JP2002506881A

JP2002506881A - 新規マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤および下方調節剤

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Publication number: JP2002506881A
Application number: JP2000536741A
Authority: JP
Inventors: エルッキ・コイヴネン; ティモ・ソルサ; トゥーラ・サロ
Original assignee: ヘルシンキ・ユニバーシティ・ライセンシング・リミテッド・オイ
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-17
Publication date: 2002-03-05
Also published as: US6624144B1; DK1071704T3; FI980604A0; PT1071704E; EP1071704B1; EP1071704A1; AU2936599A; DE69909076T2; WO1999047550A1; CA2323239C; ES2203088T3; ATE243709T1; CA2323239A1; DE69909076D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)阻害剤および下方調節剤、これらの阻害剤の製造方法、これらの阻害剤／下方調節剤を含んでなる医薬組成物、医薬品および研究製剤の製造のための新規ＭＭＰ阻害剤の使用、インビボまたインビトロのいずれかにおけるＭＭＰ依存状態を阻害および下方調節する方法、マトリックスメタロプロテイナーゼの形成、合成、発現、活性化および／または機能、さらにはまた、作用を阻害する方法、並びにマトリックスメタロプロテイナーゼの生化学的な単離および精製方法における新規ＭＭＰ阻害剤および下方調節剤の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新規マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)阻害剤および下方
調節剤(down-regulators)、これらの阻害剤の製造方法、これらの阻害剤／下方調節剤を含んでなる医薬組成物、医薬品および研究製剤の製造のための新規マト
リックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の使用、インビボまたインビトロのいずれ
かにおけるＭＭＰ依存状態を阻害および下方調節する方法、マトリックスメタロ
プロテイナーゼの形成、合成、発現および／または機能、さらにはまた、作用を
阻害する方法、並びにマトリックスメタロプロテイナーゼの生化学的な単離およ
び精製方法における新規ＭＭＰ阻害剤の使用に関する。

【０００２】マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)は、細胞移動を制限する細胞外マ
トリックスおよび基底膜のほとんど全ての構成要素を分解することができる、遺
伝的に密接に関連のあるタンパク質分解酵素のスーパーファミリーを構成する。
ＭＭＰはまた、セルピンズ、サイトカインおよび成長因子、さらにはまた、ある
細胞表面成分も処理する(Ｗoessner，１９９１；Ｂirkendal−Ｈansen，１９９５；Ｃhandlerら，１９９７)。ＭＭＰは、形態形成、並びに創傷治癒、栄養芽層
移植および子宮内膜月経崩壊といったような生理的な状況の間、組織再構築およ
び細胞遊走を媒介する際に重要な役割を担うと考えられる。

【０００３】ＭＭＰはさらに、組織再構築、脈管形成、サイトカイン、成長因子、インテグ
リンおよびそれらのレセプター処理といったような分子現象の処理および変更に
関与する(Ｃhandlerら，１９９７)。ＭＭＰはまた、単球により誘発される細菌毒性因子による腫瘍壊死因子(ＴＮＦ−α)の放出および膜結合型タンパク質分解
処理も媒介する。この事象は、膜結合型メタロプロテイナーゼＴＡＣＥ(ＴＮＦ −α活性化酵素)により媒介される。従って、本発明に提示する新規ペプチドのようなＭＭＰ阻害剤は、このタイプの活性化酵素をブロックすることにより、Ｔ
ＮＦ−αの活性化を防ぐことができる(Ｓhapiraら，１９９７)。

【０００４】幾つかの研究は、癌、転移、リウマトイド関節炎、多発性硬化症、歯周炎、骨
粗鬆症、骨肉腫、骨髄炎、気管支拡張症、慢性肺閉塞性疾患、並びに皮膚および
眼病といったような様々な疾患において、ＭＭＰの発現および活性が身体の内因
性抗プロテイナーゼシールド以上に病理学的に高まることを示した。タンパク質
分解酵素、とりわけＭＭＰは、これらの疾患に伴う組織破壊損傷の原因になると
思われる。

【０００５】細胞外タンパク質の分解／崩壊が重要な役割を担う、様々な他の障害がある。
そのような疾患の例には、関節炎、後天性免疫不全症候群(エイズ)、熱傷、褥瘡
および静脈瘤性潰瘍といったような創傷、骨折、外傷、胃潰瘍形成、?瘡および乾癬といったような皮膚病、苔癬様病変、表皮水疱症、アフタ(反応性経口潰瘍)
、歯周病、インプラント周囲炎(peri-implantitis)、顎および他の嚢胞並びに根
管処置または歯内治療処置、関連のある疾患、外部および内部の歯根吸収、齲蝕
等といったような歯科病が含まれる。

【０００６】ＭＭＰスーパーファミリーの少なくとも２０のメンバーが知られていて(Ｂirk
endal−Ｈansen，１９９５；Ｐei ＆Ｗeiss，１９９６；Ｌlanoら，１９９７) 、ＭＭＰファミリーメンバーおよびそれらの細胞起源の数は常に増えている。Ｍ
ＭＰ酵素は各々、酵素において活性部位を構成すると思われる、推定上の三座配
位Ｚn²⁺結合部位を含む。ごく最近では、cＤＮＡライブラリーを既知のＭＭＰ遺
伝子の保存領域に対する相同性に関してスクリーニングすることにより、ＭＭＰ
ファミリーの３つの新たなメンバーが発見されて、膜型マトリックスメタロプロ
テイナーゼ−１、−２、および−３(ＭＴ−ＭＭＰ−１、−２、および−３)と名
付けられた。それらの予想されるアミノ酸配列に基づいて、ＭＴ−ＭＭＰは各々
、前に特性決定したＭＭＰはほとんど全て、（ｉ）候補のリーダー配列、（ii）
触媒作用的に不活性な状態にあるＭＭＰチモーゲンを安定化するのに役立つ、高
度に保存されたＰＲＣＧＸＰＤ配列が含まれるプロペプチド領域、（iii）亜鉛が結合する触媒作用ドメイン、および（iv）それらの各々のＣ末端付近にヘモペ
キシン様ドメインを含む。加えて、ストロメライシン−３に関して記載されてい
るパターンに似たパターンでは、ＭＴ−ＭＭＰは各々、プロタンパク質コンベル
ターゼファミリーのメンバーに関して可能性のある認識モチーフをコードする、
それらのプロドメインと触媒作用ドメインとの間に挟まれた、短いアミノ酸挿入
断片を含む。しかしながら、他のＭＭＰファミリーメンバーに対する、それらの
相当な類似性にもかかわらず、ＭＴ−ＭＭＰだけが、それらのＣ末端に約７５−
１００個のアミノ酸伸張を含み、これらには各々、膜貫通(ＴＭ)ドメインの存在
と一致する親水性ストレッチが含まれる。従って、全ての他のＭＭＰと対比して
、ＭＴ−ＭＭＰは、可溶性タンパク質というよりはむしろ、膜に結合した細胞外
酵素として発現する(Ｐei ＆Ｗeiss，１９９６)。

