PL237994B1 - Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 - Google Patents

Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 Download PDF

Info

Publication number
PL237994B1
PL237994B1 PL432230A PL43223019A PL237994B1 PL 237994 B1 PL237994 B1 PL 237994B1 PL 432230 A PL432230 A PL 432230A PL 43223019 A PL43223019 A PL 43223019A PL 237994 B1 PL237994 B1 PL 237994B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mirna
pri
expression
qpcr
gene
Prior art date
Application number
PL432230A
Other languages
English (en)
Other versions
PL432230A1 (pl
Inventor
Tomasz Powrózek
Teresa Małecka-Massalska
Original Assignee
Univ Medyczny W Lublinie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Medyczny W Lublinie filed Critical Univ Medyczny W Lublinie
Priority to PL432230A priority Critical patent/PL237994B1/pl
Publication of PL432230A1 publication Critical patent/PL432230A1/pl
Publication of PL237994B1 publication Critical patent/PL237994B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób amplifikacji uzyskanego cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (ang. quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction; RT-qPCR) za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych.
Prekursory miRNA (pri-miRNA) należą do rodziny długich, niekodujących białek cząsteczek kwasu rybonukleinowego (ang. longnon-coding RNA; IncRNA) oraz stanowią pierwszy, jądrowy produkt transkrypcji genu kodującego określone miRNA (stąd określenie prekursor). W procesie jądrowej i cytoplazmatycznej obróbki pri-miRNA przekształcane są w dojrzałe miRNA. miRNA regulują funkcję genów na poziomie potranskrypcyjnym, tzn. posiadają zdolność do wiązania się do matrycowego RNA (ang. messenger RNA; mRNA), wpływając przez na to na poziom syntezowanych w organizmie białek. Rola miRNA w molekularnej regulacji funkcjonowania ludzkich genów została dotychczas opisana w wielu pracach naukowych. Na szczególną uwagę zasługuje jednak rola miRNA w procesie rozwoju chorób nowotworowych, w których obserwuje się zaburzenie ekspresji tych cząsteczek w porównaniu do stanu fizjologii. Istotne różnice w profilu ekspresji miRNA między osobami zdrowymi oraz chorymi na nowotwory złośliwe, a także możliwość ich badania we krwi obwodowej czynią je obiecującymi markerami diagnostycznymi umożliwiającymi wczesne i nieinwazyjne wykrycie raka [Chang TC. i wsp. Genomewide annotation of microRNA primary transcript structures reveals novel regulatory mechanisms, Genome Res 2015;25(9): 1401-1409 oraz Peng Y. i wsp. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Target Ther 2016; 1:15004.]
Ze względu na obiecujące wyniki badań dotyczących oceny miRNA jako markerów nowotworowych, coraz większą uwagę poświęca się również ich prekursorom, ze względu na ich odmienną biologię w porównaniu do miRNA. pri-miRNA w odróżnieniu od dojrzałych miRNA są strukturami dwuniciowymi o długości ok. 100 par zasad, zlokalizowane są w jądrze komórkowym oraz są bezpośrednimi, niezmodyfikowanymi produktami genów kodujących miRNA [O’Brien J i wsp. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol 2018;9:402.]. Mimo że ich rola w procesie rozwoju raka jest dotychczas niejasna, to ostatnie doniesienia naukowe zdają się potwierdzać istotną rolę pri-miRNA w procesie rozwoju chorób nowotworowych. W liniach komórkowych oraz materiale komórkowym pobranym od chorych z ostrą białaczką szpikową Rommer i wsp. odnotowali istotnie większą ekspresję prekursora miRNA-221/222 (pri-miRNA-221/222) w porównaniu do dojrzałych cząsteczek miRNA-221 i 222. Obecnie pri-miRNA-221/222 uznaje się za obiecujący onkogen związany z rozwojem ostrej białaczki szpikowej, a ocena jego ekspresji może być użyteczna w ocenie stopnia zaawansowania choroby [Rommer A. i wsp. Overexpression of primary microRNA 221/222 in acute myeloid leukemia. BMC Cancer 2013; 13:364]. W materiale tkankowym pobranym z guzów od chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca o utkaniu gruczołowym odnotowano natomiast istotnie wyższą ekspresję prekursora miRNA-3662 (pri-miRNA-3662) w porównaniu do tkanek o utkaniu płaskonabłonkowym i tkanki płucnej nieobjętej procesem nowotworowym. Ocena ekspresji pri-miRNA-3662 umożliwiła odróżnienie tkanki raka gruczołowego od tkanki zdrowej ze 80% czułością oraz swoistością na poziomie 96% oraz od tkanki raka płaskonabłonkowego z czułością 100% i swoistością 80%. Większą wartość diagnostyczną zdaje się posiadać jednoczesna analiza ekspresji prekursora i dojrzałego miRNA. Ocena pri-miRNA-3662 i miRNA-3662 umożliwiła odróżnienie tkanki raka gruczołowego od płaskonabłonkowego z czułością 96% i swoistością 85,7% oraz od tkanki zdrowej z czułością i swoistością odpowiednio 92% i 92% [Powrózek T. i wsp. Analysis of primary-miRNA-3662 and its mature form may improve detection of the lung adenocarcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 2017; 143( 10): 1941-1946]. Pri-miRNA-3662 podobnie jak jego dojrzała forma miRNA-3662 jest uwalniany do krążenia, stąd może stanowić potencjalny marker diagnostyczny gruczołowego raka płuca. Ocena ekspresji krążącego primiRNA-3662 we krwi obwodowej umożliwia wykrycie wczesnych stadiów zaawansowania raka gruczołowego (operacyjne stadia choroby I i II) z czułością 71,4% oraz swoistością 98,5%. Ekspresja primiRNA-3662 we krwi obwodowej jest istotnie wyższa u chorych z rakiem gruczołowym płuca w porównaniu do chorych z rakiem płaskonabłonkowym i osób zdrowych [Powrózek T. i wsp. The diagnostic role of plasma circulating precursors of miRNA-944 and miRNA-3662 for nonsmall cell lung cancer detection. Pathol Res Pract 2017;213(11): 1384-1387].
Gen kodujący pri-miRNA-944, który następnie zostaje przekształcony w dojrzałe miRNA-944 zlokalizowany jest w sekwencji intronowej genu TP63 (ang. tumorprotein 63) kodującego białko p63, które jest regulatorem proliferacji komórek podstawnych nabłonka. Zwiększoną ekspresję TP63 oraz p63 od
PL 237 994 B1 notowuje się w guzach nowotworowych o utkaniu płaskonabłonkowym, a w rutynowej diagnostyce histopatologicznej używane są przeciwciała przeciwko białku p63 w celu określenia typu histologicznego nowotworu.
Wynalazek rozwiązuje zagadnienie sposobu amplifikacji cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) za pomocą określonych starterów genowo i regiono-specyficznych dla pri-miRNA-944. Amplifikację cDNA pri-miRNA-944 służącą badaniu jego ekspresji przeprowadza się za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), która jest techniką dwuetapową. Zgodnie z założeniami RT-qPCR amplifikacji cDNA sekwencji badanej (w tym przypadku pri-miRNA-944) musi towarzyszyć równoległa amplifikacja sekwencji cDNA kontrolnej, która jest niezbędna jest do wyznaczenia ekspresji badanego primiRNA. W wynalazku jako kontrolę reakcji wykorzystano cDNA genu GAPDH (ang. Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase). Sposób prowadzenia RT-qPCR oraz kontrolę reakcji opisano szczegółowo w dalszej części.
Sposób amplifikacji cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla pri-miRNA-944 według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się startery genowo-specyficzne (służące przepisaniu sekwencji RNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH na komplementarne dla nich DNA - cDNA) wykorzystywane w pierwszym etapie RT-qPCR oraz startery regiono-specyficzne (służące amplifikacji cDNA primiRNA-944 oraz GAPDH) wykorzystywane w drugim etapie RT-qPCR posiadające sekwencje nukleotydowe przedstawione w załączniku.
