JP2002516566A - 金属介在セリンプロテアーゼインヒビター - Google Patents

金属介在セリンプロテアーゼインヒビター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、二価のカチオン錯体としてプレ−調製されるか、又は二価のカチオンの存在下でセリンプロテアーゼと組合される、Ｐ部位結合成分及び二価のカチオンキレート化成分を有するセリンプロテアーゼインヒビター、前記インヒビターを同定し、そして使用するための方法に関する。前記化合物は、二価のカチオンに錯化される場合、高い阻害活性を有することが示されており、そしてセリンプロテアーゼ単離及び阻害に関係する種々の方法において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 金属介在セリンプロテアーゼインヒビター 発明の分野 本出願は、セリンプロテアーゼインヒビター、前記セリンプロテアーゼインヒ ビターにより形成されるインヒビター酵素複合体、前記セリンプロテアーゼイン ヒビター及び前記インヒビター酵素複合体の使用方法、並びに化合物がセリンプ ロテアーゼを阻害するかどうかを決定するための方法に関する。 発明の背景 セリンプロテアーゼは、多くの生存生物の細胞内で生成され、そしてしばしば 、その生成細胞の外部で作用するよう分泌される。個々のセリンプロテアーゼは 、特定の基質（たとえば、その生物学的活性形への転換のための不活性前駆体） を標的化することができ、又は非特異的に（たとえば切断によるタンパク質又は 他のペプチドの分解）作用することができる。さらに、個々のセリンプロテアー ゼは、それらが１又は少数の関連するサブ配列のみを認識することにおいて高い 選択性であり、又はそれらが種々の関連しない配列を認識し、そして分解するこ とにおいて非選択性であり得る。 セリンプロテアーゼは高度に保存された活性部位を有し、ここでは結合分解を 触媒する特定のアミノ酸がほぼ同一の空間的配置を有する。活性部位に隣接する 相補的結合部位（complementary binding site）が、いづれかの個々のセリンプ ロテアーゼの一次特異性を提供する。プロテアーゼの表面にそっての連続したく ぼみ又は“ポケット”が、切断されるべきペプチド結合のいづれかの側に基質ポ リペプチド鎖にそって連続的なアミノ酸側鎖を結合するよう作用する。プロテア ーゼとの結合に寄与する基質側鎖は、許容できる結合に最も近い側鎖からタンパ ク質のアミノ末端の方に向かって、Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３、等と命名され、そして許 容できる結合に最も近い側鎖からタンパク質のカルボキシル末端の方に向かって 、Ｐ１’，Ｐ２’，Ｐ３’、等と命名される。適切なＰ結合成分を有する小さな 分子は、基質の結合部位を支配することによって基質を模倣し、そしてセリンプ ロテアーゼの機能を阻害するよう企画され得る。 セリンプロテアーゼは、種々の生物学的機能を提供する。重要なセリンプロテ アーゼは、トリプシン様プロテアーゼ、たとえばトリプシン、トリプターゼ、ト ロンビン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン及び第Ｘａ因子を包含する。セ リンプロテアーゼのための基質は、たとえば血液凝集、補体介在溶菌、免疫応答 、糸球体腎炎、苦痛感覚、炎症、膵炎、癌、受精調節、細菌感染及びウィルス成 熟に関係している。従って、適切な薬物療法は、疾病の病理学及び／又は症候学 に関係する特定のセリンプロテアーゼの阻害を包含することができる。従って、 特異的セリンプロテアーゼのための高い選択性を有するセリンプロテアーゼイン ヒビターの同定に実質的な興味が存在する。 本明細書に言及される他の参考資料の開示は、引用により本明細書中に組込ま れる。 発明の要約 本発明の１つの観点は、化合物のセリンプロテアーゼ阻害活性を測定するため の方法であり、ここでこの方法は、前記化合物と、媒体に存在する二価の金属カ チオンを有する媒体中のセリンプロテアーゼとを接触せしめることを含んで成り 、ここで前記カチオンが前 記化合物との相互作用のための、及びそれにより、前記化合物により獲得される いづれかのセリンプロテアーゼ阻害活性を強化する能力を有し、そして前記媒体 中の二価の金属カチオンの濃度がいづれかのそのような相互作用を引き起こすの に十分なレベルまで変更される。 本発明の第２の観点は、セリンプロテアーゼインヒビターの阻害活性が二価の 金属カチオンの存在により強化されるかどうかを決定するための方法であり、こ こで前記方法は、 （ａ）前記インヒビターによるセリンプロテアーゼの阻害についてアッセイし 、ここで前記アッセイは解離された二価金属カチオンを実質的に欠いている媒体 において実施され；そして （ｂ）前記化合物によるセリンプロテアーゼの阻害について、段階（ａ）に使 用されるアッセイ条件に対して実質的に同等な条件下でアッセイし、但し、段階 （ｂ）において実施されるアッセイは有効濃度の二価金属カチオンを含む媒体に おいて実施されることを含んで成り；ここで前記化合物の阻害活性は、段階（ｂ ）により測定される場合、段階（ａ）により測定される場合の化合物の阻害活性 よりも有意に高い。 本発明の第３の観点は、セリンプロテアーゼ及びインヒビターを含んで成る媒 体中でセリンプロテアーゼインヒビターによりセリンプロテアーゼを阻害するた めの方法であり、ここで前記インヒビターはキレート化できる、生理学的に許容 できる二価の金属カチオンをキレート化するためにお互い立体的な関係での２つ のヘテロ原子を含んで成り、ここで前記方法は、媒体に十分な量の二価の金属カ チオンを有し、又は二価の金属カチオン錯体としてセリンプロテアーゼに結合さ れるいづれかの又はすべてのインヒビターを有するように媒体に十分な量の二価 の金属カチオンを添加し、又は二価の金 属カチオンが二価の金属カチオンの三元錯体としてインヒビターとセリンプロテ アーゼとの間で結合されるよう、二価の金属カチオン二元錯体としてインヒビタ ーを供給することを含んで成る。 本発明の第４の観点は、下記式Ｉ： {(BP)r-(I)}n(Y)q Ｉ 〔式中、 ｑは０でありそしてｎは１であり、又はｑは１でありそしてｎは２であり； Ｙは６個よりも多くない、典型的には３個よりも多くない原子の結合又は結合 基であり、そして好ましくは鎖中の炭素原子であり； Ｂpはセリンプロテアーゼの１又は複数のＰ部位に結合するための結合成分で あり； ｒは０又は１であり、但し少なくとも１個のＢp結合成分が存在し；そして Ｉは、ｎが２である場合、少なくとも１個のヘテロ原子を含んで成り、そして ｎが１である場合、少なくとも２個のヘテロ原子を含んで成る成分であり、ここ で２個のヘテロ原子は、二配座態様で二価の金属カチオンをキレート化できるよ うお互い立体的関係で存在する〕 で表わされる化合物の二価の金属カチオン二元錯体である。 本発明の第５の観点は、二価の金属カチオン及びセリンプロテアーゼと共に式 Ｉの化合物を含んで成る二価金属カチオン三元錯体である。 本発明の第６の観点は、本発明の方法により同定されるセリンプロテアーゼイ ンヒビターである。 本発明の第７の観点は、セリンプロテアーゼ活性が動物の病理学及び／又は症 候学に寄与する、動物における疾病の処理方法であり 、ここで前記方法は、本発明の方法により同定される治療的有効量のセリンプロ テアーゼインヒビターを動物に投与することを含んで成る。 従って、本発明の範囲は、化合物のセリンプロテアーゼ阻害活性を測定するた めの任意の方法を包含することが意図されており、ここで前記方法は、二価の金 属カチオン及びセリンプロテアーゼの存在を必要とし、そして当業者は、前記カ チオンが、式Ｉの化合物との相互反応のための、及びそれにより、前記化合物の 阻害活性を強化するための能力を有し、又は式Ｉの化合物及びセリンプロテアー ゼの活性部位と同時にキレート化することができ、そしてそれにより、化合物の 阻害活性を強化することができることを示すことができた。 発明の特定の記載 定義： 特にことわらない限り、明細書及び請求の範囲に使用される次の用語は下記意 味を有する： “アルキル”とは、示される数の炭素原子を有する、直鎖又は枝分れ鎖、飽和 又は不飽和の炭化水素基を意味する（たとえば、（Ｃ1-8）アルキルは、メチル 、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert −ブチル、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、 ２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチルアリル、エニニル、１−プロピニル、 ２−プロピニル、等を包含する）。 “アルキレン”とは、直鎖、飽和又は不飽和の炭化水素二価基（たとえば、メ チレン、エチレン、ビニレン、エチニレン、２−プロピレン、１−プロピレン、 テトラメチレン、イソプロピリデン、等 ）を意味する。 “アミジノ”とは、基−C(NH)NH2を意味する。 “アミノ”とは、基−NH2を意味する。 “アリール”とは、示される数の炭素原子を含む芳香族単環式又は多環式基を 意味し、ここでフリー原子価を有する炭素原子は芳香族環の員である（たとえば 、（Ｃ6-14）アリールは、フェニル、ナフチル、アトラセニル、フェナントレニ ル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチ−５−イル、等を包含する）。 “アリーレン”とは、示される数の炭素原子を含む芳香族単環式又は多環式炭 化水素二価基を意味し、ここでフリー原子価を有する炭素原子は芳香族環の員で ある（たとえば、（Ｃ6-14）アリーレンは、１，２−フェニレン、１，３−フェ ニレン、１，２−ナフチレン、１，３−ナフチレン、１，２−アントラセニレン 、１，３−アントラセニレン、１，２−フェナントレニレン、１，２，３，４− テトラヒドロ−５，６−ナフチレン、等を包含する）。 “シクロアルキル”とは、示される数の炭素原子を含む、飽和又は不飽和、単 環式又は多環式炭化水素基を意味し、ここでフリー原子価を有する炭素原子は非 芳香族環の員である（たとえば、（Ｃ3-14）シクロアルキルは、シクロプロピル 、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，５ −シクロヘキサジエニル、ビシクロ〔２．２．２〕オクチル、１，２，３，４− テトラヒドロナフチ−１−イル、等を包含する）。 “シクロアルキレン”とは、示される数の炭素原子を含む、飽和又は不飽和、 単環式又は多環式炭化水素二価基を意味し、ここでフリー原子価を有する炭素原 子は非芳香族環の員である（たとえば、（Ｃ3-6）シクロアルキレンは、１，２ −シクロプロピレン、１，２−シクロブチレン、１，３−シクロブチレン、１， ２−シクロペ ンチレン、１，３−シクロペンチレン、１，２−シクロヘキシレン、３−シクロ ヘキセン−１，２−イレン、２，５−シクロヘキサジエン−１，３−イレン、１ ，２−ビシクロ〔２．２．２〕オクチレン、１，２，３，４−テトラヒドロ−１ ，２−ナフチレン、等を包含する）。 解離される二価金属カチオンを実質的に欠いている媒体におけるような“解離 される二価金属カチオンを実質的に欠いている”とは、媒体におけるカチオンの 自由濃度が予測されたセリンプロテアーゼインヒビターとのキレート化の能力を 有さないか又は最小の能力を有するほど低いことを意味する。 化合物、セリンプロテアーゼ及び有効濃度の二価金属カチオンを含む媒体にお けるような“有効濃度”とは、媒体におけるカチオンの自由濃度が化合物との相 互作用を引き起こすのみ十分であることを意味し、ここで前記カチオンはそのよ うな相互作用のための、及びそれにより、化合物の阻害活性を強化し、又は化合 物及びセリンプロテアーゼの活性部位との同時キレート化を引き起こす能力を有 し、そしてそのようなキレート化のための及びそれにより、化合物の阻害活性を 強化する能力を有する。 化合物及びセリンプロテアーゼを含む媒体における二価金属カチオンの自由濃 度におけるような“自由濃度”とは、解離され、そして化合物と自由に相互作用 できる媒体におけるカチオンの濃度を意味し、ここで前記カチオンは、そのよう な相互作用のための、及びそれにより、化合物のいづれかの阻害活性を強化し、 又は化合物の及びセリンプロテアーゼの活性部位との同時キレート化を引き起こ す能力を有し、そしてそのようなキレート化のための、及びそれにより、化合物 の阻害活性を強化する能力を有する。 “グアニジノ”とは、基−NHC(NH)NH2を意味する。 “ヘテロアルキレン”とは、上記に定義されるようなアルキレンを意味し、こ こで示される１〜５個の炭素原子は、Ｎ，Ｏ、又はＳ（たとえばアミノ、オキシ 、チオ、アザエチレン（−NHCH2−）、オキサエチレン（−OCH2−）、等）から 選択されたヘテロ原子により置換されており、但し、そこに含まれる酸素、窒素 及び硫黄原子は他のヘテロ原子と結合を形成しない。 “ヘテロアリール”とは、上記で定義されるようなアリールを意味し、ここで 示される１〜５個の炭素原子は、Ｎ，Ｏ、又はＳから選択されたヘテロ原子によ り置換されている。 “ヘテロアリーレン”とは、上記で定義されるようなアリーレンを意味し、こ こで示される１〜５個の炭素原子は、Ｎ，Ｏ、又はＳから選択されたヘテロ原子 により置換されている。 “ヘテロ原子”とは、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、又は硫黄（Ｓ）を意味する。 本出原のための“ヘテロ原子含有成分”とは、−OR，−NRR又は−SRを意味し 、ここで個々のＲは独立して、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ア リール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール（たとえば、メトキシ、アミノ 、メチルアミノ、アミジノ、グアニジノ、アニリノ、ヒドロキシ、メルカプト、 カルボキシ、メチルアセトキシ、グリシンアミド、シクロヘキシルアミノ及び同 様のもの）である。 本発明のための“ヘテロシクロアルキル"とは、少なくとも１つのヘテロ原子 、及び示される数の炭素原子を含み、そして４〜７個、典型的には５〜６個の環 状員及び１〜４個、典型的には１〜３個及びより好ましくは１〜２個の環状ヘテ ロ原子を有する、芳香族又は非芳香族、飽和又は不飽和、単環式又は多環式、融 合され又は融合されていない炭化水素基（たとえば、ピラゾール、イミダゾール 、トリアゾール、オキサゾール、チアゾール、イソキサゾール、ベンズイミダゾ ール、ビラン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ジオキサリン、 キノリン、イソキノリン、シンノリン、２，２’−ビス−イミダゾール、２，２ ’−ビス−ピリジン、等）を意味する。 疾病の“病理学”とは、疾病の実質的な性質、原因及び進行、並びに疾病過程 に起因する構造及び機能の変化を意味する。 “医薬的に許容できる”とは、一般的に安全で非毒性であり、そして生物学的 に所望の医薬組成物の調製において有用であることを意味し、そして家畜への使 用及びヒトへの医薬使用のために許容できることを包含する。 “医薬的に許容できる塩”とは、上記のように医薬的に許容でき、そして所望 の薬理学的活性を有する塩を意味する。そのような塩は、無機酸、たとえば臭酸 、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸及び同様のもの；又は有機酸、たとえば酢酸、ベン ゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、ｐ−クロロベンゼン−スルホン酸 、桂皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、１，２−エタンジスルホン 酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプタン酸、グルコン酸、グルタミン 酸、グリコール酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、Ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル ）安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、 ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデリン酸、メタンスルホ ン酸、４−メチルビシクロ〔２．２．２〕オクト−２−エン−１−カルボン酸、 ４，４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、ムコ ン酸、２−ナフタレンスルホン酸、蓚酸、３−フェニルプロピオン酸、プロピオ ン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、琥珀酸、酒石酸、tert−ブチル 酢酸、ｐ−トルエンスルホ ン酸、トリメチル酢酸、及び同様のものにより形成される酸付加塩を包含する。 医薬的に許容できる塩はまた、存在する酸プロトンが無機又は有機塩基と反応 することができる場合に形成され得る塩基付加塩を包含する。許容できる無機塩 基は、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウ ム及び水酸化ナトリウムを包含する。許容できる有機塩基は、ジエタノールアミ ン、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、トリエタノールアミン、トロメ タミン及び同様のものを包含する。 “セリンプロテアーゼ”とは、共有結合、続く加水分解の機構を通してアミド 結合を分解し；従って、通常、タンパク質及びペプチドのより小さなフラグメン トへの分解を引き起こすユニークに反応性のセリン残基を有するいづれかの酵素 を意味する。この目的のためには、セリンプロテアーゼの定義は、プロテインＣ 、チマーゼ、キモトリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスター ゼ、第VIIａ因子、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレ イン、β−ラクタマーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ 、及びウロキナーゼを包含するが、但しそれらだけには限定されない。 疾病の“症候学”とは、いづれかの病的な現象、又は患者により経験され、そ して疾病、それらの生成及びそれらが付与する症候の表示である、構造、機能又 は感覚の標準からの離脱を意味する。 “治療的有効量”とは、疾病を処理する(treat)ために動物に投与される場合 疾病に対してそのような処理をもたらすのに十分である量を意味する。 疾病の“処理すること”又は“処理”とは、疾病にかかりやすくなっているが 、しかしまだ、疾病の症候を経験していないか又は示 していない動物における疾病の発生を妨げること、疾病を阻害すること（すなわ ち、その進行を阻止すること）、又は疾病を緩和すること（すなわち、疾病の緩 解を引き起こすこと）を包含する。 