JPH10512300A - カテプシンｋの阻害法 - Google Patents

カテプシンｋの阻害法

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JPH10512300A
JPH10512300A JP9517568A JP51756897A JPH10512300A JP H10512300 A JPH10512300 A JP H10512300A JP 9517568 A JP9517568 A JP 9517568A JP 51756897 A JP51756897 A JP 51756897A JP H10512300 A JPH10512300 A JP H10512300A
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JP
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cathepsin
center
atom
hydrophobic group
compound
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JP9517568A
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アブデル−メキド，シェリン・サラヘルディン
カー，トーマス・ジョゼフ
デスジャーレイス，レネー・ルイス
ギャラガー，ティモシー・フランシス
ハルバート，ステイシー・マリー
ジャンソン，シェリル・アン
マーキス，ロバート・ウェルズ・ジュニア
オー，ハイ−ジャ
ル，ユ
スミス，ワード・ホイットロック・ジュニア
トンプソン，スコット・ケビン
ベバー，ダニエル・フランク
ヤマシタ，デニス・シンジ
イェン，ジャック・フェクウォ
ツァオ，バオグァン
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SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 新規なカテプシンＫ結晶構造が同定されている。さらにこのプロテアーゼの阻害剤を同定する方法およびある種の構造的、物理的および空間的特徴を有する阻害剤を用いてカテプシンＫを阻害する方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 カテプシンＫの阻害法 発明の分野 本発明は、化合物が酵素の活性部位の特異的残基と相互作用することを可能と する、ある種の構造的、物理的および空間的特性を有する化合物を投与すること によりカテプシンＫを阻害する方法に関する。本発明の化合物と酵素の活性部位 の間での相互作用はカテプシンＫの活性を阻害し、これらの化合物は、骨粗鬆症 および歯周病などの、かかる阻害が必要とされる疾患を治療するのに有用である 。本発明はまた、カテプシンＫの新規な結晶構造、この酵素に対する新規な触媒 活性部位の同定および該活性部位の阻害剤の設計および選択を可能とする方法に 関する。 発明の背景 カテプシンＫは、システインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーであ る酵素群の構成員である。カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、ＮおよびＳは文献に記載され ている。最近、カテプシンＫポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードす るｃＤＮＡが米国特許第５５０１９６９号に開示された（その中ではカテプシン Ｏと言われている）。カテプシンＫは、最近になって、明示され、精製され、か つ特徴付けられた。Ｂossard,Ｍ.Ｊ.ら、（１９９６）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２７１、 １２５１７−１２５２４；Ｄrake,Ｆ.Ｈ.ら、（１９９６）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２７ １、１２５１１−１２５１６；Ｂromme,Ｄ.ら、（１９９６）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２ ７１、２１２６−２１３２。 カテプシンＫは、文献中、カテプシンＯ、カテプシンＸまたはカテプシンＯ２ と種々命名されている。カテプシンＫなる名称がより適切な命名であると考えら れる（Ｎomenclature Ｃommittee of the Ｉnternational Ｕnion of Ｂiochemi stry and Ｍolecular Ｂiologyにより付与された名称）。 システインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーのカテプシンは、ヒト を含む動物において、蛋白質分解の正常な生理学的プロセス、例えば、結合組織 の分解において機能する。しかしながら、体内でこれらの酵素が高レベルである ことは、疾患に至る病理学的状況をもたらし得る。かくして、カテプシンは、限 定されるものではないが、ニューモシスチス・カリニ、トリパノソーマ・クルー ジ、トリパノソーマ・ブルーセイおよびクリチジア・フシクラタによる感染症、 ならびにマラリア住血吸虫症、腫瘍転移、異染性白質萎縮症、筋ジストロフィー 、筋萎縮症などの種々の病態と関連付けられる。国際公開番号ＷＯ９４／０４１ ７２（１９９４年３月３日公開）およびその中に記載されている参考文献を参照 のこと。また、欧州特許出願ＥＰ０６０３８７３Ａ１およびその中に記載されて いる参考文献を参照のこと。ギンギパインと称されるピー・ギンギバルリス由来 の２種の細菌性システインプロテアーゼが、歯肉炎の病原と関係付けられている 。Ｐotempa,Ｊ.ら、(１９９４)Ｐerspectives in Ｄrug Ｄiscovery and Ｄesig n,２，４４５−４５８。 カテプシンＫは過度の骨または軟骨喪失の疾患の原因となると考えられる。骨 はヒドロキシアパタイトの紡錘または平面形結晶が組み込まれている蛋白質マト リックスで構成されている。Ｉ型コラーゲンは、約９０％の構造蛋白質を含有し てなる骨の主たる構造蛋白質である。マトリックスの残りの１０％が、オステオ カルチン、プロテオグリカンス、オステオポンチン、オステオネクチン、トロン ボスポンジン、フィブロネクチンおよび骨シアロ蛋白質を包含する、多くの非コ ラーゲン蛋白質からできている。骨格は生涯を通して個々の病巣で改造作用を受 けている。これらの病巣または改造単位は、骨吸収期、つづいて骨置換期からな るサイクルを受ける。 骨吸収は、造血系統の多核細胞である破骨細胞により行われる。破骨細胞は骨 表面に吸着し、密閉ゾーンを形成し、つづいてその先端（すなわち、再吸収）表 面に襞をとる広範囲の膜を形成する。これは波うち膜におけるプロトンポンプに より酸性化されている骨表面上に密閉された細胞外区画を造り、その中に破骨細 胞は蛋白質分解酵素を分泌する。その区画の低ｐＨは骨表面でヒドロキシアパタ イト結晶を溶かし、一方で蛋白質分解酵素が蛋白質マトリックスを消化する。こ のようにして、吸収窩または窪みが形成される。該サイクルのこの期の終わりに 、破骨細胞は、新たな蛋白質マトリックスを構築し、それはその後に鉱物状とさ れる。骨粗鬆症およびパジェット病などの数種の病態において、骨吸収と形成の 正常な均衡が壊れ、各サイクルで骨喪失が生じる。最終的に、これにより骨が弱 くなり、小さな衝撃で骨折する危険性が増加する結果となる。 破骨細胞におけるカテプシンＫに富む選択的発現は、この酵素が骨吸収に不可 欠であることを強く示唆する。かくして、カテプシンＫの選択的阻害は、骨粗鬆 症、歯肉炎および歯周病などの歯肉疾患、パジェット病、悪性疾患の高カルシウ ム血症、および代謝性骨疾患を包含するが、これに限定されない、過度の骨喪失 の疾患に対して効果的な治療手段を付与する。カテプシンＫの高濃度はまた、変 形性関節炎の滑膜の軟骨吸収細胞においても測定される。すなわち、カテプシン Ｋの選択的阻害はまた、変形性関節炎およびリウマチ様関節炎を包含するが、こ れに限定されない、過度の軟骨またはマトリックス分解の疾患の治療に有用であ る。転移性腫瘍細胞はまた、典型的には、周辺のマトリックスを分解する蛋白質 分解酵素を高濃度で発現する。かくして、カテプシンＫの選択的阻害はまた、あ る種の腫瘍疾患の治療にも有用である。 意外にも、広範囲の、構造的に異なる種類の化合物が、その化合物がカテプシ ンＫの活性部位の特異的残基と相互作用することを可能とする共通の構造的、物 理的および空間的特性を有し、骨吸収の阻害が必要とされる疾患、例えば骨粗鬆 症および歯周病の治療に有用であることが見いだされた。したがって、本発明は 以下の特性を有する化合物を用いるカテプシンＫの阻害方法に関する。 発明の要約 一の態様において、本発明は、化合物がカテプシンＫの活性部位の特異的残基 と相互作用することを可能とする、ある種の構造的、物理的かつ空間的特性を有 する化合物を投与することによりカテプシンＫを阻害する方法を提供する。この 相互作用はカテプシンＫの活性を阻害し、かくして骨吸収が要因である疾患を治 療する。 別の態様において、本発明は結晶形の新規なシステインプロテアーゼを提供す る。 もう一つ別のの態様において、本発明は、表ＸＸIXに列挙されたアミノ酸残基 の原子により形成される三次元触媒部位により特徴付けられる新規なプロテアー ゼ構造物を提供する。 さらにもう一つ別の態様において、本発明は前記した構造物の阻害剤の識別方 法であって、本発明のプロテアーゼ構造をコンピューターで処理されたモデルシ ステムに整合させ；その構造に結合するであろう化合物を識別し；そしてカテプ シンＫ阻害生物活性について識別された化合物またはその化合物由来のアナログ をスクリーニングする工程からなる方法を提供する。 本発明の他の態様および利点を、以下のその好ましい具体例の詳細な記載にお いてさらに記載する。 図面の簡単な記載 図１は他のシステインプロテアーゼのアミノ酸配列と一緒に並べられたカテプ シンＫのアミノ酸配列を示す。 図２はカテプシンＫの帯状図である。アミノおよびカルボキシル末端はＮおよ びＣで示される。図面はプログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴ［Ｋraulis,Ｐ.,Ｊ.Ａpp l.Ｃrystallogr.,２４，９４６−９５０（１９９１）］を用いて作成した。 図３はシステインプロテアーゼの公知阻害剤であるＥ−６４と一緒にしたカテ プシンＫの帯状図である。この図面はプログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴを用いて作 成した。 図４ａはカテプシンＫの活性部位の説明図である。図４ｂはカテプシンＫの活 性部位の立体図である。簡単にするため、水素原子または水分子は図示していな い。 図５ａ−１３ａはカテプシンＫの新規阻害剤と一緒にしたカテプシンＫの活性 部位の説明図である。図５ｂ−１３ｂはカテプシンＫの新規阻害剤と一緒にした カテプシンＫの活性部位の立体図である。これらの図面は、各阻害剤と、阻害剤 の５Åの範囲内にあるカテプシンＫの活性部位の残基のあらゆる原子との相互作 用を描写する。簡単にするため、水素原子または水分子は図示していない。 表Ｉは本発明のカテプシンＫ結晶構造の三次元蛋白質座標を提供する。 表II−Ｘは本発明の特異的阻害剤と一緒にしたカテプシンＫのついての三次元 座標を提供する。 表XI−ＸIXは、蛋白質の５Åの範囲内にあるすべての阻害剤原子について、阻 害剤と蛋白質の原子の間の３つの原子の角度の一覧表を提供する。 表ＸＸ−ＸＸVIIIは、蛋白質の５Åの範囲内にあるすべての阻害剤原子につい て、阻害剤と蛋白質の原子の間の距離の一覧表を提供する。 表ＸＸIXは触媒部位のアミノ酸残基の原子を提供する。 発明の詳細な記載 本発明は新規なシステインプロテアーゼ結晶構造、新規なシステインプロテア ーゼ活性部位、およびプロテアーゼ阻害剤化合物を識別するためにその結晶形お よび活性部位を用いる方法を提供する。 特に、本発明は、化合物が特異的残基と相互作用することを可能とするある種 の構造的、物理的および空間的特性を有する化合物を投与することによるカテプ シンＫの阻害方法を提供する。 詳細には、本発明において用いるカテプシンＫの阻害剤は、以下の２またはそ れ以上の領域と相互作用する： １．チロシン６７側鎖； ２．メチオニン６８、ロイシン２０９、アラニン１６３、アラニン１３４およ びチロシン６７の一部に由来の原子を並べた疎水性ポケット； ３．グリシン６６のアミドにより得られる窒素に結合する水素； ４．システイン２５の活性部位の求核原子； ５．グルタミン２１、システイン２２およびグリシン２３残基と相互作用する 主鎖； ６．トリプトファン１８４の側鎖；および ７．グルタミン１４３およびアスパラギン１６１の側鎖原子およびアラニン１ ３７およびセリン１３８の主鎖と接触する疎水基。 好ましくは、本発明にて用いるカテプシンＫの阻害剤は、活性部位の３または それ以上の前記した領域と相互作用する。 本発明の方法にて用いる化合物は、親電子的炭素と、その中心が該炭素から５ .４４−６.９４Åの距離にある疎水基またはその中心が該炭素から９.２４−１ １.２４Åの距離にある芳香族基のいずれか、または疎水基と芳香族基であって 、この場合、これら２つの基の中心が１５.６７−１６.６７Å離れている両方の 基を有する。これらの特徴はカテプシンＫ活性部位と適宜相互作用しうるもので なければならない。親電子的炭素原子はアミノ酸システイン２５上の側鎖硫黄原 子（ＳＧ）から１.７−４.０Åの距離になければならない。疎水基は、側鎖原子 の中心と疎水基の中心が適当な距離幅（括弧内）にある以下のアミノ酸の近くに なけらばならない：チロシン６７（４.９１−５.９１Å）、メチオニン６８（５ .７４−６.７４Å）、アラニン１３４（４.１５−５.１５Å）、ロイシン１６０ （６.１８−７.１８Å）およびロイシン２０９（５.７１−６.７１Å）。芳香族 基はトリプトファン１８４（４.１０−７.１０Å）またはトリプトファン１８８ （４.１０−７.１０Å）のいずれかまたはその両方の近くになけらばならない。 本発明の阻害剤の鍵となる構造的特徴は、親電子的炭素、好ましくはカルボニ ル基の炭素、疎水基、好ましくはイソブチル基、および芳香族基、好ましくはフ ェニル基を有することである。阻害剤の疎水性炭素は、２個のイソブチル基のよ うな２個の疎水基と、または２個のフェニル基のような２個の芳香族基と、また は１個の疎水基および１個の芳香族基と一緒に同じ化合物中にあってもよい。 適当には、本発明のカテプシンＫを阻害する方法は、カテプシンＫの阻害を必 要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、空間的にカテプシンＫの活性部位に適合 する、以下の２またはそれ以上の基を含有してなる、化合物を投与することから なる： （ｉ）システイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素原子（ここに、該 親電子炭素原子は該硫黄原子から１.７−４.０Åの距離にある）； （ii）トリプトファン１８４と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心 とトリプトファン１８４の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０−７.１０Åであ る）； （iii）チロシン６７、メチオニン６８、アラニン１３４、ロイシン１６０お よびロイシン２０９と相互作用し、疎水性ポケットを形成し、該疎水基の中心と 該疎水性ポケットのアミノ酸残基の側鎖原子の中心の間で一定の距離幅を有し、 それがチロシン６７：４.９１−５.９１Å、メチオニン６８：５.７４−６.７４ Å、アラニン１３４：４.１５−５.１５Å、ロイシン１６０：６.１８−７.１８ Åおよびロイシン２０９：５.７１−６.７１Åである疎水基； （iv）チロシン６７と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心とチロシ ン６７の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０−７.１０Åである）； （ｖ）グリシン６６のアミドの窒素により得られる水素原子と相互作用する、 ７未満のｐＫaを有するアミノ基または酸素原子（ここに、これら２個の原子の 間の距離は２.７−３.５Åである）； （vi）グルタミン２１、システイン２２およびグリシン２３の主鎖原子と相互 作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心とグルタミン２１、システイン２２お よびグリシン２３の中心の間の距離は、各々、３.７−５.４、４.９−５.７およ び５.４−６.７Åである）；または （vii）グルタミン１４３およびアスパラギン１６１の側鎖原子およびアラニ ン１３７およびセリン１３８の主鎖と相互作用する疎水基（ここに、疎水基の中 心とグルタミン１４３、アスパラギン１６１、アラニン１３７およびセリン１３ ８の中心の間の距離は、各々、７.９−９.６Å、４.７−５.４Å、４.２−５.５ Åおよび４.６−６.４Åである）。 好ましくは、本発明で用いるカテプシンＫの阻害剤は、前記のもの３またはそ れ以上を有してなる。 適当には、本発明のカテプシンＫの阻害法は、それを必要とする哺乳動物、好 ましくはヒトに、カテプシンＫの活性部位に空間的に適合する、以下の基を有し てなる、化合物を投与することからなる： （ｉ）システイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素原子（ここに、該 親電子炭素原子は該硫黄原子から１.７−４.０Åの距離にある）；および （ii）トリプトファン１８４と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心 とトリプトファン１８４の側鎖原子の中心の距離は４.１０−７.１０Åである） 。好ましくは、トリプトファン１８４と相互作用する該疎水基は芳香族基であり 、この芳香族基の中心はシステイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素の 中心から９.２４−１１.２４Åの距離にある。 好ましくは、システイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素はカルボニ ル炭素である。 適当には、本発明の方法は、 中心が親電子炭素から５.４４−６.９４Åの距離にあり； チロシン６７、メチオニン６８、アラニン１３４、ロイシン１６０およびロイ シン２０９と相互作用し、疎水性ポケットを形成し；および 疎水基の中心と該疎水性ポケットのアミノ酸残基の側鎖原子の中心の間で、チ ロシン６７：４.９１−５.９１Å、メチオニン６８：５.７４−６.７４Å、アラ ニン１３４：４.１５−５.１５Å、ロイシン１６０：６.１８−７.１８Åおよび ロイシン２０９：５.７１−６.７１Åの距離幅を有する 疎水基を含む化合物からなる。好ましくは、この疎水基はイソブチル基である。 また、本発明の方法は、さらに、疎水基の中心とチロシン６７の側鎖原子の中 心の距離が４.１０−７.１０Åである、チロシン６７と相互作用する疎水基を有 する化合物からなる。好ましくは、この疎水基は芳香族基である。 別法として、本発明の方法は、さらに、７未満のｐＫaを有するアミノ基また は酸素原子を有する化合物からなり、その各々がグリシン６６のアミド窒素によ り付与される水素原子と相互作用する（これら２個の原子の距離は２.７−３.５ Åである）。好ましくは、該化合物は、カルボニル基の酸素原子またはヒドロキ シル基の酸素原子などの酸素原子を含有してなる。 あるいは、本発明の方法は、さらに、グルタミン２１、システイン２２および クリシン２３の主鎖原子と相互作用する疎水基を有する化合物であって、その疎 水基の中心とグルタミン２１、システイン２２およびグリシン２３の中心の間の 距離は、各々、３.７−５.４、４.９−５.７および５.４−６.７Åである化合物 からなる。好ましくは、この疎水基はイソブチル基である。 また、本発明の方法は、さらに、グルタミン１４３およびアスパラギン１６１ の側鎖原子と、アラニン１３７およびセリン１３８の主鎖と相互作用する疎水基 を有する化合物であって、その疎水基の中心とグルタミン１４３、アスパラギン １６１、アラニン１３７およびセリン１３８の中心の間の距離が、各々、７.