JP2002511844A - ウロキナーゼレセプターの阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウロキナーゼレセプターへのウロキナーゼの結合を阻害する因子であるペプチドに関する。これらのペプチドは、好ましくは環状であり、ウロキナーゼとそのレセプターによってもたらされる疾患に対する薬剤として適している。

Description

【発明の詳細な説明】 ウロキナーゼレセプターの阻害 本発明は、ウロキナーゼレセプターへのウロキナーゼの結合を阻害する因子で あるペプチドに関する。好ましくは環状になっている、これらのペプチドは、ウ ロキナーゼとそのレセプターによってもたらされる疾患に対する薬剤として適し ている。 セリンプロテアーゼであるuPA（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子 ）は、細胞の侵襲性および移動、ならびに組織の再造形に必要とされる、細胞外 基質物質のタンパク質分解など、さまざまな生理学的および病理学的な過程に関 与している。uPAは、細胞表面にある膜結合uPAレセプター（uPAR）に高い親和性 （K₀＝10^-10〜10^-9M）をもって結合する。 uPAレセプターへのuPAの結合は、悪性腫瘍の転移による展開、色素体移植、炎 症、および新血管形成などの多くの侵襲的な生物学的過程に関係する。このため 、uPAの拮抗剤は、腫瘍の侵襲性、転移性展開、および新脈管形成を阻害するこ とができる。uPA拮抗剤は、例えば、乳癌、肺癌、腸癌、および卵巣癌など、腫 瘍の侵襲性病巣にuPAおよびuPARが存在している侵襲性かつ転移性の癌疾患（Dan o et al.，ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子に対するレセプター：癌の 侵襲過程での細胞外タンパク質分解におけるストローマ細胞の関与（The recept or for urokinase plasminogen activator:Stromal cell involvement in extra cellular proteolysis during cancer invasion）、Barrett，A．J.およびBond ，J.編、タンパク質分解とタンパク質の反転より（Proteolysis and Protein Tu rnover）、ポートランドプレス（Portland Press）、ロンドン、1994、239）を 治療するための薬剤として用いることができる。さらに、uPA拮抗剤は、他の目 的、例えば、関節炎、炎症、骨粗しょう症、網膜症などの疾患を治療するため、 および避妊のためなど、プラスミノーゲンのタンパク質分解による活性化を阻害 することが必要とされる他の目的のために使用することもできる。 uPAレセプターは、国際公開公報第90/12091号、ならびにプロウグら（Plougら 、J.Biol.Chem.268(1993)，17539）およびロンら（Ronneら、J.Immunol.Methods 167(1994)，91）の刊行物に記載されている。 uPAは、単鎖分子（uPA前駆体）として合成され、活性のある二本鎖uPAに酵素 的に変換される。uPA分子は、Ｎ末側成長因子様ドメイン（GFD、uPA1〜46）、ク リングル構造ドメイン（uPA45〜135）、およびセリンプロテアーゼドメイン（uP A159〜411）という、構造的に独立した3つのドメインから構成されている。GFD とクリングルドメインが一緒になって、二本鎖uPAをさらにタンパク質分解して 産生される、いわゆるuPAのアミノ末端側断片（ATF、uPA1〜135）を構成する。A TFは、uPAと同程度の親和性をもって、uPAレセプターに結合する。 uPAの12番目から32番目のアミノ酸残基を含むペプチドは（この場合、19番目 のシステインがアラニンに置換されているが）、uPAレセプターへの結合に関し てATFと競合するため、uPAのレセプター結合領域は、アミノ酸12位から32位に及 んでいることになる（Appella et al.，J．Biol．Chem．262(1987)，4437-4440 ）。また、この刊行物には、このペプチドが、12位と32位の２つのシステイン残 基を架橋して環状化された後も、uPAレセプターへの親和性をもつことが示され ている。