JP2002501534A - オリゴヌクレオチド合成用新規硫黄転移試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明者らの研究によれば、２つの市販されている化合物３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（１）および水素化キサンタン（２）およびそれらの誘導体３〜６が強力な硫黄転移試薬であることが見出された。これらの新規硫黄転移試薬の効率及び適合性をジヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドホスホロチオエート類の固相合成法により調べた。その結果、両化合物（１）および（２）は高効率の硫化試薬であり、各工程で９９％以上の硫黄転移効率が達成されることを示す。ビューケイジ試薬と異なり、これらの新規硫黄転移試薬は各種の溶媒中で安定で、低価格にて大量に入手可能である。これらの利点により、化合物（１）および（２）はビューケイジ試薬の代替となり得、特にオリゴヌクレオチドホスホロチオエート類の大規模製造に有利である。さらに、化合物（１）および（２）はアセトニトリルに対する溶解性を高めるように改変された。式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の３つのタイプの構造を有するものが効果的な硫黄転移試薬として有用であると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド合成用新規硫黄転移試薬 技術分野 本発明はオリゴヌクレオチド類の化学合成および該合成に有用な化学物質に関 する。さらに詳しくは、本発明はオリゴヌクレオチド類のヌクレオシド間結合の 硫化に関する。 背景技術 オリゴヌクレオチド類は、近代的分子生物学における不可欠の道具となってお り診断方法から遺伝子発現のアンチセンス抑制のＰＣＲに渡る広範な技術に用い られている。 オリゴヌクレオチドホスホロチオエート類は核酸研究に重要な関係を有し、オ リゴヌクレオチド治療にて試験される類似物の中にある。オリゴヌクレオチドホ スホロチオエート類はヌクレオシド間結合に含まれ、そこではホスフェート基の 非架橋酸素原子の１つが硫黄原子で置換されている。オリゴヌクレオチド類のこ れら広範な使用により、オリゴヌクレオチド類の迅速で低廉でかつ効率的な合成 法に対する要求が増大している。 アンチセンスおよび診断用のオリゴヌクレオチド類の合成は今やルーチンにて 完成している（Methods in Molecular Biology，Vol 20:Protocols for Oligonu cleotides and Analogs，pp．165-189(S．Agrawal，ed，Humana Press，1993);O ligonucleotides and Analogues:A Practical Approach，pp．87-108(F.Eckstei n.，ed.，1991);およびUhlmann and Peyman，Chemical Reviews，90:543-584(19 90);Agawal and Iyer，Curr．Op．in Biotech．6:12(1995);およびAntisense Re search and Applications(Crooke and Lebleu，eds，CRC Press，Boca Raton，1 993)を参照）。初期合成手法にはホスホジエステルおよびホスホトリエステル化 学が含まれる。コラナ等(Khorana et al，J．Molec．Biol，72209(1972))には、 オリゴヌクレオチド合成のホスホジエステル化学が開示されている。 リーズ(Reese，Tetrahedron Lett．34:3143-3179(1978))にはオリゴヌクレオ チドおよびポリヌクレオチド合成のホスホトリエステル化学が開示されている。 これら初期合成手法は、より効果的なホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネー ト手法から自動合成へと大きく道を開いた。ビューケイジら(Beaucage and Carr uthers，Tetrahedron Lett．22:1859-1862(1981))はポリヌクレオチド合成にデ オキシヌクレオチドホスホルアミダイトの使用を開示している。アグラウォール ら（Agrawal and Zamecnik，U.S．Patent No．5,149,798(1992)）にはＨ−ホス ホネート手法によるオリゴヌクレオチドの最適合成を開示している。 これら後者の手法は各種の改変またヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレ オチド類の合成に用いられている。アグラウォールら（Agrawal and Goodchild ，Tetrahedron Lett．28:3539-3542(1987)）はホスホルアミダイト化学を利用し たオリゴヌクレオチドメチルホスホネート類の合成について教示している。コノ リーら（Connolly et al.，Biochemistry 23:3443(1984)）は、ホスホルアミダ イト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエート類の合成を開示してい る。ジェイガーら（Jager et al.