JP2002523469A - Ｄｎａワクチン接種の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 疾病状態に対して哺乳動物に予防接種する方法であって、適切なベクターの中にある、前記疾病状態と関連する抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を前記哺乳動物に投与することと；さらに、前記抗原ペプチドによって開始される液性免疫反応と細胞性免疫反応の両者を増強する化合物であって、本明細書中に含まれる表から選択される化合物、好ましくはツカレソール、又は、適切な場合には、その生理学的に許容される塩、又はそれらのエステルを前記哺乳動物に投与することを備えた方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、ＤＮＡワクチン接種の改良、とりわけ、疾病状態に対して免疫にな
るように哺乳動物に予防接種する方法、ワクチン組成物、及び医薬の製造におけ
るある種の化合物の使用に関するが、これらに限定されるものではない。

【０００２】

【発明の背景】

動物に免疫応答を誘導し得る抗原を動物系の中に導入することにより、感染か
ら動物を保護することを含む伝統的なワクチン接種手法は、長年にわたって知ら
れている。プラスミドＤＮＡが、インビボで直接動物細胞をトランスフェクトで
きるという１９９０年初期の観察に従って、抗原ペプチドをコードするＤＮＡを
動物の中に直接導入することにより、免疫応答を誘導するためのＤＮＡプラスミ
ドの使用に基づいたワクチン接種手法を開発するために、多大な研究の努力が企
てられてきた。現在では、「ＤＮＡ免疫化」又は「ＤＮＡワクチン接種」と称さ
れるこのような手法は、ウイルス性、細菌性、及び寄生虫疾病の広範な前臨床モ
デルに感染防御抗体（液性）及び細胞媒介性（細胞性）免疫反応を誘起するため
に使用されている。癌、アレルギー、及び自己免疫疾患の治療及び保護における
ＤＮＡワクチン接種手法の使用に関する研究も進行中である。

【０００３】 ＤＮＡワクチンは、通常、その中に強力なウイルスプロモーターが挿入されて
いる細菌プラスミドベクター、抗原ペプチドをコードする対象遺伝子、及びポリ
アデニル化／転写終結配列からなる。対象遺伝子は、完全なタンパク質をコード
してもよく、あるいは、単に病原体、腫瘍、又はそれに対する保護を意図してい
るその他の病原体に関連する抗原ペプチド配列をコードしてもよい。前記プラス
ミドは、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉのような細菌の中で増殖させてから、単離され、
宿主に投与する前に、所望の投与経路に応じた適切な媒体中に調製することがで
きる。投与後、プラスミドは、宿主の細胞に取り込まれ、そこでコードされてい
るペプチドが産生される。哺乳動物の宿主内でのプラスミドの複製と当該動物の
染色体ＤＮＡへの組み込みを防ぐために、プラスミドベクターは、真核細胞中で
機能する複製起点を持たないように作成することが好ましいであろう。

【０００４】 伝統的なワクチン接種手法に比べて、ＤＮＡワクチン接種には数多くの利点が
ある。第１に、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質が宿主内で合成され
るので、タンパク質の構造又はコンホメーションは、疾病状態に関与する天然状
態のタンパク質と類似しているだろうと予想される。保存されたタンパク質から
のエピトープを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球反応を引き起こすことによって、
ＤＮＡワクチン接種は、様々なウイルス株に対する保護を与えるであろうとも思
われる。さらに、プラスミドは、抗原タンパク質が産生され得る場所である宿主
細胞によって取り込まれるので、長期にわたる免疫反応が誘起されるであろう。
この手法は、多くの疾病状態に対する同時免疫化を促進するために、単一の調製
物の中に様々な免疫原を混合するという可能性も与える。

【０００５】 ＤＮＡワクチン接種に関する有益な背景情報は（１）に示されており、その開
示全体が、参考文献として本明細書に包含される。

【０００６】 伝統的なワクチン療法に対してＤＮＡワクチン接種が有する数多くの利点にも
かかわらず、動物に投与されるプラスミドＤＮＡによってコードされるタンパク
質によって誘導された免疫反応を増大させるのに役立つであろうアジュバント化
合物を開発することが、なお望まれている。

【０００７】 この理由の１つは、ＤＮＡワクチンはマウスモデルではよく機能する傾向があ
るが、ヒト以外の霊長類等のより大きな種では、幾分効力が弱いという証拠が存
在し（２、３）、これはヒトでも同様の効力しか得られないことを予想させるも
のと考えられていることである。アジュバントは、特に、直接表皮に投与したと
きに（４）、ＤＮＡワクチン接種に伴うことがあるＴｈ１からＴｈ２反応への不
適切な免疫反応の逸脱を是正するのにも有用であり得る。最後に、ＤＮＡ自体も
、ＣｐＧモチーフを介して、何らかのアジュバント特性を示すことがあり（５、
６、７）、これは、ＤＮＡワクチンを筋肉内に投与された、より小さな動物にお
いて顕著であるが、より大きな種においては、又は「遺伝子銃」投与のように少
量のＤＮＡを投与したときには減弱することが認められている。

【０００８】 従って、ＤＮＡワクチン接種法と共に使用できるアジュバント化合物を提供す
ることが本発明の課題の１つである。このようなアジュバントを用いる改良され
たワクチン接種法、及び前記アジュバントを含む組成物を提供することも課題で
ある。本発明の他の課題は、以下の本発明の詳細な記述から明らかとなるであろ
う。しかしながら、主に、伝統的なワクチン手法と比べたＤＮＡワクチン接種に
伴う機構的相違のために、これまでは、これらの課題を解決することは困難であ
った。

【０００９】 文献は、ＤＮＡワクチン接種から生じる、動物モデルでの液性免疫反応の例を
多数報告している。とりわけ、ヒト成長ホルモンとヒトα−１抗トリプシン（８
）に対して、インフルエンザＮＰ（９）に対して、ＨＩＶエンベロープタンパク
質（１０）、ウシヘルペスウイルス糖タンパク質（１１）、及びＢ型肝炎表面抗
原（１２）に対する抗体反応が、それらをコードするプラスミドＤＮＡを投与し
た後に示されてきた。細胞傷害性Ｔ細胞反応も、ＤＮＡワクチン接種の動物モデ
ルで実証されてきた。細胞傷害性Ｔ細胞の生成は、２〜３の例として、インフル
エンザＡからのＮＰ（１３）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ Ａｇ）６５とコア抗
原（１４）、及びＨＩＶ Ｅｎｖ（１５、１６、１７）に対して実証されてきた
。しかしながら、ヘルパーＴ細胞の反応はプラスミドＤＮＡの送達様式に依存す
るらしいということに注目するのは興味深い。筋肉内投与は、ヘルパーＴ細胞反
応をＴｈ１様反応に片寄らせるのに対して、主に表皮に投与すると、免疫反応を
Ｔｈ２様反応の方に片寄らせる（４）。さらに、ＤＮＡワクチン接種手法と組み
合わせて、多くの公知の免疫賦活剤が試されてきたが、不十分な成功か、せいぜ
い一定しない成功しかもたらされていないことが注目される。例えば、ＧＭ−Ｃ
ＳＦと狂犬病ウイルス糖タンパク質（１８）及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ；ｃａ
ｒｃｉｎｏｅｍｂｒｏｙｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（１９））との同時発現、並び
にＢ７−１とＢ７−２ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＨＳＰ６５（２０）又
はＣＥＡ（１９）との同時発現は全て、抗原のみの発現に比べて、より高い抗体
力価を誘導したが、細胞性免疫応答が増大したという報告は存在しない。また、
興味深いことに、狂犬病ウイルス糖タンパク質は、インターフェロンγをコード
するＤＮＡと同時に投与すると、実際に、抗体反応に対して阻害的な効果を有し
ていた（１８）。

【００１０】 このような背景に留意すれば、本発明者らが、液性免疫反応を刺激するのみな
らず、細胞性免疫反応機構も同時に刺激するという二重作用を示すアジュバント
化合物を報告していることは、最も驚異的な特筆すべきことである。ＤＮＡワク
チン接種に関してこの特筆すべきアジュバント活性が、最近実証された化合物は
、それらの免疫賦活活性と関連して、国際特許公開ＷＯ９４／０７４７９号に開
示された。好ましいＤＮＡワクチンアジュバント活性を有するとして本発明者ら
によって同定された具体的な化合物の１つは、ツカレソール（ｔｕｃａｒｅｓｏ
ｌ）としても知られ、最初にＥＰ第００５４９２４号に記載された４−（２−ホ
ルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸である。ここでＤＮＡワク
チンとのアジュバントとして作用するのに適していると、本発明者らによって同
定された化合物は何れも、液性免疫原活性と細胞性免疫原性活性を有し、そのた
めに、これらの化合物がＤＮＡワクチンのアジュバントとしての役割に適してい
ることが以前に開示又は示唆されたことはない。

【００１１】

【発明の概要】

本発明のある態様によれば、疾病状態に対して哺乳動物に予防接種する方法で
あって、 適切なベクターの中にある、前記疾病状態と関連する抗原ペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を前記哺乳動物に投与することと； さらに、前記抗原ペプチドによって開始される液性免疫反応と細胞性免疫反応
の両者を増強する化合物であって、 ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタンアミド； Ｎ，Ｎ−ジエチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ンアミド； Ｎ−イソプロピル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ンアミド； エチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノニトリル； （±）−５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−メチルペン
タン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２，２−ジメチルペンタ
ン酸； メチル ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチルベンゾエー
ト； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチル安息香酸； ベンジル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート
； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−ブチル］テト
ラゾール； ７−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘプタン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−ｎ−プロポキシフェノキシ）ペン
タン酸； ５−（４，６−ジクロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−メチルスルホニルペ
ンタンアミド； エチル ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）ベンゾエー
ト； ５−（４−クロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタン酸； ５−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシ）ペンタン酸； アミノグアニジン； ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ブタン酸； ６−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサン酸； エチル ４−（３−アセチルアミノ（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｉｏ）−２−ホル
ミルフェノキシメチル）ベンゾエート； ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）安息香酸； ２−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）フェニル］テ
トラゾール； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェノキシ）ペンタン酸
； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）プロピオニトリル； ４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド； フェニルアセトアルデヒド； ４−メトキシフェニルアセトアルデヒド； １−ヒドロキシ−２−フェニルプロパン； ３−フェニルプロポニオンアルデヒド（３−Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｏｎｉｏｎ
ａｌｄｅｙｄｅ）； ４−ニトロベンズアルデヒド； メチル ４−ホルミルベンゾエート； ４−クロロベンズアルデヒド； ４−メチルオキシベンズアルデヒド； ４−メチルベンズアルデヒド； ８，１０−ジオキソウンデカン酸； ４，６−ジオキソヘプタン酸； ペンタンジオン； ５−メトキシ−１−テトラロン； ６−メトキシ−１−テトラロン； ７−メトキシ−１−テトラロン； ２−テトラロン； ３−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ブタノン
； ２’，４’−ジヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ２−ヒドロキシ−１−（４−メトキシ（ｍｅｔｈｙｏｘｙ）フェニル）−ペン
ト−２エン−４オン； ナリンゲニン ４’，５，６−トリヒドロキシフラボノン； ４’−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ６，７−ジヒドロキシクマリン； ７−メトキシ−２−テトラロン； ６，７−ジメトキシ−２−テトラロン； ６−ヒドロキシ−４−メチルクマリン； ホモゲンチジン酸γ−ラクトン； ６−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン； ８−メトキシ−２−テトラロン； 及び、適切な場合には、生理学的に許容されるその塩 から選択される化合物を前記哺乳動物に投与することと を備えた方法が提供される。

