JP2002504323A - アルカリ性バチルスアミラーゼ - Google Patents

アルカリ性バチルスアミラーゼ

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JP2002504323A JP2000532507A JP2000532507A JP2002504323A JP 2002504323 A JP2002504323 A JP 2002504323A JP 2000532507 A JP2000532507 A JP 2000532507A JP 2000532507 A JP2000532507 A JP 2000532507A JP 2002504323 A JP2002504323 A JP 2002504323A
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オウトトルップ，ヘレ
レンフェルト ニールセン，ビャルネ
ヘデガード，リスベート
トエンネ アンデルセン，イエンス
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ノボザイムス アクティーゼルスカブ
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
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    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase

Abstract

(57)【要約】 本発明は、低温でのアルカリ性洗浄において向上した洗浄性能を有するアミラーゼに関する。更に具体的に、本発明はアルカリ性溶液中、特にpH９〜１１周辺のアルカリ洗剤溶液中で向上した性能を有するバチルス種由来の新規α−アミラーゼを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は低温でのアルカリ性洗剤溶液における向上した洗浄性能を有するアミ
ラーゼに関する。 発明の背景 長年、α−アミラーゼは様々な異なる目的のために使用され、その中でも最も
重要なものは澱粉の液化、織物のデサイジング、紙及びパルプ工業における澱粉
修飾、並びに醸造及びベーキングのためである。ますます重要になっているα−
アミラーゼの更なる使用法は、アルカリ性のpHでの洗剤による洗浄の間の、澱粉
性の汚れの除去である。
【０００２】 商業用α−アミラーゼ製品の例は、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、ＢＡＮ（商標
）及びＦｕｎｇａｍｙｌ（商標）であり、全てデンマークのNovo Nordisk A/Sか
ら入手可能である。これら及び他の商業用供給源からの類似の製品は、酸性から
中性の至適pHを有しており、典型的にpH５〜pH７．５の範囲内であり、そしてア
ルカリ性のpHでの洗剤溶液中でそれらは至適な活性を示さない。
【０００３】 国際公開第９５／２６９３７号は、pH８で至適活性を有するバチルスの菌株由
来α−アミラーゼを開示している。国際公開第９６／２３８７３号は、洗浄条件
下で向上した性能を有するバチルスのアミラーゼの変異体を開示している。 米国特許第５，１４７，７９６号は、アルファアミラーゼ活性を有するアルカ
リ性プルラナーゼを記載している。前記書類の図２ｂはpH８〜８．５での至適ア
ミラーゼ活性を示す。
【０００４】 M.Takagi等の、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ８１，Ｎｏ．６
，５５７〜５５９（１９９６）は、バチルス・スペーシス種由来のアルカリ性ア
ルファアミラーゼ−プルラナーゼを記載している。前記酵素はpH９で至適アミラ
ーゼ活性を有するが、前記の活性はそれ以上のpHで急速に下がり、そしてpH１０
での前記の活性はpH７よりも低い。
【０００５】 アルカリ性溶液における、特におよそ９〜１１のpHでのアルカリ性洗剤溶液に
おける向上した性能を有する新規α−アミラーゼを提供することが、本発明の目
的である。 発明の要約 本発明は、 ａ）バチルス・スペーシスＮＣＩＭＢ４０９１６によって製造されるポリペプ
チドであり、あるいは ｂ）配列番号２の３２〜５３２位において示した様なアミノ酸配列を有するポ
リペプチドであり、あるいは ｃ）エスケリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１２
６６２において存在するプラスミド内にクローン化したＤＮＡ配列の前記アルフ
ァアミラーゼをコードする部分によってコードされるポリペプチドであり、ある
いは ｄ）ｉ）前記ポリペプチドと少なくとも６０％の相同性がある、又は ii) １若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入による前
記ポリペプチド由来である、 （ａ）又は（ｂ）において定義したポリペプチドの類似体である、アルファアミ
ラーゼを提供する。
【０００６】 別の観点において、本発明は１又は複数の以下の特性を有するα−アミラーゼ
を提供する： ・３７℃で測定するとき、pH１０．５での活性がpH７．３での活性よりも少な
くとも２倍高い。 ・３７℃で測定するとき、pH９．５での活性がpH７．３での活性よりも少なく
とも４倍高い。
【０００７】 ・３７℃で測定するとき、至適pHが約９．５。 ・pH１０．５及び６度のドイツ硬度で２０％ＳＴＰＰ、２５％Ｎａ2 ＳＯ4 、
１５％Ｎａ2 ＣＯ3 、２０％ＬＡＳ、５％Ｃ１２−Ｃ１５アルコールエトキシラ
ート、５％Ｎａ2 Ｓｉ2 Ｏ5 、０．３％ＮａＣｌを含む、３ｇ／ｌの試験洗剤溶
液における、２５℃での２０分のインキュベーションの後、９０％以上のその活
性を保持し、前記の同一の溶液における、３０℃での２０分のインキュベーショ
ンの後、９０％より低いその活性を保持する様な熱安定性。
【０００８】 ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定するとき、分子量が約５５kDa 。 ・等電点電気泳動によって決定するとき、等電点が約５。 本発明はまた、アルファアミラーゼをコードする、単離したＤＮＡを提供し、
