JP2002508670A

JP2002508670A - 細胞型特異的レポーターである蛍光タンパク質

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Publication number: JP2002508670A
Application number: JP50631699A
Authority: JP
Inventors: ヘシェラー，ユルゲン
Original assignee: ヘシェラー，ユルゲン
Priority date: 1997-07-02
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2002-03-19
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: US20060168665A1; ES2191324T3; PT1002080E; DK1002080T3; DE59807479D1; EP1002080B1; EP1002080A1; WO1999001552A1; US20020092035A1; DE19727962A1; EP1002080B9; ATE234357T1; US7105344B2; JP3956154B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、非細胞損傷性蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列および操作しやすいように当該ＤＮＡ配列に連結した細胞および／または発生依存プロモーターを含むＤＮＡ構成を安定してトランスフェクトしたヒト以外の哺乳類の胚幹(ＥＳ)細胞；そのＥＳ細胞を調製する方法；当該ＥＳ細胞を培養することにより得ることが出来る細胞培養；その細胞培養を用いた物質の毒理学的検査用の方法；当該ＥＳ細胞を用いたヒト以外のトランスジェニック哺乳類をつくる方法；当該方法により得ることが出来るヒト以外のトランスジェニック哺乳類；ならびにそのヒト以外の哺乳類の細胞を用い細胞発生の段階を検査する方法に関係する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞型特異的レポーターである蛍光タンパク質本発明は、細胞型特異的レポーターである非細胞損傷性蛍光タンパク質の使用に関する。詳細には、本発明は、非細胞損傷性蛍光タンパク質および操作しやすいように当該ＤＮＡ配列に連結した細胞-および／または発生-依存プロモーターを含むＤＮＡ構成を安定してトランスフェクトしたヒト以外の哺乳類の胚幹(ＥＳ)細胞；そのＥＳ細胞の調製方法；当該ＥＳ細胞を培養することにより得ることが出来る細胞培養；その細胞培養を用いた物質の毒理学的検査用の方法；当該ＥＳ細胞を用いたヒト以外のトランスジェニック哺乳類をつくる方法；当該方法により得ることが出来るヒト以外のトランスジェニック哺乳類；ならびにそのヒト以外の哺乳類の細胞を用い細胞発生の段階を検査する方法に関する。胚幹(ＥＳ)細胞は、遺伝子導入動物モデルの創造の基礎であり、かつインビトロ細胞培養システムに使用し得る。現在まで、ＥＳ細胞から分化した細胞型は、抗体染色またはアンチセンスオリゴヌクレオチドによるイン・シトゥーハイブリダイゼーションによる特徴によって確認されてきた。しかし、これを行なうためには、最初に細胞を固定しなければならない。これまでのどの当業者の方法も、ＥＳ細胞から分化した異なる細胞型の二次機能試験に適当ではない。現在まで、インビトロでＥＳ細胞誘導体の機能的研究を行なう唯一の方法は、形態学的確認であった。これは成功したが、心筋および骨格筋細胞においては、収縮で特性化されるため非常に不満足なものであった。非収縮心室細胞においても、機能研究用の識別は困難であった。従って、Maltsev et al.，1994，Circ．Res.，75，23 3/244およびDD-299439 A5では、心細胞(心筋細胞)の分化は、インビトロにおいて、心室または心房細胞の特定化されたペースメーカーに対する発達の非常に早い段階で起こるというモデルが記述されている(Maltsev et al.