９ −９.６Å、４.７−５.４Å、４.２−５.５Åおよび４.６−６.４Åである化合 物からなる。 本発明の方法にて用いる化合物は、限定するものではないが、以下のもの： ３（Ｓ）−３［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシル］アミノ− ５−メチル−１−（１−プロポキシ）−２−ヘキサノン； ４−［Ｎ−［（４−ピリジルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１− ［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノ ン； ４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−Ｎ− ［Ｎ−（メチル）−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノン； ４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−［Ｎ −［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノン； ビス−（Ｃbz−ロイシニル）−１，３−ジアミノプロパン−２−オン； ２−［Ｎ−（３−ベンジルオキシベンゾイル）］−２'−［Ｎ'−（Ｎ−ベンジ ルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル）］カルボヒドラジド； （１Ｓ）−Ｎ−［２−［（１−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−メチ ルベンジル］チアゾール−４−イルカルボニル］−Ｎ'−（Ｎ−ベンジルオキシ カルボニル−Ｌ−ロイシニル）ヒドラジド； １−Ｎ−（Ｎ−イミダゾール アセチル−ロイシニル）−アミノ−３−Ｎ−（ ４−フェノキシ−フェニル−スルホニル）−アミノ−プロパン−２−オン；およ び ２,２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニルカルボヒ ドラジド； またはその医薬上許容される塩を包含する。 本明細書に記載するように、システイン２５の側鎖硫黄原子での阻害剤の相互 作用は、阻害剤が「親電子炭素」原子を含有することが要求される。この語は電 子不足炭素を意味する。この語は、限定するものではないが、カルボニル炭素原 子を包含する。この語はまた、エポキシド、チオカルボニル、イミンおよびニト リルを包含する。適当には、この語は、式：−Ｃ＝Ｎ−Ｘ（式中、Ｘは所望によ り環のＣに結合していてもよく、またはＸはＣＨ2、Ｈ、Ｏ、ＳまたはＮＲa（こ こに、ＲaはＣ1-4アルキルのＨである）で表すことができる。 トリプトファン１８４またはチロシン６７と相互作用する疎水基は、限定され るものではないが、芳香族基を包含する。これらの疎水基は、後記する、フェニ ル、Ｃ1-6アルキルおよびヘテロアリールを包含する。チロシン６７、メチオニ ン６８、アラニン１３４、ロイシン１６０およびロイシン２０９に由来の原子で ラインを形成する疎水性ポケットと相互作用する疎水基は、イソブチルだけでな く、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-6シクロアルキルおよびアダマンチルを包含する。グル タミン２１、システイン２２およびグリシン２３の主鎖原子またはグルタミン１ ４３およびアスパラギン１６１の側鎖原子およびアラニン１３７およびセリン１ ３８の主鎖と相互作用する疎水基は、Ｃ1-10アルキル、ＣbＦ2b+1（ここに、ｂ は１〜３である）、アリールまたはヘテロアリール（その各々は後記と同意義で ある）を包含する。 本明細書にて用いる場合、「中心」なる語は、中心のＸ座標を得るためにその 原子のＸ座標を平均し、中心のｙ座標を得るために原子のｙ座標を平均し、およ び中心のｚ座標を得るために原子のｚ座標を平均することで算定した所定の原子 の位置を意味する。 本発明の方法にて用いる化合物は、限定するものではないが、式（Ｉ）： ［式中、 Ｄは、 であり； Ｑは、 であり； ここに、 Ａは、不在、 であり； Ｂは、 であり； ＬはＣ2-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキル、ＣＨ(Ｒ66)Ｎ Ｒ60Ｒ68、ＣＨ(Ｒ66)Ａr、ＣＨ(Ｒ66)ＯＡr'、ＮＲ66Ｒ67であり； ＭはＣ(Ｏ)、ＳＯ2であり； Ｇは、 であり； ＪはＣ(Ｏ)、ＳＯ2であり； ＴはＡr、Ｈetであり； ＶはＣ3-7シクロアルキルであり； ＷはＨ、-ＣＮ、-ＣＦ3、-ＮＯ2、-ＣＯＲ7、-ＣＯ2Ｒ6、-ＣＯＮＨＲ6、-Ｓ Ｏ2ＮＨＲ6、-ＮＨＳＯ2Ｒ6、-ＮＨＣＯＲ7、-ＯＣＯＲ6、-ＳＲ6、ＮＲ'Ｒ6、 ＮＲ'(Ｃ＝ＮＨ)ＮＨＲ5、Ｃl、Ｂr、Ｉ、Ｆであり； Ｘ、ＹまたはＺはＮ、Ｏ、ＳまたはＣＲ4である； ただし、Ｘ、ＹおよびＺのうち少なくとも２つはヘテロ原子であって、Ｘ、Ｙ およびＺのうち少なくとも１つはＮであるか、またはＸ、ＹおよびＺのうち少な くとも１つはＣ＝Ｎ、Ｃ＝ＣまたはＮ＝Ｎであって、他の２つはＣＲ4またはＮ である；ただし、Ｘ、ＹおよびＺは合わせて少なくとも２個のＮからなる； ・・・・は、５員複素環における単結合または二重結合を意味し； ｍは０、１または２であり； ｎは１ないし６であり； ｆは０、１または２であり； Ａrは１またはそれ以上のＰh-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキル、Ｃ1-6ア ルコキシ、Ｐh-Ｃ0-6アルコキシ、Ｈet-Ｃ0-6アルコキシ、ＯＨ、(ＣＨ2)1-6Ｎ Ｒ58Ｒ59またはＯ(ＣＨ2)1-6ＮＲ58Ｒ59で置換されていてもよいフェニルまたは ナフチルであり； Ａr'は１またはそれ以上のＰh-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキル、Ｃ1-6ア ルコキシ、Ｐh-Ｃ0-6アルコキシ、Ｈet-Ｃ0-6アルコキシ、ＯＨ、(ＣＨ2)1-6Ｎ Ｒ58Ｒ59、Ｏ(ＣＨ2)1-6ＮＲ58Ｒ59またはハロゲンで置換されていてもよいフェ ニルまたはナフチルであり； Ｒ'はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ1はＨ、Ｃ1-6アルキルであり； Ｒ2はＣ4-6アルキル、Ｃ4-6アルケニル、ベンジルであり； Ｒ3はＣ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキル、Ｒ5ＣＯ-、 Ｒ5ＳＯ2-、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)-、Ｒ5ＮＨＣＯ-であり； Ｒ4はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ5はＡr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ6はＨ、Ｃ1-6アルキル、ＣＨ2ＣＦ3、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アル キルであり； Ｒ7はＣ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ8はＨ、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｈet、ＡrまたはＣ1-6アルキ ルであり、所望により、ＯＲ'、ＳＲ'、ＮＲ'2、ＣＯ2Ｒ'、ＣＯ2ＮＲ'2、Ｎ(Ｃ ＝ＮＨ)ＮＨ2、ＨetまたはＡrで置換されていてもよく； Ｒ9はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ10はＣ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ11はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ1-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルまたは Ｒ12はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ13はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ15はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ａr、Ｈetま たはＯＲ9、ＮＲ9 2、ＣＯＮＲ9 2、Ｎ(Ｃ＝ＮＨ)ＮＨ-、ＨetまたはＡrで置換さ れていてもよいＣ1-6アルキルであり； Ｒ16はＣ2-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ａr、Ｈetまたは ＯＲ9、ＳＲ9、ＮＲ2 9、ＣＯ2Ｒ9、ＣＯＮＲ9 2、Ｎ(Ｃ＝ＮＨ)ＮＨ-、Ｈetまた はＡrで置換されていてもよいＣ2-6アルキルであり； Ｒ19はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ａr、Ｈetま たはＯＲ9、ＳＲ9、ＮＲ9 2、ＣＯ2Ｒ9、ＣＯＮＲ9 2、Ｎ(Ｃ＝ＮＨ)ＮＨ-、Ｈet またはＡrで置換されていてもよいＣ1-6アルキルであり； Ｒ17またはＲ72はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ｒ10、Ｒ10Ｃ(Ｏ)-、Ｒ10Ｃ(Ｓ)-、Ｒ1 0 ＯＣ(Ｏ)-であり； Ｒ21またはＲ26はＣ5-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ3-11シクロアルキル、 Ｔ-Ｃ3-6アルキル、Ｖ-Ｃ1-6アルキル、Ｔ-Ｃ2-6アルケニル、Ｔ-(ＣＨ2)nＣＨ( Ｔ)(ＣＨ2)nであり、所望により１または２個のハロゲン、ＳＲ20、ＯＲ20、Ｎ Ｒ20Ｒ27またはＣ1-4アルキルで置換されていてもよく； Ｒ27はＲ28ＣＯ、Ｒ28ＯＣＯであり； Ｒ28はＣ1-6アルキル、Ｃ3-11シクロアルキル、Ａr、Ｈet、Ｔ-Ｃ1-6アルキル 、Ｔ-(ＣＨ2)nＣＨ(Ｔ)(ＣＨ2)nであり、所望により１または２個のハロゲン、 ＳＲ20、ＯＲ20、ＮＲ20Ｒ73またはＣ1-6アルキルで置換されていてもよく； Ｒ20、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25またはＲ73はＨ、Ｃ1-4アルキル、Ａr-Ｃ0-6ア ルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ29は Ｃbz-ロイシニル-、２-、３-または４-ピリジルメチルオキシカルボニルロイシ ニル-；４-イミダゾールアセチル-ロイシニル-、フェニルアセチル-ロイシニル- 、Ｎ,Ｎ-ジメチル-グリシニルロイシニル、４-ピリジルアセチル-ロイシニル-、 ２-ピリジルスルホニル-ロイシニル-、４-ピリジルカルボニル-ロイシニル、ア セチル-ロイシニル、ベンゾイル-ロイシニル、４-フェノキシ-ベンゾイル-、２- または３-ベンジルオキシベンゾイル-、ビフェニルアセチル、アルファ-イソブ チル-ビフェニルアセチル、Ｃbz-フェニルアラニニル、Ｃbz-ノルロイシニル-、 Ｃbz-ノルバリニル-、Ｃbz-グルタミル-、Ｃbz-イプシロン-(ｔ-ブチルエステル )-グルタミル、アセチル-ロイシニル-、６-または８-キノリンカルボニル、ビフ ェニルアセチル、アルファ-イソブチル-ビフェニルアセチル、アセチル、ベンゾ イル、２-または３-ベンジルオキシベンゾイル、４-フェノキシベンゾイル-、Ｃ bz -アミノ酸、２-、３-または４-ピリジルメチルオキシカルボニル-アミノ酸-、ア リールＣ0-Ｃ6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6 アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、アリールＣ0−Ｃ6アルキルオキシカルボ ニル-アミノ酸-、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸- 、Ｃ1-6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、Ｃ1−Ｃ6アルキルカルボニル、 アリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボ ニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキル カルボニル、Ｃ1−Ｃ6アルキルスルホニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニ ル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルス ルホニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニルであり； Ｒ30はＨ、Ｃ1-6アルキルであり； Ｒ31は Ｃbz-ロイシニル-、２-、３-または４-ピリジルメチルオキシカルボニル-ロイシ ニル-；４-イミダゾールアセチル-ロイシニル-、フェニルアセチル-ロイシニル- 、Ｎ,Ｎ-ジメチル-グリシニルロイシニル、４-ピリジルアセチル-ロイシニル-、 ２-ピリジルスルホニル-ロイシニル-、４-ピリジルカルボニル-ロイシニル、ア セチル-ロイシニル、ベンゾイル-ロイシニル、４-フェノキシ-ベンゾイル-、２- または３-ベンジルオキシベンゾイル-、ビフェニルアセチル、アルファ-イソブ チル-ビフェニルアセチル、Ｃbz-フェニルアラニニル、Ｃbz-ノルロイシニル-、 Ｃbz-ノルバリニル-、Ｃbz-グルタミル-、Ｃbz-イプシロン-(ｔ-ブチルエステル )-グルタミル、アセチル-ロイシニル-、６-または８-キノリンカルボニル、ビフ ェニルアセチル、アルファ-イソブチル-ビフェニルアセチル、アセチル、ベンゾ イル、２-または３-ベンジルオキシベンゾイル、４-フェノキシベンゾイル-、Ｃ bz-アミノ酸、２-、３-または４-ピリジルメチルオキシカルボニル-アミノ酸-、 アリールＣ0-Ｃ6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6 アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、アリールＣ0−Ｃ6アルキルオキシカル ボニル-アミノ酸-、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルオキシカルボニル-アミノ 酸-、Ｃ1-6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、Ｃ1−Ｃ6アルキルカルボニル 、アリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルカル ボニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキ ルカルボニル、Ｃ1−Ｃ6アルキルスルホニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホ ニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキル スルホニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニルであり； Ｒ32はＯＣＨ2Ａr、ＯＣＨ2Ｃ1-6アルキル、アリール置換Ｃ0-6アルキル、ヘ テロアリール置換Ｃ0-6アルキル、４-イミダゾールメチレン、２-、３-または４ -ピリジルメチレンオキシ、４-ピリジルメチレン、２-ピリジルスルホニル、４- ピリジル、アリール置換Ｃ0-6アルキルオキシ、ヘテロアリール置換Ｃ0-6アルキ ルオキシであり； Ｒ33はＣ1-6アルキル、-ＣＨ2Ｐh、-ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｒ34であり； Ｒ34はＨ、Ｃ1-6アルキルであり； Ｒ35はＡr、ＨetＡrであり； Ｒ36はアリール、ヘテロアリール、ピリジル、イソキノリニル； Ｒ37はＣ1-6アルキル、-ＣＨ2Ｐh、-ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｒ34であり； Ｒ38はＣbz、Ｃ1-6アルキルまたはアリール置換Ｃbz、Ｃ1-6アルキル-ＣＯ、 ベンゾイル、Ｃ1-6アルキルまたはアリール置換ベンゾイルであり； Ｒ39は Ｃbz-ロイシニル-、２-、３-または４-ピリジルメチルオキシカルボニル-ロイシ ニル-；４-イミダゾールアセチル-ロイシニル-、フェニルアセチル-ロイシニル- 、Ｎ,Ｎ-ジメチル-グリシニルロイシニル、４-ピリジルアセチル-ロイシニル-、 ２-ピリジルスルホニル-ロイシニル-、４-ピリジルカルボニル-ロイシニル、ア セチル-ロイシニル、ベンゾイル-ロイシニル、４-フェノキシ-ベンゾイル-、２- または３-ベンジルオキシベンゾイル-、ビフェニルアセチル、アルファ-イソブ チ ル-ビフェニルアセチル、Ｃbz-フェニルアラニニル、Ｃbz-ノルロイシニル-、Ｃ bz-ノルバリニル-、Ｃbz-グルタミル-、Ｃbz-イプシロン-(ｔ-ブチルエステル)- グルタミル、アセチル-ロイシニル-、６-または８-キノリンカルボニル、ビフェ ニルアセチル、アルファ-イソブチル-ビフェニルアセチル、アセチル、ベンゾイ ル、２-または３-ベンジルオキシベンゾイル、４-フェノキシベンゾイル-、Ｃbz -アミノ酸、２-、３-または４-ピリジルメチルオキシカルボニル-アミノ酸-、ア リールＣ0-Ｃ6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6 アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、アリールＣ0−Ｃ6アルキルオキシカルボ ニル-アミノ酸-、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸- 、Ｃ1-6アルキルオキシカルボニル-アミノ酸-、Ｃ1−Ｃ6アルキルカルボニル、 アリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボ ニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルカルボニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキル カルボニル、Ｃ1−Ｃ6アルキルスルホニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニ ル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニル、アリールＣ0−Ｃ6アルキルス ルホニル、ヘテロアリールＣ0−Ｃ6アルキルスルホニルであり； Ｒ40はＨまたはＣ1-6アルキルであり； Ｒ41はＨまたはＣ1-6アルキルであり； Ｒ42はＣ1-6アルキル、アリール置換Ｃ1-6アルキルまたはヘテロアリール置換 Ｃ1-6アルキルであり、Ｒ43がＣ1-6アルキル、アリール置換Ｃ1-6アルキルまた はヘテロアリール置換Ｃ1-6アルキルである場合、Ｈであり； Ｒ43はＣ1-6アルキル、アリール置換Ｃ1-6アルキルまたはヘテロアリール置換 Ｃ1-6アルキルであり、Ｒ42がＣ1-6アルキル、アリール置換Ｃ1-6アルキルまた はヘテロアリール置換Ｃ1-6アルキルである場合、Ｈであり； Ｒ44はＣＨ(Ｒ53)ＮＲ45Ｒ54、ＣＨ(Ｒ55)Ａr、Ｃ5-6アルキルであり； Ｒ45、Ｒ46、Ｒ47、Ｒ48、Ｒ49、Ｒ50またはＲ51はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr- Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ52はＡr、Ｈet、ＣＨ(Ｒ56)Ａr、ＣＨ(Ｒ56)ＯＡr、Ｎ(Ｒ56)Ａr、Ｃ1-6ア ルキル、ＣＨ(Ｒ56)ＮＲ46Ｒ57であり； Ｒ53はＣ2-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであるか、ま たはＲ53とＲ45が結合してピロリジンまたはピペリジン環を形成してもよく； Ｒ54またはＲ57はＲ47、Ｒ47Ｃ(Ｏ)、Ｒ47Ｃ(Ｓ)、Ｒ47ＯＣ(Ｏ)であり； Ｒ55、Ｒ56、Ｒ58またはＲ59はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet -Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ60、Ｒ61、Ｒ62、Ｒ63またはＲ64はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル またはＨet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ65はＣ1-6アルキル、Ａr、Ｈet、ＣＨ(Ｒ69)Ａr、ＣＨ(Ｒ69)ＯＡr、Ｎ(Ｒ6 9 )Ａr、ＣＨ(Ｒ69)ＮＲ61Ｒ70であり； Ｒ66、Ｒ69またはＲ71はＨ、Ｃ1-6アルキル、(ＣＨ2)0-6-Ｃ3-6シクロアルキ ル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであり； Ｒ67はＣ1-6アルキル、(ＣＨ2)0-6-Ｃ3-6シクロアルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル 、Ｈet-Ｃ0-6アルキルであるか、またはＲ66およびＲ67が結合して３〜７員の単 環式または７〜１０員の二環式炭素環または複素環式環を形成し、それらは所望 により１ないし４個のＣ1-6アルキル、Ｐh-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキル 、Ｃ1-6アルコキシ、Ｐh-Ｃ0-6アルコキシ、Ｈet-Ｃ0-6アルコキシ、ＯＨ、(Ｃ Ｈ2)1-6ＮＲ58Ｒ59、Ｏ(ＣＨ2)1-6ＮＲ58Ｒ59で置換されていてもよく； Ｒ68またはＲ70はＲ62、Ｒ62Ｃ(Ｏ)、Ｒ62Ｃ(Ｓ)、Ｒ62ＯＣ(Ｏ)、Ｒ62ＯＣ( Ｏ)ＮＲ59ＣＨ(Ｒ71)(ＣＯ)を意味する］ で示される化合物またはその医薬上許容される塩を包含する。 