【０００７】ＭＭＰファミリーメンバーの包括的な概観、それらの活性化、作用方式、様々
な天然タンパク質(内因性阻害剤)および合成化合物による、それらの阻害、さら
にはまた、様々な病的状態および疾患におけるＭＭＰファミリーメンバーの関与
の詳細は、Ｗoessner（１９９１）；Ｋrane（１９９４）；Ｂirkendal−Ｈansen
ら（１９９３）；およびＢirkendal−Ｈansenら（１９９５）(これらの開示に記
載されている内容は全て、本明細書の一部を構成する)により記されいる。本発明の範囲において、マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)という用語は、
全ての発見されたＭＭＰをいう。

【０００８】ゼラチナーゼＡまたは７２kＤaのＭＭＰ−２およびゼラチナーゼＢまたは９２
kＤaのＭＭＰ−９は、当初、それらが基底膜の分解に不可欠な酵素であるらしい
ことから、IV型コラゲナーゼとして記載されていた(Ｔryggvasonら，１９８７) 。循環に出入りする間、内皮基底膜を通り抜けるには、細胞が必要である。これ
はまた、腫瘍細胞が遠位の臓器に転移し得る前に成し遂げなければならない転移
カスケードにおいて極めて重要な工程でもある。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は
また、脈管形成(Ｈanahan ＆Ｆolkman，１９９６；Ｖolpertら，１９９６)およ
び局所腫瘍浸潤(Ｓtetler−Ｓtevensonら，１９９３)といったような転移カスケ
ードの他の工程における機能も有し得る。

【０００９】ＭＭＰは、治療介入に関して可能性のある標的であることから、多くの研究が
合成メタロプロテイナーゼ阻害剤の設計に焦点を合わせてきた。チオール、ヒド
ロキサメート、ＥＤＴＡ、ホスホンアミダート、ホスフィナート等といったよう
な反応性亜鉛キレート基を含む、多くのＭＭＰを阻害する化合物が開発されてき
た(Ｂeckettら，１９９６)。ペプチド模倣物質の幾つかは、転移、関節炎、およ
び他の炎症疾患の動物モデルにおいて有利な効果を示している。腫瘍細胞浸潤は
また、生来のＭＭＰ阻害剤ＴＩＭＰ−１(メタロプロテイナーゼの組織阻害剤)お
よびＴＩＭＰ−２により阻害することもできる。ＭＭＰはまた、ＭＭＰの潜在に
重要である、ＭＭＰの高度に保存されたプロドメイン領域に基づいたペプチドに
より阻害することもできる(Ｐarkら，１９９１；Ｍelchioriら，１９９２；Ｆot
ouhiら，１９９４)。加えて、テトラサイクリン類およびそれらの非抗菌性化学的修飾物質(ＣＭＴ)、さらにはまた、アントラサイクリン誘導体は、ＭＭＰを阻
害することが見出されている(Ｇolubら，１９９２；Ｓorsaら，１９９４)。

【００１０】上の論議は、ＭＭＰに対する幾つかの阻害剤が確かに存在することを示して、
研究しているが、その試験はまだ、ほとんど実験段階にあって、ＭＭＰに対する
臨床的に許容され得る阻害剤は、ＭＭＰと関係のある可能性を持つ病的状態およ
び疾患の幾つかに対する治療または予防薬として存在していない。上に記載した
ＭＭＰ阻害剤において検出されている有害な副作用には、例えば、毒性(合成ペプチド)、抗菌活性(テトラサイクリン)等が含まれる。

【００１１】合理的な分子設計のための他の方法は、ランダムペプチドまたは他の化学物質
のライブラリーをスクリーニングして、標的分子に結合するリード化合物を見出
すことである。特に、バクテリオファージの表面上に示されるペプチドライブラ
リーは、標的タンパク質に対する有益な結合ペプチドをもたらすことが多かった
。しかしながら、短いペプチドは、プロテイナーゼにより容易に分解されるかも
しれないことから、プロテイナーゼに対する阻害剤を短いペプチドのライブラリ
ーから単離するのはより困難であった。むしろ、ファージが示すペプチドライブ
ラリーを利用して、プロテイナーゼにより切断される配列の情報を得ている(Ｍa
tthews ＆Ｗells，１９９３；Ｓmithら，１９９５)。プロテイナーゼに対する阻害剤は、ファージ表面発現およびある活性部位残基をランダム化した大きなプ
ロテイナーゼ阻害剤ドメインの選択をもって開発された(Ｒobertsら，１９９２；Ｄennisら，１９９５)。

【００１２】本発明者達は、現在、設計したジスルフィド結合により配座的に制限した、フ
ァージが示すペプチドライブラリーを使用して、ＭＭＰ、とりわけＭＭＰ−９お
よびＭＭＰ−２に対する新規ペプチド阻害剤を上手く単離した。開発した最も活
性なＭＭＰ阻害剤は、内皮細胞のインビトロでの遊走、さらにはまた、腫瘍細胞
の浸潤を阻害することができ、従って、ペプチド模倣物質を設計して、ＭＭＰを
ブロックするための、可能性のあるリード化合物であり得る。そのペプチドはま
た、ＭＭＰの生化学的な単離および精製方法のためのカラムクロマトグラフマト
リックスにおいて使用することもできる。

【００１３】従って、本発明の目的は、配列表の配列番号１に示した配列に対応するペプチ
ドモチーフ：ＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣ［ここで、Ｘは、いずれかのアミノ酸残基である。］の環状構造(システインの間のジスルフィド結合)に基づいた新規マトリックスメ
タロプロテイナーゼ阻害剤および結合性リガンドを提供することである。

【００１４】本発明の別の目的は、配列番号２に示した配列に対応するペプチドモチーフ：ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣおよび配列番号３に示した配列に対応するペプチドモチーフ：ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの環状構造に基づいた新規マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤および下方
調節剤を提供することである。

【００１５】本発明はまた、１つ以上のＭＭＰ、とりわけＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ
−９の活性、活性化、機能、および／または発現を減少させるのに有効な新規マ
トリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤／下方調節剤の量、および薬学的および
生化学的に許容され得る担体を含んでなる医薬組成物にも関する。本発明による
新規ＭＭＰ阻害剤／下方調節剤を含んでなる医薬組成物は、全身的に、局所的に
、および／または局部的に使用することができる。それらにはまた、他のＭＭＰ
阻害剤、他の薬物および腫瘍ホーミング化学薬品／分子との、全ての可能性のあ
る組み合わせ(組み合わせ投薬)も含まれる。