【００１２】 好ましくは、前記ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。

【００１３】 好ましくは、前記化合物の１乃至７投与は、前記ＤＮＡ配列の投与から約１４
日前と投与から約１４日後の間に行われ、とりわけ、前記ＤＮＡ配列の投与から
約７日前と投与から約７日後の間が好ましく、前記ＤＮＡ配列の投与から約１日
前と投与から１日後の間が好ましい。特に最も好ましい前記化合物の投与は、前
記ＤＮＡ配列の投与と実質的に同時であり、必要に応じて、前記ＤＮＡ配列を投
与した後の日に、さらに前記化合物を投与することである。

【００１４】 好ましくは、前記化合物は、投与当たり約０．１ｍｇ／ｋｇと約１００ｍｇ／
ｋｇの間の用量で投与される。

【００１５】 好ましくは、前記哺乳動物は、ヒトである。

【００１６】 好ましくは、前記化合物は、４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ
メチル）安息香酸である。

【００１７】 本発明の別の態様によれば、疾病状態と関連し、適切なベクターの中にある抗
原ペプチドをコードするＤＮＡ配列と、抗原ペプチドによって開始される哺乳動
物中の液性免疫反応と細胞性免疫反応の両者を増強する化合物であって、 ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタンアミド； Ｎ，Ｎ−ジエチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ンアミド； Ｎ−イソプロピル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ンアミド； エチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノニトリル； （±）−５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−メチルペン
タン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２，２−ジメチルペンタ
ン酸； メチル ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチルベンゾエー
ト； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチル安息香酸； ベンジル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート
； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−ブチル］テト
ラゾール； ７−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘプタン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−ｎ−プロポキシフェノキシ）ペン
タン酸； ５−（４，６−ジクロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−メチルスルホニルペ
ンタンアミド； エチル ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）ベンゾエー
ト； ５−（４−クロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタン酸； ５−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシ）ペンタン酸； アミノグアニジン； ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ブタン酸； ６−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサン酸； エチル ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）ベンゾ
エート； ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）安息香酸； ２−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）フェニル］テ
トラゾール； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェノキシ）ペンタン酸
； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）プロピオニトリル； ４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド； フェニルアセトアルデヒド； ４−メトキシフェニルアセトアルデヒド； １−ヒドロキシ−２−フェニルプロパン； ３−フェニルプロポニオンアルデヒド； ４−ニトロベンズアルデヒド； メチル ４−ホルミルベンゾエート； ４−クロロベンズアルデヒド； ４−メチルオキシベンズアルデヒド； ４−メチルベンズアルデヒド； ８，１０−ジオキソウンデカン酸； ４，６−ジオキソヘプタン酸； ペンタンジオン； ５−メトキシ−１−テトラロン； ６−メトキシ−１−テトラロン； ７−メトキシ−１−テトラロン； ２−テトラロン； ３−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ブタノン
； ２’，４’−ジヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ２−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−ペント−２エン−４オン； ナリンゲニン ４’，５，６−トリヒドロキシフラボノン； ４’−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ６，７−ジヒドロキシクマリン； ７−メトキシ−２−テトラロン； ６，７−ジメトキシ−２−テトラロン； ６−ヒドロキシ−４−メチルクマリン； ホモゲンチジン酸γ−ラクトン； ６−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン； ８−メトキシ−２−テトラロン； 及び、適切な場合には、生理学的に許容されるその塩 から選択される化合物と を含むワクチン組成物が提供される。

【００１８】 好ましい前記化合物は、４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチ
ル）安息香酸である。

【００１９】 本発明のさらなる態様によれば、医薬の製造における化合物の使用であって、
哺乳動物への該化合物の投与が、疾病状態と関連する抗原ペプチドによって開始
される液性応答と細胞性応答の両者を増強せしめ、前記ペプチドが、前記ペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の前記哺乳動物への投与の結果として発現されており
、 前記化合物が、 ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタンアミド； Ｎ，Ｎ−ジエチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ンアミド； Ｎ−イソプロピル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ンアミド； エチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノニトリル； （±）−５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−メチルペン
タン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２，２−ジメチルペンタ
ン酸； メチル ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチルベンゾエー
ト； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチル安息香酸； ベンジル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート
； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−ブチル］テト
ラゾール； ７−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘプタン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−ｎ−プロポキシフェノキシ）ペン
タン酸； ５−（４，６−ジクロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
ン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−メチルスルホニルペ
ンタンアミド； エチル ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）ベンゾエー
ト； ５−（４−クロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタン酸； ５−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシ）ペンタン酸； アミノグアニジン； ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ブタン酸； ６−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサン酸； エチル ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）ベンゾ
エート； ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）安息香酸； ２−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）フェニル］テ
トラゾール； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェノキシ）ペンタン酸
； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）プロピオニトリル； ４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド； フェニルアセトアルデヒド； ４−メトキシフェニルアセトアルデヒド； １−ヒドロキシ−２−フェニルプロパン； ３−フェニルプロポニオンアルデヒド； ４−ニトロベンズアルデヒド； メチル ４−ホルミルベンゾエート； ４−クロロベンズアルデヒド； ４−メチルオキシベンズアルデヒド； ４−メチルベンズアルデヒド； ８，１０−ジオキソウンデカン酸； ４，６−ジオキソヘプタン酸； ペンタンジオン； ５−メトキシ−１−テトラロン； ６−メトキシ−１−テトラロン； ７−メトキシ−１−テトラロン； ２−テトラロン； ３−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ブタノン
； ２’，４’−ジヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ２−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−ペント−２エン−４オン； ナリンゲニン ４’，５，６−トリヒドロキシフラボノン； ４’−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ６，７−ジヒドロキシクマリン； ７−メトキシ−２−テトラロン； ６，７−ジメトキシ−２−テトラロン； ６−ヒドロキシ−４−メチルクマリン； ホモゲンチジン酸γ−ラクトン； ６−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン； ８−メトキシ−２−テトラロン； 及び、適切な場合には、生理学的に許容されるその塩 から選択される使用が提供される。

【００２０】 好ましくは、前記化合物は、４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ
メチル）安息香酸であり、投与当たり約０．１ｍｇ／ｋｇと約１００ｍｇ／ｋｇ
の間の用量で投与するのが好ましい。

【００２１】 本発明のさらなる態様によれば、抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列
と前記抗原ペプチドによって開始される細胞性免疫反応と液性免疫反応の両者を
増強する化合物とを含む、上述の方法において、別々に、連続して、又は同時に
投与するための成分の組合せが提供される。

【００２２】

【発明の詳細な記載】

本明細書と添付の特許請求の範囲を通じて、文脈から特に反対に解することが
必要でなければ、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ
）」という用語、又は「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「備える（ｃ
ｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎ
ｃｌｕｄｅｓ）」などのような変形は、包括的に、すなわち、これらの用語の使
用は、具体的に明記されていない整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）又は要素（ｅｌｅｍｅ
ｎｔ）が含まれ得ることを示唆するであろうと解釈しなければならない。

【００２３】 上述のように、本発明は、ワクチン接種法、とりわけ、タンパク質又はペプチ
ドが哺乳類の身体内で発現されることにより、抗原タンパク質又はペプチドに対
する哺乳動物中の免疫応答を誘導するように、抗原タンパク質又はペプチドをコ
ードするＤＮＡを哺乳動物中に導入することを含むワクチン接種法の改良に関す
る。このような手法は周知であり、上で参照したように、（１）に完全に記載さ
れている。

【００２４】 本願のワクチン接種法は、例えば、ウイルス、細菌、又は寄生虫感染、癌、ア
レルギー及び自己免疫疾患のような様々な疾病状態に対する哺乳動物の保護に適
合させることができる。本発明の方法又は組成物を用いることによって、保護又
は治療され得る疾患又は疾病状態の幾つかの具体例は、以下のとおりである。

【００２５】 ウイルス感染 Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、及びＥ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス
１、２、６及び７、サイトメガロウイルス、水痘−帯状ヘルペスウイルス、乳頭
腫ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、インフルエンザウイルス、パライ
ンフルエンザウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ピコルナウイ
ルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、鶏痘ウイルス、ライノウイルス、風疹ウイ
ルス、パポウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス
。

【００２６】 細菌感染 ＴＢ及びらい病を引き起こすマイコバクテリウム、肺炎球菌、好気性グラム陰
性桿菌、マイコプラズマ、ブドウ球菌性感染、連鎖球菌性感染、サルモネラ、ク
ラミジア 寄生虫 マラリア、レーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、住血吸
虫症、フィラリア症 癌 乳癌、大腸癌、直腸癌、頭部及び頚部の癌、腎臓癌、悪性メラノーマ、喉頭癌
、卵巣癌、子宮頚癌、前立腺癌 アレルギー イエダニ、花粉、及び他の環境中のアレルゲンによる鼻炎 自己免疫疾患 全身性エリテマトーデス これらの具体的な疾病状態は、例示のために引用されているにすぎず、本発明
の範囲を限定する意図ではないことを理解しなければならない。

【００２７】 抗原反応を誘導するために哺乳動物系で発現すべき本出願で引用されるＤＮＡ
配列は、タンパク質全体をコードしてもよく、又は、抗原反応を開始させること
ができるより短いペプチド配列だけをコードしてもよい。本明細書と添付の特許
請求の範囲を通じて、「抗原ペプチド」という用語は、対象動物の中に免疫反応
を誘導することができる全てのペプチド又はタンパク質配列を包含するものとす
る。しかしながら、動物系内に完全なタンパク質を発現することは、天然の抗原
提示を模倣することにより、完全な免疫反応を惹起する可能性がより高いので、
前記ＤＮＡ配列は、最も好ましくは、前記疾病状態に関連する完全なタンパク質
をコードするであろう。具体的な疾病状態に関連する公知の抗原ペプチドの非限
定的な幾つかの例には、以下のもの： ＨＢＶ−ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、及び表面ｅｎｖタンパク質、ｃｏｒｅ、及び
ｐｏｌ ＨＩＶ−ｇｐ１２０ ｇｐ４０、ｇｐ１６０、ｐ２４、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ
、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ 乳頭腫−Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｌ１、Ｌ２ ＨＳＶ−ｇＬ、ｇＨ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥ、ｇＤ、ＩＣＰ４７、ＩＣ
Ｐ３６、ＩＣＰ４ インフルエンザ−赤血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｔｉｎ）、核タンパク質
ＴＢ−マイコバクテリウムスーパーオキシドジスムターゼ、８５Ａ、８５Ｂ、Ｍ
ＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、Ｈ
ＳＰ９０、ＰＰＤ １９ｋＤａ Ａｇ、ＰＰＤ ３８ｋＤａ Ａｇ が含まれる。

【００２８】 哺乳動物細胞の中で抗原ペプチドの発現を得るためには、抗原ペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列が適切なベクター系の中に提示されることが必要である。例え
ば、選択したベクターは、抗原ペプチドの発現を得るために正しい順序で配置さ
れた細菌のプラスミド、及び強力なウイルスプロモーター、及びポリアデニル化
／転写終結配列を含み得る。これらの成分と必要に応じて、エンハンサー、制限
酵素部位、及び抗生物質耐性遺伝子のような選別遺伝子のような他の成分とを含
むベクターの構築は、当業者に周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら（２１）に詳細
に説明されている。

【００２９】 プラスミドが哺乳動物宿主の中で複製し、動物の染色体ＤＮＡ中に組み込まれ
るのを防ぐことは重要なので、前記プラスミドは、真核細胞中で機能する複製起
点を持たないように作成することが好ましいであろう。