，1994，Circ．R es.，74，233-244)。この目的のために、株細胞Ｄ３の分化全能性胚幹(ＥＳ)細胞を、以下の細胞培養条件で心筋細胞に分化する：細胞を２日間懸滴中に保ち、５日間懸濁にし、引き続き培養皿に蒔いた(Maltsev et al.，1994， Circ．Res.，74，233-244)。蒔いてから１-２日で、拍動領域は自発的にこれらの"胚様体"(ＥＢｓ)を形成する。これらの領域から、各心筋細胞を、酵素消化( コラゲナーゼ)を使用して分離する；これらの心筋細胞は、様々な分化段階の、機能的、分子-生物および形態学(免疫組織学、電子顕微鏡)試験技術に関する。心筋細胞に加えて、生成したＥＢｓもとりわけ、ニューロン、グリア細胞、造血細胞、内皮細胞(初期毛細管)、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および上皮細胞を含む。加えて、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ、後に記述)などの生物発光タンパク質は、ごく最近報告されている(Prasher et al.，Gene，Vol．111，229-233(1992)); これらは、遺伝子発現のマーカーとしての使用方法を提唱している(Chalife et al.，Science，Vol．263，802-805(1994))。例えば、WO-A-95/07463およびWO-A- 96/27675は、ＧＦＰによる細胞の遺伝子形質転換を開示している。しかしながら、哺乳類細胞の形質転換、とりわけＧＦＰをコードするＤＮＡ配列を有する哺乳類ＥＳ細胞は、上述文献にも他の文献にも叙述されていない。心血管疾患は、西欧工業国において、未だ、最も頻々たる死因である。この分野の徹底的な基礎調査によって、病態生理学的原因を見いだし得、新たな治療案を発見し得、毒理学的変化を開示する。心血管疾患の病因研究および新しい治療および毒理学的物質の試験用に、一方で人に転移し得、他方で非常にゆっくりと、かつ費用がかからない動物モデルで置換し得るモデルが必要とされている。１９９１年までに、先の西ドイツ連邦州だけでも、２００万匹を超える動物が動物実験に使用されてきた。最近重要となりつつある薬理学的／毒理学的調査のある出発点は心臓分化である。常同的な進行心臓細胞発生から、心臓筋細胞の病理学的および毒理学的変化についての結論が導かれる。そのため、例えば、レセプターの状態および細胞内シグナルカスケードが心臓肥大(Yamazaki et al.，J．Mol．Cell Cardiol．27(1 ):133-140(1995))および心不全(Johnson et al.，Biochem．Pharmacol．45(12): 2365-2372(1993))で破壊されることが知られている。これら病理学的に変化した心臓筋細胞は、一部、初期分化段階の心臓細胞に再び似る。しかしながら、初期分化段階の心臓細胞の性質の解明に必要な検査は生存動物に実施することは技術的に困難であり、その検査を行うことが出来るとしても、非常に面倒である：１２-３日、最も初期、マウスの胚から心臓筋細胞が調製できるが、その細胞は既に初期心臓分化段階に相当していない。種々分化段階のレセプター発現の詳細な分析は非常に高価な動物材料(animal material)を必要とし、上記のように行うことは技術的に困難である。同様に、数日または数週間にわたる相対的未分化心臓細胞の発生観察は動物モデルではできない。新規治療剤、例えば変力性物質もしくは不整脈治療剤または毒性物質、例えば重金属物質もしくはレチノイドの使用を試験するために、動物の、例えばブタの侵襲的モニターを週数間動物実験に実施しなければならない。この度の本発明の目的は、生存細胞の特性化が簡単にできる細胞培養方法を提供することであり、Ｌａｃ-Ｚ(Niwa et al．1991，Gene 108，193-199;Wobus et al.，1996，J．Cell Mol．Cardiol.；Metzger et al.，1996，Circ．Res.，78 ，547-552)のようなレポーター遺伝子に基く以外の機能検査ができる。