JP2002503480A

JP2002503480A - がんスクリーニングならびに疾病段階および予後の評価のための体液のテロメラーゼ・アッセイ

Info

Publication number: JP2002503480A
Application number: JP2000531587A
Authority: JP
Inventors: ストロベル，ジエフリー・ダブリユー; スタンバーグ，ジユデイス; ハイスミス，エドワード; アブラツゾ，リン・ブイ
Original assignee: ユニバーシティオブメリーランド，ボルチモア
Priority date: 1998-02-16
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2002-02-05
Also published as: WO1999041406A1; AU2682299A; EP1071808A1; CA2321259A1

Abstract

(57)【要約】組織および細胞抽出物における上昇したテロメラーゼ活性レベルが、組織サンプルにおけるがんの存在を決定するために使用されてきた。ここに本発明は、がんの存在を検出し、ならびに患者の疾病段階および予後を評価する両目的のために、容易に得られる体液、例えば血液、血漿、リンパ液、胸膜液、脊髄液、唾液、喀痰、尿および精液を用いて、テロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性レベルを定量するための改良されたテロメア反復配列増幅法（ＴＲＡＰ）アッセイに対向される。改良されたＴＲＡＰアッセイは、悪性腫瘍の診断マーカーとして、ならびにがん療法の進捗および有効性をモニターする手段として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明の開発は、マリーランド大学、ボルチモア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏ
ｆＭａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）によって支援された。

【０００２】発明の分野本発明は、最小に侵入的な（ｍｉｎｉｍａｌｌｙｉｎｖａｓｉｖｅ）がん検
出および評価の分野にある。本明細書に開示され、そして特許請求されるテロメ
ラーゼ・アッセイは、診断および治療の両実用性を有する。

【０００３】発明の背景１９７２年、ＪａｍｅｓＷａｔｓｏｎは、末端複製問題として今や周知であ
る直鎖状ＤＮＡ分子の末端を完全に複製すべきＤＮＡポリメラーゼの不能を記述
している（図１）。その末端複製問題は、多数回の細胞周期の間に新しく複製さ
れる娘鎖の５’末端における染色体ＤＮＡの進行性縮小を予測している。各複製
サイクルにおけるゲノム配列の喪失は、末端のトランスフェラーゼもしくは「テ
ロメラーゼ」、テロメアＤＮＡ配列の新規合成のための鋳型としてそれ自身のＲ
ＮＡコンポーネントの配列を利用するリボ核タンパク質複合体、を伴う酵素反応
による末端配列の付加によって補償することができる。

【０００４】ほとんどの体細胞は、それらが分裂するにつれ確実にテロメアＤＮＡを喪失し
、そして検出しうるテロメラーゼ活性を保持しなくなる［Ｋｉｍｅｔａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：２０１１−２０１４（１９９４）］。テロメラーゼ
は、染色体ＤＮＡの分解を防ぐので、それは、細胞不死化にとって必須の機能を
有する。発がんについての現在の考え方は、制御不能な細胞増殖が、悪性疾患発
生の一部であり、そして悪性状態に進行する制御不能な細胞集団が、無制限に複
製する能力を獲得することである。明らかに、酵素テロメラーゼは、無限の細胞
増殖に対して絶対に必要なものである。かくして、ほとんど例外なく、テロメラ
ーゼは、悪性細胞において高度に発現し、そしてそれに特異的である。テロメラ
ーゼを普遍的な腫瘍マーカーにさせることが、試験されたすべての腫瘍組織（ｎ
＝２０００）の約９０％において見い出された［Ｓｈａｙｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，１２：１２９−１３１（１９９６）］。

【０００５】大多数のがんによる死は、慣例の療法に抵抗性である転移に起因する。診断、
外科技術および一般的な患者ケアにおける改善にもかかわらず、初期診断がなさ
れる時には、転移が既に発生しているであろうから、多くのがんは、根絶するこ
とができない［Ｆｉｄｌｅｒｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，５０：６
１３０−６１３４（１９９０）］。がんを早期に検出できれば、腫瘍が、より小
さく、より侵略性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）が低く、そして転移した可能性のよ
り低い時に、腫瘍を治療させることによって治癒率を改善できるであろう。疾病
の表示と転移の確立の間の短い時間とは逆に、化学的予防もしくは診断期間は、
１０年以上も溯るかもしれない［Ｋｅｌｌｏｆｆｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，５４：２０１５−２０２４（１９９４）；Ｍｕｌｓｈｉｎｅｅｔ
ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ，５５：２８０Ｓ−２８６Ｓ（１９９４）］。腫瘍成長は、
腫瘍が既知の手段によって検出できる前に、長い間表示する異形成ないしがん腫
から血管形成までの明白な期間を特徴とする（図２）。平均して、腫瘍は、３カ
月毎に細胞数を倍加するであろう［Ｉｓｒａｅｌ，ＪＴｈｅｏｒＢｉｏｌ，１７８：３７５−３８０（１９９６）］。百万個の細胞の腫瘍に相当するほぼ２
０回の倍加において、腫瘍は血管形成を経て、その結果、転移能力を獲得する。
腫瘍塊にとって直径２ｍｍを超えるためには、十分な血液供給（すなわち血管形
成）の獲得が必要とされる［Ｆｏｌｋｍａｎ，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ，１：２７
−３３（１９９５）］。今日の技術では、我々は、ほぼ３０回の倍加に相当する
１０億個の細胞より小さい腫瘍（特定の疾病タイプおよび段階に応じる）を検出
することは、ほとんど不可能である。典型的には、患者は、それよりもかなり大
きい腫瘍量を提示するであろう［Ｍｕｌｓｈｉｎｅｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５：２５−３２（１９９１）］。しかしながら、３０回の倍加でさえも
、腫瘍成長の自然の経過においては非常に遅い。しばしば、転移は既に起きてお
り、そして結局は、患者は疾病により死ぬであろう［Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１３：３３７−３４２（１９９１）］。