別の研究において、グッドソン（Goodson）ら（Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 91(1994)，7129-7133）は、バクテリオファージのペプチドライブラリー をスクリーニングして、uPARに対して拮抗的なuPAペプチドを同定した。これら のペプチドは、天然uPAのuPAR結合配列との明らかな配列相同性がなかった。 uPAのuPAR結合領域をさらに調べたことについて、最近の刊行物で説明されて いる（Rettenberger et al.，Biol．Chem．Hoppe-Seyler 376(1995)，587-594;M agdolen et al.，Eur．J．Biochem．237(1996)，743-751;Goretzki et al.，Fib rinolysis and Proteolysis 11(1997)，11-19）。Cys19、Lys23、Tyr24、Phe25 、Ile28、Trp30、およびCys31という残基が、uPA/uPAR相互作用にとって重要な 決定基であると同定された。これらの研究において、uPAの16番目から32番目の アミノ酸をもつuPAペプチドが最も効果的な阻害因子であると同定された。 前記マグドレン（Magdolen）ら(1996)、は、uPAの14番目から32番目のアミノ 酸を有するペプチド、および、それに由来するペプチドを用いて、uPA分子のuPA R結合領域を解析した。しかしながら、これらのペプチド、および別の研究グル ープによって用いられたペプチド（例えば、Appella et al.，(1987)，前記参照 ）も、uPARに対する親和性は比較的低かった。 国際公開公報第A-94/22464号は、uPAの14番目から33番目のアミノ酸領域から 得られた、6から18アミノ酸の長さをもつペプチドを開示している。uPAから得ら れた短いペプチド（uPA21〜29、およびuPA21〜26）が、角化細胞の増殖に影響を 与えることができると述べられている。国際公開公報第A-94/22464号は、uPA/uP AR相互作用を阻害するために、請求の範囲にかかるペプチドを用いる可能性があ ることに言及しているが、そのような結合研究に関するデータまたは情報が何も 示されていない。さらに、好ましいといわれているペプチドuPA 21〜29、および ペプチドuPA 21〜26は、19番目から31番目のアミノ酸配列領域を含む、uPA分子 中の最小のuPAR結合領域も含んでいない。したがって、これらの短いペプチドに よる角化細胞の増殖への影響は、uPA/uPAR相互作用によるものでない可能性が非 常に高い。 以前から公知のuPAペプチド阻害因子の短所は、uPAレセプターへの結合親和性 が比較的低いために、治療薬として応用するのに向いていないということである 。そのため、レセプターへのより強い親和性をもつ新規のuPAペプチド拮抗剤が 大いに必要とされている。 定量研究において、直鎖状ペプチドuPA（19〜31）およびこのペプチドの環状 誘導体は、驚くべきことに、uPAレセプターに対する結合親和性がかなり向上し ていることが分かった。 実験データによって、本発明に係るペプチドを、高い親和性をもってuPARに結 合するuPA拮抗剤として用いることができることが示された。特に、天然のuPA分 子には存在しないジスルフィド結合で架橋されているという特徴をもつ環状ペプ チドが、特に好ましい。 このように、本発明は、下記の一般構造式（I）を有するペプチドに関する。 X¹-[X²]_n-X³-X⁴-K-Y-F-X⁵-X⁶-I-X⁷-W-[X⁸]_m （I） 式中、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、およびX⁸は、それぞれアミノカルボン酸、 好ましくは、α-アミノカルボン酸を表し、 nおよびmは、それぞれ独立に0または1であり、 Kは、リジン側鎖をもつアミノカルボン酸、好ましくは、α-アミノカルボン酸を 表し、 Yは、チロシン側鎖をもつアミノカルボン酸、好ましくは、α-アミノカルボン酸 を表し、 Fは、フェニルアラニン側鎖をもつアミノカルボン酸、好ましくは、α-アミノカ ルボン酸を表し、 Iは、イソロイシン側鎖をもつアミノカルボン酸、好ましくは、α-アミノカルボ ン酸を表し、 Wは、トリプトファン側鎖をもつアミノカルボン酸、好ましくは、α-アミノカル ボン酸を表し、また、これらのモノマー結合単位は、-CONR¹-、または-NR¹CO-に よって連結されているが、式中、R¹は、それぞれの場合に別個に水素、メチル基 、エチル基、および薬学的に親和性のあるそれらの塩または誘導体を表している 。 