ここで前記のアルファアミラーゼは上述したものであり、又は前記ＤＮＡ配列は
： ａ）配列番号１の９４〜１５９６位に示したＤＮＡ配列、あるいは ｂ）ｉ）前記ＤＮＡ配列と少なくとも６０％の相同性である、又は ii) 少なくとも５５℃で前記ＤＮＡ配列とハイブリダイズする、 ａ）において定義したＤＮＡ配列の類似体、 を含んで成る。
【０００９】 本発明の他の観点は、前記ＤＮＡ配列を含んで成る組換え発現ベクター、及び
前記ＤＮＡ配列又は前記組換え発現ベクターにより形質転換した細胞を提供する
。 本発明はまた、前記細胞を培養することによるアルファアミラーゼの製造方法
及び前記アルファアミラーゼを含んで成る洗剤組成物を提供する。 発明の詳細な説明 微生物供給源 本発明のアルファアミラーゼはバチルスの菌株由来であることができる。好ま
しい菌株はバチルス・スペーシスのＮＣＩＭＢ４０９１６である。この菌株は、
特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の期間のも
と、本発明者によって１９９８年１月２８日に、23St. Machar Drive, Aberdeen
AB2 1RY, Scotland, United KingdomのNational Collections of Industrial a
nd Marine Bacteria limited (NCIMB)に寄託された。プラスミドｐＪＡ３８８内
でクローン化されるアルファアミラーゼ遺伝子を含む、ＪＡ３８８と命名された
、エスケリッチャ・コリの菌株もまた、ブタペスト条約の期間のもと、１９９９
年２月３日にMasheroder Weg 1b, D-38124 Brannshwerg DE の、Deutshe Sammlu
ng von Microorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ) に寄託され、そして受
託番号ＤＳＭ１２６６２が与えられた。 アルファアミラーゼの製造 本発明のアルファアミラーゼは、バチルスの適当なアミラーゼ産生菌株又は本
発明の形質転換した宿主細胞の適当な栄養培地中での培養、及び前記培養培地か
らのアルファアミラーゼの回収によって製造することができる。
【００１０】 前記細胞を培養するために使用する培地は、問題の宿主細胞の生育及び本発明
のα−アミラーゼの発現の獲得に適当な従来の培地のいずれかであることができ
る。適当な培地は商業提供者から入手可能であり、又は公の方法（例えばCatalo
gues of the American Type Culture Collectionに記載）に従い調製することが
できる。
【００１１】 前記宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼは、公知の方法によって前記の培
養培地から都合よく回収することができ、この方法は、遠心又は濾過による前記
培地からの前記細胞の分離、及び硫安の様な塩による培地のタンパク質性成分の
沈澱、それに続くクロマトグラフィー的方法の使用、例えばイオン交換クロマト
グラフィー、親和性クロマトグラフィーなどを含む。 アルファアミラーゼの特性 好ましいアルファアミラーゼはバチルス・スペーシスのＮＣＩＭＢ４０９１６
由来である。それは前記の例において記述した様に製造することができる。前記
アミラーゼ及びそれをコードする前記ＤＮＡのアミノ酸配列は、配列番号１及び
２において示される。以下の特徴は、本発明のアミラーゼ（ＮＣＩＭＢ４０９１
６由来の精製したアルファアミラーゼ）のために見出された： Novex 社の４〜２５％グラジエントゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決
定するときの分子量が約５５kDa 。
【００１２】 等電点電気泳動（Ampholine PAG 社、pH３．５〜９．５）によって決定される
約５のｐＩ。 １００％としてpH７．３での活性を採用する、pH−活性曲線を図１に示す。そ
れは様々なpH値に調節した５０mMブリッテン−ロビンソン緩衝液を用いるファデ
バス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アッセイを用いて決定された。参照のため、２つの従
来技術のバチルスアミラーゼ（Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）由来のＴｅｒｍａｍｙｌ及び国際公開第９５／２６３９７号に従い製造さ
れるＳＰ７２２）のpHプロファイルを、図１においても示される同一の条件下測
定した。本発明のアミラーゼが、pH９．５において２つの従来技術のアミラーゼ
よりも約１０倍高い活性を持つことを図１は示す。図１はまた、至適活性が約pH
９．５であることを示す。
【００１３】 pH９．５に調節した５０mMブリッテン−ロビンソン緩衝液を用いる様々な温度
でのファデバスアッセイを用いて、温度−活性曲線を測定した。前記の結果を図
２において示す。本発明のアミラーゼが、約５５℃での至適活性を有することが
図２から読み取れる。 前記アミラーゼの安定性を、３０分インキュベーションした後、２２，３７，
４５，５５及び６５℃で、pH１０．５（５０mM ＣＡＰＳ）で測定した。前記酵
素を緩衝液中で４０NU／mlに希釈し、そして２５マイクロリットルの試料を各温
度でインキュベートした。３０分後、前記試料を氷上で冷却し、そして残留活性
を決定した。本発明のアミラーゼ及び従来技術のアミラーゼ（ＳＰ７２２）の安
定性プロファイルを図３に示す。
【００１４】 pH１０．５及び６°ｄＨ（ドイツ硬度、Ｃａ：Ｍｇ ２：１）で、上述の３ｇ
／ｌのＡ／Ｐモデル洗剤の溶液中で４０NU／mlのアミラーゼをインキュベートす
ることによって、安定性を試験した。インキュベーション後、残留活性をpH７．
３でファデバスによって測定した。前記の結果は２５℃でのインキュベーション
後が９５％の残留活性、そして３０℃では８７％であった。 ポリペプチド及びＤＮＡ配列の相同性 アミノ酸配列の相同性を、２つの配列の間の同一性の値として決定することが
でき、これは第２の配列から導いた第１の配列の値を示唆する。当業界で知られ
るコンピュータープログラムによって、前記の相同性を適当に決定することがで
きる。従って、バージョン８のＧＣＧにおいて提供されるFASTA (Needleman, S.