【０００６】腫瘍細胞が生活環をもつことは、長い間知られてきた。悪性腫瘍は「不死」で
あるけれども、腫瘍内の細胞は、酸素と栄養素の欠乏によって壊死に至り、次い
で、一定の対数割合において血流中に流出される。血管形成が起きた後も、腫瘍
の外側の細胞は、また、定常的に、血流中に流出され、そしてこの細胞の放出は
、急速に成長する腫瘍において増加する［Ｋｏｈｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，５５：１８５６−１８６１（１９９５）］。理論に拘束されること
を望まないけれども、本発明者らは、血流中に流出する腫瘍細胞の自然の生活環
によって、腫瘍の生活環の２０〜３０倍加くらい早期に、腫瘍細胞の証拠が血行
中に検出できると信じている。そのように、循環する悪性細胞を測定するのに十
分に感度の高い検出方法は、今日使用されるすべての臨床的検出方法よりも良好
であろう。

【０００７】今日まで、血行中の腫瘍マーカーの分析によるがんの正確な、そして早期の検
出は、いくつかの理由：すなわち（ａ）腫瘍マーカーレベルは、既知の方法によ
って血行中に検出されるにはあまりにも低すぎるであろう；（ｂ）腫瘍マーカー
は悪性細胞に特異的ではないので、高い間違ったポジティブ率をもたらすであろ
う；（ｃ）腫瘍マーカーは、試験された腫瘍の、あるパーセントにおいてのみ発
見されるので、高い間違ったネガティブ率をもたらすであろう、という理由によ
り達成されなかった［Ｃａｎｎｅｙｅｔａｌ．，ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，５０：７６５−７６９（１９８４）；Ｂａｔｅｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔＲｅｖ，１２：１６３−２０７（１９８５）；Ｓｃｏｔｔｅｔ
ａｌ．，ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ，１７：１７５−１８３（１９９３）
］。がんの早期診断をもたらすすべての悪性腫瘍に特異的な腫瘍マーカーを定量
的に検出する非侵入的（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）アッセイの開発は、がん検
出の分野において主要な突破口を提供するであろう。

【０００８】多くの研究者が、腫瘍組織におけるテロメラーゼ活性を、種々のがん、例えば
神経芽細胞腫、急性骨髄性白血病、乳がんおよび胃腸がんにおける予後と相関さ
せた［Ｈｉｙａｍａｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ，１：２４９−２５
５（１９９５）；Ｃｏｕｎｔｅｒｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８５：２３１５
−２３２０（１９９５）；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２：７９９−８０３（１９９６）；Ｈｉｙａｍａｅｔａｌ．，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ，８８（１９９６）；Ｔａｈａｒａｅｔ
ａｌ．，ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ，２３：３０７−３１５（１９９５）］。こ
れらの研究のすべては、腫瘍それ自体において実施された。しかしながら、がん
のスクリーニングにおいて有用であるテロメラーゼのような腫瘍マーカーの測定
のためには、いくつかの臨床上の疑問：マーカーは、正常な組織と高い危険性の
ある組織において異なって発現されるか；マーカーは、どの進行段階において出
現するか；臨床的結果と相関があるか；アッセイの許容しうる特異性、感度およ
び精度は何か；そしてアッセイが、進行するであろう侵略性のがんと、進行性で
はないがんとの区別ができるか？という疑問が指摘されねばならない。従来の研
究からのデータは、テロメラーゼ活性は、がんの診断および予後において正当な
マーカーであることが分かっている［Ｈｉｙａｍａら（１９９５）；Ｓｈａｙら
（１９９６）；Ｈｉｙａｍａら（１９９６）；Ｔａｈａｒａら（１９９６）］。

【０００９】現在まで、がんにおけるテロメラーゼ活性を伴うすべての研究は、腫瘍それ自体からの直接サンプルを用いて実施されてきた。例えば、肺がん患者におけるテ
ロメラーゼ活性の検出は、生検もしくは外科的切除の肺腫瘍を検査することによ
って；脳腫瘍患者では、脳腫瘍を検査すること、等々によって実施される。血液
腫瘍（白血病）の場合は、白血細胞のサンプルが検査される。

【００１０】本発明は、根本的に異なり、そして優れている。本発明者らは、がん患者の血液の非細胞部分において、血液以外の器官によって流出される悪性細胞の証拠を
検出することが可能であることを見い出した。例えば、本発明者らは、腫瘍が血
液腫瘍ではない肺がん患者の血液の非細胞部分において、上昇されたテロメラー
ゼ活性レベルを検出した。本発明者らは、新規に構成されたテロメア反復配列（
ｒｅｐｅａｔ）増幅法（もしくはＴＲＡＰ）アッセイを利用する。この改変ＴＲ
ＡＰアッセイを用いれば、本発明者らは、がんの血液試験スクリーニングを開発
できる。