従前の方法を用いた場合、遺伝子の発現は細胞固定後のみ特定基質を用いて検出できるからである。以外にも、非細胞損傷性蛍光タンパク質をコードする遺伝子と細胞および発生依存プロモーターと連結したＤＮＡ構成が、エレクトロポレーションを用い、ＥＳ細胞に安定してトランスフェクトされることが判った。この構成を天然ＤＮＡに組込む。細胞内シグナルの特異的活性化の後、プロモーターは活性化され、蛍光タンパク質を発現する。そのため、分化のある点で細胞特異的転写因子を活性化するＥＳ細胞は、蛍光励起したときに、蛍光放射により認識できた。そのため、本発明は、非細胞損傷性蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列当該ＤＮＡ配列に操作しやすいように連結した細胞および／または発生依存プロモーターを含むＤＮＡ構成を安定してトランスフェクトしたヒト以外の哺乳類の胚幹(ＥＳ)細胞に関係する。ＥＳ細胞は齧歯、特にマウスから好ましくは得られる。特に好ましいＥＳ細胞は、Ｄ３細胞(Doetschmann et al.，J．Embryol．Exp．Morphol．87，27(1985)) 、Ｒ１細胞(Nagy et al.，PNAS(1995))、Ｅ１４細胞(Handyside et al.，Roux Arc h．Develop．Biol．198，48(1989))、ＣＣＥ細胞(Bradley et al.，Nature 309 ，255(1985))およびＰ１９細胞(Mummery et al.，Dev．Biol．109，402(1985)) である。本発明の“非細胞損傷性蛍光タンパク質”として、グラゲAuequorea victoria 由来のグリーン・フルオレセント・プロテイン(ＧＦＰ)(WO-A-95/07463，WO-A-9 6/27675およびWO-A-95/21191)およびその誘導体“ブルーＧＦＰ”(Heim et al. ，Curr．Biol．6(2):178-182(1996))および“赤色偏移ＧＦＰ”(Muldoon et al. ,;Biotechniques 22(1):162-167(1997))が用い得る。好ましいのは、グリーン・フルオレセント・プロテインＧＦＰ、特に寄託されている株ＤＳＭ１１６３３に含まれているＧＦＰ突然変異体である。本発明において、“細胞-および／または発生依存プロモーター”は、特定細胞型および／または細胞発生の特定段階でのみプロモーター活性がみられ、本発明ＥＳ細胞由来の細胞培養(胚様体)中およびヒト以外のトランスジェニック哺乳類中の両方において活性がみられるプロモーターを意味する。さらに、何れか他の既知細胞特異的プロモーターを用いることができ、例えば神経細胞、心臓細胞、ニューロン、グリア細胞、造血性細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および上皮細胞である。本発明の好ましい実施態様において、プロモーターは心臓細胞に特異的なプロモーターである。特に、以下のプロモーターについて言及する：ＳＭＨＣミニマル・プロモーター（平滑筋細胞に特異的、Kallmeier et al.，J．Biol．Chem．2 70(52):30949-30957(1995))；Ｎｋｘ-２．５(相当初期の心臓筋細胞に特異的、L ints et al.，Development，119(2):419-431(1993))；ヒトα-アクチン(心臓組織に特異的、Sartorelli et al.，Genes Dev.，4(10):1811-1822(1990))；ＭＬＣ-２Ｖ(心室に特異的、O'Brien et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90(11) :5157-5161(1993))および(WO-A-96/16163)。好ましい実施態様では、ＤＮＡ構成は、さらに、機能性ＤＮＡ配列、特にエンハンサーおよび選択配列を含む。その選択配列は、例えばネオマイシンおよびヒグロマイシンを含む。