式Ｉの化合物は、プロテアーゼ基質、特にカテプシンＫ基質に要求される共通 の鍵となる構造的特徴を有するヒドラジジル、ビスヒドラジジルおよびビスアミ ノメチルカルボニル化合物である。これらの構造的特徴は本発明の化合物に酵素 活性部位に適合し、かかる活性部位に結合するために必要な適当な分子形状を付 与し、それによって該部位を遮断し、酵素生物学的活性を阻害することとなる。 式Ｉに関して、かかる構造的特徴は、中心性親電子カルボニルを、その中心性カ ルボニルのいずれかの側にペプチジルまたはペプチド模倣分子骨格を、そのカル ボニルの片または両側の骨格に末端カルボベンジルオキシ基（例えば、Ｃbz-ロ イシニル）またはその類似基を、所望によりそのカルボニルの片側または両側に その骨格から伸びるイソブチル側鎖を有してもよいことである。 ペプチドおよび化学の分野にて一般に用いられる略語および符号を本明細書に おいて用い、本発明の化合物を記載する。一般に、アミノ酸略語は、Ｅur.Ｊ.Ｂ iochem.,１５８，９（１９８４）に記載されている生化学命名法のＩＵＰＡＣ− ＩＵＢ Ｊoint Ｃommissionに従う。本明細書にて用いる「アミノ酸」なる語は 、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタ ミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン 、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトフ ァン、チロシンおよびバリンのＤ−またはＬ−異性体をいう。 本明細書にて用いる「Ｃ1-6アルキル」は、置換または置換されていないメチ ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびｔ− ブチル、ペンチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびヘキシル およびその単純な脂肪族異性体を包含する。いずれのＣ1-6アルキル基も、独立 して、１または２個のハロゲン、ＳＲ'、ＯＲ'、Ｎ(Ｒ')2、Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒ')2、カ ルバミルまたはＣ1-4アルキル（Ｒ'はＣ1-6アルキル）で置換されていてもよい 。Ｃ0アルキルはその部分にアルキル基が存在しないことを意味する。かくして 、Ａr-Ｃ0アルキルはＡrに相当する。 本明細書にて用いる「Ｃ3-11シクロアルキル」は、置換または非置換シクロプ ロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シ クロオクタン、シクロノナン、シクロデカン、シクロウンデカンを包含する。 本明細書にて用いる「Ｃ2-6アルケニル」は、一の炭素−炭素単結合が一の炭 素−炭素二重結合で置換されている炭素数２〜６のアルキル基を意味する。Ｃ2- 6 アルケニルはエチレン、１−プロペン、２−プロペン、１−ブテン、イソブテ ンならびに数種のペンテンおよびヘキセン異性体を包含する。シスおよびトラン ス異性体の両方を含む。 「Ｃ2-6アルキニル」は、一の炭素−炭素単結合が一の炭素−炭素三重結合で 置換されている炭素数２〜６のアルキル基を意味する。Ｃ2-6アルキニルはアセ チレン、１−プロピン、２−プロピン、１−ブチン、２−ブチン、３−ブチンな らびにペンチンおよびヘキシンの簡単な異性体を包含する。 「ハロゲン」はＦ、Ｃl、ＢrまたはＩを意味する。 「Ａr」または「アリール」は、１またはそれ以上のＰh-Ｃ0-6アルキル、Ｈet -Ｃ0-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｐh-Ｃ0-6アルコキシ、Ｈet-Ｃ0-6アルコキ シ、ＯＨ、(ＣＨ2)1-6ＮＲ58Ｒ59、Ｏ(ＣＨ2)1-6ＮＲ58Ｒ59（ここに、Ｒ58、Ｒ59 はＨ、Ｃ1-6アルキル、Ａr-Ｃ0-6アルキル、Ｈet-Ｃ0-6アルキル、Ｃ1-4アル キルから、ＯＲ'、Ｎ(Ｒ')2、ＳＲ'、ＣＦ3、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ'、ＣＯＮ( Ｒ')、ＣＯＮ(Ｒ')、Ｆ、Ｃl、ＢrまたはＩで置換されていてもよいフェニルま たはナフチルを意味する。 本明細書にて用いる場合、「Ｈet」または「複素環」は、安定した５ないし７ 員の単環または安定した７ないし１０員の二環式複素環式環をいい、それは飽和 または不飽和のいずれかであり、炭素原子とＮ、ＯおよびＳからなる群より選択 される１ないし３個のヘテロ原子とからなり、窒素および硫黄ヘテロ原子は酸化 されていてもよく、窒素原子は第四級化されていてもよく、前記した複素環式環 がベンゼン環に縮合したいずれの二環式環も包含する。複素環式環はいずれかの ヘテロ原子または炭素原子に結合し、安定した構造を形成し、Ｃ1-4アルキル、 ＯＲ'、Ｎ(Ｒ')2、ＳＲ'、ＣＦ3、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ'、ＣＯＮ(Ｒ')、Ｆ、 Ｃl、ＢrおよびＩから選択される１または２個の基で置換されていてもよい（こ こに、Ｒ'はＣ1-6アルキルである）。このような複素環の例は、ピペリジニル、 ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソ ピロロジニル、２−オキソアゼピニル、アゼピニル、ピロリル、４−ピペリドニ ル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、ピリジル、ピ ラジニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリル、イソキサゾリル 、モルホリニル、チアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリル、キヌクリジニル 、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラ ニル、ベンゾオキサゾリル、フリル、ピラニル、テトラヒドロフリル、テトラヒ ドロピラニル、チエニル、ベンゾオキサゾリル、チアモルホリニルスルホキシド 、 チアモルホリニルスルホンおよびオキサジアゾリルを包含する。 「ＨetＡr」または「ヘテロアリール」は、芳香族の性質を有するＨetの前記 した定義により含まれるいずれの複素環基、例えばピリジンを意味する。 しているチアゾール、オキサゾール、トリアゾール、チアジアゾール、オキサジ アゾール、イソキサゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ピラジン、ピリダ ジン、ピリミジン、トリアジンおよびテトラジンを包含する。かかる複素環にお ける単結合および二重結合（すなわち、・・・・）は、該複素環が芳香族性（例えば 、ヘテロアリール基である）ように存在するヘテロ原子を基礎として配置される 。本明細書に用いられるヘテロ原子なる語は酸素、窒素および硫黄をいう。ヘテ ロアリール基が５員環を構成する場合、Ｗは、好ましくは、電子求引基、例えば ハロゲン、-ＣＮ、-ＣＦ3、-ＮＯ2、-ＣＯＲ7、-ＣＯ2Ｒ6、-ＣＯＮＨＲ6、-Ｓ Ｏ2ＮＨＲ6、-ＮＨＳＯ2Ｒ6、-ＮＨＣＯＲ7、-Ｏ-ＣＯＲ6、-ＳＲ6または-ＮＲ' Ｒ6あるいは当該分野において公知の類似する電子求引置換基である。 本明細書において、ある基を略記する。ｔ-Ｂuはターシャルブチル基をいい、 Ｂocはｔ-ブチルオキシカルボニル基をいい、Ｆmocはフルオレニルメトキシカル ボニル基をいい、Ｐhはフェニル基をいい、Ｃbzはベンジルオキシカルボニル基 をいう。 本明細書においては、ある試薬を略記する。ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボ ジイミドをいい、ＤＭＡＰは２,６−ジメチルアミノピリジンであり、ＥＤＣは Ｎ−エチル−Ｎ'−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドをいう。ＨＯＢ Ｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールをいい、ＤＭＦはジメチルホルムアミド をいい、ＢＯＰはベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミ ノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートをいい、ＤＭＡＰはジメチルアミ ノピリジンであり、ローソン（Ｌawesson）試薬は２,４−ビス（４−メトキシフ ェニル）−１,３−ジチア−２,４−ジホスフェタン−２,４−ジスルフィドであ り、ＮＭＭはＮ−メチルモルホリンであり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸をいい、 ＴＦ ＡＡはトリフルオロ酢酸無水物をいい、ＴＨＦはテトラヒドロフランをいう。ジ ョーンズ試薬は、当業者に周知の三酸化クロム、水および硫酸の溶液である。 式（Ｉ）の化合物は、スキーム１−２５に詳説した方法にしたがって製造され る。 もう１つの態様において、本発明は、本明細書の表Ｉ中の位置により定義され る結晶形態の新規プロテアーゼを提供する。 さらにもう１つの態様において、本発明は、本明細書の表ＸＸＩＸに掲載され たアミノ酸残基の原子により形成される３次元触媒部位によって特徴づけられる 新規プロテアーゼ構成物を提供する。 本発明プロテアーゼの３次元（３Ｄ）構造により、ヒト・カテプシンＫが他の 既知システインプロテイナーゼのパパインファミリーに対して非常に相同的であ ることが明らかとなる。カテプシン−Ｋは、活性部位の裂け目により分割された ２個のサブドメインに折り畳まれており、それはシステインプロテアーゼのパパ インファミリーの特徴である。カテプシンＫの全体の折り畳みはパパインおよび アクチニジンのものと非常に類似している。パパインと比較すると、カテプシン Ｋの残基アラニン７９における１個のさらなる残基の挿入が存在する。この挿入 は、カテプシンＫの残基メチオニン６８−リジン７７により形成されるヘリック スのカルボキシ末端におけるターンに容易に適応する。パパインと比較すると、 カテプシンＫ表面の残基アスパラギン９９からリジン１０３までの骨格原子に関 するコンホーメーションの相違が存在する。カテプシンＫとパパインとの間の他 の骨格コンホーメーションの相違は：ループ残基１２６〜１２７における２個の 残基の挿入、残基アスパラギン酸における２この残基の挿入、グルタミン１７２ における４個の残基の挿入および残基リジン２００周辺のループのコンホーメー ションにおける相違である。ヒト・カテプシンＫとヒト・カテプシンＢとの間に はより多くの相違が存在するが、これら２つの酵素間の２次構造はよく保存され ている。 システインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーであるカテプシンＫ、 カテプシンＳ、カテプシンＬ、パパイン、アクチニジン、カテプシンＨおよびカ テプシンＢを、それらの間の相同性を示すために並置したものを図１に掲載する 。 本発明によれば、阻害剤不存在下において９個の別個の阻害剤との複合体形態 のヒト・カテプシンＫの結晶構造が３.０Åから２.２Åの分解能で決定された。 構造は分子置換法を用いて決定され、阻害剤不存在下におけるリファインされな かった酵素を除き、０.１９０〜０.２６７の範囲の値のＲcにリファインされた 。 原子座標のさらなるリファインメントは表Ｉ中の数を変化させるであろう。他 の結晶構造からの結晶構造のリファインメントは新たなセットの座標を生じるで あろうし、別のシステインプロテアーゼの結晶構造の決定もまた表Ｉ中の座標に 関する異なるセットの数を生じるであろう（実験誤差は約０.４Å）。さらに例 えば、突然変異の誘発により、あるいは異なる起源の蛋白を用いることにより、 システインプロテアーゼのアミノ酸配列を変化させることができる。 ヒト・カテプシンＫは２１５個のアミノ酸を含み、本明細書記載の酵素のモデ ルは全２１５個の残基により示される。 カテプシンＫ結晶構造により、以前は不明であった活性部位が原子の独特な３ 次元配列を含んでなることが明らかとなる。 表ＩはカテプシンＫの蛋白座標を開示する。これらのデータを本明細書記載の 結晶構造に関して報告する。標準的フォーマットの直交座標系に関してオングス トロームでデータを示し、結晶構造から得られた原子、すなわち窒素、酸素、炭 素、イオウ（アミノ酸残基中のα、β、γ、δまたはε位置）；アミノ酸番号を 付けられた原子が存在するアミノ酸残基、および座標Ｘ、ＹおよびＺがオングス トロームで示される。活性部位および全体構造における各原子は結晶中でユニー クな位置を有することに注意。またデータはＢまたは温度係数値も示し、それら は原子の熱運動の程度を示すものであり、測定値の相乗平均（Ａ2）である。図 ２は、本発明カテプシンＫ構造を活性部位を含めて示すものである。 Ｅ−６４に結合したカテプシンＫの活性部位を図３に示す。カテプシンＫに結 合したＥ−６４のコンホーメーションは、公表されているパパイン−Ｅ−６４複 合体の構造（Varughese,K.I.,Biochemistry 31,5172-5176(1992)）において見ら れるものと類似している。システイン２５のイオウと阻害剤の炭素Ｃ２との間の 共有結合が電子密度において非常に明確である。システインプロテアーゼのパパ インファミリーの種々のメンバーの酵素上の活性部位ポケットに沿って並んでい る側鎖原子の相違は、これらの構造におけるＥ−６４の原子と蛋白の原子との間 の異なる相互作用を引き起こす。カテプシンＫ中においては、ロイシンのイソブ チル原子は、カテプシンＫの残基ロイシン１６０、アラニン１３４およびメチオ ニン６８の側鎖原子により形成された疎水性ポケット中に十分に埋まって存在し 、ポケットはＥ−６４のこれらの原子を溶媒から遮蔽している。パパイン中にお い ては、Ｅ−６４のロイシル側鎖原子はこの疎水性ポケット中に深く突き刺さって いない。カテプシンＫの別のポケットはＥ−６４のグアニジニウム原子により占 領されている。水素結合はＥ−６４のＮ４とグルタミン５９の骨格カルボニル酸 素およびアスパラギン酸６１のＯＤ２酸素との間に形成される。アスパラギン酸 ６１のカルボキシレート酸素はＥ−６４のＮ３原子とも水素結合を形成する。ア スパラギン酸６１の側鎖はカテプシンＫのこのポケットの入口にある。これらの 相互作用はパパインにおいては不可能である。なぜなら、パパインにおける対応 残基はアクセスを遮断するチロシン６１だからである。Ｅ−６４のカルボキシレ ート酸素はヒスチジン１６２のＮＤ１原子およびグルタミン１９のＮＥ２原子と 水素結合を形成する。パパインおよびアクチニジンにおいてもこれらの相互作用 が見られる。Ｅ−６４の原子は酵素活性部位の完全領域を貫通しない。パパイン におけるがごとく、カテプシンＫの残基グリシン６６の骨格窒素原子はＥ−６４ のカルボニル酸素Ｏ４と水素結合を形成する。また、カテプシンＫのグリシン６ ６のカルボニル酸素はＥ−６４のＮ２と水素結合を形成する。活性部位領域の一 部は、カテプシンＫ、パパインおよびアクチニジンのコンホーメーションと非常 に類似している。カテプシンＫおよびカテプシンＢの活性部位の比較により、パ パインまたはアクチニジンをカテプシンＫと比較した場合に観察される相違より も多くの相違が明らかとなる。カテプシンＢの活性部位の一部は、カテプシンＫ の活性部位の対応部分とは有意に異なる。ヒト・カテプシンＢにおけるループで あるグルタミン１０７〜プロリン１１６の存在は、この酵素のジペプチジルカル ボキシペプチダーゼ活性に原因と推測され、カテプシンＫ、パパインまたはアク チニジンにおいては等価物がない。このループは、カテプシンＢの活性部位のこ の領域を、カテプシンＫを包含するシステインプロテアーゼのこのパパインファ ミリーの他のメンバーにおけるものよりも小型にしている。ヒト・カテプシンＢ とカテプシンＫの活性部位間の相違にもかからず、カデプシンＢおよびカテプシ ンＫにおいて構造的に相同性のあるアルファ炭素を並置することにより、活性部 位のシステイン残基はほとんど正確に重ね合わされる。カテプシンＫのロイシン １６０近傍の疎水性ポケットの相違も、カテプシンＢにおいて明らかである。こ のポケットを形成している残基は、カテプシンＫにおいてメチオニン６８に代わ るプロリン７８により置換されており、カテプシンＢにおけるグルタミン２４３ はカテプシンＫにおけるロイシン１６０と構造的に等価である。興味深いことに 、側鎖原子がＥ−６４阻害剤に対する水素結合を形成しているカテプシンＫの残 基、すなわちヒスチジン１６２、グルタミン１９およびアスパラギン酸６１は、 カテプシンＢの残基、すなわち、それぞれヒスチジン１９７、グルタミン２３お よびアスパラギン酸６７と構造的相同性を有している。 カテプシンＫの活性部位における本発明の特定の阻害剤の特別な相互作用を以 下に詳述する。 ３（Ｓ）−３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシル］アミノ −５−メチル−１−（１−プロポキシ）−２−ヘキサノンは、酵素の残基である トリプトファン１８４のインドール環およびグルタミン１９の側鎖原子ＣＧと疎 水的接触を行う。酸素０２６は、システイン２５のアミド窒素およびグルタミン １９のＮＥ２原子とに２つに分かれた水素結合を形成する。活性部位のシステイ ン２５の求核性イオウは阻害剤の炭素Ｃ２５に共有結合し、四面体コンホーメー ションをとる。 ビス−（Ｃｂｚ−ロイシル）−１,３−ジアミノ−プロパン−２−オンは、３ （Ｓ）−３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシル］アミノ−５ −メチル−１−（１−プロポキシ）−２−ヘキサノンと同じ相互作用を示し；こ の阻害剤の炭素Ｃ２１はシステイン２５のＳＧに共有結合する。阻害剤のイソプ ロピル原子ＣＣ３４、Ｃ３５、Ｃ３６およびＣ３７は、酵素表面上の残基の側鎖 原子と疎水的相互作用を形成する。このポケットは、メチオニン６８、ロイシン ２０９、アラニン１６３およびアラニン１３４およびチロシン６７の一部からの 原子により形成される。 ２,２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニルカルボヒ ドラジドは、ビス−（Ｃｂｚ−ロイシル）−１,３−ジアミノ−プロパン−２− オンと類似の相互作用を有しており、さらに、阻害剤のＣＢＺ基の原子Ｃ２３〜 ２９は、チロシン６７のフェノール環とエッジ面積み重ね相互作用をする。