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分間伸長
させて増幅した。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル（ＴＡＥ）ゲルにおいて１
００ボルトで４５分間にてアッセイした。ゲルはＵＶ下で可視化し、写真を撮影
した。ヒト鋳型からのこの増幅に用いたプライマーはSEQ ID NO:９−10に相当し
、マウス鋳型からのものはSEQ ID NO:12−13に相当する。ＲＴ−ＰＣＲにより、
α２δ−Ｃは広範囲の組織において発現することが見出された（表２）。α₂δ
−Ｃの最も高いレベルは、ヒトの脳において、そしてヒトの精巣および腎臓にお
いて検出された。ＲＴ−ＰＣＲに加えて、この遺伝子のｃＤＮＡ配列は、ヒトの
成人の脳のライブラリーにおいて検出され、また幼児の脳、ｈＮＴ神経細胞系、
精巣、全胎児、胞巣状横紋筋肉腫、腺癌およびプールされた生殖細胞系のライブ
ラリーにおいても検出された。

【０１１４】 ノーザンブロット分析はプローブとしてα２δ−Ｃを用いて実施した。ヒト全
ＲＮＡは Invitrogen (Carlsbad, CA) （脳の全ＲＮＡ(Cat #D6030-01)，腎臓の
全ＲＮＡ(Cat ＃D6070-01)，精巣の全ＲＮＡ(Cat ＃D6121-01)，肝臓の全ＲＮＡ
(Cat # D6080-015)）または Ambion Inc(Austin, TX)（胎盤の全ＲＮＡ(Cat ＃7
950)，心臓の全ＲＮＡ(Cat ＃7966)，肺の全ＲＮＡ(Cat #7968)）から得た。Ｒ
ＮＡは、ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動し、次いで荷電したナイロン膜（Am
bion Inc. (Austin TX) Cat ＃10104.）にトランスファーした。ＥＳＴクローン
（SEQ ID NO:47）はBamHIで消化して、ＲＮＡ合成反応において鋳型として用い
て³²Ｐ標識したプローブを得た。ＲＮＡを含有するナイロン膜は、Express Hyb
ハイブリダイゼーション溶液（Clontech Inc. (Palo Alto, CA)(Cat ＃8015-1)
）中にて２時間予備ハイブリダイズさせた。予備ハイブリダイゼーション後、³² Ｐ標識した４×１０⁶cpmのＲＮＡプローブを溶液に添加し、同じ溶液中にて２時
間ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後、ナイロンフ
ィルターを１時間、室温で２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを４回交換して洗浄した
。ナイロンフィルターを６８℃の０.２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳの溶液に移し、
溶液を４回交換して洗浄した。次いで、ナイロンフィルターをphosphoroimager
screens Molecular Dynamics（Sunnyvale, CA）に露呈し、Storm phosphorimage
r Molecular Dynamics（Sunnyvale, CA）において読んだ。ノーザン分析の結果
（図４）は、α２δ−Ｃがヒトの脳、腎臓および精巣において最も高いレベルで
発現していることを示している。

【０１１５】 α₂δ−Ｃがα₂δ−Ａに対して配列ホモロジーを有しており、そしてα₂δ−
ＡはＶＳＣＣsのサブユニットとして機能するため、実験を行ってα₂δ−Ｃがα
２δ−Ａと置換して、機能的なＶＳＣＣｓを生成するかを決定した。標準的技術
を用いてXenopus 卵母細胞を単離し、電荷ゲートＣａ²⁺チャンネルのα_1B、β_1C およびα₂δ−ＣサブユニットｃＲＮＡを注入した。ｃＲＮＡ注入の４日〜１週
間後、Ｃａ²⁺チャンネルの電流を、電荷キャリアとして５mM Ｂａ²⁺を用いる２
電極電圧クランプを使用して測定した。−８０mVの保持膜の電位から＋１０mVま
での試験パルスを適用して、Ｃａ²⁺チャンネルの電流を誘発した。試験パルスの
間に誘発されたピーク内向き電流を測定した。内向き電流の振幅は、電圧ゲート
Ｃａ²⁺チャンネルの発現レベルと比例している。

