JP2002520064A

JP2002520064A - 昆虫による修飾された花蜜からの代謝産物を収集する方法

Info

Publication number: JP2002520064A
Application number: JP2000560273A
Authority: JP
Inventors: クレーメルス，ヤンティナ; コルネリスアンヘネント，ゲルリト; マリアカテル，マルティン
Original assignee: スティッチングセントルムフォールプランテンベレデリングス−エンレプロデュクティエオンデルズーク（セーペーエルオー−デーエルオー）
Priority date: 1998-07-16
Filing date: 1999-07-15
Publication date: 2002-07-09
Also published as: WO2000004176A1; CA2333897A1; IL140911A0; NZ509813A; AU772119B2; AU5070699A; EP1097229A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｉ）植物の蜜腺の中で機能するプロモーターと、ｉｉ）タンパク質を暗号化していて、このプロモーターと融合するＤＮＡ配列と、ｉｉｉ）シグナルペプチドを暗号化しているＤＮＡ配列であって、翻訳によって、組み換えタンパク質を暗号化しているＤＮＡ配列と融合することで、この組み換えタンパク質に花蜜を生産させるＤＮＡ配列とを含み、さらにオプションとして、ｉｖ）ＲＮＡ分子の転写終結とポリアデニル化のために植物の中で機能する信号配列を含む発現カセットを有する組み換え二重鎖ＤＮＡ分子に関するものである。本発明はさらに、蜂蜜から組み換え遺伝子産物を生産する方法に関するものでもあり、その方法は、ｉ）植物細胞の中に組み換え二重鎖ＤＮＡ分子を導入してトランスジェニック植物を栽培し、そのトランスジェニック細胞から複数本の植物を新たに栽培し、その中から、花蜜の中に組み換え遺伝子産物を分泌するように変化した植物を選択し、ｉｉ）昆虫、好ましくはミツバチに、それらトランスジェニック植物から花蜜を集めさせ、その花蜜を処理して蜂蜜にし、ｉｉｉ）その蜂蜜から組み換え遺伝子産物を分離精製する操作を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、真核細胞においてプロモーターとして働くことができる、分離精製
されたDNA配列に関する。より詳細には、本発明は、植物の蜜腺（nectary）にお
いて遺伝子を発現するためのプロモーターとして働くそのようなDNA配列に関す
る。本発明はまた、蜜腺において該遺伝子の発現に影響を及ぼすプロモーターの
制御下で、構造遺伝子または合成遺伝子を含むキメラ遺伝子構成物に関する。本
発明はまた、昆虫、好ましくはミツバチに、花蜜または他の滲出物において代謝
産物を放出する植物から花蜜を集めさせ、加工させることによって、蜂蜜におい
て該代謝産物を製造する方法に関する。さらに本発明は、該キメラ遺伝子を発現
する、植物細胞、植物またはそれらからの誘導体に関する。

【０００２】発明の背景蜜腺は、花の内部（花）または外部（花の外）に配置されることができる花蜜
分泌器官または組織である。花蜜の主成分は糖であり、異なる種からの花の花蜜
間の変動は主に、グルコース、フルクトースおよびショ糖の濃度および比である
（ベイカー(Baker)およびベイカー(Baker)、1982）。さらに、植物の種に依存し
て、種々の量の多糖、脂質、有機酸、揮発成分、無機物、リン酸塩、アルカロイ
ド、アミノ酸およびタンパク質が検出された（ベイカー(Baker)およびベイカー(
Baker)、1982）。分化された吸込み器官(sink organ)であるので、蜜腺は、篩部
の荷下ろし(unloading)によってショ糖を供給される。

【０００３】糖の蓄積および花蜜の分泌のメカニズムは、数種の植物種について記載されて
いる（ファーン(Fahn)ら、1979）。蜜腺への糖の輸送は、活発な輸送メカニズム
ならびに／または浸透および化学勾配によって達成される。多くの植物の蜜腺に
おいては、ショ糖がグルコースとフルクトースに転化され、その結果、ヘキソー
スが主要な花蜜をもたらす。ヘキソースの一部はでん粉へと転化され、でん粉は
、開花および花蜜の分泌の前に加水分解される。

【０００４】蜜腺の柔組織における細胞から細胞への花蜜の輸送は、これらの細胞間での多
数の原形質連絡の存在によって証明された（ファーン(Fahn)ら、1979）ように、
主として共原形質体によるものである。花蜜は、分泌細胞から、細胞膜を経て（
エクリン腺分泌）、またはゴルジおよび原形質内網状小胞(endoplastmatic reti
culum vesicle)を経て（グラニュロクリン(granulocrine)分泌）、分泌される。
蜜腺の発達および蜜腺の生化学の分子的調節についての研究は報告されていない
。

【０００５】花蜜の主な機能は、受粉する昆虫に報いることである。昆虫は、それらの短期
間のエネルギー必要性を満たすために花蜜を集める。コロニーで暮らすミツバチ
は、大量の花蜜を蜂蜜に加工し、蜂蜜は巣箱のハチの巣に貯蔵され、冬期に食物
供給物として使用される。ミツバチのコロニー内では、異なる種類の働きバチが
蜂蜜製造プロセスにおいて協力する。軍隊ハチ(foraging bee)は、花から花粉お
よび花蜜を集め、ミツバチの巣箱に持って行く。巣箱に戻ると、そのほとんどを
家バチ(household bee)に与える。

【０００６】花粉は、特にハチの子を養うために、タンパク質源として使用される。成虫の
看護(nurse)バチと働きバチは、わずかのタンパク質しか使用せず、タンパク質
を消化するための彼らの容量は非常に低い（クライルシェイム(Crailsheim)ら、
1993）。蜂蜜加工は、蜂蜜胃袋(honey stomach)からの花蜜を繰り返し飲み込み
、かつ吐くことによって行う。最初のプロセスで、水分含量の15％が失われる。
この半加工された花蜜は、蜂の巣の巣室に一時的に貯蔵され、後にさらに加工す
るために取り出される。最終のプロセスは、花粉粒子のような小さい粒子を廃棄
するために蜂蜜をろ過することを含む。

【０００７】糖代謝酵素（インベルターゼ、アミラーゼ）を加え、そして、蜂蜜は20％の平
均水分含量まで濃縮される。ほとんどの花蜜および蜂蜜は、痕跡量（＜0.2％）
のタンパク質しか含まない。しかしながら、カルナブルガリス(Calluna vulga
ris)（ヘザー）の蜂蜜は、1.8％までのタンパク質を含むことができ、蜂蜜にチ
キソトロピー特性を与える（バトラー(Butler)、1962）。ミツバチが、蜂蜜加工
中に、インベルターゼのような酵素を花蜜に加えることが知られている。

【０００８】したがって、プロテアーゼがまた加えられる見込みは非常に低い。タンパク質
消化は、蜂蜜の胃袋中では起こらないが、ミツバチの腸では起こる。しかし、成
虫の働きバチがタンパク質を消化する能力は非常に低く、ハチが主に必要とする
のは、ハチが花蜜から得るエネルギーである。今までに、タンパク質がヘザーの
蜂蜜に存在すること、および、これらがヘザーの花蜜に由来するのか、またはミ
ツバチによって蜂蜜に加えられたのかは立証されていなかった。

【０００９】本発明においては、ヘザーの蜂蜜は、ヘザーの花蜜に由来する２つの独特のタ
ンパク質を含むことを立証した。これらの結果に基づいて、花蜜および蜂蜜にお
けるタンパク質の製造系が立証された。本発明の目的は、組換えタンパク質がトランスジェニック植物の花蜜で分泌さ
れ得ること、この花蜜はミツバチによって集められること、および、ミツバチは
この花蜜を、不変のタンパク質を濃縮した形態で含む蜂蜜へと加工することを示
すことである。

【００１０】定義蜂蜜：約80％の糖および種々の量の他の成分を含み、花または花の外の蜜腺か
ら、または糖液(honeydew)、他の植物の滲出液もしくは人工的な糖溶液から花蜜
を集め、加工する、昆虫、好ましくはミツバチによって生産される物質。

【００１１】MADS ボックス遺伝子(MADS box gene) ：アラビドプシスアガモウス(Arabid
opsis AGAMOUS)タンパク質およびアンチリーナムデフィシエンス(Antirrhinum
DEFICIENCE)タンパク質における同様の領域と相同である、56個のアミノ酸の領
域を有する転写因子をコードする遺伝子。この領域は、「MADS ボックス」と呼
ばれる。この領域の少なくとも50％のアミノ酸は、アガモウス(AGAMOUS)および
／またはデフィシエンス(DEFICIENCE)のMADS ボックスにおけるアミノ酸組成と
同一でなければならない。

【００１２】蜜腺：花蜜を放出する、花に配置された（花の蜜腺）、または花の外に配置さ
れた（花の外の蜜腺）、植物の分泌器官または分泌組織。花蜜：蜜腺により分泌される、流体を含む糖。花蜜はまた、無機物、アミノ酸
、タンパク質、有機酸、揮発成分、アルカロイド等のような物質を含むことがで
きる。

【００１３】組換えタンパク質：組換えDNA分子の遺伝子産物組換えDNA分子：天然には連続しない配列が、インビトロ(in vitro)での操
作によって、互いに隣接して置かれるDNA分子。プロモーター：遺伝子のコード配列に対して通常上流のDNA領域であり、RNAポ
リメラーゼを結合し、酵素を正しい転写開始部位に向ける。

【００１４】発明の概要製薬目的のための組換えタンパク質の製造は、成長している市場である。今ま
でに、主に細菌および酵母系が、タンパク質の大量生産のために使用された。近
年、動物生産系がまた発達してきた。植物のための有効な形質転換技術の利用可
能性を用いて、タンパク質製造のために植物を使用する方法が、現在進行中であ
る。植物においては、組換えタンパク質は、塊茎および種子のような吸込み器官
に対して標的にされる。これらの製造方法の重大な欠点は、組換えタンパク質が
、延長された、したがって高価な精製工程の後にのみ得られることである。

【００１５】本発明は、トランスジェニック植物の花蜜を集める昆虫、好ましくはミツバチ
によって製造される蜂蜜において、代謝産物、好ましくは組換えたんぱく質を製
造する方法を提供する。蜂蜜の収集は非常に単純であり、タンパク質の精製は非
常に真直ぐに進み、高等な精製工程を必要としない。菜種のような作物における
タンパク質収量の見積りを与えるために、本発明者らは、ヘザーの蜂蜜において
見出されたように、蜂蜜中2％の平均タンパク質生産量を示唆する。１ヘクター
ルの菜種が１シーズンに100〜500キロの蜂蜜を生じるなら、２〜10キロのタンパ
ク質収量が得られる。