，Biochemistry 27:7237(1988)）はホスホルア ミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミデート類の合成を開示し ている。アグラウオールら（Agrawal et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 7079-7083(1988)）は、Ｈ−ホスホネート化学を用いたオリゴヌクレオチドホス ホルアミデート類およびホスホロチオエート類の合成を開示している。 上記方法によるオリゴヌクレオチド類の固相合成法は同じ一般的プロトコール を含んでいる。簡単に示せば、この手法は、３’−モストヌクレオシド(３’−m ost nucleoside)をアミノおよび／またはヒドロキシ基で官能性を付与した固体 担体に固定させ、ついで追加のヌクレオシドを段階的に追加することからなる。 ヌクレオシド間結合は、付加されるヌクレオシドの３’−官能基と初期の担体に 固定されたオリゴヌクレオシドの５’−モストヌクレオシドとの間で形成される 。ホスホルアミダイド手法では、ヌクレオシド間結合はホスファイド結合であり 、一方、Ｈ−ホスホネート手法では、Ｈ−ホスホネートヌクレオシド間結合であ る。硫黄含有ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を作るためには、ホスファ イト結合またはＨ−ホスホネート結合は適当な硫黄転移試薬で酸化しなければな らな い。Ｈ−ホスホネート手法では、この硫化はすべてのＨ−ホスホネート結合にお いて単一工程で行なわれ、ついでオリゴヌクレオチド鎖組立が完成する。 それは、典型的にはＣＳ₂／ピリジン等の混合溶媒中で硫黄元素を用いて行な われる。反対に、ホスホルアミダイド手法では、各カップリング後に段階的に硫 化が行なわれ、それにより、部位特異的に各結合の状態がコントロールできる。 部位特異的に各結合状態をコントロールできると共に、優れたカップリング効果 のために、ホスホルアミダイト手法が有利である。 しかし、洗練された手法開発が依然要求されており、とくに、大規模合成（１ ０μｍｏｌ〜１ｍｍｏｌまたはそれ以上）に移行するときには余計に必要である （パドマプリヤら(Padmapriya et．al.，Antisense Res．Dev．4:185(1994)を参 照）。標準的ホスホルアミダイト法のいくつかの改良法が合成法に関して報告さ れている（パドマプリヤら(Padmapriya et．al.，supra;Ravikumar et.al.，Tet rahedron 50:9255(1994)、テイセンら(Theisen et al.，Nucleosides & Nucleot ides 12:43(1994))およびアイヤーら（Iyer et．al.，Nucleosides & Nucleotid es 14:1349(1995)）。またオリゴヌクレオチドの単離に関して〔キュイジュパー スら(Kuijipers et．al.，Nucl．Acids．Res．18:5197(1990))およびレディら(R eddy et．al.，Tetrahedron Lett．35:4311(1994))〕報告されている。 ホスホロアミダイト手法を介してオリゴヌクレオチドホスホロチオエート類を 合成するためには効果的な硫黄転移試薬を使用することが肝要である。 硫黄元素は低溶解性および遅い硫化反応のために効果的でない。近年、多くの より効果的な硫化試薬が報告されている。これらには、フェニルアセチルジスル フィド（カメルら(Kamer et．al．Tetrahedron Lett．30:6757-6760(1989)）、 Ｈ−１，２−ベンゾジオチール−３−オン−１，１−ジオキシド（ビューケイジ 試薬(Beaucage reagent)（アイヤーら(Iyer et．al.，J.Qrg．Chem．55:4693-46 99(1990)）、テトラエチルチューラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）（ヴーら（Vu e t al.，Tetrahedron Lett．32:3005-3008(1991)）、ジベンゾイルテトラスルフ ィド（ラオら（Rao et．al.，Tetrahedron Lett．33:4839-4842(1992)）、ビス （Ｏ，Ｏ−ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジスルフィド （Ｓ−Tetra）（ステックら（Stec et al.，Tetrahedron Lett．33:5317-5320(1 993)）、ベンジルトリエチルアンモニウムテトラチオモリベート（ＢＴＴＭ）（ ラオら(Rao et．al.，Tetrahedron Lett．35:6741-6744(1994)）、ビス（p−ト ルエンスルホニル）ジスルフィド（エフィルノフら（Effirnov et．al.，Nucl． Acids Res．23:4029-4033(1995)）、３−エトキシ−１，２，４−ジチアゾリン −５−オン（ＥＤＩＴＨ）（シューら（Xu et．al.，Nucleic Acid Res．24:160 2-1607(1996)）、および１，２，４−ジチアゾリジン−３，５−ジオン（Ｄｔｓ ＮＨ）（シューら（Xu et．al.，Nucleic Acid Res．24:1602-1607(1996)）があ る。 