本発明は、本発明のＥＳ細胞を調製する方法にさらに関係する：ヒト以外の哺乳類の出発ＥＳ細胞に、上記定義のようなＤＮＡ構成を導入すること；および安定してトランスフェクトされたＥＳ細胞をスクリーニングすること。当該導入は、当分野の当業者に既知の何れかの方法により実施され得る。しかし、エレクトロポレーションが好ましい。スクリーニングは、ＤＮＡ構成中に存在する選択配列を用い好ましくは行う。本発明は、上記ＤＮＡ構成にも関係する。好ましい構成は、図１および２に示したリポーターｐＣＸ-(β−ａｃｔ)ＧＦＰ-ＮｅｏおよびｐＣＸ(α-ａｃｔ)ＧＦＰ-Ｎｅｏ(ＤＳＭ１１６３３)である。本発明は、非細胞損傷性蛍光タンパク質の細胞型特異的発現を示す細胞培養にも関係し、本発明ＥＳ細胞を培養することにより得ることができる。好ましい実施態様において、細胞は集塊型である(胚様体)。胚様体の調製における標準的な方法に従う。例えば“ハンギング・ドロップ”方法またはメチルセルロース培養 (Wobus et al.，Differentiation(1991)48，172-182)である。これら細胞培養に、物質の毒理学的検査用の方法を用いることができ、例えばレチノイド、重金属および医薬製剤である。それは、今日使用されている何れかの細胞培養モデルよりも実質的な有利点がある：ａ)生存し、固定化されていない細胞が分化中に観察でき、そのため、例えば心臓細胞の増殖は心拍部分で連続的に観察できる。ｂ)発生の初期段階における細胞は、電気生理学および他の測定方法に利用しやすい。蛍光細胞が存在し、当初より識別できるからである(図３参照)。これは、これら細胞の機能調査の重要な簡易化を意味する。ｃ)単一細胞の調製は細胞損失を意味する。存在する小数の細胞を視覚化するためには、蛍光タンパク質を発現する細胞が有利である。その方法は、ＦＡＣＳ分類法で補うことができ、それによって、均一な細胞群を得ることができる。従って、表現型的に分化した大きなＥＳ細胞群の調査(例えば、分子生物学的なもの) をすることも可能である。ｄ)蛍光タンパク質を発現するＥＳ細胞は、心臓特異的プロモーターの活性化によりＥＢ中で視覚化できるため、心臓関連細胞の増殖が事実上単一の方法による薬理学的／毒理学的条件下において測定できる。心臓細胞分化における種々の物質の効果の定型検査のために、ＥＢ中で蛍光タンパク質を発現する細胞部分が分化時に測定でき、そのため、これらの物質が心臓細胞の分化に定量的に、または定性的に、影響するかどうかが確立できた。より正確な結果を定量するために、細胞を解離し、次いでＦＡＣＳ分類法を行った(図４)。最終的に、本発明のＥＳ細胞をヒト以外の哺乳類の胚盤胞に注入すること、および代理母に胚盤胞を移すことを含む、非細胞損傷性蛍光タンパク質の細胞型特異的発現を示すヒト以外のトランスジェニック哺乳類を作成する方法；当該方法により得られるヒト以外のトランスジェニック哺乳類；ならびに蛍光測定方法を用いた本発明のヒト以外の哺乳類の対応する標識細胞の検査を含むヒト以外の哺乳類の細胞の発生段階を検査する方法、に関係する。本発明の検査方法により、正確な細胞の分類分けが、動物全てにおいてインビボで初めて行うことができた。そのため、蛍光心臓細胞は、初期の胚の原基において既に観察され、初期の胚の段階における心臓の発生のインビボでの観察が可能となった。また、心臓細胞は発生の分化段階において容易に同定できた。本発明は、さらに以下の図および実施例により説明される。図１は、実施例１に使用したリポーター遺伝子構成ｐＣＸ-(β-ａｃｔ)ＧＦＰ -Ｎｅｏを示す。図２は、実施例２に使用したリポーター遺伝子構成ｐＣＸ-(α-ａｃｔ)ＧＦＰ -Ｎｅｏ(ＤＳＭ１１６３３)を示す。図３、パートＡ：２つの若いＥＢが、透過光(Ａａ)の下および４８８ｎｍ励起 (Ａｂ)の下、懸濁液で見られる。心臓細胞はこれらの初期ＥＢではまだ分化していないので、緑色の蛍光は見ることができない。パートＢ：透過光(Ｂａ)の下、４８８ｎｍ蛍光励起の下(Ｂｂ)および透過光および４８８ｎｍ蛍光励起の組み合わせにおいて、プレーティング(７＋３日)３日後のＥＢ。このＥＢにおいて、相対的に小さい自然発生的心拍部分が観察できた。これは、自然発生的な萎縮を示す一部のＥＢに相当する。ＥＢは２０倍の像であった。