現在好ましい態様： 本発明の最大に広い定義が本発明の要約に示されているが、本発明の特定の観 点が好ましい。たとえば、化合物のセリンプロテアーゼ阻害活性を測定するため の方法が好ましく、ここで前記方法は、亜鉛及びコバルトから成る群から選択さ れた、媒体に存在する二価の金属カチオンを有する媒体中でセリンプロテアーゼ と前記化合物とを接触せしめることを含んで成り、ここで前記カチオンは、前記 化合物との相互作用のための能力、及びそれにより、前記化合物により持たれる いづれかのセリンプロテアーゼ阻害活性を強化する能力を有し、そして前記媒体 中の二価金属カチオンの濃度は、いづれかのそのような相互作用を引き起こすの に十分なレベルに変更され；より好ましくは、前記二価の金属カチオンは亜鉛で ある。 本発明の好ましい方法においては、セリンプロテアーゼインヒビターの濃度に 少なくとも等しい量の亜鉛がアッセイ媒体に存在する。一般的に、インヒビター を含む調製物又は媒体に含まれる亜鉛の量は、少なくとも0.1μＭ、典型的には 少なくとも１μＭ、より好ましくは少なくとも10μＭ、及びより好ましくは少な くとも100μＭである。典型的には、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも 約90％及びより好ましくは実質的にすべてのインヒビターが亜鉛によりキレート 化されるであろう、使用される亜鉛濃度が提供されるであろう。生理学的システ ムにおいては、存在する亜鉛の量は通常、亜鉛錯体をもたらすのに十分であろう 。 セリンプロテアーゼが二価の金属カチオンによる阻害に対して敏感である場合 、前記方法はさらに、交換平衡により相互作用を引き 起こすために十分な二価の金属カチオンを供給しながら、セリンプロテアーゼが 二価の金属カチオンの存在により実質的に阻害されない程度まで、その二価の金 属カチオンの自由濃度を減じることができる媒体に存在する金属緩衝剤(metal b uffering agent)を有する媒体中で、セリンプロテアーゼと前記化合物とを接触 せしめることを含んで成る。典型的な金属緩衝剤は、対応する二価の金属カチオ ンのキレート化のためのＫdを有し、そして前記二価の金属カチオンの自由濃度 が、前記カチオンがセリンプロテアーゼとの会合のためにほとんど利用されない が、しかし前記カチオンはプロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターとの同時 の会合のために利用される程度まで減じられるような適切な量で存在するであろ う。従って、金属緩衝剤は、解離されたカチオンのすべて又はほとんどを金属イ オン封鎖(requester)し、そしてインヒビターとの二元錯体又はインヒビター及 びプロテアーゼとの三元錯体を形成するために前記カチオンを容易に移行するで あろう（本明細書においては、交換平衡として定義される）。たとえば、亜鉛が 媒体中に存在し、そしてセリンブロテアーゼがその亜鉛による阻害に対して敏感 である場合に、化合物のセリンプロテアーゼ阻害を測定するための好ましい方法 はさらに、金属緩衝剤としてその媒体に存在するオキサレートを有する媒体中で 前記化合物とセリンプロテアーゼとを接触せしめることを含んで成る。 二価の金属カチオンの濃度が変更され得、そして本発明の範囲内にある方法は 、化合物がプロテアーゼと接触された後、アッセイ媒体に適切な量の二価の金属 カチオンを添加すること、媒体中の二価の金属カチオンの所望の最終濃度が達成 されるよう、アッセイ試薬と適切な量の二価の金属カチオンとを混合すること、 試薬の組合せの後、アッセイ媒体中の二価の金属カチオンの最終濃度が達成され るよう、付随的に存在する二価の金属カチオンのレベルによりアッセイ試薬を選 択すること、及び本発明の範囲内に存在するようアッセイ媒体における濃度を調 節するために適用されるいづれか他の方法を包含するが、但しそれらだけには制 限されない。 セリンプロテアーゼインヒビターの阻害活性が、亜鉛及びコバルトから成る群 から選択された二価の金属カチオンの存在により増強されるかどうかを決定する ための方法が好ましく、ここでこの方法は、 （ａ）前記インヒビターによるセリンプロテアーゼの阻害についてアッセイし 、ここでこのアッセイは解離した二価金属カチオンを実質的に欠いている媒体中 で実施され；そして （ｂ）前記化合物によるセリンプロテアーゼの阻害について、段階（ａ）に使 用されるアッセイ条件に対して実質的に同等な条件下でアッセイし、但し、段階 （ｂ）において実施されるアッセイは有効濃度の二度金属カチオンを含む媒体中 で実施されることを含んで成り；ここで前記化合物の阻害活性は、段階（ｂ）に より測定される場合、段階（ａ）により測定される場合の化合物の阻害活性より も有意に高く；より好ましくは、前記二価の金属カチオンは、カチオン金属イオ ン封鎖剤の存在により、段階（ａ）に使用される媒体から除去され、そして最と も好ましくは、前記二価の金属カチオンは亜鉛である。 典型的なカチオン金属イオン封鎖剤は、二価の金属カチオンが化合物との会合 のために利用できないよう、対応する二価の金属カチオンのキレート化のための Ｋdを有するであろう。たとえば、本発明の実施において適切なカチオン金属イ オン封鎖剤は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、フェナントロリン、及びそれ 自体プロテアーゼ活性に対する効果を有さないいづれか他の通常のカチオン金属 イオン封鎖剤を包含し、好ましくはEDTAである。本発明の実施のための標準のア ッセイ型式は、選択のセリンプロテアーゼ、及びその切断が、典型的には単純な 比色法によりモニターされ得る短いペプチド基質を利用する。本発明のためには 、段階（ｂ）により測定される場合の化合物の阻害活性は、活性の差異が、当業 者が典型的な生物学的及び実験的な変動性の観点から実質的であると見なすよう に存在する場合、段階（ａ）により測定される場合の化合物の阻害活性よりも有 意に高いと思われる。典型的には、有意に高い活性とは、阻害活性において、少 なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍及びより好ましくは少なくとも1000 倍高いことを意味する。 セリンプロテアーゼ、及び亜鉛をキレート化するためにお互い立体的関係で２ 個のヘテロ原子を含んで成るインヒビターを含んで成る媒体中で亜鉛及びコバル トから成る群から選択された二価の金属カチオンによりセリンプロテアーゼを阻 害するための方法が好ましく、ここで前記方法は、媒体に十分な量の二価の金属 カチオンを有し、又は二価の金属カチオンの三元錯体としてセリンプロテアーゼ に結合されるインヒビターのいづれか又はすべてを有するように媒体に十分な量 の二価の金属カチオンを添加し、又は二価の金属カチオンがインヒビターと、セ リンプロテアーゼの活性部位との間で、二価の金属カチオンの三元錯体として結 合されるように、インヒビターを二価の金属カチオン二元錯体として供給する、 ことを含んで成り；ここで、より好ましくは２個のヘテロ原子は環の環状員であ り、特にヘテロ原子の少なくとも１個はベンズイミダゾールの環状員であり、又 はインヒビターは亜鉛二元錯体として提供される。化合物の適切な亜鉛二元錯体 は、化合物と、少なくとも0.01μＭ〜100mM、典型的には0.1μＭ〜50mMそして好 ましくは約５μＭ〜50μＭの濃度の亜鉛とを組合わすことによって調製され得る 。 セリンプロテアーゼインヒビターによりセリンプロテアーゼを阻害するための 本発明の好ましい方法は、アッセイ媒体に含まれる亜鉛の量がセリンプロテアー ゼインヒビターの濃度に少なくとも等しい方法である。一般的には、インヒビタ ーを含む調製物又は媒体に含まれる亜鉛の量は、少なくとも0.1μＭ、典型的に は少なくとも１μＭ、より好ましくは10μＭ、及びより好ましくは少なくとも10 0μＭであろう。典型的には、少なくとも80％、好ましくは少なくとも約90％、 そしてより好ましくは実質的にすべてのインヒビターが亜鉛によりキレート化さ れるように、使用される亜鉛濃度が供給されるであろう。生理学的系においては 、存在する亜鉛の量は、通常、亜鉛錯体を供給するのに十分な量であろう。 セリンプロテアーゼ、及び亜鉛をキレート化するために立体的関係で、ビス（ ベンズイミダゾール）の窒素原子を含んで成るインヒビターを含んで成る媒体中 で、ビス（ベンズイミダゾール）を含んで成るセリンプロテアーゼインヒビター によりセリンプロテアーゼを阻害するための方法が好ましく、ここで前記方法は 、亜鉛錯体としてセリンプロテアーゼに結合されるインヒビターのすべてを有す るよう媒体に十分な亜鉛を添加し、又は亜鉛二元錯体としてインヒビターを供給 することを含んで成り；より好ましくは、ビス（ベンズイミダゾール）はアミジ ノ基により置換される。 下記式II： (BP)r{α-(A)-β} II 〔式中、Ｂpはセリンプロテアーゼの１個の又は複数のＰ部位に結合するための 結合成分であり； ｒは０又は１であり、但し、少なくとも１つのＢp結合成分が存在し； Ａは結合、又はアルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレ ン、アリーレン、及びヘテロアリーレンから選択された連結基であり、この連結 基は、１〜２個の原子によりα及びβを分離し、そして場合によっては、オキソ 、ヒドロキシ、（Ｃ1-2）アルキルオキシ、ハロ、メルカプト（Ｃ1-2）アルキル チオ、アミノ、（Ｃ1-2）アルキルアミノ及びジ（Ｃ1-2）アルキルアミノから選 択された１〜２個の基により置換されており、ここでヘテロ原子は炭素又は水素 のみに結合し；そして α及びβはそれぞれ、独立して、２〜36個の炭素原子、典型的には、２〜18個 そしてより好ましくは２〜12個及び１〜８個のヘテロ原子を含んで成る基であり 、そしてα及びβのそれぞれに含まれる少なくとも１個のヘテロ原子は、Ａの３ 個の原子、典型的には２個又はそれ以上の原子内、好ましくは１個の原子内にあ り、そして他のヘテロ原子の６個の原子内、典型的には４個の原子内にある〕 で表わされる化合物の二価の金属カチオン二元錯体が好ましい。