Powyższe startery genowo-specyficzne stosowane są jednocześnie podczas trwania reakcji odwrotnej transkrypcji, tzn. do każdej próbki RNA pochodzącej od osoby badanej dodawane są oba startery (G1 i G2). Natomiast startery regiono-specyficzne stosuje się w parach (F1 z R1 oraz F2 z R2) podczas trwania reakcji qPCR służącej amplifikacji cDNA (startery umożliwiają uzyskanie następujących produktów qPCR: cDNA o długości odpowiednio 87 par zasad (pri-miRNA-944) oraz 118 par zasad (GAPDH)). W tym etapie każda uzyskana próbka cDNA (pochodząca od jednej badanej osoby) oznaczana jest osobno w czterech dołkach na płytce reakcyjnej PCR. W pierwszym dołku prowadzona jest reakcja ze starterami regiono-specyficznymi dla cDNA pri-miRNA-944 (startery: F1 i R1), natomiast w drugim dołku amplifikowane jest cDNA genu kontrolnego (GAPDH) (startery F2 i R2). Trzeci i czwarty dołek na płytce reakcyjnej stanowią powtórzenia powyższych reakcji. Zabieg ten ma na celu poprawę jakości uzyskanych wyników, które zostają następnie matematycznie uśrednione. Sposób rozmieszczenia badanych prób oraz powtórzeń reakcji przedstawiono na przykładzie - rycina 1. Dzięki prowadzeniu reakcji amplifikacji cDNA w aparacie Real-time PCR, wszystkie reakcje mogą być prowadzone w tym samym czasie, co umożliwia bieżący przebieg procesu amplifikacji cDNA oraz zapewnia obiektywną analizę uzyskanych wyników.
Zastosowanie powyższych starterów genowo-specyficznych umożliwia szybkie, wydajne i selektywne przepisanie tylko sekwencji RNA pri-miRNA-944 i GAPDH na komplementarne dla nich sekwencje DNA. Dzięki wykorzystaniu sposobu według wynalazku spośród dziesiątek tysięcy RNA obecnych w próbce pacjenta, na cDNA przepisywane są tylko dwie sekwencje niezbędne do dalszych eksperymentów. Znane metody przepisywania RNA, choćby te wykorzystywane w cytowanych publikacjach oparte są na globalnym przepisywaniu RNA na cDNA, tzn. przepisane na cDNA zostają wszystkie sekwencje RNA obecne w próbce badanej osoby. Wynalazek dzięki zastosowaniu starterów genowo-specyficznych umożliwia selektywne przepisanie na cDNA tylko sekwencji RNA pri-miRNA-944 i GAPDH. Zapewnia to po pierwsze wydajne uzyskanie cDNA wyłącznie badanych RNA, a po drugie zwiększa to efektywność amplifikacji w kolejnym etapie eksperymentu, gdyż nie jest ona zaburzana przez inne niepożądane cDNA. Natomiast zastosowanie starterów regiono-specyficznych dzięki korzystaniu ze sposobu według wynalazku umożliwia szybkie, wydajne i stosunkowe tanie otrzymywanie kopii matrycy cDNA pri-miRNA i GAPDH. Znane metody służące amplifikacji cDNA pri-miRNA-944 i GAPDH dotyczą innych fragmentów badanych sekwencji oraz są bardziej kosztowne głównie ze względu na wykorzystanie sond znakowanych fluorescencyjnie w drugim etapie RT-qPCR. Wynalazek dzięki wykorzystaniu regiono-specyficznych starterów umożliwia szybką i czułą, a przede wszystkim specyficzną amplifikację cDNA krążącego pri-miRNA-944 krwi obwodowej z wykorzystaniem barwnika interkalującego, tzn. wysycającego powstającego podczas reakcji PCR cDNA. Uzyskane w reakcji wyniki są odpowiednie do wyznaczenia ekspresji pri-miRNA-944. Opis metody amplifikacji pri-miRNA-944 za pomocą wynalazku opisano poniżej.
PL 237 994 B1
Wynalazek może mieć zastosowanie w wykrywaniu nowotworów płaskonabłonkowych zwłaszcza regionów głowy i szyi.