図４：図４は、ＦＡＣＳ法により確立されたＥＢ由来細胞の分布ヒストグラムを示し、ｐＣＸ-(α-ａｃｔ)ＧＦＰ−Ｎｅｏを有するＥＳ細胞から得られる。その構成は、ＣＭＶ-ＩＥエンハンサーを破壊するためにＡａｔＩを用い直鎖状とした。 (ａ)ＥＳ細胞 (ｂ)懸濁の２日後(２＋２日) (ｃ)プレーティング後５日(７＋５日) ｘ軸：ＧＦＰ蛍光の密度(ＦＡＣＳ単位)、ｙ軸：細胞カウント実施例実施例１：強い偏在性プロモーター下でGFPを発現する安定ES細胞系の調製、およびこれらの細胞由来の心筋細胞の分化および特性。ａ)GFP発現構築物の調製：オカベ博士(日本、大阪大学)から提供された、GFP-コード配列をトリα-アクチンプロモーター下に含むpCXGFP発現ベクターを(M．Ika wa，K．Kominami，Y．Yoshimura，K．Tanaka，Y．Nishimune and M．Okabe，Dev elop．Growth Differ．(1995)37，455-459)、下記のように修飾した： pTL2Neoのネオマイシン(G418)耐性遺伝子を含むSalI-XbaI制限フラグメントを (Tarakhovsky博士から提供)、pCX-GFPのSalI部位に平滑末端のライゲーションにより挿入した。得られた構築物pCX-(β-act)GFP-Neo(図１)を、D3細胞のエレクトロポレーションに使用した。ｂ)エレクトロポレーションおよび選択法：pCX-(β-act)GFP-Neo構築物を、レストリクラーゼ(restrictase)ScaIで直線化し(GFP発現カセットの外側）、以下の条件下でのES細胞のD3細胞のエレクトロポレーションに使用した： DNA：２０−４０μg、細胞：０．8mlPBS、エレクトロポレーションキュベット BioRad ０．４cm(Cat．No．165-2088)、エレクトロポレーション装置BioRad(Ge n Pulser)、２４０Ｖ、５００μF中７×１０/ml。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液を氷上に２０分置き、次いで、１５％ FCS(ウシ胎児血清)添加DMEM培地１０ml中のG418耐性支持細胞層を含む１０cm組織グレードペトリ皿に移した。２日後、３００μg／mlネオマイシン(G418、Gibc o)を選択G418-耐性細胞に添加した。G418(３００μg／ml)含有培地を、一日おきに変えた。選択８から１０日後、医薬耐性コロニーが出現し、それをGFP発現に関して蛍光顕微鏡で試験した。約９５％のG418-耐性コロニーが強いGFP発現(緑色発光)を発し、ES細胞中のβ -アクチンプロモーター(β-アクチンは細胞骨格の主タンパク質の一つである)の活性の高い程度を示した。コロニーを、パスツールピペットでの吸引により取りこみ、個々にトリプシン処理し、続いて増殖のためのG418(３００μg／ml)を添加した支持細胞層を含む４８および２４ウェルプレートに移した。最後に、ニワトリβ-アクチンプロモーターの制御下、GPS遺伝子１〜５個のコピーを担持する安定なESコロニーを検出し、胚様体(EBs)の製造に使用した。ｃ)心筋細胞の分化および分析：EBsを標準“懸滴”法に従って発育させた(A．Wo bus，G．Walluka and J．Hescheler;Differentiation（1991）48，173-182)。プレーティングの前の発育の全段階において、β-アクチンプロモーター制御下に統合されたGFP発現ベクターを有するES細胞由来のEBsは、蛍光顕微鏡下で強い緑色発光を示した。プレーティング後、GFP発現は、分化の一連で出現する異なる細胞型に一様でなく分布していた。収縮性心筋細胞の発現後のEBsにおける最も明るい緑色発光は、EBsの律動コア部分(中心部)よりむしろ対応する律動領域と一致した。 EBsの他の領域は、弱くから強くまでの異なる程度のGFP発現を示し、これは種々の細胞型の細胞骨格の主成分としてのβ-アクチンの既知の広範囲な発現を示す。これらの視覚的観察は、FACS分析(フロー・サイトフルオリメトリー)により得られた発育しているEBsにおける細胞集団におけるGFP発現の分布のヒストグラムで確認される。