【００１６】さらに、本発明は、花蜜にこれらの代謝産物を分泌する非トランスジェニック
植物に由来する蜂蜜から代謝産物を集める方法を提供する。例としては、ロドデ
ンドロン・アルボレウム(Rhododendron arboreum)およびロドデンドロン・バル
バタム(Rhododendron barbatum)ならびに、ピプタンタス・ネパレンシス(Piptan
thus nepalensis)の花蜜において放出される、アセチルアンドロメドール（ジテ
ルピン(diterpine)化合物）のような二次代謝産物である（マルチニ(Martini)ら
、1990）。

【００１７】本発明は、ペチュニアの蜜腺において大いに発現され、おしべにおいて弱く発
現される、ペチュニアからの遺伝子、NEC1を提供する。本発明はまた、MADSボッ
クスタンパク質をコードし、ペチュニアの蜜腺において特異的に発現される、ペ
チュニアからの別の遺伝子、FBP15を提供する。さらに、本発明は、NEC1およびF
BP15遺伝子のプロモーターの分離されたDNA配列を提供する。さらには、本発明
は、胚様(germin-like)タンパク質に翻訳的に融合され、成熟胚様(germin-like)
タンパク質をヘザー（カルナブルガリス(Calluna vulgaris)）の蜜腺に対して
標的にする機能を有するシグナルペプチドをコードする、蜜腺において発現され
る、分離されたDNA配列を提供する。

【００１８】本発明は、タンパク質含有糖溶液がミツバチによって集められて、糖溶液自体
よりタンパク質含量が多い蜂蜜を製造し、このタンパク質は質的な変化を受けな
いことの証明を与える。本発明はまた、組換えタンパク質をトランスジェニック
植物の花蜜において製造することができること、および、このタンパク質は、こ
の花蜜を集めたミツバチによって製造される蜂蜜に存在することの証明を与える
。

【００１９】したがって、本発明は、NEC1で示されたタンパク質をコードし、後の配列一覧
表の配列番号:1で与えられるアミノ酸配列またはNEC1の相同体を有する、分離さ
れたDNA配列を提供する。NEC1の相同体は、主に蜜腺において発現され、および
／または、配列番号:1で与えられるアミノ酸配列と少なくとも60％の相同性を有
する。さらに、本発明は、FBP15で示されたタンパク質をコードし、後の配列一
覧表の配列番号:2で与えられるアミノ酸配列またはFBP15の相同体を有する、分
離されたDNA配列を提供する。FBP15の相同体は蜜腺において特異的に発現され、
MADSボックス族に属する。

【００２０】さらには、相同体はまた、MADSボックス領域内の少なくとも80％の相同性およ
び、配列番号:2で与えられるアミノ酸配列と60％の全体的相同性を有する遺伝子
配列である。さらに、本発明は、「CVSP」で示されたシグナルペプチド（カルナ
ブルガリスシグナルペプチド(Calluna Vulgaris signal peptide)）をコ
ードするDNA配列の特性決定および分離を提供し、ここで、DNA配列に含まれる情
報は、蜜腺において発現されるタンパク質をコードするDNA配列と翻訳的に融合
すると、花蜜に対するタンパク質の標的化を可能にする。

【００２１】本発明のDNA配列はまた、それらが、それぞれ配列番号:4および配列番号:5で
与えられるヌクレオチド配列を有する、NEC1遺伝子およびFBP15遺伝子または、
機能的に相同の遺伝子もしくは本質的に同一のヌクレオチド配列もしくはその一
部もしくは、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって該配列
から誘導されるその誘導体を含み、該誘導されたヌクレオチド配列は、それぞれ
配列番号:4および5で与えられるヌクレオチド配列を用いたハイブリッド化によ
って得ることができることにおいて、特徴づけることができる。

【００２２】さらには、本発明のDNA配列はまた、それらが、配列番号:6で与えられるヌク
レオチド配列または、本質的に同一のヌクレオチド配列またはその一部または、
１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって該配列から誘導され
るその誘導体を有するシグナル配列CVSPを含むことにおいて、特徴づけることが
できる。

【００２３】さらに、本発明は、蜜腺特異的に発現された配列の上流のプロモーター領域か
らの分離されたDNA配列を提供し、この蜜腺特異的に発現された配列は、配列番
号:1で与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質または相同タンパク質をコード
する。さらには、本発明は、蜜腺特異的に発現された配列の上流のプロモーター
領域からの分離されたDNA配列を提供し、この蜜腺特異的に発現された配列は、
配列番号:2で与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質または相同タンパク質を
コードする。

【００２４】さらなる態様においては、本発明は、先に定義したDNA配列の任意のものによ
ってコードされるタンパク質を提供する。さらに、本発明は、蜜腺において組換
えタンパク質の放出を示すトランスジェニック植物を製造する方法であって、キ
メラ遺伝子の発現および組換えタンパク質の標的化は、本発明において記載した
プロモーター配列およびシグナル配列の制御下にある方法を提供する。

【００２５】なおさらには、本発明は、蜜腺において組換えタンパク質を製造するトランス
ジェニック植物の製造方法であって、キメラ遺伝子の発現は、蜜腺において発現
される他の遺伝子の上流のプロモーター領域の制御下にある方法を提供する。な
おさらには、本発明は、蜜腺において組換えタンパク質を製造するトランスジェ
ニック植物の製造方法であって、これらのタンパク質の発現は、蜜腺においてタ
ンパク質の標的化に影響を及ぼす任意のシグナルペプチドの制御下にある方法を
提供する。

【００２６】また、本発明は、上記の方法において使用されるべき発現カセットを含む組換
え二重らせんDNA分子を提供する。さらに、本発明は、トランスジェニック細菌
、蜜腺に組換えタンパク質を製造するトランスジェニック植物および、また植物
細胞、組織培養物、植物の部分または該トランスジェニック植物に由来する後代
植物を提供する。最後に、本発明は、トランスジェニック植物から花蜜を集め、
この花蜜を蜂蜜へと加工するミツバチによって製造される蜂蜜において組換え遺
伝子産物を製造する方法を提供する。

【００２７】発明の詳細な説明本発明は、群を成して蜜を集めるミツバチにより収集される蜜腺および花蜜中
の組換えタンパク質を産生するトランスジェニック植物の製造方法を提供する。
本発明は、ミツバチがタンパク質含有花蜜を濃縮形態での不変タンパク質を含有
する蜂蜜に加工処理する証拠を示す。所望のタンパク質は、その後、蜂蜜から精
製され得る。

【００２８】トランスジェニック植物の蜜腺中で組換えタンパク質を発現するためには、蜜
腺中で発現されるタンパク質をコードする配列の上流のプロモーター領域からの
単離DNA配列の、組換えタンパク質をコードする配列との翻訳的融合（transloti
onal fusion）が実行されねばならない。好ましくは、プロモーター領域からの
単離DNA配列は、蜜腺中で特定的にまたは高度に発現される配列の上流に存在す
る。

【００２９】本発明は、NEC1を指示されるタンパク質あるいはその相同タンパク質またはそ
の一部をコードするペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）から単離されるD
NA配列に関する。相同タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、少
なくとも65％の相同を有する。NEC1遺伝子のcDNA配列は、図４にそして配列番号
４で示される。NEC1遺伝子の推定アミノ酸配列は、配列番号１で示される。

【００３０】 NEC1遺伝子は、ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）の蜜腺中ならびに
花糸の非常に局限された領域で強い発現を示す。NEC1の推定アミノ酸配列は、膜
結合タンパク質を予示する。その遺伝子の正確な機能は未だ明らかにされていな
いが、しかし、葉でNEC1を異所的に発現するトランスジェニック植物の表現型を
考えれば、NEC1の糖代謝における役割は明らかである。

【００３１】本発明は、標準的方法およびNEC1遺伝子の既知のDNA配列を用いて、その他の
生物体、好ましくは植物から単離され得る相同DNA配列にも関する。より的確に
は、NEC1遺伝子のDNA配列と高度の相同性を有するが、しかし完全に同一という
わけではないDNA配列を、本発明の方法に用いることもできる。85〜100％の相同
性を有する配列の使用が好ましい。１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠
失または置換による配列番号４で示される配列に起因するDNA配列も用いられ得
る。これは、天然変異あるいは標的化突然変異誘発または組換えにより導入され
る変異を含む。配列番号４で示されるDNA配列は、DNA合成技法を用いても生成さ
れ得る。

【００３２】本発明は、FBP15を指示されるMADSボックスタンパク質あるいはその相同タン
パク質またはその一部をコードするペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）
から単離されるDNA配列に関する。FBP15のcDNA配列は、配列番号５で示される。
FBP15は、ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）の蜜腺中でのみ発現を示す
。FBP15の機能は不明である。

【００３３】本発明は、標準的方法およびFBP15の既知のDNA配列を用いて、その他の生物体
、好ましくは植物から単離され得る相同DNA配列にも関する。より的確には、FBP
15のDNA配列と高度の相同性を有するが、しかし完全に同一というわけではないD
NA配列を、本発明の方法に用いることもできる。85〜100％の相同性を有する配
列の使用が好ましい。１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換
による配列番号５で示される配列に起因するDNA配列も用いられ得る。これは、
天然変異あるいは標的化突然変異誘発または組換えにより導入される変異を含む
。配列番号５で示されるDNA配列は、一般的DNA合成技法を用いても生成され得る
。

【００３４】さらに、本発明は、蜜腺特異的発現配列の上流のプロモーター領域からの単離
DNA配列であって、蜜腺特異的発現配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列を
包含するタンパク質、または蜜腺中で発現される相同タンパク質をコードする単
離DNA配列を提供する。さらに、本発明は、蜜腺特異的発現配列の上流のプロモ
ーター領域からの単離DNA配列の上流のプロモーター領域からの単離DNA配列であ
って、蜜腺特異的配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列を包含するタンパク
質または蜜腺中で発現される相同タンパク質をコードする単離DNA配列を提供す
る。

【００３５】特に本発明は、蜜腺特異的発現配列の上流のプロモーター領域からの単離DNA
配列であって、蜜腺特異的発現配列が：ａ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列、あるいはｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列とのまたは（ａ）の断片とのハイブリダ
イゼーションにより得られるヌクレオチド配列、を有する単離DNA配列を提供する。

【００３６】さらに特定の実施態様では、本発明は、ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybr
ida）の植物から得られる、蜜腺特異的発現配列の上流のプロモーター領域から
の単離DNA配列であって、本質的に配列番号７で示される配列、またはプロモー
ター活性を有するその機能性断片から成る単離DNA配列を提供する。

【００３７】さらに別の局面において、本発明は蜜腺特異的発現配列の上流のプロモーター
領域からの単離DNA配列であって、蜜腺特異的発現配列が、ａ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列、あるいはｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列とのまたは（ａ）の断片とのハイブリダ
イゼーションにより得られるヌクレオチド配列、を有する単離DNA配列を提供する。