Opis metody RT-qPCR
RT-qPCR jest jedną z podstawowych technik badawczych zarówno w badaniach eksperymentalnych jak i w rutynowej praktyce diagnostycznej. Metoda ta umożliwia głównie badanie i ocenę ekspresji genów na poziomie mRNA, ale również ocenę ekspresji RNA: IncRNA, miRNA i pri-miRNA. Omawiana metoda składa się dwóch etapów: odwrotnej transkrypcji (ang. reverse transcription; RT) oraz reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. quantitative polymerase chain reaction; qPCR). Pierwszy etap RT-qPCR to odwrotna transkrypcja (RT). W etapie tym dzięki wykorzystaniu enzymu odwrotnej transkryptazy oraz starterów reakcji RT wyizolowane z próbek biologicznych RNA przepisywane jest na cDNA. Drugi etap RT-qPCR stanowi PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) podczas którego uzyskane w poprzednim etapie cDNA jest amplifikowane, tj. namnażane dzięki zastosowaniu starterów reakcji specyficznych dla sekwencji badanych i kontrolnych. Dzięki zastosowaniu barwnika interkalującego (wysycającego) cDNA, które jest namnażane podczas PCR, wynalazek umożliwia szybką, czułą i tanią ocenę ekspresji badanych RNA.
Jak wspomniano wcześniej, ocena ekspresji wybranych do badania sekwencji RNA wymaga równoległej oceny ekspresji genu kontrolnego, np. GAPDH, którego ekspresja w komórkach jest stała i niezależna od stanu zdrowia i choroby, co czyni go idealną i uniwersalną cząsteczką kontrolną. Ponieważ wydajność amplifikacji oraz namnażanie nowych kopii cDNA w reakcji PCR zależy głównie od jakości przeprowadzonej izolacji RNA oraz reakcji odwrotnej transkrypcji, to bez zastosowania kontroli reakcji uzyskany wynik mógłby być nierzetelny i nieobiektywny. Dzięki równoczesnej analizie cDNA genu kontrolnego z cDNA badanej sekwencji RNA z tej samej próbki badanej, możliwa jest normalizacja wyniku ekspresji badanego RNA. Poprzez normalizację należy rozumieć wyznaczenie cyklu progowego (Ct), tzn. określenie, w którym cyklu qPCR rozpoczyna się wykładniczy przyrost produktu amplifikacji cDNA kontroli i badanej sekwencji (w tym przypadku GAPDH i pri-miRNA-944), a następnie porównanie obu uzyskanych Ct względem siebie, poprzez obliczenie ACt (ACt = Ct dla pri-miRNA-944 - Ct dla GAPDH). Dzięki procesowi normalizacji ostateczny wynik, czyli wartość ekspresji badanego RNA jest rzetelny i obiektywny. Im większe wartości ACt, tym mniejsza jest relatywna ekspresja badanej cząsteczki (zależność odwrotnie proporcjonalna). Ekspresję badanego pri-miRNA-944 oblicza się matematycznie z uproszczonego wzoru Pffafl’a (Pffafl MW. A new mathematical model for relative quantification in realtime RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001; 29(9): e45.):
Relatywna ekspresja pri-miRNA-944 = 2-ACt gdzie ACt— Ctpri-miRNA-944 - CtGAPDH
Opis działania wynalazku przedstawiono i omówiono na poniższym przykładzie.