ビューケイジ試薬およびＴＥＴＤの両者は共に市場で入手可能である。ビュー ケイジ試薬は広く用いられるが、その合成および安定性に難点がある。さらに、 硫化中にビューケイジ試薬で形成される副生成物、３Ｈ−２，１−ベンゾキサン チオラン−３−オン−１−オキシドは潜在的な酸化剤となってある条件下では好 ましくないホスホジエステル結合をもたらす。したがって、オリゴヌクレオチド ホスホロチオエート類の大規模合成にそれを適用するのはとくに好ましくない。 我々は２つの商業的に利用し得る化合物１および２および新規なその類似体を強 力な硫化試薬として報告する。 したがって、新たな硫黄転移試薬およびオリゴヌクレオチドの硫化方法の開発 に対する要求がなお引続き存在する。実際に、そのような硫黄転移試薬は、低廉 に作られ、貯蔵安定性がよく、かつ高効率のものであるべきである。 発明の要旨 本発明は、硫黄転移試薬を用いたオリゴヌクレオチド類の新規な硫化方法を提 供するものである。本発明の方法によれば、硫化が安価に貯蔵安定性良く、かつ 高効率で行なわれる。 第1の態様では、本発明は式Ｉの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する 。式中、ＸはＲ¹、ＮＲ²Ｒ³、ＮＲ⁴ＣＯＲ⁵、ＳＲ⁶またはＯＲ⁷を示し、Ｒ¹、Ｒ² 、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は各々独立してＨまたはアルキルまたは芳香族有機基、Ｒ⁶ およびＲ⁷は各々独立してアルキルまたは芳香族有機基である。 第2の態様は、本発明は式ＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する 。 式中、Ｒ⁸はＨまたは有機基、Ｒ⁹は有機基である。 本発明の他の態様は、式ＩＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する 。 式中、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は各々独立してＨまたは有機基である。 第4の態様では、本発明は、本発明の新規硫黄転移試薬を用いてオリゴヌクレ オチドのヌクレオシド間結合に硫黄基を付加する新規な方法を提供するものであ る。 好ましい態様では、本発明の新規な方法は、少なくとも１つの硫化し得るヌク レオシド間結合を有するヌクレオチドを、本発明の新規な硫黄転移試薬とヌクレ オシド間結合を硫化するに充分な時間接触させることからなる。 図面の簡単な説明 図１は標準のＤＭＴ保護Ｔ−ＴホスホチオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。図 1Ａは、標準Ｐ＝ｓダイマーのＨＰＬＣを示す。図１ＢはＰ＝ＳおよびＰ＝Ｏダ イマーの共注入を示す。 図２は、硫黄転移試薬として化合物１を用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−Ｔホスホ チオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。図２Ａは、４等量１分間の条件で硫化し た場合を示す。図２Ｂは、４等量５分間の条件で硫化した場合を示す。図２Ｃは 、１２等量１分間の条件で硫化した場合を示す。図２Ｄは、１２等量５分間の条 件で硫化した場合を示す。 図３は、硫黄転移試薬として化合物２を用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−Ｔホスホ チオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。 図４は、硫黄転移試薬として化合物３用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−Ｔホスホチ オエートダイマーのＨＰＬＣを示す。 図５は、硫黄転移試薬として化合物４用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−Ｔホスホチ オエートダイマーのＨＰＬＣを示す。 図６は、硫黄転移試薬として化合物１を用いて合成したＳＥＱＩＤＮｏ：１のＨ ＰＬＣを示す。図６Ａは、各合成サイクルにおいて１分間の硫化の場合を示す。 図６Ｂは、各合成サイクルにおいて２分間の硫化の場合を示す。 図７は、硫黄転移試薬として化合物１を用い、硫化を１分間行なって合成したＳ ＥＱＩＤＮｏ．１のＣＥを示す。 図８は、硫黄転移試薬として化合物２を用い、硫化を２分間行なって合成したＳ ＥＱＩＤＮｏ．１のＣＥを示す。 発明を実施するための最良の形態 本発明はオリゴヌクレオチド類の化学合成および該合成に有用な化学物質に関 する。さらに詳しくは、本発明はオリゴヌクレオチド類のヌクレオシド間結合の 硫化に関する。 本明細書に示している特許および刊行物は当該技術分野の習熟者に知られてい るものであって、それら全体を本明細書において引用する。 本発明は、新規な硫黄転移試薬およびそれらのオリゴヌクレオチド硫化への使 用法を提供する。本発明の硫黄転移試薬は、安価に製造でき、貯蔵安定性で、硫 化に高い効率を有する。 第1の態様では、本発明は式Ｉの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する 。 