【００１１】がんの診断および予後における臨床上の実用性に加えて、テロメラーゼ発現の
レベルは、がん療法の有効性をモニターするために使用することができる。化学
療法後の血液において、テロメラーゼ活性が、正常なわずかに検出できる範囲内
に復帰できないことは、疾病の持続と断定されるであろう。そのような場合には
、治療は中止されるか、または疾病の限定される範囲への努力に変えられてもよ
い。健康な個体の対照集団に由来するテロメラーゼ活性の基礎値は、療法が成功
したことを示し、そして治療への終点を提供するであろう。容易に得られる体液
を使用してテロメラーゼ活性レベルが測定されて、患者に対するもっとも有効な
治療処方を決定し、そしてがん再発を減じることに役立つことができる。寛解傾
向の患者は、その後の受診では、血液中のテロメラーゼ活性レベルについてモニ
ターすることができる。テロメラーゼ活性の増大は、治療が比較的有効である場
合、より早い再発を示しているであろう。

【００１２】不死化細胞をもたらす遺伝的変化は、細胞の究極の破滅であろう。悪性細胞に
とって無制限に増殖するためには、そのテロメア末端が、ある安定な長さにおい
て維持されねばならない［Ｈａｒｌｅｙ，ＭｕｔａｔＲｅｓ，２５６：２７１
−２６３（１９９１）］。９０％までもの悪性腫瘍において、本来のままの染色
体末端が、テロメラーゼによって維持されている［Ｓｈａｙら（１９９６）］。
本明細書に開示される技術を用いれば、少量の（ｍｉｎｕｓｃｕｌｅ）血液サン
プルが、テロメラーゼレベルに関して分析され、そして肺、肝臓、乳房もしくは
すべての器官の新規もしくは転移腫瘍の存在を明らかにして、直ちにそれを根絶
することができる。この非侵入的試験の感度は、我々のがんについての概念を変
えることができた。限定された治療の選択をもたらす診断になるよりもむしろ、
早期の腫瘍が捕らえられ、そして根絶されるであろう。

【００１３】発明の概要本発明の目的は、がん患者の体液においてテロメラーゼの存在を測定し、そし
てテロメラーゼ活性のレベルを定量する方法を提供することである。

【００１４】本発明のさらなる目的は、診断目的のための腫瘍マーカーとしてテロメラーゼ
およびテロメラーゼ活性測定値を使用することである。本発明のさらなる目的は
、これらのテロメラーゼおよびテロメラーゼ活性測定値を使用して、がん患者の
状態を最小の侵入方式においてモニターし、そして疾病の予後を評価することで
ある。

【００１５】本発明のさらなる目的は、容易に得られる体液を用いて早期のがんを検出する
ため、健康な個体において日常的に使用するがんスクリーニングキットを開発す
ることである。本発明のさらなる目的は、測定されたテロメラーゼおよびテロメ
ラーゼ活性と、腫瘍の大きさおよび疾病の程度および／または段階とを相関させ
ることである。

【００１６】発明の詳細な記述本発明の研究のために、本発明者らは、肺が、非常に濃密な毛細血管床を含有
し、そして毎分、完全な心臓血液搏出量を受けているので、最初の研究では肺が
ん患者を選んだ［Ｗｅｓｔ，ＷｉｌｋｉｎｓａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ（１９８
２）］。したがって、肺腫瘍は、血液中の腫瘍マーカーを検出する可能性を増加
する体の循環系への平易なアクセスを有する。一般に、肺がんは、組織学によっ
て２つの広いサブタイプ：１）小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および２）非小細胞
肺がん（ＮＳＣＬＣ）に分けられる。この分類は、広く受け入れられており、そ
してＳＣＬＣ対ＮＳＣＬＣをもつ患者における治療上のアプローチにおいて大き
な違いがあるために欠かせない［Ｈｉｒｓｃｈｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，６２：９７３−９８０（１９８８）］。本研究では、ＮＳＣＬＣは、（ａ）腺が
ん、（ｂ）鱗細胞がん腫、および（ｃ）大細胞がん腫：を含む小細胞成分以外の
全肺がんを含む。

【００１７】肺がんは、毎年、全がん死の２８％以上に数えられる、世界でもっとも共通の
宿命的悪性腫瘍の１つである［Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ，９３：２７８９−２７９５（１９９３）］。新しい治療戦略
への継続する研究にもかかわらず、すべての肺がん生存率は、過去２０年間改善
せず、５年生存者は約１３％に留まっている［Ｒｉｅｓｅｔａｌ．，ＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ，９４：２６３−２７６（１９９４）］。転移性肺
がんの５年生存者は１．５％以下に留まっているけれども、早期肺がんの完全な
疾病のない生存者がいることは、早期診断の展望を全く有益なものにすることに
勇気づける。腫瘍が比較的小さく、そして結節性併発のない１期肺がんの５年生
存者は、８０％位高いと報告されている［Ｒｉｅｓら、（１９９４）］。しかし
ながら、ほとんどの肺がん死は、明らかに転移性疾病によっている。典型的には
、患者が、初期症状の訴えを示すか、または分離スクリーニングで、唯一非常に
大きい病巣（直径３もしくは４〜７ｃｍの病巣）を示す場合には、現在の診断操
作、例えば胸部放射線写真法によって容易に肉眼でみることができる［Ｍｕｌｓ
ｈｉｎｅら、（１９９４）］。これらの病巣は、通常は、転移性である進行がん
を表している。現時点では、長期生存率を増加するのに十分に早期の肺がん検出
のためのスクリーニング操作は存在しない［Ｒｉｍｅｒｅｔａｌ．，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＨｅａｌｔｈＢｅｈａｖｉｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ，（１
９９７）］。