B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453
) は、以下の設定を使用することができる：スコアリングマトリックス（Ｓｃｏ
ｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）：Ｇｅｎ Ｒｕｎ Ｄａｔａ：ｂｌｏｓｕｍ５０．ｃ
ｍｐ、ギャップクリエイションペナルティー（ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔ
ｙ）：１２、ギャップエクステンションペナルティー（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐ
ｅｎａｌｔｙ）：２を使用する可変パムファクター（ｐａｍｆａｃｔｏｒ）。あ
るいは、バージョン９のＧＣＧからのギャップを、変換したバージョン８のペプ
チドスコアリングマトリックス、３０αギャップクリエイションペナルティー、
ntol社のマトリックス（http://plasmid/ 〜bioweb/matrix/) を用いる１のギャ
ップエクステンションペナルティーで、エンドギャップペナルティーなしで使用
することができる。
【００１５】 前記アミノ酸配列は、配列番号２の３２〜５３２位に示すアミノ酸配列と、少
なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも８０
％、特に少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性の値を好ましくは示す
。 前記のＤＮＡ配列の相同性は、２つの配列の間の同一性の値として決定するこ
とができ、これは第２の配列から導いた第１の配列の値を示唆する。前記の相同
性は当業界で知られているコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラム
パッケージ（前述）において提供されるＧＡＰによって適当に決定することがで
きる。従って、ギャップＧＣＧｖ８は以下のデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）パラ
メーターを使用することができる：５．０のギャップクリエーションペナルティ
ー及び０．３のギャップエクステンションペネルティー、デフォルトスコアリン
グマトリックス。整列させるために、ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎｎ／Ｗｕｎｓ
ｃｈ／Ｓｅｌｌｅｒｓの方法を使用する。
【００１６】 本発明のＤＮＡコンストラクトは、配列番号１の９４〜１５９６位に示すアミ
ノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは
少なくとも８０％、特に少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性の値を
好ましくは示すＤＮＡ配列を含んで成る。 知られている配列の相同性探索は、多くのバチルスのアミラーゼとの本発明の
配列の相同性が、上述した様に決定され、アミノ酸を基にして３１〜３４％及び
ＤＮＡを基にして４６〜４８％の範囲であることを示した。 ハイブリダイゼーション 与えられるＤＮＡが、配列番号１に相当するヌクレオチドプローブに対して類
似であることを示すために、ハイブリダイゼーションを使用する。ハイブリダイ
ゼーション条件を下文に詳細に記述する。
【００１７】 ヌクレオチドプローブ及び相同性のあるＤＮＡ又はＲＮＡ配列の間のハイブリ
ダイゼーションを決定するための適当な条件は、５×ＳＳＣ（標準クエン酸塩溶
液）中で１０分間、ハイブリダイゼーションするための、ＤＮＡフラグメント又
はＲＮＡを含むフィルターの予備浸漬、並びに５×ＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．１９８９）、５×デンハルト溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．１９８９）、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／mlの変性した、超音波処理した
サケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）の溶液中でのフィ
ルターのプレハイブリダイゼーション、そしてランダムプライミングされ（Fein
berg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6〜13) 、32Ｐ
−ｄＣＴＰ標識した（比活性＞１×１０9 cpm ／μｇ）プローブを含む前記と同
一の溶液中での約５５℃での１２時間のハイブリダイゼーションを含む。次に、
少なくとも５５℃、更に好ましくは少なくとも６０℃、更に好ましくは少なくと
も６５℃、より更に好ましくは少なくとも７０℃、特に少なくとも７５℃の温度
で、前記フィルターは２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、３０分間２回洗浄される
。
【００１８】 これらの条件下、オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、
Ｘ線フィルムを用いて検出される。 組換え発現ベクター 本発明の発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位
、翻訳開始シグナル、及び任意に、レプレッサー遺伝子又は種々のアクチベータ
ー遺伝子をコードする調節配列を含む。
【００１９】 本発明のα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクター
は、組換えＤＮＡの方法に都合よく適用することができるベクターのいずれかで
あることができ、そしてベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞にしばしば
依存するであろう。従って、前記ベクターは自律複製ベクター、すなわち染色体
外の存在物として存在するベクターであることができ、染色体複製から独立的で
ある複製をするもの、例えばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外の因
子、ミニクロモソームあるいは人工的な染色体である。あるいは、前記ベクター
は、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞のゲノムに組込まれ、そして組込まれ
た染色体と一緒に複製されるものであることができる。
【００２０】 前記ベクターにおいて、本ＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に作用可能に
連結する。前記プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ
配列のいずれかであることができ、そして宿主細胞に対して相同性か又は非相同
性かのどちらかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。
特に細菌の宿主における、本発明のα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の転
写を方向づけるのに適当なプロモーターの例は、Ｅ．コリのｌａｃオペロンのプ
ロモーター、ストレプトマイセス・コエリコロー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バチルス・
リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子（ａ
ｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプ
ロモーター、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ａｍｙｌｏｌｉｇｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・ズブチ
リス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどで
ある。菌類の宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａ．オリ
ザエ（ｏｒｙｚａｅ）のタカアミラーゼ、リゾムコール・ミエーイ（Ｒｈｉｚｏ
ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーの中
性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ニガーのグルコア
ミラーゼ、リゾムコール・ミエーイのリパーゼ、Ａ．オリザエのアルカリ性プロ
テアーゼ、Ａ．オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニジュランス
（ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するもので
ある。
【００２１】 本発明の発現ベクターはまた、適当な転写ターミネーター及び、真核生物にお
ける、本発明のα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結したポ
リアデニル化配列を含んで成ることができる。ターミネーター及びポリアデニル
化配列は、前記プロモーターと同一の供給源に適当に由来することができる。 更に、前記ベクターは、問題の宿主細胞において前記ベクターが複製すること