阻害 剤の原子Ｃ２１は酵素に共有結合する。 （１Ｓ）−Ｎ−［２−［（１−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−メチ ルブチル］チアゾール−４−イルカルボニル］−Ｎ'−（Ｎ−ベンジルオキシカ ルボニル−Ｌ−ロイシル）ヒドラジドのイオウ原子は、ヒスチジン１６３のＮＤ １原子およびトリプトファン１８４のインドール環に接触する。炭素Ｃ２２はシ ステイン２５のＳＧに共有結合する。 ２−［Ｎ−（３−ベンジルオキシベンゾイル）］−２'−［Ｎ'−（Ｎ−ベンジ ルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル）］カルボヒドラジドのＣＢＺの原子Ｃ２０ 〜２６はロイシン１６０の側鎖原子と相互作用する。炭素Ｃ１９はシステイン２ ５のＳＧに共有結合する。 カテプシンＫは、４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイ シル］−１−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３ −ピロリジノンの１の立体異性体に選択的に結合する。炭素Ｃ２２はシステイン ２５のＳＧに共有結合する。阻害剤４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニ ル］−Ｌ−ロイシル］−１−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ− ロイシル］−３−ピロリジノンの原子Ｃ１４およびＣ１５は、グルタミン１４３ およびアスパラギン１６１の側鎖原子ならびにアラニン１３７およびセリン１３ ８の主鎖に接触する。 ４−［Ｎ−［（４−ピリジルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１− ［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノ ンは４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−［ Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノン と同様の様式で相互作用する。さらに１の立体異性体が結合する。炭素Ｃ１７は システイン２５のＳＧに共有結合する。４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カル ボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−Ｎ［Ｎ−（メチル）−Ｌ−ロイシル）］−３− ピロリジノンは４−［Ｎ−［（４−ピリジルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイ シル］−１−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３ −ピロリジノンと同じであるが、炭素Ｃ２２がシステイン２５のＳＧに共有 結合することが異なる。 １−Ｎ−（Ｎ−イミダゾールアセチル−ロイシル）−アミノ−３−Ｎ−（４− フェノキシフェニル−スルホニル）−アミノ−プロパン−２−オンの原子Ｏ２４ は、グリシン６６のアミドＮＨと水素結合相互作用を形成する。炭素Ｃ１９はシ ステイン２５のＳＧに共有結合する。 まとめると、すべての阻害剤はトリプトファン１８４のインドールの原子と芳 香族的相互作用を示す。２,２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ −ロイシニルカルボヒドラジドおよび（１Ｓ）−Ｎ−［２−［（１−ベンジルオ キシカルボニルアミノ）−３−メチルブチル］チアゾール−４−イルカルボニル ］−Ｎ'−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル）ヒドラジドのイソ プロピル原子Ｃ１２〜１５は、残基グルタミン２１、システイン２２およびグリ シン２３の主鎖原子と疎水的接触を行う。グルタミン１９のＮＥ２原子は、２, ２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニルカルボヒドラ ジドの酸素原子Ｏ２２、１−Ｎ−（Ｎ−イミダゾールアセチルロイシニル）−ア ミノ−３−Ｎ−（４−フェノキシ−フェニル−スルホニル）−アミノ−プロパン −２−オンのＯ２０、２−［Ｎ−（３−ベンジルオキシベンゾイル）］−２'− ［Ｎ'−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル）］カルボヒドラジ ドのＯ２０、４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］ −１−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロ リジノンのＯ２３、ビス−（Ｃｂｚ−ロイシル）−１,３−ジアミノ−プロパン −２−オンのＯ２２、３（Ｓ）−３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ −ロイシニル］アミノ−５−メチル−１−（１−プロポキシ）−２−ヘキサノン のＯ２６、４−［Ｎ−［（４−ピリジルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル ］−１−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピ ロリジノンのＯ４２、（ＩＳ,２'Ｒ）−Ｎ−２−［［（１−ベンジルオキシカル ボニル）アミノ］−３−メチルブチル］チアゾール−４−イルカルボニル−Ｎ' −２'−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ−４'−メチルペナノイルヒドラジ ドのＯ２３、４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイ シル］−１−Ｎ［Ｎ−（メチル）−Ｌ−ロイシル）］−３−ピロリジノンのＯ２ ３に水素結合することができる。グリシン６６の骨格アミド窒素は、２,２'−Ｎ ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニルカルボヒドラジドの酸 素原子Ｏ３９、１−Ｎ−（Ｎ−イミダゾールアセチルロイシニル）−アミノ−３ −Ｎ−（４−フェノキシ−フェニル−スルホニル）−アミノ−プロパン−２−オ ンのＯ２４、２−［Ｎ−（３−ベンジルオキシベンゾイル）］−２'−［Ｎ'−（ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル）］カルボヒドラジドのＯ３７ 、４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−［Ｎ −［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノンの Ｏ４０、ビス−（Ｃｂｚ−ロイシル）−１,３−ジアミノ−プロパン−２−オン のＯ２２、３（Ｓ）−３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシニ ル］アミノ−５−メチル−１−（１−プロポキシ）−２−ヘキサノンのＯ３９、 （１Ｓ,２'Ｒ）−Ｎ−２−［［（１−ベンジルオキシカルボニル）アミノ］−３ −メチルブチル］チアゾール−４−イルカルボニル−Ｎ'−２'−（ベンジルオキ シカルボニル）アミノ−４'−メチルペナノイルヒドラジドのＯ４０、４−［Ｎ −［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−Ｎ［Ｎ−（メチ ル）−Ｌ−ロイシル）］−３−ピロリジノンのＯ３１に水素結合することができ る。残基メチオニン６８、ロイシン２０９、アラニン１６３およびアラニン１３ ４およびチロシン６７の一部からの原子に沿って配置される疎水性ポケットは、 ビス−（Ｃｂｚ−ロイシニル）−１,３−ジアミノ−プロパン−２−オンのイソ プロピル原子Ｃ３４〜３７、２,２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル −Ｌ−ロイシニルカルボヒドラジドのイソプロピル原子Ｃ３４〜３７、（１Ｓ） −Ｎ−［２−［（１−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−メチルブチル］ チアゾール−４−イルカルボニル］−Ｎ'−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− Ｌ−ロイシニル）ヒドラジドのイソプロピル原子Ｃ３５〜３８、２−［Ｎ−（３ −ベンジルオキシベンゾイル）］−２'−［Ｎ'−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニ ル−Ｌ−ロイシニル）］カルボヒドラジドのイソプロピル原子Ｃ３２〜３５、４ −［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイ シル］−１−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３ −ピロリジノンのイソプロピル原子Ｃ３５〜３８、４−［Ｎ−［（４−ピリジル メトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−［Ｎ−［（フェニルメトキシ） カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノンのイソプロピル原子Ｃ１９〜 ２２、１−Ｎ−（Ｎ−イミダゾールアセチル−ロイシル）−アミノ−３−Ｎ−（ ４−フェノキシ−フェニル−スルホニル）アミノ−プロパン−２−オンのイソプ ロピル原子Ｃ２６〜２９と相互作用する。３（Ｓ）−３−［（Ｎ−ベンジルオキ シカルボニル）−Ｌ−ロイシニル］アミノ−５−メチル−１−（１−プロポキシ ）−２−ヘキサノンおよび４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ −ロイシル］−１−Ｎ［Ｎ−（メチル）−Ｌ−ロイシル）］−３−ピロリジノン 以外のすべての阻害剤は、蛋白のチロシン６７と相互作用する芳香族基を有して いる。すべての阻害剤はその炭素原子を介して、システイン２５のＳＧ原子と共 有結合する。 本発明プロテアーゼの結晶構造により、表ＸＸＩＸに掲載したアミノ酸残基の 原子により形成される新規活性部位の３次元構造が明らかとなる。 この構造はプロテアーゼ阻害剤の構造に基づく設計において明らかに有用であ り、プロテアーゼ阻害剤を骨吸収の阻害が示される疾病に対する治療剤として用 いることができる。新規カテプシンＫの触媒部位の発見は、強力で非常に選択的 なプロテアーゼ阻害剤の設計を可能にする。 本発明のもう１つの態様は、本明細書記載の結晶構造および新規活性部位によ り特徴づけられるカテプシンＫの阻害剤の同定方法、ならびに阻害剤自体を包含 する。本発明新規プロテアーゼ結晶構造はプロテアーゼ活性の阻害剤の同定を可 能にする。かかる阻害剤はカテプシンＫの活性部位のすべてまたは一部に結合し てもよく；あるいは競争的または非競争的阻害剤であってもよい。生物学的活性 について同定しスクリーニングしたならば、これらの阻害剤を治療的または予防 的に用いてプロテアーゼ活性をブロックすることができる。 １の設計のアプローチは、種々の化学的部分から構成される分子を用いて本発 明カテプシンＫをプローブしてカテプシンＫ阻害剤候補と酵素との間の相互作用 に関する最適部位を決定することである。例えば、溶媒で飽和された結晶から集 めた高分解能Ｘ線回折データにより、各タイプの溶媒分子が付着する部位を決定 することができる。 次いで、それらの部位に固く結合する小型分子を設計し、合成し、カテプシン Ｋ阻害剤活性について試験することができる。 また本発明は、基質の化学反応において異性化して短命な反応中間体になるこ とのできる化合物、あるいはカテプシンＫに結合する他の化合物の開発を可能に する。よって、他の分子との反応中のカテプシンＫの構造変化の経時的分析が可 能になる。カテプシンＫの反応中間体を、カテプシンＫとの共複合体となった反 応生成物から推定することもできる。既知システインプロテアーゼ阻害剤の改良 されたアナログの設計、あるいはカテプシンＫ酵素およびカテプシンＫ阻害剤の 共複合体からなる反応中間体に基づく新規クラスの阻害剤の設計に、かかる情報 は有用である。このことにより、高特異性および高安定性の両方を備えたカテプ シンＫ阻害剤の新規設計ルートが提供される。 本発明により、もう１つのアプローチが可能となり、それは、カテプシンＫ酵 素に対して全体的または部分的に結合しうる化学的部分または化合物に関する小 型分子のデータベースをコンピューターによりスクリーニングすることである。 このスクリーニングにおいて、結合部位に対するかかる部分または化合物の適合 の質を、形態相補性（shape complementarity）［R.L.DesJarlais et al.,J.Med .Chem.31:722-729(1988)］または推定相互作用エネルギー［E.C.Meng et al,J.C omp.Chem.,13:505-524(1992)］のいずれかにより判定することができる。 カテプシンＫは１種よりも多い結晶形態として結晶化しうるので、本発明によ り提供されるカテプシンＫまたはその一部の構造座標はカテプシンＫの他の結晶 形態の構造を解明するのに特に有用である。それらを用いてカテプシンＫ変種、 カテプシンＫ共複合体の結晶形態あるいはカテプシンＫの機能的ドメインに相同 的なアミノ酸配列を有する他の蛋白の結晶形態の構造を解明することもできる。 この目的に使用できる１の方法は分子置換である。この方法において、未知結 晶構造（カテプシンＫ、カテプシンＫ変種、カテプシンＫ共複合体の別の血漿形 態、あるいはカテプシンＫの機能的ドメインに相同的なアミノ酸配列を有する他 の蛋白の結晶であっても）を、表Ｉに示す本発明カテプシンＫ構造座標を用いて 決定することができる。この方法は、最初からかかる情報を決定しようとするよ りも、迅速かつ効率的に未知結晶の正確な構造形態を提供するであろう。 よって、本明細書のカテプシンＫ構造は、既知分子のスクリーニングおよび／ またはプロテアーゼ構造、詳細には活性部位に結合する新たな分子のコンピュー ターシステムを用いる設計を可能にする。例えば、プロテアーゼ配列ならびにプ ロテアーゼ構造（すなわち、カテプシンＫの原子座標および／または活性部位腔 、結合角、二面角、活性部位領域における原子間距離等の原子座標）をインプッ トすることのできるコンピューターモデリングシステムが使用可能である。よっ て、このプロセスにおいて機械が読み取ることのできる媒体を、表Ｉの座標を示 すデータを用いてコードすることができる。次いで、コンピューターにより、試 験化合物が結合する部位の構造の詳細が得られ、それにより該試験化合物の相補 的な構造の詳細の決定が可能になる。 より詳細には、本発明のカテプシンＫに結合またはこれを阻害する化合物の設 計は２つのファクターの考慮を必要とする。第１に、化合物は物理的および構造 的にカテプシンＫに結合できるものでなくてはならない。カテプシンＫとその基 質との結合において重要な非共有的分子相互作用は、水素結合、ファン・デル・ ワールス力および疎水的相互作用を包含する。 第２に、化合物は、カテプシンＫに結合できるコンホーメーションをとること のできるものでなければならない。化合物の特定の部分がカテプシンＫとの結合 に直接関与しないとしても、やはりそれらの部分は分子の全体的コンホーメーシ ョンに影響しうる。このことは効能に対して重大な衝撃を与える。かかるコンホ ーメーションの必要事項は、全体の３次元構造および結合部位の全体または一部 、例えばカテプシンＫの活性部位または補助的結合部位に対する化学的部分また は化合物の方向、あるいはカテプシンＫと直接相互作用するいくつかの化学的部 分を含んでなる化合物の官能基間の距離を包含する。 コンピューターモデリング法により、化合物とカテプシンＫとの潜在的阻害ま たは結合効果を、それを実際に合成し試験する前に評価することができる。ある 化合物の理論上の構造がカテプシンＫとの間の不十分な相互作用および結合を示 唆するものでる場合、化合物の合成および試験を行わなくてすむ。しかしながら 、コンピューターモデリングが強い相互作用を示すものである場合には、その分 子を合成し、適当なアッセイにおいてカテプシンＫに対する結合能につき試験す ることができる。カテプシンＫの個々の結合ポケットまたは他の領域への結合能 について化学的部分またはフラグメントをスクリーニングし選択する一連の工程 からなる手段により、カテプシンＫに対する阻害化合物または他の結合化合物を コンピューターにより評価し設計することができる。 当業者は、カテプシンＫへの結合能、より詳細にはカテプシンＫの個々の結合 ポケットまたは補助的結合部位への結合能に関して、化学的部分またはフラグメ ントをスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの１つを用いることがで きる。このプロセスを視覚的検査、例えば、表ＩのカテプシンＫ座標に基づくコ ンピューター画面上の活性部位から始める。QuantaおよびSybylのごときソフト ウェアを用い、次いで、CHARMMおよびAMBERのごとき標準的分子力学の力の場を 用いるエネルギー最小化および分子ダイナミックスによってドッキングを行うこ とができる。 専門化されたコンピュータープログラムは、フラグメントまたは化学的部分の 選択プロセスにおいて助けとなる。これらのプログラムは以下のものがある： ・GRID［P.J.Goodford,"A Computational Procedure for Determining Energeti cally Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J.Med.Chem.,28:849-857(1985)］。GRIDはOxford University,Oxford,UKから市 販されている。 ・MCSS［A.Miranker and M.Karplus,"Functionality Maps of Binding Sites:A Multiple Copy Simultaneous Search Method",Proteins:Structure,Function an d Genetics,11:29-34(1991)］。MCSSはMolecular Simulations,Burlington,MAか ら市販されている。 ・AUTODOCK［D.S.Goodsell and A.J.Olsen,"Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing",Proteins:Structure,Function and Gene tics,8:195-202(1990)］。AUTODOCKはScripps Research Institute,La Jolla,CA から市販されている。 ・DOCK［I.D.Kuntz et al,"A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand In teractions",J.Mol.Biol.,161:269-288(1982)］。DOCKはUniversity of Califor nia,San Francisco,CAから市販されている。 小型分子用のさらなる市販コンピューターデータベースはCambridge Structur al DatabaseおよびFine Chemical Databaseを包含し、レビューのためにはRusin ko,A.,Chem.Des.Auto.News 8,44-47(1993)参照。 適当な化学的部分またはフラグメントを選択したならば、それらを単一化合物 または阻害剤中に集合させることができる。カテプシンＫの構造座標に関連した コンピューター画面に示された３次元映像上のフラグメントの相互関係を視覚的 に検査することにより、集合を行うことができる。これを行った後、Quantaまた はSybylのごとき手動モデル構築を行う。 