JP4811885B2 - ルシリア・セリカータの幼虫から得られるキモトリプシン及び創傷の治療のためのその使用 - Google Patents
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Description
組織の再生
繊維芽細胞の接着の促進
ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物の収集及び性質決定
排泄物/分泌物(ES)を、以前に記載されているとおりに(Horobin et al,2003)、孵化した直後の無菌のルシリア・セリカータの幼虫(LarvETM,Zoobiotic Ltd,UK)から収集した。簡潔に述べると、ES産物を回収するために、無菌のリン酸緩衝化生理的食塩水(PBS)1mL中において、室温で(RT)30分間、400個の生きた幼虫を洗浄した。それぞれ、Bio−Rad(Hercules,CA)タンパク質アッセイキット及びフルオレセインイソチオシアナート(FITC)−カゼイン消化アッセイ(Horobin et al,2003)を用いて、ESのタンパク質濃度及びタンパク質分解活性を測定した。ともに、これらは、161.74μg/mLのタンパク質濃度及び6.04×106相対蛍光単位/mgESタンパク質の比活性であることを明らかにした。
ダルベッコの改変イーグル培地(D−MEM)(GibcoTM,Invitrogen Ltd,UK)、10%ウシ胎児血清(FCS)(Sigma(R),UK)、抗生物質/抗真菌溶液(Sigma(R))(100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び0.25μg/mLアムフォテリシンB)及び2mML−グルタミン(Sigma(R))を含有するT75フラスコ(Nunc,Life Technologies Ltd,UK)内で、HFF細胞(TCS Cellworks(R),UK)を単層培養した。5%CO2を含有する加湿された雰囲気中において、細胞を37℃に維持した。
通常の細胞培養(上記参照)に対して使用した濃度の2倍のD−MEM、抗生物質/抗真菌物質及びL−グルタミンを含有する原液を作製した。冷蔵後、1:1の比で、3mg/mLウシコラーゲンI型(ICN Biomedicals,Ohio,USA)、60μg/mLウシフィブロネクチン(Sigma(R))及び幼虫のES又はPBSブランクを含有する冷溶液と原溶液を氷上で混合した。1×D−MEM、1.5mg/mLコラーゲン及び30μg/mLフィブロネクチンの最終濃度を得た。幼虫のESの最終タンパク質濃度は、表記されているように、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml又は10μg/mlであった。図3に示されているように、及びここに記載されているように、アッセイを組み立てた。すなわち、上述のように、58mm組織培養皿(Nunc,Life Technologies Ltd)の中に、D−MEM−コラーゲン/フィブロネクチン混合物1000μLを注ぎ、均一な薄い連続層の中に37℃でゲル化した。HFF細胞(継代6)をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために、10%FCSを含有するD−MEM中に懸濁した。次いで、遠心によってそれらを沈降させ、FCSを含まないD−MEM中に再懸濁した。血球計数器を用いた細胞数の推定後に、細胞を再び沈降させ、1×107細胞/mLの密度で、D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチンゲル混合物内に再懸濁した。次いで、皿の中のゲル層の上に、それぞれ、この細胞懸濁物2μLを含有する5つの小滴を配置し、ゲル化されるまで、37℃で温置した。次いで、細胞小滴を完全に覆うために、細胞小滴の上に、D−MEM/コラーゲン/フィブロネクチン混合物をさらに1000μLに注ぎ、ゲル化させるために37℃で放置した。最後に、上部ゲル層を覆うために、ゲル中と同じ濃度で抗生物質/抗真菌物質、L−グルタミン及びPBSブランク又は幼虫のESを含有する、FCSを含まないD−MEMを添加した。次いで、表記の時間、加湿された5%CO2雰囲気中、37℃で、組み立てられたアッセイを温置した。この間、無菌条件を維持した。
各処理内において各細胞小滴反復のmm周囲当りの遊走する細胞数に相当する値を平方根に変換した。次いで、GraphPadPrismTMソフトウェアを用いて、これらを一元配置の分散分析(ANOVA)及びダネットの多重比較検定にかけた。各処理内の各小滴反復下で、細胞によって達成された直線遊走距離をまとめた。次いで、正常な分布を確保するために、それらを対数変換し、適切な処理カテゴリー下において、幾何平均を順に並べた。GraphPadPrismTMソフトウェア内で使用できる一元配置のANOVA及びダネットの多重比較検定を用いて、順に並べられた平均を解析した。全ての事例で、各分散を確認し、統計的な有意性をP<0.05と定義した。