を可能にするＤＮＡ配列を含んで成ることができる。その様な配列の例は、プラ
スミドｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１
及びｐＩＪ７０２の複製起点である。
【００２２】 前記ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞の欠損を補完する生成物
の遺伝子、例えばＢ．ズブチリス又はＢ．リチェニホルミス由来のｄａｌ遺伝子
、あるいは抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニ
コール又はテトラサイクリン耐性を与えるものを含んで成ることができる。更に
、前記ベクターはアスペルギルス選択マーカー、例えばａｍｄＳ，ａｒｇＢ，ｎ
ｉａＤ及びｓＣ、ハイグロマイシン耐性を引き起こすマーカーを含んで成ること
ができ、あるいは前記選択を共同形質転換によって、例えば国際公開第９１／１
７２４３号に記載の様に達成することができる。
【００２３】 細胞内発現はいくつかの点、例えば宿主細胞としてある細菌を使用するとき、
において有利であることができるが、細胞外での発現が一般に好ましい。 α−アミラーゼをコードし、そしてプロモーター、ターミネーター及び他の因
子をそれぞれ含む本発明のベクターの構築のために適当な方法は、当業者に公知
である〔例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）を参照〕。 宿主細胞 上文で定義した本発明のＤＮＡコンストラクト又は発現ベクターのいずれかを
含んで成る、本発明の細胞は、本発明のα−アミラーゼの組換え体生成において
宿主細胞として有利に使用される。宿主細胞のクロモソームにおける、（１又は
複数のコピーにおける）前記ＤＮＡコンストラクトが都合よく組込まれることに
よって、前記細胞を前記アミラーゼをコードする本発明のＤＮＡコンストラクト
で形質転換することができる。この組込みは、宿主細胞内で安定に維持されやす
いＤＮＡ配列ほど有利であると一般に考えられている。宿主のクロモソームへの
ＤＮＡコンストラクトの組込みは、従来の方法に従い、例えば相同性又は非相同
性組換えによって行うことができる。あるいは、異なる型の宿主細胞に関連する
、上述の発現ベクターによって、前記細胞は形質転換することができる。
【００２４】 本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳類又は昆虫の細胞であることができる
が、好ましくは微生物細胞、例えば細菌類又は菌類（酵母を含む）の細胞である
。 培養において、本発明の酵素を製造することができる微生物の宿主細胞の例は
、グラム陽性細菌、例えばバチルスの菌株、例えばＢ．ズブチリス、Ｂ．リチェ
ニホルミス、Ｂ．レンタス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．クラウシイ（ｃｌａｕｓｉｉ
）、Ｂ．ブレビス（ｂｕｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモファラス、Ｂ．アル
カロフィラス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス、
Ｂ．コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（ｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒ
ｉｕｍ）又はＢ．サーリンジエンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の菌株、
あるいはストレプトマイセスの菌株、例えばＳ．リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ
）又はＳ．ムリヌス（ｍｕｒｉｎｕｓ）、あるいはグラム陰性細菌、例えばエス
ケリッチャ・コリである。前記細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エ
レクトロポレーション、接合によってか、又は本質的に知られている方法（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａを参照のこと）におけるコンピテント
細胞を用いることによって果たすことができる。
【００２５】 酵母生物はサッカロミセス又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）から都合よく選択することができる。糸状菌はアスペルギルスの種に
都合よく属することができ、例えばアスペルギルス・オリザエ又はアスペルギル
ス・ニガーである。菌類細胞を、プロトプラストの形成を含む方法によって形質
転換することができ、プロトプラストの形質転換に、本質的に知られている方法
において前記の細胞壁の再生が続く。アスペルギルスの宿主細胞の形質転換のた
めの適当な方法は、欧州特許第２３８０２３号に記載されている。 工業的適用 アルカリ性のpH値でのそれらの活性のおかげで、本発明のアミラーゼは様々な
工業的方法における使用に非常に適しており、特に本酵素は洗剤における成分、
例えば洗濯の及び固い表面を洗浄する洗剤組成物としての潜在的適用を見出すが
、それはまた澱粉からの甘味料及びエタノールの製造において有用であることが
できる。従って、それは従来の澱粉の変換方法において使用することができ、例
えば米国特許第３，９１２，５９０号並びに欧州特許公開第２５２，７３０号及
び第６３，９０９号に記載の液化及び糖化方法である。
【００２６】 本発明のアルカリ性α−アミラーゼはまた、リグノセルロース性材料の製造に
おいて使用することができ、例えば澱粉補強した古紙及びボール紙からのパルプ
、紙及びボール紙の製造であり、ここで特に再パルプ化はpH７以上で起こり、そ
してアミラーゼは補強澱粉の減成を通して、廃棄材料の分解を促進することがで
きる。本発明のα−アミラーゼは澱粉をコートした印刷用紙から、製紙パルプを
製造するための方法において特に有用である。前記の方法は国際公開第９５／１
４８０７号に記載の様に行うことができ、これは以下の段階： ａ）パルプを製造するための、前記の紙の分解、 ｂ）ａ）段階の前、間又は後の、澱粉減成酵素による処理、及び ｃ）ａ）及びｂ）段階の後の、前記パルプからのインク粒子の分離、 を含んで成る。
【００２７】 本発明のα−アミラーゼはまた、澱粉の修飾において非常に有用であることが
でき、ここで酵素的に修飾された酵素はアルカリ性フィルター、例えば炭酸カル
シウム、白土及び粘土と一緒に、製紙において使用される。本発明のアルカリ性
α−アミラーゼにより、充填剤の存在下での澱粉の修飾が可能になり、その結果
、より単純な統合の方法が見込まれる。
【００２８】 本発明のα−アミラーゼはまた、織物のデサイジングにおいて非常に有用であ
ることができる。織物製造工業において、α−アミラーゼは澱粉を含む糊の除去
を促進するための、デサイジング段階における補助剤として伝統的に使用され、
これは編み込みの間の、横編み糸上の保護的な被覆剤として役立ってきた。編み
込み後の糊被覆剤の完全な除去は、前記の織物が洗い流され、漂白され、そして
染色される、続く段階において最適な結果を確実にするために重要である。酵素
的な澱粉の分解が好まれるのは、それが繊維材料に対する有害な効果を全く伴わ
ないからである。製造費を減少させ、そして製造処理量を増大するために、デサ
イジング処理は時に、洗い流し及び漂白段階と組合わせられる。その様な場合、
非酵素的補助剤、例えばアルカリ又は酸化剤が、典型的に澱粉を分解するために
使用されるのは、伝統的なα−アミラーゼが高いpHレベル及び漂白剤と、全く両
立できないからである。幾分攻撃的な化学薬品が使用されるので、澱粉糊の非酵
素的分解はいくつかの繊維的損傷を引き起こす。従って、本発明のα−アミラー
ゼを使用することは、それらがアルカリ性溶液中で向上した性能を有するので、
望ましいであろう。前記α−アミラーゼは単独、あるいはセルロースを含む繊維
又は織物をデサイジングするときに組合わせにおいて使用することができる。
【００２９】 本発明のα−アミラーゼはまた、ビールの製造方法において非常に有用である
ことができ；本α−アミラーゼはマッシュ処理の間に、典型的に加えられるだろ
う。 洗剤組成物 本発明に従い、本α−アミラーゼは、典型的に洗剤組成物、例えば洗濯用洗剤
組成物の成分であることができる。
【００３０】 それ自体、それは洗剤組成物中に、非粉化顆粒、安定化液体、又は保護された
酵素の形態で含まれることができる。非粉化顆粒を、例えば米国特許第４，１０
６，９９１号及び第４，６６１，４５２号（共にNovo Industri A/S)に記載され
ている様に製造することができ、そして当業界で知られている方法によって任意
にコートすることができる。ロウ性コーティング材料の例は、１０００〜２００
００の平均分子量を有するポリエチレンオキシド生成物（ポリエチレングリコー
ル、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有する、エトキシル化した
ノニルフェノール；エトキシル化した脂肪酸アルコール（ここで前記アルコール
は１２〜２０の炭素原子を含み、そして１５〜８０のエチレンオキシド単位が存
在する）；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。
流動床技術による適当な模形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５
９１号において与えられている。液体酵素調製物は、例えば確立された方法に従