【００３８】さらに特定の実施態様では、本発明は、ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybr
ida）の植物から得られる、蜜腺特異的発現配列の上流のプロモーター領域から
の単離DNA配列であって、本質的に配列番号８で示される配列、またはプロモー
ター活性を有するその機能性断片から成る単離DNA配列を提供する。

【００３９】さらに、本発明は、シグナルペプチドのためのコード領域を包含する単離DNA
配列であって、DNA配列に含入される情報が、蜜腺中で発現されるタンパク質を
コードするDNA配列との翻訳的融合に際して、タンパク質を花蜜の標的にする単
離DNA配列を提供する。特に、前記のDNA配列は、カルナ・ブルガリス（Calluna
vulgaris）から得られる、配列番号６で示されるヌクレオチド配列、または配列
番号６で示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションにより得られる
ヌクレオチド配列を包含する。95〜100％の相同性を有する配列の使用が好まし
い。

【００４０】１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換による配列番号６で
示される配列に起因するDNA配列も用いられ得る。これは、天然変異あるいは標
的化突然変異誘発または組換えにより導入される変異を含む。配列番号６で示さ
れるDNA配列は、DNA合成技法を用いても生成され得る。シグナルペプチドCVSPは
、カルナ・ブルガリス（Calluna vulgaris）花の花蜜から、ならびにその花蜜を
収集したミツバチにより加工処理される蜂蜜から単離された。ギョリュウモドキ
蜜腺中のCVSPの機能は、ゲルミン（germin）様タンパク質を花蜜の標的にするこ
とである。DNA配列CVSPは、他のタンパク質を植物種中の花蜜の標的にするため
にも用いられ得る。

【００４１】本発明の目的は、植物の花蜜中に組換えタンパク質を産生するためのDNA配列
の使用であって、タンパク質が蜜腺中に産生され、花蜜の標的にされ、そして蜜
腺中での発現が蜜腺中で発現されるDNA配列の上流のプロモーター領域から成るD
NA配列を用いることにより達成され、そして花蜜中の分泌が組換えタンパク質を
花蜜の標的にするシグナル配列をコードするDNA配列を用いることにより達成さ
れる使用である。

【００４２】さらに別の局面では、本発明は、組換えタンパク質が蜜腺以外の植物組織中で
発現される方法であって、花蜜の生化学的組成が組換え遺伝子発現の結果として
変えられる方法に関する。本発明は、組換えタンパク質がトランスジェニック植
物の蜜腺中で発現される方法であって、花蜜の生化学的組成または花蜜分泌がこ
のタンパク質発現の結果として変えられる方法にも関する。特に、本発明は、組
換えタンパク質が蜜腺中の糖代謝を妨げる酵素である方法に関する。

【００４３】蜜腺および花蜜中の組換えタンパク質の産生は、植物のゲノム中に、以下の構
成要素を有する発現カセットを包含し、それを発現する組換え二本鎖DNA分子を
統合することにより成し遂げられる：ｉ）植物の蜜腺中で機能性のプロモーター、ｉｉ）プロモーターに融合されるタンパク質をコードするDNA配列、ｉｉｉ）組換えタンパク質を花蜜の標的化し、組換えタンパク質をコードする
DNA配列に翻訳的に融合されるシグナルペプチドをコードするDNA配列、および任
意に、ｉｖ）RNA分子の転写終止およびポリアデニル化に関して植物中で機能的なシ
グナル配列。

【００４４】このようなDNA分子も本発明の目的である。本発明は、ペチュニアからのNEC1
遺伝子のプロモーター領域、ギョリュウモドキからのシグナル配列CVSP、レポー
ター遺伝子GUSのコード領域およびNOSターミネーターを包含するプラスミドpCV3
（図18）の形態の前記の発現カセットを含有するのようなDNA分子の一例を提供
する。原則として、植物の蜜腺中で活性であるあらゆるプロモーターは、プロモ
ーターとして用いられ得る。プロモーターは、選択された遺伝子が蜜腺中で発現
されるのを保証する。

【００４５】さらに、原則として、発現タンパク質を花蜜の標的にするあらゆるシグナル配
列が、シグナル配列として用いられ得る。シグナル配列は、タンパク質が花蜜中
で発現されるのを保証する。さらに、蜜腺中の組換えタンパク質をコードするあ
らゆる配列が、本発明で用いられ得る。好ましくは、本発明の目的は、製薬目的
に用いられるタンパク質をコードするDNA配列に関する。その他の目的、例えば
生物検定用の酵素または食品添加剤用の酸化防止剤のためにタンパク質を産生す
るために本発明を用いることもできる。さらに、有害昆虫の捕食者を引き寄せる
か、あるいは有害昆虫を殺害または撃退する花蜜中の代謝物質を産生するために
本発明を用いることもできる。

【００４６】別の局面では、授粉昆虫に対する植物の誘引性を修飾し、または授粉昆虫の健
康を改善する花蜜中の代謝物質を産生するために本発明を用いることができる。
花蜜組成または蜜腺の吸込み穴強度を修飾するタンパク質をコードするDNA配列
を用いることもできる。これは、組換えタンパク質が蜜腺中の代謝経路を妨げ、
花蜜中に既存の化合物または花蜜中の新規の化合物の生成のレベル変化を引き起
こすことを意味する。

【００４７】さらに、本発明は、シグナル配列を除いた前記のDNA配列を含有する発現カセ
ットにも関する。組換えタンパク質は、その場合、蜜腺中で発現されるだけであ
るが、しかし花蜜に対して標的にされない。したがって、蜜腺中の組換えタンパ
ク質の発現は、さらに花蜜組成に影響を及ぼし得る。さらに別の局面では、本発明は、蜜腺以外の他の組織中で発現されるタンパク
質をコードするDNA配列を含有する発現カセットにも関する。組換えタンパク質
の発現は、花蜜の生化学的組成における、または花蜜分泌における変化に影響を
及ぼす。

【００４８】最後に、本発明は、この花蜜を収集するミツバチにより産生される蜂蜜から収
穫され、精製され得る花蜜中の代謝物質を産生する非トランスジェニック植物に
も関する。これらの代謝物質に関する例は、アルカロイド、テルピン、アミノ酸
、タンパク質、色素および揮発性物質である。

【００４９】前記の方法の好ましい実施態様は、発現カセットが花蜜を産生する植物種に形
質転換されることを提供する。好ましくは、組換えタンパク質は、花蜜を収集す
るミツバチが訪れる植物の花蜜中に産生される。ミツバチは、花ならびに花外蜜
を収集する。本発明は、花または花外蜜中に組換えタンパク質を産生する植物に
関する。さらに、本発明は、他の植物器官中に組換えタンパク質を産生する植物
であって、前記の植物器官が、昆虫、好ましくはミツバチにより収集され、蜂蜜
に加工処理される浸出物を産生する植物にも関する。

【００５０】本発明の特に好ましい実施態様は、制御条件下で栽培され得る植物である。制
御条件は、必要とされる安全性規準にしたがってトランスジェニック植物が栽培
され得る温室または野外施設である。好ましくは、制御条件は、正常略奪行動を
実施するミツバチコロニーが開花期間中に同一区画中に保持され得るような条件
である。好ましい植物は、アブラナ科の、特にBrassica napusから生じる。

【００５１】実施例実施例１．NEC1のクローニング mRNA分別表示系（Genhunter Corporation, Brookline USA）を用いて、NEC1
cDNAを単離した。ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）の開花した花から
のならびに若い葉からの蜜腺、萼片、花弁、雄蕊および雌蕊からの全RNAの単離
を、Verwoerd等（1989）にしたがって実行した。個々のRNA単離は、蜜腺ならび
に雌蕊に関して実施した。

【００５２】 RNA MessageClean^TMキット（Genhunter Corporation Brookline USA、カタロ
グ番号M601）を用いて、各RNA標本に関して、DNアーゼ処理を実行した。Genhunt
erキットからのオリゴ−コDTプライマーT12MGを用いて、各標本の0.1μg RNAに
関して、逆転写反応を実行した。プロトコールにしたがって、任意プライマーAP
11〜AP15をキットからのプライマーT12MGと組合せて用いて、PCR反応を実行した
。

【００５３】 PCR生成物をシーケンシングゲル上に載せて、電気泳動処理後、ゲルを3M紙上
にブロットし、乾燥して、Ｘ線フィルムに露出した（図１）。２つの隣接蜜腺特
異的バンドをブロットから切り取り、マニュアルにしたがってDNAを精製した。
オリゴ−dTプライマーT12MGおよび任意プライマーAP15を用いて、断片の再増幅
を実行した。電気泳動処理後、液体窒素中で単離断片を凍結し、その後遠心分離
することにより、アガロースゲルからPCR生成物を抽出した。

【００５４】 1/10容量の１％HAc、0.1 M MgClおよび2.5容量の96％エタノールを上清に付加
することにより、DNAを沈澱させた。ペレットを10μlのTE緩衝液中に溶解した。
ここではDD18aと呼ばれる断片をPMOSBlueＴベクター（RPN1719, Amersham Littl
e Chalfont UK）中でクローン化して、ベクターpDD18aを得た。

【００５５】ジデオキシヌクレオチド鎖終止法（ABI PRISM Ready Reaction DyeDeoxy^TMタ
ーミネーターサイクルシーケンシングキット、P/N 402078, Perkin Elmer）によ
りこの３’cDNAクローンのヌクレオチド配列を確定した。それを図２に示す。DN
A断片は、460ヌクレオチド長を有する。Clontech（カタログ番号K1802-1）のMar
athon TM cDNA増幅キットを用いて、マニュアルに記載されたような手法にした
がって、cDNAの欠けた５’部分を単離した。

【００５６】要するに、ポリA+RNAをペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）の花の蜜腺
から単離した。二本鎖cDNA合成後、アダプターを結紮し、キット中に供給された
アダプタープライマーAP1，および遺伝子特異的プライマーprat 122を用いて、5
'RACE反応を実行した。prat 122のヌクレオチド配列は、5’-gtgggaaggctatgcta
caagc-3’（図２）である。PCR生成物を10倍に稀釈し、１μlを、キットにより
供給された入れ子式アダプタープライマー（AP2）および入れ子式遺伝子特異的
プライマーprat 119（図２）との二次5’RACE反応に用いた。

【００５７】 prat 119のヌクレオチド配列は、5’-ccttctccatggactgcaatgcg-3’である。
ゲル電気泳動後、クローンDD18aとハイブリダイズした±850の断片を得た。ここ
ではRC8と呼ばれる断片をゲルから抽出し、精製して、前記のようにPMOSBlueＴ
ベクター中にクローン化した。その配列を図３に示す。以後、NEC1と呼ばれる遺
伝子の全長cDNAを包含する、クローンDD18aとRC8の併合（重複）配列を、図４に
示す。NEC1クローンは、1205ヌクレオチド長を有し、265アミノ酸残基のポリペ
プチドをコードする。