【００３０】 本発明の方法と組成物は、例えば、家畜、実験動物、農業用動物、捕獲された
野生動物、及び最も好ましくはヒトを含む全ての哺乳動物の予防的又は治療処置
に関連して使用することができる。

【００３１】 ＤＮＡワクチンの投与によって開始される液性免疫原活性と細胞性免疫原活性
の両者を増強する好ましい活性を示すとして、本発明者らによって同定された上
記化合物は、免疫賦活特性を有するとして、以前ＷＯ９４／０７４７９に報告さ
れた公知の化合物である。特に、ツカレソールとしても知られる、好ましい化合
物である４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸は、
最初にＥＰ第００５４９２４号に記載され、免疫賦活活性を有し、ＨＩＶ、ＨＢ
Ｖ、ＨＣＶ、腫瘍、鎌状赤血球貧血症を含む様々な疾患の治療に有効であると報
告されてきた。報告されたツカレソールの活性は、シッフ塩基を形成するその能
力によって説明することが可能であり、それは、これによって、生理的な供与体
、すなわちカルボニル基に代替することができ、ＣＤ４ Ｔｈ細胞に共同刺激（
ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）シグナルを与えると考えられている。以前、ツ
カレソールは、Ｔｈ２に比べてＴｈ１型プロフィールに選択的に偏向して、ＣＤ
４ Ｔｈ細胞反応を増強することが報告された（２２）が、本発明者らは、マウ
スモデルで、Ｔｈ１とＴｈ２イソタイプの抗体の両者を増強できることを実証し
た。

【００３２】 抗原ペプチドによって開始され、本発明の化合物によって引き起こされる液性
と細胞性免疫反応の両者の増強を参照することによって、血清抗体レベルと細胞
傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のレベルが何れも、それぞれ、前記化合物の投与の
結果、抗原ペプチドをコードするＤＮＡ配列のみを投与したときのレベルと比べ
て上昇するであろうということを伝えることが意図される。このようなレベルは
、添付の例でさらに説明されているように、本分野で周知の方法によって定量す
ることができるだろう。

【００３３】 抗原ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターは、様々な態様で投与す
ることができる。ベクターは、裸の形態で（すなわち、リポソーム製剤、ウイル
スベクター、又はトランスフェクション促進タンパク質を伴わない裸のＤＮＡと
して）、適切な溶媒、例えば、ＰＢＳのような緩衝化した生理的食塩水溶液中に
懸濁した後、筋肉内、皮下、腹腔内、又は静脈内に注射して投与することができ
るが、幾つかの以前のデータは、筋肉内又は皮下注射が好ましいことを示唆して
いる（２３）、（その開示は、参照文献としてその全体が本明細書に包含される
）。さらに、ベクターは、経口、鼻、又は肺経路を介して投与するために、例え
ば、リポソームによって、又はポリアクチドコグリコライド（ＰＬＧ；ｐｏｌｙ
ａｃｔｉｄｅ ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）粒子（２５）の中に封入することが
できる。本発明の好ましい態様によれば、好ましくは遺伝子銃（特に微粒子銃）
投与手法の使用を介して、ベクターの皮内投与も可能である。このような手法に
は、ベクターを含む懸濁液の凍結乾燥と、それに続くベクターの金粒子上へのコ
ーティングの後に、例えば、（２６）に記載されているように、金粒子を表皮の
中に高圧で投与することが含まれ得る。送達されるＤＮＡの量は、免疫する哺乳
動物の種と重量、それに対して治療／保護される疾病状態の性質、採用するワク
チン接種プロトコール（すなわち単回投与対反復投与）、投与経路、及び選択し
たアジュバント化合物の効力と用量に応じて、大きく変わるであろう。これらの
変動要素に基づいて、医師又は獣医師は、容易に、適切な投与量レベルを決定で
きるであろう。

【００３４】 抗原ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクターは、１度限りの原
則で、又は、例えば、約１日から約１８月の間の間隔で、１乃至７回、好ましく
は１乃至４回、繰り返して投与することができる。しかしながら、この場合にも
、この治療法は、対象動物の大きさと種、それに対して治療／保護される疾病、
投与されるＤＮＡの量、投与経路、選択したアジュバント化合物の効力と用量、
及び熟練した獣医師又は医師には明らかであろう他の要素に応じて大きく変わる
であろう。

【００３５】 本明細書に明記したアジュバント化合物は、例えば、経口、鼻、肺、筋肉内、
皮下、皮内、又は局所経路のような様々な異なる投与経路を介して同じように投
与できる。この投与は、前記ＤＮＡ配列の投与から約１４日前と投与から約１４
日後の間に、好ましくは前記ＤＮＡ配列の投与から約７日前と投与から約７日後
の間に、さらに好ましくは前記ＤＮＡ配列の投与から約２４時間前と投与から２
４時間後の間に、特に好ましくは前記ＤＮＡ配列の投与と実質的に同時に行い得
る。「実質的に同時」とは、前記化合物の投与が、好ましくは、前記ＤＮＡ配列
の投与と同時であるか、同時でなければ、ＤＮＡ配列投与の何れかの側の少なく
とも２〜３時間以内であることを意味する。最も好ましい治療プロトコールでは
、前記化合物は、前記ＤＮＡ配列の投与と実質的に同時に投与され、続いて、Ｄ
ＮＡ配列投与から１４日後まで、およそ毎日を基本として、好ましくは、最初の
投与から３日間毎日、再度投与されるであろう。明らかに、このプロトコールは
、必要であれば、上述した変動要素の種類に従って換えることができる。ここで
も、投与量は、このような変動要素に応じて変動するであろうが、例えば、約０
．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ（ここで、「／ｋｇ」とは、対象哺乳動
物の体重を意味する）にわたり得る。アジュバント化合物のこの投与は、好まし
くは、ＤＮＡ配列の各後続又は追加投与によって繰り返すことが好ましい。最も
好ましくは、投与用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇの間、好まし
くは約１ｍｇ／ｋｇと約５ｍｇ／ｋｇの間であろう。

【００３６】 アジュバント化合物を元の化学状態で投与することも可能ではあるが、薬学的
組成物の形態で投与するのが好ましい。すなわち、前記化合物は、１以上の薬学
的に、又は獣医学的に許容される担体及び必要に応じて他の治療成分と組み合わ
せることが好ましいであろう。前記担体は、調剤中の他の成分と適合し、そのレ
シピエントに対して害がないという意味で「許容され得る」ものでなければなら
ない。調剤の性質は、当然のことながら、意図する投与経路に応じて変動し、薬
学分野での周知の方法によって調製され得る。全ての方法は、本発明の化合物（
前記アジュバント化合物）を、適切な１の担体又は複数の担体と会合させる工程
を含む。一般的には、前記調剤は、前記化合物を液状担体又は細かく分割した固
体担体、又は両者と均一且つ緊密に会合させた後、必要であれば、産物を所望の
剤形に作り上げることによって調製してもよい。経口投与に適した本発明の調剤
は、それぞれが所定量の活性成分を含有するカプセル、カシェー、又は錠剤のよ
うな分離したユニットとして、粉末若しくは顆粒として、水性液若しくは非水性
液中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油液体エマルジョン若しくは油中水
エマルジョンとして与えられ得る。前記活性成分は、大丸薬、なめ薬、又はペー
ストとして与えてもよい。

【００３７】 錠剤は、必要に応じて、１以上の副成分とともに、圧縮又は鋳造によって作成
してもよい。圧縮された錠剤は、適切な機械の中で、必要に応じて、結合剤、潤
滑剤、不活性な希釈剤、潤滑、界面活性、又は分散剤と混合して、粉末又は顆粒
のような自由に流れる形態の活性成分を圧縮することによって調製し得る。鋳造
された錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化された化合物の混合物を適
切な機械の中で鋳造することによって作成され得る。

【００３８】 前記錠剤は、必要に応じて、コートするか、又は刻み目を付けてもよく、活性
成分を緩やかに、又は制御して放出するように製剤してもよい。

【００３９】 例えば、筋肉内、腹腔内、又は皮下投与経路を介した注射用の製剤は、抗酸化
剤、緩衝液、制菌物質、及び前記製剤を意図したレシピエントの血液と等張にす
る溶質を含んでもよい滅菌注射水溶液及び非水溶液；並びに懸濁剤及び濃縮剤を
含んでもよい滅菌水性懸濁液及び非水性懸濁液を含む。前記製剤は、単位用量又
は複用量の容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアル中に入れてもよく、
使用直前に、滅菌した液状担体、例えば、注射水の添加だけを必要とする凍結乾
燥状態で保存してもよい。即席の注射溶液及び懸濁液は、上述した種類の滅菌粉
末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。頬又は鼻腔を介した肺投与に適した製剤
は、望ましくは、０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する活性成分を含有した
粒子が、レシピエントの気管支に送達されるように与えられる。このような製剤
の可能性は、それらが、吸入装置に使用するための、多数の穴が開けられた（ｐ
ｉｅｒｃａｂｌｅ）、適切には例えばゼラチンのカプセル中か、あるいは、活性
成分、適切な液体噴霧剤、及び必要に応じて、界面活性剤及び／又は固体賦形剤
のような他の成分を含む自動噴霧製剤として便宜に与えられ得る微細に粉砕され
た粉末の形態であることである。自動噴霧製剤は、活性成分が溶液又は懸濁液の
液滴の形態で調合された場合に利用してもよい。このような自動噴霧製剤は、本
分野で公知のものと類似しており、確立された手順によって調製し得る。それら
は、適切には、所望の噴霧特性を有する手動又は自動のうち何れかの機能バルブ
で得られる；有利には、前記バルブは、各操作時に、例えば、５０〜１００μＬ
の定まった容量を運ぶ計量タイプのものである。

【００４０】 さらなる可能性として、前記活性成分は、加速された気流又は超音波攪拌を利
用することによって、吸入用の微細液滴霧を作り出す霧吹き又は噴霧器で使用す
るための溶液の形態であってもよい。

【００４１】 鼻内投与に適した製剤は、一般的に、肺投与について上記したのと同様な体裁
を含み得るが、鼻腔での保持を可能にするために、このような製剤は、約１０〜
約２００ミクロンの範囲の粒径有することが好ましい。これは、適切には、適当
な粒子サイズの粉末の使用、又は適切なバルブの選択によって達成され得る。他
の適切な製剤は、鼻の近くに固定した容器から鼻への運搬を通じて迅速に吸入す
ることによって投与するために、約２０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有す
る粗い粉末と水溶液又は油性溶液中に約０．２〜５％の活性成分を含む点鼻薬を
含む。

【００４２】 本発明のアジュバント化合物を含む適切な製剤の例は、ＷＯ９４／０７４７９
号に示されており、その開示全体は参照文献として本明細書に含まれる。

【００４３】 本発明の好ましい態様では、抗原ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベク
ターは、アジュバント化合物と同一の製剤の中に入れて投与することができる。
特に好ましい態様では、前記アジュバント化合物は、遺伝子銃投与に適した形態
で調製され、その経路を介して、前記ＤＮＡ配列の投与と実質的に同時に投与さ
れる。この態様での使用に適した製剤を調製するためには、アジュバント化合物
を凍結乾燥し、例えば、遺伝子銃投与に適した金粒子上に付着させることが必要
かもしれない。