構造式（I）をもつ配列を含むペプチドの他にも、薬学的に親和性のあるこれ らの塩および誘導体もuPA拮抗薬として適当である。適当な誘導体とは、側鎖の 反応基、および/または、N末端もしくはC末端、例えばアミノ基もしくはカルボ キシル基などの反応基が修飾されている特定の化合物である。このような修飾の 実例は、例えば、アミノ基のアセチル化などのアシル化、および/またはカルボ ン酸のアミド化もしくはエステル化などである。 天然のアミノ酸、もしくはその光学異性体、または天然でないアミノ酸、すな わち、γ-アミノ酪酸、β-アラニンなどのように、遺伝子にはコードされていな いアミノ酸を、本発明に係るペプチドの構成単位として用いることができる。 モノマー構成単位を、NR¹COまたはCONR¹という酸アミド結合によって連結する 、すなわち、ペプチド配列の方向を逆にする（レトロペプチド）こともできる。 天然のペプチドにおいてのように、R¹は水素を表すこともある。一方、アミド結 合のN-アルキル化は、活性に主要な影響を与えることが多いため、R¹は、例えば 、メチル基またはエチル基などのアルキル基、特に、メチル基を表すこともある （例えば、Levian-Teitelbaum et al.，Biopolymers 28(1989)，51-64を参照） 。 α-アミノカルボン酸は、L型光学異性体および/またはD型光学異性体の形でモ ノマー構成単位として用いることもできる。これも活性に影響を与えうるキラリ ティーを変化させることによって、本発明に係るペプチドの立体構造を改変する こともできる。逆向き-反転したペプチド、すなわち、配列方向が逆向きで、モ ノ マー構成単位としてD型アミノ酸を含んでいるペプチドが特に好ましい。これら のD型反転構造において、機能的な側鎖は、天然のペプチド配列の機能的な側鎖 と同様の立体的配向をもつが、D型アミノ酸が存在するために、生物学的に分解 されにくく、そのため、薬剤として好都合であった（例えば、Wermuth et al.， J．Am．Chem．Soc．119(1997)，1328-1335、およびそこに引用されている参考文 献を参照のこと）。 本発明に係るペプチドは、好ましくは、特に、モノマー構成単位のX¹とX⁷、な らびにX¹とX⁸が互いに架橋されている環状化合物である。この架橋は、好ましく は、天然の架橋ではない。すなわち、天然のuPAに存在しない架橋である。これ には、例えば、それぞれのα-アミノカルボン酸残基の側鎖を利用することがで きるが、その場合には、例えば、2個のシステイン残基（天然のuPA配列のCys¹⁹ とCys³¹の架橋に相当するもの）の間のジスルフィド結合による架橋が特に好ま しい。しかし、例えば、Lysのような、ωアミノ側鎖基をもつアミノ酸と、Aspま たはGluのような、カルボン酸側鎖をもつアミノ酸との間のアミド結合など、ア ミノ酸側鎖間での他の型の環状化も可能である。さらに、ジスルフィド架橋を、 化学的安定性を高めるためにアルキレン架橋に置き換えることも可能である。さ らに、アミノ酸側鎖をペプチドのバックボーンに結合させること、例えば、オメ ガアミノ側基をC末端に連結させたり、または、カルボン酸側基をN末端に結合さ せたりすることもできる。N末端とC末端とを連結させることも可能である。 ジスルフィド架橋の代わりに、いわゆる回転模倣剤（turn mimetics）（Haubn er et al.，J．Am．Chem．Soc．118(1996)，7884-7891）、または糖アミノ酸（G raf von Roedern et al.，J．Am．Chem．Soc．118(1996)，10156-10167）を用い ることも可能である。 本発明の特に好ましい態様において、ペプチドは、下記の一般構造式（II）を 有する： X¹-X²-X³-X⁴-K-Y-F-X⁵-X⁶-I-X⁷-W-X⁸ （II） 式中、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、X⁸、K、Y、F、I、およびWは、上記と同様 に定義され、X¹とX⁸が互いに架橋されている。 