【００５８】推定アミノ酸配列に基づいて、豆類のMedicage trunculataにおけるリゾビウ
ム属Rhizobium誘導性結節発育に関連するcDNA（MtN3、遺伝子バンク番号：gn1/P
ID/e274341）との高相同性が見出された。同一性および類似性のパーセンテージ
は、それぞれ47％および72％である。CAOS/CAMMプログラム（Protein analysis
1991, Genetics Computer Group Inc., Wisconsin USA）を用いた予測タンパク
質の分析は、推定タンパク質構造は膜タンパク質に類似し、細胞膜を横断する６
つの等間隔疎水性ループを有する、ということを示す。

【００５９】さらに、シグナル配列はＮ末端で予測されるが、一方Ｃ末端は高親水性である
。MtN3との最高相同性は、Ｎ末端シグナル配列、最初の２つの膜−スパニングル
ープおよび最後の２つの膜−スパニングループに見出される。Ｃ末端親水性部分
は、最低相同性（同一性28％、類似性30％）を示す。NEC1の機能は未だ確定され
ていない。

【００６０】実施例２．FBP15のクローニングペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）の花の蜜腺から作製したcDNAライ
ブラリーから、ペチュニアMADSボックスcDNAクローンを単離した。λZAPクロー
ニングベクター（Stratagene, La Jolla USA、カタログ番号200400〜200402）を
用いて、cDNAライブラリーを構築した。花結合タンパク質遺伝子FBP2、FBP6およ
びpMADS3のMADSボックス領域を包含する混合プローブを用いた低緊縮ハイブリダ
イゼーション条件下で、ライブラリーをスクリーニングした（Angenent et al.,
1993, 1994, Tauchimoto 1993）。

【００６１】標準技法を用いて、ハイブリダイジングファージプラークを精製した。in viv
o切出し法を用いて、heポリリンカーのEcoRIとXhoI切断部位との間にcDNA挿入を
有する二本鎖Bluescript SKプラスミドを含有する大腸菌クローンを生成した。
精製クローンの交差ハイブリダイゼーションは、予め単離されたFBP cDNAと交
差ハイブリダイズせず、FEP15、FBP16およびFBP17と呼ばれる３つの別々のクロ
ーンを明示した。ジデオキシヌクレオチド媒介性鎖終止法によりFEP15のヌクレ
オチド配列を確定した。

【００６２】これは、配列番号:5に示されている。FEP15 cDNAクローンは1157ヌクレオチ
ド長を有し、222アミノ酸残基のペプチドをコードする。MADSボックスタンパク
質の全特徴は、FBP15中に存在する。Ｎ末端存在MADSボックス領域は、他のMADS
ボックスタンパク質と高度の類似性を示し、タンパク質の中間のＫボックスはα
らせん構造を有する。FIP15はタバコMADSボックスタンパク質NAG1と最も類似す
るが、これはAgamous相同であり、whorl３および４で発現される（Huang et al.
, 1996, Mizukami et al., 1996）。

【００６３】実施例３．FBP15の発現 FBP15の発現を、標準的なノーザンブロットハイブリダイゼーション実験によ
り決定した。FBP15の完全なcDNAからなるDNAフラグメントをプローブとして用い
た。高度に厳格なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いた。さまざまな
ペチュニア組織由来の全RNA 10μｇを用いると、FBP15の発現は蜜腺でのみ検出
可能であった。Quickprep Micro mRNA Purification Kit（Pharmacia Biotech）
のキットおよびプロトコールを用いて調製された、さまざまな組織由来のmRNA
10μｇを用いると、FBP15の発現は、図5Bで示すとおり蜜腺でのみ検出可能であ
った。

【００６４】子房および蜜腺での発現を、FBP15の全長cDNAに対応するDIGラベルアンチセン
スRNAプローブを用いてin situハイブリッド形成法により決定した。in vitroア
ンチセンスRNAの写しを、T7 RNAポリメラーゼを用いて作った。Canas et al.,1
994により記載されたin situハイブリッド形成法の標準的なプロトコールを用い
た。ハイブリッドシグナルは、蜜腺組織の全細胞中で一様に強く観察された。

【００６５】実施例４．NEC1の発現 NEC1のRNAの発現を、標準的なノーザンブロットハイブリダイゼーション実験
により決定した。ディファレンシャルディスプレークローンDD18（図２）の完全
な配列からなるDNAフラグメントをプローブとして用いた。さまざまなペチュニ
ア組織由来の全RNA 10μｇを用いると、蜜腺においてNEC1の強い発現が、葯に
おいて弱い発現が検出された。他の花の器官、葉または根においては、発現は検
出されなかった（図５Ａ）。

【００６６】子房および蜜腺における発現を、コード領域および３’の翻訳されない領域の
１部からなる、NEC1 cDNAのヌクレオチド79から1036に対応するDIGラベルアン
チセンスRNAプローブを用いてin situハイブリッド形成法により決定した。この
配列を含むクローンは、５’末端においてBamHIおよびNcoIであった。958ヌクレ
オチドのPCRフラグメントを得て、PMOSBlueベクター内にクローニングした。フ
ラグメントを、T7プロモーターを含むベクター内にサブクローニングし、T7 RN
Aポリメラーゼを用いてin vitroアンチセンスRNAの写しを作った。Canas et al.
,1994により記載されたin situハイブリッド形成法の標準的なプロトコールを用
いた。強いハイブリッドシグナルが、蜜腺の外側の細胞層で観察された（図6A）
。

【００６７】実施例５．NEC1プロモーターフラグメントの単離 NEC1のプロモーターフラグメントを、Clontech Laboratoriesにより提供され
るgenome walkerプロトコール（PT3042-1）およびキットを用いてクローニング
した。簡単に言うと、ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）由来のゲノムD
NAを、５種の異なるブラントカッティング制限酵素により消化した。GenomeWalk
erアダプターを連結し、遺伝子特異的逆転プライマープラット１４８およびキッ
トのアダプタープライマー（AP1）を用いて各GenomeWalker「ライブラリー」上
でPCR反応を行った。

【００６８】プラット148のヌクレオチド配列は、NEC1 cDNAの105から128のヌクレオチド
からなる5’-ccaagaaggccaaatatgaaagac-3’である（図４）。PCR産物を、プラ
イマーシフトアダプタープライマーAP2およびプライマーシフト遺伝子特異的逆
転プライマープラット149を用いて、第２回目のPCRにかけた。プラット149のヌ
クレオチド配列は、NEC1 cDNAの81から104のヌクレオチドからなる5’-aagtcat
cagcacgtaattgcgcc-3’である。

【００６９】第２回目のPCRから、２kbのフラグメントがStuIライブラリーから単離され、P
MOSBlue T-ベクター内にクローニングし、コンストラクトpMA5-10が生成した。
図７（配列番号:7）は、NEC1 cDNAの翻訳開始を含むコンストラクトpMA5-10中
のNEC1プロモーターのDNA配列を示している。

【００７０】実施例６．NEC1プロモーター−GUSの構築 pMOSBlueの前進ベクタープライマーU19および遺伝子特異的プライマープラッ
ト169を用いて、PCR反応をpMA5-10（実施例５）上で行った。プラット169のヌク
レオチド配列は、5’-cgctgcagcgccatggttttttttagtgaagcccc-3’である。遺伝
子特異的領域に下線を引いた。プライマーは３’末端にNcoIおよびBglII制限部
位を含んでいる。

【００７１】 PCR産物をKpnIおよびNcoIで消化し、NTM19プロモーター（Custers et al.,199
7）、レポーター遺伝子GUSおよびnosターミネーターを含むpBluescript−由来ベ
クター（pMO4）中に連結した。KpnI/NcoI NTM19プロモーターフラグメントを置
換し、NEC1−プロモーター／GUS翻訳融合を得た。得られたプラスミドpNEP1をSm
aIで消化し、NEC1プロモーター／GUS／nosフラグメントを放出し、このフラグメ
ントをバイナリープラスミドpBIN（Bevan,1984）の誘導体に連結すると、バイナ
リープラスミドpBNEP1（図８）が生成した。

【００７２】 pBNEP1をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）菌株LBA4404またはC58pMP90に電気穿孔法により導入した。アグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）形質転換体由来のプラスミドDNAを単離し、バイナリーベク
ターの構造を、制限分析およびPCRにより確認した。

【００７３】実施例７．トランスジェニックペチュニア植物の生成アグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株LBA4404形質転換体を使用し、Hors
ch et al.(1985）により記載された葉盤を用いてペチュニア・ヒブリダ（Petuni
a hybrida）を形質転換した。カナマイシン選択媒体上での発芽および根の誘導
の後、植物を温室内の土に移した。

【００７４】実施例８．組織化学的GUSアッセイ pBNEP1コンストラクトで形質転換されたカナマイシン耐性植物の異なる植物部
分を、（Jefferson et al.,1987）により記載された方法を用いてβ−グルクロ
ニダーゼ（GUS）活性の分布について分析した。発現レベルの高いトランスジェ
ニック植物では、反応生成物の他の組織への拡散が観察された。この拡散を避け
るため、変更したGUSアッセイを利用した。

【００７５】簡単に言うと、-20℃において90％冷アセトンで１時間組織を前処理し、次い
で１mMフェリシアン化カリウムを含む100mMリン酸緩衝液で三回すすいだ。この
処理の後、反応混合物からフェリシアン化物を除いた変更点を除き、標準的なGU
Sアッセイを実施した。

【００７６】実施例９．組織化学的GUSアッセイの結果非常に若い花（1.4cm未満）では、青色染色は見られず、２〜４cmの花では蜜
腺の弱い青色染色が見られた。４〜６cmの花では、蜜腺（図6B）および葯の花糸
の上部の非常に限られた部分（図6C）に強い青色染色が見られた。GUS発現は蜜
腺柔組織の外側の細胞層で最も高かった。葯の花糸の断面では、内部維管束の木
部を除き、全ての細胞でGUS発現が観察された。

【００７７】実施例１０．ヒースの蜂蜜および花蜜のタンパク質分析純粋なヒース蜂蜜の試料を、ナタネ、クローバー、ピクナンサアカシアの樹皮
およびラベンダー蜂蜜の試料とともに、希釈、透析し、12％SDS page ゲル（La
emmli,1970）上に載せた。蜂蜜試料は全て、同一な高分子量タンパク質のバンド
を数本示した。ヒース蜂蜜には、29および50kDaの２本の独特なタンパク質のバ
ンドがあった（図９）。このタンパク質を、CVH29およびCVH50と名付けた（CVH
はCalluna vulgaris honeyを示す）。