【００４４】 ともに製剤しない場合でも、前記アジュバント化合物は、前記ＤＮＡ配列の投
与部位と同じ部位又はその近くに投与することが適切かもしれない。

【００４５】 その他の薬学的な調製の詳細は、（２４）に見出すことができ、その開示全体
は参照文献として本明細書に含まれる。

【００４６】 ここで、以下の非限定的な例を参照しながら、本発明をさらに記載することに
する。

【００４７】

【実施例】例１ ペプチド免疫化と比較したＤＮＡワクチン接種における従来のアジュバントの活
性 オボアルブミン抗原に特異的な受容体を発現するＴＣＲトランスジェニックマ
ウスからのリンパ系細胞を正常な同系のマウスに移植した。続いて、アジュバン
トとともに、又はアジュバントなしに、皮下にオボアルブミンペプチドを与えて
これらのマウスを免疫した。３日後、局所リンパ節細胞を除去し、トリチウム標
識したチミジンのＤＮＡへの取り込みによって、オボアルブミンペプチドに対す
るそれらの分裂増殖反応を測定した。これは、免疫化に応じてインビボで生じた
特異的Ｔ細胞初回免疫の程度の指標を与える。オボアルブミンペプチドのみ（白
丸）による免疫化は、擬似免疫化（黒丸）と比較して有意だが、低レベルのＴ細
胞初回免疫をもたらした。細菌リポ多糖（ＬＰＳ）（白抜き上向き三角）、完全
フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（白抜き四角）、とウシ型弱毒結核菌ワクチ
ン（ＨＫ−ＢＣＧ）（白抜き下向き三角）は、全て、この反応の有意な増強を与
えた。免疫化抗原の非存在下では、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）（黒塗り上向き三角
）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（黒塗り四角）、とウシ型弱毒結核
菌ワクチン（ＨＫ−ＢＣＧ）（黒塗り下向き三角）の投与は、ｏｖａペプチドに
応答後の増殖に対して最少の影響しか与えなかった。

【００４８】 オボアルブミン抗原に特異的な受容体を発現しているＴＣＲトランスジェニッ
クマウスからのリンパ系細胞を正常な同系マウスに移植した。続いて、皮下にア
ジュバントを与えて、又は与えずに、（遺伝子銃によって）皮下にプラスミドＤ
ＮＡ（ｐＶＡＣ１）、又はオボアルブミンをコードするプラスミドＤＮＡ構築物
（ｐＶＡＣ１．Ｏｖａ）を与えてこれらのマウスを免疫した。３日後、局所リン
パ節細胞を除去し、トリチウム標識したチミジンのＤＮＡへの取り込みによって
、オボアルブミンペプチドに対するそれらの分裂増殖反応を測定した。これは、
免疫化に応じてインビボで生じた特異的Ｔ細胞初回免疫の程度の指標を与える。
対照群は、完全フロイントアジュバント中のオボアルブミンペプチドで免疫され
、かなりのＴ細胞初回免疫を生じた（黒塗り菱形）。ｐＶＡＣ１．Ｏｖａによる
ＤＮＡ免疫化（白抜き上向き三角）は、空のベクターによる免疫化（白丸）と比
べて有意なＴ細胞初回免疫を生じた。しかしながら、従来のペプチド免疫化とは
対照的に、何れのアジュバントも、ＤＮＡ免疫化に対するこの応答を増強するこ
とはできなかった。ＬＰＳ（黒塗り上向き三角）、熱で死滅させたリステリア菌
（ＨＫＬＭ）（黒塗り下向き三角）、ＧＭ−ＣＳＦ（白抜き菱形）、及び完全フ
ロイントアジュバント（ＣＦＡ）（白抜き下向き三角）は、全て、ＤＮＡワクチ
ン接種に対する応答を増強することはできなかった。［ＨＫＬＭをアジュバント
として用いた空のベクター対照で、異様に高い応答が見られた］。

【００４９】例２ ツカレソールは抗原特異的な抗体の産生を増強する マイコバクテリウム熱ショックタンパク質６５（Ｍ．ｈｓｐ６５）抗原をコー
ドするプラスミドＤＮＡによる免疫化に対するツカレソールの影響を分析し、ツ
カレソールの影響とサイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮγを発現しているプラ
スミドの影響とを比較した。２０μｇのプラスミド（ｐ３）を筋肉内（ｉ．ｍ．
）に与えて、マウスの群を免疫化した。Ｍ＞ｈｓｐ６５に対する有意な量の抗体
が、ｐ３Ｍ．６５で免疫したマウスからの血清中に検出できたが、ｐ３免疫した
マウスには検出できなかった（図３ａ）。Ｍ．ｈｓｐプラスミド９ｐ３Ｍ．６５
，Ｔ）と同時に、１ｍｇのツカレソールを皮下に投与すると、抗体の力価が顕著
に増加した。対照的に、対照プラスミドとツカレソールで免疫した一群のマウス
（ｐ３，Ｔ）には、特異的な抗体反応の増加は検出されず、観察された効果が、
ツカレソールの投与に伴う高度の免疫賦活に起因する非特異的な交叉抗体の一般
的な増加によって説明されるという可能性を排除している（図３ａ）。

【００５０】 我々は、同じ実験で、ツカレソールの影響とサイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩ
ＦＮγを発現しているプラスミドを注入することの影響とを比較した。ｐ３Ｍ．
６５プラスミドを単独で、又はＧＭ−ＣＳＦを発現するプラスミド（ｐ３Ｍ．６
５，Ｇ）、ＩＦＮγを発現するプラスミド（ｐ３Ｍ．６５，γ）、若しくはＧＭ
−ＣＳＦとＩＦＮγの混合物を発現しているプラスミド（ｐ３Ｍ．６５，Ｇγ）
の何れかと等モルで組み合わせて投与した。抗Ｍ．ｈｓｐ６５の力価は、免疫化
にＧＭ−ＣＳＦプラスミドを含めたときに、ｐ３Ｍ６５と比べて、著しく増加し
た。Ｍ．ｈｓｐ６５特異抗体反応に対するＧＭ−ＣＳＦプラスミドの賦活効果と
は対照的に、ＩＦＮγを発現するプラスミドを含めたときには、以前に公表され
たデータと一致して、有意でない抗体反応が存在した。両サイトカインプラスミ
ドを合わせると、ｐ３Ｍ．６５のみで免疫したときに観察されるのと実質的に同
様のレベルまで反応が減少し、ＧＭ−ＣＳＦプラスミドの増強効果を拮抗するよ
うであった（データは示していない）。総合すると、これらの結果は、ツカレソ
ールが、ＧＭ−ＣＳＦプラスミドの効果と匹敵する、Ｍ．ｈｓｐ６５抗原での遺
伝学的な免疫化によって誘導された抗体反応を増強する強力な能力を有している
ことを実証している。

【００５１】 我々は、抗Ｍ．ｈｓｐ６５抗体のイソタイプを分析した。ｐ３Ｍ．６５で免疫
したマウスは、有意な量のＩｇＧ２ａ抗Ｍ．ｈｓｐ６５抗体を産生した。この力
価は、ツカレソールを与えたマウスで有意に（Ｐ＝０．００３）増加していた（
図３ｂ）。ｐ３Ｍ．６５，Ｇ、ｐ３Ｍ．６５γ、又はｐ３Ｍ．６５Ｇγでの免疫
化はこのような効果を示すことができなかったので、このＴｈ１が関与する抗体
反応の明瞭な増強は特有のものであった。ＩＦＮγを発現するプラスミドを免疫
化に含めても、ＩｇＧ２ａ抗Ｍ．ｈｓｐ６５抗体応答を増強しなかった。

【００５２】 Ｔｈ２が関与する抗Ｍ．ｈｓｐ６５ ＩｇＧ１抗体反応は、ｐ３Ｍ．６５，Ｇ
、ｐ３Ｍ．６５γ、又はｐ３Ｍ．６５Ｇγを与えたマウスに、有意な量で検出で
きなかった。しかしながら、この反応は、ｐ３で免疫したマウスに比べて、ｐ３
Ｍ．６５，Ｔを与えたマウスにおいて（Ｐ＝０．００３）、これよりは少ないが
（Ｐ＝０．０２７）ｐＭ．６５Ｇで免疫したマウスにおいて、有意な量で誘導さ
れた（図３ｃ）。

【００５３】 総合すると、我々のデータは、遺伝学的な免疫化の結果として生じる特異抗体
反応の有意な増加が、ツカレソールの投与によって達成できることを証明してい
る。この投与はＴｈ１が関与する反応を強力に増強したが、Ｔｈ２が関与する抗
体反応も確かに誘導した。ツカレソールが特異抗体反応の産生を増強すると報告
されるのは、これが最初である。

【００５４】例３ ツカレソールは特異的なＴ細胞の分裂増殖反応を増強する 我々は、次に、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核抗原４（ＥＢＮＡ
−４）を発現するｐＤＮＡのワクチン接種によって誘導されたＴ細胞の分裂増殖
反応に対するツカレソールの効果を分析した。対照プラスミドｐ３、又はＥＢＮ
Ａ−４を発現しているプラスミド（Ｅ４）、又はＥ４＋ツカレソールによる処置
（Ｅ４，Ｔ）（筋肉内）で、マウスの群を免疫化した。同系ＥＢＮＡ−４をトラ
ンスフェクトしたがん腫株（Ｓ６Ｃ−Ｅ４）で刺激したときに、Ｅ４で免疫した
マウスからの脾臓細胞の培養では、最少の分裂増殖反応しか検出されなかった。
興味深いことに、Ｅ４で筋肉内に免疫し、皮下にツカレソールを処置したマウス
からの脾臓細胞を用いると、Ｓ６Ｃ−Ｅ４に対してずっと強い分裂増殖反応が得
られた（図４）。以前に報告されているように、ＥＢＮＡ−４ワクシニア感染刺
激因子（Ｓ６Ｃ−ＶＥ４）も、Ｅ４で免疫したマウスとＥ４，Ｔで免疫したマウ
スの両者からの脾臓細胞に、Ｓ６Ｃ−Ｅ４より高い分裂増殖反応を誘導した。分
裂増殖は、式：ＳＩ＝（ＥＢＮＡ−４ワクシニアに感染した）Ｓ６Ｃ−ＥＢＮＡ
−４形質移入体への脾臓細胞の分裂増殖／Ｓ６Ｃ−ｇｐｔ（ＴＫ−ワクシニアに
感染した）対照形質移入体への脾臓細胞の分裂増殖を用いて、刺激指数（ＳＩ）
として計算した。対照免疫化マウス（ｐ３）由来の脾臓細胞には、それぞれＳ６
Ｃ−ｇｐｔ又は対照ＴＫワクシニア感染Ｓ６ｃ−ｇｐｔＶへの分裂増殖を超える
、Ｓ６Ｃ−Ｅ４又はＥＢＮＡ−４ワクシニア感染細胞への分裂増殖が全く検出で
きなかったので、この反応も抗原集中的（ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｃｕｓｅｄ）で
あった（図４）。

【００５５】例４ ツカレソールはＴｈ−１サイトカインの産生を有意に増強する ｐＤＮＡ免疫化は、ＩＦＮγを含むＴｈ１サイトカインの産生を特徴とする顕
著なＴｈ−１反応を伴う。このＴｈ−１反応を増強するツカレソールの能力を評
価するために、ｐ３、Ｅ４、又はツカレソールを同時に皮下投与するＥ４を筋肉
内に与えてマウスを免疫した。ｐ３で免疫したマウスからの対照脾臓細胞からの
産生、又はＳ６Ｃ−ｇｐｔに応じた産生と比較して、ＩＦＮγは、Ｓ６Ｃ−Ｅ４
による特異的な刺激に応じて、Ｅ４のみで免疫したマウスからの脾臓細胞により
、たとえ産生されたとしても、ごく僅かしか産生されなかった。興味深いことに
、ｅ４で免疫し、ツカレソールで処置したマウスからの脾臓細胞は、Ｓ６Ｃ−Ｅ
４による特異的なインビトロでの刺激に応じて最大量のＩＦＮγを産生したが、
Ｓ６Ｃ−ｇｐｔによる対照刺激に応じては産生しなかった。我々は、特異的な刺
激に応じた、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４の産生は、何れの群からの培養
脾臓細胞にも検出できなかった（データは示されていない）。我々は、それ故、
ｐＤＮＡワクチン接種と共にツカレソールを投与することは、特異的なＴｈ１優
位なサイトカイン応答を促進する極めて効率的な方法であると結論する。