い、多価アルコール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸
又はホウ酸を加えることによって安定することができる。他の酵素安定化剤は当
業界で公知である。保護された酵素を、欧州特許第２３８，２１６号に開示され
た方法に従い調製することができる。
【００３１】 本発明のアルファアミラーゼの特性は、アルカリ性洗剤、例えばpH９．５〜１
０．５における使用、及び低温、例えば２０〜４０℃での洗浄に特に適当である
。 本発明の洗剤組成物は都合の良い形態、例えば粉末、顆粒、ペースト又は液体
として存在することができる。液体洗剤は最大７０％の水及び０〜３０％の有機
性溶媒を典型的に含む、水性であるか、又は非水性であることができる。
【００３２】 前記洗剤組成物は、陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、又は両性（双性）
のいずれかであることができる、１又は複数の界面活性剤を含んで成る。前記洗
剤は通常直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルファオレフィン
スルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（脂肪酸アルコール硫酸塩）（ＡＳ）
、アルコールエトキシ硫酸塩（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、第２級アルカンスルホン
酸塩（ＳＡＳ）、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニ
ルコハク酸、又はセッケンを含むであろう。それはまた０〜４０％の非イオン性
界面活性剤、例えばアルコールエトキシラート（ＡＥＯ又はＡＥ）、アルコール
プロポキシラート、カルボキシル化したアルコールエトキシラート、ノニルフェ
ノールエトキシラート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキ
シド、エトキシル化した脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールア
ミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２／０
６１５４号に記載されている）を含むことができる。
【００３３】 前記洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプルラナーゼ、エステラー
ゼ、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、若
しくはオキシダーゼ、例えばラッカーゼを更に含んで成ることができる。 通常、前記洗剤は洗浄性ビルダー又は錯化剤、例えばゼオライト、二リン酸塩
、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、
アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えばHo
echst 社のＳＫＳ−６）を含む。
【００３４】 前記洗浄性ビルダーは、リンを含む及びリンを含まない型に再分することがで
きる。リンを含む無機性アルカリ性洗浄性ビルダーの例は、水溶性塩、特にアル
カリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩、ポリリン酸及びホスホン酸を含む。リ
ンを含まない無機性ビルダーの例は、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸塩及び
ケイ酸塩並びに層状二ケイ酸及び様々な型の水溶性クリスタリン又は不定形アル
ミノケイ酸塩を含み、ここでゼオライトのものが最も知られている代表的なもの
である。
【００３５】 適当な有機性ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウム又はコハク酸の置
換アンモニウム塩、脂肪酸マロン酸塩、脂肪酸硫酸塩、カルボキシメトキシコハ
ク酸塩、ポリ酢酸塩、炭酸塩、ポリ炭酸塩、ポリ炭酸塩、アミノポリ炭酸塩及び
ポリアセチル炭酸塩を含む。前記洗剤はまた、何も含まないことができ、すなわ
ち本質的に洗浄性ビルダーの無い状態である。
【００３６】 前記洗剤は１又は複数の重合体を含んで成ることができる。例は、カルボキシ
メチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラー
ト、例えばポリアクリラート、ポリマレアート、マレイン酸／アクリル酸共重合
体、及びラウリルメタクリラート／アクリル酸共重合体である。
【００３７】 前記洗剤組成物は塩素／臭素型又は酸素型の漂白剤を含むことができる。前記
漂白剤を、コートするか又はカプセルに包むことができる。 無機性塩素／臭素型漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム若しくはカルシウム
次亜塩素酸塩又は次亜臭素酸塩並びに塩素化三ナトリウムリン酸塩である。有機
性塩素／臭素型漂白剤の例は、ヘテロ環式Ｎ−ブロモ及びＮ−クロロイミド、例
えばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシア
ヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、並びに水溶性陽イオン、例えばカリウム及
びナトリウムとのそれらの塩である。ヒダントイン化合物もまた適している。前
記漂白系はまた、例えばアミド、イミド、又はスルホン型の過酸化物を含んで成
ることができる。
【００３８】 前記の酸素型漂白剤は、好ましくは漂白活性化剤と一緒の無機性過酸塩、又は
過酸化合物であることができる。無機性過酸塩の例はアルカリ金属過ホウ酸塩、
四水和物及び一水和物両方、アルカリ金属過炭酸塩、過ケイ酸塩及び過リン酸塩
である。前記活性化剤はテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナ
ノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）であることができる。
【００３９】 本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤を用いて安定化することができ
、例えばプロピレングリコール若しくはグリセロールなどの多価アルコール、糖
又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルなどのホウ
酸誘導体であり、そして前記組成物を例えば国際公開第９２／１９７０９号及び
国際公開第９２／１９７０８号に記載されている様に調製することができる。本
発明の酵素はまた、例えば欧州特許第０５４４７７７Ｂ１号に記載のタンパク質
型の、可逆酵素阻害剤を加えることによって安定化することができる。
【００４０】 前記洗剤はまた、他の従来の洗剤成分、例えば粘土を含む繊維調節剤、解膠性
材料、泡増幅剤、泡抑制剤、石けん水抑制剤、防食剤、汚れの懸濁剤、抗−汚れ
再沈着剤、染料、脱水剤、殺菌剤、光増白剤、又は香料などを含むことができる
。 pH（使用濃度の水溶液において測定）は通常中性又はアルカリ性、例えば７〜
１１の範囲内だろう。
【００４１】 更に具体的に、本発明のアルファアミラーゼを、国際公開第９６／２３８７３
号に記載の洗剤調製物のいずれかの中に組込むことができる。 本発明のα−アミラーゼを、洗剤において従来使用される濃度で混合すること
ができる。本発明の洗剤組成物において、本α−アミラーゼを洗浄液のリットル
当たり、０．００００１〜１mg（純粋酵素タンパク質として計算）に相当する量
で加えることを現在考えている。
【００４２】 本発明は更に以下の例において例示され、これは請求した本発明の範囲を限定
する、あらゆる方法を意図するものではない。 例宿主細胞： Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjφholm,
C. (1990) Journal of Bacteriology, Vol.172, No.8, p.4315〜4321に記載され
ているエスケリッチャ・コリ ＳＪ２。プラスミド： ジーンバンクベクターは引用によって本明細書に組込まれる国際公開第９４／
１９４５４号に、更に開示されるｐＳＪ１６７８であった。
【００４３】 前記のジーンバンクベクターｐＳＪ１６７８は引用によって本明細書に組込ま
れる国際公開第９４／１９４５４号において、更に開示される。モデル洗剤： Ａ／Ｐ（アジア／太平洋）モデル洗剤は以下の組成を有する：２０％ＳＴＰＰ
（トリポリリン酸ナトリウム）、２５％Ｎａ2 ＳＯ4 、１５％Ｎａ2 ＣＯ3 、２
０％ＬＡＳ（直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎａｎｓａ ８０Ｓ）、５
％Ｃ12−Ｃ15アルコールエトキシラート（Ｄｏｂａｎｏｌ ２５−７）、５％Ｎ
ａ2 Ｓｉ2 Ｏ5 、０．３％ＮａＣｌ。 例１ Ｅ．コリへのアルファアミラーゼのクローニング Pitcher, D. G., Saunders, N. A., and Owen, R. J. (1989) Lett. Appl. Mi
crobiol. 8, 151-156 の方法によって、ＤＮＡをバチルス・スペーシスＮＣＩＭ
Ｂ４０９１６から単離した。染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に
分解した。図４に示した様に、前記フラグメントはクローニングベクターｐＳＪ