P r z y k ł a d 1. RT-qPCR z wykorzystaniem unikalnych starterów genowo i regiono-specyficznych dla oznaczenia ekspresji pri-miRNA-944
W celu przeprowadzenia reakcji niezbędne są:
1. Wyizolowane z osocza krwi obwodowej całkowite RNA
2. Unikalna mieszanina reakcyjna RT zawierająca startery genowo-specyficzne (G1 i G2) oraz inne odczynniki chemiczne w odpowiednich proporcjach i stężeniach (tabela 1)
3. Termocykler z możliwością ustawienia optymalnych warunków termicznych (tabela 2)
4. Unikalna mieszanina reakcyjna qPCR zawierająca startery regiono-specyficzne (F1 i R1 oraz F2 i R2) oraz inne odczynniki chemiczne w odpowiednich proporcjach i stężeniach (tabela 3)
5. Aparat real-time PCR z możliwością ustawienia optymalnych warunków termicznych qPCR (tabela 4)
RT-qPCR w wariancie oznaczania poziomu ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH według wynalazku, prowadzono z wykorzystaniem opisanych wyżej starterów genowo i regiono-specyficznych. W omawianym przykładzie oceniono ekspresję pri-miRNA-944 w osoczu krwi obwodowej u 40 chorych na nowotwory okolicy głowy i szyi o utkaniu płaskonabłonkowym oraz u 40 osób zdrowych. W 8-stanowiskowych probówkach typu strip (pojemność probówek po 0,2 ml; każde stanowisko odpowiada jednej badanej osobie) przygotowano mieszaninę reakcyjną dla RT zgodnie z proporcjami przedstawionymi w tabeli 1. Do przygotowanych mieszanin reakcyjnych dodano startery reakcji RT (starter G1 i G2) oraz wyizolowane wcześniej RNA. Reakcję RT prowadzono w termocyklerze zgodnie z warunkami czasowymi i temperaturowymi przedstawionymi w tabeli 2. W wyniku przeprowadzonej reakcji RT w każdej z probówek uzyskano cDNA sekwencji pri-miRNA-944 oraz GAPDH dla badanych chorych oraz osób zdrowych.
PL 237 994 Β1
W 96 kołkowej płytce przystosowanej do odpowiedniego aparatu Real-time PCR przygotowano mieszaninę reakcyjną zgodnie z proporcjami przedstawionymi w tabeli 3. W celu lepszego zrozumienia działania wynalazku oraz omówienia przebiegu ostatniego etapu RT-qPCR, tzn. qPCR, opis przykładu oraz interpretację wyników omówiono na wyniku dwóch osób: chorej na raka z wysoką ekspresją primiRNA- 944 oraz osoby zdrowej z niską ekspresją badanej sekwencji. Dla osoby chorej na raka w dołu nr A1 sporządzono mieszaninę ze starterami regiono-specyficznymi dla pri-miRNA-944 (starter F1 oraz R1), natomiast w dołku nr A2 ze starterami regiono-specyficznymi dla GAPDH (starter F2 oraz R2). Dołki nr A3 i A4 stanowią powtórzenia wspomnianych reakcji. W analogiczny sposób przygotowano mieszaniny reakcyjne dla osoby zdrowej: w dołkach nr B1 i B3 dodano startery dla pri-miRNA-944 (F1 oraz R1), a w dołkach nr B2 i B4 startery dla GAPDH (F2 oraz R2). Przygotowaną płytkę zabezpieczano folią ochronną, umieszczono w aparacie Real-time PCR i zaprogramowano parametry reakcji qPCR (tabela 4). Po zakończeniu qPCR wyniki interpretowano na monitorze komputera podłączonego do aparatu Real-time PCR. Wyznaczone przez oprogramowanie cykle progowe (Ct) reakcji zapisywano w arkuszu programu Microsoft Excel, który wykorzystano również do wyliczenia średnich wartości Ct z dwóch powtarzanych oznaczeń oraz w celu wyznaczenia relatywnej ekspresji pri-miRNA-944 wprowadzając do arkusza kalkulacyjnego uproszczony wzór Pffaffa. U osoby chorej po uśrednieniu Ct dla pri-miRNA-944 i GAPDH wynosił odpowiednio 28 i 26 cykl qPCR, natomiast dla osoby zdrowej odpowiednio 28 i 22 cykl qPCR (rycina 2 oraz rycina 3). Następnie obliczono ACt dla osoby chorej i zdrowej. Wynosiły odpowiednio dla osoby chorej ACtosoba chora= Ctpri-miRNA-944- CtGAPDH (ACtosoba chora= 28 cykl - 26 cykl = 2 cykle) oraz zdrowej ACt osoba zdrowa = Ctpri-miRNA-944 - CtGAPDH (ACtosoba zdrowa =28 cykl - 22 cykl = 6 cykli). Podstawiając uzyskane ACt do wzoru PffafTa wyliczono ekspresję pri-miRNA-944:
Relatywna ekspresja pri-miRNA-944 = 2 Δα
Ekspresja pri-miRNA-944 osobachora= 2 ACt = 2-2= 0,25
Ekspresja pri-miRNA-944 osoba zdrowa = 2 ACt = 2-6= 0,016
Porównując wartość ekspresji pri-miRNA-944 u obu badanych osób (Ekspresja pri-miRNA944osoba chora / Ekspresja pri-miRNA-944osoba zdrowa) można stwierdzić, że ekspresja pri-miRNA-944 jest ok. 15,63 raza większa (0,25/0,016) u osoby chorej na raka w porównaniu do osoby zdrowej.