【００５６】例５ ツカレソールによる特異的ＣＴＬ反応の増加 ｐＤＮＡワクチン接種によって誘導された特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
反応に対するツカレソールの影響を調べるために、我々は、ｐ３ Ｍ．６５、ｐ
３Ｍ．６γ、又はｐ３Ｍ．６５，Ｔの何れかで２回、ＨＬＡ Ａ２トランスジェ
ニックマウスを免疫した。最後の免疫化から２週間後に、マイコバクテリウムｈ
ｓｐ６５分子由来のＨＬＡ−Ａ２拘束されたペプチドのエピトープを用いて、免
疫したマウスからの脾臓細胞を１度刺激し、コグネイトペプチドで、又は対照Ｈ
ＬＡ Ａ２拘束されたインフルエンザペプチドで短時間刺激しなかった、又は短
時間刺激したＨＬＡ−Ａ２／ｋｂ Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｋ−Ａ２／ｋｂｄｓ）細胞
株に対する特異的ＣＴＬ活性について、その培養物をテストした。ｐ３Ｍ．６５
とツカレソールで免疫したマウス（ｐ３Ｍ．６５，Ｔ）からの脾臓細胞は、コグ
ネイトＭ．ｈｓｐ６５エピトープで短時間刺激した標的細胞に対して高いＣＴＬ
活性を発現したのに対して、対照インフルエンザペプチドで短時間刺激しなかっ
た、又は短時間刺激したＪｋ−Ａ２／ｋｂ細胞に対するそれらの溶解活性は、ず
っと低かった（図６）。対照的に、何らの共同刺激剤もなく、ｐ３Ｍ．６５で免
疫したマウスからの脾臓細胞は、ほぼ完全に不活性であった。ｐ３Ｍ．６５ワク
チンにＩＦＮγプラスミドを含めると（ｐ３Ｍ．６５γ）、ｐ３Ｍ．６５のみで
免疫したマウスに由来する脾臓細胞の活性と比べて、脾臓細胞のＣＴＬ活性を増
大させたが、この細胞傷害毒性は、ツカレソールで処置したマウスからの脾臓細
胞で観察されたものの３０〜５０％にすぎなかった。我々は、それ故、ｐＤＮＡ
ワクチン接種とともに与えたときに、ツカレソールが、特異的ＣＴＬの発現を増
強する極めて効率的な物質であると結論する。

【００５７】例６ エプスタイン−バールウイルス核抗原４（ＥＢＮＡ−４）を発現するプラスミド
による免疫化後のインビボでの腫瘍の成長阻害に対するツカレソールの影響 エプスタイン−バールウイルスは、幾つかの癌に関与していると考えられてき
た。我々は、ＥＢＮＡ−４を発現するプラスミドを用いたｐＤＮＡワクチン接種
によるインビボでの腫瘍の成長阻害に対するツカレソールの影響を分析した（図
７）。対照擬似プラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｐ３）、ＥＢＮＡ−４（Ｅ４）を発現
するプラスミド、又は１、２、３、及び４日後に、２００μｇのツカレソールを
皮下投与した、すなわち、マウス当たり合計８００μｇのツカレソールを投与し
たＥＢＮＡ−４を発現するプラスミド（Ｅ４Ｔ）のうちの何れか４０μｇを筋肉
内注射することによって、マウスを免疫した。この免疫化スケジュールは、最初
の免疫から、１ヶ月及び２ヶ月後に繰り返された。最後の免疫化から２週間後に
、１０４のＳ６Ｃ−Ｅ４腫瘍細胞を皮下に与えて、マウスに攻撃誘発を行った。
腫瘍が直径２０ｍｍに到達した時点で、マウスを屠殺した。図７は、ツカレソー
ルが、腫瘍の成長を阻害するＥＢＮＡ−４の能力を有意に増強することを示して
いる。

【００５８】例７ マウスへの遺伝子銃ＤＮＡ免疫化によって誘導されたＣＴＬサイトカイン応答に
対するツカレソールの影響 細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の産
生は、ウイルス感染の除去に重要な細胞媒介性免疫応答の中心的な指標である。

【００５９】 インフルエンザＮＰ抗原を使用（図８ａ） ２つの用量レベル（１０及び１００ｎｇ）のＡ／ＰＲ８／３４インフルエンザ
ウイルス核タンパク質（ｐＶＡＣ１．ＰＲ）をコードするＤＮＡプラスミド、又
は空のベクターを用いた遺伝子銃によって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫した。
免疫化から１４日後に脾臓を集め、組換えヒトＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）とと
もに、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞によってのみ認識される、ＮＰペプチド（１０μ
Ｍ）によって、インビトロで脾臓細胞を再刺激した。サイトカインを産生する各
細胞の数を測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、１０ｅ６の脾臓細胞当た
りのＩＦＮγ陽性細胞を検出した（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝３マウス）。ツカ
レソールは、免疫化の時に、表皮内のＤＮＡワクチン接種部位に皮下（ｓ．ｃ．
）（２×１ｍｇ）から、又は免疫化の日から開始して５日間毎日、経口からの食
事供給（１５ｍｇ／ｋｇ）によってマウスに投与した。皮下へのツカレソールは
、免疫化に応じたＣＴＬサイトカイン応答の小さいが有意な増加をもたらすが、
経口からのツカレソールは、応答の倍加をもたらす。

【００６０】 エプスタイン−バールウイルス核抗原４（ＥＢＮＡ−４）を使用（図８ｂ） ＥＢＮＡ−４（Ｅ４）をコードするＤＡＮプラスミド又は空のベクター（ｐ３
）を用いた遺伝子銃によって、マウスを免疫した。射撃当たり２μｇのＤＮＡを
投与し、マウス当たり２回の重複しない射撃を与えた。１、２、３、及び４日目
に、２００μｇの量で、マウス（Ｅ４Ｔ）の皮下にツカレソールを投与した。２
ヶ月後に、同じ免疫化及び処置スケジュールで、マウスに追加接種した。２週間
後、ＥＢＮＡ−４抗原を発現している腫瘍細胞（Ｓ６Ｃ−Ｅ４）を用いて、又は
抗原陰性腫瘍細胞（Ｓ６Ｃ−ｇｐｔ）を用いて、インビトロで７２時間、脾臓細
胞を刺激した。続いて、上清を集めて、特異的なＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−
γの力価を決定した。ツカレソールは、ＩＦＮγの産生を劇的に増加させた。

【００６１】例８ 遺伝子銃ＤＮＡ免疫化によって誘導された溶解性ＣＴＬ反応に対するツカレソー
ルの影響 ＣＤ８ＣＴＬによる標的細胞の溶解は、免疫系によるウイルス感染の除去にお
ける主要な機序である。溶解性ＣＴＬは、ウイルスペプチドを担持し、ユーロピ
ウムで標識された標的細胞を用いて測定することができる。

【００６２】 ツカレソールの皮下投与（図９ａ） ツカレソールを皮下（ｓｃ）に与えて、又は与えずに、インフルエンザウイル
ス核タンパク質（ＮＰ）をコードするプラスミドＤＮＡ（１０ｎｇ）でＣ５７Ｂ
Ｉ／６マウスを免疫した。免疫化から１４日後にマウスを屠殺し、ウイルス（Ａ
／ＰＲ８／３４）で短時間刺激した放射線照射された脾臓細胞によって、インビ
トロで再刺激した（５日）。Ｈ−２Ｄ^ｂ拘束されたＮＰペプチドで短時間刺激し
た、ＭＨＣ適合標的細胞（ＥＬ４細胞）の特異的溶解を測定するために、標準的
なユーロピウム放出技法を使用した。全ての対照について、非特異的な溶解は１
５％未満であった。ツカレソールは、表皮内遺伝子銃免疫化の部位に、皮下で（
１ｍｇ）与えた。

【００６３】 ツカレソールの経口投与（図９ｂ） Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、経口でツカレソールを与えて、及び与えずに、イン
フルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）をコードするプラスミドＤＮＡ（１０
ｎｇ）でＣ５７Ｂ１／６マウスを免疫した。免疫化から１４日後にマウスを屠殺
し、ウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４）で短時間刺激した放射線照射された脾臓細胞
によって、インビトロで再刺激した（５日）。Ｈ−２Ｄ^ｂ拘束されたＮＰペプチ
ドで短時間刺激した、ＥＬ４細胞の特異的溶解を測定するために、標準的なユー
ロピウム放出技法を使用した。全ての対照について、非特異的な溶解は１５％未
満であった。免疫化の日から開始して５日間毎日１度、経口からの食事供給によ
って、ツカレソール（１５ｍｇ／ｋｇ）を与えた。

【００６４】 実験結果の考察 我々は、シッフ塩基の形成を介したＴ細胞への共同刺激シグナルを与えること
に基づき、ｐＤＮＡ免疫化を増強する簡便且つ極めて効果的なアプローチをここ
に発表する。我々の観察のうち幾つかは、この方法が、ｐＤＮＡワクチン接種の
結果として通常遭遇する効力の限界という問題を回避できることを実証している
。これらには、免疫された動物の大部分で観察された特異的免疫反応の誘導が含
まれるが、サイトカインをコードするベクターを用いるアプローチは、この点で
、効率性がかなり劣っていた（データは示していない）。この増強は、ｐＤＮＡ
ワクチン接種のみ、又はサイトカイン遺伝子を発現するｐＤＮＡと組み合わせた
ｐＤＮＡワクチン接種を与えた場合と比較して、この増強には、前記反応の有意
な量的増加が伴っており、特異抗体力価の増加、並びに分裂増殖及び細胞傷害性
Ｔ細胞反応の増強の両者として観察された。

【００６５】 十分な免疫反応の誘導には、免疫系の複数の成分の参加が必要であるが、ｐＤ
ＮＡ免疫化は、液性反応とＣＴＬ反応を含む細胞性反応の両者を含む（これらは
全てツカレソールによって増強することが見出された）ので、この要件を満たす
。さらに、ｐＤＮＡの免疫化を増強する他の様式は、Ｔ細胞に偏った免疫反応の
抗体を導くと思われるのに対して、ツカレソールの同時投与は、Ｔｈ１とＴｈ２
が関与する抗体反応の増強を含む両タイプの特異的な免疫の一般的な増強をもた
らした。ｐＤＮＡとツカレソールの組合せは、それ故、細胞性又は抗体をベース
とした免疫反応の何れかが宿主にとって有益であろう状況において考慮され得る
。

【００６６】 他の免疫化手法と比べて、最高のＩｇＧ：ＩｇＭ比によっても評価された、特
異抗体産生の産生の顕著な増加が存在した（データは示されていない）。これは
、モノクローナル抗体の産生中に、この手法を用いることが有利であり得るとい
うことを示している。