１６７８のＢａｍＨ１部位にクローン化され、そしてエスケリッチャ・コリＳＪ
２に形質転換を起こし、それによってバチルス・スペーシスＮＣＩＭＢ４０９１
６の遺伝子ライブラリーを作製した。
【００４４】 この遺伝子ライブラリーはアルファアミラーゼ活性をスクリーニングされ、そ
してアルファアミラーゼ活性を示す菌株をＪＡ３８８と命名した。寄託され、そ
して受託番号ＤＳＭ１２６６２を与えられ、そして本アルファアミラーゼをコー
ドするｐＪＡ３８８と命名したプラスミドを宿しているこのエスケリッチャ・コ
リ菌株ＪＡ３８８は、ＤＮＡの配列決定のために使用された。 例２ ＤＮＡ及びアルファアミラーゼの配列決定 プラスミドｐＪＡ３８８においてクローン化されたアルファアミラーゼ遺伝子
は、プライマーウォーキングによるＤＮＡシークエンスによって特徴づけられ、
これは、Ｔａｑデオキシ末端サイクルシークエンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）、蛍光標識したターミネーター及びプライマーとして適当
なオリゴヌクレオチドを用いた。
【００４５】 シークエンスデータの解析は、Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res.
12, 387 〜395 に従い行われた。本配列は、配列番号１に示すＤＮＡ配列に相当
する。シグナルペプチドを含む本アルファアミラーゼ及び本成熟アルファアミラ
ーゼの予想されるタンパク質配列を、配列番号２において表わす。導き出したＮ
末端配列を、本タンパク質のＮ末端における３４アミノ酸をシークエンスするこ
とによって証明した。 例３ アルファアミラーゼの製造 プラスミドｐＪＡ３８８を宿すＥ．コリＪＡ３８８を１０μｇ／mlのクロラム
フェニコールを含むＬＢ培養液中、３７℃、２５０rpm で一晩培養した。細胞を
６０００rpm での１５分間の遠心によって、２．７Ｌの培養液から採収した。細
胞内に存在するアミラーゼを、以下の低浸透圧ショク法を用いて前記細胞から放
出させた： １）細胞を５００mlの１０mMトリス塩酸、pH７．０（ＥＫＶ−緩衝液）中で再
懸濁し、そして洗浄し、続いて遠心した。
【００４６】 ２）細胞を７５mlの２０％スクロース、３０mMのpH８トリス塩酸、１mM ＥＤ
ＴＡ中で再懸濁し、そしてリゾチームを５mg／mlの濃度になるまで加えた。 ３）前記溶液を氷上で１５分間インキュベートし、続いて遠心した。大部分の
本アミラーゼは、そのとき上清に含まれていた。 前記上清を高濃度のスクロースを減少させるために、ＥＫＶ緩衝液１０Ｌに対
して一晩透析し、１回緩衝液を交換した。前記溶液を、０．４５μｍの真空濾過
膜を通して濾過した。
【００４７】 前記酵素溶液をあらかじめpH７のＥＫＶ緩衝液で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉ
ａ ＱセファロースカラムＦＦにかけ、前記カラムをＥＫＶ緩衝液で洗浄した。
結合したタンパク質を、１０カラム容量以上の、０〜５００mMの直線ＮａＣｌ勾
配で溶出した。アミラーゼを含む画分を集め、そしてＥＫＶ緩衝液に対して一晩
透析した。
【００４８】 次に、前記溶液をあらかじめpH８のＥＫＶ緩衝液で平衡化したＱセファロース
カラムＦＦにかけ、前記カラムをＥＫＶ緩衝液で洗浄し、そして前記アミラーゼ
を１０カラム容量以上の、０〜５００mMの直線ＮａＣｌ勾配で溶出した。アミラ
ーゼを含む画分を集めた。 １Ｍの硫酸アンモニウムを含む、pH８のＥＫＶ緩衝液であらかじめ平衡化した
フェニルセファロースカラムに、硫酸アンモニウムを１Ｍの濃度になるまで加え
た前記の酵素溶液を載せた。結合しない材料を硫酸アンモニウム緩衝液で洗浄し
、そして前記カラムを２０カラム容量以上の、１〜０Ｍの硫酸アンモニウムの、
直線ＮａＣｌ勾配で溶出した。アミラーゼを含む画分を集めた。
【００４９】 精製したアミラーゼを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、そしてクーマシー
ブルーで染色後、１つのバンドのみが得られた。 例４ 洗浄試験 洗浄性能を、本発明のアルファアミラーゼを有する洗剤溶液中、２５℃で１５
分間汚れた試験布を洗浄することによって評価した。
【００５０】 使用した洗剤はpH１０．５を有する、上述した３ｇ／ＬのＡ／Ｐモデル洗剤、
又はpH９．７のpHを有する３ｇ／Ｌのマレーシアの商業用洗剤（Ｃｏｌｇａｔｅ
のＦＡＢ ｔｏｔａｌ）であった。例３の精製したアミラーゼを以下に示した濃
度で洗剤溶液に加えた。前記の試験布をオレンジ色の米の澱粉で汚れをつけた（
オランダのCFT, Centerfor Test Materialから入手可能なＣＳ−２８布）。
【００５１】 洗浄後、前記の布を４６０nmにおける減少を測定することによって評価した。
前記の結果を、ΔＲが本アルファアミラーゼで洗浄した布の減少から、本アルフ
ァアミラーゼ無しの、前記の同一の条件で洗浄した布の減少を引いたものである
として表わした。
【００５２】
【表１】
【００５３】 前記の結果を図５及び６に示す。高度にアルカリ性のpHで、両方の洗剤中、本
発明のアルファアミラーゼが効果的であることを前記結果は示している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、２つの従来技術のアミラーゼ（ＳＰ７２２及びターマミル）と比較さ
れる、ＮＣＩＭＢ４０９１６由来のアミラーゼのpH活性プロファイルを示す。
【図２】 図２は、ＮＣＩＭＢ４０９１６由来のアミラーゼの温度活性プロファイルを示
す。
【図３】 図３は、様々な温度でインキュベーションした後の、ＮＣＩＭＢ４０９１６由
来のアミラーゼの安定性を示す。
【図４】 図４は、例１に記載のクローニングベクターｐＳＪ１６７８を示す。
【図５】 図５は、例４に記載の洗浄試験の結果を示す。
【図６】 図６は、例４に記載の洗浄試験の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヘデガード，リスベート デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 アンデルセン，イエンス トエンネ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA13 CA03 DA05 DA06 DA07 EA04 GA11 GA19 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 CC04 DD02 FF05E FF12E LL04 4B065 AA15Y AA26X AB01 AC14 AC16 BA02 CA32 CA57 4H003 AB19 AC08 DA01 EA09 EA12 EA15 EA16 EA19 EC01 FA28 FA47

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルファアミラーゼが： ａ）バチルス・スペーシスＮＣＩＭＢ４０９１６によって産生されるポリペプ
    チドであり、あるいは ｂ）配列番号２の３２〜５３２位において示した様なアミノ酸配列を有するポ
    リペプチドであり、あるいは ｃ）エスケリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１２
    ６６２において存在するプラスミド内にクローン化されるＤＮＡ配列の前記アル
    ファアミラーゼをコードする部分によってコードされるポリペプチドであり、あ
    るいは ｄ）ｉ）前記ポリペプチドと少なくとも６０％の相同性があり、又は ii) １若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入による前
    記ポリペプチド由来であり、 （ａ）又は（ｂ）において定義したポリペプチドの類似体である、 アルファアミラーゼ。
  2. 【請求項２】 ３７℃で測定するとき、pH７．３での活性よりも少なくとも
    ２倍高い、pH１０．５での活性を有するアルファアミラーゼ。
  3. 【請求項３】 ３７℃で測定するとき、pH７．３での活性よりも少なくとも
    ４倍高い、pH９．５での活性を有するアルファアミラーゼ。
  4. 【請求項４】 ３７℃で測定するとき、約９．５の至適pHを有するアルファ
    アミラーゼ。
  5. 【請求項５】 バチルスの菌株、好ましくはバチルス・スペーシスＮＣＩＭ
    Ｂ４０９１６由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルファアミラ
    ーゼ。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルファアミラーゼで
    あり、pH１０．５及び６度のドイツ硬度で２０％ＳＴＰＰ、２５％Ｎａ2 ＳＯ4 、１５％Ｎａ2 ＣＯ3 、２０％ＬＡＳ、５％Ｃ１２−Ｃ１５アルコールエトキシ
    ラート、５％Ｎａ2 Ｓｉ2 Ｏ5 、０．３％ＮａＣｌを含む、３ｇ／ｌの試験洗剤
    溶液における２５℃での２０分のインキュベーションの後、９０％以上のその活
    性を保持するアルファアミラーゼであり、前記の同一の溶液における、３０℃で
    の２０分のインキュベーションの後、９０％より低いその活性を保持するアルフ
    ァアミラーゼ。
  7. 【請求項７】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるとき、約５５kDa の分子
    量を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載のアルファアミラーゼ。