【００１６】本発明にはまた、マトリックスメタロプロテイナーゼ依存状態の処置のための
医薬品製剤の製造を目的とした、新規マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
の使用、およびそれにまた、ＭＭＰの生化学的な精製および単離方法における、
例えば、親和性リガンドとしての、それらの使用も含まれる。ＭＭＰ依存状態に
は、限定されるものではないが、創傷、熱傷、骨折、病変、潰瘍、結合組織およ
び骨における癌および転移進行、歯周炎、歯肉炎、インプラント周囲炎、嚢胞、
根管処置、内部および外部の根管吸収、齲蝕、エイズ、角膜潰瘍形成、胃潰瘍形
成、アフタ、外傷、?瘡、乾癬、骨内股関節部プロテーゼの弛み、骨髄炎、骨粗鬆症、組織再構築、脈管形成、関節炎(リウマトイド、反応性および骨関節炎)、
脈管形成、肺疾患(気管支拡張症および慢性閉塞性肺疾患および他の肺疾患)が含
まれる。

【００１７】本発明はまた、新規マトリックスメタロプロテイナーゼの製造方法であって、
標準的な固相Ｍerrifieldペプチド合成を含んでなる方法にも関する。

【００１８】本発明による新規ＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣ構造は、前に記載したＭＭＰ阻害剤に
対する類似性を示さないが、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの活性は、以下に記載するよ
うに、化学的に修飾されたテトラサイクリン(ＣＭＴ)の特性に似ている。その新
規構造を含んでなるペプチドは、単一のシステインを発現するＣＸ₉ライブラリーから得られて、ＨＷＧＦ共通配列を示した。全て、もう１つのシステインを含
み、環状構造ＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣを示した。ファージ結合実験は、クローン化
ファージが相当な親和性をもつＭＭＰ−９に結合することを示した。

【００１９】本発明による環状ペプチドは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９によるゼラチンお
よびカゼイン基質の分解を５−１０μg／mlのＩＣ₅₀で阻害した。合成した一連のペプチドのうち、ＨＷＧＦを含むペプチドＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣおよびＣＴＴ
ＨＷＧＦＴＬＣは、ＭＭＰ−９の阻害剤として最も有望であることが見出された
。これらの２つのＨＷＧＦを含むペプチドはまた、ＭＭＰ−２も阻害した。ペプ
チドをＭＭＰ−９に対して選択したが、ＭＭＰ−２もまた強く阻害することがで
きるという事実は、それらのペプチドがＭＭＰ−９とＭＭＰ−２との間の非常に
類似した結合部位を認識することを示す。

【００２０】開発した最も活性なＨＷＧＦを含むペプチド(ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ)は、標準
血清を含む媒体中で試験した細胞遊走を阻害して、再構築された基底膜を通して
のヒト内皮細胞の遊走、さらにはまた、ＨＴ１０８０線維肉腫およびＣ８１６１
黒色腫細胞の浸潤をブロックした。これらの発見は、癌細胞と内皮細胞との両方
が、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの下方調節効果に感受性のある、遊走するための非常
に類似したＭＭＰ依存機構を使用し得ることを意味する。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ
の高い活性は、少なくとも一部が、ゼラチンおよびカゼイン基質を使用すること
により以下に示すように、ペプチドは、活性酵素を阻害することができるだけで
はなく、精製したプロＭＭＰ−９およびプロ−ＭＭＰ−２の自己活性化を妨げる
こともできるという事実によるものであろう。そのペプチドはまた、ＭＭＰ−９
の産生を下方調節することもできる。我々がプロＭＭＰ−９へのファージ結合を
いずれも見ることができなかったファージ結合データとは対照的に、アフィニテ
ィークロクトグラフィーをセファロースに結合したペプチドで使用して、ヒト白
血球軟膜からのプロＭＭＰ−９の単一工程の単離により示すように、合成ＣＴＴ
ＨＷＧＦＴＬＣペプチドは、プロＭＭＰ−９へ確かに結合する。概して、プロＭ
ＭＰに結合することにより、そのペプチドは、細胞浸潤の間に起こりそうな活性
化機構である、他のプロテイナーゼによる真のタンパク質分解活性化を妨げ得る
ことが可能である。

【００２１】対応する直鎖状ペプチドは、システインの還元およびアルキル化による活性の
喪失により実証されるように、実質的には不活性であった。従って、本発明によ
るとりわけ好ましいＭＭＰ阻害剤は、以下に示すように、ＭＭＰ−２およびＭＭ
Ｐ−９の活性を阻害する環状ペプチド阻害剤ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣおよびＣＲＲ
ＨＷＧＦＥＦＣである。

【００２２】上に述べたように、我々が開発した新規環状ペプチド阻害剤は、ＭＭＰおよび
細胞遊走をブロックするためのペプチド模倣物質を設計するのに有用なリード化
合物である。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、２つのＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣペプ
チドにより別々に阻害されたので、ＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣモチーフはまた、ＭＭ
Ｐファミリーの個々のメンバーに対するより選択的な阻害剤を開発するのに利用
することもできる：ＭＭＰ−２は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣにより、より強く阻害
されたが、ＭＭＰ−９は、ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣにより優先的に阻害された。多
くの実験系において、腫瘍細胞の転移の可能性は、ＭＭＰ−９活性よりはむしろ
ＭＭＰ−２活性とかなり相関していたので、例えば、ＭＭＰ−２に割り当てられ
た選択的な阻害剤は、腫瘍播種を防ぐのにより有効であるかもしれない。最後に
、小さなサイズのＭＭＰ標的化環状ペプチドは、薬物を腫瘍へと運ぶために利用
することができる。腫瘍脈管系においてファージライブラリーから得られるペプ
チド標的化受容体は、マウスにおける腫瘍への有用な細胞毒性薬物担体であるこ
とが見出された。ＭＭＰは、通常、正常組織と比較して、腫瘍において過剰発現
し、脈管形成方法に関与するらしいので、標的化した化学療法に関して可能性の
ある受容体である。

【００２３】従って、本発明の結果として、ＭＭＰ依存状態は、現在、新規ＭＭＰ阻害剤単
独で、または問題の疾患もしくは障害と関連して通常使用される他の薬物と組み
合わせて、処置または予防することができる。これらには、例えば、テトラサイ
クリン、化学的に修飾されたテトラサイクリン(Ｇolubら，１９９２)、ビスホス
ホネート、さらにはまた、インテグリンが結合するペプチド(Ａrapら，１９９８
)のような、腫瘍部位へのホーミング／担体分子が含まれる。本発明による医薬組成物において使用すべき新規マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の量は
、使用する特定の阻害剤、処置すべき患者および疾患、さらにはまた、投与経路
により様々である。

【００２４】本発明の新規ＭＭＰ阻害剤は、動物に注射した場合に毒性を示さず、トリパン
ブルー色素排除により測定される細胞数または生存率に影響を及ぼさなかった。

【００２５】従って、本発明はまた、哺乳動物におけるＭＭＰ依存状態の治療または予防処
置のための方法であって、該哺乳動物に、新規ＭＭＰ阻害剤の有効量を投与する
ことによる方法、さらにはまた、哺乳動物におけるＭＭＰの形成、合成、発現、
活性化、機能および作用を阻害する方法であって、該哺乳動物に、新規ＭＭＰ阻
害剤／下方調節剤を、ＭＭＰの形成、活性化および作用をブロックするのに有効
である量で投与することを含んでなる方法にも関する。