それらは、ヒストグラムの最初の鋭い対称性ピークの左手側へのシフトおよび拡大を示し、これは、増殖している非分化ES細胞の高く相対的に均質なGFP発現からその分化細胞型の集団への広い分布の遷移を示す。 EBsは、コラゲナーゼを使用して分化し、スライドに蒔き、２-３日培養し、その後電気物理学的測定を、標準法に従って行った(V．Maltsev，A．Wobus，J．Ro hwedei，M．Bader and J．Hescheler，Circ．Res．(1994)72(2)，233-244)。強くGFPを発現する、単離した本質的に律動している心筋細胞は、全て、パッチ-クランプ法により示される活動電位、Ｃａ²⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺およびＩ_f流を含む、心筋細胞に典型的な電気物理学的特性を有する。従って、ゲノム内に統合された発現ベクターのためにGFPを強く発現する安定なES細胞系は、“正常”D3細胞から分化された心筋細胞と同じ基本的電気物理的特性を有する機能的に成熟した収縮性心筋細胞に分化できる。実施例２：分化した心筋細胞において、心臓特異的プロモーター下でGFPを発現する安定なES細胞の調製ａ)GFP発現構築物の調製：M．McBurney博士(University of Ottawa，Canada)から提供された、心臓特異的ヒトα-アクチンプロモーター(A．Minti，L．Kedes;M olecular and Cellular Biology（1986）6，2125-2136;G．Pari，K．Jardine an d M．McBurney;Molecular and Cellular Biology（1991）11，4796-4803)のセグメント(−４４６＋６)を含むプラスミドpPv／B-Act-lacZから、制限酵素SalIおよびHindIIIを使用してプロモーターを切除した。ニワトリβ-アクチンプロモーターを心臓特異的α-アクチンプロモーターに置きかえるために、pCX-GFP発現ベクター(実施例１参照)をレストリクターゼSnaBIおよびApaIで開裂し、ニワトリ β-アクチンプロモーターを切除した。続いて、心臓特異的α-アクチンブロモーターの上記SalI-HindIIIフラグメントを平滑末端のライゲーションにより挿入した。レストリクターゼTth111I、SalIおよびHinfIを、心臓特異的α-アクチンプロモーターがGFP-コード配列に関して正しい配向で挿入されているプラスミドコロニーの選択に使用した。実施例１ａ)に記載のネオマイシン(G418)耐性遺伝子を、次いでSalI部位に挿入し、得られるプラスミドpCX-(α-act)GFP-Neo(図２) をD3細胞のエレクトロポレーションに使用した。ｂ)エレクトロボレーションおよび選択法：pCX-(α-act)GFP-NeoをScaI(GFPカセットの外側、実施例１ｂ)に記載)またはAatIで直線化し、サイトメガロウイルス (CMV-IE)エンハンサー(下記参照)を破壊した。エレクトロポレーションおよびG4 18選択法を実施例１ｂ)に記載のように行った。ｃ)心筋細胞の分化の間の細胞集団の分析および心臓特異的α-アクチンプロモーターの制御下のGFP発現：EBsを実施例１ｃ)に記載のように発育させた。β-アクチンプロモーター制御下のGFP発現の上記パターンと比較して、ゲノムに統合されたpCX-(α-act)GFP-Neoを担持するES細胞は、蛍光顕微鏡で可視であるシグナルを全く示さないか、非常に弱い。FACS分析は、SacIで直線化したpCX-(α-act) GFP-Neoを含むD3細胞の緑色蛍光の平均レベルが、pCX-(β-act)GFP-Neoを担持する細胞系よりも、約３５から４０倍低いことを示す。EBsの発育中、FACSで得たG FP蛍光ヒストグラムの最初のピークの右手側へのシフトおよび拡大が見られた。 EBsのプレーティング２から４日後に出現する律動領域は、pCX-(β-act)GFP-Neo 担持ES細胞でのGFP発現と同等のレベルで、蛍光顕微鏡で可視の緑色発光を示す。