W badanej grupie 40 chorych na nowotwory głowy i szyi oraz 40 zdrowych ochotników, średnią ekspresję z wszystkich pomiarów pri-miRNA-944 wykorzystano jako wartość progową, tzn. u badanych osób, u których ekspresja badanego pri-miRNA była niższa niż wartość ekspresji dla całej grupy ekspresję uznawano za niską, natomiast u osób z wynikiem powyżej średniej, ekspresję uznawano za wysoką. Następujące wyniki uzyskano dla grupy 40 chorych na raka oraz 40 osób zdrowych:
ekspresja pri-miRNA-944 chorzy (40 osób) zdrowi (40 osób)
ekspresja wysoka (wynik dodatni) 35 (87,5%) 2 (5%)
ekspresja niska (wynik ujemny) 5(12,5%) 38 (95%)
Obecność niskiej ekspresji pri-miRNA-944 (wynik ujemny) u osób zdrowych może świadczyć o braku rozwijającego się procesu nowotworowego w obrębie głowy i szyi lub innego raka o utkaniu histologicznym typu płasko nabłonkowego. Natomiast u zdrowych osób z wysoką ekspresją (wynik dodatni) pri-miRNA-944, zalecana jest dalsza diagnostyka, np. w oparciu o badanie obrazowe oraz wywiad i badanie lekarskie mające na celu ustalenie przyczyny nieprawidłowego wyniku badania genetycznego. W przypadku chorych z niską ekspresją (wynik ujemny) pri-miRNA-944, należy ustalić przyczynę uzyskania wyniku ujemnego badania genetycznego - może być to związane, m.in. z wielkością i lokalizacją guza oraz innymi cechami kliniczno-demograficznymi chorych. Obecność produktu qPCR potwierdza prawidłowe przeprowadzenie reakcji RT ze starterami genowo-specyficznymi oraz odpowiednio skonstruowane startery regiono-specyficzne dla badanych sekwencji. Metoda oceniająca ekspresję primiRNA-944 z wykorzystaniem opisanych starterów genowo i regiono-specyficznych charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością diagnostyczną, odpowiednio 87,5% i 95%.
PL 237 994 Β1
T a b e I a 1. Stężenia i objętości odczynników stosowanych podczas reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) dla oznaczania ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH (pierwszy etap reakcji RT-qPCR)
Skład mieszaniny reakcyjnej RT ilość
Bufor RT (10x) 3 μΙ
Mieszanina nukleotydów (25x) (100 mmol) 0,8 μΙ
Enzym odwrotna transkryptaza - MultiScribe (50 U/μΙ) 1 μΙ
Inhibitor RNAz (20 U/μΙ) 1 μΙ
Starter RT (Gl) dla pri-miRNA-944 (lOOpmol/μΙ) 1 μΙ
Starter RT (G2) dla GAPDH (100 pmol/μΙ) 1 μΙ
woda wolna od nukleaz 4,2 μΙ
Badane mRNA (>lng/pl) 8 μΙ
Razem 20 μΙ
T a b e I a 2. Warunki temperaturowe prowadzenia reakcji RT w wariancie przystosowanym do oznaczania ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH
Etap reakcji RT Temperatura Czas
1 Przyłączenie starterów genowospecyficznych oraz przepisanie RNA na cDNA 37°C 60 minut
II 95°C 5 minut
III Chłodzenie próbki 4°C (do momentu schłodzenia)
T a b e I a 3. Stężenia i objętości odczynników stosowanych podczas reakcji qPCR dla oznaczania ekspresji primiRNA-944 oraz GAPDH (drugi etap reakcji RT-qPCR)
Skład mieszaniny reakcyjnej qPCR ilość
Mix PCR z barwnikiem SYBR Green 13 μΙ
Starter FI dla pri-miRNA-944 lub F2 dla GAPDH 0,8 μ!