さらに一層好ましい態様において、本発明に係るペプチドは、下記の一般構造 式（III）を有する： X¹-X³-X⁴-K-Y-F-X⁵-X⁶-I-X⁷-W （III） 式中、X¹、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、K、Y、F、I、およびWは、上記と同様に定義さ れ、X¹とX⁷が互いに架橋されている。 モノマー構成単位のX¹からX⁸までは、好ましくは、以下の意味を有する： X¹、およびX⁸がある場合にX⁸は、SH側鎖、特にシステイン側鎖をもつα-アミ ノカルボン酸構成単位である。 X²がある場合それは好ましくは、例えば、バリン、ロイシン、またはイソロイ シン、特にバリンなど、脂肪族で非荷電性の側鎖をもつα-アミノカルボン酸で ある。 X³、およびX⁵がある場合X⁵は、セリンまたはスレオニン、特にセリンのような 、脂肪族の疎水性側鎖をもつα-アミノカルボン酸である。 X⁴およびX⁶は、好ましくは、アスパラギンまたはグルタミン、特にアスパラギ ンのような、脂肪族の疎水性側鎖、特にアミド側鎖をもつα-アミノカルボン酸 である。 構造式（II）を有する化合物においてX⁷は、好ましくは、塩基性のα-アミノ カルボン酸、特に、ヒスチジンである。構造式（III）を有する化合物においてX⁷ は、SH側基をもつα-アミノカルボン酸、特にシステインである。 本発明は、さらに、上記のように活性物質と定義されたペプチドを少なくとも 一つ含む薬学的組成物で、選択的には、一般的な薬学的担体、補助剤、または希 釈剤と一緒になった薬学的組成物に関する。本発明に係るペプチドは、特に、腫 瘍を治療するのに適したuPA拮抗剤を製造するために用いられる。 本発明に係る薬学的組成物は、例えば、コーティングした錠剤などの錠剤、ま たは水性もしくは非水性の溶剤中の溶液もしくは懸濁液の形状など、いかなる形 状のものでもよい。このペプチドは、好ましくは、液体または固体の形状にして 、経口または非経口で投与する。液剤で投与する場合には、通常、注射液用に用 いられる安定剤、可溶化剤、および/または緩衝液を選択的に含む担体用媒体と して、好ましくは、水を用いる。このような添加剤は、例えば、酒石酸緩衝液も しくはホウ酸緩衝液、エタノール、ジメチルスルホキシド、EDTAのような錯化剤 、 液体ポリエチレンオキシドなどのポリマーなどである。 もし、固体の形で投与するのであれば、固形担体物質として、デンプン、乳糖 、マンニトール、メチルセルロース、タルク、高度に分散した二酸化硅素、ステ アリン酸などの高分子量脂肪酸、ゼラチン、寒天、リン酸カルシウム、ステアリ ン酸マグネシウム、動物性および植物性の脂肪、またはポリエチレングリコール などの固体高分子ポリマーなどを用いることができる。また、経口投与するため に望ましければ、処方薬に、香料および甘味料を含有させてもよい。 投与される量は、患者の年齢、健康状態、および体重、病気の種類および重篤 度、治療の種類、投薬頻度、ならびに必要とされる効果の種類によって異なる。 活性化合物の１日分の用量は、通常、体重１キログラム当り0.1から50mgである 。普通は、必要とされる効果を生じさせるには、0.5から40mg/kg/日、好ましく は、1.0から20mg/kg/日を、１回から数回の投与で行うのが適当である。 本発明は、以下と図で説明される実施例によって、さらに具体的に述べられて いる。 図１は、合成ペプチドによる、細胞表面に結合したuPARへのuPA前駆体の用量 依存的な結合阻害を示しており、 図２は、uPARへの結合に関する、合成ペプチドのATFとの競合を示しており、 図３Aは、シクロ^19-31uPA19-31の構造（右側）を、天然のuPAの対応するドメ インの構造と比較して示しており、また、 図３Bは、シクロ^19,31uPA19-31のさまざまな環状ペプチド誘導体の構造を示し ている。 実施例 １．方法 1.1固相ペプチド合成 アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製モデル431Aペプチド 合成機、またはマルチプルペプチド合成機Syro II（MultiSynTech）を用いて、 直鎖状のペプチドを2-クロロトリチル樹脂上で合成した（Barlos et al.，Int． J．Pept．Protein Res．37(1991)，513-520）。直交Fmoc法（the orthogonal Fm oc strategy）（CarpinoおよびHan，J．Org．Chem．37(1972)，3404-3409;Fiel dsおよびNoble，Int．J．Peptide Protein Res．