【００６７】 分裂増殖、サイトカイン産生、及び細胞傷害反応によって検出された、ｈｓｐ
６５、インフルエンザＮＰ、及びＥＢＮＡ−４に対する、ｐＤＮＡによって誘導
される特異的Ｔ細胞応答を増強するツカレソールの顕著な能力は、特に重要であ
る。マイコバクテリウムの感染に対する感染防御免疫は、ＩＦＮγを含むマクロ
ファージ活性化サイトカインを分泌する能力を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞と、感染し
たマクロファージを除去できる細胞傷害性ＣＤ８^＋細胞の両者に依存する。ＥＢ
Ｖ感染に対する感染防御免疫は、ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋Ｔ細胞応答に依存し、移植
後の移植リンパ球増殖性疾患に対するＴ細胞をベースとした免疫療法が、効率的
であることが既に証明されている。ツカレソールと組み合わせたｐＤＮＡワクチ
ン接種は、ここに示されているように、ＣＤ４とＣＤ８を介した応答の両者を好
むので、これは、細胞内の細菌及びウイルスに対する新しいＴ細胞ワクチンに適
用すべき魅力的な様式のワクチン接種である。

【００６８】 ツカレソールは、既に臨床的に試験されている化学的には明確な分子である。
これは、新しいｐＤＮＡをベースとしたワクチン接種プロトコールにおけるこの
薬物の承認手順を簡単にするはずである。さらに、それは全身的に活性であるこ
とが示されたので、ここに示されているように、筋肉内ｐＤＮＡ免疫化とツカレ
ソールの皮下注射を組み合わせることによって、ｐＤＮＡとツカレソールを同時
局所投与する必要がない。特に、血液媒介性の感染症又は注射に伴う文化的なス
チグマータ（ｃｕｌｔｕｒａｌ ｓｔｉｇｍａｔａ）のリスクのために、非経口
免疫を避けるべき状況下で、ｐＤＮＡワクチン接種の皮内「弾道」送達とツカレ
ソールの経口投与との組合せは、極めて魅力的な免疫化様式であることが証明さ
れるかもしれない。

【００６９】 要約すれば、我々は、ここに、ｐＤＮＡワクチン接種によって誘導された特異
的な免疫反応を増加するための簡易且つ効率的な方法として、シッフ塩基を形成
する薬物を使用することの有用性を初めて示すデータを提示する。これらのデー
タは、臨床と産業環境の何れにも妥当する。

【００７０】 実験の方法 プラスミドの構築と試験 全ての遺伝子は、ｐＣＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ、ＮＶ
Ｌｅｅｋ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に挿入した。マイコバクテリウム
・ボビスｈｓｐ６５のｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩを用いてプラスミドｐ
ＲＩＢ１３００（Ｄｒ．Ｒ． ｖ ｄ Ｚｅｅ、Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓの好意によりいた
だいた）から切り出し、ｐＣＤＮＡ３ ＭＣＳのＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位に
サブクローニングした。得られたプラスミド（ｐ３Ｍ．６５）中の遺伝子の同一
性と方向は、制限地図によって確認した。ｈｓｐタンパク質の発現と産生が、Ｌ
ｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ
、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を用いたリポフェクションによって、ｐ３Ｍ．６５をトラ
ンスフェクトしたＣＯＳ−７の可溶化液中に検出された。可溶化液を１２％のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ、ＣＡ）上の
ウェスタンブロッティングと抗マイコバクテリウムｈｓｐ特異的モノクローナル
抗体ＤＣ−１６（Ｄｒ．Ｊｕｒａｊ Ｉｖａｎｙｉ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕ．Ｋ．の
好意によりいただいた）による免疫検出を行った。続いて、二次アルカリホスフ
ァターゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡＬ）を
用いて、これを検出し、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｕｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙ
ｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いてブ
ロットを展開した。

【００７１】 ＥＬＩＳＡ手法 免疫したマウスからの血清を採取し、前に記載したように、直接ＥＬＩＳＡに
使用した。４℃で一晩、９６ウェルのプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、
Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルをコートするために、４μｇ／ｍＬの炭酸緩衝液の濃
度で、組換えマイコバクテリウムｈｓｐ６５（Ｄｒ．Ｒ． ｖ ｄ Ｚｅｅの好
意によりいただいた）を使用した。血清は、１：１００の希釈で２つずつ添加し
、４℃で一晩インキュベートした。（マウスＩｇＭに対して予め吸収された）Ｉ
ｇＧ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ａ特異的アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウ
ス血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、結合した抗体を検出し
た。

【００７２】 マウス この研究で用いたＨＬＡ−Ａ２^＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウス（
Ｄｒ Ｌ．Ｓｈｅｍａｎ、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、Ｃａの好意によりいただいた）については記載した。これらのマ
ウスは、α１とα２ドメインは、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子のものであるが、α
３膜貫通及び細胞質ドメインは、マウスＨ２ Ｋｂ分子のものである、キメラＭ
ＨＣクラスＩＩ分子Ｉを発現している。この構築物は、Ｔ細胞上のマウスＣＤ８
分子の結合部位がキメラ分子のα３ドメインと相互作用するのを可能にする。Ｈ
ＬＡ−Ａ２^＊０２０１／Ｋｂの表面発現は、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１特異的ＦＩＴ
Ｃ抱合モノクローナル抗体（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ、Ｃａ）を用いて確認し、Ｆ
ＡＣＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．，Ｍｏｕｎｔａ
ｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。Ｃ５
７５ＢＩ／６マウスについては記載した。これらのマウスは、所定のインフルエ
ンザウイルス核タンパク質ＣＴＬエピトープを有している。ＡＣＡ（Ｈ−２ｆ）
マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎ）から購入した。マウスは、カロリンスカ研究所のＭＴ
Ｃ動物施設中の我々のＳＰ環境で繁殖させ、飼育した。

【００７３】 免疫化 遺伝学的な免疫化は、筋肉内免疫化によって達成した。プラスミドは、Ｑｉａ
ｇｅｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｇｉｇａ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＧｍｂＨ、Ｈｉｌ
ｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＬＢアンピシリン大腸菌の培養から調製し
た。濃度と純度は、分光光度計と分析用ゲル電気泳動を用いて決定した。２０μ
ｇのｐＤＮＡ／１００μＬ／筋肉の対照プラスミド（ｐ３）又はＥＢＮＡ−４発
現プラスミド＋対照プラスミドｐ３（Ｅ４）、ｐ３Ｍ．６５発現プラスミド＋対
照プラスミドｐ３（ｐ３Ｍ．６５）、ｐ３Ｍ．６５＋ＧＭ−ＣＳＦ発現プラスミ
ド（ｐ３Ｍ．６５Ｇ）、又はｐ３Ｍ．６５＋ＩＦＮγ発現プラスミド（９ｐ３Ｍ
．６５γ）のうちの何れかを用いて、Ｄａｖｉｓらの方法に従って、マウスの再
生している前脛骨筋に注射した。プラスミドは、等モル量混合した。あるいは、
免疫化は、Ａ／ＰＲ８／３４インフルエンザウイルス核タンパク質をコードする
１０ｎｇ又は１００ｎｇのＤＮＡプラスミド（ｐＶＡＣ１．ＰＲ）又は空のベク
ター、又はＥＢＮＡ−４をコードする２μｇのプラスミド（Ｅ４）又は対照ベク
ターｐ３を用いて、Ｆｙｎａｎら（２７）の方法に従って、遺伝子銃によって行
った。ツカレソール処置したマウスは、Ｅ４、ｐ３Ｍ．６５、又はｐＶＡＣ１．
ＰＲ（それぞれ、Ｅ４，Ｔ ｐ３Ｍ．６５，ｔ、及びｐＶＡＣ１．ＮＰ ＰＲ（
Ｔｕｃ ｓｃ））で免疫し、同時に、それぞれ１ｍｇのツカレソールを皮下投与
するか、又は４日間、マウス当たり２００μｇのツカレソールを毎日、この場合
にも皮下に投与した。同用量で初回免疫してから２週間後に、マウスに追加免疫
を施した。

【００７４】 細胞株 ＪｕｒｋａｔＡ^＊０２０１／Ｋｂ（Ｊｋ−Ａ２／ｋｂ）、ヒトｔ細胞白血病０
ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１陰性細胞株を、ＨＬＡ−Ａ８０２０１／Ｋｂキメラ遺伝子
（Ｄｒ．Ｗ．Ｍ．Ｋａｓｔ、Ｌｏｙｏｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍａｙｗｏ
ｏｄ ＩＩＩの好意によりいただいた）で安定にトランスフェクトした。Ｓ６Ｃ
細胞株は、ＡＣＡマウスから生じた自発性哺乳類の腺がんに由来した。Ｓ６Ｃ−
ｇｐｔとＳ６Ｃ−Ｅ４は、それぞれ対照プラスミドとＥＢＮＡ−４形質移入体で
ある（Ｄｒ． Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｌｅｉｎ、ＭＴＣ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍの好意によりいただいた）。全ての細胞
株は、インビボにおいて同系ＡＣＡマウス中で、及びインビトロにおいて１０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレ
プトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、及び２ｍＭ Ｌ−グルタ
ミンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で継代することによって維持した。

【００７５】 増殖試験 脾臓細胞は、免疫したマウスから採取した。単一細胞の懸濁液を調製し、１０
％ＦＢＳとＬ−ｇｌｕと抗生物質を補充したＩＭＤＭ中に細胞を再懸濁した。混
合した脾臓細胞と腫瘍細胞の培養（ＭＳＴＣ）は、３×１０^６腫瘍細胞／ｍＬを
混合することによって調製した。培養物は、７．５％ＣＯ_２中において、３７℃
で５日間インキュベートした。Ｕ字底の９６ウェルプレートの各ウェルに、１μ
Ｃｉのトリチウム標識したチミジンを加えた。上記と同一の条件で、細胞をさら
に１８時間インキュベートして、採取し、Ｂｅｔａ Ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ
（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて、取り込まれたトリチ
ウム標識チミジンの量を測定した。試験は３回行い、式：ＳＩ＝Ｓ６Ｃ−ＥＢＮ
Ａ−４形質移入体（又はＥＢＮＡ−４ワクシニアに感染した）への脾臓細胞の分
裂増殖／Ｓ６Ｃ−ｇｐｔ（又はＴＫ−ワクシニアに感染した）対照形質移入体へ
の脾臓細胞の分裂増殖を用いて、刺激指数（ＳＩ）を計算した。

【００７６】 サイトカインアッセイ 混合した（Ｅ４免疫したマウスからの）脾臓細胞と腫瘍細胞の培養（ＭＳＴＣ
）は、３×１０^６脾臓細胞と３×１０５腫瘍細胞／ｍＬを混合することによって
調製した。７２時間の培養後に上清を集め、製造者の指示書に従って、マウスサ
イトカインＥＬＩＳＡ用の市販のマッチさせた抗体対（Ｉｍｍｕｎｏｋｏｎｔａ
ｃｔ、Ｂｉｏｇｇｉｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、インターフェロン
γ（ＩＦＮγ）とＩＬ−４の存在を試験した。

【００７７】 特異的なＣＴＬ株の作成と細胞傷害アッセイ 以下のように、ペプチド特異的なＣＴＬ株を１２ウェルのプレート中に調製し
た。免疫マウス又は対照非免疫マウスからの脾臓細胞を、６×１０^６／ウェルで
播種し、３×１０^６のペプチドを短時間加えた（５μｇ／ｍＬ Ｐ４）同系脾臓
細胞とともに培養した。６〜８日後、以下のように、^５１Ｃｒ放出によって細胞
媒介性細胞傷害を測定した。２００μＣｉの^５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ａｍ
ｅｒｓｈｍａ、ＵＫ）の存在下において、３７℃で１時間、１００万の標的細胞
をインキュベートし、３回洗浄し、１０μｇの関係する（Ｐ４）又は無関係の（
インフルエンザＮＰ５８−６６）ペプチドの存在下又は非存在下において、１０ ^５ 細胞／ｍＬで、競合培地（ｃｏｍｐｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）中に再懸濁した。
３つのウェルに、異なるエフェクター対標的比で、Ｖ字底９６ウェルプレート中
２００μＬの最終容量で、５×１０^３標的細胞をインキュベートすることによっ
て、試験を行った。細胞を３７℃で４時間インキュベートした後、上清を採取し
、以下の式：パーセント比放出＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大
放出−自発的放出）を用いて特異的な溶解を決定するために使用した。