【０１１６】 α₂δサブユニットを持たないα_1B、β_1Cの発現は、１０５±１３nA（ｎ＝２
０）の平均振幅を有する電流を生成した。α_1Bおよびβ_1Cとα₂δＣサブユニッ
トの同時注射は、２１３±１２nA（ｎ＝２０，ｐ＜０.０１ α₂δサブユニット
がない場合との比較）までの電流の振幅において顕著な増加を生成した。これら
のデータは、α₂δＣがＣａ²⁺チャンネルにおいてα₂δ_Aと同様な作用を有して
おり、チャンネルの発現レベルを促進することを示唆している。しかし、α₂δ_C は、α₂δ_A程のチャンネルの発現における大きな作用を及ぼさず、α₂δ_Aの同時
注射にて観察された２０倍の増加と比較して、２倍の電流の増加しか引き起こさ
ない。全体としては、これら初期の機能の研究は、α₂δ−ＣがXenopus卵母細胞
へのα１およびβサブユニットとの同時注射後において電圧感受性カルシウムチ
ャンネル中のα₂δ−Ａと置換しうることを示している。

【０１１７】

【表２】

【０１１８】 実施例３ ヒトα２δ−Ａの配列（Accession No. M76559.1）を用いて、Genbankの非重
複タンパク質データベースに対するBLASTPサーチおよび発現した配列タグデータ
ベース（dbEST）対するTBLASTNサーチを実施した。EST配列が特定され（Accessi
on No. T70594.1, T96901.1, AA766033.1, AI160471.1, AA719773.1, AI003601.
1, AA442451.1, AA521470.1, AA770076.1, AA001411.1, AA001473.1, W22650.1,
H86016.1）、これをα２δ−Ａに類似する新規遺伝子に相当するα２δ−Ｄと
名付けた。配列データベースの別のサーチは、α₂δ−Ｄに関連する他の配列の
同定をもたらした。これにはヒト染色体12p13.3に由来するゲノム配列（Accessi
on No. AC005342.1, AC005343.1）が包含される。α２δ−Ｄの最初の特定のた
め、追加の関連する配列はGenbankデータベースに寄託した。これらk配列は次の
Accession No．に相当する（ヒトESTs: T96900.1, AI457823.1, A1377638.1 お
よび AI433691.1）。

【０１１９】 α２δ−Ｄクローンの全長を単離するために、Accession No．AA001473.1 の
ＥＳＴクローン由来の配列に基づき、３７２bpの断片が増幅されるように設計し
たプライマー（SEQ ID NO:18-19）を使用するOrigeneにより、ＰＣＲベースｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングを実施した。陽性クローンが胎盤のライブラ
リーにて特定された。ネスト化した内部プライマー（SEQ ID NO:20）を用いて確
かめた。このクローンを完全にシーケンスした。配列はＥＳＴ配列から得られた
配列の５′末端から３５０bp伸張していたが、これには５′末端は含まれていな
かった。

【０１２０】 ５′末端を得るために、２つの手法を行った。１つの手法では５′ＲＡＣＥ（
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を利用した。５′ＲＡＣＥでは、Clontechからの胎盤
ポリＡ＋ＲＮＡを用いて、Clontechから購入したMarathon ｃＤＮＡ増幅キット
を使用してＲＡＣＥ用ｃＤＮＡライブラリーを構築した。α２δ−Ｄの５′末端
の配列は、プライマーの第１セット：Marathon ｃＤＮＡアダプタープライマー
１（SEQ ID NO:45）および遺伝子特異的プライマーＩ（SEQ ID NO：21）を使用
した５′ＲＡＣＥ ＰＣＲにより得た。ＰＣＲ産物は、ネスト化したプライマー
のセット：アダプタープライマー２（SEQ ID NO:46）および遺伝子特異的プライ
マーII（SEQ ID NO:22）を使用して再度増幅させた。得られた１kbのＰＣＲ産物
は、ＴＡベクター（Invitrogen）中にクローン化して配列を決定した。配列分析
は、これがα２δ−Ｄの５′配列を含んでいることを明らかにした。