個々の化学的部分またはフラグメントを結合することにおける、当業者にとり 有用なプログラムは以下のものを包含する： ・CAVEAT［P.A.Bartlett et al,"CAVEAT:A Program to Facilitate the Structu re-Derived Design of Biologically Active Molecules",Molecular Recognitio n in Chemical and Biological Problems",Special Pub.,Royal Chem.Soc.78,pp .182-196(1989)］。CAVEATはUniversity of California,Berkeley,CAから市販さ れている。 ・MACCS-3D（MDL Information Systems,San Leandro,CA）のごとき３Ｄデータベ ースシステム。この部分はY.C.Martin,"3D Database Searching in Drug Design "J.Med.Chem.,35:2145-2154(1992)にレビューされている。 ・HOOK（Molecular Simulations,Burlington,MAから市販）。 カテプシンＫ阻害剤の構築を段階的に進行させるかわりに、空の活性部位を用 いるかまたは所望により既知阻害剤のいくつかの部分を用いて、上記のごとく１ のフラグメントまたは化学的部分を一度に、阻害分子または他のタイプの結合分 子を全体としてあるいは「de novo」設計してもよい。これらの方法は下記のも のを包含する： ・LUDI[H.-J.Bohm,"The Cpmputer Program LUDI:A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors",J.Comp.Aid.Molec.Design,6:61-78(1992)]。LU DIはBiosym Technologies,San Diego,CAから市販されている。 ・LEGEND［Y.Nishibata and A.Itai,Tatrahedron,47:8985(1991)］。LEGENDはMo lecular Simulations,Burlington,MAから市販されている。 ・LeapFrog（Tripos Associates,St.Louis,MOから市販）。 他の分子モデリング法を本発明に従って用いてもよい。例えば、N.C.Cohen et al,"Moleculr Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry",J.M ed.Chem.,33:883-894(1990)参照。さらにM.A.Navia and M.A.Murcko,"The Use o f Structural Infiomation in Drug Design",Current Opinions in Structural Biology,2:202-210(1992)参照。例えば、試験化合物の構造が知られている場合 には、試験化合物のモデルを本発明の構造のモデルに重ね合わせてもよい。この 工程を行うための多くの方法および手法が当該分野において知られており、いず れの方法を用いてもよい。例えば、P.S.Farmer,Drug Design,Ariens,E.J.,ed.,V ol.10,pp 119-143(Academic Press,New York,1980)；米国特許第5,331,573号； 米国特許第5,500,807号；C.Verlinde,Structure,2:577-587(1994)；およびI.D.K untz,Science,257:1078-1082(1992)参照。本明細書記載のモデル構築法およびコ ンピューター評価システムは本発明を限定しない。 よって、これらのコンピューター評価システムを用いて、多くの化合物のメン バーを迅速かつ簡単に試験することができ、経費と時間のかかる生物学的試験を 回避することができる。そのうえ、多くの化合物の実際の合成のための必要事項 が効率的に減少する。 モデリング法により同定したならば、標準的方法を用いてプロテアーゼ阻害剤 を生物学的活性について試験することができる。例えば、阻害剤のスクリーニン グのための慣用的フォーマットを用いて本発明構造を結合アッセイに用いること ができる。本発明で用いる適当なアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ （ELISA）または蛍光クエンチアッセイを包含するが、これらに限らない。例え ば、下記実施例２のカテプシンＫ活性のアッセイ参照。他のアッセイフォーマッ トを用いてもよく；これらのアッセイフォーマットは本発明を限定しない。 もう１つの態様において、本発明プロテアーゼ構造は、本発明プロテアーゼ活 性部位のコンホーメーションに相補的な形態を有する合成化合物および／または 他の分子の設計および同定を可能にする。既知コンピューターシステムを用いて 、機械が読み取ることのできる形態として本発明プロテアーゼ構造の座標を提供 することができ、試験化合物を設計および／またはスクリーニングし、それらの コンホーメーションを本発明プロアーゼの構造と重ね合わせることができる。次 いで、上記のごとく同定された適当な候補を、所望プロテアーゼ阻害生物学的活 性、安定性等についてスクリーニングすることができる。 生物学的活性について同定しスクリーニングしたならば、これらの阻害剤を治 療的または予防的に用いてカテプシンＫ活性をブロックすることができる。 以下の実施例は本発明の種々の態様を説明する。これらの実施例は、添付した 請求の範囲により画定される本発明の範囲を限定するものでない。実施例１：カテプシンＫ構造の分析 Ａ.発現、精製および結晶化 Bossard,M.J.,et al.,J.Biol.Chem.271,12517-12524(1996)に記載のごとくカ テプシンＫ（図１参照）を発現させ、精製した。 ０.２Ｍ Ｌｉ2ＳＯ4含有３０％ ＰＥＧ ８０００,０.１Ｍ リン酸Ｎａ+／Ｋ+ 溶液（ｐＨ４.５）から、懸滴中の蒸気拡散によりカテプシンＫの結晶を成長さ せた。複合体の結晶は四面体であり、空間群Ｐ４3２1２、セル定数ａ＝５７.７ オングストローム、ｃ＝１３１.１オングストロームである。結晶は非対称ユニ ット中に１個の分子を含み、さらに３６％の溶媒を含み、２.３Å3／ダルトンの Ｖm値である。X-PLOR［Brunger,A.T.,et al.,Science,235,458-460(1987)］を用 いる分子置換により構造を決定した。出発モデルは本明細書記載のカテプシンＫ Ｅ−６４複合体構造由来の蛋白の原子からなっていた。 Ｂ.モデル構築およびリファインメント 上で得られた３次元電子密度マップを用いて、カテプシンＫのポリペプチド鎖 をあいまいさを伴わずにトレースすることができる。３−Ｄコンピューターグラ フィックスプログラムFRODO［Jones,T.A.,J.Appl.Crystallogr.,11,268-272(197 8)］を用いて、側鎖を伴う全部で２１５個の残基を構築した。２１５個の各アミ ノ酸残基をその電子密度に手動で当てはめ、カテプシンＫにおける各原子につい てのユニークな位置（各位置は表Ｉに示す原子座標（Ｘ,Ｙ,Ｚ）のユニークなセ ットにより決定される）を考慮した。これらの原子座標から始めて、回折パター ンを計算し、実験データと比較した。計算により決定された回折パターンと実験 的に決定された回折パターンとの相違を、Ｒc値によりモニターした。構造モデ ルのリファインメント（X-PLORを使用）にはＲ因子を最小にするための原子位置 の調節が必要であり、高品質の蛋白構造を得るためにはＲ因子は２０％未満の値 が典型的であり、通常は２５％よりも高い値はさらなるリファインメントの必要 性を示す。 実施例２：アッセイ カテプシンＫタンパク溶解性触媒活性の決定 カテプシンＫについての全てのアッセイは、ヒト組換え酵素を用いて行った。 速度定数の決定のための標準的なアッセイ条件は、フルオロジェニックペプチド 基質、典型的には、Ｃbz−Ｐhe−Ａrg−ＡＭＣを用い、２０mＭシステインおよ び５mＭ ＥＤＴＡを含有するpＨ５.５の１００mＭ酢酸ナトリウム中で決定した 。アッセイにおける最終基質濃度２０uＭを有するＤＭＳＯ中１０または２０mＭ の濃度でストック基質溶液を調製した。全てのアッセイは、１０％ＤＭＳＯを含 有した。独立実験により、このレベルのＤＭＳＯは、酵素活性または速度定数に 対して効果を有しないことが判明した。全てのアッセイは、室温で行った。パー セプティブ・バイオシステムズ・サイトフルアー・II・フルオレセント・プレー ト・リーダー（Perceptive Biosystems Cytofluor II fluorescent plate reade r）を用いて生成物の蛍光（３６０nＭでの励起；４６０nＭでの発光）をモニタ ーし た。生成物の経過曲線は、ＡＭＣ生成物の形成後、２０〜３０分間にわたって得 られた。 阻害研究 経過曲線法を用いて有効な阻害薬を評価した。アッセイは、種々の濃度の試験 化合物の存在下で行った。阻害薬および基質の緩衝化溶液に酵素を添加すること により、反応を開始した。阻害薬の存在下、経過曲線の外観に依存して２つの方 法のうちの一方に従って、データ分析を行った。経過曲線が線形であるこれらの 化合物について、式１（Brandt et al.，Biochemistry，1989，28，140）： ｖ＝ＶmＡ／[Ｋa(１＋Ｉ／Ｋi app)＋Ａ］ （１） ［式中、ｖは、最大速度Ｖmについての反応速度であり、Ａは、ミカエリス定数 Ｋaを有する基質の濃度であり、Ｉは、阻害薬の濃度である］ に従って見かけの阻害定数（Ｋi app）を算出した。 経過曲線が時間依存性阻害の下方曲率特徴を示したこれらの化合物について、 個々のセットからのデータを分析し、式２： [ＡＭＣ]＝ｖssｔ＋(ｖ０−ｖss)[１−exp(−ｋobsｔ)]／ｋobs （２） ［式中、[ＡＭＣ]は、時間ｔにわたって形成された生成物の濃度であり、ｖ０は 、初期反応速度であり、ｖssは、最終定常状態速度である］ に従ってｋobsを得た。次いで、阻害薬濃度の一次関数としてｋobsの値を分析し て、時間依存性阻害を示す見かけの二次速度定数（ｋobs／阻害薬濃度またはｋo bs ／[Ｉ]）が得られる。この速度処理の完全な検討は、充分に開示されている（ Morrison et al.，Adv．Enzymol．Relat．Areas Mol．Biol.，1988，61，201） 。 このアッセイは、カテプシンＫの阻害薬のアフィニティーを測定する。当業者 は、さらなる研究のために有効なリード化合物であるように５０マイクロモル未 満のＫi値を示す化合物を考えるであろう。好ましくは、本発明の方法で用いら れる化合物は、１マイクロモル未満のＫi値を有する。最も好ましくは、該化合 物は、１００ナノモル未満のＫi値を有する。 ヒト破骨細胞吸収アッセイ 液体窒素ストレージから破骨細胞腫誘導細胞懸濁液のアリコットを取り出し、 迅速に３７℃で加温し、遠心分離（１０００rpm、４℃で５分間）によりＲＰＭ Ｉ−１６４０培地中で１回洗浄した。該培地を吸引し、ネズミ抗−ＨＬＡ−ＤＲ 抗体と交換し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で１：３に希釈し、氷上で３０分間イ ンキュベートした。該細胞懸濁液をよく混合した。 該細胞を、遠心分離（１０００rpm、４℃で５分間）により冷ＲＰＭＩ−１６ ４０で２回洗浄し、次いで、無菌の１５mＬ遠心管に移した。改良したニューバ ウエル計数チャンバー（Ｎeubauer counting chamber）において単核細胞の数を 数えた。 ヤギ抗マウスＩgＧで被覆した充分な大きさのビーズ（５／単核細胞）をそれ らのストック瓶から取り出し、新しい培地５mＬ中に置いた（これは、毒性アジ ド防腐剤を洗浄する）。磁石の上にビースを固定化することによって培地を除去 し、新しい培地と交換する。 該ビーズを細胞と混合し、該懸濁液を氷上で３０分間インキュベートした。該 懸濁液をよく混合した。ビーズ被覆細胞を磁石の上に固定化し、残りの細胞（破 骨細胞が豊富なフラクション）を無菌の５０mＬ遠心管中にデカントした。該ビ ーズ被覆細胞に新しい培地を添加して、捕獲した破骨細胞を移動させた。この洗 浄工程を１０回繰り返した。ビーズ被覆細胞を廃棄した。 大きな口径の使い捨てプラスチック製パスツールピペットを用いて計数チャン バーに試料を充填し、計数チャンバー中で破骨細胞を数えた。遠心分離により細 胞をペレット化し、破骨細胞の密度をＥＭＥＭ培地中１.５×１０4／mＬに調整 し、１０％ウシ胎児血清および１.７g／リットルの重炭酸ナトリウムで補足した 。細胞懸濁液のアリコット３mＬ（処理当たり）を１５mＬの遠心管にデカントし た。これらの細胞を遠心分離によりペレット化した。各管に適切な処理液３mＬ を添加した（ＥＭＥＭ培地中５０uＭに希釈した）。適切なビヒクル対照物、正 の対照物（１００ug／mＬに希釈した８７ＭＥＭ１）およびイソタイプ対照物（ １００ug／mＬに希釈したＩgＧ２ａ）も含まれた。これらの管を３７℃で３０分 間インキュベートした。 ４８ウエルプレート中の無菌象牙質薄片上に細胞のアリコット０.５mＬをまき 、３７℃で２時間インキュベートした。各処理液を４重にスクリーニングした。 該薄片を熱ＰＢＳ（６ウエルプレートにおいて１０mＬ／ウエル）中で６回交換 して洗浄し、次いで、新しい処理液または対照物中に置き、３７℃で４８時間イ ンキュベートした。次いで、該薄片をリン酸塩緩衝化生理食塩水中で洗浄し、２ ％グルタルアルデヒド（０.２Ｍカコジル酸ナトリウム中）中で固定し、次いで 、水で洗浄し、３７℃で５分間、バッファー中でインキュベートした。次いで、 該薄片を冷水中で洗浄し、４℃で５分間、冷酢酸塩バッファー／ファーストレッ ドガーネット中でインキュベートした。過剰のバッファーを吸引し、薄片を水中 で洗浄した後、風乾した。 明視野顕微鏡観察によりＴＲＡＰ陽性の破骨細胞を数え、次いで、超音波処理 により象牙質の表面から取り出した。Ｎikon／Ｌasertec ＩＬＭ２１Ｗ共焦顕微 鏡を用いてピットの体積を測定した。 実施例３：阻害薬の検出方法 有効な阻害薬を選択するための鋳型として、三次元原子構造を容易に用いるこ とができる。このために種々のコンピュータープログラムおよびデータベースが 利用可能である。良好な阻害薬は、少なくとも、標的に対する優れた立体的かつ 静電的相補性、覆われたわずかな量の疎水性表面および結合によりエントロピー 損失を最小にするのに充分な配座的剛性を有する。アプローチは、通常、いくつ かの工程からなる： １）標的とする領域を定義する。カテプシンＫの活性部位キャビティーを選択 することができるが、プロテアーゼ活性に必須である場所が有効な標的となる。 結晶構造が決定されているので、標的領域の空間的および化学的性質は、知られ ている。 ２）標的上に小分子を合体させる。多くの方法を用いて、これを行うことがで きる。非常に多くの小分子化合物をスクリーニングするために三次元構造のコン ピューターデータベースが利用可能である。これらの化合物のネガティブイメー ジを算出し、これを用いて、標的キャビティーの形状に適合させることができる 。 また、これらの化合物の水素結合供与体−受容体のプロフィルおよび親油性ポイ ントを用いて、標的のものを補足することもできる。当業者は、ヒットとして多 くの小分子またはフラグメントを同定することができる。 ３）認識フラグメントを連結し、伸長させる。前記の方法により同定したヒッ トを用いて、種々の官能基または小分子を単一の大分子中に取り込むことができ る。得られた分子は、より有効であり、高い特異性を有すると思われる。標的タ ンパクと相互に作用するであろう多くの原子またはフラグメントを付加するこに よって「シード」阻害薬を改良しようとすることもできるであろう。最初に定義 された標的領域は、容易に拡大して、さらに必要な拡大を得ることができる。 当該プロセスを介して、限定された数の有望な化合物を選択することができる 。次いで、それらを合成し、それらの阻害特性についてアッセイすることがでる 。成功率は、しばしば、２０％という高いものになり、コンピューターを使用す る方法における迅速な進行によりさらに高くなる。 実施例４：阻害薬による酵素の結晶化 Ａ．阻害薬の調製 化合物１．４−[Ｎ−[（フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１ −[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノンの 製造 ａ）３−ヒドロキシ−４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイ シル]−１−ピロリジンカルボン酸１,１ジメチルエチルエステル ３−ヒドロキシ−４−アミノ−１−ピロリジンカルボン酸１,１−ジメチルエ チルエステル（２０２mg、１.１４ミリモル）のＣＨ2Ｃl2（５mＬ）中溶液にＣ ＢＺ−ロイシン（３０２.９mｇ、１.１４ミリモル）、ＨＯＢＴ（１５４mg、１. １４ミリモル）およびＥＤＣ（２６２.２mｇ、１.３７ミリモル）を添加した。 該反応をＴＬＣ分析による完了まで撹拌し、次いで、ＥtＯＡcで希釈し、連続し て、pＨ４バッファー、飽和Ｋ2ＣＯ3、水および食塩水で洗浄した。有機層を乾 燥させ（ＭgＳＯ4）、濾過し、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ ３：１のＥtＯＡc：ヘキサン）に付して、標記化合物３２５mgを得た：ＭＳ(Ｅ Ｓ＋) ４５０.３(ＭＨ＋)、４７２.２(Ｍ＋Ｎａ)。 ｂ）３−ヒドロキシ−４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイ シル]−１−ピロリジン・塩酸塩 カルバメート（３１０mｇ、０.６９ミリモル）の乾燥ＥtＯＡc（５.０mＬ）中 溶液にＨＣlガスを約５分間通気させた。ＴＬＣ分析が出発物質の完全な消費を 示すまで、該反応を撹拌した。次いで、該反応を真空濃縮して、標記化合物２４ ９mgを得た：ＭＳ(ＥＳ＋)３５０.３(ＭＨ＋)。 ｃ）４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−[Ｎ−[ (フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノール 前工程からのアミン塩酸塩（２４９mｇ、０.６４ミリモル）のＣＨ2Ｃl2（１ ０mＬ）中溶液にＣＢＺ−ロイシン（１７０.４mg、０.６４ミリモル）、ＨＯＢ Ｔ（８６.５mg、０.６４ミリモル）、ＮＭＭ（３００uＬ）およびＥＤＣ（１４ ７.２mg、０.７７ミリモル）を添加した。該反応を室温で２時間撹拌し、次いで 、酢酸エチルで希釈し、前記に従って後処理した。残留物をカラムクロマトグラ フィー（３：１のＥtＯＡc：ヘキサン）に付して、標記化合物１０４mgを得た： ＭＳ(ＥＳ＋)５９７.１(ＭＨ＋)、６１９.１(Ｍ＋Ｎa)。 ｄ）４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−[Ｎ−[ (フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノン アルコール（１００mg、０.１７ミリモル）のアセトン（５.０mＬ）中０℃溶 液にジョーンズ試薬を、褐色が維持するまで滴下した。該反応を室温に加温し、 約４８時間撹拌し、次いで、イソプロパノールで急冷し、ＥtＯＡcで希釈し、連 続して、飽和Ｋ2ＣＯ3、水および食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭgＳ Ｏ4）、濾過し、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（３：１のＥtＯ Ａc：ヘキサン）に付して、標記化合物３１mgを得た：ＭＳ(ＥＳ＋)５９５.１( ＭＨ＋)、６１７.０(Ｍ＋Ｎａ)。 化合物２．４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１− Ｎ[Ｎ−(メチル)−Ｌ−ロイシル)]−３−ピロリジノンの製造 ａ）４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−[Ｎ− [(tert−ブトキシ)カルボニル]−Ｎ−(メチル)−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジ ノール ３−ヒドロキシ−４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル] −１−ピロリジン（３５０mg）の溶液にＮ−ＢＯＣ−Ｎ−メチル−ロイシン（２ ２２mg、０.９１ミリモル）、ＨＯＢＴ（１２２.５mg、０.９１ミリモル）、Ｅ ＤＣ（２０８.６mg、１.