【００７８】タンパク質の出所を決定するため、ナタネおよびヒースの花蜜および蜂蜜試料
を調製し12％SDS page ゲル上に載せた。全蜂蜜試料に存在する70kDa付近の高
分子量タンパク質のバンドが、ナタネまたはヒース花蜜には見られなかった（図
10）。これらのタンパク質は、蜂蜜の処理の間にミツバチにより加えられる。タ
ンパク質CVH29およびCVH50は、ヒースの蜂蜜およびヒースの花蜜には存在するが
、ナタネの花蜜には存在しない。したがって、CVH29およびCVH50はヒースの花蜜
に分泌され、この花蜜由来の蜂蜜から回収できると結論づけられた。発明者らが
試験したヒース蜂蜜中のタンパク質濃度は、約0.5％であった。

【００７９】実施例11 ．CVH29およびCVH50のＮ−末端配列分析蜂蜜試料を、SDS PAGEゲル上に載せ、電気泳動の後ゲルをPVDFメンブレン上に
吸い取った。染色の後、CVH29およびCVH50バンドを染色部分から切り出し、両タ
ンパク質のＮ−末端シーケンシングを実施した。CVH50のＮ−末端配列は、SVLDF
CVADPSLPDGPAGYSCTEPSTVTSQDFである。CVH29のＮ−末端配列は、SVLDFCVADPSLPD
GPAGYSCKEPAKVTVDDFVFHGLGTAである。遺伝子銀行ホモロジーサーチ（BLAST）に
より、シロイヌナズナから単離された胚様タンパク質との高いアミノ酸配列ホモ
ロジー（63％）が示された（図12）。

【００８０】実施例12 ．CVH29のシグナル配列の同定胚様タンパク質CVH29はヒース花蜜に排出されるので、cDNAの１部がシグナル
配列をコードしていることが予測される。Ｎ−末端アミノ酸配列に基づき、変性
プライマーを設計した。前進プライマープラット176の配列は、5’-gayttytgygt
ngcngaycc-3’（ｙはｃまたはｔ、ｎはｃ，ｔ，ａまたはｇ）である。逆転プラ
イマープロット177の配列は、ccrtgraanacraartcrtc（ｒはｇまたはａ）である
。

【００８１】ヒースのゲノムDNAに実施されたPCR反応は、99bp DNAフラグメントを生成し
た。このフラグメントの配列を決定し２種の逆転した遺伝子特異的５’プライマ
ーを設計して、Clontech Laboratoriesのキットおよびプロトコール（プロトコ
ール PT1115-1,Clontech Palo Alto USA）を用いて「Marathon cDNA racing」
により、５’cDNAをクローニングした。使用された遺伝子特異的プライマープラ
ット207の配列は、5’-ggtgactttagagggctccttgc-3’である。

【００８２】遺伝子特異的プライマーシフトプライマープラット206の配列は、5’-gctcctt
gcaggagtagcctgc-3’である（図13）。ヒースの開いた花からRNAを単離し、Phar
macia quickprep micro mRNAキットを用いてmRNAを調製した。cDNA合成およびア
ダプター連結の後、アダプタープライマーAP1および遺伝子特異的プライマープ
ラット207を用いてPCR反応を実施した。アダプタープライマーAP2および遺伝子
特異的プライマーシフトプライマープラット206を用い、PCR産物を第２のPCRに
用いた。

【００８３】約300ヌクレオチドの単一のフラグメントを得て、PMOSBlue Ｔ−ベクター中
にクローニングした。４つのクローンの配列を決定した。図14は、３つのクロー
ンは同一であり、1つのクローンは翻訳されていない５’領域に２つの異なるヌ
クレオチドを有することを示している。17のアミノ酸の推定シグナル配列が、AT
G開始コドンと４つのクローン全てで同一な成熟タンパク質CVH29の第１のコドン
の間で同定された。推定シグナル配列のヌクレオチドの配列（配列番号:6）は、
5’-atgtttcttccaattctcttcaccatttccctcctcttctcctcctcccatgct-3’である。

【００８４】実施例13 ．花蜜中のタンパク質排出のための発現カセットの構築 NEC1プロモーターをPMOSBlueベクター中にクローニングするため、前進プライ
マープラット247および逆転プライマープラット248（図７）を用いてpMA5-10（
実施例５）上でPCR反応を行った。プラット247は、余分なPst1制限部位を含んで
いる。プラット248のNdeI制限部位は、NEC1のATG翻訳開始と一致している。プラ
ット247のヌクレオチド配列は、5’-ggctgcaggagtgttctttgatagaatg-3’である
。プラット248のヌクレオチド配列は、5’-cgccatatgttttttttatggaagcccc-3’
である。遺伝子特異的領域に下線を引いてある。1.8kbのプロモーターフラグメ
ントを得て、pMOSBlueベクター中にクローニングすると、プラスミドpNECPが生
成した。

【００８５】配列番号:6に示されたシグナル配列CVSPをコードするDNA分子を、２つのオリ
ゴ分子プラット245およびプラット246の合成およびその後のアニーリングにより
製造した。欧ラット245の配列は、5’tatgttccttccaattcttttcactatttctcttcttt tctcttcttctcatgct tctgttcttgatttc’3である。プラット246の配列は、5’gatcc
gaaatcaagaacagaagcatgagaagaagagaaaagaagagaaatagtgaaaagaattggaaggaaca’3
である。シグナル配列CVSPをコードする領域に下線を引いてある。

【００８６】シグナルペプチドの正しい分裂を確実にするため、成熟胚様タンパク質の最初
の５つのアミノ酸のコード領域でリンカーを延長した（図13）。シグナルペプチ
ド配列のコドンの使用を、シロイヌナズナに対して最適化した。３’末端にBamH
I制限部位を加えることにより、２つの余分なアミノ酸をフレーム中で成熟タン
パク質に結合した。得られたDNA分子を図15に示す。フラグメントをNde1／BamH1
カットPMOSBlueベクター中に連結すると、プラスミドpCVSPが生成した。

【００８７】 pNECPをNdeIおよびPatIで消化し、NEC1プロモーターフラグメントを放出し、
それをPst1／Nde1カットpCVSP中にクローニングすると、プラスミドpCV1が生成
した。pCV1の模式図を図16に示す。

【００８８】 NOSターミネーター配列（NOST）を含む250bpの長さのフラグメントを、pUC19
由来のプラスミドであるpRAP33のDNA上で前進プライマープラット251および逆転
プライマープラット252を用いて、PCRにより得た。プラット251はSacIおよびXho
I部位を、プラット252はSmaIおよびEcoRI部位を加えている。プラット251の配列
は、5’-gggagctcgagtcgttcaaacatttggcaataaag-3’である。

【００８９】プラット252の配列は、5’-cgaattcccgggatctagtaacatagatgacac-3’である。
NOST特異的領域に下線を引いてある。PCR産物を、pCR-Script^TM Amp SK(+)Cloni
ng Kit（カタログ21188-21190,Stratagene LA Jolla USA）中にクローニングし
、pCR-NOSTプラスミドが生成した。pCR-NOSTをSac1およびEcoR1で消化し、得ら
れたフラグメントをpUC19（ClonTech）、誘導されたプラスミドpUCAP中にクロー
ニングし、プラスミドpCVNOSが生成した。

【００９０】 pUC119中にレポーター遺伝子GUSを含み、1.814kb GUS コード配列中のＮ−
結合グリコシル化部位を破壊するよう修飾されたプラスミドpGUSN358をClontech
（カタログ6030-1）から購入した。遺伝子特異的プライマープラット249および
プラット250を用いてPCR反応を行い、GUS遺伝子コード領域および５’末端にBam
HI制限部位および３’末端にSacI制限部位を含むフラグメントが生成した。プラット249の配列は、5’-ccggatccatgttacgtcctgtagaaacc-3’である。プラ
ット250の配列は、5’-gggagctcccaccgaggctgtag-3’である。GUS特異的な領域
に下線を引いてある。その後、PCRフラグメントをBamHIおよびSacIで消化し、Ba
mHI／SacIカットプラスミドpCVNOS中で連結し、プラスミドpCV2が生成した。pCV
2の模式図を図17に示す。

【００９１】 pCV1を、PstIおよびBamHIで消化し、得られたフラグメントをPstI／BamHIカッ
トプラスミドpCV2中にクローニングし、プラスミドpCV3が生成する。pCV3の模式
図を図18に示す。pCV3をAscIおよびSmaIで消化し、得られたフラグメントをバイ
ナリープラスミドpBINの誘導体中にクローニングして、バイナリープラスミドpB
CV3が生成する。pBCV3を、電気穿孔法により大腸菌（Escherichia coli）からア
グロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA44
04およびC58pMP90に移した。形質転換されたアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）の菌株を用いて、シロイヌナズナおよびペチュニアを形質転換した。

【００９２】実施例14 ．花蜜中のタンパク質産生 GUSリポーター遺伝子を用いて、トランスジェニック植物の花蜜中のGUS活性を
、Jefferson et al.,(1987）により記載された方法に従い測定した。簡単に言う
と、GUSにより産生されたメチルウンベリフェロン（MU）の量を455nmの発光によ
り蛍光測定法で測定することによりアッセイを実施した。１nM MUの内部標準を
用いて、絶対的な発光を人工的な消光に関して補正した（Angenent et al.,1993
）。

【００９３】実施例15 ．ミツバチの給餌実験 1996年の９月、屋外におかれたミツバチの巣箱に、２％BSA（ウシ血清アルブ
ミン）を補った25％スクロース溶液を供給した。３週間後、ミツバチは15リット
ルの給餌溶液を消費し、巣箱から蜂蜜を回収した。花が咲く季節はほとんど過ぎ
ていたが、ミツバチは花を探して戸外の花蜜を集めた。したがってこの期間に作
られた蜂蜜は、給餌溶液および花の花蜜の混合物から由来している。

【００９４】 SDS page プロテインゲルに透析済み蜂蜜試料および糖／BSA溶液を載せた。
図11は、BSAのタンパク質バンドが試験した全試料に存在し、糖／BSA溶液に比べ
て蜂蜜試料中で量的な変化が見られなかったことを示している。蜂蜜中のBSA濃
度は給餌試料中より1.5倍高く、タンパク質が蜂蜜中に濃縮されることを表して
いる。糖／BSA溶液をとったミツバチは異常な挙動を全く示さず、コロニーは普
通に成長した。

【００９５】実施例16 ．トランスジェニック植物から蜂蜜を生産する方法花蜜の中に組み換えタンパク質を生産するトランスジェニック植物を250本、2
5平方メートルの温室で栽培した。設備は、欧州の法律に規定された安全基準に
合致するようにした。設備には、昆虫が内部に入ってきたり外部に出ていったり
しないような安全対策を施すことが含まれる。