【００１８】血液サンプルにおいて悪性度を評価する際に、腫瘍マーカー、例えばテロメラ
ーゼが利用されるためには、それが、原発腫瘍によって発現されねばならない。
肺がん腫瘍におけるテロメラーゼ活性に関して３種の研究が公表されている［Ｋ
ｉｍら、（１９９４）；Ｈｉｙａｍａｅｔａｌ．，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ，８７：８９５−９０２（１９９５）；Ｓｈｉｒｏｔａｎｉｅ
ｔａｌ．，ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ，１１：２９−４１（１９９４）］。これ
らの研究からの結果を集めると、テロメラーゼ活性は、ＮＳＣＬＣ腫瘍の７８％
（ｎ＝１２５）およびＳＣＬＣ腫瘍の１００％（ｎ＝１５）において検出された
。もっとも高いテロメラーゼ活性は、ＳＣＬＣにおいて検出され、これは、ポジ
ティブ対照として使用された不死化肺がん細胞系に匹敵するレベルを示した［Ｈ
ｉｙａｍａｅｔａｌ．，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ（１９９５
）］。小細胞肺がんは、急速に拡大した疾病に進行する非常に侵略性の悪性腫瘍
である。発表では、ＳＣＬＣ患者の９０％以上が、進行性および／または転移性
の疾病をもっていた［Ｆｅｌｄｅｔａｌ．，Ｃｈｅｓｔ，１０３：１０１０
−１０１５（１９９６）］。したがって、ＳＣＬＣ腫瘍におけるテロメラーゼの
極端に高いレベルは、進行期のがんにおける高いテロメラーゼ活性との相関関係
があっても驚くべきことではない［Ｓｈａｙら、（１９９６）］。

【００１９】早期に悪性疾患を検出することに加えて、血液中のテロメラーゼ活性の定量的
測定は、予後データを提供できる。肺がんの初期診断の後、腫瘍体積が、臨床上
の期別評価によって評価される。この評価は、組織学的データを確認し、転移が
存在するか否かを示し、そして手術の可能性について患者を評価する。腫瘍が、
比較的局限されていれば−１期もしくは２期−、外科的切除が、一般に推奨され
る。しかしながら、手術後、患者の３５％位多くは、後期にある（ｕｎｄｅｒｓ
ｔａｇｅｄ）ことが分かった［Ｉｈｄｅ，ＣｕｒｒＰｒｏｂＣａｎｃｅｒ，１５：６５−７２（１９９１）］。これらの患者では、腫瘍の外科的除去は、予
後を改善せず、かくして、不必要な侵入的操作である。しかしながら、テロメラ
ーゼ活性レベルの測定は、がんの正確な臨床上の段階決定に役立つデータを提供
できる。腫瘍マーカーレベルは、腫瘍の大きさに強く関連するので、疾病の拡大
が限定される時には、比較的低い［Ｃｒｉｐｐａｅｔａｌ．，ＪＮｕｃｌＢｉｏｌＭｅｄ，３６：５２−５５（１９９２）］。したがって、非常に高
いテロメラーゼ活性レベルは、良好な手術の候補ではない進展した疾病をもつ患
者に相関する。

【００２０】腫瘍が、いかに急速に成長もしくは拡大するかを確認することは、照射か、ま
たは化学療法かいずれか、手術後の処置を決定する際の決定的要素になる。ＮＳ
ＣＬＣでは、腫瘍がＧ０もしくはＧ１期の細胞の低い割合をもっている患者は、
より短い生存時間をもつ［Ｖｏｌｍｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，５６：１３
９６−１４０１（１９８５）］。テロメラーゼは、Ｇ０期には下方制御されるの
で、高いテロメラーゼ活性をもつ腫瘍は、一般に、低い数のＧ０における細胞を
含有するであろう［Ｈｏｌｔｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌ，１６（６）：２９３２−２９３９（１９９６）］。したがって、原発腫瘍
におけるテロメラーゼ活性の測定は、急速に成長する腫瘍を無痛性疾病と区別で
きる。がんの侵略性に基づく特定の療法を開発するために、これらのテロメラー
ゼ測定値を使用することができる。

【００２１】外科的切除縁における潜在性の新生物細胞の検出は、全生存者において有意な
減少をもたらす局部域の再発の強い予言となる［Ｂａｒｔｌｅｔｔｅｔａｌ
．，ＧｅｒｍＣｅｌｌＮｅｏｐｌａｓｍ，５（６）：１２４５−１２６０（
１９９１）］。頭頸部がんでは、例えば、腫瘍は、ｐ５３突然変異に関する分子
的なものにタイプ分けされる。腫瘍は、次に、標準的病理検査によっては発見で
きない残存腫瘍細胞をもつ患者を特定するために、切除縁におけるこれらの同じ
変異体を探される［Ｂｒｅｎｎａｎｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，３３２：４２９−４３５（１９９５）］。これらの患者は、再発について高い
危険性にあり、そして彼らを特定することは、照射のような局所療法の付加を可
能にすると思われる。マーカーとしてテロメラーゼ活性を用いる同じアプローチ
が、肺がんにおける腫瘍切除縁に応用することができる。テロメラーゼ活性は、
わずか０．０１％のテロメラーゼポジティブ細胞からなる組織において検出でき
る［Ｗｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ，５：２
９３−２９７（１９９５）］。他方、現在の組織学的技術は、２％未満の新生物
細胞を含有する切片において転移を検出することはできないであろう［Ｂｒｅｎ
ｎａｎら、（１９９５）］。さらに、同じ患者から採取された一連の血液サンプ
ルにおけるテロメラーゼ活性の定量的測定は、腫瘍切除縁の外側に残存する疾病
の証拠を示すかもしれない。腫瘍切除後、テロメラーゼ活性は、血液中のその理
論的半減期において正常の基礎値まで減少するに違いない。延長された半減期は
、残留もしくは潜在性疾病の存在を指示するであろう［Ｌａｎｇｅｅｔａｌ
．，ＪＵｒｏｌ，１２８：７０８−７１１（１９８２）］。疾病の証拠および
腫瘍マーカーレベルの増加のない乳がん患者において、予備データは、化学療法
の投与が生存率を改善したことを示した［Ｊａｇｅｒ，ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒＰｒｅｖ，２（３）：１３３−１３９（１９９３）］。したがって、腫瘍切
除縁および血液におけるテロメラーゼ活性の測定は、原発腫瘍について根本的外
科手術を検討するための感度の高い手段を提供できる。