０８ミリモル）およびＮ−メチルモルホリン（０.３mＬ 、２.７２ミリモル）を添加した。該反応をＴＬＣ分析による完了まで室温で撹 拌した。後処理およびカラムクロマトグラフィー（１：１のヘキサン：ＥtＯＡc ）により、標記化合物４８０mgを得、これを以下の反応に用いた：ＭＳ(ＥＳ＋) ４７７.４、５７７.４(ＭＨ＋)、５９９.４(Ｍ＋Ｎa)。 ｂ）４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−[Ｎ−[ (tert−ブトキシ)カルボニル]−Ｎ−(メチル)−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノ ン 塩化オキサリル（０.１１mＬ、１.２３ミリモル）のＣＨ2Ｃl2中−７８℃溶液 にＤＭＳＯ（０.１７mＬ、２.４６ミリモル）を滴下した。該反応を−７８℃で ２０分間撹拌し、次いで、アルコール（４７４mg、０.８２ミリモル）のＣＨ2Ｃ l2中溶液を滴下した。該反応を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで、トリエチル アミン（０.５７mＬ）を一度に添加し、室温に加温した。後処理およびカラムク ロマトグラフィー（２：１のヘキサン：酢酸エチル）により、標記化合物２４７ mgを得た：ＭＳ(ＥＳ＋)４７５、５７５(Ｍ＋Ｈ)、５９７(Ｍ＋Ｎa)。 ｃ）４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−Ｎ[Ｎ −(メチル)−Ｌ−ロイシル)]−３−ピロリジノン塩酸塩 ＥtＯＡc／ＨＣlの室温溶液にカルバメートを添加した。該反応をＴＬＣ分析 による完了まで撹拌した。濃縮により、標記化合物を得た：ＭＳ(ＥＳ＋)４７５ (Ｍ＋Ｈ、１００％)。 化合物３．４−[Ｎ−[(４−ピリジルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]− １−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノン の製造 ａ）３−ヒドロキシ−４−[Ｎ−[(４−ピリジルメトキシ)カルボニル]−Ｌ− ロイシル]−１−ピロリジンカルボン酸１,１ジメチルエチルエステル 前記と同様の方法で、３−ヒドロキシ−４−アミノ−１−ピロリジンカルボン 酸１,１−ジメチルエチルエステルをイソ−ニコチノイルオキシカルボニルロイ シンとカップリングさせて、標記化合物８.５gを得た：ＭＳ(ＥＳ＋)４５１(Ｍ Ｈ＋、１００％)。 ｂ）３−ヒドロキシ−４−[Ｎ−[(４−ピリジルメトキシ)カルボニル]−Ｌ− ロイシル]−１−ピロリジン塩酸塩 前工程からのカルバメートをＥtＯＡc／ＨＣlで脱保護し、濃縮した後、標記 化合物８.４gを得た：ＭＳ(ＥＳ＋)３５１(ＭＨ＋、１００％)。 ｃ）４−[Ｎ−[(４−ピリジルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−[ Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノール ＣＢＺロイシナール（１５５mg）のＣＨ2Ｃl2中溶液にトリエチルアミン（０. ０９mＬ）および前工程からのアミン塩酸塩（２００mg、０.５２ミリモル）を添 加した。該反応を室温で２時間撹拌し、次いで、溶媒の大部分を真空除去した。 該混合物をＣＨ2Ｃl2に再溶解させ、トリアセトキシホウ水素化ナトリウムを添 加した。該反応を室温で４時間撹拌した。後処理およびカラムクロマトグラフィ ー（５％メタノール／クロロホルム）により、標記化合物２００.５mgを得た： ＭＳ(ＥＳ＋)５８３(ＭＨ＋、１００％)。 ｄ）４−[Ｎ−[(４−ピリジルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−[ Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノン 前工程からのアルコール（５０mg、０.０９ミリモル）のＤＭＳＯ（２mＬ）溶 液にトリエチルアミン（０.０７mＬ、０.５２ミリモル）およびピリジン／三酸 化硫黄複合体（４１mg、０.２６ミリモル）を添加した。該反応をＴＬＣ分析に よる完了まで室温に維持した。後処理およびクロマトグラフィー（５％メタノー ル／クロロホルム）により、標記化合物３７mgを得た：ＭＳ(ＥＳ＋)５８２(Ｍ Ｈ＋、１００％)。 化合物４．(３Ｓ)−３−[(Ｎ−ベンジルオキシカルボニル)−Ｌ−ロイシニル] アミノ−１−(１−プロポキシ)−５−メチル−２−ヘキサノの製造 (３Ｓ)−３−[(Ｎ−ベンジルオキシカルボニル)−Ｌ−ロイシニル]アミノ−１ −ジアゾ−５−メチル−２−ヘキサノン（１５０mg、０.３７ミリモル）を１− プロパノール（２.５ml）に溶解させ、次いで、酢酸ロジウム（２mg）を添加し 、該反応を室温で２時間撹拌した。該反応混合物をクロマトグラフィー（シリカ ゲル、２０％ＥtＯＡc／ヘキサン）に付して、白色固体として標記化合物を得た （５９mg、３７％）：ＭＳ(ＥＳ)Ｍ＋Ｈ+＝４３５、Ｍ＋ＮＨ4 +＝４５２、２Ｍ ＋Ｈ+＝８６９.６。 化合物５．ビス−(Ｃbz−ロイシニル)−１,３−ジアミノ−プロパン−２−オ ンの製造 Ｃbz−ロイシン（５００mg、１.８８ミリモル）、ＥＤＣＩ（５５８mg、１.８ ８ミリモル）を、１,３−ジアミノ−プロパン−２−オール（８５mg、０.９４ミ リモル）およびフニッヒ塩基（０.３ml、１.８８ミリモル）と一緒にＤＭＦ（４ .０ml）に溶解させ、室温で一晩撹拌した。該反応をＥtＯＡc（２０ml）で希釈 し、水（２×２０ml）で抽出した。合わせた有機物を硫酸マグネシウムで乾燥さ せ、濾過し、真空濃縮した。次いで、該中間体をアセトン（４.０ml）に溶解さ せ、ジョーンズ試薬（２.０ml、１.５Ｍ）を滴下し、該反応を室温で一晩撹拌し た。次いで、過剰のジョーンズ試薬をイソプロパノール（１.０ml）により急冷 し、次いで、該反応をＥtＯＡc（２０ml）で希釈し、水（２×２０ml）で抽出し て、無機塩を除去した。合わせた有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し 、濃縮し、クロマトグラフィー（シリカゲル、２−５％ＭeＯＨ／塩化メチレン ）に付して、白色固体として標記化合物（４１０mg、７５％）を得た。ＭＳ(Ｅ Ｓ)Ｍ＋Ｈ+＝５８３、Ｍ＋Ｎa+＝６０５。 化合物６．２−[Ｎ−(３−ベンジルオキシベンゾイル)]−２'−[Ｎ'−(Ｎ−ベ ンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル)]カルボヒドラジドの製造 ａ）３−ベンジルオキシ安息香酸メチル ＮaＨ（０.３９５g、９.８７ミリモル、鉱油中６０％）のＤＭＦ（２０mＬ） 中懸濁液に３−ヒドロキシ安息香酸メチル（１.０g、６.５８ミリモル）を添加 した。室温で１５分間撹拌した後、臭化ベンジル（１.１g、６.５８ミリモル） を添加した。室温て３時間撹拌した後、該溶液を酢酸エチルおよび水に分配させ た。有機層を水（２×７５mＬ）、重炭酸ナトリウム飽和水溶液および食塩水で 洗浄し、次いで、乾燥させ（ＭgＳＯ4）、濾過し、濃縮して、オフホワイト色の 固体（１.０１３g、４.２ミリモル）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz，ＣＤＣ l3）ｄ ７.６７(ｍ,２Ｈ)、７.４８−７.３４(ｍ,６Ｈ)、７.１９(ｍ,１Ｈ)、５ .１２(ｓ,２Ｈ)、３.９５(ｓ,３Ｈ)。 ｂ）３−ベンジルオキシ安息香酸 実施例６(ａ)の化合物（０.４００g、１.６５ミリモル）のＴＨＦ（２mL）お よび水（２mＬ）中溶液に水酸化リチウム一水和物（０.０７６g、１.８２ミリモ ル）を添加した。還流させながら５時間撹拌した後、該溶液を酢酸エチルおよび ３Ｎ ＨＣlに分配させた。有機層を食塩水で洗浄し、乾燥させ（ＭgＳＯ4）、濾 過し、濃縮して、白色固体（０.３５５g、１.５６ミリモル）を得た。1Ｈ ＮＭ Ｒ（４００ＭＨz,ＣＤ3ＯＤ）ｄ ７.５８(ｍ,２Ｈ)、７.３６-７.２４(ｍ,６Ｈ) 、７.１０(ｍ,１Ｈ)、５.０４(ｓ,２Ｈ)。 ｃ）２−[Ｎ−(３−ベンジルオキシベンゾイル)]−２'−[Ｎ'−(Ｎ−ベンジル オキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル)]カルボヒドラジド Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシンの代わりに３−ベンジルオキシ安息香酸を、２− [Ｎ−(Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル)]カルボヒドラジドの代わ りに２−[Ｎ−(Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル)]カルボヒドラ ジドを用いる以外は、下記実施例Ａの方法に従って、標記化合物を白色固体とし て製造した（０.０６２g、２５％）。ＭＳ(ＥＳＩ)：５４８.１(Ｍ＋Ｈ)+。 実施例Ａ ２−[Ｎ−(Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル)]−２'−[Ｎ'−(Ｎ−ベンジルオキ シカルボニル−Ｌ−アラニル)]カルボヒドラジドの製造 ２−[Ｎ−(Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニル)]カルボヒドラジド （０.１５０g、０.５０８ミリモル）のＤＭＦ（２mＬ）中撹拌溶液にＮ−アセチ ル−Ｌ−ロイシン（０.０９２g、０.５３４ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾ トリアゾール（０.０１４g、０.１０２ミリモル）および１−(３−ジメチルアミ ノプロピル)−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０.１０２g、０.５３４ミリモ ル）を添加した。室温で１６時間撹拌した後、該溶液を酢酸エチルで希釈し、連 続して、水、重炭酸ナトリウム飽和水溶液、および食塩水で洗浄した。有機層を 乾燥させ（ＭgＳＯ4）、濾過し、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー （シリカゲル、メタノール／ジクロロメタン）に付すことによって精製して、白 色固体として標記化合物（０.０２８g、１２％）を得た。ＭＳ(ＥＳＩ)：４５１ .１(Ｍ＋Ｈ)＋。 化合物７．(１Ｓ)−Ｎ−[２−[(１−ベンジルオキシカルボニルアミノ)−３− メチルブチル]チアゾール−４−イルカルボニル]−Ｎ'−(Ｎ−ベンジルオキシカ ルボニル−Ｌ−ロイシニル)ヒドラジドの製造 ａ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−(Ｌ)−ロイシンアミド −４０℃で、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−(Ｌ)−ロイシン（７.０g、２８ .１ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（１００mＬ）中溶液にクロロギ酸イソブチル（３. ８g、２８.１ミリモル）およびＮ−メチルモルホリン（６.０、５９ミリモル） を添加した。１５分間撹拌した後、該混合物にアンモニアをさらに１５分間通気 させ、次いで、室温に加温し、２時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を真空濃 縮して、白色固体として標記化合物（６.５、２８.０ミリモル〕を得た。1Ｈ Ｎ ＭＲ(４００ＭＨz,ＣＤＣl3)ｄ ６.３８(ｂｒ ｓ,１Ｈ)、５.８９(ｂｒ ｓ,１Ｈ )、５.０４(ｂｒ ｄ,１Ｈ)、４.１３(ｍ,１Ｈ)、１.７１−１.４９(ｍ,３Ｈ)、 １.３９(ｓ,９Ｈ)、０.９２(ｄｄ,６Ｈ)。 ｂ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−(Ｌ)−ロイシンチオアミド 実施例７(ａ)の化合物（６.５、２８.０ミリモル）の乾燥ＴＧＦ中撹拌溶液に ローソン試薬（６.８g、１６.９ミリモル）を添加し、アルゴン下、室温で一晩 、該混合物を撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をクロマトグラフィー（シリカ ゲル、１２％酢酸エチル／ヘキサン）に付して、白色固体として標記化合物を得 た（５.４g、７７％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz,ＣＤＣl3）ｄ ８.５４(ｂｒ ｓ,１Ｈ)、７.９７(ｂｒ ｓ,１Ｈ)、５.２８(ｂｒ ｄ,１Ｈ)、４.５２(ｍ,１Ｈ) 、 １.７２−１.５８(ｍ,３Ｈ)、１.４０(ｓ,９Ｈ)、０.９２(ｍ,６Ｈ)。 ｃ）(１Ｓ)−１−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ−１−(４−カルボエト キシチアゾール−２−イル)−３−メチルブタン アルゴン下、−１０℃で、実施例７(ｂ)の化合物（５.４ｇ、２１.７ミリモル )を乾燥アセトン（１００mＬ）中で撹拌した。ブロモピルビン酸エチル（４.７g 、２３.９ミリモル）を添加し、−１０℃で１時間撹拌した。該溶液をクロロホ ルムおよび水のよく撹拌した混合物中に注ぎ、次いで、重炭酸ナトリウム飽和水 溶液中に注いだ。有機相を分離し、水性層をクロロホルムで抽出した。合わせた 有機抽出物をＭgＳＯ4で乾燥させ、濾過し、油状物に濃縮した。−２０℃で１時 間、油状残留物をジクロロメタン中のＴＦＡＡ（５.０g、２３.９ミリモル）お よびピリジン（３.８g、４７.８ミリモル）で処理した。過剰の溶媒を真空除去 し、残留物をジクロロメタンに溶解させた。該溶液を、重炭酸ナトリウム飽和水 溶液および１.０Ｎ ＫＨＳＯ4でpＨが７になるまで洗浄した。該溶液を硫酸マグ ネシウムで乾燥させ、濾過し、油状物に濃縮し、これをクロマトグラフィー（シ リカゲル、７.５％酢酸エチル／ヘキサン）に付して、黄褐色固体として標記化 合物を得た（４.５g、６１％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz,ＣＤＣl3）ｄ ７.９ ８(ｓ,１Ｈ)、５.０４(ｂｒ ｄ,１Ｈ)、４.９５(ｍ,１Ｈ)、４.３１(ｑ,２Ｈ)、 １.８８(ｍ,１Ｈ)、１.６３(ｍ,２Ｈ)、１.４０(ｓ,９Ｈ)、１.３２(ｔ,３Ｈ)、 ０.８５(ｄｄ,６Ｈ)。 ｄ）(１Ｓ)−１−(ベンジルオキシカルボニル)アミノ−１−(４−カルボエト キシチアゾール−２−イル)−３−メチルブタン 実施例７(ｃ)の化合物（０.２５０g、０.７３１ミリモル）をＴＦＡ（２mＬ） に溶解させ、室温で１５分間撹拌した後、メタノールで希釈し、次いで、真空濃 縮した。残留物を塩化メチレンに溶解させ、トリエチルアミン（０.７３９g、７ .３１ミリモル）で処理し、次いで、クロロギ酸ベンジル（１.２g、７.３１ミリ モル）で処理した。該溶液を室温で２時間撹拌した後、酢酸エチル／水に分配さ せた。有機層を食塩水で洗浄し、回収し、乾燥させ（ＭgＳＯ4）、濃縮して残留 物を得、これをクロマトグラフィー（シリカゲル、１５％酢酸エチル／ヘキサン ） に付して、油状物として標記化合物を得た（０.１９８g、７２％）。1Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨz,ＣＤＣl3）ｄ ８.０１(ｓ,１Ｈ)、７.３２(ｍ,５Ｈ)、５.５１( ｂｒ ｄ,１Ｈ)、５.１４(ｍ,１Ｈ)、５.１０(ｓ,２Ｈ)、４.３７(ｑ,２Ｈ)、１. ９３(ｍ,１Ｈ)、１.８１−１.６７(ｍ,２Ｈ)、１.３９(ｔ,３Ｈ)、０.９５(ｍ, ６Ｈ)。 ｅ）(１Ｓ)−Ｎ−[２−[(１−ベンジルオキシカルボニルアミノ)−３−メチル ブチル]チアゾール−４−イルカルボニル]−Ｎ'−(Ｎ−ベンジルオキシカルボニ ル−Ｌ−ロイシニル)ヒドラジド 工程（ｃ）において(１Ｓ)−１−ベンジルオキシカルボニルアミノ−１−(２ −カルボエトキシチアゾール−４−イル)−３−メチルブタンの代わりに(１Ｓ) −１−(ベンジルオキシカルボニル)アミノ−１−(４−カルボエトキシチアゾー ル−２−イル)−３−メチルブタンを用いる以外は、実施例Ｂ(ａ)−(ｄ)の方法 に従って、標記化合物を製造した。ＭＳ(ＭＨ+)：６１０.０。 実施例Ｂ ( １Ｓ,２'Ｒ)−Ｎ−４−[[(１−ベンジルオキシカルボニル)アミノ]−３−メ チルブチル]チアゾール−２−イルカルボニル−Ｎ'−２'−(ベンジルオキシカル ボニル)アミノ−４'−メチルペンタノイルヒドラジドの製造 ａ）Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニルブロモメチルケトン エーテル（２２５mＬ）中の１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジ ン（６.６５g、４５.２ミリモル）を０℃に冷却した。４０％水酸化ナトリウム をゆっくりと添加し、０℃で３０分間、エーテル溶液中にジアゾメタンを回収し た。次いで、該エーテル溶液をデカントし、０℃で放置した。 Ｎ−Ｃbz−Ｌ−ロイシン（２.１０g、７.６ミリモル）をＴＨＦ（１０mＬ）に 溶解させ、−４０℃に冷却し、４−メチルモルホリン（０.７７g、７.６ミリモ ル、０.８３mＬ）を添加し、次いで、クロロギ酸イソブチル（１.０４g、７.６ ミリモル、０.９８mＬ）を滴下した。１５分後、該溶液を、予め製造したエーテ ル性ジアゾメタンの０℃溶液中に濾過した。得られた溶液を０℃で２３時間放置 した。ＨＢr（酢酸中３０％）（４５.２ミリモル、９mＬ）を添加し、得られた 溶液を０℃で５分間撹拌し、次いで、連続して、０.１Ｎ ＨＣl、ＮaＨＣＯ3飽 和水溶液および飽和食塩水で洗浄し、次いで、乾燥させ（ＭgＳＯ4）、濾過し、 濃縮して、無色の油状物として標記化合物を得た（２.４３g、９４％）。 ｂ）(１Ｓ)−１−ベンジルオキシカルボニルアミノ−１−(２−カルボエトキ シチアゾール−４−イル)−３−メチルブタン 実施例Ｂ(ａ)の化合物（１.５７ｇ、４.５８ミリモル）およびチオオキサミン 酸エチル（０.６１g、４.５８ミリモル）のエタノール（１０mＬ）中溶液を還流 させながら４時間加熱した。次いで、該溶液を冷却し、濃縮し、該残留物を１： ４の酢酸エチル／ヘキサンで溶離する２３０−４００メッシュのシリカゲル上で のフラッシュクロマトグラフィーに付すことによって精製して、黄色油状物とし て標記化合物を得た（１.０g、５８％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz,ＣＤＣl3） ｄ ７.４１(ｓ,１Ｈ)、７.３４−７.３１(ｍ,５Ｈ)、５.４０(ｄ,１Ｈ)、５.１ ０(ｄ,１Ｈ)、５.０５(ｄ,１Ｈ)、４.９８(ｑ,１Ｈ)、４.４８(ｑ,２Ｈ)、１.８ ０−１.７６(ｍ,２Ｈ)、１.５７−１.５３(ｍ,１Ｈ)、１.４４(ｔ,３Ｈ)、０.９ ５(ｄ,３Ｈ)、０.９３(ｄ,３Ｈ)。 ｃ）(１Ｓ)−１−ベンジルオキシカルボニルアミノ−１−(２−ヒドラジノカ ルボニルチアゾール−４−イル)−３−メチルブタン 実施例Ｂ(ｂ)の化合物（０.３０g、０.８ミリモル）およびヒドラジン水和物 （０.４０g、８.０ミリモル、０.３９mＬ）のエタノール（８mＬ）中溶液を室温 で２時間撹拌した。次いで、該溶液を濃縮して、白色泡状物として標記化合物を 得た（０.２８g、９８％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz,ＣＤＣl3）ｄ ８.２９( ｓ,１Ｈ)、７.３７−７.３５(ｍ,５Ｈ)、５.１８(ｄ,１Ｈ)、５.０９(ｄｄ,２Ｈ )、４.９５(ｑ,１Ｈ)、４.０７(ｄ,２)、１.７１(ｔ,２Ｈ)、１.５５(ｍ,１Ｈ) 、０.９６(ｄ,３Ｈ)、０.９４(ｄ,３Ｈ)。 ｄ）(１Ｓ,２'Ｒ)−Ｎ−４−[[(１−ベンジルオキシカルボニル)アミノ]−３ −メチルブチル]チアゾール−２−イルカルボニル−Ｎ'−２'−(ベンジルオキシ カルボニル)アミノ−４'−メチルペンタノイルヒドラジド 実施例Ｂ(ｃ)の化合物（１００mg、０.２８ミリモル）、Ｎ−Ｃbz−Ｌ−ロイ シン（８０.５mg、０.３０ミリモル）、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３ −エチルカルボジイミド塩酸塩（５８.２mg、０.３０ミリモル）および１−ヒド ロキシベンゾトリアゾール（７.５mg、０.０６ミリモル）のＤＭＦ（０.６ミリ モル）中溶液を室温で１８時間撹拌した。