【００９６】植物が開花している間に、約200匹の働きバチと１匹の女王バチという少数の
ミツバチ用に設計した巣箱を、その温室の中に設置した。女王バチが存在してい
れば、その女王バチは卵を産み始め、幼虫が生まれてくることになる。同時に生
まれた仲間がいることで、ミツバチが花蜜を集めて処理し、それを蜂蜜に変える
行動が促進される。２〜３週間経つと、ミツバチは花蜜を処理して蜂蜜に変え、
巣のシールされた巣室に貯蔵した。上記の条件だと、250〜1000グラムの蜂蜜を
得ることが可能である。

【００９７】実施例17 ．蜜腺の除去組織特異的プロモーターを制御しながら非常に敏感なリボヌクレアーゼである
BARNASEを植物細胞の中に導入することにより、ごく特定の組織または器官の中
の細胞を除去することができる。蜜腺を除去することで、蜜腺から分泌される花
蜜を奪う害虫にとって植物があまり魅力的でないようにすることができる。それ
に加え、細菌やカビの感染に対してより抵抗力のある、蜜腺のない植物を得るこ
ともできる。NEC1プロモーターを用いて蜜腺で細菌のBARNASEを発現させること
によって花蜜組織を除去した例を示す。

【００９８】 pNEP1のプラスミドDNA（実施例６）をKpnIとNcoIを用いて消化し、1800ｂｐの
NEC1プロモーター断片を遊離させた。精製したこのプロモーター断片を、BARNAS
E-BARSTARという細菌オペロン構造物の上流にあるpWP90由来のベクターに組み込
んだ（ハートリー、1988年）。この構造物は、BARNASE-BARSTARオペロンの下流
に、ポリＡ信号カリフラワー・モザイク・ウイルスのターミネーター配列の35SC
aMVターミネーターを含んでいる。

【００９９】得られたプラスミドpWP126をKpnI／XhoIを用いて消化し、NEC1-プロモーター
／BARNASE-BARSTAR／CamVポリＡの断片を遊離させ、この断片をpBIN由来のベク
ターであるpBINプラスに組み込んだ。この組み換えベクターを、アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（LBA4404）を介してペ
チュニアの一品種W115に移した。そうやって得られたものの中から、蜜腺のない
花、または蜜腺が未発達な花を有するトランスジェニック・ペチュニアを選択し
た。

【０１００】多くのプロモーターは、プロモーター／GUSの発現に基づく結論から予想され
るほど特異的ではないことが結論される。細菌のBARNASEはごく低濃度でも大き
な細胞毒性があるため、弱い構成的プロモーター（例えばNOSプロモーター）の
制御、または細胞を除去することになる組織で活性を持たない組織特異的プロモ
ーターの制御を行ないつつ、リボヌクレアーゼ抑制遺伝子を発現させることによ
って、他の植物組織を保護することが好ましい（マリアニ他、1992年、ビールズ
他、1997年）。

【０１０１】実施例18 ．異所性の蜜腺発達 MADSボックス遺伝子は、花の分裂組織と花器官が将来何になるかの調節を行な
っている。MADSボックス遺伝子の異所性発現により、花器官または細胞が成長し
ていく運命を変えてしまう可能性がある。胚珠特異的MADSボックス遺伝子である
FBP11が異所発現したトランスジェニック・ペチュニアでは、花萼と花弁におい
て胚珠のような構造が発達する（コロンボ他、1995年）。

【０１０２】 FBP15は蜜腺特異的MADSボックス遺伝子であり、蜜腺の発達の分子レベルにお
ける制御に関与する。ペチュニアでは、蜜腺が心皮の基部で発達する。ペチュニ
アにおいてFBP15が異所発現すると、花の別の器官において、またはこの植物の
成長力のある部分において、蜜腺が発達する可能性がある。植物に移すとFBP15
が異所発現する遺伝子構造物の例を示す。

【０１０３】 ATG翻訳開始部位のわずかに上流にあるFBP15配列とハイブリッドを形成する５
’プライマーと、翻訳停止部位のわずかに下流にあるFBP15配列とハイブリッド
を形成する３’プライマーとを用いて、FBP15を増幅した。５’プライマーはNco
I認識部位を含んでおり、３’プライマーはBamHI認識部位を含んでいる。増幅し
たFBP15断片は、配列を確認した後、BamHI／NcoI断片として、バイナリーベクタ
ーpCPO31に組み込んだ。このバイナリーベクターは、フロラック他（1994年）が
記述しているようにpPCV708に由来するものであり、左右のT-DNAの境界に挟まれ
た位置に、複数のクローニング部位を有する発現カセットを３つ含んでいる。

【０１０４】 cDNAを、修飾された35S CamVプロモーターとノパリン・シンターゼ・ターミネ
ーター配列との間でセンス方向にクローニングした。このキメラ遺伝子構造物を
、実施例７に記載した転移方法を用い、アグロバクテリウムGV3101を介してペチ
ュニアの一品種W115に移した。そうやって得られたものの中から、蜜腺が異所発
現しているトランスジェニック・ペチュニアを選択した。

【０１０５】実施例19 ．糖分組成と花蜜分泌の調節ペチュニアW115のさまざまなから花から取れる花蜜の糖分含有量には幾分かの
変動があるとはいえ、ヘキソースとスクロースの比は非常に安定している。した
がって、花蜜に含まれるヘキソースとスクロースの比の決定に関わる遺伝子を上
方に調節するか下方に調節するかによって、花蜜の組成が変化することになる。
ペチュニアに由来するインベルターゼ遺伝子をアンチセンス発現させた例を示す
。

【０１０６】ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum）からクローニングしたインベル
ターゼ遺伝子のcDNAとハイブリッドを形成するPCRプライマーを明確にした。５
’プライマーである5’-AAGGACTTTAGAGAGACCCGACCACTGCTGG-3’と、３’プライ
マーである5’-AAATGTCTTTGATGCATAATATTTCCCATAATC-3’とを用いてペチュニア
のゲノムDNAにPCR反応をさせ、約420bpの断片を得た。この断片の配列を決定し
、クローニングしてpMOSBlueベクターに組み込んだ。このベクターは、ペチュニ
アの蜜腺特異的cDNAライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いる。

【０１０７】実施例２に記載したように、ハイブリッドを形成するファージのプラークを精
製し、インビボでの切り出しによってcDNAを修復した。cDNAの発現は、実施例３
に記載したように、ノーザン・ブロット法で確認した。また蜜腺特異的インベル
ターゼの配列は、実施例２に記載したようにして決定した。インベルターゼ遺伝
子は、ATG翻訳開始部位のわずかに上流にある配列とハイブリッドを形成する５
’プライマーと、翻訳停止部位のわずかに下流にある配列とハイブリッドを形成
する３’プライマーとを用いて増幅した。

【０１０８】実施例18に記載したように、余分な制限酵素認識部位を発生させることで、セ
ンス方向（過剰発現）またはアンチセンス方向にcDNAのクローニングがなされ、
バイナリーベクターpCPO31に組み込まれるようにした。このキメラ遺伝子構造物
を、実施例７に記載した転移方法を用い、アグロバクテリウムGV3101を介してペ
チュニアの一品種W115に移した。そうやって得られたものの中から、花蜜に含ま
れる糖分の組成が変化しているトランスジェニック・ペチュニアを選択した。

【０１０９】実施例20 ．植物の成長の調節 DNAの断片であるNEC1遺伝子またはそれと相同な遺伝子を植物細胞に導入した
。このDNAは、導入されたDNAの発現を制御するプロモーターによって刺激され、
転写によりセンスRNAを生成させる。植物は、実施例７に記載したように、トラ
ンスジェニック細胞から新たに栽培した。NEC1遺伝子が異所発現している植物は
、葉の形と糖分の組成が変化していた。それに加え、NEC1遺伝子が異所発現して
いる植物は、開花の時期が遅くなった。

【０１１０】参考文献：アンゲネント G.C.，フランケンＪ．，ブッシャーＭ．，コロンボＬ．
，ヴァン・トゥーネン A.J.（1993年）、「ペチュニアにおける花弁と雄しべの
形成はホメオティック遺伝子fbp1によって調節されている」、Plant J. 、第４
巻、101〜112ページ。アンゲネント G.C.，フランケンＪ．，ブッシャーＭ．，ヴァイスＤ．
，ヴァン・トゥーネン A.J.（1994年）、「ペチュニアのホメオティック遺伝子
fbp2の共抑制が、生殖能力のある分裂組織が将来何になるかに影響を与えている
」、Plant J. 、第５巻、33〜44ページ。

【０１１１】ベイカー H.G.，ベイカーＩ．（1982年）、「花粉媒介者のタイプと関係す
る花蜜の成分」、『実験的受粉生物学ハンドブック』（CE ジョーンズとRJ リ
トル編）、117〜141ページ、サイエンティフィック・アンド・アカデミック・エ
ディション、ヴァン・ノストランド・ラインホルト、ニューヨークより。ビールズ T.P.とゴールドバーグ R.B.（1997年）、「新しい細胞除去戦略が
タバコの葯の開裂を妨げる」、The Plant Cell、第９巻、1527〜1545ページ。

【０１１２】ビーヴァンＭ．（1984年）、「植物を変換するためのバイナリー・アグロバ
クテリウム・ベクター」、Nucl. Acids Res.、第12巻、8711〜8721ページ。バトラー C.G.（1962年）、「ミツバチの世界」、ロンドン、コリンズ。カニャス L.A.，ブッシャーＭ．，アンゲネント G.C.，ベルトラン J-P
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ンパク質FBP1の核局在」、Plant J. 、第６巻、597〜604ページ。

【０１１３】コロンボＬ．，フランケンＪ．，コエチェＥ．，ヴァン・ヴェントＪ
．，ドンス H.J.M.，アンゲネント G.C.，ヴァン・トゥーネン A.J.（1995年
）、「ペチュニアのMADSボックス遺伝子FBP11が、胚珠が将来何になるかを決定
している」、The Plant Cell、第７巻、1859〜1868ページ。クライルスハイムＫ．，フラッスニッヒＮ．，ローレンツＷ．，ラス
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ェラ・カルニカ・ポルム）」、Apidologie、第24（５）巻、510〜511ページ。

【０１１４】カスターズ J.B.M.，オルデンホフ、シュラウヴェン J.A.M.，コルデヴェー
ナー J.H.G.，ヴュレムス G.J.，ルッカーレン・カンパーニュ M.M.（1997年
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、Plant Molecular biology、第35巻、689〜699ページ。デイヴィス A.R.，ピーターソン R.L.，シュール R.W.（1986年）、「ブラ
シカ・ナプス（Brassica napus）（アブラナ科アブラナ属）の花と蜜腺の解剖学
と維管束系」、Can. J. Bot.、第64巻、2508〜2516ページ。