【００７８】 本発明は、例として記載したにすぎず、本明細書の開示に基づけば当業者に自
明であろう、本発明に対する修飾及び／又は改変も、添付の特許請求の範囲に明
記された本発明の範囲及び精神に属するものと考えられることを理解しなければ
ならない。

【００７９】

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】 （０．５％マウス血清の存在下での）Ｏｖａペプチドに応じたリンパ節Ｔ細胞
のインビトロでの増殖。結果は、ＰＢＳ（アジュバントなし）中のオボアルブミ
ンとＰＢＳのみ、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）のみとＯｖａペプチド
と組み合わせたＣＦＡ、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）のみとＯｖａペプチドと組み合
わせたＬＰＳ、及びウシ型弱毒結核菌ワクチン（ＨＫ−ＢＣＧ）のみとＯｖａペ
プチドと組み合わせたＨＫ−ＢＣＧに対するＴ細胞の応答を示している。

【図２】 ｐＤＮＡ、すなわちオボアルブミンをコードするＤＮＡ（ＰＶＡＣ１．Ｏｖａ
）単独、及びアジュバントＬＰＳ、ＣＦＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、及び熱で死滅させた
リステリア菌（ＨＫＬＭ；Ｈｅａｔ−Ｋｉｌｌｅｄ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎ
ｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）と組み合わせたＰＶＡＣ１．Ｏｖａに応じたリンパ節Ｔ
細胞の増殖。

【図３ａ】 Ｍｈｓｐ６５を発現するｐＤＮＡによる免疫化後のマイコバクテリウムｈｓｐ
６５に応答した特異抗体に対するツカレソールの影響。３週間の間を置いて、２
回、２０μｇのｐＤＮＡでマウスを免疫した。２週間後に、それらから採血し、
ＥＬＩＳＡによって、特異的ＩｇＧ（ａ）、ＩｇＧ２ａ（ｂ）、及びＩｇＧ１（
ｃ）抗組換えＭ．ｈｓｐ６５タンパク質を検出した。ｐ^＊≧０．１ 特異抗体反
応に有意差なし。（ａ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．６５、及びＴｐ３Ｍ．
６５とｐ３Ｍ．６５Ｇ又はｐ３Ｍ．６５，Ｔ、（ｂ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ
３Ｍ．６５又はｐ３Ｍ．６５Ｇ、（ｃ）でのｐ３及び／又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．
６５Ｇｕｂとの比較でｐ^＊＊≦０．０５。（ａ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ
．６５Ｇ又はｐ３Ｍ．６５，Ｔとの比較、（ｂ）でのｐ３及び／又はｐ３，Ｔと
ｐ３Ｍ．６５，ｔ、及びｐ３Ｍ．６５とｐ３Ｍ．６５，ｔ、（ｃ）でのｐ３及び
／又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．６５，Ｔとの比較でｐ^＊＊＊≦０．００３。ｐとｈは
、それぞれ、ｐ３とｐ３Ｍ．６５と比較して有意である。

【図３ｂ】 Ｍｈｓｐ６５を発現するｐＤＮＡによる免疫化後のマイコバクテリウムｈｓｐ
６５に応答した特異抗体に対するツカレソールの影響。３週間の間を置いて、２
回、２０μｇのｐＤＮＡでマウスを免疫した。２週間後に、それらから採血し、
ＥＬＩＳＡによって、特異的ＩｇＧ（ａ）、ＩｇＧ２ａ（ｂ）、及びＩｇＧ１（
ｃ）抗組換えＭ．ｈｓｐ６５タンパク質を検出した。ｐ^＊≧０．１ 特異抗体反
応に有意差なし。（ａ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．６５、及びＴｐ３Ｍ．
６５とｐ３Ｍ．６５Ｇ又はｐ３Ｍ．６５，Ｔ、（ｂ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ
３Ｍ．６５又はｐ３Ｍ．６５Ｇ、（ｃ）でのｐ３及び／又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．
６５Ｇｕｂとの比較でｐ^＊＊≦０．０５。（ａ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ
．６５Ｇ又はｐ３Ｍ．６５，Ｔとの比較、（ｂ）でのｐ３及び／又はｐ３，Ｔと
ｐ３Ｍ．６５，ｔ、及びｐ３Ｍ．６５とｐ３Ｍ．６５，ｔ、（ｃ）でのｐ３及び
／又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．６５，Ｔとの比較でｐ^＊＊＊≦０．００３。ｐとｈは
、それぞれ、ｐ３とｐ３Ｍ．６５と比較して有意である。

【図３ｃ】 Ｍｈｓｐ６５を発現するｐＤＮＡによる免疫化後のマイコバクテリウムｈｓｐ
６５に応答した特異抗体に対するツカレソールの影響。３週間の間を置いて、２
回、２０μｇのｐＤＮＡでマウスを免疫した。２週間後に、それらから採血し、
ＥＬＩＳＡによって、特異的ＩｇＧ（ａ）、ＩｇＧ２ａ（ｂ）、及びＩｇＧ１（
ｃ）抗組換えＭ．ｈｓｐ６５タンパク質を検出した。ｐ^＊≧０．１ 特異抗体反
応に有意差なし。（ａ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．６５、及びＴｐ３Ｍ．
６５とｐ３Ｍ．６５Ｇ又はｐ３Ｍ．６５，Ｔ、（ｂ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ
３Ｍ．６５又はｐ３Ｍ．６５Ｇ、（ｃ）でのｐ３及び／又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．
６５Ｇｕｂとの比較でｐ^＊＊≦０．０５。（ａ）でのｐ３又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ
．６５Ｇ又はｐ３Ｍ．６５，Ｔとの比較、（ｂ）でのｐ３及び／又はｐ３，Ｔと
ｐ３Ｍ．６５，ｔ、及びｐ３Ｍ．６５とｐ３Ｍ．６５，ｔ、（ｃ）でのｐ３及び
／又はｐ３，Ｔとｐ３Ｍ．６５，Ｔとの比較でｐ^＊＊＊≦０．００３。ｐとｈは
、それぞれ、ｐ３とｐ３Ｍ．６５と比較して有意である。

【図４】 増殖性Ｔ細胞応答に対するツカレソールの影響。Ｓ６ｃ−Ｅ４のみ、若しくは
ＥＢＮＡ−４を発現しているワクシニアに感染したＳ６ｃ−Ｅ４ ９Ｓ６Ｃ−Ｖ
Ｅ４）、又はＳ６Ｃ−ｇｐｔ対照腫瘍細胞のみ、若しくはワクシニアＴＫ−対照
ワクシニア構築物に感染したＳ６Ｃ−ｇｐｔ ９Ｓ６Ｃ−ｇｐｔＶ）のうちの何
れかの存在下において、ｐＤＮＡで免疫したマウスから得た脾臓細胞を培養した
。刺激指数は、方法の部に記載されているように計算した。

【図５】 ｐＤＮＡで免疫したマウスでのＩＦＮγの応答とそれに対するツカレソールの
影響。ｐ３、Ｅ４、又はＥ４，Ｔでマウスの群を免疫し、腫瘍Ｓ６Ｃ−Ｅ＄、Ｓ
６Ｃ−ｇｐｔ、又は何も加えずに、脾臓細胞をインビトロで７２時間刺激した。
ＩＦＮγの力価（ｔｉｒｅｓ）は、特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。

【図６】 細胞傷害性Ｔ細胞反応は、ツカレソール処置したマウスで顕著に増強する。ｐ
３Ｍ．６５、ｐ３Ｍ．６５γ、又はｐ３Ｍ．６５，ＴでＨＬＡ−Ａ２／ｋｂトラ
ンスジェニックマウスの群を２回免疫した。５〜６日間、ＨＬＡ−Ａ２結合ペプ
チドＰ＄とともに脾臓細胞を培養した後、通常の^５１Ｃｒ放出アッセイでのエフ
ェクターとして使用した。Ｊｋ−Ａ２ｋｂを標的として使用して、実験の部に記
載されているように、Ｐ４で、無関係なペプチド（Ｉｎｆ）で、又は何も加えず
に短時間の刺激を与えた。

【図７】 ツカレソールで処置したマウスでは、腫瘍の成長阻害が顕著に増強される。ｐ
３、Ｅ４又はＥ４，ＴでＡＣＡマウスの群を３回免疫し、続いて、１０４ Ｓ６
Ｃ腫瘍細胞で攻撃誘発した。マウスは、腫瘍の直径が２０ｍｍに達した時点でマ
ウスを屠殺した。

【図８ａ】 遺伝子銃免疫化に続いてツカレソール処置したマウスでは、ＩＦＮγの産生が
増大する。 それぞれ、単独の、又はツカレソールと組み合わせたｐＶＡＣ１．ＰＲ（図８
ａ）又はＥＢＮＡ−４（図８ｂ）、又は夫々のネガティブプラスミドを用いた遺
伝子銃によって、Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はＡＣＡマウスを免疫した。核タンパ
ク質ペプチド、又はＥＢＮＡ−４抗原を発現している腫瘍細胞、又は抗原陰性腫
瘍細胞とともに脾臓細胞を培養した。ＩＦＮγの力価は、特異的なＥＬＩＳＰＯ
Ｔアッセイによって（図８ｂ）又は特異的なＥＬＩＳＡアッセイ（図８ａ）によ
って測定した。

【図８ｂ】 遺伝子銃免疫化に続いてツカレソール処置したマウスでは、ＩＦＮγの産生が
増大する。 それぞれ、単独の、又はツカレソールと組み合わせたｐＶＡＣ１．ＰＲ（図８
ａ）又はＥＢＮＡ−４（図８ｂ）、又は夫々のネガティブプラスミドを用いた遺
伝子銃によって、Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はＡＣＡマウスを免疫した。核タンパ
ク質ペプチド、又はＥＢＮＡ−４抗原を発現している腫瘍細胞、又は抗原陰性腫
瘍細胞とともに脾臓細胞を培養した。ＩＦＮγの力価は、特異的なＥＬＩＳＰＯ
Ｔアッセイによって（図８ｂ）又は特異的なＥＬＩＳＡアッセイ（図８ａ）によ
って測定した。

【図９ａ】 ツカレソールは、遺伝子銃ＤＮＡ免疫化によって誘導された溶解性ＣＴＬ応答
を増強する。 皮下に（図９ａ）又は経口で（図９ｂ）ツカレソールを与え、又は与えずに、
インフルエンザウイルス核タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡでＣ５７Ｂ
１／６マウスを免疫した。Ａ／ＰＲ８／３４ウイルスを用いて、インビトロで脾
臓細胞を再刺激した。標準的なユーロピウム放出技法を用いて、Ｈ−２Ｄ^ｂで拘
束されたＮＰペプチドを短時間与えた、ＭＨＣに適合した標的細胞の特異的溶解
を測定した。