【００２６】本発明はまた、マトリックスメタロプロテイナーゼをインビトロで阻害する方
法であって、インビトロでの系に、新規マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害
剤を、ＭＭＰ活性を阻害するのに有効である量で加えることを含んでなる方法に
も関する。

【００２７】本発明のさらなる目的は、新規マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の助
けをもって、マトリックスメタロプロテイナーゼを単離および精製する方法であ
る。

【００２８】図面の簡単な説明図１は、合成ペプチドを使用しての、ＭＭＰ−９が媒介する[¹²⁵Ｉ]−ゼラチン分解の阻害から得られた結果を示す。ＡＰＭＡで活性化したＭＭＰ−９を、Ｃ
ＲＲＨＷＧＦＥＦＣおよびＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣと共に、指示した濃度で予め１
時間インキュベートしておいた後、[¹²⁵Ｉ]−ゼラチン基質を加えた。１時間ゼラチン分解した後、媒体に放出された内容物を測定した。その結果は、２回の測
定から得られた平均を示す。３回の独立実験において、類似の結果を得た。

【００２９】図２は、ＡＰＭＡで活性化したＭＭＰまたはそれらのプロ型により誘発される
ゼラチン分解を示す。環状および直鎖状ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣペプチドの濃度は
、１０μg／mlであった。その結果は、２回の実験から得られた平均を示す。

【００３０】図３は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ａ、Ｂ）およびＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣ（Ｃ、
Ｄ）による、ＭＭＰ−２が媒介するカゼイン分解の阻害を示す。ペプチドで予め
処理しておいた後、ＡＰＭＡで活性化したＭＭＰ−２（Ａ、Ｃ）またはプロＭＭ
Ｐ−２（Ｂ、Ｄ）をカゼインと共に２時間インキュベートした。５２μＭ β− カゼインをＭＭＰに対する基質として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し
た、２１kＤのβ−カゼイン（レーン１）およびそのフラグメント（レーン２− ９）のクーマシーブルー染色を示す。（Ａ、Ｂ）；レーン２−９において、ＣＴ
ＴＨＷＧＦＴＬＣは各々、（２）０μg／ml、（３）７５、（４）５０、（５）２５、（６）１０、（７）５、（８）１、および（９）０.５μg／mlの濃度で使
用した。（Ｃ、Ｄ）；ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣの濃度は各々、０、２５０、１００
、５０、２５、１０、１、および０.５μg／mlであった。

【００３１】図４は、セファロースに結合したＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドへのプロＭＭ
Ｐ−９の結合を示す。ヒト軟膜細胞のライゼートを各々のペプチドセファロース
に適用して、ＳＤＳゲル、続いて、クーマシー青色染色（レーン１−２）、また
は抗ＭＭＰ−９抗体での免疫ブロッティング（レーン５−６）により、結合タン
パク質を分析した。レーン１および５は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ−セファロース
から溶出したタンパク質を示す。レーン２および６は、ＧＡＣＬＲＳＧＲＧＣＧ
Ａ−セファロースから溶出したタンパク質を示す。レーン３は、細胞ライゼート
のタンパク質染色を示す。レーン４は、２００、９２、７６、および５５kＤaの
分子量マーカーを示す。

【００３２】図５は、どのようにしてＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣがＨＴ１０８０線維肉腫細胞の
遊走を阻害するかを示す。細胞を、指示した濃度でのＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣまた
は５００μg／mlの関連のないＥＶＧＴＧＳＣＮＬＥＣＶＳＴＮＰＬＳＧＴＥＱ対照ペプチドで予め２時間処理しておいた。細胞をトランスウェルチャンバーに
塗布して、１０％血清を含む媒体中で２０時間遊走させた。フィルターの下面に移行した細胞を染色して、フィルター領域を走査した。その結果は、３枚のウ
ェルから得られた平均光学密度±Ｓ.Ｄ.を示す。細胞を含まない盲検のトランス
ウェルの光学密度は０.０００であった。

【００３３】図６は、Ｃ８１６１黒色腫細胞の遊走を防ぐためのＭＭＰ阻害剤ＣＴＴＨＷＧ
ＦＴＬＣおよびＣＭＴ−８の効力の比較を示す。細胞を、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ
、ＣＭＴ−８、またはＥＶＧＴＧＳＣＮＬＥＣＶＳＴＮＰＬＳＧＴＥＱ対照で予
め処理しておいて、トランスウェルチャンバー中で２０時間遊走させた。フィル
ターの下面に遊走した細胞を染色して、走査した。その結果は、３枚のウェルか
ら得られた平均光学密度±Ｓ.Ｄ.を示す。

【００３４】図７は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる内皮細胞遊走の阻害を示す。ＨＵＶＥＣ
は２０％血清、Ｅahy９２ラインは１０％血清の存在下、内皮細胞を１８時間遊走させた。トランスウェルチャンバーの下面に移行した細胞の相対数を示す。
その結果は、３枚のウェルから得られた平均±Ｓ.Ｄ.を示す。

【００３５】図８は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる腫瘍細胞のＭatrigel浸潤の阻害を示す。１０％血清を含む媒体中、Ｃ８１６１またはＨＴ１０８０細胞を、Ｍatrigel
を通して２４時間浸潤させた。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣおよびＥＶＧＴＧＳＣＮＬ
ＥＣＶＳＴＮＰＬＳＧＴＥＱ対照の濃度は５００μg／mlであった。浸潤した細胞を数えて、細胞の相対数を、３枚のウェルから得られた平均±Ｓ.Ｄ.として表
わす。

【００３６】図９は、乳癌の増殖がＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドにより明らかに阻害され
ることを示す。

【００３７】図１０は、黒色腫細胞でコンディションした媒体のゼラチン酵素電気泳動法を
示す。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドは、活性な８２kＤのＭＭＰ−９の形成を阻害するが、対照ペプチドは阻害しない。

【００３８】図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドの不存在ま
たは存在下における、１０％血清中でのＭＢ−４３５乳癌細胞の２日間の増殖を示す。

【００３９】図１２は、表皮細胞ゲラチナーゼの産生および発現に対するＣＴＴＨＷＧＦＴ
ＬＣ（Ｐ２９１）の効果を示す。

【００４０】図１３は、表皮細胞遊走に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ｐ２９１）の効果を
示す。遊走してから４日後にプレートの写真を撮る。

【００４１】しかしながら、次の実施例は、何ら限定することなく、本発明を説明する。

【００４２】実施例１．ファージ展示ライブラリーの作製およびＭＭＰ−９に結合するファー
ジの選択

【００４３】前に記載した方法(Ｋoivunenら，１９９４ａ；Ｋoivunenら，１９９４ｂ；およびＫoivunenら，１９９５)(これらに記載されている内容は全て、本明細書の一部を構成する)により、単一のシステインを発現するＣＸ₉ライブラリーを作製
した。