【０１１５】デュマＢ．，フレイシネＧ．，パレットＥ．（1995年）、「オオムギの
苗が成長している間およびオオムギの苗にカビに感染している間におけるゲルミ
ン様シュウ酸エステル・オキシダーゼの組織特異的発現」、Plant Physiol.、第
107巻、1091〜1096ページ。ファーンＡ．（1979年）、「花蜜の分泌と関係する蜜腺の超微細構造」、Am
er. J. Bot.、第66（８）巻、977〜985ページ。フロラック D.E.A.，ダークス W.G.，ヴィッサー B.,F.ハイデカンプ、ス
ティーケマ W.J.（1994年）、「生物学的に活性なホルドチオニンのタバコにお
ける発現：ホルドチオニン前躯体のアミノ末端とカルボキシル末端におけるプレ
配列とプロ配列が成熟タンパク質の発現とソーティングに及ぼす効果」、Plant
Mol. Biol.、第24巻、83〜96ページ。

【０１１６】ハートリー R.W.（1988年）、「BARNASEとBARSTAR：これらのインヒビターを
クローニングしたものを発現させることによって、クローニングされたリボヌク
レアーゼの発現が可能になる」、J. Mol. Biol.、第202巻、913〜915ページ。ホルシュ R.B.，フリー J.E.，ホフマン N.L.，アイヒホルツＤ．，ロジ
ャース S.G.，フラリー R.T.（1985年）、「遺伝子を植物に移す簡単かつ一般
的な方法」、Science、第227巻、1229〜1231ページ。

【０１１７】フアンＨ．，チューダーＭ．，スーＴ．，フーＹ．，マーＨ．（19
96年）、「２つのアラビドプシスMADS領域タンパク質のDNA結合特性：結合の調
和とダイマー形成」、The Plant Cell、第８巻、81〜94ページ。ジェファーソン R.A.，カヴァナフ T.A.，ベヴァンＭ．（1987年）、「GU
S融合：高等植物における敏感かつ多機能な遺伝子融合マーカーとしてのＪ-グル
クロニダーゼ」、EMBO J.、第６巻、3901〜3907ページ。ラムリＵ．Ｋ．（1970年）、「ヘッド・バクテリオファージＴ４が集合して
いる間の構造タンパク質の分割」、Nature、第227巻、680〜685ページ。

【０１１８】レイン B.G.，ダンウェル J.M.，レイ J.A.，シュミット M.R.，カミング A.C.（1993年）、「植物の成長の初期段階におけるタンパク質マーカーである
ゲルミンは、シュウ酸エステル・オキシダーゼである」、The JouRNAl of Biolo
gocal Chemistry、第268（17）巻、12239〜12242ページ。マリアニＣ．，ゴッセレＶ．，デ・ボイケレーアＭ．，デ・ブロック
Ｍ．，ゴールドバーグ R.B.，デ・グレーフＷ．，レーマンスＪ．（1992年
）、「キメラのリボヌクレアーゼ-インヒビター遺伝子が、雄性の不稔性植物の
稔性を回復させる」、Nature、第357巻、384〜387ページ。

【０１１９】マルティニＭ．，シュミットＡ．，ヘスＤ．（1990年）、「ネパールか
らのロドデンドロン（Rhododendron）とピプタントゥス（Piptanthus）の花蜜に
含まれる抗生物質とアミノ酸」、Bot. Acta、第103巻、343〜348ページ。ミズカミＹ．，フアンＨ．，チューダーＭ．，マーＨ．（1996年）、
「花の調節を行なうAGAMOUSの機能領域：DNA結合領域のキャラクテリゼーション
とドミナントネガティブ突然変異の解析」、The Plant Cell、第８巻、831〜845
ページ。

【０１２０】ツチモトＳ．，ヴァン・デア・クロル A.R.，チュア N.-H.（1993年）、
「トランスジェニック・ペチュニアにおけるｐMADS3の異所発現が、ペチュニア
のブラインド突然変異体を表現型模写する」、Plant Cell、第５巻、843〜853ペ
ージ。フェアヴォールト T.C.，デッカー B.M.M.，ヘケマＡ．（1989年）、「植
物のRNAを迅速に単離するための小規模な方法」、Nucl. Acids Res.、第17巻、2
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・Ｌ．（Rosmarinus officinalis L.）の花の蜜腺の構造、超微細構造、花蜜分
泌」、Annals of Botany、第70巻、391〜397ページ。

【０１２１】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、示差表示 (Differential Display) mRNA増幅後のPCR生成物を用いた
ポリアクリルアミドゲルを示す。PCR反応は、蜜腺のないめしべ（２つの独立し
た試料）、蜜腺（２つの独立した試料）、葉ならびに、がく片(s)、花弁(p)およ
びおしべ(a)の混合物のcDNA試料で、５つの異なるランダムプライマーAp11〜AP1
5と組合せてオリゴ‐dTプライマーT12MGを用いて行った。

【図２】図２は、示差表示 (Differential Display)RT-PCRクローンDD18aのDNA配列で
ある。5' RACE PCR反応のために使用された、プライマープラット(prat)122お
よびプラット119に下線を引いてある。

【図３】図３は、アダプタープライマーと組合せて遺伝子特異的プライマープラット12
2およびプラット119（図２）を用いたRACE PCRによって得られたクローンRC8の
DNA配列である。プライマープラット129（下線）は、次の工程において、プライ
マープラット122と共に使用されて、NEC1 cDNAのコード領域を増幅する。

【図４】図４は、NEC1 cDNAの全長配列である。翻訳開始(ATG)および翻訳停止(TAA)を
太字で示す。

【図５】図５は、ノーザンブロット(Northern blot)分析により決定した野生型ペチ
ュニア植物（W115系統）におけるNEC1(A)およびFBP15(B)の発現を示す。ブロッ
トAは、全RNAを含み、一方、ブロットBはmRNAが豊富である。組織は、次のよう
に示される：１＝葉、２＝がく片、３＝花弁、４＝おしべ、５＝めしべ、６＝蜜
腺。ブロットAについては、pDD18aのHindIII／EcoRI断片をプローブとして使用
した。ブロットBについては、FBP15の全長cDNAをプローブとして使用した。

【図６】図６ NEC1転写物(A)のインサイツ(in situ)での局在化によるNEC1の発現な
らびに、NEC1プロモーターにより誘導されたGUS発現によって示された、蜜腺(B)
およびおしべ(C)におけるNEC1プロモーターの活性。おしべについて使用したGUS
アッセイは、拡散を防ぐための修飾なしに１晩インキュベートした（実施例８）
。蜜腺についてのGUSアッセイは、拡散を防ぐためにアッセイ混合物を用いて、
５時間インキュベートした（実施例８）。インサイツ(in situ)での局在化の
ために、ペチュニアハイブリダ(Petunia hybrida)の花の長手方向の部分を、
ジゴキシゲニン(digoxigenin)で標識したアンチセンスNEC1 RNAを用いてハイブ
リッド化した。

【図７】図７は、NEC1タンパク質をエンコードする配列の上流のプロモーター領域から
のDNA配列である。下線を引いてあるのは、NEC1 cDNAの翻訳開始である。

【図８】図８は、pBINPLUS中の、NEC1プロモーター（図７）、GUSレポーター遺伝子お
よびnosターミネーターを含むバイナリーベクターpBNEP1の境界間のT-DNA領域の
概略の説明を示す。このベクターは、NEC1プロモーターの発現を研究するために
、トランスジェニック植物を生じさせるのに使用された。

【図９】図９は、異なる花からの市販の蜂蜜試料に存在するタンパク質のSDS-PAGE分離
を示す。Ｍ＝マーカー、レーン１：ワットル(wattle)、レーン２：花の混合物、
レーン３：ヘザー、レーン４：クローバー、レーン５：菜種。

【図１０】図10は、菜種（RH2x、RH10x）およびヘザー（HH2x、HH10x）の市販の蜂蜜試料
に存在するタンパク質ならびに、菜種（RN2x、RN10x）およびヘザー（HN2x、HN1
0x）の花蜜試料のSDS-PAGE分離を示す。Ｍ＝分子量マーカー。２倍（2x）または
10倍（10x）希釈を使用した。

【図１１】図11は、糖／BSA供給溶液(A)の希釈物および、糖／BSA溶液(B)を集めたミツバ
チからの蜂蜜の希釈物に存在するタンパク質のSDS-PAGE分離を示す。糖／BSAお
よび蜂蜜／BSAの溶液の希釈物は、両方のゲルについて同じであった：１＝15x、
２＝30x、３＝60x、４＝75x、５＝75x、６＝90ｘ、７＝105x、８＝120x、９＝13
5x。Ｍ＝マーカー。

【図１２】図12は、CVH29のN-末端タンパク質配列（ヘザーの蜂蜜および花蜜に存在する
ユニークタンパク質）の、遺伝子バンク相同性サーチ（BLAST）からの胚様たん
ぱく質GER1との配列相同性を示す。

【図１３】図13は、CVH29のN-末端タンパク質配列の推測されるDNA配列を示す。縮重した
プライマープラット176およびプラット177に下線を引いてある(A)。ヘザーのゲ
ノムDNAで行ったプラット176およびプラット177を用いて得られたPCR生成物のDN
A配列をBに示す。ヘザーの花からのcDNAで5' RACE PCR反応を行うために使用し
た遺伝子特異的プライマープラット207およびプラット206に下線を引いてある。

【図１４】図14は、ヘザーの花のcDNAでプラット207およびプラット206を用いた5' RACE
PCRによって得られた、４つの独立したクローンのDNA配列を示す。推定のシグナ
ル配列のATG翻訳開始は、四角で囲んである。推定のシグナル配列の末端および
成熟タンパク質の開始は、矢印で示す。

【図１５】図15は、リンカーを有するシグナル配列CVSP（四角で囲まれる）をエンコード
する合成的に製造したDNA分子の配列である。

【図１６】図16は、プラスミドpCV1を概略的に示したものである。全ての制限部位が示さ
れているわけではない。

【図１７】図17は、プラスミドpCV2を概略的に示したものである。全ての制限部位が示さ
れているわけではない。

【図１８】図18は、プラスミドpCV3を概略的に示したものである。全ての制限部位が示さ
れているわけではない。

【図１９】図19は、FBP15の全長cDNAのDNA配列である。翻訳開始(ATG)および翻訳停止(TA
A)を四角で囲んである。MAD-ボックスおよびK-ボックス領域に下線を引いてある
。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１月３１日（２００１．１．３１）