任意には、α 及びβは、オキソ、ヒドロキシ、（Ｃ1-2）アルキルオキシ、ハロ、メルカプト 、（Ｃ1-2）アルキルチオ、アミノ、（Ｃ1-2）アルキルアミノ及びジ（Ｃ1-2） アルキルアミノから選択された１又は２個の基により任意に置換されていてもよ い、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択された連結基を通して結合され、 ここでヘテロ原子は、２個の関連するヘテロ原子が二価の金属カチオンの二配座 キレート形成を促進するように相互に立体的な関係で配置されるような態様で、 炭素又は水素のみに結合される。 α及びβが独立して、Ａに直接的に又は間接的に結合されたヘテロシクロアル キル又はヘテロアリール成分から構成される基、又はヘテロ原子含有成分により 置換された、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキルもし くはヘテロアリール成分から構成された基であり、そして個々のα及びβ内に含 まれる少なく とも１個の環状又は非環状ヘテロ原子はＡの３個の原子内、典型的には、２個そ してより好ましくは１個の原子内、そして他のヘテロ原子の６個原子内、典型的 には４個の原子内にある、式IIの化合物がより好ましい。 また、下記式III： (BP){Xa-(γ)-Xb} III 〔式中、Ｂpはセリンプロテアーゼの１又は複数のＰ部位に結合するための結合 成分であり； γは６〜18個の炭素原子を含んで成る、芳香族又は非芳香族、飽和又は不飽和 の融合された多環式炭化水素であり；そして Ｘa及びＸbは独立して、γ内に含まれる環内ヘテロ原子、又はγに直接的に結 合される、ヘテロ原子含有成分であり、ここでＸa及びＸbはお互いの６個の原子 、典型的には４個の原子内にある〕 で表わされる化合物の二価の金属カチオン二元錯体が好ましい。 代表的な二価の金属カチオンは、コバルト及び亜鉛を包含する。亜鉛は、生理 学的組織及び流体に、典型的には10〜100μＭの濃度で存在するより通常の二価 の金属カチオンの１つである。従って、本発明の好ましい態様は、二価の金属カ チオンとして亜鉛を包含する。 代表的な第１のＢp連結成分は、一般的に、炭素、水素、窒素及び／又は酸素 、典型的には、10個よりも多くない、好ましくは６個よりも多くない水素以外の 原子から構成される、炭素原子を通してα又はβに結合される塩基性基（たとえ ば、グアニジノ、アミジノ、アミノメチル、アミノ高級アルキル、α−アミノカ ルボキシメチル、α−アミノカルボキサミドメチル及び同様のもの）を含んで成 る。代表的な第２のＢp連結成分は、一般的に、炭素、水素、窒素及び／又は酸 素、典型的には、水素以外の20個よりも多くない原子 から構成される（たとえば、アルキル、非オキシカルボニル、アミノ、アミノア ルキル、アミジノ、又は同様のもの）。さらに、Ｂp連結成分は、アミノ酸基、 特にアルギニル又はリシュルであり得、又は標的セリンプロテアーゼのための特 異的標的部位であるオリゴペプチド基（たとえば、アミジノ、アミノ、グアニジ ノ、又はトリプシン様セリンプロテアーゼのための他の塩基性成分、及びキモト リプシン様プロテアーゼのためのカルボキシレート又は親油性基）であり得る。 代表的なＡ連結基は、メチレン、メセン、カルボニル、アミノ、オキシ、チオ 、イソプロピリデン、１，２−シクロヘキシレン、１，２−フェニレン及び同様 のものを包含する。 α及び／又はβ基は、キレート化に関与するヘテロ原子以外の１又は複数のヘ テロ原子含有置換基を有することができる。その置換基は通常、６個よりも多く ない炭素原子、より通常には、３個よりも多くない炭素原子を有するものであり 、そして０〜６個の炭素原子のアミノ、１〜６個の炭素原子の非−オキソ−カル ボニル、特に塩、エステル及びアミド、及びそれらの硫黄及び窒素類似体、０〜 ６個の炭素原子のヒドロキシ又はアルキルオキシ、又はアリールオキシ、ハロ、 シアノ、ニトロ、オキソ、等を包含する。 代表的なα及び／又はβヘテロアリール基は好ましくは、少なくとも１個のSP2 窒素原子を有し、そして５員環、たとえばピラゾール、イミダゾール、トリア ゾール、オキサゾール、チアゾール、イソキサゾール等、及びそれらのベンゾ融 合された誘導体、たとえばベンズイミダゾール等、６員環、たとえばピラン、ピ リジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ジオキソン等、及びそれらのベン ゾ−融合された誘導体、たとえばキノリン、イソキノリン、シンノリン等、及び 融合されていない環、たとえば２，２’−ビス−イミ ダゾール、２，２’−ビス（ピリジン）、等を包含する。ヘテロアリール基は、 任意には、ハロ、アルキルオキシ、アミノ、シアノ、非−オキソ−カルボニル、 アルキル、又は機能するインヒビターのために必要な結合又は錯化を立体的に排 除しない、電子供与するいづれか他の通常の置換基である。さらなる代表的なα 及びβ基は、メトキシメチル、アミノメチル、メチルアミノメチル、グアニジノ メチル、アミジノメチル、アニリノメチル、２，３−ジアミノプロピル、２−ア ミノ−３−ヒドロキシプロピル、２−アミノ−２−トリフルオロメチルエチル、 ２−ヒドロキシエチル、置換された芳香族炭化水素、たとえば２−メルカプトフ ェニル、２−ヒドロキシフェニル、２−アミノフェニル、２−カルボキシフェニ ル、及びそれらの置換された類似体、メチルアセトキシ、グリシンアミドメチル 、シクロヘキシルアミノメチル、及び同様のものを包含する。 代表的なγ基は１，８−ナフタレニレン、８−シンノリニル、５，６−フェナ ントレニレン、１，８−ジヒドロキシナフタレニレン、及び同様のものを包含し 、ここでフリー原子価を有する原子がヘテロ原子含有成分に結合されている。 一般的に、本発明の実施において有用な化合物は、60個よりも少ない、典型的 には36個よりも少ない炭素原子、及び20個よりも少ない、典型的には16個よりも 少ない、好ましくは12個よりも少ない、及びより好ましくは８個よりも少ないヘ テロ原子を含んで成るであろう。たとえば、本発明の実施において有用な代表的 なセリンプロテアーゼインヒビターは、その５−位に１個のＢp連結成分を有し 、そして任意には、その４’−又は５’−位に第２のベンズイミダゾリル成分を 有する２，２’−ビス（ベンズイミダゾール）を包含する。 特に、本発明の実施において有用な化合物は、次のものを包含す るが、但しそれらだけには限定されない：ビス（５−アミジノベンズイミダゾー ル−２−イル）メタン（化合物１）；ビス（５−アミノベンズイミダゾール）− メタノン（化合物２）；２−（５−アミノメチルベンズイミダゾール−２−イル メチル）ベンズイミダゾール；２−（５−アミノメチルベンズイミダゾール−２ −イルメチル）−５−メチルベンズイミダゾール（化合物７）；２−（５−アミ ノ−ベンズイミダゾール−２−イルメチル）ベンズイミダゾール（化合物４）； ２−ベンズイミダゾール−２−イルエチルベンズイミダゾール；２−（５−グア ニジノベンズイミダゾール−２−イルメチル）ベンズイミダゾール；２−（５− カルボキシベンズイミダゾール−２−イルメチル）−ベンズイミダゾール（化合 物８）；２−（イミダゾール−２−イルメチル）−５−アミジノベンズイミダゾ ール（化合物６）；５−アミジノ−２−イミダゾール−４−イルメチルベンズイ ミダゾール；５−アミジノ−２−ピリド−２−イルベンズイミダゾール（化合物 10）；５−アミジノ−２−ピリド−２−イルメチルベンズイミダゾール；１−（ ５−アミジノベンズイミダゾール−２−イル）−イソキノリン；２−（５−アミ ジノベンズイミダゾール−２−イル）キノリン；３−（５−アミジノベンズイミ ダゾール−２−イル）−イソキノリン；８−（５−アミジノベンズイミダゾール −２−イル）キノリン；５−アミジノ−２−（２−ヒドロキシフェニル）−ベン ズイミダゾール；５−アミジノ−２−（２−メルカプトフェニル）ベンズイミダ ゾール；及び５−アミジノ−２−（２−アミノフエニル）−ベンズイミダゾール 。 本発明の実施において有用な化合物は、既知の合成方法に従って調製され得る 。たとえばTidwellなど.，J．Med．Chem．(1978)21：613-623；及び“Comprehen sine Heterocyclic Chemistry”，Pergamon Press：Oxford，1988に記載される ような、置換され、そ して／又は融合された複素環式系及びそれらの異性体の合成のための一般的な方 法を参照のこと。インヒビターは、組成物の少なくとも約50重量％、典型的には 少なくとも約90重量％、好ましくは少なくとも99重量％を含んで成る粗混合物と して調製され得る。 本発明の実施において有用な代表的なプロテアーゼは、活性化されたプロテイ ンＣ、チマーゼ、キモトリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラス ターゼ、第VIIａ因子、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリ クレイン、β−ラクタマーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプタ ーゼ及びウロキナーゼを包含するが、但し、それらだけには限定されない。 