式中、ＸはＲ¹、ＮＲ²Ｒ³、ＮＲ⁴ＣＯＲ⁵、ＳＲ⁶またはＯＲ⁷を示し、Ｒ¹、Ｒ² 、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は各々独立してＨまたはアルキルまたは芳香族有機基、Ｒ⁶ およびＲ⁷は各々独立してアルキルまたは芳香族有機基である。 好ましい具体例は、式Ｉの硫黄転移試薬が３−アミノ−１，２，４−ジチアゾ ール−５−チオン（１）、水素化キサンタン（２）、３−Ｎ−アセチル−３−ア ミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３）、３−Ｎ−トリメチルアセ チル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（４）、３−Ｎ−ベ ンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（５）または３ −Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオ ン（６）である。 第2の態様は、本発明は式ＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する 。 式中、Ｒ⁸はＨまたは有機基、Ｒ⁹は有機基である。 本発明の他の態様は、式ＩＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する 。 式中、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は各々独立してＨまたは有機基である。 好ましい具体例は、式ＩＩＩの硫黄転移試薬が３−アミノ−１，２，４−ジチ アゾール−５−チオン（１）、水素化キサンタン（２）、３−Ｎ−アセチル−３ −アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３）、３−Ｎ−トリメチル アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（４）、３−Ｎ −ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（５）また は３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５− チオン（６）である。 化合物１および２の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンおよ び水素化キサンタンは、ランカスター、クレセントケミカルス、メイグリッジお よびＴＣＩアメリカを含む種々の化学会社から市販されている。得られる化合物 １および２の純度は９８％以上で、両化合物共に、さらに精製することなくオリ ゴヌクレオチド合成に直接使用し得る。これらの化合物はゴム工業において加硫 化剤として用いられている。しかし、これらの化合物は、我々の知る限りでは、 オリゴヌクレオチド合成に適用されたことはない。 化合物１の誘導体は容易に合成される。反応式１に示すように、化合物１を出 発物質として、固相ホスホルアミダイト法により、７０％以上の収率にて３−Ｎ −アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３）、３− Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン （４）、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チ オン（５）および３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチ アゾール−５−チオン（６）を容易に得ることができる。 反応式１ より詳細に説明すると、反応条件としては、化合物３では酢酸無水物／ピリジ ン中で（収率９６％）、化合物５ではトリメチル酢酸無水物／Ｅｔ₃Ｎ中で（収 率７０％）、および化合物６ではベンゼンスルホニルクロリド／Ｅｔ₃Ｎ中で（ 収率７６％）行なう。最終生成物を簡単な沈殿法で精製しうる。 これらの硫黄転移試薬の安定性および溶解性を調べた。化合物１〜６はＣＨ₃ ＣＮ、ピリジン−ＣＨ₃ＣＮ（１：９）およびピリジン中で１週間以上安定であ る。テスト期間中沈殿は生じなかった。すべての試薬は自動ＤＮＡシンセサイザ ーの操作中安定であり、合成中に凝結その他の問題は生じなかった。 親化合物１および２はＣＨ₃ＣＮに溶解し、０．０１Ｍ溶液が得られる。それ らの安定性はピリジン添加〔ピリジン−ＣＨ₃ＣＮ（１：９）中０．０２Ｍ、純 ピリジン中０．５Ｍ〕により改良される。 したがって、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート類は、３−アミノ−１， ２，４−ジチアゾール−５−チオン（１）、水素化キサンタン（２）およびそれ らの対応誘導体を用いて固相ホスホルアミダイト手法により効率よく製造される ことがわかる。化合物１および２は市販されており、ビューケイジ試薬やＥＤＩ ＴＨなどの一般に使われている硫化試薬と比較して安価である。 その高効率と低価格により、化合物１および２ならびにそれらの改変類似体は ビューケイジ試薬の代替として有利であり、特にオリゴヌクレオチドホスホロチ オエート類の大規模製造において有利である。 他の態様では、本発明は、本発明の新規硫黄転移試薬を用いてオリゴヌクレオ チドのヌクレオシド間結合に硫黄基を付加する新規な方法を提供するものである 。