該溶液を酢酸エチルで希釈し、連続し て、水、０.１Ｎ ＨＣl、ＮaＨＣＯ3飽和水溶液および飽和食塩水で洗浄し、次 いで、乾燥させ（ＭgＳＯ4）、濾過し、濃縮した。残留物を、１：１の酢酸エチ ル／ヘキサンで溶離する２３０−４００メッシュのシリカゲル上でフラッシュク ロマトグラフィーに付すことによって精製して、白色固体として標記化合物を得 た（１１１.４mg、６６％）。融点１１０−１１２℃。 化合物８．２,２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニ ルカルボヒドラジドの製造 Ｎ−Ｃbz−Ｌ−ロイシン（ケミカル・ダイナミクス・コーポレーション（Ｃhe mical Ｄynamics Ｃorp.））（２.９４g、１１.１ミリモル）のＤＭＦ ２２mＬ 中撹拌溶液にカルボヒドラジド（０.５ｇ、５.６ミリモル）、１−(３−ジメチ ルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２.１３g、１１.１ミリ モル）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０.３g、２.２ミリモル）を 添加した。室温で２２時間撹拌した後、該溶液を水５００mＬ中に注いだ。真空 濾過によって沈殿物を回収し、水（４×１５０mＬ）およびジクロロメタン（４ ×１５０mＬ）で洗浄し、次いで、真空乾燥させて、白色固体として標記化合物 を得た（１.４９g、４６％）。ＭＳ(ＥＳＩ)：６０７.１(Ｍ＋Ｎａ)+。 化合物９．１−Ｎ−(Ｎ−イミダゾールアセチル−ロイシニル)−アミノ−３− Ｎ−(４−フェノキシ−フェニル−スルホニル)−アミノ−プロパン−２−オン ａ）１−Ｎ−(Ｎ−イミダゾールアセチル−ロイシニル)−アミノ−３−Ｎ−( ４−フェノキシフェニルスルホニル)−アミノ−プロパン−２−オン 「４−ピリジル酢酸」の代わりに「イミダゾール酢酸」を用いて、以下の実施 例Ｃ(ａ)−(ｄ)の方法に従って、標記化合物を製造した：ＭＳ(ＥＳ)Ｍ＋Ｈ+＝ ５４２。 実施例Ｃ １−Ｎ−(Ｎ−Ｃbz−ロイシニル)−アミノ−３−Ｎ−(２−ピリジル−スルホ ニル)−アミノ−プロパン−２−オンの製造 ａ）１−Ｎ−(Ｎ−Ｃbz−ロイシニル)−アミノ−３−Ｎ−(４−フェノキシ− フェニル−スルホニル)−アミノ−プロパン−２−オール ＤＭＦ（１００ml）およびＣbz-ロイシン（２０g、７５.５ミリモル）に１,３ −ジアミノプロパン−２−オール（６.７５g、７５ミリモル）を溶解させ、ＨＯ ＢＴ水和物（１１g、８１.５ミリモル）、およびＥＤＣＩ（１５.５g、８１.２ ミリモル）を添加した。該反応を室温で一晩撹拌した。該反応混合物の一部（３ ０ml）を真空濃縮し、次いで、エーテル（５０ml）およびＭeＯＨ(３０ml）を添 加した。塩酸のエーテル中１Ｎ溶液（１Ｍ、３０ml）を添加し、白色のガム状物 を形成し、エーテルで数回洗浄した。ＭeＯＨ−アセトンを添加し、ガム状物が 白色固体になるまで加熱した。白色固体をＤＭＦ（２５ml）およびＤＩＥＡ（５ ml）に溶解させ、次いで、塩化４−フェノキシフェニルスルホニルを添加した。 該反応を２時間撹拌し、真空濃縮し、次いで、クロマトグラフィー（シリカゲル 、１：１のＥtＯＡc：ヘキサン）に付して、白色固体として所望の生成物を得た 。 ｂ）ロイシニル−アミノ−３−Ｎ−(４−フェノキシフェニルスルホニル)−ア ミノ−プロパン−２−オール １−Ｎ−(Ｃbz−ロイシニル)−アミノ−３−Ｎ−(４−フェノキシ−フェニル −スルホニル)−アミノ−プロパン−２−オール（１.０g、１.８ミリモル）をＥ tＯＨ（３０ml）に溶解させ、次いで、１０％Ｐd／Ｃ（０.２２g）を添加し、次 いで、６Ｎ塩酸（２.５ml）を添加し、室温で４時間、水素ガスのバルーン下で 、該反応を撹拌した。該反応混合物を濾過し、濃縮し、トルエンと一緒に共沸さ せて、白色のガラスを得、これをさらには精製せずに次反応で用いた。 ｃ）１−Ｎ−(Ｎ−４−ピリジルアセチル−ロイシニル)−アミノ−３−Ｎ−( ４−フェノキシ−フェニル−スルホニル)−アミノ−プロパン−２−オール ロイシニル−アミノ−３−Ｎ−(４−フェノキシフェルスルホニル)−アミノ− プロパン−２−オール（０.３６g、０.７６ミリモル）をＤＭＦ（５ml）に溶解 させ、次いで、ＮＭＭ（０.４５ml、４ミリモル）を添加し、次いで、４−ピリ ジル酢酸（０.１３g、０.７５ミリモル）およびＨＢＴＵ（０.２９g、０.７６ミ リモル）を添加し、該反応を室温で一晩撹拌した。該反応混合物を真空濃縮し、 クロマトグラフィー（シリカゲル、５％ＭeＯＨ：塩化メチレン）に付して、白 色固体として所望の生成物を得た（９０mg）。ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ＋Ｈ+＝５５５。 ｄ）１−Ｎ−(Ｎ−４−ピリジルアセチル−ロイシニル)−アミノ−３−Ｎ−( ４−フェノキシ−フェニル−スルホニル)−アミノ−プロパン−２−オン １−Ｎ−(Ｎ−４−ピリジル−アセチル−ロイシニル)−アミノ−３−Ｎ−(４ −フェノキシ−フェニル−スルホニル)−アミノ−プロパン−２−オール（４５m g、０.０８ミリモル）をアセトン（５ml）に溶解させ、次いで、１Ｎ塩酸（２ml ）を添加した。該反応を真空濃縮し、次いで、アセトンに再溶解させた。ジョー ンズ試薬（１.５Ｍ、数滴）を添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。イ ソプロパノール（０.５ml）を添加し、反応混合物を真空濃縮した。該反応をpＨ ７バッファーで希釈し、次いで、ＥtＯＡcで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥さ せ、濾過し、真空濃縮し、次いで、クロマトグラフィー（シリカゲル、５％Ｍe ＯＨ−塩化メチレン）に付して、白色固体として所望の生成物を得た（２７mg、 ５０％）：ＭＳ(ＥＳ)：Ｍ＋Ｈ+＝５５３。 Ｂ．タンパクおよびタンパク−阻害薬複合体の結晶化 以下に記載する９種類の阻害薬のうち最初の８種類について、ヒトカテプシン Ｋをバキュロウイルス（baculovirus）細胞中で発現させた。発現したプロ−カ テプシンＫを含有するならし培地を、２５mＭリン酸塩バッファー（pＨ８）で予 め平衡化させたＳ−セファロース（Ｓepharose）カラムに直接負荷した。含有カ ラムをＮaＣl勾配液で溶離した。プロ−カテプシンＫを含有するフラクションを プールし、２.５mg／mlに濃縮し、２０mＭ Ｌ−システインおよび１％成熟カテ プシンＫをシードとして含有する５０mＭ酢酸ナトリウムバッファー（pＨ４.０ ）中で成熟カテプシンＫに活性化された。フルオロジェニック基質としてＣＢＺ −Ｐhe−Ａrg−ＡＭＣを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって該活性化をモニターし た。増大する比活性がプラトー（約１５マイクロモル／分／mg）に達した後、阻 害薬 の添加によって該反応を停止した。阻害された成熟カテプシンＫを濃縮し、２０ mＭ ＭＥＳ、５０mＭ ＮaＣl、２mＭ Ｌ-システイン（pＨ６）に対して透析した 。 ４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−１−Ｎ−[Ｎ−( メチル)−Ｌ−ロイシル)]−３−ピロリジノン（のみ）を用いるカテプシンＫ複 合体のためのタンパク調製 ヒトカテプシンＫをイ−・コリ（Ｅ.coli）中で発現させた。細菌培養物１Ｌ からの細胞ペレット２.３５gのを５０mＭトリス／ＨＣl、５mＭ ＥＤＴＡ、１５ ０mＭ ＮaＣl（pＨ８.０）の５０mＬで洗浄した。１３,０００ｘｇで１５分間遠 心分離した後、洗浄したペレットを、４℃で調製した同バッファー２５mＬに再 懸濁させ、１０,０００psiで細胞粉砕器（アベスティン（Ａvestin））に２回か けて、溶解させた。前記に従って、溶解物を遠心分離し、上清をデカントし、８ Ｍ尿素または６ＭグアニジンＨＣlを含有する５０mＭトリス／ＨＣl、１０mＭ ＤＴＴ、５mＭ ＥＤＴＡ、１５０mＭ ＮaＣl（pＨ８.０）２５mＬにペレットを 懸濁させた。４℃で３０分間撹拌した後、２３,０００ｘｇで３０分間遠心分離 することによって、不溶性細胞デブリを除去し、上清を濾過（０.４５um、ミリ ポア（Ｍillipore））により浄化した。 種々の量のカテプシンＫの酵素前駆体を素早く希釈することによって、撹拌し ているＮ2（ｇ）散布した５０mＭトリス／ＨＣl、５mＭ ＥＤＴＡ、１０mＭ還元 グルタチオンおよび１mＭ酸化グルタチオン、０.７Ｍ Ｌ−アルギニン（pＨ８. ０）中に再び切るように混ぜ、４℃で一晩撹拌した。ＹＭ−１０膜（アミコン（ Ａmicon））に適合した撹拌細胞を用いて約１mg／mＬに濃縮した後、試料を遠心 分離および濾過により浄化し、次いで、２５mＭ Ｎa2ＰＯ4、１.０Ｍ ＮａＣl（ pＨ７.０）に対して透析した。２５mＭ Ｎa2ＰＯ4、１.０Ｍ ＮaＣl（pＨ７.０ ）中で予備平衡化させたセファデックス（Ｓephadex）７５（ファルマシア（Ｐh armacia））の２.６×９０cmカラムにＬＦＲ＝２３cm／時で透析物を負荷した。 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察した場合の純度に基づいて、カテプシンＫ酵 素前駆体をプールした。 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶は、２０℃で約６ 日間のうちに約０.２mm3の大きさに成長した。結晶化において用いた阻害された カテプシンＫの濃度は、約８mg／mlであった。ハンギングドロップ法における蒸 気拡散の方法を用いて、カテプシンＫ−阻害薬複合体の溶液により結晶を成長さ せた。決定しようとする初期の結晶構造は、システインプロテアーゼ阻害薬Ｅ６ ４との複合体におけるカテプシンＫのものであった。Ｅ−６４と複合体形成した 成熟した活性化カテプシンＫの結晶は、２０℃で６日間のうちに約０.２mm3の大 きさに成長した。結晶化において用いたＥ−６４阻害されたカテプシンＫの濃度 は、８mg／mlであった。０.２Ｍ ＮaＣlを含有する１０％ＰＥＧ８００００、０ .１Ｍ Ｎa+／Ｋ+リン酸塩（pＨ６.２）の溶液によるハンギングドロップ法にお ける蒸気拡散法を用いた。該複合体の結晶は、ａ＝３８.４、ｂ＝５０.７および ｃ＝１０４.９Åのセル定数を有する斜方晶系空間群Ｐ２1２1２1である。この結 晶形は、フォームIIで示されるであろう。該結晶は、非対称単位中に１個の分子 を含有し、Ｖｍ値が２.１Ａ3／ダルトンである約４０％溶媒を含有する。５ＫＷ で操作するシ−メンス・ローテーティング・アノード・ジェネレート（Ｓiemens rotating anode generate）上でシーメンス（Ｓiemens）二次元座標感受性検出 器を用いて、単結晶からＸ線回折データを測定した。該構造は、Ｘ−ＰＬＯＲを 用いて分子置換法により決定した。パパインの主鎖の全原子およびこれらの側鎖 原子からなる初期モデルは、配列整列により決定されるように２つのタンパク間 で相同であると予想された。１０〜４ÅのＸ線回折データおよび３２Åの積分半 径を用いて交差回転関数を算出した。最高ピークは、６.０σであった。並進サ ーチは、最高ピーク１２.５σを生じる８〜３.５Åのデータを用いて行った。得 られたモデルは、０.４８８のＲc因子を与えた。このモデルは、剛体精密化によ り精密化され、得られた位相を用いて、係数|Ｆo−Ｆc|および|２Ｆo−Ｆc|を有 するフーリエマップを算出し、分子グラフィックスプログラムＦＲＯＤＯを用い て、カテプシンＫの原子モデルを作成した。慣用的な座標精密化を用いて、モデ ル作成の間に構造を精密化した。該構造は、Ｘ−ＰＬＯＲを用いて精密化した。 Ｅ６４についての電子密度は、マップにおいて明確であった。阻害薬は、密度に 組み込まれ、最終Ｒc０.１９１までさらに数回のマップ適合化および精密化の サイクルを行った。 カテプシンＫの３(Ｓ)−３−[(Ｎ−ベンジルオキシカルボニル)−Ｌ−ロイシ ニル]アミノ−５−メチル−１−(１−プロポキシ)−２−ヘキサノンとの複合体 の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を１０％イソプロ パノール、０.１Ｍ ＮaＰＯ4／クエン酸塩（pＨ４.２）の溶液により成長させた 。該複合体の結晶は、ａ＝５７.６Åおよびｃ＝１３１.２Åのセル定数を有する 正方晶系空間群Ｐ４3２1２である。この結晶形は、フォームIIIで示されるであ ろう。前記に従って、回折データを収集した。該結晶は、非対称単位中に１個の 分子を含有し、Ｖｍ値が２.３Å3／ダルトンである３６％溶媒を含有する。該構 造は、２.５Åの分解能でＸ−ＰＬＯＲを用いて分子置換法により決定した。初 期モデルは、カテプシンＫ−Ｅ６４構造の斜方晶系の全てのタンパク原子からな っていた。分子置換法は、カテプシンＫ−Ｅ６４構造決定について前記したと同 様に行った。このモデルは、Ｘ−ＰＬＯＲを用いて剛体精密化により精密化され 、得られた位相を用いて、係数|Ｆo−Ｆc|および|２Ｆo−Ｆc|を有するフーリエ マップを算出し、分子グラフィックスプログラムＦＲＯＤＯを用いて、阻害薬の 原子モデルを作成した。慣用的な座標精密化を用いて、モデル作成の間に構造を 精密化した。該構造は、Ｘ−ＰＬＯＲを用いて精密化した。最終Ｒc０.２４５ま で数回のマップ適合化および精密化のサイクルを行った。 カテプシンＫの２−[Ｎ−(３−ベンジルオキシベンゾイル)]−２'−[Ｎ'−(Ｎ −ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル)]カルボヒドラジドとの複合体の 結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を、０.１５Ｍ Ｌ i2ＳＯ4を含有する２２.５％ＰＥＧ ８０００、０.０７５Ｍ酢酸ナトリウム（p Ｈ４.５）の溶液により成長させた。該複合体の結晶は、フォームIIIとして成長 した。前記に従って、回折データを算出した。該構造は、２.４Åの分解能で前 記フォームIIIタンパクモデルを用いて、Ｘ−ＰＬＯＲによる剛体精密化により 決定した。係数|Ｆo−Ｆc|および|２Ｆo−Ｆc|を有するフーリエマップを用い、 分子グラフィックスプログラムＦＲＯＤＯを用いて、阻害薬の原子モデルを適合 させた。慣用的な座標精密化（Ｘ−ＰＬＯＲ）を用いて、モデル作成の間に構造 を精密化した。最終Ｒc０.２３７まで数回のマップ適合化および精密化のサイク ルを行った。 カテプシンＫのビス−(Ｃbz−ロイシニル)−１,３−ジアミノプロパン−２− オンとの複合体の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を１０％イソプロ パノール、０.１Ｍ ＮaＰＯ4／クエン酸塩（pＨ４.２）の溶液により成長させた 。該複合体の結晶は、フォームIIIとして成長した。前記に従って、回折データ を収集した。該構造は、２.６Åの分解能で前記フォームIIIタンパクモデルの剛 体精密化により決定した。係数|Ｆo−Ｆc|および|２Ｆo−Ｆc|を有するフーリエ マップを用い、分子グラフィックスプログラムＦＲＯＤＯを用いて、阻害薬の原 子モデルを適合させた。慣用的な座標精密化を用いて、モデル作成の間に構造を 精密化した。最終Ｒc０.２１０まで数回のマップ適合化および精密化のサイクル をＸ−ＰＬＯＲを用いて行った。 カテプシンＫの４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]− １−Ｎ[Ｎ−(メチル)−Ｌ−ロイシル)]−３−ピロリジノンとの複合体の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を、０.１２Ｍ Ｌ i2ＳＯ4を含有する１８％ＰＥＧ ８０００、０.６Ｍ酢酸ナトリウム（pＨ４.５ ）の溶液により成長させた。該複合体の結晶は、フォームIIIにおいて成長した 。前記に従って、回折データを収集した。該構造は、２.４Åの分解能でＸ−Ｐ ＬＯＲによる前記フォームIIIタンパクモデルの剛体精密化により決定した。係 数|Ｆo−Ｆc|および|２Ｆo−Ｆc|を有するフーリエマップを用い、分子グラフイ ックスプログラムＦＲＯＤＯを用いて、阻害薬の原子モデルを適合させた。慣用 的な座標精密化を用い、Ｘ−ＰＬＯＲを用いてモデル作成の間に構造を精密化し た。最終Ｒc０.２１８まで数回のマップ適合化および精密化のサイクルを行った 。 カテプシンＫの(１Ｓ)−Ｎ−[２−[(１−ベンジルオキシカルボニルアミノ)− ３−メチルブチル]チアゾール−４−イルカルボニル]−Ｎ'−(Ｎ−ベンジルオキ シカルボニル−Ｌ−ロイシニル)ヒドラジドとの複合体の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を３０％ＭＰＤ、 ０.１Ｍ ＭＥＳ（pＨ７.０）および０.１Ｍトリスバッファー（pＨ７.０）の溶 液により成長させた。該複合体の結晶は、フォームIIである。前記に従って、回 折データを収集した。該構造は、２.３Åの分解能でＸ−ＰＬＯＲによる前記フ ォームIIタンパクモデルの剛体精密化により決定した。係数|Ｆo−Ｆc|および| ２Ｆo−Ｆc|を有するフーリエマップを用い、分子グラフィックスプログラムＦ ＲＯＤＯを用いて、阻害薬の原子モデルを適合させた。慣用的な座標精密化を用 い、Ｘ−ＰＬＯＲを用いてモデル作成の間に構造を精密化した。最終Ｒc０.２１ １まで数回のマップ適合化および精密化のサイクルを行った。 カテプシンＫの２,２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイ シニルカルボヒドラジドとの複合体の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を３３％ＭＰＤ、 ０.１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ７）の溶液により成長させた。該複合体の結晶は、フォー ムIIとして成長した。前記に従って、回折データを収集した。該構造は、２.２ Åの分解能でＸ−ＰＬＯＲによる前記フォームIIタンパクモデルの剛体精密化に より決定した。係数|Ｆo−Ｆc|および|２Ｆo−Ｆc|を有するフーリエマップを用 い、分子グラフィックスプログラムＦＲＯＤＯを用いて、阻害薬の原子モデルを 適合させた。慣用的な座標精密化を用い、Ｘ−ＰＬＯＲを用いてモデル作成の間 に構造を精密化した。最終Ｒc０.２０８まで数回のマップ適合化および精密化の サイクルを行った。 カテプシンＫの４−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]− １−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリジノン との複合体の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を２８％ＭＰＤ、 ０.１Ｍ ＭＥＳ（pＨ７.０）および０.１トリスバッファー（pＨ７.０）の溶液 により成長させた。該複合体の結晶は、フォームIIである。前記に従って、回折 データを収集した。該構造は、２.３Åの分解能でＸ−ＰＬＯＲによる前記フォ ームIIタンパクモデルの剛体精密化により決定した。係数|Ｆo−Ｆc|および|２ Ｆo−Ｆc|を有するフーリエマップを用い、分子グラフィックスプログラムＦＲ ＯＤＯを用いて、阻害薬の原子モデルを適合させた。慣用的な座標精密化を用い 、Ｘ−ＰＬＯＲを用いてモデル作成の間に構造を精密化した。最終Ｒc０.１９３ まで数回のマップ適合化および精密化のサイクルを行った。 カテプシンＫの４−[Ｎ−[(４−ピリジルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシ ル]−１−[Ｎ−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−ロイシル]−３−ピロリ ジノンとの複合体の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を３０％ＭＰＤ、 ０.１Ｍ ＭＥＳ（pＨ７.０）および０.１トリスバッファー（pＨ７.０）の溶液 により成長させた。該複合体の結晶は、フォームIIである。前記に従って、回折 データを収集した。該構造は、２.２Åの分解能でＸ−ＰＬＯＲによる前記フォ ームIIタンパクモデルの剛体精密化により決定した。係数|Ｆo−Ｆc|および|２ Ｆo−Ｆc|を有するフーリエマップを用い、分子グラフィックスプログラムＦＲ ＯＤＯを用いて、阻害薬の原子モデルを適合させた。