【００４４】本質的にはＨibbsら（１９８５）により記載されているように、プロＭＭＰ−
９をヒト好中球から精製して、酢酸アミノフェニル水銀(ＡＰＭＡ)で活性化した
。ＭＭＰ−９に結合するファージの選択のために、ＡＰＭＡで活性化したＭＭＰ
−９を１μg／mlの濃度を使用して、マイクロタイタープレートを４℃で一晩被覆した後、細胞を５％仔ウシ血清アルブミンで飽和した。最初のパニング(pann
ing)では、１％仔ウシ血清アルブミンを含む５０mＭトリス−ＨＣl／０.１Ｍ
ＮaＣl緩衝液(pＨ７.５)(ＴＢＳ)中、ライブラリーを４℃で一晩インキュベートし、何回も洗浄した後、結合ファージを低いpＨの緩衝液で溶出した。その後のパニングでは、増幅したファージを２２℃で１時間結合させた。Ｋoivunenら（１９９４ｂ）により記載されているように、ランダムに選択したクローンを一
晩増幅して、配列決定した。ＭＭＰ−９への各々のクローンの結合を結合アッセ
イにより確かめ、ここでは、ＭＭＰで被覆した、または盲検のマイクロタイター
プレートウェル中、クローン化ファージを６０分間インキュベートした。そのウ
ェルを、０.５％トゥィーン２０を含むＴＢＳで５回洗浄した。ユウロピウム−
キレート(Ｗallac Ｌtd.，Ｔurku，Ｆinland)で標識した抗Ｍ１３抗体(Ｐharmac
ia，Ｕppsala，Ｓweden)を１ウェルあたり５０ng加えることにより、結合ファー
ジを定量した。４５分間インキュベーションし、続いて、洗浄した後、蛍光を１
２３０Ａrcus 蛍光光度計(Ｗallac Ｌtd.，Ｔurku，Ｆinland)で測定した。

【００４５】３つのＭＭＰ−９に結合する配列、ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣ、ＣＴＴＨＷＧＦＴ
ＬＣ、およびＣＳＬＨＷＧＦＷＷＣをＣＸ₉ライブラリーから得た。３つは全て、もう１つのシステインを含み、環状構造ＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣを示した。幾つ
かの試みにもかかわらず、我々は、選択したクローンにおけるＬＲＳＧＲＧモチ
ーフの優位から、ＨＷＧＦを含むファージを３つだけ単離することができた。従
って、我々は、ランダムテトラペプチド(および従って、ＨＷＧＦもまた)が両方
の側面でシステイン残基により隣接したペプチドライブラリーを構築し、これは
、幾つかのジスルフィド架橋を作り、それによって、ペプチド配座を構築するこ
とができた。このＣＸ₃ＣＸ₄ＣＸ₂Ｃライブラリーは、２つ、３つおよび４つのランダム残基をもつ、３つの異なったペプチド環サイズを発現した。ＭＭＰ−９
でのパニングでは、このライブラリーは、ヒスチジンが保存されなかったことを
除き、ＨＷＧＦ共通に類似している、ＷＧＦ、ＹＧＦおよびＦＧＦモチーフをも
たらした。

【００４６】実施例２．ペプチドの合成および酵素阻害アッセイによるそれらのＭＭＰ阻害剤
活性の測定

【００４７】我々は、ＭＭＰ−９に対して最も高い活性を示す実施例１のファージモチーフ
に対応する環状ペプチドを合成し、ゼラチンおよびカゼイン分解アッセイを使用
して、合成ペプチドのメタロプロテイナーゼ阻害剤活性を測定した。

【００４８】Ｆmoc化学を使用して、ペプチドをＡpplied Ｂiosystems ４３３Ａ型(Ｆoster
Ｃity，ＣＡ)で合成し、２０％ジメチルスルホキシドを含む５％酢酸(pＨ６
.０)中、絶えず混合しながら室温で一晩環化した。０.１％トリフルオロ酢酸で
１:２に希釈した後、ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製した。ペプチドの構造を質量分析により確認した。ペプチドをＨ₂Ｏ中の１００mg／mlの保存溶液中で保存して、使用する直前に、中性のpＨをもつ緩衝液に希釈した。

【００４９】ゼラチンおよびカゼイン分解アッセイに関して、まず最初に、精製したＭＭＰ
−２およびＭＭＰ−９(５０−１００ng)を様々な濃度のペプチド阻害剤と共に６
０分間インキュベートした後、２１kＤaのβ−カゼイン(５２μＭ)または[¹²⁵Ｉ
]−ゼラチン基質を加えた。２２℃で２時間インキュベーションした後、カゼインの分解をＳＤＳゲル電気泳動法により分析した。分解していないゼラチンを２
０％トリクロロ酢酸で沈殿させた後、上清中の放射能を数えることにより、[¹²
⁵Ｉ]−ゼラチンの分解を測定した。

【００５０】合成した一連のペプチドのうち、ＨＷＧＦモチーフを含むペプチドＣＲＲＨＷ
ＧＦＥＦＣおよびＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣは、ＭＭＰ−９の最も有望な阻害剤であ
ることが見出された。[¹²⁵Ｉ]−ゼラチン分解アッセイにおいて、ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣは、その２つのペプチドのうちのより活性なものであって、ＡＰＭＡで
活性化したＭＭＰ−９を約１０μg／mlの最大半減阻害値(ＩＣ₅₀)で阻害した（図１）。

【００５１】ＨＷＧＦを含むペプチドはまた、ゼラチンとのインキュベーションの間に自己
活性化する、プロＭＭＰ−９により媒介されるゼラチン分解活性も阻害した。図
２は、プロＭＭＰ−９活性の５０％より多くの阻害が１０μg／mlの濃度でのＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣペプチドで得られたことを示す。ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣペプ
チドの活性に関するジスルフィド結合の重要性を評価するために、我々は、Ｋoi
vunenら（１９９３）により記載されているように、システイン残基を還元およびアルキル化することにより、ペプチドの直鎖化変種を作製した。ペプチドの直
線化は、プロＭＭＰ−９、さらにはまた、ＡＰＭＡで活性化した酵素に対する阻
害活性の喪失を結果的に引き起こした（図２）。

【００５２】プロＭＭＰ−２をヒト歯茎線維芽細胞の無血清培養培地から精製した。２つの
ＨＷＧＦを含むペプチドＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣおよびＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣはま
た、ＭＭＰ−２も阻害し、１０μg／mlの濃度では、環状ＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣペプチドは、プロＭＭＰ−２およびＡＰＭＡで活性化したＭＭＰ−２の両方によ
るゼラチン分解をブロックした（図２）。対照として使用した直鎖状ペプチドは
、実質的には不活性であった。