【００２２】血液サンプル収集および調製次の変数が、血液サンプル中の測定可能なテロメラーゼ活性に及ぼすそれらの
影響について試験された：１）血液抜き取りチューブの型（ヘパリン処理、ＥＤ
ＴＡ、クエン酸ナトリウムもしくは無添加）、２）血液抜き取りとタンパク質抽
出の間の経過時間（０，２，４および２４時間）、３）サンプルが、タンパク質
抽出まで保持される温度（室温対冷蔵）および４）タンパク質溶解バッファーへ
のＲＮアーゼ阻害剤の添加。各血液サンプルは、Ｋ５６２細胞抽出物により「ス
パイク（ｓｐｉｋ）」され、上記変数に従い処理され、そしてテロメラーゼ活性
をアッセイされた。Ｋ５６２は、非常に高いテロメラーゼ活性を示すことが分か
っているヒト白血病細胞系である［Ｋｉｍら、（１９９４）］。本発明者らは、
本アッセイの開発におけるポジティブ対照としてこの細胞系のタンパク質抽出物
を使用した。各血液サンプルが、室温で５分間１２５ｘｇにおいて遠心されて細
胞画分を沈降させた。各サンプルからの血漿の１００μｌが、次のもの：０．５
％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．
２ｍＭＡＥＢＳＦおよび広範囲ＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａより入手）８
０単位：を含有する溶解バッファー１ｍｌに添加された。全量を、４℃で２０分
間１７，０００ｇで遠心した。上澄液の２／３を回収し、そしてタンパク質濃度
を下記のように決定した。タンパク質抽出物（タンパク質９および１２ｍｇ含有
）２μｌを、テロメラーゼ活性についてアッセイした。ヘパリンナトリウム・バ
キュテナー中に抜き取られた血液サンプルは、室温において４時間以内はテロメ
ラーゼ活性が最良に維持されて保たれた。

【００２３】テロメラーゼ活性の測定細胞中のテロメラーゼ活性は、基本的には、ＫｉｍおよびＳｈａｙによって開
発されたＴＲＡＰ（テロメア反復配列増幅法）アッセイを用いて測定される。Ｔ
ＲＡＰアッセイは、腫瘍組織および腫瘍細胞から直接単離されたタンパク質抽出
物中のテロメラーゼ活性を測定する［Ｋｉｍら、（１９９４）］。しかしながら
、テロメラーゼは、２つの理由のために血液液物（ｂｌｏｏｄｆｌｕｉｄ）で
は測定されなかった。第１に、テロメラーゼは、細胞酵素であり、細胞核中にの
み見いだされ、したがって、非細胞組織成分、例えば血液液物もしくは血漿では
検出されないことが予想された。第２には、既知のＴＲＡＰアッセイによる血液
成分を含有する組織におけるテロメラーゼ活性の検出は、次の理由：（１）血液
中に見いだされるヘム生産物が、ＰＣＲ増幅、ＴＲＡＰアッセイの構成要素部分
、に対して大きな阻害効果をもつ；および（２）リソソームの破壊によって血液
中に放出されるリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）が、そのリボ核酸（ＲＮＡ）鋳
型を分解することによってテロメラーゼを失活させるので、ＴＲＡＰアッセイに
よるテロメラーゼ活性の検出を不可能にするにちがいない：という理由から、技
術的挑戦を表すことが予想されるであろう［Ａｋａｎｅｅｔａｌ．，ＪＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉ，３９：３６２−３７２（１９９４）］。これらの欠点
が与えられるので、非細胞性の、ＲＮアーゼ含有液、例えば血漿においてテロメ
ラーゼ活性を検出するか、またはテロメラーゼ活性を定量するためのアッセイを
開発する可能性は、当業者にとっては遠い存在と考えられた。

【００２４】予期せぬことに、本発明者らは、テロメラーゼ活性が、実に、血液もしくは血
漿のように血清においても測定できることを見い出した。本発明者らは、希薄な
タンパク質抽出物におけるテロメラーゼ検出の感度増強ならびに並列アッセイ間
で、より均一な結果を達成するために、既知のＴＲＡＰアッセイを改変した。本
アッセイは、種々のＰＣＲチューブを用いて実施され、そして反応バッファーが
改変された。時間、温度および逆プライマーさえも変えられた。新規なプライマ
ーは、プライマーのスタッガー（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）アニーリングを制限し、
プライマー／ダイマー人工産物によって惹起される誤ったポジティブな結果を、
事実上排除する。高忠実度（ｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙ）Ｔａｑポリメラーゼ
は、Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ製の推奨されているＴａｑポリメラーゼを置き換える。
これらの改良は、テロメラーゼ活性検出の感度を増大、ならびにアッセイの信頼
性を改善した。