【図９ｂ】 ツカレソールは、遺伝子銃ＤＮＡ免疫化によって誘導された溶解性ＣＴＬ応答
を増強する。 皮下に（図９ａ）又は経口で（図９ｂ）ツカレソールを与え、又は与えずに、
インフルエンザウイルス核タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡでＣ５７Ｂ
１／６マウスを免疫化した。Ａ／ＰＲ８／３４ウイルスを用いて、インビトロで
脾臓細胞を再刺激した。標準的なユーロピウム放出技法を用いて、Ｈ−２Ｄｂで
拘束されたＮＰペプチドを短時間与えた、ＭＨＣに適合した標的細胞の特異的溶
解を測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ａ６１Ｐ 37/00 37/04 37/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ (72)発明者 キエスリング、ロルフ スウェーデン国、エス−171・76、ストッ クホルム、カロリンスカ・ホスピタル、キ ャンサー・センター・カロリンスカ内（番 地なし) Ｆターム(参考） 4C084 AA13 MA02 MA52 MA59 MA63 NA05 NA14 ZB07 ZB09 ZB33 4C085 AA03 BB01 BB11 DD62 EE06 FF11 FF12 FF17

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 疾病状態に対して哺乳動物に予防接種する方法であって、 適切なベクターの中にある、前記疾病状態と関連する抗原ペプチドをコードす
   るヌクレオチド配列を前記哺乳動物に投与することと； さらに、前記抗原ペプチドによって開始される液性免疫反応と細胞性免疫反応
   の両者を増強する化合物であって、 ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタンアミド； Ｎ，Ｎ−ジエチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
   ンアミド； Ｎ−イソプロピル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
   ンアミド； エチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノニトリル； （±）−５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−メチルペン
   タン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２，２−ジメチルペンタ
   ン酸； メチル ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチルベンゾエー
   ト； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチル安息香酸； ベンジル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート
   ； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−ブチル］テト
   ラゾール； ７−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘプタン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−ｎ−プロポキシフェノキシ）ペン
   タン酸； ５−（４，６−ジクロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
   ン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−メチルスルホニルペ
   ンタンアミド； エチル ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）ベンゾエー
   ト； ５−（４−クロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタン酸； ５−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシ）ペンタン酸； アミノグアニジン； ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ブタン酸； ６−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサン酸； エチル ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）ベンゾ
   エート； ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）安息香酸； ２−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）フェニル］テ
   トラゾール； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェノキシ）ペンタン酸
   ； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）プロピオニトリル； ４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド； フェニルアセトアルデヒド； ４−メトキシフェニルアセトアルデヒド； １−ヒドロキシ−２−フェニルプロパン； ３−フェニルプロポニオンアルデヒド； ４−ニトロベンズアルデヒド； メチル ４−ホルミルベンゾエート； ４−クロロベンズアルデヒド； ４−メチルオキシベンズアルデヒド； ４−メチルベンズアルデヒド； ８，１０−ジオキソウンデカン酸； ４，６−ジオキソヘプタン酸； ペンタンジオン； ５−メトキシ−１−テトラロン； ６−メトキシ−１−テトラロン； ７−メトキシ−１−テトラロン； ２−テトラロン； ３−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ブタノン
   ； ２’，４’−ジヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ２−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−ペント−２エン−４オン； ナリンゲニン ４’，５，６−トリヒドロキシフラボノン； ４’−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ６，７−ジヒドロキシクマリン； ７−メトキシ−２−テトラロン； ６，７−ジメトキシ−２−テトラロン； ６−ヒドロキシ−４−メチルクマリン； ホモゲンチジン酸γ−ラクトン； ６−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン； ８−メトキシ−２−テトラロン； 及び、適切な場合には、生理学的に許容されるその塩 から選択される化合物を前記哺乳動物に投与することと を備えた方法。
2. 【請求項２】 前記化合物の投与が、１乃至７の時点で、前記ヌクレオチド
   配列の投与から約１４日前と約１４日後の間に行われる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記化合物の投与が、１乃至７の時点で、前記ヌクレオチド
   配列の投与から約７日前と約７日後の間に行われる請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記化合物の投与が、前記ヌクレオチド配列の投与から約２
   ４時間前と約２４時間後の間に行われる請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記化合物の投与が、前記ヌクレオチド配列の投与と実質的
   に同時である請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 約１日から約１８ヶ月の間の間隔で、１乃至４回繰り返され
   る請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ヌクレオチド配列の投与が、経口、鼻、肺、筋肉内、皮
   下、又は皮内経路を介する請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ヌクレオチド配列が、遺伝子銃送達手法を用いて投与さ
   れる請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記化合物の投与が、経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、皮内、
   又は局所経路を介する請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記化合物が、遺伝子銃送達手法を用いて投与される請求
    項１〜８の何れか１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記化合物が、約０．１ｍｇ／ｋｇ／投与と約１００ｍｇ
    ／ｋｇ／投与の間の用量で投与される請求項９又は１０の何れかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記哺乳動物がヒトである請求項１〜１１の何れか１項に
    記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記化合物が、４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェ
    ノキシメチル）安息香酸である請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 疾病状態と関連し、適切なベクターの中にある抗原ペプチ
    ドをコードするヌクレオチド配列と、抗原ペプチドによって開始される哺乳動物
    中の液性免疫反応と細胞性免疫反応の両者を増強する化合物であって、 ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタンアミド； Ｎ，Ｎ−ジエチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
    ンアミド； Ｎ−イソプロピル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
    ンアミド； エチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノニトリル； （±）−５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−メチルペン
    タン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２，２−ジメチルペンタ
    ン酸； メチル ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチルベンゾエー
    ト； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチル安息香酸； ベンジル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート
    ； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−ブチル］テト
    ラゾール； ７−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘプタン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−ｎ−プロポキシフェノキシ）ペン
    タン酸； ５−（４，６−ジクロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
    ン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−メチルスルホニルペ
    ンタンアミド； エチル ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）ベンゾエー
    ト； ５−（４−クロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタン酸； ５−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシ）ペンタン酸； アミノグアニジン； ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ブタン酸； ６−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサン酸； エチル ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）ベンゾ
    エート； ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）安息香酸； ２−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）フェニル］テ
    トラゾール； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェノキシ）ペンタン酸
    ； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）プロピオニトリル； ４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド； フェニルアセトアルデヒド； ４−メトキシフェニルアセトアルデヒド； １−ヒドロキシ−２−フェニルプロパン； ３−フェニルプロポニオンアルデヒド； ４−ニトロベンズアルデヒド； メチル ４−ホルミルベンゾエート； ４−クロロベンズアルデヒド； ４−メチルオキシベンズアルデヒド； ４−メチルベンズアルデヒド； ８，１０−ジオキソウンデカン酸； ４，６−ジオキソヘプタン酸； ペンタンジオン； ５−メトキシ−１−テトラロン； ６−メトキシ−１−テトラロン； ７−メトキシ−１−テトラロン； ２−テトラロン； ３−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ブタノン
    ； ２’，４’−ジヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ２−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−ペント−２エン−４オン； ナリンゲニン ４’，５，６−トリヒドロキシフラボノン； ４’−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ６，７−ジヒドロキシクマリン； ７−メトキシ−２−テトラロン； ６，７−ジメトキシ−２−テトラロン； ６−ヒドロキシ−４−メチルクマリン； ホモゲンチジン酸γ−ラクトン； ６−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン； ８−メトキシ−２−テトラロン； すなわち、及び、適切な場合には、生理学的に許容されるその塩 から選択される化合物と を含むワクチン組成物。
15. 【請求項１５】 経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、又は皮内経路からの投与に
    適した形態である請求項１４に記載のワクチン組成物。
16. 【請求項１６】 遺伝子銃送達手法を用いた投与に適した形態である請求項
    １４に記載のワクチン組成物。
17. 【請求項１７】 前記化合物が、４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェ
    ノキシメチル）安息香酸である請求項１４〜１６の何れか１項に記載のワクチン
    組成物。
18. 【請求項１８】 医薬の製造における化合物の使用であって、哺乳動物への
    該化合物の投与が、疾病状態と関連する抗原ペプチドによって開始される液性応
    答と細胞性応答の両者を増強せしめ、ペプチドが、前記ペプチドをコードするヌ
    クレオチド配列の前記哺乳動物への投与の結果として発現されており、 前記化合物が、 ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタンアミド； Ｎ，Ｎ−ジエチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
    ンアミド； Ｎ−イソプロピル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
    ンアミド； エチル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノニトリル； （±）−５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−メチルペン
    タン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２，２−ジメチルペンタ
    ン酸； メチル ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチルベンゾエー
    ト； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）メチル安息香酸； ベンジル ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタノエート
    ； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−ブチル］テト
    ラゾール； ７−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘプタン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−ｎ−プロポキシフェノキシ）ペン
    タン酸； ５−（４，６−ジクロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタ
    ン酸； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）−Ｎ−メチルスルホニルペ
    ンタンアミド； エチル ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）ベンゾエー
    ト； ５−（４−クロロ−２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ペンタン酸； ５−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシ）ペンタン酸； アミノグアニジン； ４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ブタン酸； ６−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）ヘキサン酸； エチル ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）ベンゾ
    エート； ４−（３−アセチルアミノ−２−ホルミルフェノキシメチル）安息香酸； ２−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）安息香酸； ５−［４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシメチル）フェニル］テ
    トラゾール； ５−（２−ホルミル−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェノキシ）ペンタン酸
    ； ３−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェノキシ）プロピオニトリル； ４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド； フェニルアセトアルデヒド； ４−メトキシフェニルアセトアルデヒド； １−ヒドロキシ−２−フェニルプロパン； ３−フェニルプロポニオンアルデヒド； ４−ニトロベンズアルデヒド； メチル ４−ホルミルベンゾエート； ４−クロロベンズアルデヒド； ４−メチルオキシベンズアルデヒド； ４−メチルベンズアルデヒド； ８，１０−ジオキソウンデカン酸； ４，６−ジオキソヘプタン酸； ペンタンジオン； ５−メトキシ−１−テトラロン； ６−メトキシ−１−テトラロン； ７−メトキシ−１−テトラロン； ２−テトラロン； ３−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ブタノン
    ； ２’，４’−ジヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ２−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−ペント−２エン−４オン； ナリンゲニン ４’，５，６−トリヒドロキシフラボノン； ４’−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）アセトフェノン； ６，７−ジヒドロキシクマリン； ７−メトキシ−２−テトラロン； ６，７−ジメトキシ−２−テトラロン； ６−ヒドロキシ−４−メチルクマリン； ホモゲンチジン酸γ−ラクトン； ６−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン； ８−メトキシ−２−テトラロン； 及び、適切な場合には、生理学的に許容されるその塩 から選択される使用。
19. 【請求項１９】 前記医薬が、経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、又は皮内経路
    からの投与に適した形態である請求項１８に記載の使用。
20. 【請求項２０】 前記医薬が、遺伝子銃送達手法を用いた投与に適した形態
    である請求項１９に記載の使用。
21. 【請求項２１】 前記化合物が、４−（２−ホルミル−３−ヒドロキシフェ
    ノキシメチル）安息香酸である請求項１８〜２０の何れか１項に記載の使用。
22. 【請求項２２】 前記化合物が、約０．１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇ／
    投与の間の用量で投与される請求項１８〜２１の何れか１項に記載の使用。
23. 【請求項２３】 前記医薬がさらに前記ヌクレオチド配列を含む請求項１８
    〜２２の何れか１項に記載の使用。
24. 【請求項２４】 抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列と前記抗原ペ
    プチドによって開始される細胞性免疫反応と液性免疫反応の両者を増強する化合
    物とを含む、請求項１に記載の方法において、別々に、連続して、又は同時に投
    与するための成分の組合せ。