  8. 【請求項８】 等電点電気泳動によって決定されるとき、約５の等電点を有
    する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアルファアミラーゼ。
  9. 【請求項９】 非粉化顆粒又は安定化処理した液体である洗剤添加物の形態
    の、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルファアミラーゼ。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載のアルファアミラーゼ
    をコードする、単離したＤＮＡ配列。
  11. 【請求項１１】 アルファアミラーゼをコードする単離したＤＮＡ配列であ
    り、 ａ）配列番号１の９４〜１５９６位に示したＤＮＡ配列、あるいは ｂ）ｉ）前記ＤＮＡ配列と少なくとも６０％の相同性である、又は ii) 少なくとも５５℃で前記ＤＮＡ配列とハイブリダイズする、 ａ）において定義したＤＮＡ配列の類似体、 を含んで成る単離したＤＮＡ配列。
  12. 【請求項１２】 細菌由来、好ましくはバチルス由来、最も好ましくは前記
    菌株ＮＣＩＭＢ４０９１６由来である、請求項１０又は１１に記載のＤＮＡ配列
    。
  13. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含
    んで成る組換え発現ベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列又は
    請求項１３に記載の組換え発現ベクターによって形質転換した細胞。
  15. 【請求項１５】 前記ＤＮＡ配列が生じる原核細胞、特に細菌細胞又は内因
    性細胞である、請求項１４に記載の細胞。
  16. 【請求項１６】 バチルス又はエスケリッチャ、好ましくはＥ．コリ（ｃｏ
    ｌｉ）に属する細胞である、請求項１５に記載の細胞。
  17. 【請求項１７】 アルファアミラーゼの製造方法であり、前記アルファアミ
    ラーゼの製造を可能にする条件下で、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の
    細胞を培養すること、及び前記の培養液から前記アルファアミラーゼを回収する
    ことを含んで成る方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のアルファアミラーゼを製造する方法で
    あり、適当な栄養培地中でバチルスのアミラーゼ産生菌株を培養すること、及び
    前記培養培地から前記アルファアミラーゼを回収することを含んで成る方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜９のいずれか１項に記載のアルファアミラーゼ
    及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
  20. 【請求項２０】 水溶液中で８．５〜１１のpH、好ましくは９〜１０．５の
    pHを有する、請求項１９に記載の洗剤組成物。
  21. 【請求項２１】 洗濯用洗剤である、請求項１９又は２０に記載の洗剤組成
    物。
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WO (1) WO1999042567A1 (ja)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6686200A (en) * 1999-08-20 2001-03-19 Novozymes A/S Alkaline bacillus amylase
US7498158B2 (en) 2001-05-15 2009-03-03 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
CN100497593C (zh) * 2005-10-19 2009-06-10 新疆农业科学院微生物应用研究所 一种低温淀粉酶菌株、低温淀粉酶及其生产方法
DK3421595T3 (da) 2011-06-30 2020-10-26 Novozymes As Alfa-amylasevarianter
WO2014194117A2 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
CN105492603B (zh) 2013-05-29 2022-06-03 丹尼斯科美国公司 新型金属蛋白酶
WO2014194032A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
EP3260538B1 (en) 2013-05-29 2021-04-14 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
ES2723948T3 (es) 2013-12-13 2019-09-04 Danisco Us Inc Serina proteasas procedentes de especies de Bacillus
EP3553173B1 (en) 2013-12-13 2021-05-19 Danisco US Inc. Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade
WO2015095046A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Use of poly alpha-1,3-glucan ethers as viscosity modifiers
CA2932501C (en) 2013-12-18 2022-04-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Cationic poly alpha-1,3-glucan ethers
CN105992796A (zh) 2014-02-14 2016-10-05 纳幕尔杜邦公司 用于粘度调节的聚-α-1,3-1,6-葡聚糖
CN106132997A (zh) 2014-03-11 2016-11-16 纳幕尔杜邦公司 作为洗涤剂助洗剂的氧化的聚α‑1，3‑葡聚糖
EP4155398A1 (en) 2014-03-21 2023-03-29 Danisco US Inc. Serine proteases of bacillus species
EP3158043B1 (en) 2014-06-19 2021-03-10 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
US9714403B2 (en) 2014-06-19 2017-07-25 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
DK3207129T3 (da) 2014-10-17 2020-02-24 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus-arten
EP3212662B1 (en) 2014-10-27 2020-04-08 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212783A1 (en) 2014-10-27 2017-09-06 Danisco US Inc. Serine proteases
CN107148472A (zh) 2014-10-27 2017-09-08 丹尼斯科美国公司 芽孢杆菌属物种的丝氨酸蛋白酶
EP3212782B1 (en) 2014-10-27 2019-04-17 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212781B1 (en) 2014-10-27 2019-09-18 Danisco US Inc. Serine proteases
AU2015369967B2 (en) 2014-12-23 2019-06-27 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Enzymatically produced cellulose
US20180112204A1 (en) 2015-05-13 2018-04-26 Danisco Us Inc. AprL-CLADE PROTEASE VARIANTS AND USES THEREOF
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
WO2016201044A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Osmotic burst encapsulates
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
EP4234693A3 (en) 2015-06-17 2023-11-01 Danisco US Inc Bacillus gibsonii-clade serine proteases
WO2017079756A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Danisco Us Inc Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