【０１２１】 α２δ−Ｄの５′末端を特定するために行った２つ目の手法は、α２δ−Ｄに
ついて知られている最も５′の配列を使用した、Edgeにより実施したＰＣＲベー
スライブラリースクリーニングである。９個のクローンが上述の方法によりＰＣ
Ｒ増幅され、SEQ ID NO:48 および SEQ ID NO:49のプライマーを用いて確かめた
。これら９個の陽性クローンは次いで標準的方法により配列を決定して確かめた
。９個の全てのクローンが互いに同じであったが、５′末端の手前約５００bpま
でであった。しかし、これらのクローンは、新規なヌクレオチド配列（SEQ ID N
O:16）が挿入されたα２δ−Ｄの新規なスプライス変異体を含有していた。

【０１２２】 全長のα２δ−Ｄは、アミノ酸レベルでα２δ−Ａと２８％と一致、そして４
７％が類似している。α２δ−ＣのｍＲＮＡ配列（SEQ ID NO:４）は５,０７３b
pの長さであり、１１２０アミノ酸（SEQ ID NO:６）をコードする。また、α２
δ−Ｄの２つのスプライス変異体が同定されている。変異体のうち１つは、内部
エクソンの７２bp（SEQ ID NO:15）の欠失を包含している。この変異体のアミノ
酸配列は、SEQ ID NO:17 に見出すことができる。２つ目の変異体は、新規な２
つの挿入物を含み、１つは３３８bpであり、１つは３０５bp（SEQ ID NO:16）で
ある。これらの挿入物は、実施例２にてα２δ−Ｃについて特定された、トラン
ケートされたタンパク質配列に相当するトランケートされたタンパク質（SEQ ID
NO:42）であると考えられる。

【０１２３】 ヒトα₂δ−ＤのＲＮＡの発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、α２δ
−Ｄの組織分布を分析した。ｃＤＮＡ発現パネルは、OriGene Technologies, In
c. (Rockville, Maryland)から購入した。２４組織由来のヒトｃＤＮＡ（catalo
g ＃HSC-101）およびマウスｃＤＮＡ（catalog ＃MSCB-101）を予め９６ウェル
ＰＣＲフォーマットに配列させた。１×ＰＣＲ緩衝液（０.２mM ｄＮＴＰ，１０
pmol／ウェル フォワードプライマー，１０pmol／ウェル リバースプライマーお
よび０.５単位 プラチナ ＴＡＱ (LTI, Bethesda, MD)）を含有するＰＣＲ混合
物を、各ウェルに添加した。生成物は、９５℃で５分間、次いで９５℃で１分間
、５８℃で１分間、６８℃で２分間を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１
０分間伸長させて増幅した。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル（ＴＡＥ）ゲル
において１００ボルトで４５分間にてアッセイした。ゲルはＵＶ下で可視化し、
写真を撮影した。α２δ−Ｄの場合、ヒトのパネルには２つの別のプライマーの
セットを使用して、スプライス変異体と野生型種を区別した（それぞれ、SEQ ID
NO:18 および 20, SEQ ID NO: 23 および 19）。

【０１２４】 α₂δ−ＤのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果（表３を参照）は、α₂δ−Ｄが広範囲の
組織において発現し、胎盤、副腎および膵臓で最も高いレベルで発現しているだ
けでなく、結腸以外のすべての組織で検出されたことを示している。注目すべき
は、α２δ−Ｄはヒトの脳にて検出され、これは神経の疾患における潜在的な役
割と矛盾しないことである。また、ＥＳＴ配列の組織分布に基づいて、α₂δ−
ＤのｃＤＮＡ配列は成人の脳、網膜、胎児の肝臓／脾臓、胎児の心臓、松果体お
よび精巣由来のヒトのライブラリーにおいて検出された。