好ましい態様では、本発明の新規な方法は、少なくとも１つの硫化し得るヌク レオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを本発明の新規な硫黄転移試薬とヌ クレオシド間結合を硫化するに充分な時間接触させることからなる。 各硫化し得るヌクレオシド間結合は好ましくは燐（ＩＩＩ）原子を含有する。 とくに好ましい態様では、硫化し得るヌクレオシド間結合は、ホスファイト、チ オホスファイト、Ｈ−ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネート、またはアルキル ホスファイト（特にメチルホスファイト）ヌクレオシド間結合である。 好ましくは、硫化反応は、³¹Ｐ−ＮＭＲで測定して、先行技術における化合物 に期待されるよりも高い効率にて硫黄転移が行なわれる。そのような効率をも たらす典型的な合成条件は、新規な転移試薬を用いて約１〜約５分間反応させる ことにより達成される。典型的には反応をピリジン、ＴＨＦまたはそれらの混液 中で行なう。本発明においては、オリゴヌクレオチドなる語は、２またはそれ以 上の天然デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または２’−Ｏ−置換 リボヌクレオチドモノマー類またはそれらの組合せの線状ポリマーを含む。該オ リゴヌクレオチドなる語はまた化学的に修飾した塩基または糖および／またはホ スホジエステル結合またはその類似体が数モノマー単位（例えば２〜３）から数 百モノマー単位のサイズで結合した非ヌクレオシド類似結合および／またはさら に置換基を有するポリマー類も含み、それらは何らの制限のない親油性基、内位 添加剤、ジアミン類およびアダマンタンを含んでいる。特に、オリゴヌクレオチ ド類は、燐含有ヌクレオシド間結合を有する非天然オリゴマー類も含み、その燐 （ＩＩＩ）プリカーサーは硫化に適合している（タケシタら（Takeshita et.al. ，J．Biol．Chem．282:10171-10179(1987)を参照）。 本発明において「２’−Ｏ−置換」なる語はペントース基の２’位に１〜６個 の飽和または不飽和炭素原子を有する−Ｏ−低級アルキル基、または２〜６個の 炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基で置換されたものを意味し、そ のアルキル、アリール、アリル基は非置換でも、またハロゲン、ヒドロキシ、ト リフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カル ボキシ、カルボアルコキシ、またはアミノ基であるいはヒドロキシ、アミノまた はハロゲンで置換していてもよい。ただし、２’−Ｈ基ではない。 それらのオリゴヌクレオチド類は、公知のヌクレオシド間結合を有していても よく、何らの制限なく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキル ホスホネート（特にメチルホスホネート）、ホスホルアミド、アミド（ＰＮＡ） 、カルバメートおよびアルキルホスホノチオエート結合を含む。好ましい態様で は、オリゴヌクレオチドは固体担体に結合しているが、これらのオリゴヌクレオ チド類は溶液相で硫化してもよい。 これらの新規な硫黄転移試薬の効率は、ジヌクレオチドホスホロチオエート、 Ｓ’−ＤＭＴ−ＴＴ−ＯＨ−３’（図１）の固相によりまず評価された。合成は 、標準ホスホロチオエートプロトコールを１．０μｍｌの規模（ＴＨＩＯ １μ ｍ ｏｌ）で用いて行なわれた。ジヌクレオチドホスホロチオエートは逆相ＨＰＬＣ により分析した。その結果、化合物１および２を用いて硫黄転移効率は９９％以 上であった（図２および図３）。化合物３〜４も効率的な硫黄転移試薬であるこ とがわかった（図４〜５）。 化合物１および２の硫化試薬としての効果についてさらに評価するために、０ ．０２ＭＣＨ₃ＣＮ／ピリジン（９：１）中溶液を用い１．０μｍｏｌの規模に て、各合成サイクルで１〜２分間の硫化を行なってオリゴヌクレオチドホスホロ チオエート、５’−ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴ−３ ’（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．１）を合成した。ＣＰＧからアンモノリシスにて解離さ せ、脱保護したのち、粗製のオリゴヌクレオチドホスホロチオエートをイオン交 換ＨＰＬＣおよびＣＥにて分析した（図６〜８）。その結果、各ステップで９９ ％以上の硫黄転移効率が達成され、８０％以上の収率で合成できた（図３）。 実施例 本発明の好ましい態様について下記実施例で具体的に示すが、本発明はこれら に限定されない。 一般に、無水ピリジンおよびＣＨ₂Ｃｌ₂はアルドリッチ（Milwarkee，WT）よ り購入した。無水ＣＨ₃ＣＮはＪ．Ｔ．ベイカー社（Phillipsburg，NJ）から購 入した。ｄＴ−ＣＰＧ、５’−ＤＭＴ−チミジンシアノエチルホスホルアミダイ ト、ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、活性化剤、酸化および脱ブロック溶液はパーセプティ ブバイオシステムズ（PerSeptive Biosystems）（Framingham，MA）より購入し た。