【００２５】具体的には、本発明者らは、患者被験者の収集された血液サンプルからタンパ
ク質を抽出した。タンパク質抽出物は、全量２５ｌ中、２０ｍＭＴＲＩＳ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、６３ｍＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭＥＧＴＡ、２５μＭ各ｄＮＴＰ、０．５μＭ
Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ａｍｂｉｏｎから入手）および２．５Ｃｉ−³²Ｐｄ
ＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する薄い管壁の反応チューブにおいて
、ＴＳオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡ
ＧＴＴ−３’）（配列番号：１）０．２５０μｇとともに３０℃で４５分間イン
キュベートされた。４５分間のインキュベーション中、テロメラーゼは、ＴＳオ
リゴヌクレオチドにＴＴＡＧＧＧ反復配列を付加する。ＰＣＲチューブは、９４
℃で２分間加熱されて、テロメラーゼを失活し、そしてプライマー／ダイマーの
形成を低下する。次に、２０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、６３ｍＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａより入手）、１ｍＭＥＧＴＡ、２５μＭ各ｄＮＴＰ、２．５ＵＨｉＦｉＴａｑポリメラ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍより入手）、０．１μｇＣＸ−
ｅｘｔオリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＣＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡ
ＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−３’）（配列番号：２）および５．０ａｔｔ
ｇＩＴＡＳ（内部テロメラーゼアッセイ基準）を含有する、９４℃に加熱された
反応バッファーが添加されて、容量５０μｌにされる。ＩＴＡＳは、正ＴＳプラ
イマーおよび逆ＣＸプライマーへの結合部位をもつ１５０塩基対ＤＮＡフラグメ
ントである。生成物は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、そして７２℃４５秒
間において、３０サイクル増幅された。増幅生成物の１０μｌ分量が、４５ｍＭ
ＴＲＩＳ塩基／４５ｍＭホウ酸／１ｍＭＥＤＴＡ中１２．５％未変性ポリアクリ
ルアミドゲル上で、２００ボルトで３０分間、次いで２７５ボルトで２．５時間
分離された。ゲルが乾燥され、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒｓｃｒｅｅｎ（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）に１６時間曝露された。ポジティブお
よびネガティブ対照は、各実験において平行して実施された。

【００２６】ＴＲＡＰアッセイの定量化本ＴＲＡＰアッセイが、直線範囲内で作動する条件下で測定するために、反応
は、Ｋ５６２細胞および組織タンパク質抽出物の連続希釈物とともに実施された
。すべての場合、アッセイを実施するために、０．０６μｇタンパク質抽出物が
選ばれた。ＴＲＡＰ反応物は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＰｈｏ
ｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒにおいてＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアーを用いて
定量された。各ＴＲＡＰ生成物バンドのシグナル強度が測定され、そしてタンパ
ク質抽出物を含まないＴＲＡＰ反応物のシグナル強度測定値を減じることによっ
て、バックグラウンドについて補正された。サンプルは、ＴＲＡＰバンドの調整
シグナル強度を合計することによって任意の活性単位を与えられた。５０Ｋ５６
２細胞における比テロメラーゼ活性のレベルは、各アッセイにおいて１００％に
設定された。各サンプルの比テロメラーゼ活性は、もっとも近似したパーセント
に丸められて、５０Ｋ５６２細胞におけるテロメラーゼ活性のパーセンテージと
して表された。

【００２７】ＲＮＡＰＣＲ分析によるテロメラーゼの測定総ＲＮＡが、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ単離キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い
て、血漿タンパク質（血漿タンパク質溶解物の調製は、先に挙げられた方法にし
たがって実施された）１４０μｌから単離された。ＲＮＡは７０℃で保存された
。テロメラーゼＲＮＡ鋳型（ｈＴＲ）の発現の分析は、ＲＴ−ＰＣＲによって遂
行された。ｈＴＲｍＲＮＡが、Ｆｅｎｇら［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１２３６
−１２４１（１９９５）］による記述のように、プライマーペアー５’−ＴＣＴ
ＡＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＧ−３’（Ｆ
３Ｂ）（配列番号：３）および５’−ＧＴＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡ
ＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧ−３’（Ｒ３Ｃ）（配列番号：４）を用いて増幅
された。

【００２８】まず、総ＲＮＡ５μｌが、薄い管壁の０．２ｍｌ容ＰＣＴチューブ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−ｅｌｍｅｒ，ｃａｔ＃Ｎ８０１−０７３７）中にピペットで注入された。
ＲＮＡは、９４℃で４分間インキュベートされ、そして直ちに氷上に置かれた。
インキュベーション温度は、ＲＮＡ２次構造を除去させ、それによってＲＮＡを
ｃＤＮＡに逆転写させることができる。

【００２９】次に、マスター混合物（表１参照）４５μｌが、氷上の各反応チューブに添加
された。チューブは、ＰＣＲブロックに移され、そして下記のｈＴＲＰＣＲプロ
グラムを用いて加熱サイクルにかけられた。プログラムは、次の、段階３〜５が
３４回繰り返されるインキュベーション段階を含む：（１）４２℃４５分間；（２）９４℃３分３０秒間；（３）９４℃３０秒間；（４）５７℃３０秒間；（５）７２℃４５秒間；（６）７２℃２分間；および（７）４℃維持。