薬理学及び実用性： 二価の金属カチオンとの会合において、又は二価の金属カチオンとのプレ−会 合された二元錯体として、本発明の実施において有用な及びその実施により同定 されるセリンプロテアーゼインヒビターは、セリンプロテアーゼの活性部位残基 と二価の金属カチオン三元錯体を形成し、そしてこれにより、その活性を阻害す る。本発明の実施において有用であり、そしてその実施により同定されるセリン プロテアーゼインヒビターは、（ａ）標的セリンプロテアーゼ上のＰ１部位を占 有する化学的官能基、及び（ｂ）酵素の触媒部位のHis57及びSer195の側鎖に関 与する四元錯体中に二価のカチオンを捕獲する構造的に隣接する二配座キレート 化剤を含んで成る。単一の組成物におけるＰ１結合及び二配座キレート化特性の 組合せは、二価のカチオン様亜鉛の生理学的レベルでセリンプロテアーゼ阻害の ために相乗効果を提供する。たとえば、典型的なＰ１認識要素をそれぞれ有する 、ベンズアミジン（化合物３）及びベンジルアミン（化合物５）は、セリンプロ テアーゼトリプシンの弱いインヒビターである。同様に、典型的な亜鉛金属イオ ン封鎖要素を含んで成る２ −ピリド−２−イルベンズイミダゾール（化合物９）は、トリプシンの阻害を引 き起こさない。しかしながら、典型的なＰ１結合及び亜鉛金属イオン封鎖要素の 構造的組合せを含んで成る５−アミジノ−２−ピリド−２−イル−ベンズイミダ ゾール（化合物10）は、トリプシンの可能性あるインヒビターである。従って、 本発明の実施において有用であり、そしてその実施により同定されるセリンプロ テアーゼインヒビターは、阻害を示すＫi（除去される亜鉛）≫Ｋi（添加される 亜鉛）の値が亜鉛の存在下で高められる場合、上記構造的必要条件を満たす。従 って、本発明の方法及び組成物は、セリンプロテアーゼのインビトロ及びインビ ボ阻害のために、セリンプロテアーゼインヒビターのスクリーニング及び同定の ために、及びタンパク質加水分解からペプチド及びタンパク質を保護するために 有用である。 インヒビター−亜鉛−セリンプロテアーゼ錯体のＸ線結晶学は、最新の生物理 学的方法論及び市販の装置を用いて得られる。そのような結晶学データは、セリ ンプロテアーゼインヒビターがセリンプロテアーゼ阻害の亜鉛強化のために必要 な構造的必要条件を有するかどうかを最終的に決定するために使用され得る。そ のようなＸ線結晶学決定の例は、下記に示される。 興味あるセリンプロテアーゼ酵素は次のものを包含するが、但しそれらだけに は限定されない：トリプシン様酵素、たとえばトリプシン、血漿カリクレイン、 組織カリクレイン、プラスミン、トロンビン及びトリプターゼ；キモトリプシン 様酵素、たとえばキモトリプシン、カテプシンＧ及びチマーゼ；エラスターゼ様 酵素、たとえば好中球エラスターゼ及びエラスターゼ；及びカルボキシペプチダ ーゼ様酵素。それらの酵素は、アポプトシス、血圧調節、癌、心血管機能、血液 凝固、溶菌、走化性、成長、消化、受精、ホルモン処 理、免疫応答、補体、感染、細菌、ウィルス及び寄生体性炎症、肥満細胞、他の 細胞、神経学、苦痛及びタンパク質分泌において役割を演じる。医薬におけるセ リンプロテアーゼ標的物は、心血管処理に関して、トロンビン、第Ｘａ因子、第 VIIａ因子、及びチマーゼ；感染性疾病、たとえば寄生体、ウィルス及び細菌に 関して、サイトメガロウィルスプロテアーゼ及びβ−ラクタマーゼ、病原体に対 して特異的なセリンプロテアーゼ、出血に関して、ウロキナーゼ、活性化された プロラインＣ及びtPA；炎症に関して、トリプターゼ、チマーゼ、好中球エラス ターゼ、血漿カリクレイン及び組織カリクレイン；及び神経学に関して、アルツ ハイマー病に関するセリンプロテアーゼを包含する（利用できる数種の標的物の みを示す場合）。 本発明の方法及び組成物は、セリンプロテアーゼを単離するために親和性カラ ムに使用され得る。さらに、本発明の実施において有用なセリンプロテアーゼイ ンヒビターはセリンプロテアーゼに対するそれらの特異性に関して変化するので 、本発明の方法及び組成物はセリンプロテアーゼを選択的に単離し、そして精製 するために使用され得る。これに関して、従来の技法は、支持体、ビーズ、高分 子、及び同様のものに種々の化合物を連結するために使用され得る。連結基は、 カルボキシル基、アミノ基、チオ基、活性化されたオレフィン、又は同様のもの を包含する。連結基は、阻害成分又は結合成分に結合され得る。カラム又は細管 の表面が親和性カラムとして使用され得、又はカラムが種々のビーズ、たとえば Sephadex、セファロース、ラテックスビーズ、又は同様のものにより充填され得 る。カラムが調製される特定の態様は、本発明の実施に対して決定的ではない。 さらに、カラムは、興味あるセリンプロテアーゼのために展開され得る結合プロ フィールを提供し、そして阻害の機構と して金属錯体を利用するインヒビターのライブラリーのための相対的Ｋi値を決 定することによって、種々のセリンプロテアーゼを検出するためのアッセイに使 用され得る。 本発明の実施において有用な及びそれにより同定されるセリンプロテアーゼイ ンヒビターはそれ自体、種々の疾病の処理のために有用である。たとえば、セリ ンプロテアーゼインヒビターは、臨床学的関節炎、滑膜炎、及び関連する病理学 の処理のために有用であり得る（たとえば、アメリカ特許第4,940,723号を参照 のこと）。本発明の実施において有用な及びそれにより同定されるセリンプロテ アーゼはまた、セリンプロテアーゼを包含する広範囲の種類の生物学的現象に関 係する生理学的工程の調査を可能にする。亜鉛を除去し、又は添加することによ ってセリンプロテアーゼ活性を変更することができる利点は、生理学的工程にお けるそのような活性の効果に基づく調査を可能にする。 さらに、本発明の二価の金属カチオン−セリンプロテアーゼインヒビター錯体 は、アッセイ媒体における亜鉛の濃度を変更する必要性を伴わないで、インヒビ ター−カチオン−セリンプロテアーゼ三元錯体を形成できるので、プレ−会合さ れたカチオン−インヒビター錯体は、インヒビターの阻害活性を同定するために 本発明の方法の実施において有用である。同様に、本発明の二価の金属カチオン −セリンプロテアーゼインヒビター錯体は、疾病の処理において有用であり、こ こでインヒビターが、標的組織に局部的に供給される（たとえば、皮膚又は眼へ の局部適用により、肺へのエアゾール供給により、等により）。 投与及び医薬組成物： 一般的に、本発明の二価の金属カチオン−セリンプロテアーゼインヒビター錯 体、及び本発明の実施において有用な及びそれにより 同定されるセリンプロテアーゼインヒビターは、当業界において知られている通 常の及び許容できる態様のいづれかを通して、単独で又は他の治療剤と組合して 、治療的有効量で投与されるであろう。治療的有効量は、疾病の重症度、対象の 年齢及び相対的健康、使用される化合物の有効性、及び他の要因に依存して広く 変化することができる。たとえば、喘息の処理のためのセリンプロテアーゼイン ヒビター又はその錯体の治療的有効量は、0.1μｇ／kg体重（μｇ／kg）／日〜 １mg／kg体重（mg／kg）／日、典型的には、１μｇ／kg／日〜0.1mg／kg／日の 範囲であり得る。従って、80kgの喘息のヒト患者のための治療的有効量は、10μ ｇ／日〜10mg／日、典型的には0.1mg／日〜10mg／日の範囲であり得る。 一般的に、個人的な知識及び本出願の開示を信頼して行動する当業者は、一定 の疾病を処理するためにセリンプロテアーゼインヒビターの治療的有効量を確か めることができるであろう。 セリンプロテアーゼインヒビターは、次の経路の１つにより医薬組成物として 投与され得る：経口、全身性（たとえば、経皮、鼻腔内又は坐剤による）又は非 経口（たとえば筋肉内、静脈内、又は皮下）。組成物は、錠剤、ピル、カプセル 、半固体、粉末、持効性製剤、溶液、懸濁液、エリキシル、エアゾール、又はい づれか他の適切な組成物の形を取ることができ、そして一般的に、少なくとも１ つの医薬的に許容できる賦形剤と組合してセリンプロテアーゼインヒビターから 構成される。許容できる賦形剤は、非毒性であり、投与を助け、そして活性成分 の治療効果に悪影響を与えない。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、又 はエアゾール組成物の場合、一般的に当業者に利用できる気体賦形剤であり得る 。 固体医薬賦形剤は、スターチ、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース 、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、 シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロー ルモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、及び同様のものを包含する。 液体及び半固体賦形剤は、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコー ル、及び種々の油、たとえば石油、動物、植物又は合成起原のもの（たとえばピ ーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、等）から選択され得る。特に、注射溶液 のための好ましい液体キャリヤーは、水、塩溶液、水性デキストロース及びグリ コールを包含する。 圧縮ガスが、活性成分をエアゾール形に分散するために使用され得る。