【０１２５】

【表３】

【０１２６】 実施例４ α２δ−Ｂのノックアウト α２δ−Ｂのノックアウトマウスを作成するために、ゲノムシステム（catalo
g: BAC 4922 Mouse ES 129Svj PCR ベースライブラリースクリーニング）はプラ
イマーSEQ ID NO:25−26を使用してマウスＢＡＣライブラリーのＰＣＲベースス
クリーニングを実施したが、６５０bpのｃＤＮＡまたはゲノム断片が増幅される
と予想された。このスクリーニングから１つのＢＡＣ陽性クローン（ゲノムシス
テムＤＮＡコントロール番号: BAC-22401）を得た。同じプライマーを使用して
、ヒトＤＮＡプローブを作成した。このプローブをサザンブロットに使用して、
ＢＡＣから〜１０kbのマウスゲノムのHind III断片を特定し、プラスミドベクタ
ーpRS416（Stratagene）のHind II部位にサブクローニングした。２つの別のサ
ブクローンを、Ｔ３およびＴ７プライマー並びに SEQ ID NO:25−32を使用して
標準技術によりシーケンスした。１０kbのゲノム断片の５′および３′末端由来
の配列の２つの５００bp領域（それぞれSEQ ID NO:33 およびSEQ ID NO:34）と
１.８kbの配列コンティグ（SEQ ID NO:35）を特定した。このゲノム配列を使用
して、マウスα２δ−Ｂ遺伝子の部分のイントロン／エクソン構造を特定するこ
とができるが、α２δ−Ｂ遺伝子の発現に重要な制御エレメントを含みうる。

【０１２７】 実施例５ α２δ遺伝子によりコードされるアミノ酸の同定 α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄのアミノ酸配列はSEQ ID NO:５と SEQ ID NO:６
に示すが、これらはSEQ ID NO:３と SEQ ID NO:４に記載のヌクレオチド配列の
翻訳により決定され、α２δ−Ａ、α２δ−Ｂ、α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄの
アミノ酸配列をアラインさせた。各アミノ酸配列について正確なオープンリーデ
ィングフレームを、他のα２δ−Ａのホモログに対するアミノ酸配列のホモロジ
ーに基づいて決定した。アミノ酸レベルにおいて、α２δ−Ｃは、α２δ−Ａと
は２８％が一致し、４８％が類似しており、α２δ−Ｂとは２８％が一致し、４
７％が類似していた。また、α２δ−Ｄは、α２δ−Ａとは２８％が一致し、４
７％が類似しており、α２δ−Ｂとは２８％が一致し、４６％が類似していた。
α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄはα２δ−Ａに関連するものであるが、これらは明
らかに新規で、異なる遺伝子である。

【０１２８】 実施例６ α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄの抗体を使用する、α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄタ
ンパク質を検出する方法 抗体は、α２δ−Ｃおよびα２δ−Ｄに特有のエピトープを特異的に検出する
抗体、または全てのα２δタンパク質を検出する抗体を開発することができた。
これらの抗体は、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄと一致するペプチドを合
成することにより、あるいはα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄのいずれかを含有する
融合タンパク質を細菌によって発現させ、次いでこれらのペプチドを実験動物に
注射して免疫原応答を刺激することにより開発することができた。そのような方
法で作成した抗体を使用して、細胞中のα２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄタ
ンパク質のレベルを検出することができた。これは、免疫細胞化学により行うこ
とができ、細胞をまるごと固定して、次いで抗体を用いて細胞全体においてα２
δ−Ｃまたはα２δ−Ｄの発現を検出し、そしてα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄの
サブ細胞局在を検出する。あるいは、細胞を溶解して、タンパク質抽出物を作成
し、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄの発現について分析することができる
。

【０１２９】 実施例７ ｃＤＮＡライブラリー用のＲＮＡの単離 細胞からα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄを単離するために、当業者に知られた標
準的技術を用いて目的の任意の組織から細胞を溶解させることによりＲＮＡを単
離することができた。単離した後、ＲＮＡは逆転写酵素およびポリ（Ｔ）プライ
マーまたはランダムプライマーミックスを使用してｃＤＮＡに逆転写する。特定
な時期においてはじめの細胞集団において発現している非常に多くの遺伝子を表
すｃＤＮＡの混合物が作成される。一度、ｃＤＮＡプールが作成されれば、当該
分野で標準的な方法を使用して制限酵素で消化して、次いでクローニングベクタ
ー中に連結することができる。この結果がｃＤＮＡライブラリーとなる。