ビューケイジ試薬（³Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１− ジオキシド）は」Ｒ．Ｉ．ケミカル（Orange，CA）より購入した。他のすべての 化学物質はアルドリッチから購入した。³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトル（１２１．６５ ＭＨｚ）および¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ）はヴァリアンＵＮＩＴ Ｙ３００（化学シフトをそれぞれ８５％Ｈ₃ＰＯ₄およびテトラメチルシランにて 補正した）上に記録した。ジヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成を自動 核酸シンセサイザー（８９０９ Expedite^TM、Millipore，Bedford，MA）にて行 なった。 逆相ＨＰＬＣはウォーターズ６００Ｅポンプ上で、ウォーターズ４４０吸光度 検出器、ウォーターズ７４６インテグレイター、およびノバーパックＣ１８（３ ．９×１５０ｍｍ）カラムにて、ＣＨ₃ＣＮ−水性ＮＨ₄ＯＡｃ（０．１Ｍ）（４ ：１）および０．１Ｍ水性ＮＨ₄ＯＡｃの１：９〜３：２の直線勾配を用い、流 速２ｍＬ／分、２６０ｎｍ検出で行なった。イオン交換ＨＰＬＣ分析は、ベック マン１６６吸光度検出器を用いるベックマンSystems Gold １２６上でバッファ Ａ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ＣＨ₃ＣＮ、ｐＨ８）およびバ ッファＢ（２ＭＮａＣｌおよびバッファＡ）を１００％Ａから１００％Ｂの直線 勾配で用い、３分間、流速２ｍＬ／分、２５４ｍｍで検出の条件でＮＵＣＥＯＰ ＡＣＰＡ−１００カラム（４×５０ｍｍ）にて行なった。毛細管電気泳動はベッ クマンＰ／ＡＣＥシステム５０１０上で行なった。試料は５秒で注入し、４Ｏ分 間分析した。 化合物３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（１）は、ランカ スター、クレセントケミカルズ、およびメイブリッジを含む種々の化学会社から 市販されている９８％純度のものを、さらに精製することなくそのまま用いた。 化合物水素化キサンタン（２）はＴＣＩアメリカより市販されている純度９８ ％のものを、さらに精製することなくそのまま用いた。 実施例１ ３−Ｎ−アセチル−２−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３ ）の合成 純粋の酢酸無水物（１．４９ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を３−アミノ−１，２，４ −ジチアゾール−５−チオン（化合物１、２．０ｇ、１３ｍｍｏｌ）のピリジン −ＣＨ₃ＣＮ（１：５、５０ｍＬ）懸濁液中に３０分をかけて滴下した。得られ る澄明な黄色溶液を２５℃で１時間攪拌し、減圧濃縮した。得られた黄色固体を ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、１０％クエン酸水溶液（５００ｍＬ）、水 （２×５００ｍＬ）、ついで食塩水（５００ｍＬ）にて洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で 乾燥した。有機溶媒を蒸発させて、標記化合物の黄色固体を得た。収量２．５０ ｇ（９６％）、融点２２９．６−２３０．１℃実施例２ ３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５− チオン（４）の合成 純粋のトリメチル酢酸無水物（３．２０ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を３−アミノ− １，２，４−ジチアゾール−５−チオン（化合物１、２．０ｇ、１３ｍｍｏｌ） のＥｔ₃Ｎ−ＣＨ₂ＣＨ₂（１：５、３０ｍＬ）懸濁液中に１度に加えた。澄明な 黄色溶液が１０分で得られ、それを２５℃で２時間攪拌し、減圧濃縮した。得ら れた黄色固体をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶かし、１０％クエン酸水溶液（２ ×１００ｍＬ）、水（２×１００ｍＬ）、ついで食塩水（１００ｍＬ）にて洗浄 し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。有機溶媒を減圧留去させ、得られた黄色固体をヘキ サン（１００ｍＬ）で処理し、４℃で２時間保持した。その黄色沈殿物を濾取し 、ヘキサン（３×５ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥した。収量２．１７（７０％）、 融点１７９．６−１７９．６℃ 実施例３ ３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ ５）の合成 ３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（化合物１、１．０ｇ、 ６．６ｍｍｏｌ）をＥｔ₃Ｎ−ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：５、２０ｍＬ）中に懸濁させ、 これに安息香酸クロリド（０．９２ｍＬ、１．２等量）を加えた。澄明な黄色溶 液を５分で得た。