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１０】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/415 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｋ 14/415 5/00 ＣＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クレーメルス，ヤンティナオランダ国，エヌエル−6708 ペーベーワヘニンヘン，ドルーベンダールセステーヒ１，スティッチングセントルムフォールプランテンベレデリングス−エンレプロデュクティエオンデルズーク（セーペーエルオー−デーエルオー) (72)発明者アンヘネント，ゲルリトコルネリスオランダ国，エヌエル−6708 ペーベーワヘニンヘン，ドルーベンダールセステーヒ１，スティッチングセントルムフォールプランテンベレデリングス−エンレプロデュクティエオンデルズーク（セーペーエルオー−デーエルオー) (72)発明者カテル，マルティンマリアオランダ国，エヌエル−6708 ペーベーワヘニンヘン，ドルーベンダールセステーヒ１，スティッチングセントルムフォールプランテンベレデリングス−エンレプロデュクティエオンデルズーク（セーペーエルオー−デーエルオー) Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 DA05 EA04 FA02 FA18 GA14 HA12 4B041 LC10 LD07 LK21 LP25 4B065 AA87X AA87Y AA88X AC14 BA03 BA25 CA24 CA41 CA53 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA30 DA30 EA01 EA05 FA74 【要約の続き】産物を分離精製する操作を含んでいる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】花蜜（nectar）特異的に発現される配列の上流にあるプロモ
ーター領域から単離されたDNA配列であって、その花蜜特異的に発現される配列
が、配列番号１で与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれと相同
なタンパク質をコードしていることを特徴とする単離されたDNA配列。
【請求項２】花蜜特異的に発現される上記配列が、ａ）配列番号４で与えられるヌクレオチド配列、またはｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列または（ａ）の断片とのハイブリダイゼーシ
ョンによって獲得可能なヌクレオチド配列；を有することを特徴とする請求項１に記載の単離されたDNA配列。
【請求項３】ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）植物から得られ
、実質的に、配列番号７で与えられる配列からなるか、またはその配列のうちの
プロモーター活性を有するその機能的断片からなることを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の単離されたDNA配列。
【請求項４】花蜜特異的に発現される配列の上流にあるプロモーター領域
から単離されたDNA配列であって、その花蜜特異的に発現される配列が、配列番
号２で与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれと相同なタンパク
質をコードすることを特徴とする単離されたDNA配列。
【請求項５】花蜜特異的に発現された上記配列が、ａ）配列番号５で与えられるヌクレオチド配列、またはｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列または（ａ）の断片とのハイブリダイゼーシ
ョンによって獲得可能なヌクレオチド配列；を有することを特徴とする請求項４に記載の単離されたDNA配列。
【請求項６】ペチュニア・ヒブリダ植物から得られ、実質的に、配列番号
８で与えられる配列からなるか、またはプロモーター活性を有するその機能的断
片からなることを特徴とする請求項４または５に記載の単離されたDNA配列。
【請求項７】配列番号１で与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質、ま
たはそれと相同なタンパク質をコードする単離されたDNA配列であって、そのDNA
配列の発現が、主として植物の蜜腺に限定されていることを特徴とする単離され
たDNA配列。
【請求項８】ａ）配列番号４で与えられるヌクレオチド配列、またはｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列または（ａ）の断片とのハイブリダイゼーシ
ョンによって獲得可能なヌクレオチド配列；を有することを特徴とする請求項７に記載の単離されたDNA配列。
【請求項９】配列番号４で与えられるヌクレオチド配列に対し、自然に発
生する変化や、標的突然変異または組み換えによって導入される変化も含め、１
つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって得られることを特徴と
する単離されたDNA配列。
【請求項１０】現在のDNA合成技術によって生成する、配列番号４で与え
られるヌクレオチド配列を持つことを特徴とする請求項７に記載の単離されたDN
A配列。
【請求項１１】配列番号２で与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質、
またはそれと相同なタンパク質をコードしている単離されたDNA配列であって、
そのDNA配列の発現が、主として植物の蜜腺に限定されていることを特徴とする
単離されたDNA配列。
【請求項１２】ａ）配列番号５で与えられるヌクレオチド配列、またはｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列または（ａ）の断片とのハイブリダイゼーシ
ョンによって獲得可能なヌクレオチド配列；を有することを特徴とする請求項11に記載の単離されたDNA配列。
【請求項１３】配列番号５で与えられるヌクレオチド配列に対し、自然に
発生する変化や、標的突然変異または組み換えによって導入される変化も含め、
１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって得られることを特徴
とする単離されたDNA配列。
【請求項１４】現在のDNA合成技術によって生成する、配列番号５で与え
られるヌクレオチド配列を持つことを特徴とする請求項７に記載の単離されたDN
A配列。
【請求項１５】花蜜特異的MADSボックス遺伝子をコードする任意の配列。
【請求項１６】シグナルペプチドのためのコード領域を含む単離されたDN
A配列であって、そのDNA配列に含まれる情報が、蜜腺において発現するタンパク
質をコードするDNA配列との翻訳融合の後に、そのタンパク質を花蜜に向けるこ
とを特徴とする単離されたDNA配列。
【請求項１７】カルーナ・ヴュルガリス（Calluna vulgaris）植物から得
られて配列番号６で与えられるヌクレオチド配列を含んでいるか、または配列番
号６で与えられるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションによって獲得可
能なヌクレオチド配列を含んでいることを特徴とする請求項16に記載の単離され
たDNA配列。
【請求項１８】ｉ）植物の中で機能するプロモーター、 ii）タンパク質をコードする請求項７〜15のいずれか１項に記載のDNA配列で
あって、このプロモーターとセンス方向またはアンチセンス方向に融合している
配列、及び場合によってはさらに、 iii）RNA分子の転写終結とポリアデニル化のために植物の中で機能するシグナ
ル配列を含む発現カセットを有する組み換え二重鎖DNA分子。
【請求項１９】ｉ）植物の蜜腺の中で機能するプロモーターと、 ii）タンパク質をコードしていて、前記プロモーターとセンス方向またはアン
チセンス方向に融合するDNA配列、及び場合によってはさらに、 iii）RNA分子の転写終結とポリアデニル化のために植物の中で機能する信号配
列、を含む発現カセットを有する組み換え二重鎖DNA分子。
【請求項２０】ｉ）植物の蜜腺の中で機能するプロモーターと、 ii）タンパク質をコードし、前記プロモーターと融合しているDNA配列、 iii）シグナルペプチドをコードしているDNA配列であって、組み換えタンパク
質を暗号化しているDNA配列との翻訳融合され、この組み換えタンパク質を花蜜
に向けるDNA配列、及び場合によってはさらに、 iv）RNA分子の転写終結とポリアデニル化のために植物の中で機能する信号配
列、を含む発現カセットを有する組み換え二重鎖DNA分子。
【請求項２１】上記プロモーターが、請求項１〜６のいずれか１項に記載
の単離されたDNA配列であることを特徴とする請求項19または20に記載の組み換
え二重鎖DNA分子。
【請求項２２】シグナルペプチドをコードする上記DNA配列が、請求項16
または17に記載の単離されたDNA配列であることを特徴とする請求項20または21
に記載の組み換え二重鎖DNA分子。
【請求項２３】花蜜の中に組み換えタンパク質を分泌させるトランスジェ
ニック植物を生産する方法であって、ｉ）植物細胞の中に請求項20〜22のいずれか１項に記載の組み換え二重鎖DNA
分子を導入し、ここで組み換えタンパク質は花蜜の中に分泌され、 ii）このトランスジェニック細胞から植物を再生せしめ、 iii）このトランスジェニック植物の中から所望のものを選択する、ことを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】修飾された花蜜を分泌するトランスジェニック植物を生産
する方法であって、ｉ）植物細胞の中に請求項19〜22のいずれか１項に記載の組み換え二重鎖DNA
分子を導入し、ここで、組み換えタンパク質は蜜腺中の代謝経路を阻害し、 ii）このトランスジェニック細胞から植物を再生せしめ、 iii）このトランスジェニック植物の中から所望のものを選択する、操作を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】修飾された花蜜を分泌するトランスジェニック植物を生産
する方法であって、ｉ）植物細胞の中に請求項19〜22のいずれか１項に記載の組み換え二重鎖DNA
分子を導入し、ここで、組み換えタンパク質は蜜腺の分泌能力を阻害し、 ii）このトランスジェニック細胞から植物を再生せしめ、 iii）このトランスジェニック植物の中から所望のものを選択する、操作を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】修飾された花蜜を分泌するトランスジェニック植物を生産
する方法であって、ｉ）植物細胞の中に請求項19または22に記載の組み換え二重鎖DNA分子を導入
し、ここで組み換えタンパク質は蜜腺の発達を妨害し、 ii）このトランスジェニック細胞から植物を再生せしめ、 iii）このトランスジェニック植物の中から所望のものを選択する、操作を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】トランスジェニック植物から得られる修飾された花蜜をも
とにして蜂蜜を生産する方法であって、ｉ）植物細胞の中に請求項19〜22のいずれか１項に記載の組み換え二重鎖DNA
分子を導入し、トランスジェニック細胞からトランスジェニック植物を再生せし
め、そして、その中から、修飾された花蜜を分泌する修飾された植物を選択し、 ii）昆虫、好ましくはミツバチに、それらトランスジェニック植物から花蜜を
集めさせ、その花蜜を処理して蜂蜜にする、操作を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】蜂蜜から組み換え遺伝子産物を生産する方法であって、ｉ）植物細胞の中に請求項20〜22のいずれか１項に記載の組み換え二重鎖DNA
分子を導入してトランスジェニック植物を栽培し、そのトランスジェニック細胞
から植物を再生せしめ、そして花蜜の中に組み換え遺伝子産物を分泌する修飾さ
れた、植物を選択し、 ii）昆虫、好ましくはミツバチに、それらトランスジェニック植物から花蜜を
集めさせ、その花蜜を処理して蜂蜜にし、そして iii）その蜂蜜から組み換え遺伝子産物を分離精製する、操作を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】蜂蜜から代謝産物を生産する方法であって、ｉ）現在の育成選択技術によってすでに生産されている植物であって、花蜜の
中にこの代謝産物を分泌する植物を生産し、 ii）昆虫、好ましくはミツバチに、選択したそれらトランスジェニック植物か
ら花蜜を集めさせ、その花蜜を処理して蜂蜜にし、そして iii）その蜂蜜から代謝産物を分離精製する、操作を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】請求項１〜17の１〜複数項に記載のDNA配列を含む微生物
。
【請求項３１】請求項18〜22のいずれか１項に記載の組み換えDNA分子を
含む微生物。
【請求項３２】請求項１〜17に記載の１つ以上のDNA配列を用いて形質転
換した植物細胞または植物細胞培養物。
【請求項３３】請求項18〜22のいずれか１項に記載の組み換えDNA分子を
用いて形質転換した植物細胞または植物細胞培養物。
【請求項３４】請求項32または33に記載の植物細胞で実質的に構成されて
いる植物。
【請求項３５】請求項23〜26のいずれか１項に記載の方法により得られる
トランスジェニック植物。
【請求項３６】請求項35に記載のトランスジェニック植物に由来する、種
子、組織培養物、植物の一部、または子孫植物。
【請求項３７】トランスジェニック植物から採取した、修飾された組成を
有する花蜜から得られる蜂蜜。
【請求項３８】トランスジェニック植物から採取した、組み換え遺伝子産
物を含む花蜜から得られる蜂蜜。