【００５３】我々はまた、ゼラチナーゼに対する基質としてβ−カゼインを使用して、ＳＤ
Ｓゲル電気泳動法により分解産物も分析した。２つのＨＷＧＦを含むペプチドは
、ＭＭＰによるカゼインの分解を有効に防いだ。ＭＭＰ−２に関して、ＣＴＴＨ
ＷＧＦＴＬＣおよびＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣペプチドは各々、約５μg／mlおよび２５μg／mlのＩＣ₅₀値を有していた（図３Ａおよび３Ｃ）。ＡＰＭＡで予め活性化しておかなかったプロＭＭＰ−２もまたカゼイン分解を引き起こし、これは
各々、５μg／mlおよび２５μg／mlの同じＩＣ₅₀値でのペプチドによりブロック
された（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＭＭＰ−９によるカゼイン分解は、ＣＲＲＨＷＧ
ＦＥＦＣがこのＭＭＰに対してＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣより僅かに強力な阻害剤で
あったことを除き、マイクロモル濃度でのペプチドにより同様に阻害された。こ
れらのペプチド(０−２００μg／ml)は、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ−１(ＭＴ１−ＭＭＰ)を阻害せず、腫瘍浸潤および基底膜崩壊におけるゼラチ
ナーゼ(ＭＭＰ−２および−２)の重要性に関する証拠を与えた。

【００５４】実施例３．ペプチドアフィニティークロマトグラフィーによるプロＭＭＰ−９の
抽出

【００５５】ファージライブラリーから選択される合成ペプチドがＭＭＰ−９を認識するこ
とを実証するために、我々は、セファロースに結合したペプチドでアフィニティ
ークロマトグラフィーを行った。

【００５６】製造業者(Ｐharmacia，Ｕppsala，Ｓweden)の指示によって、ＣＮＢrで活性化
したセファロース１mlあたりペプチド２mgを結合させることにより、アフィニテ
ィークロマトグラフィー樹脂またはＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣを作製した。Ｆinnish
Ｒed Ｃrossから得たヒト軟膜細胞を、１％オクチルグルコシドを含む５０mＭ
ＴＢＳに溶解して、澄明となった抽出物２０mlを各々のペプチドセファロースに適用した。ＯＤ₂₈₀が０.０１以下となるまで、カラムを洗浄した。１％オクチルグルコシドの存在下、結合タンパク質を０.１Ｍグリシン−ＨＣl緩衝液(p Ｈ２.２)で溶出した。次いで、そのpＨを１Ｍトリス塩基で中和した。還元条件下、画分２０μlを８％アクリルアミドゲルでのＳＤＳゲル電気泳動法により
分析した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。免疫ブロット分析に関し
て、ニトロセルロースフィルターをポリクローナルＭＭＰ−９抗体と共に１：５
００の希釈で１時間、続いて、二次抗ウサギ抗体と共に１：１０００の希釈でも
う１時間インキュベートした。高められた化学発光システム(Ａmersham，Ｂucki
nghamshire，Ｅngland)を視覚化のために使用した。

【００５７】白血球から得られた抽出物を、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣと結合させたセファロー
スカラムに適用して、抗ＭＭＰ−９抗体でのＳＤＳゲル電気泳動法および免疫ブ
ロッティングにより、結合したタンパク質を分析した。ペプチドカラムは、一組
のポリペプチドを結合し、このうちの一方は、９２kＤaのプロＭＭＰ−９であっ
た(図４)。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣセファロースに結合したプロＭＭＰ−９は、Ｓ
ＤＳゲルを９２kＤaでダブレットとして移動し（レーン１）、この型は両方とも
、抗ＭＭＰ−９抗体と免疫反応性であった。幾つかの腫瘍セルラインによりコン
ディションされた培養培地のＭＭＰ−９免疫ブロットにおいて、類似のダブレッ
トを観察することができた(データは示しておりません)。ペプチドセファロース
はまた、５５−６５kＤaで遊走する一組のポリペプチドも結合し、この同一性は
知られておらず、さらに試験しなかった。

【００５８】実施例４．ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる細胞遊走の阻害

【００５９】細胞遊走に対する、新規ＨＷＧＦを含むＭＭＰの有効性を試験するために、我
々は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドを、そのより良好な溶解性から、選択して
使用した。

【００６０】内皮セルラインＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＡＴＣＣ，Ｒockville，ＭＤから得られた)を、ペニシリン(１００単位／ml)、ストレプトマイシン(１０
０μg／ml)、１０mＭヘペス、３０μg／ml 内皮細胞増殖補助物質(Ｂiomedical
Ｔechnologies，Ｓtoughton，ＭＡ)、および２０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で培養した。ＨＴ１０８０線維肉腫細胞(ＡＴＣＣ，Ｒockville
，ＭＤ)、Ｃ８１６１黒色腫細胞およびＥahy９２６細胞(ＨＵＶＥＣの誘導体)を
、Ｅahy９２６細胞と共に、抗生物質、１０％ウシ胎仔血清、およびヒポキサン
チン／アミノプテリン／チミジン添加物を含むダルベッコの修飾されたイーグル
の培地で培養した。細胞の培養物をトリプシン−ＥＤＴＡ(内皮細胞)またはＥＤ
ＴＡ単独(他の細胞)で収集し、洗浄して、上に示した全ての血清を含む培地に再
縣濁させた。

【００６１】使用前に血清を含む培地中で２時間平衡化した、細孔径８.０μＭおよび直径
６.５mmのトランスウェル挿入物(Ｃostar，Ｃambridge，ＭＡ)を使用して、ランダム細胞浸潤を試験した。Ｍatrigel(Ｂecton Ｄickinson，Ｂedford，ＭＡ) で予め被覆しておいて、血清を含む培地で平衡化した、直径６.４mmのＢoyden チャンバーを使用して、腫瘍細胞遊走を試験した。血清を含む培地７５０μlを、遊走装置のより低いコンパートメントに加えた。ランダム遊走アッセイに関し
て、指示した濃度でのペプチドの存在下、細胞を予め２時間インキュベートして
おいて、容積１００μl中の２０,０００個の細胞をトランスウェルに塗布した。
Ｍatrigel浸潤に関して、容積５００μl中の１００,０００個の細胞を、ペプチドと共に、またはペプチドなしで、各々のウェルに塗布した。細胞を１６−２０
時間培養した後、細胞をメタノールで固定し、洗浄して、トリパンブルーで染色
した。細胞を膜の上面から綿棒で除去して、膜の下部に遊走した細胞を顕微鏡に
より数えるか、あるいはまた、走査により定量した。

【００６２】ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドは、１０または２０％血清の存在下に試験した様々なセルラインの遊走をブロックすることができた。トランスウェルランダ
ム遊走アッセイにおいて、そのペプチドは、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞の運動性
を濃度依存的に阻害した（図５）。５００および１００μg／mlの濃度では、そのペプチドは各々、８０〜４０％まで阻害した。対照を目的として、我々は、ス
クランブルしたＣＷＬＴＦＴＨＧＴＣを合成したが、その水性緩衝液中での溶解
性の喪失から、それを使用することはできなかった。従って、我々は、３つの関
連のない非常に可溶性のペプチドＥＶＧＴＧＳＣＮＬＥＣＶＳＴＮＰＬＳＧＴＥ
Ｑ、ＣＱＷＮＮＤＮＰＬＦＫＥＡＥＥＥＶＭＮＰＫＦＡＥＳ、およびＲＡＶＲＡ
ＬＷＲＣを使用した。これらの対照ペプチドはいずれも、５００μg／mlの濃度での細胞遊走に影響を及ぼさなかった（図５、およびデータは示しておりません
）。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣは、そのペプチドが初期結合を防がず、細胞をフィブ
ロネクチン、コラーゲンIV、またはＭatrigel基層に広げることから、細胞表面インテグリンをブロックすることは見出されなかった。ペプチドの存在下に培養
してから１日または２日後では、細胞生存率の有意な減少は留意されなかった( データは示しておりません)。