別の実験において、僅かな修飾を加えて、上述のように三次元インビトロアッセイを組み立てた。ここで、3×105細胞/mLのより低い細胞密度を含有する1つの20μL小滴を各アッセイ中に組み込んだ。1μg/mLES、5μg/mLES又はPBSブランク(対照)の何れかでアッセイを処理した。位相差顕微鏡を用いて、0、24及び48時間の温置後に、細胞の形態を観察した。ゲルマトリックスの外観にも着目した。
繊維芽細胞の遊走を調べるために、三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイ組み立て直後(0時間)又は48時間の温置後(48時間)に固定されたゲルの共焦点顕微鏡画像は、第一に、0時間の温置の時点で細胞小滴の外側に細胞が全く観察されなかったこと、第二に、48時間にわたって細胞小滴からの細胞の遊走が水平及び垂直の両配向で起こることを確認し、遊走の三次元の性質を確認した(HorobinAJPhDthesis,2004)。
繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化を調べるために、繊維芽細胞のより低い密度を含有する三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイを組み立てた直後には、ESの存在下又は不存在下の細胞は同じように見えた(図9)。しかしながら、24時間の温置までに、1μg/mLES、特に5μg/mLESの存在下の細胞は、ESの不存在下の細胞より、より長い細胞質伸長突起を有するより十分に広がった形態を採った。5μg/mLのESが存在する場合には、細胞間の並列された鎖様結合性マトリックス原繊維が観察された。48時間の温置では、アッセイ間の差はより顕著であった。この時点までに、ESの不存在下では、細胞はより丸い状態となった(図9)。一方、1μg/mLのES又は5μg/mLのESに曝露された細胞は十分に広がった形態を維持していた。5μg/mLのESに曝露された細胞間で観察された、並列された鎖様結合性原繊維は、より見やすく、数が多かった。さらに、マトリックスはより透明であるように見え、原繊維の無作為な網目構造はより目立たなかった。
本発明者らは、ESキモトリプシンの効果を市販のウシキモトリプシンと比較するためにさらなる実験を行った。従って、フィブロネクチンへの繊維芽細胞の接着に対するESの効果をトリプシン及びキモトリプシンの市販の調製物と比較した。これは、ES、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンの様々な濃度の存在下で、フィブロネクチンで被覆された表面上に繊維芽細胞を播種することによって達成された。最大48時間の温置期間後に、全ての培地から試料を吸引し、穏やかに洗浄して、表面に付着することができなかった細胞を除去した。次いで、検出されたATPの濃度に従って、表面上に残存する細胞の相対数を定量するためにアデノシン三リン酸(ATP)アッセイを行った。トリプシン特異的な基質に対する活性の同等のレベルを含有するES及びトリプシンの効果を比較すると、ESは、表面への繊維芽細胞の接着を低下させる上でより効果的であった。例えば、24時間の温置後、5μg/mLのESは、対照の16.6%まで細胞接着を低下させた(図10a)。トリプシン特異的な蛍光発生基質トシル−Gly−Pro−Arg−AMCに対するESの活性の103.2%を示した市販のトリプシン(1.6μg/mL)は、対照の34.9%まで細胞接着を低下させた。48時間の温置後、5μg/mLESの存在下での細胞接着は対照の9.3%まで減少したのに対して、1.6μg/mLの市販のトリプシンは細胞の接着を対照の24.7%まで低下させた。
創傷郭清
ウジのキモトリプシンの精製
L.セリカータES産物のSephacrylS300クロマトグラフィー。
7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)の、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC(キモトリプシン)及びトシル−Gly−Pro−Arg−AMC(トリプシン)からの放出をモニタリングすることによって、キモトリプシン/トリプシン活性を評価した。PBS中に希釈された基質150μL(5μM)とともに各画分50μLを温置した。37℃で30分間、試料を温置し、その後、DynexMFXマイクロプレート蛍光光度計を用いて蛍光を測定した(励起365nm、発光検出465nm)。ゼロ時点の読み取りの推測後、30分にわたって発せられた蛍光単位の数として、タンパク質分解活性を表す。
Kumar&Pritchard(1992)によって記載された方法を用いて、基質SDS−PAGEを実施した。分離ゲル中に0.1%(w/v)ゼラチンを含めて、12%(w/v)SDS−PAGEゲルを調製した。ゼラチンを溶解するために、ゲルを55℃まで加温した。各画分10μLを非還元試料緩衝液(0.5MTris、pH6.8、5%SDS(w/v)、20%グリセロール(w/v)、0.01 %ブロモフェノールブルー)の等容量と混合し、37℃で30分間温置した。次いで、スタッキングゲル中に形成された各ウェルに画分を適用し、20mAの定常電流で試料を電気泳動した。電気泳動後、Lacks&Springhorn(1980)によって記載されたように酵素を再生するために、室温で20分間、2.5%TritonX−100中でゲルを洗浄した。次いで、水の中で20分間、ゲルを洗浄し、最後に、PBS中において、37℃で一晩温置した。Coomassie brilliant blueR250でゲルを染色することによって、タンパク分解活性を検出し、青の背景に対する透明なバンドの領域として観察される。