EP3371308B1 (en) 2015-11-05 2022-05-11 Danisco US Inc. Paenibacillus sp. mannanases
EP3374400B1 (en) 2015-11-13 2022-04-13 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
EP3374488B1 (en) 2015-11-13 2020-10-14 DuPont Industrial Biosciences USA, LLC Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
WO2017083229A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
BR112018011755A2 (pt) 2015-12-09 2018-12-04 Danisco Us Inc variantes combinatórias de alfa-amilase
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
US20190194636A1 (en) 2016-05-03 2019-06-27 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
EP3845642B1 (en) 2016-05-05 2023-08-09 Danisco US Inc. Protease variants and uses thereof
MX2018014768A (es) 2016-05-31 2019-03-06 Danisco Us Inc Variantes de proteasa y sus usos.
EP4151726A1 (en) 2016-06-17 2023-03-22 Danisco US Inc Protease variants and uses thereof
EP3535365A2 (en) 2016-11-07 2019-09-11 Danisco US Inc. Laundry detergent composition
CN110312795A (zh) 2016-12-21 2019-10-08 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
WO2018118950A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
WO2018169750A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Danisco Us Inc Trypsin-like serine proteases and uses thereof
CN110662836B (zh) 2017-03-31 2024-04-12 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶组合变体
WO2018183662A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Danisco Us Inc Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN110809624A (zh) 2017-06-30 2020-02-18 丹尼斯科美国公司 低团聚的含酶颗粒
MX2020001606A (es) 2017-08-18 2020-08-03 Danisco Us Inc Variantes de alfa-amilasa.
US20200354708A1 (en) 2017-11-29 2020-11-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants having improved stability
EP3728543A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 Danisco US Inc. Enzyme-containing, hot-melt granules comprising a thermotolerant desiccant
CN111867388A (zh) 2018-02-08 2020-10-30 丹尼斯科美国公司 用于酶包封的耐热蜡基质颗粒
WO2019245704A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
US20210363470A1 (en) 2018-06-19 2021-11-25 Danisco Us Inc Subtilisin variants
MX2021001213A (es) 2018-07-31 2021-08-24 Danisco Us Inc Variantes de alfa-amilasas que tienen sustituciones de aminoácidos que bajan el pka del ácido general.
WO2020047215A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Danisco Us Inc Enzyme-containing granules
WO2020068486A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Danisco Us Inc Compositions for medical instrument cleaning
CA3116128A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Danisco Us Inc Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants
US20230028935A1 (en) 2018-11-28 2023-01-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants having improved stability
US20220220419A1 (en) 2019-05-24 2022-07-14 Danisco Us Inc Subtilisin variants and methods of use
EP3980517A1 (en) 2019-06-06 2022-04-13 Danisco US Inc. Methods and compositions for cleaning
US20220403359A1 (en) 2019-10-24 2022-12-22 Danisco Us Inc Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2022047149A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2022165107A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Danisco Us Inc Compositions for cleaning and methods related thereto
CN117083370A (zh) 2021-03-26 2023-11-17 诺维信公司 聚合物含量降低的洗涤剂组合物
WO2023278297A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Danisco Us Inc Variant lipases and uses thereof
WO2023034486A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Danisco Us Inc. Laundry compositions for cleaning
WO2023039270A2 (en) 2021-09-13 2023-03-16 Danisco Us Inc. Bioactive-containing granules
WO2023114932A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114988A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2023114939A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114936A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP9903559A3 (en) * 1996-08-01 2000-08-28 Procter & Gamble Detergent compositions comprising improved amylase for dingy fabric clean-up

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Publication number Publication date
WO1999042567A1 (en) 1999-08-26
KR20010040517A (ko) 2001-05-15
EP1054957A1 (en) 2000-11-29
AU2411699A (en) 1999-09-06
CA2320759A1 (en) 1999-08-26

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