【００３０】

【表１】

【００３１】ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析される。先ず、１０Ｘ
負荷バッファー５μｌが、各反応チューブに添加される、次に、ＰＣＲ生成物２
０μｌが、ＥｔｈｉｄｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ（５ｍｇ／ｍｌ）で染色された２％
Ｎｕｓｉｅｖｅゲル（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）上に負荷される。２５
塩基対ラダー（１μｇ）をもつ列が含まれる。生成物は、０．５ＸＴＢＥにお
いて１２５ボルト４５分間電気泳動される。ゲルは、トランスイルミネーター上
に置かれ、そして写真撮影される。期待されるＰＣＲ生成物は１２６塩基対であ
る。

【００３２】次の実施例は、具体的に説明する目的のためにのみ提供され、そしていかなる
点においても本発明の範囲を限定することを意図しない。

【００３３】実施例１−対照集団におけるテロメラーゼ活性：血液サンプルは、２０人の対照被験者から収集され、そして本明細書に開示さ
れる改変ＴＲＡＰアッセイを利用して繰り返し試験された。すべての場合、テロ
メラーゼ活性は、ポジティブ対照細胞系の５％未満であった（図４）。

【００３４】実施例２−がん集団におけるテロメラーゼ活性：血液サンプルは、２０人の肺がん患者から収集され、そして本明細書に開示さ
れる改変ＴＲＡＰアッセイを利用して二重盲検様式で試験された。具体的には、
本発明者らは、試験後まで、患者の疾病状態についての情報を得ていなかった；
同様に、患者のケアーをしている臨床医は、パイロット研究の終了後に患者の段
階が決定され、そして予後された後まで、本発明者らの結果について話されてい
なかった。１４症例では、テロメラーゼ活性は、ポジティブ対照細胞系の５％未
満か、それと同等であった。これらの１４症例では、患者は、試験時点において
完全に、または完全に近い寛解傾向にあることが、続いて分かった。高いテロメ
ラーゼ活性（ポジティブ対照の２４％〜１６０％）をもつ６症例では、すべてが
、活動的な進行性および／または転移性疾病を有した（図５）。本発明者らは、
疾病予後の機能しているようながん患者における、すなわち完全な、または部分
的寛解傾向における、血漿テロメラーゼ活性対侵略性および／または転移性疾病
をプロットした（図６）。寛解傾向の患者の１００％において、テロメラーゼ活
性レベルは５％以下であった。１人の患者を除く全患者において、テロメラーゼ
活性レベルは十分５％を超えていた。必ずしも、どの腫瘍組織も上昇したテロメ
ラーゼレベルを発現する［試験された腫瘍組織約９０％において見いだされる、
Ｓｈａｙら（１９９６）に注目］とは限らないので、本発明者らは、場合によっ
ては患者が、テロメラーゼネガティブな腫瘍をもつこともあろうと予測できる。

【００３５】実施例３−がんのタイプおよび予後を評価する手段としてのテロメラーゼ活性血液サンプルは、２０人の肺がん患者から収集され、そして本明細書に開示さ
れる改変ＴＲＡＰアッセイを利用して試験された。１４症例では、テロメラーゼ
活性は、対照細胞系の５％未満か、それと同等であった。これらの１４症例では
、患者は、試験時点において、完全に、または完全に近い寛解傾向にあった。高
いテロメラーゼ活性（２４％〜１６０％）をもつ６症例では、すべてが、活動的
な進行性および／または転移性疾病を有した（図５）。

【００３６】本明細書に引用された全参考文献は、完全に、引用によって組み入れられてい
る。本発明は、詳細に、そしてその特定の実施態様に関して、記述されたけれど
も、種々の変化および修飾が、その精神および範囲を逸脱することなく、ここに
実施することができることは、当該技術分野において通常の技術をもつものにと
っては明白であろう。例えば、特定の実施例が、肺がん患者からの血液を試験す
ることに向けられたけれども、腫瘍組織の９０％超において高度に発現されてい
るテロメラーゼは、他のタイプのがんに関する診断マーカーになる得ることは明
らかである。第２に、本明細書に開示されたテロメラーゼアッセイは、血液液物
からのタンパク質抽出物の試験について特に議論されているけれども、他の体液
、例えばリンパ液、胸膜液、脊髄液、唾液、喀痰、尿および精液からのものであ
ってもよいことは明らかである。自然には、テロメラーゼ検出のために選ばれる
特定の体液は、患者、スクリーニングもしくは評価されるべきがんのタイプ、な
らびに疾病の発現に依存するであろう。例えば、精液は、卵巣がんを診断するた
めに試験される体液ではあり得ないことは明白である。同じく、胸膜液は、一般
に、健康な個体では見いだされない。したがって、胸膜液における上昇したテロ
メラーゼレベルは、単なる細菌もしくはウイルス感染よりも、むしろ悪性腫瘍を
示しているであろう。最後に、テロメラーゼ活性を定量的に検出する段階は、開
示された方法に限定されるものではない。むしろ、テロメラーゼレベルを測定す
るあらゆるメカニズムが使用できる。例えば、テロメラーゼに特異的に結合する
か、または認識する試薬もしくは化学実体（ｃｈｅｍｉｃａｌｅｎｔｉｔｙ）
、例えばテロメラーゼ抗体が使用されてもよい。かくして、種々の既知の血清学
的アッセイ、例えば補体結合、ＥＬＩＳＡ、イムノブロットおよびその等価物が
、テロメラーゼ活性レベルを測定するのに使用されてもよい。