35(1990)，161-214）を用いて 、保護基であるトリチル基（Asn、Cys、G1n、およびHis）、t-ブチルオキシカル ボニル基（LysおよびTrp）、t-ブチル基（Asp、Glu、Ser、Thr、およびTyr）、 アセトアミドメチル基（Cys）、および2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スル ホニル基もしくは2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル 基（Arg）によって、アミノ酸側鎖をブロックした。結合反応は、N-メチル-ピロ リドン中、2.5倍等量のN-エチルジイソプロピルアミンが入った3倍過剰量の2-(1 H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチル-ウロニウムテトラフルオ ロホウ酸/1-ヒドロキシベンゾトリアゾール/Fmocアミノ酸を用いて、ジメチルホ ルムアミドの中で室温で行った。ジメチルホルムアミド中、過剰量の40%または2 0%ピペリジンで樹脂を連続的に処理してFmoc基を除去した。82.5%トリフルオロ 酢酸/5%フェノール/2.5%エタンジチオール/5%チオアニソール/5%H₂O(0℃/1時間 ；室温/1時間）で処理して、ペプチドの切断と側鎖保護基の除去とを同時に行っ た。2,2,5,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル基で保護されたArg基の場 合、ペプチドを、さらに12時間室温でインキュベートした。粗製ペプチドを、-3 0℃で、ジエチルエーテルによって沈殿させ、メタノールに溶解し、前述したよ うにして沈殿させ、t-ブタノールに溶解して凍結乾燥させた。トリプトファンを 含むペプチドは、凍結乾燥の前に、5%酢酸でさらに２時間処理した。 このペプチドは、逆相C18カラム（ヌクレオシル社（Nucleosil）製1005-C18） 、またはYMCパックODSカラムを用いたHPLCによって精製した。システイン残基の 間でジスルフィド結合を形成させて、ペプチドを環状化した。これに必要な酸化 は、0.1から0.3mg/mlの精製された直鎖状ペプチドを、80%水および20%DMSO(容量 /容量)の中に入れ、10時間後に減圧下で溶剤を除去して行った。環状ペプチドを 、再び上記のようにしてHPLCで精製した。 1.2質量分析とアミノ酸解析 精製し脱塩したペプチドを、HPLCシステム140 B（Applied Biosystems，Foste r City，USA）上で分析した。UVIS 200検出器（Linear Instruments，Reno，USA ）によって、206nmでのUV吸光度を測定した。アクアポア（Aquapore）3μ（Appl ied Biosystems，Foster City，USA）逆相カラム（1mm×50mm）上で、20μ l/分の流速でクロマトグラフィーを行った。溶媒システムは、水中0.1% TFA（A ）と、アセトニトリル中0.1% TFA（B）であった。HPLCシステムは、直列の四極 子装置API III（Sciex、Perkin Elmer，Thornhill，CA）に接続された大気圧電 離装置に連結した。 ポリプロピレングリコールのアンモニウム付加産物によって、四極子のM/Z目 盛を較正した。複数の荷電イオンの電荷分布プロファイルにおけるM/Zのピーク から、平均質量値を計算した（Covey et al.，Rapid Commun．Mass Spectrom．2 (1988)，249-256;Fenn et al.，Science 246(1989)，64-71）。 ペプチド濃度の定量的な測定ができるTFA-HCl気相法によって、ペプチドを加 水分解してから、解析システム6300（Beckman Instruments，Fullerton，USA） を用い、ニンヒドリン法によってアミノ酸解析を行った（Tsugita et al.，J．B iochem．102(1987)，1593-1597）。 1.3フローサイトメトリー 細胞の天然uPARの供給源としてヒト骨髄前駆細胞系U937を用い、FACScanフロ ーサイトメーター（Becton-Dickinson，Heidelberg，Germany）でフローサイト メトリーを行う方法によって、合成ペプチドのuPA/-uPAR相互作用阻害能力を測 定した（Chuchulowski et al.