【０１３０】 実施例８ ｃＤＮＡクローニング法 α２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄは、上述のように作成したｃＤＮＡライブラリー
から、鋳型としてｃＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応においてα２δ−Ｃま
たはα２δ−Ｄヌクレオチド配列に対する特異的なプライマーを使用することに
よりクローニングすることができた。また、α２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄの配列
をプローブとして用いて、ハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることができた。いずれかの技術を使用して、単一のコロニ
ーをライブラリーから最終的に単離して、標準的技術を用いてシーケンスする。
ライブラリーからの多数のコロニーをシーケンスすることにより、α２δ−Ｃま
たはα２δ−Ｄの選択的スプライシング変異体の存在、単一ヌクレオチドの多型
性、またはα２δ−Ｃもしくはα２δ−Ｄにおける突然変異／選択の存在を探す
ことができた。

【０１３１】 実施例９ 抗体を用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング α２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄに対する抗体を用いて、ｃＤＮＡライブラリーも
スクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリーを、クローニングされた挿入物のタ
ンパク質発現を誘導しうるベクターにクローニングした。完全なｃＤＮＡライブ
ラリーを誘導して、クローニングされた挿入物を表すタンパク質を発現させ、こ
れらがα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄに対して作成された抗体とハイブリダイズす
る場合には、α２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄをコードする挿入物を含む単一コロニ
ーが特定される。陽性クローンを単離し、次いで標準的方法を用いてシーケンス
した。

【０１３２】 本発明は、詳細な操作、あるいは示し且つ記載した化合物、組成物、方法、手
法または態様に厳密に限定されるものではないと理解されるべきであり、当業者
によれば本発明の改良および同等なものもまた本発明であることは明らかである
。故に本発明は、添付した特許請求の範囲の全ての範囲にのみ限定されるもので
ある。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ネズミ染色体９におけるα２δ−Ｂの微細な地図を表す。

【図２】 ヒトα２δ−Ｂの組織における分布を表す。

【図３】 ＣＯＳ７に一過的にトランスフェクションしたヒトα２δ−Ｂによる［³Ｈ］
ガバペンチンの結合活性を表す。

【図４】 ヒトα２δ−Ｃの組織における分布を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/08 Ａ６１Ｐ 25/20 ４Ｃ０８４ 25/16 25/22 ４Ｃ０８６ 25/20 25/28 ４Ｈ０４５ 25/22 25/30 25/28 29/00 25/30 35/00 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１１４，０８８ (32)優先日 平成10年12月29日(1998．12．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 ジェイムズ・デイヴィッド・オフォード アメリカ合衆国ミシガン州48105．アンア ーバー．アランマークドライブ3388 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 CB01 CB26 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA61 BA80 CA02 CA04 CA09 DA03 HA03 HA17 4B063 QA18 QA19 QQ08 QQ12 QQ43 QQ52 QR55 QR59 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AA90 AA93 AB04 BA02 CA23 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 AA13 BA44 CA17 CA18 CA53 DC50 NA14 ZA05 ZA06 ZA08 ZA12 ZA15 ZA18 ZB26 ZC42 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA05 ZA06 ZA08 ZA12 ZA15 ZA18 ZA42 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 EA34 EA50 FA74