【００３７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】末端複製問題（先行技術）。

【図２】干渉（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）対治療のためのタイムウィンドウ（先行技
術）。

【図３】体液のテロメラーゼ反復配列増幅法（ＴＲＡＰ）アッセイ。

【図４】対照の血漿テロメラーゼ活性（５０Ｋ５６２細胞における活性のパーセンテー
ジとして表される）。

【図５】がん患者における血漿テロメラーゼ活性。

【図６】寛解傾向のがん患者対侵略性肺がんをもつ患者における血漿テロ
メラーゼ活性。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ハイスミス，エドワードアメリカ合衆国メリーランド州21201ボルチモア・ウエストプラツトストリート 519・アパートメント302 (72)発明者アブラツゾ，リン・ブイアメリカ合衆国メリーランド州20850ポトマク・アルダースゲイトロード9705 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 CA01 CA11 CA20 DA03 HA08 HA11 HA14 4B063 QA01 QA05 QA18 QA19 QQ03 QQ26 QQ52 QR08 QR31 QR57 QR62 QS16 QS24 QS25 QS34 4B064 CA21 CC24 DA05 DA14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）被験者から収集された体液被検物の細胞部分を除去し
；（ｂ）該体液の残物からタンパク質抽出物を調製し；（ｂ）テロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性の存在について該抽出物を
アッセイし；（ｃ）テロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性のレベルを定量し；そして（ｄ）テロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性のレベルを、正常レベルに
おいて見いだされるテロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性のレベルと比
較して、がんの存在を決定する：段階を含む、該被験者においてがんを検出する方法。
【請求項２】該がんが、胃腸、内分泌、生殖、頭・首、肝臓、乳房、腎臓
、泌尿、神経、血液、リンパ様、筋骨格および心臓と呼吸器からなる群から選ば
れる解剖学的構造系において発現されている、請求項１の方法。
【請求項３】該がんが肺がんである、請求項１の方法。
【請求項４】がんが非転移性である、請求項１の方法。
【請求項５】がんが転移性である、請求項１の方法。
【請求項６】体液が、血液、血漿、リンパ液、胸膜液、脊髄液、唾液、喀
痰、尿および精液からなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項７】体液が循環液である、請求項１の方法。
【請求項８】体液が血液である、請求項１の方法。
【請求項９】段階（ｂ）および（ｃ）が、（ｉ）テロメア反復配列の付加によるテロメラーゼ基質の伸長を触媒するように
、抽出物を、該テロメラーゼ基質の反応混合物およびバッファーとともにインキ
ュベートし；（ｉｉ）伸長されたテロメラーゼ基質が存在する場合には、テロメア反復配列に
十分に相補的な配列を含有するプライマーが、該伸長テロメラーゼ基質にハイブ
リダイズし、それにより二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができるような条件下
で、該プライマーを該混合物に添加して、それに特異的にハイブリダイズさせる
：段階をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１０】（ｉｉｉ）二本鎖ＤＮＡを増幅して測定しうるサンプル量
を達成する：段階をさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１１】テロメラーゼ基質がオリゴヌクレオチドＴＳ（５’−ＡＡ
ＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’）である、請求項９の方法
。
【請求項１２】プライマーがＣＸ−ｅｘｔオリゴヌクレオチド（５’−Ｇ
ＴＣＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−３
’）である、請求項９の方法。
【請求項１３】（ａ）患者から抜き取られた体液サンプル中のテロメラー
ゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性を定量的に測定して、初期テロメラーゼ活性
レベルを測定し；（ｂ）既知のがん療法によって患者を治療し；（ｃ）該療法後に患者の体液中のテロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性
のレベルを再測定し；（ｄ）初期テロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性レベルを、該療法後に
測定されたレベルと比較し；そして（ｅ）テロメラーゼＲＮＡもしくはテロメラーゼ活性における減少を、該がん療
法の有効性と相関させる：段階を含む、患者において診断されたがんを治療する方法。
【請求項１４】所定の期間にわたって段階（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すこと
をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１５】体液が、血液、血漿、リンパ液、胸膜液、脊髄液、唾液、
喀痰、尿および精液からなる群から選ばれる、請求項１３の方法。
【請求項１６】体液が循環液である、請求項１３の方法。
【請求項１７】体液が血液である、請求項１３の方法。
【請求項１８】テロメラーゼ基質；伸長されたテロメラーゼ基質の存在下
で二本鎖ＤＮＡ分子を形成するように、テロメア反復配列に十分に相補的な配列
を含み、それに特異的にハイブリダイズする逆プライマー；反応バッファー、お
よびＤＮＡ増幅コンポーネント：を含んでなる、血液調製物においてテロメラーゼレベルを検出するためのキット
。
【請求項１９】テロメラーゼ基質がＴＳオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡ
ＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’）であり、そして逆プライ
マーがＣＸ−ｅｘｔオリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＣＣＣＣＴＴＡＣＣ
ＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−３’）である、請求項１８のキ
ット。
【請求項２０】ＤＮＡ増幅コンポーネントが、高忠実度Ｔａｑポリメラー
ゼを含む、請求項１８のキット。