，Fibrinolysis 6，Suppl．4(1992)，95-102;Magd olen et al.，(1996)，前記）。1mMのホルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸（PM A）で48時間、U937細胞を刺激した。PMAで刺激すると、U937細胞は、かなりの量 の細胞表面結合型uPARを発現した。 内因性レセプター結合型uPAを解離させるために、刺激した細胞を、50mMのグ リシン塩酸、0.1NaCl、pH3.6によって、室温で1分間処理した。その後、0.5M HE PES-100mM NaCl，pH7.5によって、酸性緩衝液を中和した。そして、細胞をすぐ にPBS/0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）で２回洗浄して、室温下、300×gで10分 間遠心分離した。PBS/0.1%BSAに細胞を再懸濁して、1ml当りの10⁶個の細胞濃度 になるように調整してから、16ngのFITC結合uPA前駆体、およびさまざまな量の 合成ペプチドとともに、室温で45分間同時にインキュベートした。分析を行う前 に、分析するU937細胞の生存率を判定するために、二本鎖DNAに特異的に結合す る蛍光染料であるヨウ化プロピジウムを各サンプルに加えた。損傷を受けてい て、ヨウ化プロピジウム標識される細胞は、分析の際に除外した。 1.4固相uPAR/uPA結合試験 フローサイトメトリー分析の他に、合成ペプチドとuPARとの相互作用を調べる ために、固相のATF-リガンド結合試験を行った。このために、微量滴定用プレー トを、CHO細胞由来の組換えヒトuPAR（Wilhelm et al.，FEBS Lett．337（1994 ），131-134;Magdolen et al.，Electrophoresis 16(1995)，813-816）で被覆し 、残りのタンパク質結合部位は、2% BSA（重量/容積）によって飽和させた。サ ンプル（1ml当り15μgの合成ペプチドと一緒になった0.6ngのATF）とインキュベ ートし、何回か洗浄した後、ATFのクリングルドメインに対するビオチニル化モ ノクローナルマウス抗体（第377号、American Diagnostics，Greenwich，CT，US A）にあるアメリカンダイアグノスティクス社（）製）を用い、その後、アビジ ン-パーオキシダーゼ結合体と、パーオキシダーゼに対する基質としての3,3',5, 5'-テトラメチルベンジジン/H₂Oとを加えて、微量滴定用プレート上に固定され たuPARに結合したATFの量を測定した。ATFのuPARへの結合と競合する合成ペプチ ドが存在すると、発色基質の変化が減少する。 ２．結果 2.1定量的フローサイトメトリー分析による、合成ペプチドのuPAR結合能力の測 定 ペプチドuPA_12-32[C19A]（Appella et al.，(1987)，前記）、ファージペプチ ドライブラリーの中で最も効果的なペプチドと同定された、いわゆるクローン20 -AEPMPHSLNFSQYLWYTペプチド（Goodson et al.，(1994)，前記）、および野生型 uPA配列に由来する合成ペプチドUPA_16-32の阻害能力を比較した。 このために、精製したペプチドを質量分析によって分析し、アミノ酸解析によ って定量し、さらに、1.3の項で説明されている方法によるフローサイトメトリ ーによって、それらのペプチドが、蛍光標識されたuPA前駆体の、U937細胞上に あるuPAレセプターへの結合を阻害できるか否かを試験した。これら３種類すべ ての合成ペプチドによって、uPA前駆体が、用量依存的な様式で、細胞表面に結 合したuPARから外れることが分かった（図1）。約15,000から12,000モル過剰のu PA_12-32[C19A]またはクローン20ペプチドは、uPAの結合を50%阻害する結果をも たらした。 uPA_16-32ペプチドは、残りの2つのペプチドに較べて4倍から5倍高い親和性をuPA Rに対して示した。すなわち、50％阻害を生じさせるには、およそ3,000モル過剰 で充分であった。 さらに、驚いたことに、uPA_16-32のIC50値が約3.2μMであるのに対し、直鎖状 ペプチドuPA_19-32が約0.8μMのIC50値を有することが分かった。 