この目 的のための適切な不活性ガスは、窒素、二酸化炭素、亜酸化窒素、等である。他 の適切な医薬キャリヤー及びそれらの配合物は、A.R．Alfonso Remington's Pha rmaceutical Sciences 1985，17th ed．Easton，Pa：Mack Publishing Company に記載されている。 組成物におけるセリンプロテアーゼインヒビター又はその金属カチオン錯体の 量は、配合物の型、単位用量のサイズ、賦形剤の種類、及び医薬科学の業者に知 られている他の要因に依存して、広く変化することができる。一般的に、セリン プロテアーゼ及びその金属カチオン錯体の組成物は、0.01重量％〜10重量％、好 ましくは0.3重量％〜１重量％の活性成分を含み、そして残りは賦形剤である。 好ましくは、医薬組成物は、連続処理のために単一単位用量形で、又は症候の軽 減が特に必要とされる場合、任意に単一単位用量形で投与される。 例１．インビトロ酵素阻害アッセイ 下記のものは、化合物のセリンプロテアーゼ阻害活性を測定するためのアッセ イを表わす。 パート（ａ）−亜鉛除去 アッセイ媒体（pH8.0に調節された緩衝溶液中、10％のDMSO；0.05％のポリオ キシエチレンソルビタンモノラウレート（Tween-20）；及び１mMのEDTAを含む） 中、ヒトトリプシン(3.4nM)及び試験化合物（種々の濃度）を、室温で１時間イ ンキュベートし、そして次に、基質Ｎ−トシル−gly−pro−lys−pNA(Sigma #T6 140、水中、0.5mM)を添加し、アッセイ混合物の最終濃度を0.125mMにした。基質 の加水分解を、405nmで５分間、分光光度的に追跡した。見掛けの阻害定数（Ｋi ）を、標準の数学的な態様を用いて、酵素進行曲線から計算した,。 パート（ｂ）−亜鉛による変更 亜鉛の存在下での阻害の測定のためのアッセイプロトコールを、パート（ａ） のために使用される条件と実質的に同等のアッセイ条件下で実施する。但し、ア ッセイ媒体はEDTAを含まず、そして100mMの原液の形での150μＭの塩化亜鉛によ り変性する。 バート（ｃ）−周囲の亜鉛 周囲レベルの亜鉛での阻害の測定のためのアッセイプロトコールを、パート（ ａ）に使用される条件と実質的に同等のアッセイ条件下で実施する。但し、アッ セイ媒体はEDTAを含まない。 例１におけるように進行して、式Ｉの化合物を、活性化されたプロテインＣ、 チマーゼ、キモトリプシン、第Ｘａ因子、第VIIａ因子、血漿カリクレイン、組 織カリクレイン、β−ラクタマーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、ト リプターゼ及びウロキナーゼに対するそれらの阻害活性について試験した。式Ｉ の化合物を、個々のプロテアーゼのために同定し、ここでパート（ｂ）により測 定される場合の化合物の阻害活性は、パート（ａ）により測定される場合の化合 物の阻害活性よりも少なくとも10倍、典型的には102〜 103倍高かった。 例１．パート（ｂ）（但し、媒体中の亜鉛濃度は10-9Ｍ〜10-4Ｍである）にお けるように進行して、アッセイを実施し、化合物の阻害活性を最大に増強するこ とが見出された最小亜鉛濃度は、0.1〜１μＭであったことを示した。 例２．インビトロ酵素阻害アッセイ 次のものは、金属緩衝剤の存在下での化合物のセリンブロテアーゼ阻害活性を 決定するためのアッセイを表わす。 パート（ａ）−亜鉛除去 アッセイ媒体（50mMのHEPES；150mMのNaCl；0.01％のPEG3350；30％のスクロ ース、4.5mMのオキサレートを含む；pH7.5に調節されている）中、サイトメガロ ウィスル(CMV)プロテアーゼ（50nM）及び試験化合物（種々の濃度）の混合物を 、室温で15分間インキュベートし、そして次に、基質ダブシル−arg−gly−val −val−asn−ala−ser−ser−arg−leu−ala−lys−Rsy−ダンシル（水中、４mM ）を添加し、アッセイ混合物の最終濃度を10μＭにした。基質の加水分解を、約 15分間、螢光学的に（ex 355nm，em 510nm）追跡した。見掛けの阻害定数（Ｋi ）を、標準の数学的な態様を用いて、酵素進行曲線から計算した。 パート（ｂ）−亜鉛による変更 亜鉛の存在下での阻害の測定のためのアッセイプロトコールを、パート（ａ） のために使用された条件と実質的に同等のアッセイ条件下で実施する。但し、ア ッセイが10μＭの亜鉛に変更される。 例２におけるように進行して、式１の化合物をCMVプロテアーゼに対するそれ らの阻害活性について試験した。式Ｉの化合物を同定し、ここでパート（ｂ）に より測定される場合の、CMVプロテアーゼに対する阻害活性は、パート（ａ）に より測定される場合の化合 物の阻害活性よりも30〜102倍高かった。 例２．パート（ｂ）（但し、CMVプロテアーゼの代わりにトリプシンを用い、 そして媒体中の亜鉛濃度は１×10-9Ｍ〜１×10-1Ｍである）におけるように進行 して、アッセイを行ない、セリンプロテアーゼインヒビターの阻害活性を最大に 増強するために必要とされる最小亜鉛濃度は0.1〜１μＭであったことを示した 。 表１ 次の表は、例１及び２に記載のようにして実施されたアッセイからの代表的な 結果を表わす。 例３．セリンプロテアーゼ−亜鉛−プロテアーゼ錯体のＸ−線結晶学 化合物３−トリプシンの結晶を、M．Krieger，L.M．Kay and R．Stroud，J．M ol Biol．83：209-230(1974)のバッチ５方法により、100mMのトリス(pH8.2)にお ける沈殿物としてMgSO4を用いて成長せしめた。化合物１−トリプシンは、新た に結晶化されず、そして化合物３−トリプシン結晶による播種によっても結晶化 されなかった。それらの結晶中にpH8.2で化合物１をソークするための初期試み は、このpHでのMgSO4−含有合成母液における化合物の制限された溶解性及び安 定性のために、好結果を生まなかった。さらに、pH8.2で、トリス緩衝液のみに おいて、化合物１は１時間以内に黄色に変わり、そして数時間後、沈殿し始めた 。pH5.9のMES緩衝液において、この転移は、数週間後、生じない。415mg／mlのM gSO4，100mMのトリス(pH8.2)又は415mg／mlのMgSO4，100mMのMES(pH 5.9)を含む合成母液に新たに溶解された化合物１の溶解度は、約100mMであるこ とが決定された。 化合物１−トリプシン(pH5.9)の結晶をまず、pH5.9で、飽和状態で、合成母液 における新たに溶解された化合物１に化合物３−トリプシン結晶をソークするこ とによって都合良く調製した。前記ソークを、新鮮なソークにより４度、１日約 １度、交換した。化合物１−トリプシン(pH8.2)の結晶を、0.1mMのZnSO4を含む 、pH8.2で、飽和状態での合成母液における新たに溶解された化合物１に化合物 ３−トリプシン結晶をソークすることによって都合良く調製した。前記ソークを 、新鮮なソークにより５度、１日約１度交換した。有意な量の黄色の沈殿物が、 １日後、ソーキング溶液に形成した。 個々のＩhk1データを、Siemens，Maltiwire Area Detector又は像プレート検 出機(Ｒ−軸−II(Rigaku Corporation))に基づいて、化合物３−トリプシン(pH8 .2)、化合物１−トリプシン(pH5.9)及びZn2+−化合物１−トリプシン(pH8.2)に ついて集めた。データを、KabschのXDSプログラム、又はMacromolecular Struct ure Curporation(The Woodland，Texas)により供給されるソフトウェア、及び索 引プログラムを用いて集めた。データ収集及び改良統計学が表２に列挙される。 化合物３−トリプシンの改良のためには、高く精製されたMIP−トリプシン構 造体が鋳型として作用した。MID Ｘ−線及び中性子構造体における活性部位領域 外の水分子が、初期相モデルに含まれた 異地図（J．L．Chambers & R．Stroud，Acta Cryst．335：1861-1875(1979)）の 交互サイクル、及びXPLOR（Brunger）による自動化された最小二乗法改良を用い て精製した。Difference Fourier地図 を、化合物３−トリプシン(pH8.2)と化合物１−トリプシン(pH5.9)又はZn2+−化 合物１−トリプシン(pH8.2)との間で計算し、次に同様にして精製される初期構 造体を得た。 差異地図は、Ｐ１ポケットを占有する化合物１の１つのアミジノベンズイミダゾ ール基を明確に示す。その化合物３部分は、化合物３−トリプシン構造体におい て、化合物３のための部粉と密接にオーバーレイする。pH8.2で、Zn2+−化合物 １−トリプシン錯体につい １の位置及び配向、並びに化合物１のイミダゾール窒素、His57のイミダゾール 及びSer195のOr原子の２つに調和するZn2+イオンの位 を明確に示す。従って、化合物１のナノモル濃度結合定数が、100nMよりも低い この金属の濃度でZn2+の共同作用により達成される。Zn2+イオンに関与する結合 距離は、他のZn2+−含有タンパク質において観察される距離に類似する。５つの リガンド−Zn2+−リガンドの角度の平均は114(11)6であるが、しかし化合物１リ ガンドのみ（Ｎ３−Zn2+−Ｎ３’）に関与する６番目の角度はわずか81°である 。化合物１分子は、化合物１のベンズイミダゾールがZn2+結合部位の一部の形成 を可能にするために、pH8.2で、トリプシン−化合物１−Zn2+の構造体における 変更された位置に軸を取る。その軸は、Ｐ１ポケットにおけるアミジン基の位置 のほんのわずかな変化を引き起こすが、しかし他のアミジン基の位置においては 、大きなシフト（〜５Å）を引き起こす。