キモトリプシン活性のC1プールの塩濃度を0.5MNaClに調整し、PBS、0.5MNaClで平衡化された大豆トリプシン阻害剤アガロースカラム3mL(流速0.2mL/分)にかけた。カラムを通過する緩衝液の280nmでの吸光度がゼロになるまで、PBS、0.5MNaClでカラムを洗浄した。0.7%エタノールアミンによって、結合されたタンパク質を溶出し、1mL画分を集め、2MTris−Cl(1:1v/v)で直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した(図16)。蛍光性基質及びゼラチンSDS−PAGEを用いるタンパク分解活性に関して、溶出されたタンパク質をアッセイした(図17)。
同様に、大豆トリプシン阻害剤カラムにトリプシン画分のT2プールを通した。カラムから溶出する画分を直ちに中和し、プールし、PBSに対して一晩透析した(図19)。
L.セリカータES産物10μgとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、Biorad等電点電気泳動再水和緩衝液(8M尿素、2%CHAPS、50mMDTT、0.2%Ampholytes)中に処理された痂皮及び処理されていない痂皮を溶解した。Biorad2Dタンパク質「クリーンアップ」キットを用いて、タンパク質をさらに精製し、得られた沈降物を等電点電気泳動再水和緩衝液中に再度可溶化した。
L.セリカータC1、T1又はT2プール100μLとともに、創傷痂皮の約1mgを一晩温置した。温置後、処理された痂皮及び処理されていない痂皮を上記のように処理した。
NcoI制限部位(5’−CTGCCATGGTCATGAAATTCTTAATAGTT−3’)を付加するフォワードプライマー及びNheI部位(5’−GACGCTAGCATAAGAAATTCCGGTGTG−3’)を付加するリバースプライマーを使用するPCRによって、cDNAライブラリーからL.セリカータキモトリプシノーゲンの完全長翻訳領域(ORF)を増幅した。生じた断片をpBac−3中のポリヘドリンプロモーターの下流にクローニングさし、配列決定し(図12)、アミノ酸配列を予想した(図13)。
Claims (16)
- 配列番号1で示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれから得られるキモトリプシン。
- 配列番号6のアミノ酸配列を含む請求項1のポリペプチド。
- 配列番号1に示されたアミノ酸配列から成る請求項1のポリペプチドまたはそれから得られるキモトリプシン。
- 創傷郭清活性および繊維芽細胞の遊走促進活性を有し、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチドの断片であるポリペプチドであって、当該ポリペプチドの断片が、配列番号1の残基65、110および205または配列番号6の残基86−90、135−138および228−231を含む前記ポリペプチドまたは
前記断片であるポリペプチドと少なくとも95%以上の同一性を有し、創傷郭清活性および繊維芽細胞の遊走促進活性を有する変異体。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチドの断片である請求項4記載のポリペプチドであって、当該ポリペプチドの断片が、配列番号1の残基65、110および205または配列番号6の残基86−90、135−138および228−231を含む前記ポリペプチド。
- 合成物である請求項1から5の何れか一項に記載のポリペプチド。
- ルシリア・セリカータの幼虫から得られる、請求項3に記載のポリペプチド。
- ルシリア・セリカータの幼虫の排泄物/分泌物から得られる、請求項7に記載のポリペプチド。
- 幼虫が新たに孵化されている、請求項7または8に記載のポリペプチド。
- 幼虫が初齢である、請求項7から9の何れか一項に記載のポリペプチド。
- 幼虫が無菌環境中で育てられる、請求項7から10の何れか一項に記載のポリペプチド。
- 創傷の治療において使用するための、請求項1から11の何れか一項に記載のポリペプチド。
- 創傷の治療用医薬の調製における、請求項1から12の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 医薬的に許容される添加物と組み合わせて請求項1から12の何れかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項1から11の何れか一項に記載のポリペプチドまたは請求項14に記載の組成物を含む、創傷のための包帯。
- 請求項1から12の何れか一項に記載のポリペプチドをコードするDNA。
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