2.2微量滴定用プレート固相リガンド結合試験における、合成ペプチドのuPAR結 合能力の測定 uPAのレセプター結合領域に由来する、さまざまな配列領域をもつ一連のペプ チドを合成して、UPA_10-32から始めて、アミノ末端を次第に短くしていった。1. 4の項で説明した微量滴定用プレート固相結合試験を用いて、これらのペプチド の阻害能力を測定した。この試験の結果を図2に示す。 図2Aから、ペプチドUPA_10-32、UPA_12-32、UPA_14-32、およびUPA_16-32が、uPAR へのATFの結合を効果的に阻害することが分かる。ペプチドUPA_17-32およびuPA_{18 -34} では、uPAR結合能力がかなり低下する。ペプチドuPA_20-34は、uPARに全く結 合しない。さらに実験を行い、ペプチドuPA_19-31、uPA_18-30、uPA_20-32、および uPA_20-30の結合能力を調べた。この実験結果を図2Bに示す。驚いたことに、uPA_{1 9-31} は、それよりも長いペプチドuPA_16-32よりも高い親和性をもってuPARに結合 することが分かった。試験したその他の直鎖状ペプチドには、有意な結合能力は なかった。 19位と31位にあるシステイン残基間の分子内ジスルフィド結合を含む環状ペプ チド、シクロ^19,31uPA_19-31は、驚いたことに、まだ、uPAとuPAレセプターとの 結合を阻害することができた。さらに、水溶液中に長期間保存した後、または凍 結/融解を繰り返した後では、シクロ^19,31uPA_19-31の結合活性は、直鎖状ペプチ ドuPA_19-31よりも有意に安定性が高かった。 2.3改変された環状uPAペプチドの合成 一定のアミノ酸を欠失および/または別のアミノ酸に置換する、最初の構造体 としてシクロ^19,31uPA_19-31を用いて、さらに別の一連の環状ペプチドを調製し た。新しい合成ペプチド変異体の構造を図3に示す。

【手続補正書】 【提出日】平成１２年７月３１日（２０００．７．３１） 【補正内容】 請求の範囲 １．下記の一般構造式（I）を有するペプチド： X¹-[X²]_n-X³-X⁴-K-Y-F-X⁵-X⁶-I-X⁷-W-[X⁸]_m （I） 式中、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、およびX⁸は、それぞれアミノカルボン酸を 表し、 nおよびmは、それそれ独立に0または1であり、 Kは、リジン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Yは、チロシン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Fは、フェニルアラニン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Iは、イソロイシン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Wは、トリプトファン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 且つ、これらのモノマー結合単位は、-CONR¹-または-NR¹CO-結合によって連結さ れているが、式中、R¹は、それぞれの場合において独立して水素、メチル基、ま たはエチル基、ならびに薬学的に親和性のあるそれらの塩および誘導体を表す。２ ．選択的には、一般的な薬学的担体、補助剤、または希釈剤とともに、活性物 質として、請求項1記載のペプチドを少なくとも1つ含む薬学的組成物。３ ．uPA拮抗剤の製造を目的とする、請求項1記載のペプチドの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シュミット マンフレッド ドイツ国 ミュンヘン ホヘナスシャウア ー ストラッセ 10 (72)発明者 マグドレン ビクトル ドイツ国 キルヘイム モーサッチウェグ ３ (72)発明者 ウィルヘルム オラフ ジー. ドイツ国 ミュンヘン サベナー ストラ ッセ 188 (72)発明者 リーマー クリストフ ドイツ国 ミュンヘン プリンツレジェン テンストラッセ 139 (72)発明者 バーグル マルクス ドイツ国 ミュンヘン オッツマンウェグ 10 (72)発明者 コーピッツ マルクス ドイツ国 ベルリン アブト．ペプチドケ ミー ファーマシューテスク ケミー ４ シェリング アーゲー (72)発明者 コニッグ バーンハルド ドイツ国 ベルグ デュルバーグストラッ セ 28 (72)発明者 ウェイドル ウルリッチ ドイツ国 ミュンヘン ランドウェルスト ラッセ 56