１つの末端アミジン窒素のNH基は、架 橋水素結合を通して主鎖カルボニル41と相互作用し、そして他の末端アミジン窒 素のもう１つのNH基は、対称関係の分子の主鎖カルボニル244との直接的な結合 を形成する。表２ 次の表は、トリプシン−化合物３、トリプシン−化合物１−SO4 -2(pH5.9)及び トリプシン−化合物１−Zn2+(pH8.2)の結晶学の結果を示す。 “抑制された”等方性温度因子はすべての構造体のために精製された。水素原 子は、化合物３−トリプシン構造体の精製に包含された。Ｂ：これは水を包含し ない。Ｃ：それらの基におけるすべての側鎖又は末端原子のための密度は弱く、 不在であり、そして温度因子は高かった。別々に不規則化された基は、このカテ ゴリーに含まれない。不良に定義された原子のための占有が精製された。ｄ：こｉ番目の観察である。Ｆ：Ｒ結晶＝Σ（Ｆa−Ｆe）／ΣＦe。８：理想的な結合 の長さ及び結合角度からの二乗平均偏差。 金属カチオン錯体、特に亜鉛、又は特に亜鉛を含む金属カチオン錯体を、活性 部位で固定することができる、Ｐ部位結合成分及び金属カチオンキレート化成分 を含んで成る化合物と、組合して使用することによって、ひじょうに活性的なセ リンプロテアーゼインヒビターが生成され得ることが、上記結果から明らかであ る。Ｐ部位結合成分を変性することによって、キレート化化合物は、高い特異性 を有する種々の異なったセリンプロテアーゼに方向づけされ得る。この態様にお いて、セリンプロテアーゼ活性を、生理学的工程の研究に、セリンプロテアーゼ の特異的基質であるタンパク質の分解を妨げることに、細菌学的作用の阻害に、 及び病理学が活性セリンプロテアーゼに関与している種々の徴候の処理において 、インビトロ及びインビボで阻害することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 クラーク，ジェームズ エム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94403, サン マテオ，ケホエ アベニュ 2400 (72)発明者 エルロッド，キール アメリカ合衆国，カリフォルニア 94555, フレモント，セッジ ストリート 4325 (72)発明者 ジェンキンス，トーマス イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94020, ラ ホンダ，レッドウッド ドライブ 16 (72)発明者 ケーツ，ブラッドリィ エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サン フランシスコ，アシュベリー スト リート 1019 ＃３ (72)発明者 ムーア，ウィリアム アール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94010, バーリンゲーム，バルボア アベニュ 1317 (72)発明者 ストルード，ロバート エム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94116, サン フランシスコ，キャスタネダ アベ ニュ 376

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．化合物のセリンプロテアーゼ阻害活性を測定するための方法であって、前 記化合物と、媒体に存在する二価の金属カチオンを有する媒体中のセリンプロテ アーゼとを接触せしめることを含んで成り、ここで前記カチオンが前記化合物と の相互作用のための能力、及びそれにより、前記化合物が有するいづれかのセリ ンプロテアーゼ阻害活性を強化する能力を有し、そして前記媒体中の二価の金属 カチオンの濃度がいづれかのそのような相互作用を引き起こすのに十分なレベル まで変更されることを特徴とする方法。 ２．前記二価の金属カチオンが、亜鉛及びコバルトから成る群から選択される 請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記二価の金属カチオンが亜鉛であり、そして前記亜鉛の濃度が少なくと も0.1μＭに変更される請求の範囲第２項記載の方法。 ４．前記亜鉛の濃度が少なくとも１μＭに変更される請求の範囲第３項記載の 方法。 ５．前記亜鉛の濃度が少なくとも100μＭに変更される請求の範囲第４項記載 の方法。 ６．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記セリンプロテアーゼが前記二価の金属カチオンによる阻害に対して敏 感であり、前記方法が、相互作用を引き起こすように 交換平衡により十分な二価の金属カチオンを供給しながら、前記セリンプロテア ーゼが二価の金属カチオンの存在により実質的に阻害されない程度まで、前記二 価の金属カチオンの自由濃度を減じることができる媒体に存在する金属緩衝剤を 有する媒体中で、前記化合物とセリンプロテアーゼとを接触せしめることをさら に含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 ８．前記二価の金属カチオンが亜鉛であり、前記亜鉛の濃度が少なくとも0.1 μＭに変更され、そして前記金属緩衝剤がオキサレートである請求の範囲第７項 記載の方法。 ９．セリンプロテアーゼインヒビターの阻害活性が二価の金属カチオンの存在 により強化されるかどうかを決定するための方法であって； （ａ）前記インヒビターによるセリンプロテアーゼの阻害についてアッセイし 、ここで前記アッセイは解離された二価金属カチオンを実質的に欠いている媒体 において実施され；そして （ｂ）前記化合物によるセリンプロテアーゼの阻害について、段階（ａ）に使 用されるアッセイ条件に対して実質的に同等な条件下でアッセイし、但し、段階 （ｂ）において実施されるアッセイは有効濃度の二価金属カチオンを含む媒体中 で実施されることを含んで成り； ここで段階（ｂ）により測定される場合の化合物の阻害活性が、段階（ａ）に より測定される場合の化合物の阻害活性よりも有意に高いことを特徴とする方法 。 10．前記二価の金属カチオンが亜鉛及びコバルトから成る群から選択され、そ して前記二価の金属カチオンが、カチオン金属イオン封鎖剤の存在により段階（ ａ）に使用される媒体から除去される請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記段階（ｂ）に使用される媒体における亜鉛の濃度が、少なくとも0.1 μＭに変更される請求の範囲第10項記載の方法・ 12．前記カチオン金属イオン封鎖剤がEDTAである請求の範囲第11項記載の方法 。 13．前記段階（ｂ）に使用される媒体における亜鉛の濃度が、少なくとも１μ Ｍに変更される請求の範囲第12項記載の方法。 14．前記段階（ｂ）に使用される媒体における亜鉛の濃度が、少なくとも100 μＭに変更される請求の範囲第13項記載の方法。 15．前記二価の金属カチオンが亜鉛であり、そして前記段階（ｂ）により測定 される場合の化合物の阻害活性が、前記段階（ａ）により測定される場合の化合 物の阻害活性よりも少なくとも10倍高い請求の範囲第14項記載の方法。 16．前記段階（ｂ）により測定される場合の化合物の阻害活性が、前記段階（ ａ）により測定される場合の化合物の阻害活性よりも少なくとも100倍高い請求 の範囲第15項記載の方法。 17．前記段階（ｂ）により測定される場合の化合物の阻害活性が、前記段階（ ａ）により測定される場合の化合物の阻害活性よりも少なくとも1000倍高い請求 の範囲第16項記載の方法。 18．前記セリンプロテアーゼが前記二価の金属カチオンによる阻害に対して敏 感であり、前記方法が、金属カチオンとの二元錯体又は金属カチオン及びプロテ アーゼとの三元錯体中に前記化合物のいづれか又はすべてを有するように平衡交 換により十分な二価の金属カチオンを供給しながら、前記セリンプロテアーゼが 二価の金属カチオンにより実質的に阻害されない程度まで、前記二価の金属カチ オンの自由濃度を減じることができる金属緩衝剤を含む媒体中で、段階（ａ）及 び（ｂ）において行なわれるアッセイを実施することをさらに含んで成る請求の 範囲第11項記載の方法。 19．前記金属緩衝剤がオキサレートである請求の範囲第18項記載の方法。 20．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第９項記載の方法。 21．セリンプロテアーゼ及びインヒビターを含んで成る媒体中でセリンプロテ アーゼインヒビターによりセリンプロテアーゼを阻害するための方法であって、 ここで前記インヒビターは、キレート化できる生理学的に許容する二価の金属カ チオンをキレート化するために相互に立体的な関係での２個のヘテロ原子を含ん で成り； 十分な量の二価の金属カチオンを有し、又は二価の金属カチオン錯体としてセ リンプロテアーゼに結合されるいづれかの又はすべてのインヒビターを有するよ うに媒体に十分な量の二価の金属カチオンを添加し、又は二価の金属カチオンが 二価の金属カチオンの三元錯体としてインヒビターとセリンブロテアーゼとの間 で結合されるように、二価の金属カチオン二元錯体としてインヒビターを供給す ることを含んで成る方法。 22．前記二価の金属カチオンが亜鉛である請求の範囲第21項記載の方法。 23．前記二価の金属カチオンがコバルトである請求の範囲第21項記載の方法。 24．前記２つのヘテロ原子が環の環内員である請求の範囲第21項記載の方法。 25．前記ヘテロ原子の少なくとも１つが、ベンズイミダゾール環 の環内員である請求の範囲第24項記載の方法。 26．