恐らく、機能的に成熟した心筋細胞から成る律動領域は、EBs発育における他の細胞型の中で強い可視発光を有する領域にすぎない。毎日の追跡により、それらが律動を始める前、１から１.５日に分離した発光領域を検出することが可能である。 GFP発現の心臓特異的性質は、単一細胞のα-アクチン特異的免疫染色により確認され、これは、心臓特異的α-アクチンプロモーターの制御下のGFP発現と相関した。ｄ)GFP発現の低い最初の非特異的レベルを有するES細胞系の調製：上記の統合されたpCX-(α-act)GFP-Neoを有するESコロニーは、発光と律動領域の明白な一致によりもたらされる明らかな心筋細胞特異的発現パターンを示す。しかし、陰性対照(そのままのES細胞)よりも５から１０倍高いこれらの非分化細胞のGFP発現の最初のレベルは、分化の非常に初期の段階での細胞の検出を妨げた。非特異的GFP発現の最初のレベルの低減のために、多くの新規細胞系を、AatI レストリクターゼを使用して直線化したpCX-(α-act)GFP-Neo(図２)を使用して調製し、CMV-IEエンハンサーの破壊を可能にした。後者は、本来の発現ベクターに存在し、これが最初の非特異的“バックグラウンド”の理由であると仮定された。エレクトロポレーションおよび選択法の後、G418-耐性クローンは、そのままのCMV-IEエンハンサーを含むクローンで示されるよりも、最初のGFP発現の大きな多様性を示した。最低の“バックグラウンド”を有するESクローンを、FACSスクリーニングで選択した。これらのクローンは、約５倍低い最初の蛍光強度を有し、GFPベクター無しの陰性対照(野性型)の細胞と同等であり得た。対応するES 細胞クローンからのEBsの調製後、その中のいくつかは分化した心筋細胞でGFP発現を示し、それは蛍光顕微鏡およびFACS分析の両方で検出可能であった。FACS分析は、挿入した心臓特異的分化を有する細胞と、EB発育中のヒストグラム力学の促進された１から２ピーク特性を示す残りの細胞の間の高い解析を示した(図４) 。従って、上記の試みは、ES細胞の“インビトロ”での心筋細胞への分化の試験を可能にし、細胞の早い段階での発育識別を付与し、心臓特異的プロモーターを有するGFP発現ベクターを“生存”レポーター遺伝子系として使用している。上記プラスミドpCX-(α-act)GFP-Neoは、１９９７年６月２７日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maschroder Weg lb，D -38124 Braunschweigに、受託番号DSM11633として寄託した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年７月１日（１９９９．７．１）【補正内容】請求の範囲１．非細胞損傷性蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列；ならびに当該ＤＮＡ配列に操作しやすいように連結した細胞および／または発生依存プロモーターを含むＤＮＡ構成を安定してトランスフェクトしたヒト以外の哺乳類の胚幹(ＥＳ)細胞の集塊からなる、非細胞損傷性蛍光タンパク質の細胞型特異的発現を示す細胞培養。２．当該ＥＳ細胞を齧歯、特にマウスから得る請求項１に記載の細胞培養。３．当該非細胞損傷性蛍光タンパク質がグリーン・フルオレセント・プロテイン (ＧＦＰ)、レッド・フルオレセント・プロテインおよびブルー・フルオレセント・プロテインから選択される請求項１または２に記載の細胞培養。４．当該プロモーターが心臓細胞、ニューロン、グリア細胞、造血性細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞または上皮細胞に特異的なプロモーターである請求項１から３の何れかに記載の細胞培養。５．当該プロモーターがＮｋｘ-２．５、ヒトα-アクチンおよびＭＬＣ-２Ｖプロモーターから選択される、特に心臓特異的ヒトα-アクチンプロモーターである請求項４に記載の細胞培養。６．当該ＤＮＡ構成が機能性ＤＮＡ配列、特にエンハンサーおよび選択配列を更に含む請求項１から５の何れかに記載の細胞培養。７．