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の一般構造式（I）を有するペプチド： X¹-[X²]_n-X³-X⁴-K-Y-F-X⁵-X⁶-I-X⁷-W-[X⁸]_m （I） 式中、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、およびX⁸は、それぞれアミノカルボン酸を 表し、 nおよびmは、それぞれ独立に0または1であり、 Kは、リジン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Yは、チロシン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Fは、フェニルアラニン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Iは、イソロイシン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 Wは、トリプトファン側鎖をもつアミノカルボン酸を表し、 且つ、これらのモノマー結合単位は、-CONR¹-または-NR¹CO-結合によって連結さ れているが、式中、R¹は、それぞれの場合において独立して水素、メチル基、ま たはエチル基、ならびに薬学的に親和性のあるそれらの塩および誘導体を表す。 ２．モノマー構成単位のX¹とX⁷、またはX¹とX⁸が互いに架橋されている、請求項 1記載の化合物。 ３．アミノカルボン酸残基の側鎖によって架橋されている、請求項2記載の化合 物。 ４．ジスルフィド結合によって架橋されている、請求項3記載の化合物。 ５．下記の一般構造式（II）で表される請求項1から3のいずれか一項に記載の化 合物： X^１-X^２-X³-X⁴-K-Y-F-X⁵-X⁶-I-X⁷-W-X⁸ （II） 式中、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、X⁸、K、Y、F、I、およびWは、請求項1と同 様に定義され、且つX¹とX⁸が互いに架橋されている。 ６．下記の一般構造式（III）で表される請求項1から4のいずれか一項に記載の 化合物： X¹-X²-X³-K-Y-F-X⁵-X⁶-I-X⁷-W （III） 式中、X¹、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、K、Y、F、I、およびWは、請求項1と同様に定義 され、且つX¹とX⁷が互いに架橋されている。 ７．X¹が、システイン側鎖をもつα-アミノカルボン酸を表している、前記請求 項の いずれか一項に記載の化合物。 ８．X²が存在する場合それが、バリン側鎖をもつα-アミノカルボン酸を表して いる、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。 ９．X³が、セリン側鎖をもつα-アミノカルボンを表している、前記請求項のい ずれか一項に記載の化合物。 10．X⁴が、アスパラギン側鎖をもつα-アミノカルボン酸を表している、前記請 求項のいずれか一項に記載の化合物。 11．X⁵が、セリン側鎖をもつα-アミノカルボン酸を表している、前記請求項の いずれか一項に記載の化合物。 12．X⁶が、アスパラギン側鎖をもつα-アミノカルボン酸を表している、前記請 求項のいずれか一項に記載の化合物。 13．X⁷が、ヒスチジンまたはシステイン側鎖をもつα-アミノカルボン酸を表し ている、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。 14．X⁸が存在する場合それが、システイン側鎖をもつα-アミノカルボン酸を表 している、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。 15．選択的に、一般的な薬学的担体、補助剤、または希釈剤とともに、活性物質 として、請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドを少なくとも1つ含む薬 学的組成物。 16．uPA拮抗剤の製造を目的とする、請求項1から14のいずれか一項に記載のペプ チドの使用。 17．腫瘍の治療を目的とする、請求項16記載の使用。