Starter R1 dla pri-miRNA-944 lub R2 dla GAPDH 0,8 μΙ
woda wolna od nukleaz 1,4 μΙ
Badane cDNA (>lng/pl) 4 μΙ
Razem 20 μΙ
T a b e I a 4. Warunki temperaturowe prowadzenia qPCR w wariancie przystosowanym do oznaczania ekspresji pri-miRNA-944 oraz GAPDH
Etap Temperatura Czas Liczba cykli reakcji
Aktywacja polimerazy DNA oraz wstępna denaturacja DNA 95°C 30 sekund 1
Właściwa denaturacja DNA 95 °C 10 sekund 40
Przyłączanie starterów regiono-specyficznych 60 °C 45 sekund
Rysunek przedstawia na Fig. 1 reprezentatywny przykład przygotowania płytki reakcyjnej dla qPCR w celu oznaczenia ekspresji pri-miRNA-944 oraz kontroli (GAPDH) w pojedynczej próbce cDNA (jedna osoba badana). W dołkach płytki oznaczonych A1-A4 znajduje się mieszanina reakcyjna dla przeprowadzenia qPCR, do dołków A1 i A3 dodano startery F1 i R1 (dla pri-miRNA-944), natomiast do dołków- A2 i A4 startery F2 i R2 (dla GAPDH). Sekwencję badaną (pri-miRNA-944) oraz kontrolną
PL 237 994 B1 (GAPDH) oznacza się w dwóch powtórzeniach, odpowiednio pary A1 i A3 oraz A2 i A4. Wynik ekspresji uzyskany w badanych dołkach zostaje matematycznie uśredniony.
Fig. 2 obejmuje przykładowy wynik reakcji qPCR (drugi etap RT-qPCR), a mianowicie wynik chorego na nowotwór złośliwy okolicy głowy i szyi - obecność wysokiej ekspresji pri-miRNA-944 we krwi obwodowej (wynik dodatni). Na rycinie widoczne są krzywe obrazujące obecność amplifikacji produktu qPCR przy użyciu starterów regiono-specyficznych dla pri-miRNA-944 oraz kontroli reakcji - GAPDH. Zaznaczono również cykle progowe (Ct) dla obu badanych sekwencji, kiedy produkt reakcji qPCR narasta wykładniczo. W celu obliczenia ACt od Ct pri-miRNA-944 odejmuje się Ct GAPDH, w tym przypadku różnica wynosi 2 cykle.
Fig. 3 pokazuje przykładowy wynik reakcji qPCR (drugi etap RT-qPCR), a mianowicie wynik osoby zdrowej - obecność niskiej ekspresji pri-miRNA-944 we krwi obwodowej (wynik ujemny). Na rycinie widoczne są krzywe obrazujące obecność amplifikacji produktu qPCR przy użyciu starterów regiono- specyficznych dla pri-miRNA-944 oraz kontroli reakcji - GAPDH. Zaznaczono również cykle progowe (Ct) dla obu badanych sekwencji, kiedy produkt reakcji qPCR narasta wykładniczo. W celu obliczenia ACt od Ct pri-miRNA-944 odejmuje się Ct GAPDH, w tym przypadku różnica wynosi 6 cykli.