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４に示されるＤＮＡ配列と実
   質的に類似する、単離・精製したＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 SEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４に示されるＤＮＡ配列と高
   ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、単離
   ・精製したＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 本質的にSEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４に示されるＤＮＡ
   配列からなる、単離・精製したＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 SEQ ID NO:５またはSEQ ID NO:６により発現されるポリペプ
   チドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有する、単離
   ・精製したＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 SEQ ID NO:３またはSEQ ID NO:４に示されるＤＮＡ配列に完
   全に相補的である、単離・精製したＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】 染色体外ベクター中にサブクローン化した請求項３または４
   に記載の単離・精製したＤＮＡ配列からなる組換えＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換した宿
   主細胞からなる組換え宿主細胞。
8. 【請求項８】 実質的に精製した組換えポリペプチドのアミノ酸配列がSEQ
   ID NO:５またはSEQ ID NO:６に示されるアミノ酸配列と実質的に類似する、実質
   的に精製した組換えポリペプチド。
9. 【請求項９】 ポリペプチドがSEQ ID NO:５またはSEQ ID NO:６に示される
   アミノ酸配列と類似する少なくとも約７０％のアミノ酸配列を有する、請求項８
   に記載の実質的に精製した組換えポリペプチド。
10. 【請求項１０】 実質的に精製した組換えポリペプチドのアミノ酸配列が本
    質的にSEQ ID NO:５またはSEQ ID NO:６に示されるアミノ酸配列からなる、実質
    的に精製した組換えポリペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項８に記載のアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ
    酸配列を有するポリペプチドと選択的に結合する抗体。
12. 【請求項１２】 細胞を請求項１１に記載の抗体と接触させ、α２δ−Ｃま
    たはα２δ−Ｄタンパク質−抗体複合体の検出を可能にするような様式で細胞を
    インキュベートすることからなる、細胞中のα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄタンパ
    ク質を検出する方法。
13. 【請求項１３】 細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、請求項１、２または３
    に記載の単離・精製したＤＮＡ配列から誘導されるプライマーを用いるＰＣＲ増
    幅に供するかまたはゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーション法により直接分析し
    、得られたＰＣＲ産物が突然変異を含むかを決定することからなる、α２δ−Ｃ
    またはα２δ−Ｄ変異体を含む細胞を検出する診断アッセイ。
14. 【請求項１４】 全細胞ＲＮＡを単離し、請求項１、２または３に記載の単
    離・精製したＤＮＡ配列から誘導されるプライマーを用いる逆転写−ＰＣＲ増幅
    にＲＮＡを供して、そして得られたＰＣＲ産物が突然変異を含むかを決定するこ
    とからなる、α２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄ変異体を含む細胞を検出する診断アッ
    セイ。
15. 【請求項１５】 請求項１、２または３に記載のＤＮＡ配列の領域を増幅す
    る方法であって、請求項１、２または３に記載の所望の配列またはその部分を含
    有すると推測される試験試料を増幅反応試薬と接触させる工程を含む方法。
16. 【請求項１６】 試験試料中の請求項１、２または３に記載のＤＮＡ配列の
    少なくとも１コピーの存在を検出するための診断キットであって、前記キットが
    プライマー、プライマーのペアまたはプローブおよび任意的に増幅試薬を含有す
    るキット。
17. 【請求項１７】 請求項８、９または１０に記載のポリペプチドおよび請求
    項８、９または１０に記載のポリペプチドに結合するリガンドとの間の相互作用
    に干渉するか、またはこれを模倣する治療用化合物の検出またはスクリーニング
    するためのアッセイ。
18. 【請求項１８】 アッセイが次の工程 (ａ) 請求項８、９または１０に記載のポリペプチドを供給し、 (ｂ) 候補の物質を得て、 (ｃ) 前記ポリペプチドを前記候補の物質と接触させ、 (ｄ) 前記ポリペプチドと前記候補の物質とで形成された複合体を検出する ことからなる請求項１７に記載のアッセイ。
19. 【請求項１９】 請求項１、２または３に記載の単離・精製したＤＮＡ配列
    を含む発現ベクターを哺乳類細胞中に導入することからなる、異常カルシウム変
    動から哺乳類細胞を保護する方法であって、前記ＤＮＡ配列が哺乳類細胞におい
    て単離・精製したＤＮＡ配列の高レベルの発現を促進するＤＮＡ配列に作動的に
    連結されている方法。
20. 【請求項２０】 請求項１、２または３に記載の単離・精製したＤＮＡ配列
    を含む発現ベクターを哺乳類に導入することからなる、癲癇を治療または予防す
    る方法であって、前記ＤＮＡ配列が哺乳類細胞において単離・精製したＤＮＡ配
    列のアンチセンスストランドの高レベルの発現を促進するＤＮＡ配列に作動的に