その反応溶液を２５℃で２時間攪拌し、減圧濃縮して有機溶媒 を除去した。得られた黄色固体をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）にて処理し、不溶物 を濾過して除き、そのＥｔＯＡｃ層を１０％クエン酸水溶液（２×２００ｍＬ） 、水（２×２００ｍＬ）、ついで食塩水（２００ｍＬ）にて洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄ で乾燥した。ＥｔＯＡｃを蒸発させて黄色固体を得、それをＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ ｍＬ）で処理し、ついでヘキサン（１００ｍＬ）を加えた。得られた固体を濾去 し、濾液を減圧蒸留して黄色固体を得た。収量１．１７ｇ（７０％） 実施例４ ３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５− チオン（６）の合成 安息香酸クロリドの代わりにベンゼンスルホニルクロリドを用いた以外は化合 物５の製造の場合と同様に処理した。収量：１．４６ｇ（７６％） 実施例５ 水素化キサンタン、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンおよ びそれらの誘導体のＣＨ₃ＣＮ中の安定性および溶解性の検討 溶解性および安定性の検討を、すべての場合について、ＣＨ₃ＣＮ、ピリジン −ＣＨ₃ＣＮ（１：９）およびピリジン中で２５℃で行なった。飽和溶液を乾燥 し、その溶解性を試験溶液の実際量中の試験化合物の重量で決定した。安定性は ＴＬＣまたはＨＰＬＣ分析のいずれかにより決定した。 実施例６ ジヌクレオチドホスホロチオエートの合成 出発物質としてＤＭＩ−Ｔ−Ｓｕ−ＣＰＧ（５００Å、充填６０μｍｏｌ／ｇ ）を用い、合成プロトコール”ＴＨＩＯ１μｍｏｌ”（Expedite software verr ionl．０１）にて０．１μｍｏｌのスケールにてPerSeptiveＤＮＡ／ＲＮＡ（Mi llipore ８９０９ Expedite、Millipore，Bedford，MA）上でダイマーを 組み立てた。硫化試薬は、ＣＨ₃ＣＮまたはピリジン−ＣＨ₃ＣＮ（１：９）のい ずれかで、特に断らない限り０．０２Ｍの濃度にて調製した。硫化は、４等量ま たは１２等量の硫化試薬を用い、各々１または５分間行なった。濃水酸化アンモ ニウム（１μｍｏｌ／１ｍＬ）を用い２５℃で１時間処理して最終の開裂を行な った。ＣＰＧおよび他の不溶残留物を濾去し、水酸化アンモニウム溶液を凍結乾 燥した。ＨＰＬＣ分析は、０．１Ｍ水性ＮＨ₄ＯＡｃおよびＣＨ₃ＣＮ−水性ＮＨ₄ ＯＡｃ（０．１Ｍ）（４：１）の１：９〜３：２の直線勾配にて、４０分間、 流速１．０ｍＬ／分、２６０ｍｍ検出により行なった。５’−ＯＭＴ−Ｔ（Ｐ＝ Ｓ）−Ｔ−ＯＨ−３’ジアステレオマーがｔ_R＝３１．６分およびｔ_R＝３１．７ 分で溶出された。対応するＰ＝Ｏダイマーはｔ_R＝２８．４分で溶出された（図 １）。 実施例７ オリゴヌクレオチドホスホロチオエート（５’−ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴ ＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ．１））の合成 ジヌクレオチドホスホロチオエート合成で記載したと同じプロトコールにした がって、鎖組み立てを行なった。硫化試薬（化合物１）は０．０２Ｍピリジン− ＣＨ₃ＣＮ（１：９）溶液で用い、硫化は１２等量で１または２分間行なった。 イオン交換ＨＰＬＣおよびＣＥ分析をこのオリゴマー合成の評価のために行なっ た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジャン，ジョアダ アメリカ合衆国01545マサチューセッツ州 シュルーズベリー、コモン・ドライブ・ナ ンバー43、60番 (72)発明者 タン，ジン−ヤン アメリカ合衆国01545マサチューセッツ州 シュルーズベリー、サンドパイパー・ドラ イブ15番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式Ｉの構造を有する硫黄転移試薬： 式中、ＸはＲ¹、ＮＲ²Ｒ³、ＮＲ⁴ＣＯＲ⁵、ＳＲ⁶またはＯＲ⁷を示し、Ｒ¹、Ｒ² 、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は各々独立してＨまたはアルキルまたは芳香族有機基であ る。 ２．式Ｉが３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、水素化キサン タン、３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン 、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５− チオン、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チ オンまたは３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾー ル−５−チオンである。請求項１の硫黄転移試薬。 ３．式ＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬： 式中、Ｒ⁸はＨまたは有機基、Ｒ⁹は有機基である。 ４．式ＩＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬： 式中、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は各々独立してＨまたは有機基である。 ５．式ＩＩＩが３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、水素化キ サンタン、３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チ オン、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール− ５−チオン、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５ −チオンまたは３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチア ゾール−５−チオンである。請求項４の硫黄転移試薬。 ６．少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドを、 請求項１の新規な硫黄転移試薬とヌクレオシド間結合を硫化するに充分な時間接 触させることを特徴とする、ヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫黄基を付加 する方法。 ７．各硫化し得るヌクレオチド間結合が燐（ＩＩＩ）原子を含有する請求項６の 方法。 ８．該硫化し得るヌクレオシド間結合が、ホスファイト、チオホスファイト、Ｈ −ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネートまたはアルキルホスファイトヌクレオ シド間結合である請求項７の方法。 ９．硫化反応を約１分〜約５分行なう請求項８の方法。 １０．少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドを 請求項２の新規な硫黄転移試薬と硫化し得るヌクレオシド間結合を硫化するに充 分な時間接触させることを特徴とする、ヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫 黄基を付加する方法。 １１．各硫化し得るヌクレオシド間結合が燐（ＩＩＩ）原子を含有する請求項１ ０の方法。 １２．該硫化し得るヌクレオシド間結合が、ホスファイト、チオホスファイト、 Ｈ−ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネートまたはアルキルホスファイトヌクレ オシド結合である請求項１１の方法。 １３．硫化反応を約１分〜約５分行なう請求項１２の方法。 １４．少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドを 請求項３の新規な硫黄転移試薬と硫化し得るヌクレオシド間結合を硫化するに十 分な時間接触させることを特徴とする、ヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫 酸基を付加する方法。 １５．各硫化し得るヌクレオシド間結合が燐（ＩＩＩ）原子を含有する請求項１ ４の方法。 １６．該硫化し得るヌクレオシド間結合が、ホスファイト、チオホスファイトＨ −ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネートまたはアルキルホスファイトヌクレオ シド間結合である請求項１５の方法。 １７．硫化反応を約１分〜５分行なう請求項１６の方法。 １８．少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドを 請求項４の新規な硫黄転移試薬とヌクレオシド間結合を硫化するに充分な時間接 触させることを特徴とする、ヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫黄基を付加 する方法。 １９．各硫化し得るヌクレオシド間結合が燐（ＩＩＩ）原子を含有する請求項１ ８の方法。 ２０．該硫化し得るヌクレオシド間結合が、ホスファイト、チオホスファイト、 Ｈ−ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネートまたはアルキルホスファイトヌクレ オシド間結合である請求項１９の方法。 ２１．硫化反応を約１分〜約５分間行なう請求項２０の方法。 ２２．少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドを 請求項５の新規な硫黄転移試薬と硫化し得るヌクレオシド間結合を硫化するに充 分な時間接触させることを特徴とする、ヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫 黄基を付加する方法。 ２３．各硫化し得るヌクレオシド間結合が燐（ＩＩＩ）原子を含有する請求項２ ２の方法。 ２４．該硫化し得るヌクレオシド間結合が、ホスファイト、チオホスファイト、 Ｈ−ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネート、またはアルキルホスファイトヌク レオシド間結合である請求項２３の方法。 ２５．硫化反応を約１分〜約５分行なう請求項２４の方法。