【００６３】ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣは、Ｃ８１６１黒色腫細胞のランダム遊走を５００μg ／mlの濃度で最大８０％まで同様に阻害する（図６）。３つの対照ペプチドは、
細胞遊走に影響を及ぼさなかった。

【００６４】我々はまた、トランスウェルアッセイにおいて、内皮細胞のランダム遊走に対
するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの効果も試験した（図７）。２００μg／mlの濃度では、そのペプチドは各々、Ｅahy９２６およびＨＵＶＥＣ細胞遊走の８５および６０％の阻害を示し、２０μg／mlの濃度でもなお、部分的に阻害することができた。ＲＡＶＲＡＬＷＲＣペプチドは、細胞遊走を細胞ブロックすることができ
なかった。

【００６５】最後に、我々は、ＨＴ１０８０およびＣ８１６１細胞のＭatrigel浸潤を防ぐＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの能力を試験した。両方のセルラインにおいて、そのペプ
チドは、浸潤を強く抑制し、その阻害は、試験した最も高い濃度の５００μg／m
lで最大９０％であった。３つの対照ペプチドはいずれも、Ｍatrigel浸潤に影響
を及ぼさなかった。

【００６６】実施例５．局所的に適用したＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる、無胸腺マウスにおけ
るヒト乳癌異種移植片の増殖の抑制

【００６７】１×１０⁶ ＭＤＡ−Ｂ−４３５細胞を脂肪乳房パッドに播種することにより、
ヒト乳癌を有するマウスを発生させた。４週間後、直径を三次元で測定すること
により、腫瘍の容積を計算した。マウスを、各々が５匹の動物からなる、２つの
グループに分けた。一方のグループは、容積２００μl中のＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ２００μgを腫瘍付近へ１週間に３回投与して処置した。もう一方のグループには、環状ペプチド対照ＣＶＲＮＳＬＡＣを与えた。腫瘍容積を毎週測定した；
結果は、ペプチドで処置してから３週間後のものである（図９）。その結果は、
ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドが乳癌増殖を明らかに阻害することを示す。

【００６８】実施例６．ゼラチン酵素電気泳動法により検出される、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣに
よるプロＭＭＰ−９の非活性化

【００６９】Ｃ８１６１黒色腫細胞を、１０％血清を含む培地中、２４ウェルのプレートにおいて４８時間培養した。ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドが図１０において指
示した濃度(５００−１０μg／ml)で含まれており、対照ペプチドＲＡＶＲＡＬＷＲＣは、５００μg／mlで含まれていた。コンディションした培地を、ＳＤＳゲル電気泳動法、続いて、ゼラチン酵素電気泳動法により分析した。ＣＴＴＨＷ
ＧＦＴＬＣは、８２kＤaの活性ＭＭＰ−９のレベルを濃度依存的に減少させたが
、７２kＤaのプロＭＭＰ−２のレベルには影響を及ぼさなかった。

【００７０】実施例７．丸い細胞形態の時間依存誘発および基層から得られた細胞の剥離

【００７１】１０％血清を含む培地中、ＭＢ−４３５乳癌細胞をＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドの不存在または存在下に４８時間培養した後、細胞を光学顕微鏡により分
析した。同じ濃度で試験した、関連のない合成ペプチドは、細胞層の形態に対し
て効果がなかった。丸い細胞形態は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣを適用した後、１６
−２４時間以内に検出可能であるが、短時間の培養においては明らかではない（
図１１Ａ〜１１Ｃ）；そのペプチドは、１または２時間の時間スケールの間、基
層での細胞の初期結合に対して効果がなかった。

【００７２】実施例８．細胞生存率に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの効果

【００７３】細胞生存率に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの効果を評価するために、１０％ウシ胎仔血清および５００μg／mlのＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣまたは関連のない対照ペプチドを含む培地１ml中、１００,０００個の細胞を２４ウェルのプレートに塗布した。２０または４０時間培養した後、トリパンブルー、または製造業者
(Ｓigma，Ｓt. Ｌouis)の指示によりＭＴＴ試薬で染色することにより、生存率を測定した。細胞接着試験に関して、マイクロタイターウェルをフィブロネクチ
ン(Ｆinnish Ｒed Ｃross)、IV型コラーゲン(Ｓigma)またはＭatrigelで被覆して、ＢＳＡでブロックした。細胞(１ウェルあたり１００,０００個)を無血清培地中の５００μg／mlのＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣまたは対照ペプチドと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、結合細胞を染色して、数えた
。

【００７４】トリパンブルー色素排除により、ペプチドが細胞数または生存率に影響を及ぼ
すことは見出されず、動物に注射した場合に毒性を示さなかった。そのペプチド
は、Ｍatrigel、コラーゲンまたはフィブロネクチンでの細胞の初期結合を防がなかった。

【００７５】実施例９．表皮細胞ゲラチナーゼの産生および発現に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬ
Ｃの効果

【００７６】ＫＧＭ５０μl中、３０,０００個のＨaＣat細胞(自発的にトランスフォームした非腫瘍形成性ヒト表皮細胞セルライン，Ｒyleら，１９８９)を９６ウェルの
プレート(Ｎunclon，Ｄenmark)のウェルに播種して、加湿大気中、３７℃で２４
時間結合させた。次いで、その細胞を、１０ng／mlのＴＧＦβと共に、またはな
しで、ＫＧＭまたは５０−５００μg／mlのＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣを含むＫＧＭにさらした。一組の培養物を、１、１０または２０ng／mlのＴＧＦβ単独で処理
した。２４時間後、培地を収集して、酵素電気泳動法(Ｈeussen ＆Ｄowdle，１
９８０)により分析するまで、−２０℃で保存した。培養培地１２μlを、１.０m
g／mlの２−メトキシ−２,４−ジフェニル−３(２Ｈ)−フラノンで標識したゼラ
チン(Ｏ'Ｇradyら，１９８４)を含む１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにお
いて操作した。ゼラチンの溶解を長波紫外光によりモニターして、ゲルを写真撮
影した。コンピューター化デンシトメーター(ＭＣＤＩ−Ｍ４，Ｉmaging resear
ch Ｉnc.，Ｓt. Ｃatherines，Ｏntario，Ｃanada)を使用して、写真撮影したゲ
ルからゼラチナーゼの量を測定した。プレートにおける細胞を、５％(ｖ／ｖ) スクロースを含むＰＢＳ中の４％(ｖ／ｖ) ホルムアルデヒドで固定して、ホウ酸(pＨ６.０)中の０.１％クリスタルバイオレットで２０分間染色した。１０％酢酸で脱染色した後、吸光度をＭultiscan ＭＳプレート読み取り装置(４. ０版，Ｌabsystem，Ｈelsinki，Ｆinland)で５９５nmにて測定した。この方法に
より得られた相対細胞数を、細胞１個あたりのゼラチナーゼの量を数える場合に
使用した。ＭＭＰ−９だけが、細胞１個あたりの酵素の量を計算するための測定
可能な切断率を与えた。図１２に示す結果は、２回の実験の平均である。