    連結されている方法。
21. 【請求項２１】 (ａ) 宿主細胞中において目的の遺伝子を発現させうるプ
    ロモーターに作動的に連結された請求項１、２または３に記載の単離・精製した
    ＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションし、 (ｂ) 細胞中において単離・精製したＤＮＡ配列の発現を誘導し、 (ｃ) 細胞を溶解させ、 (ｄ) 細胞からα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄタンパク質を単離し、そして (ｅ) 単離物からα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄタンパク質を精製する ことからなる、細胞からα２δ−Ｃまたはα２δ−Ｄタンパク質を精製する方法
    。
22. 【請求項２２】 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14−16、SEQ ID NO:21−24、SE
    Q ID NO:31−35、SEQ ID NO:40−41、SEQ ID NO:43−44、SEQ ID NO:47−48また
    はSEQ ID NO:49に示されるＤＮＡ配列に実質的に類似する、単離・精製したＤＮ
    Ａ配列。
23. 【請求項２３】 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14−16、SEQ ID NO:21−24、SE
    Q ID NO:31−35、SEQ ID NO:40−41、SEQ ID NO:43−44、SEQ ID NO:47−48また
    はSEQ ID NO:49に示されるＤＮＡ配列と高ストリンジェントなハイブリダイゼー
    ション条件下でハイブリダイズする、単離・精製したＤＮＡ配列。
24. 【請求項２４】 本質的にSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14−16、SEQ ID NO:21
    −24、SEQ ID NO:31−35、SEQ ID NO:40−41、SEQ ID NO:43−44、SEQ ID NO:47
    −48またはSEQ ID NO:49に示されるＤＮＡ配列からなる、単離・精製したＤＮＡ
    配列。
25. 【請求項２５】 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14−16、SEQ ID NO:21−24、SE
    Q ID NO:31−35、SEQ ID NO:40−41、SEQ ID NO:43−44、SEQ ID NO:47−48また
    はSEQ ID NO:49に示されるＤＮＡ配列により発現されるポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有する、単離・精製したＤＮ
    Ａ配列。
26. 【請求項２６】 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14−16、SEQ ID NO:21−24、SE
    Q ID NO:31−35、SEQ ID NO:40−41、SEQ ID NO:43−44、SEQ ID NO:47−48また
    はSEQ ID NO:49に示されるＤＮＡ配列と完全に相補的な単離・精製したＤＮＡ配
    列。
27. 【請求項２７】 実質的に精製された組換えポリペプチドがSEQ ID NO:17ま
    たはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列と実質的に類似する、実質的に精製さ
    れた組換えポリペプチド。
28. 【請求項２８】 ポリペプチドがSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:42に示され
    るアミノ酸配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列の類似性を有する、請求項
    ２６に記載の実質的に精製された組換えポリペプチド。
29. 【請求項２９】 実質的に精製された組換えポリペプチドのアミノ酸配列が
    本質的にSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列からなる、実
    質的に精製された組換えポリペプチド。
30. 【請求項３０】 請求項２６に記載のアミノ酸配列と実質的に類似するアミ
    ノ酸配列を有するポリペプチドと選択的に結合する抗体。
31. 【請求項３１】 ポリヌクレオチド配列が本質的に M76559.1、AF040709.1
    、AF042792.1、AF042793.1、AB011130.1、T80372.1、AA360556.1、AI563965.1、
    N53512.1、AA000341.1、CAA90091.1、AI027237.1、AI026646.1、AA994701.1、AA
    887514.1、AI275868.1、AI675521.1、AA906993.1、AA301068.1、AI884536.1、AI
    862563.1、AI191453.1、AI241832.1、AA534927.1、AA329137.1、AI586961.1、AA
    394008.1、AW007700.1、R38827.1、AA255807.1、H11152.1、R60736.1、T16903.1
    、AA435601.1、AI094263.1、AA008996.1、AI105056.1、AI502878.1、Z84493.1、
    Z84494.1、Z75743.1、Z75742.1、Z84492.1、AA815447.1、AA190607.1、AI223142
    .1、AA188635.1、R43629.1、R20288.1、AA459684.1、AA662058.1、Z44942.1、Z4
    0693.1、AI051759.1、AU022914.1、AI843362.1、G36524.1、AA459804.1、AI6963
    20.1、AI051759.1、AI696214.1、AC010180.1、AA445859.1、AJ010949.1、AA1906