当該ＤＮＡ構成がプラスミドｐＣＸ(α-ａｃｔ)ＧＦＰ-Ｎｅｏ(ＤＳＭ１１６３３)である請求項１に記載の細胞培養。８．ヒト以外の哺乳類の出発ＥＳ細胞に、請求項１および３から７に記載のＤＮＡ構成を導入すること、安定してトランスフェクトされたＥＳ細胞をスクリーニングすることを含む請求項１から７の何れかに記載の細胞培養を調製する方法。９．当該導入をエレクトロポレーションにより実施する請求項８に記載の方法。１０．インビトロで安定してトランスフェクトした当該ＥＳ細胞を培養することを更に含む請求項８または９に記載の方法。１１．蛍光測定方法を用いた請求項１から７に記載の細胞培養における物質の効果の検査を含む物質の毒理学的検査用の方法。１２．請求項１から６の何れかに記載のＥＳ細胞をヒト以外の哺乳類の胚盤胞に注入すること、および代理母に胚盤胞を移すことを含む非細胞損傷性蛍光タンパク質の細胞型特異的発現を示すヒト以外のトランスジェニック哺乳類をつくる方法。１３．請求項１２に記載の方法により得ることが出来るヒト以外のトランスジェニック哺乳類。１４．蛍光測定方法を用いインビトロで請求項１３に記載のヒト以外の哺乳類の対応する標識細胞の検査を含む、細胞の発生段階を検査するための当該ヒト以外の哺乳類の使用。【手続補正書】【提出日】平成１２年１月７日（２０００．１．７）【補正内容】【図１】【図２】【図３】【図４】

Claims

【特許請求の範囲】１．非細胞損傷性蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列；ならびに当該ＤＮＡ配列に操作しやすいように連結した細胞および／または発生依存プロモーターを含むＤＮＡ構成を安定してトランスフェクトしたヒト以外の哺乳類の胚幹(ＥＳ)細胞。２．当該ＥＳ細胞を齧歯、特にマウスから得る請求項１に記載のＥＳ細胞。３．当該非細胞損傷性蛍光タンパク質がグリーン・フルオレセント・プロテイン (ＧＦＰ)、レッド・フルオレセント・プロテインおよびブルー・フルオレセント・プロテイン、特にＧＦＰから選択される請求項１または２に記載のＥＳ細胞。４．当該プロモーターが心臓細胞、ニューロン、グリア細胞、造血性細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞または上皮細胞に特異的なプロモーター、特に心臓細胞に特異的なプロモーターである請求項１から３の何れかに記載のＥＳ細胞。５．当該プロモーターがＮｋｘ-２．５、ヒトα-アクチンおよびＭＬＣ-２Ｖプロモーターから選択される、特に心臓特異的ヒトα-アクチンプロモーターである請求項５に記載のＥＳ細胞。６．当該ＤＮＡ構成が機能性ＤＮＡ配列、特にエンハンサーおよび選択配列を更に含む請求項１から５の何れかに記載のＥＳ細胞。７．ヒト以外の哺乳類の出発ＥＳ細胞に、請求項１および３から６に記載のＤＮＡ構成を導入すること、安定してトランスフェクトされたＥＳ細胞をスクリーニングすることを含む請求項１から６の何れかに記載のＥＳ細胞を調製する方法。８．当該導入をエレクトロポレーションにより実施する請求項７に記載の方法。９．請求項１および３から６の何れかに記載のＤＮＡ構成。１０．プラスミドｐＣＸ(α-ａｃｔ)ＧＦＰ-Ｎｅｏ(ＤＳＭ１１６３３)であることを特徴する請求項９に記載のＤＮＡ構成。１１．インビトロで請求項１から６の何れかに記載のＥＳ細胞を培養することにより得ることが出来る、非細胞損傷性蛍光タンパク質の細胞型特異的発現を示す細胞培養。１２．細胞が集塊型である請求項１１に記載の細胞培養。１３．蛍光測定方法を用いた請求項１１または１２に記載の細胞培養における物質の効果の検査を含む物質の毒理学的検査用の方法。１４．請求項１から６の何れかに記載のＥＳ細胞をヒト以外の哺乳類の胚盤胞に注入すること、および代理母に胚盤胞を移すことを含む非細胞損傷性蛍光タンパク質の細胞型特異的発現を示すヒト以外のトランスジェニック哺乳類をつくる方法。１５．請求項１４に記載の方法により得ることが出来るヒト以外のトランスジェニック哺乳類。１６．蛍光測定方法を用いインビトロで請求項１５に記載のヒト以外の哺乳類の対応する標識細胞の検査を含むヒト以外の哺乳類の細胞の発生段階を検査する方法。