【００７７】実施例１０．表皮細胞ゲラチナーゼの遊走に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣの効果

【００７８】２４ウェルのプレート(Ｃostar，Ｃambridge，ＭＡ，ＵＳＡ)をＰＢＳ(pＨ７
.４)中の５０μg／mlのフィブロネクチン(ＦＮ；ヒト血漿から得られた；Ｓigma
，Ｆ−２００６，Ｓt. Ｌouis，ＭＯ，ＵＳＡ)で被覆した。金属シリンダーを被
覆したウェルに置いて、ＫＧＭ培地(５０μlでの)中の５０,０００個のＨaＣat 細胞をシリンダーに播種した。加湿大気中、その細胞を基質に３７℃で２４時間
結合させた。そのシリンダーを取り除き、非接着細胞を培養培地で洗浄すること
により取り除いて、培地を、様々な濃度のＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣまたはＴＧＦβ
を含むＫＧＭに置き換えた。細胞をディスクから３７℃で４日間遊走させて取り
除いた。培地を収集して、細胞を、５％(ｖ／ｖ) スクロースを含むＰＢＳ中の４％(ｖ／ｖ) ホルムアルデヒドで固定して、ホウ酸(pＨ６.０)中の０.１％ク
リスタルバイオレットで染色した。ウェルを写真撮影し、Ｍacintoshコンピュー
ター用のＮＩＨＩmage １.４５プログラムを使用して、遊走した細胞の領域を数えることにより、遊走量を測定した。遊走してから４日後のプレートの写真お
よび遊走した細胞の計算した領域を図１３に示す。その結果は、２回の二重実験
の平均である。

【００７９】配列表フリーテキスト配列番号１に関して：２の位置にある可変性のaa、Ｘaaは、いずれのアミノ酸でもあり得る。３の位置にある可変性のaa、Ｘaaは、いずれのアミノ酸でもあり得る。８の位置にある可変性のaa、Ｘaaは、いずれのアミノ酸でもあり得る。９の位置にある可変性のaa、Ｘaaは、いずれのアミノ酸でもあり得る。

【００８０】参考文献

【表１】

【００８１】

【表２】

【００８２】

【表３】

【００８３】

【表４】

【００８４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、合成ペプチドを使用しての、ＭＭＰ−９が媒介する[¹²⁵
Ｉ]−ゼラチン分解の阻害から得られた結果を示す。

【図２】図２は、ＡＰＭＡで活性化したＭＭＰまたはそれらのプロ型によ
り誘発されるゼラチン分解を示す。

【図３】図３は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ａ、Ｂ）およびＣＲＲＨＷＧＦ
ＥＦＣ（Ｃ、Ｄ）による、ＭＭＰ−２が媒介するカゼイン分解の阻害を示す。

【図４】図４は、セファロースに結合したＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチド
へのプロＭＭＰ−９の結合を示す。

【図５】図５は、どのようにしてＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣがＨＴ１０８０線
維肉腫細胞の遊走を阻害するかを示す。

【図６】図６は、Ｃ８１６１黒色腫細胞の遊走を防ぐためのＭＭＰ阻害剤
ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣおよびＣＭＴ−８の効力の比較を示す。

【図７】図７は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる内皮細胞遊走の阻害を示す
。

【図８】図８は、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣによる腫瘍細胞のＭatrigel浸潤の阻害を示す。

【図９】図９は、乳癌の増殖がＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドにより明ら
かに阻害されることを示す。

【図１０】図１０は、黒色腫細胞でコンディションした媒体のゼラチン酵
素電気泳動法を示す。

【図１１】図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプ
チドの不存在または存在下における、１０％血清中でのＭＢ−４３５乳癌細胞の２日間の増殖を示す。

【図１２】図１２は、表皮細胞ゲラチナーゼの産生および発現に対するＣ
ＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ｐ２９１）の効果を示す。

【図１３】図１３は、表皮細胞遊走に対するＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（Ｐ２
９１）の効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者トゥーラ・サロフィンランド、エフイーエン−90570オウル、フィーシコンティエ８番Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA17 BA23 NA14 ZA332 ZA592 ZA892 ZA962 ZA972 ZB152 ZB262 ZC202 4H045 AA30 BA15 BA32 CA01 DA56 EA28 FA34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペプチドモチーフ：ＣＸＸＨＷＧＦＸＸＣ［ここで、Ｘは、いずれかのアミノ酸残基である。］の環状構造を含んでなるマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤および下方調
節剤。
【請求項２】ペプチドモチーフがＣＲＲＨＷＧＦＥＦＣである、請求項１
に記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤および下方調節剤。
【請求項３】ペプチドモチーフがＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣである、請求項１
に記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤および下方調節剤。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテ
イナーゼ阻害剤および下方調節剤、並びに薬学的に許容され得る担体を含んでな
る医薬組成物。
【請求項５】マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)依存状態の処置
のための医薬組成物の製造を目的とした、請求項１〜３のいずれかに記載のマト
リックスメタロプロテイナーゼ阻害剤および下方調節剤の使用。
【請求項６】ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９に依存する状態の処置
のための医薬組成物の製造を目的とした、請求項５に記載の使用。
【請求項７】請求項１に記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
／下方調節剤の製造方法であって、固相Ｍerrifieldペプチド合成を含んでなる方法。
【請求項８】哺乳動物におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ依存状
態の治療または予防処置のための方法であって、該哺乳動物に、請求項１〜３の
いずれかに記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤／下方調節剤を、該
哺乳動物におけるＭＭＰの活性化、発現および／または機能を阻害または下方調
節するのに有効である量で投与することを含んでなる方法。
【請求項９】ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９に依存する状態の治療
または予防処置のための、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】哺乳動物におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの形
成、合成、活性化、発現、機能および作用を阻害する方法であって、該哺乳動物
に、請求項１〜３のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
および下方調節剤を、ＭＭＰの形成、活性、活性化および作用をブロックするの
に有効である量で投与することを含んでなる方法。
【請求項１１】ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９の発現、形成、活性
化および作用を阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】マトリックスメタロプロテイナーゼをインビトロで阻害お
よび下方調節する方法であって、インビトロでの系に、請求項１〜３のいずれか
に記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤および下方調節剤を、ＭＭＰ
活性を阻害および下方調節するのに有効である量で加えることを含んでなる方法
。
【請求項１３】阻害および下方調節すべきマトリックスメタロプロテイナ
ーゼがＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】マトリックスメタロプロテイナーゼの生化学的な単離およ
び精製方法における、請求項１〜３のいずれかに記載のマトリックスメタロプロ
テイナーゼ阻害剤および下方調節剤の使用。