    07.1、AI051759.1、T70594.1,T96901.1、AA766033.1、AI160471.1、AA719773.1
    、AI003601.1、AA442451.1、AA521470.1、AA770076.1、AA001411.1、AA001473.1
    、W22650.1、H86016.1、AC005342.1、AC005343.1、T96900.1、AI457823.1、AI37
    7638.1 および AI433691.1、AA001473.1 並びに SEQ ID NO:１−16、SEQ ID NO:
    18−41またはSEQ ID NO:43−49のいずれかのポリヌクレオチド配列からなる群か
    ら選択される、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄ遺伝子の変化、またはα２
    δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄを包含する細胞の経路の変化に起因しうる疾病
    を治療するためのポリヌクレオチド配列の使用方法。
32. 【請求項３２】 疾病が、本質的に痙攣に関連する症候群、偏頭痛、運動失
    調、前庭欠損、慢性の痛み、感情障害、睡眠干渉、不安、ＡＬＳ、多発性硬化症
    、躁病、震え、パーキンソン症候群、物質乱用／依存症候群、感情障害、うつ病
    および癌からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
33. 【請求項３３】 ポリヌクレオチド配列が本質的に M76559.1、AF040709.1
    、AF042792.1、AF042793.1、AB011130.1、T80372.1、AA360556.1、AI563965.1、
    N53512.1、AA000341.1、CAA90091.1、AI027237.1、AI026646.1、AA994701.1、AA
    887514.1、AI275868.1、AI675521.1、AA906993.1、AA301068.1、AI884536.1、AI
    862563.1、AI191453.1、AI241832.1、AA534927.1、AA329137.1、AI586961.1、AA
    394008.1、AW007700.1、R38827.1、AA255807.1、H1ll52.1、R60736.1、T16903.1
    、AA435601.1、AI094263.1、AA008996.1、AIl05056.1、AI502878.1、Z84493.1、
    Z84494.1、Z75743.1、Z75742.1、Z84492.1、AA815447.1、AA190607.1、AI223142
    .1、AA188635.1.R43629.1、R20288.1、AA459684.1、AA662058.1、Z44942.1、Z40
    693.1、AI051759.1、AU022914.1、AI843362.1、G36524.1、AA459804.1、AI69632
    0.1、AI051759.1、AI696214.1、AC010180.1、AA445859.1、AJ010949.1、AA19060
    7.1、AI051759.1、T70594.1、T96901.1、AA766033.1、AI160471.1、AA719773.1
    、AI003601.1、AA442451.1、AA521470.1、AA770076.1、AA001411.1、AA001473.1
    、W22650.1、H86016.1、AC005342.1、AC005343.1、T96900.1、AI457823.1、AI37
    7638.1、および AI433691.1、AA001473.1 並びに SEQ ID NO:１−16、SEQ ID NO
    :18−41または SEQ ID NO:43−49 のいずれかのポリヌクレオチド配列からなる
    群から選択される、α２δ−Ｃおよび／またはα２δ−Ｄの変化または欠損に起
    因する疾病の存在または疾病への感受性を試験するためのポリヌクレオチド配列
    の使用方法。
34. 【請求項３４】 ポリヌクレオチド配列が本質的に M76559.1、AF040709.1
    、AF042792.1、AF042793.1、AB011130.1、T80372.1、AA360556.1、AI563965.1、
    N53512.1、AA000341.1、CAA90091.1、AI027237.1、AI026646.1、AA994701.1、AA
    887514.1、AI275868.1、AI675521.1、AA906993.1、AA301068.1、AI884536.1、AI
    862563.1、AI191453.1、AI241832.1、AA534927.1、AA329137.1、AI586961.1、AA
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    Z84494.1、Z75743.1、Z75742.1、Z84492.1、AA815447.1、AA190607.1、AI223142
    .1、AA188635.1、R43629.1、R20288.1、AA459684.1、AA662058.1、Z44942.1、Z4
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    20.1、AI051759.1、AI696214.1、AC010180.1、AA445859.1、AJ010949.1、AA1906
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    、AI003601.1、AA442451.1、AA521470.1、AA770076.1、AA001411.1、AA001473.1
    、W22650.1、H86016.1、AC005342.1、AC005343.1、T96900.1、AI457823.1、AI37
    7638.1、および AI433691.1、AA001473.1 並びに SEQ ID NO:１−16、SEQ ID NO
    :18−41 または SEQ ID NO:43−49のいずれかのポリヌクレオチド配列からなる
    群から選択される、ガバペンチンに対するポリヌクレオチド配列の結合可能性を
    特定するためのポリヌクレオチド配列の使用方法。