慣用的な座標精密化を用い 、Ｘ−ＰＬＯＲを用いてモデル作成の間に構造を精密化した。最終Ｒc０.２６７ まで数回のマップ適合化および精密化のサイクルを行った。 カテプシンＫの１−Ｎ−(Ｎ−イミダゾールアセチル−ロイシニル)−アミノ− ３−Ｎ−(４−フェノキシ−フェニル−スルホニル)−アミノ−プロパン−２−オ ンとの複合体の結晶化 阻害薬と複合体形成した成熟した活性化カテプシンＫの結晶を、０.１２Ｍ Ｌ i2ＳＯ4を含有する１８％ＰＥＧ ８０００、０.６Ｍ酢酸ナトリウム（pＨ４.５ ）の溶液により成長させた。該複合体の結晶は、フォームIIIである。前記に従 って、回折データを収集した。該構造は、２.５Åの分解能でＸ−ＰＬＯＲによ る前記フォームIIタンパクモデルの剛体精密化により決定した。係数|Ｆo−Ｆc| および|２Ｆo−Ｆc|を有するフーリエマップを用い、分子グラフィックスプログ ラムＦＲＯＤＯを用いて、阻害薬の原子モデルを適合させた。慣用的な座標精密 化を用い、モデル作成の間に構造を精密化した。最終Ｒc０.２４６まで数回のマ ッ プ適合化および精密化のサイクルをＸ−ＰＬＯＲを用いて行った。 略語 Ｅ−６４、[１−[Ｎ−[(Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カル ボニル)−Ｌ−ロイシル]アミノ]−４−グアニジノブタン］ ＣＢＺ、ベンジルオキシカルボニル ＡＭＣ、アミノメチルクマリン ＭＰＤ、２−メチル−２,４−ペンタンジオール ＰＩＰＥＳ、ピペラゾン−Ｎ,Ｎ−ビス(２−エタンスルホン酸) ＭＥＳ、２−(Ｎ−モルホリノ)−エタンスルホン酸 トリス、トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン ＰＥＧ、ポリエチレングリコール Ｍ、モル Ｒc＝Σ|(Ｆo−Ｆc)|／Ｆo Ｆo＝構造アンプリチュードの測定値 Ｆc＝構造アンプリチュードの理論値 ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸 ＤＴＴ、１,４−ジチオトレイトール ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動法 本発明は、本明細書に記載した特定の具体例によって範囲を限定されるもので はない。実際、当業者には、前記のことから本明細書に記載した具体例に加えて 本発明の種々の変形例が明らかになるであろう。かかる変形例は、添付した請求 の範囲の範囲内となるものである。 本明細書で引用した特許、特許出願および刊行物の記載は、出典明示により本 明細書の一部とする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＥＤ (31)優先権主張番号 ６０／００８，９９２ (32)優先日 1995年12月21日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０１３，７４７ (32)優先日 1996年３月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０１３，７４８ (32)優先日 1996年３月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０１３，７６４ (32)優先日 1996年３月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０１７，４５５ (32)優先日 1996年５月17日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０１７，８９２ (32)優先日 1996年５月17日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０２０，４７８ (32)優先日 1996年６月13日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０２２，０４７ (32)優先日 1996年７月22日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０２３，４９４ (32)優先日 1996年８月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０２３，７４２ (32)優先日 1996年８月８日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カー，トーマス・ジョゼフ アメリカ合衆国19460ペンシルベニア州 フェニックスビル、ジョナサン・ドライブ 27番 (72)発明者 デスジャーレイス，レネー・ルイス アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州 セント・デイビズ、コーンウォール・サー クル11番 (72)発明者 ギャラガー，ティモシー・フランシス アメリカ合衆国19438ペンシルベニア州 ハーレーズビル、マナー・ロード255番 (72)発明者 ハルバート，ステイシー・マリー アメリカ合衆国19438ペンシルベニア州 ハーレーズ・ビル、モンゴメリー・ドライ ブ149番 (72)発明者 ジャンソン，シェリル・アン アメリカ合衆国19010ペンシルベニア州 ブリン・モーア、ラドブローク・ロード 200番 (72)発明者 マーキス，ロバート・ウェルズ・ジュニア アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州 セント・デイビズ、キャンブリア・コート 115番 (72)発明者 オー，ハイ−ジャ アメリカ合衆国19341ペンシルベニア州 エクストン、ロング・リッジ・レイン326 番 (72)発明者 ル，ユ アメリカ合衆国19083ペンシルベニア州 ヘイバータウン、ギルモア・ロード109番 (72)発明者 スミス，ワード・ホイットロック・ジュニ ア アメリカ合衆国19010ペンシルベニア州 ブリン・モーア、ラドブローク・ロード 200番 (72)発明者 トンプソン，スコット・ケビン アメリカ合衆国19460ペンシルベニア州 フェニックスビル、ギルフォード・サーク ル75番 (72)発明者 ベバー，ダニエル・フランク アメリカ合衆国19002ペンシルベニア州 アンブラー、ベイトルソン・ロード290番 (72)発明者 ヤマシタ，デニス・シンジ アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州 キング・オブ・プルシア、エッジウッド・ ロード 703番 (72)発明者 イェン，ジャック・フェクウォ アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州 マルバーン、フェニックスビル・パイク 273番 (72)発明者 ツァオ，バオグァン アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州 キング・オブ・プルシア、エイ312、サウ ス・ヘンダーソン・ロード649番

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．カテプシンＫの阻害を必要とする哺乳動物に、カテプシンＫの活性部位に 空間的に適合する化合物を投与することからなるカテプシンＫの阻害方法であっ て、その化合物が、以下のいずれか２つの基を含有してなることを特徴とする方 法： （ｉ）システイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素原子（ここに、該 親電子炭素原子は該硫黄原子から１.７−４.０Åの距離にある）； （ii）トリプトファン１８４と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心 とトリプトファン１８４の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０−７.１０Åであ る）； （iii）チロシン６７、メチオニン６８、アラニン１３４、ロイシン１６０お よびロイシン２０９と相互作用し、疎水性ポケットを形成する疎水基であって、 該疎水基の中心と該疎水性ポケットのアミノ酸残基の側鎖原子の中心の間が一定 の距離離れており、その距離がチロシン６７：４.９１−５.９１Å、メチオニン ６８：５.７４−６.７４Å、アラニン１３４：４.１５−５.１５Å、ロイシン１ ６０：６.１８−７.１８Åおよびロイシン２０９：５.７１−６.７１Åである疎 水基； （iv）チロシン６７と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心とチロシ ン６７の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０−７.１０Åである）； （ｖ）グリシン６６のアミド窒素により供与される水素原子と相互作用する、 ｐＫaが７未満のアミノ基または酸素原子（ここに、これら２個の原子の間の距 離は２.７−３.５Åである）； （vi）グルタミン２１、システイン２２およびグリシン２３の主鎖原子と相互 作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心とグルタミン２１、システイン２２お よびグリシン２３の中心の間の距離は、各々、３.７−５.４、４.９−５.７およ び５.４−６.７Åである）；または （vii）グルタミン１４３およびアスパラギン１６１の側鎖原子およびアラニ ン １３７およびセリン１３８の主鎖と相互作用する疎水基（ここに、疎水基の中心 とグルタミン１４３、アスパラギン１６１、アラニン１３７およびセリン１３８ の中心の間の距離は、各々、７.９−９.６Å、４.７−５.４Å、４.２−５.５Å および４.６−６.４Åである）。 ２．カテプシンＫの阻害を必要とする哺乳動物に、カテプシンＫの活性部位に 空間的に適合する化合物を投与することからなるカテプシンＫの阻害方法であっ て、その化合物が、以下のいずれか３またはそれ以上の基を含有してなることを 特徴とする方法： （ｉ）システイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素原子（ここに、該 親電子炭素原子は該硫黄原子から１.７−４.０Åの距離にある）； （ii）トリプトファン１８４と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心 とトリプトファン１８４の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０−７.１０Åであ る）； （iii）チロシン６７、メチオニン６８、アラニン１３４、ロイシン１６０お よびロイシン２０９と相互作用し、疎水性ポケットを形成する疎水基であって、 該疎水基の中心と該疎水性ポケットのアミノ酸残基の側鎖原子の中心の間が一定 の距離離れており、その距離がチロシン６７：４.９１−５.９１Å、メチオニン ６８：５.７４−６.７４Å、アラニン１３４：４.１５−５.１５Å、ロイシン１ ６０：６.１８−７.１８Åおよびロイシン２０９：５.７１−６.７１Åである疎 水基； （iv）チロシン６７と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心とチロシ ン６７の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０−７.１０Åである）； （ｖ）グリシン６６のアミド窒素により供与される水素原子と相互作用する、 ｐＫaが７未満のアミノ基または酸素原子（ここに、これら２個の原子の間の距 離は２.７−３.５Åである）； （vi）グルタミン２１、システイン２２およびグリシン２３の主鎖原子と相互 作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心とグルタミン２１、システイン２２お よびグリシン２３の中心の間の距離は、各々、３.７−５.４、４.９−５.７およ び５.４−６.７Åである）；または （vii）グルタミン１４３およびアスパラギン１６１の側鎖原子およびアラニ ン１３７およびセリン１３８の主鎖と相互作用する疎水基（ここに、疎水基の中 心とグルタミン１４３、アスパラギン１６１、アラニン１３７およびセリン１３ ８の中心の間の距離は、各々、７.９−９.６Å、４.７−５.４Å、４.２−５.５ Åおよび４.６−６.４Åである）。 ３．カテプシンＫの阻害を必要とする哺乳動物ヒトに、カテプシンＫの活性部 位に空間的に適合する化合物を投与することからなるカテプシンＫの阻害方法で あって、その化合物が、以下の基を有してなることを特徴とする方法： （ｉ）システイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素原子（ここに、該 親電子炭素原子は該硫黄原子から１.７−４.０Åの距離にある）；および （ii）トリプトファン１８４と相互作用する疎水基（ここに、該疎水基の中心 とトリプトファン１８４の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０−７.１０Åであ る）。 ４．トリプトファン１８４と相互作用する疎水基が芳香族基である請求項３記 載の方法。 ５．トリプトファン１８４と相互作用する芳香族基の中心が、システイン２５ の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素の中心から９.２４−１１.２４Åの距離に ある請求項４記載の方法。 ６．システイン２５の側鎖硫黄原子に結合する親電子炭素がカルボニル炭素で ある請求項３記載の方法。 ７．化合物が、さらに、 中心が親電子炭素から５.４４−６.９４Åの距離にあり； チロシン６７、メチオニン６８、アラニン１３４、ロイシン１６０およびロイ シン２０９と相互作用し、疎水性ポケットを形成し；および 疎水基の中心と該疎水性ポケットのアミノ酸残基の側鎖原子の中心の間で、チ ロシン６７：４.９１−５.９１Å、メチオニン６８：５.７４−６.７４Å、アラ ニン１３４：４.１５−５.１５Å、ロイシン１６０：６.１８−７.１８Åおよび ロイシン２０９：５.７１−６.７１Åの距離幅を有する 疎水基を有してなる請求項３記載の方法。 ８．疎水性ポケットと相互作用する疎水基がイソブチル基である請求項７記載 の方法。 ９．化合物が、さらに、チロシン６７と相互作用する疎水基を含有してなる（ ここに、疎水基の中心とチロシン６７の側鎖原子の中心の間の距離は４.１０− ７.１０Åである）請求項３記載の方法。 １０．チロシン６７と相互作用する疎水基が芳香族基である請求項９記載の方 法。 １１．化合物が、さらに、ｐＫaが７未満であるアミノ基または酸素原子を有 する化合物からなり、その各々がグリシン６６のアミド窒素により供与される水 素原子と相互作用する（これら２個の原子の距離は２.７−３.５Åである）請求 項３記載の方法。 １２．化合物が、さらに、グルタミン２１、システイン２２およびグリシン２ ３の主鎖原子と相互作用する疎水基を有し、その疎水基の中心とグルタミン２１ 、システイン２２およびグリシン２３の中心の間の距離が、各々、３.７−５.４ 、４.９−５.７および５.４−６.７Åである請求項３記載の方法。 １３．グルタミン２１、システイン２２およびグリシン２３と相互作用する疎 水基がイソブチル基である請求項１２記載の方法。 １４．化合物が、さらに、グルタミン１４３およびアスパラギン１６１の側鎖 原子と、アラニン１３７およびセリン１３８の主鎖と相互作用する疎水基を有し 、その疎水基の中心とグルタミン１４３、アスパラギン１６１、アラニン１３７ およびセリン１３８の中心の間の距離が、各々、７.９−９.６Å、４.７−５.４ Å、４.２−５.５Åおよび４.６−６.４Åである請求項３記載の方法。 １５．化合物が： ３（Ｓ）−３−［（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシニル］アミ ノ−５−メチル−１−（１−プロポキシ）−２−ヘキサノン； ４−［Ｎ−［（４−ピリジルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１− ［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノ ン； ４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−Ｎ− ［Ｎ−（メチル）−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノン； ４−［Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−１−［Ｎ −［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル］−３−ピロリジノン； ビスー（Ｃbz−ロイシニル）−１,３−ジアミノ−プロパン−２−オン； ２−［Ｎ−（３−ベンジルオキシベンゾイル）］−２'−［Ｎ'−（Ｎ−ベンジ ルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニル）］カルボヒドラジド； （ＩＳ）−Ｎ−［２−［（１−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−メチ ルブチル］チアゾール−４−イルカルボニル］−Ｎ'−（Ｎ−ベンジルオキシカ ルボニル−Ｌ−ロイシニル）ヒドラジド； １−Ｎ−（Ｎ−イミダゾール アセチル−ロイシニル）−アミノ−３−Ｎ−（ ４−フェノキシ−フェニル−スルホニル）−アミノ−プロパン−２−オン；また は ２,２'−Ｎ,Ｎ'−ビス−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシニルカルボ ヒドラジド； またはその医薬上許容される塩である請求項１記載の方法。 １６．結晶形のカテプシンＫを含有してなる組成物。 １７．カテプシンＫが表ＸＸIXにおけるアミノ酸で形成される活性部位腔を有 する請求項１６記載の組成物。 １８．活性部位が表Ｉ−Ｘの座標からなる群より選択される座標により特徴付 けられる請求項１７記載の組成物。 １９．カテプシンＫ結晶の化合物。 ２０．表ＸＸIXに列挙した残基により形成され、表Ｉの蛋白質座標により特定 される触媒上活性な部位を含有してなる構成を有する単離され、適当に折りたた まれたカテプシンＫ分子またはそのフラグメント。 ２１．請求項１７のカテプシンＫの活性部位腔と結合するペプチド、ペプチド 模倣体または合成分子。 ２２．カテプシンＫに結合し、その蛋白質分解活性の阻害能を有する阻害剤化 合物を同定する方法であって、 表ＸＸIXに列挙された残基により形成され、表Ｉの蛋白質座標により特定され る触媒上活性な部位を有してなるカテプシンＫ分子の活性部位の構成を特定する 適当なコンピュータープログラム情報（ここに該プログラムはその三次元構造を 示す）に導入し； 該コンピュータープログラムにてその活性部位腔の三次元描写を創造し； 該試験化合物のモデルを該活性部位のモデル上に表示かつ重ね； 該試験化合物モデルが空間的にその活性部位に適合するかどうかを評価し； その活性部位に空間的に適合する試験化合物を調製し； その試験化合物を該活性部位により特徴付けられるプロテアーゼについての生 物学的アッセイにて用い； 該試験化合物が該アッセイにてカテプシンＫ活性を阻害するかどうかを決定す る ことからなる阻害剤の同定方法。 ２３．請求項２２の方法により同定されるペプチド、ペプチド模倣体または合 成分子。 ２４．カテプシンＫ結晶の構造座標を用い、カテプシンＫの活性部位と会合す ることについての化合物をコンピューターで評価することからなる薬物設計の方 法。 ２５．化合物がカテプシンＫの競合的または非競合的阻害剤である請求項２４ 記載の方法。 ２６．表ＸＸIXに列挙された残基により形成される触媒上活性な部位により特 徴付けられるカテプシンＫ分子の活性部位またはそのフラグメントに競合的に結 合する阻害剤を同定する方法であって、 プロテアーゼの活性部位の座標をコンピューター化モデルシステムに提供し； その構造物と結合するであろう化合物を同定し；および プロテアーゼ阻害生物活性について同定した化合物をスクリーンする ことからなる方法。
JP9517568A 1995-10-30 1996-10-30 カテプシンｋの阻害法 Withdrawn JPH10512300A (ja)

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