前記インヒビターが亜鉛二元錯体として供給される請求の範囲第21項記載 の方法。 27．前記添加される亜鉛の量が、セリンプロテアーゼインヒビターの濃度に少 なくとも等しい濃度に媒体中の亜鉛濃度を変更するのに十分である請求の範囲第 21項記載の方法。 28．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリブシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第21項記載の方法。 29．セリンプロテアーゼ及びインヒビターを含んで成る媒体中で、ビス（ベン ズイミダゾール）を含んで成るセリンプロテアーゼインヒビターによりセリンプ ロテアーゼを阻害するための方法であって、ここで前記インヒビターが亜鉛をキ レート化するために立体的関係で前記ビス（ベンズイミダゾール）の窒素原子を 含んで成り、 亜鉛二元錯体としてセリンプロテアーゼに結合されるインヒビターのすべてを 有するよう前記媒体に十分な亜鉛を添加し、又は亜鉛錯体として前記インヒビタ ーを供給することを含んで成る方法。 30．前記ビス（ベンズイミダゾール）がアミジノ基により置換される請求の範 囲第29項記載の方法。 31．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から 選択される請求の範囲第29項記載の方法。 32．下記式Ｉ： {(BP)r-(I)}n(Y)q Ｉ 〔式中、 ｑは０でありそしてｎは１であり、又はｑは１でありそしてｎは２であり； Ｙは結合、又は６個よりも多くない、典型的には３個よりも多くない原子そし て好ましくは鎖中の炭素原子の連結基であり； Ｂpはセリンプロテアーゼの１又は複数のＰ部位に結合するための連結成分で あり； ｒは０又は１であり、但し少なくとも１つのＢp結合成分が存在し；そして Ｉは、ｎが２である場合、少なくとも１つのヘテロ原子を含んで成り、そして ｎが１である場合、少なくとも２個のヘテロ原子を含んで成る成分であり、ここ で２個のヘテロ原子は、二配座態様で二価の金属カチオンをキレート化できるよ う相互立体的関係で存在する〕 で表わされる化合物の二価の金属カチオン二元錯体。 33．請求の範囲第32項記載の二価の金属カチオン二元錯体及びセリンプロテア ーゼを含んで成る二価の金属カチオン三元錯体。 34．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第33項記載の三元錯体。 32．下記式II： (BP)r{α-(A)-β} II 〔式中、Ｂpはセリンプロテアーゼの１つの又は複数のＰ部位を結合するための 連結成分であり； ｒは０又は１であり、但し、少なくとも１つのＢp結合成分が存在し； Ａは結合、又はアルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレ ン、及びヘテロアリーレンから選択された連結基であり、この連結基は、１〜２ 個の原子によりα及びβを分離し、そして任意には、オキソ、ヒドロキシ、（Ｃ1-2 ）アルキルオキシ、ハロ、メルカプト（Ｃ1-2）アルキルチオ、アミノ、（Ｃ1-2 ）アルキルアミノ及びジ（Ｃ1-2）アルキルアミノから選択された１〜２個の 基により置換されていてもよく、ここでヘテロ原子が炭素又は水素のみに結合さ れ；そして α及びβはそれぞれ、独立して、２〜36個の炭素原子を含んで成る基であり、 そしてα及びβの個々内に含まれる少なくとも１つのヘテロ原子がＡの３個の原 子内にあり、そして他のヘテロ原子の６個の原子内にあり、α及びβは任意には 、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択された連結基を通して一緒に結合さ れていてもよく、前記基は任意には、オキソ、ヒドロキシ、（Ｃ1-2）アルキル オキシ、ハロ、メルカプト、（Ｃ1-2）アルキルチオ、アミノ、（Ｃ1-2）アルキ ルアミノ、及びジ（Ｃ1-2）アルキルアミノから選択された１〜２個の基により 置換されていてもよく、ここでヘテロ原子は、２個の関連するヘテロ原子が二価 の金属カチオンの二配座キレート化を促進するために相互立体的に関連して配置 されるような態様で、炭素又は水素のみに結合される〕で表わされる化合物の二 価の金属カチオン二元錯体。 36．前記α及びβは個々に、独立して、Ａに直接的に又は間接的 に結合された、（Ｃ3-18）ヘテロシクロアルキルもしくは（Ｃ5-18）ヘテロアリ ール成分を含んで成る基、又はヘテロ原子含有成分により置換された、（Ｃ2-18 ）アルキル、（Ｃ3-18）シクロアルキル、（Ｃ6-18）アリール、（Ｃ3-18）ヘテ ロシクロアルキルもしくは（Ｃ5-18）ヘテロアリール成分を含んで成る基であり 、ここでα及びβの個々内に含まれる少なくとも１つの環内又は非環内ヘテロ原 子がＡの２個の原子内及び他のヘテロ原子の４個の原子内に存在する請求の範囲 第35項記載の錯体。 37．前記α及びβは個々に、独立して、Ａに直接的に又は間接的に結合された 、（Ｃ3-12）ヘテロシクロアルキルもしくは（Ｃ5-12）ヘテロアリール成分を含 んで成る基、又はヘテロ原子含有成分により置換された、（Ｃ2-12）アルキル、 （Ｃ3-12）シクロアルキル、（Ｃ6-12）アリール、（Ｃ3-12）ヘテロシクロアル キルもしくは（Ｃ5-12）ヘテロアリール成分を含んで成る基であり、ここでα及 びβの個々内に含まれる少なくとも１つの環状又は非環状ヘテロ原子がＡの１つ の原子内に存在する請求の範囲第36項記載の錯体。 38．前記二価の金属カチオンが亜鉛であり、α及びβはそれぞれベンズイミダ ゾリルであり、γは１であり、そしてＢpは、塩基性窒素原子が炭素原子を通し てその５−位でα又はβに結合されている基を含んで成る請求の範囲第37項記載 の錯体。 39．前記Ｂpがアミノメチルである請求の範囲第38項記載の錯体。 40．前記Ｂpがアミジノである請求の範囲第38項記載の錯体。 41．セリンプロテアーゼと共に請求の範囲第35項記載の二元錯体を含んで成る 二価の金属カチオン三元錯体。 42．前記二価の金属カチオンが亜鉛である請求の範囲第41項記載の三元錯体。 43．前記αがベンズイミダゾール環である請求の範囲第42項記載の三元錯体。 44．前記ベンズイミダゾール環に結合されるＢpがアミジノである請求の範囲 第43項記載の三元錯体。 45．前記セリンプロテアーゼインヒビターが２−（５−アミジノ）ベンズイミ ダゾール−２−イルメチルベンズイミダゾールである請求の範囲第44項記載の三 元錯体。 46．前記セリンプロテアーゼインヒビターが、２−（５−アミノメチル）ベン ズイミダゾール−２−イルメチル−５−メチルベンズイミダゾールである請求の 範囲第44項記載の三元錯体。 47．前記セリンプロテアーゼインヒビターが、２−（５−カルボキシ）ベンズ イミダゾール−２−イルメチルベンズイミダゾールである請求の範囲第44項記載 の三元錯体。 48．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第41項記載の三元錯体。 49．下記式III： (BP){Xa-(γ)-Xb} III 〔式中、Ｂpはセリンプロテアーゼの１又は複数のＰ部位を結合するための結合 成分であり； γは６〜18個の炭素原子を含んで成る、芳香族又は非芳香族、飽和又は不飽和 の融合された多環式炭化水素であり；そして Ｘa及びＸbは独立して、γ内に含まれる環状ヘテロ原子、又はγに直接的に結 合された、ヘテロ原子含有成分であり、ここでＸa 及びＸbはお互いの６個の原子、典型的には４個の原子内にある〕 で表わされる化合物の二価の金属カチオン二元錯体。 50．セリンプロテアーゼと共に請求の範囲第49項記載の二元錯体を含んで成る 二価の金属カチオン四元錯体。 51．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第50項記載の四元錯体。 52．請求の範囲第１項記載の方法により同定されるセリンプロテアーゼインヒ ビター。 53．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第51項記載のセリンプロテアーゼインヒビ ター。 54．セリンプロテアーゼ活性が疾病の病理学及び／又は症候学に寄与する、動 物における疾病の処理方法であって、請求の範囲第１項記載の方法により同定さ れるセリンプロテアーゼインヒビターの治療的有効量を前記動物に投与すること を含んで成る方法。 55．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロン ビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼから成る群から選択される請 求の範囲第53項記載の方法。 56．セリンプロテアーゼ活性が疾病の病理学及び／又は症候学に寄与する、動 物における疾病の処理方法であって、請求の範囲第31項記載の錯体の治療的有効 量を前記動物に投与することを含んで成る方法。 57．前記セリンプロテアーゼが、活性化されたプロテインＣ、チマーゼ、キモ トリプシン、サイトメガロウィルスプロテアーゼ、エラスターゼ、第VIIａ因子 、第IXａ因子、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、β−ラクタ マーゼ、プラスミン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ及びウロキナーゼ から成る群から選択される請求の範囲第56項記載の方法。
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