Wykaz sekwencji nukleotydowych:
a) startery genowo-specyficzne (służące przepisaniu sekwencji RNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH na komplementarne dla nich DNA - cDNA) wykorzystywane w pierwszym etapie RTqPCR:
1. starter genowo-specyficzny (G1) dla RNA pri-miRNA-944:
5’- ATGGGAGACACAGC - 3’
2. starter genowo-specyficzny (G2) dla RNA GAPDH:
5’ - GGACTGAGATTGGC - 3’
b) startery regiono-specyficzne (służące amplifikacji cDNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH wykorzystywane w drugim etapie RT-qPCR:
1. starter sensowny (F1) dla cDNA pri-miRNA-944:
5’- GTTCCAGACACATCTCATCTGATA - 3’
2. Starter antysensowny (R1) dla cDNA pri-miRNA-944:
5’- TCCCAGACACAGCTCATCCG - 3’
3. Starter sensowny (F2) dla cDNA GAPDH:
5’- CCATCTCAGTCGTTCCCAAAGT - 3’
4. Starter antysensowny (R2) dla cDNA GAPDH:
5’- AGGTGATCGGTGCTGGTTCC-3’

Claims (1)

1. Sposób przepisywania sekwencji RNA oraz amplifikacji cDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944, znamienny tym, że stosuje się startery genowo-specyficzne (służące przepisaniu sekwencji RNA pri-miRNA-944 oraz GAPDH na komplementarne dla nich DNA-cDNA) posiadające sekwencje nukleotydowe przedstawione w załączniku, wykorzystywane w pierwszym etapie RT-qPCR oraz startery regiono-specyficzne (służące amplifikacji cDNA, pri-miRNA-944 oraz GAPDH) wykorzystywane w drugim etapie RT-qPCR zawierające sekwencje nukleotydowe przedstawione w załączniku.
PL432230A 2019-12-16 2019-12-16 Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944 PL237994B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL432230A PL237994B1 (pl) 2019-12-16 2019-12-16 Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL432230A PL237994B1 (pl) 2019-12-16 2019-12-16 Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL432230A1 PL432230A1 (pl) 2021-02-22
PL237994B1 true PL237994B1 (pl) 2021-06-28

Family

ID=74647669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL432230A PL237994B1 (pl) 2019-12-16 2019-12-16 Sposób amplifikacji komplementarnego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją za pomocą starterów genowo i regiono-specyficznych dla prekursora miRNA-944

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL237994B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL432230A1 (pl) 2021-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2654587C2 (ru) Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении
US9068974B2 (en) Biomarkers in peripheral blood mononuclear cells for diagnosing or detecting lung cancers
JP2018027089A (ja) ｍｉＲＮＡに基づくユニバーサルスクリーニングテスト（ＵＳＴ）
US20180105888A1 (en) Methods and Kits for Detecting Subjects at Risk of Having Cancer
JP6216470B2 (ja) 甲状腺腫瘍の分類におけるｍｉＲＮＡ発現シグネチャー
EP2734636B1 (en) Micro-rna biomarkers for identifying risk of and/or for diagnosing lung tumour
JP2015128442A (ja) 早期結腸直腸癌の検出のための血漿マイクロｒｎａ
US20180142303A1 (en) Methods and compositions for diagnosing or detecting lung cancers
JP7390285B2 (ja) 老化細胞を検出するための新規バイオマーカー
WO2016186987A1 (en) Biomarker micrornas and method for determining tumor burden
EP2982985A1 (en) System for predicting prognosis of locally advanced gastric cancer
WO2008070301A9 (en) Predicting lung cancer survival using gene expression
WO2015017537A2 (en) Colorectal cancer recurrence gene expression signature
CN108949992B (zh) 一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物
EP2733220B1 (en) Novel miRNA as a diagnostic marker for Alzheimer's Disease
EP3122905B1 (en) Circulating micrornas as biomarkers for endometriosis
TW201309805A (zh) 預測大腸直腸癌復發的生物標記
CN109735623B (zh) 一种结直肠癌生物标志物
US11661633B2 (en) Methods for predicting prostate cancer and uses thereof
US20220180973A1 (en) Early detection and prediction method of pan-cancer
WO2010101916A1 (en) Methods for predicting cancer response to egfr inhibitors
Nashtahosseini et al. Circulating status of microRNAs 660‐5p and 210‐3p in breast cancer patients
CN106755343A (zh) 胰腺癌预后诊断分子标记物
US20190316207A1 (en) Mir-320e and colorectal cancer
BR112020012280A2 (pt) composições e métodos para diagnosticar cânceres de pulmão usando perfis de expressão de gene