KR20220032004A

KR20220032004A - DUX4 프리-mRNA의 스플라이싱을 변화시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20220032004A
Application number: KR1020217040852A
Authority: KR
Inventors: 마코토 고이즈미; 아키후미 나카무라; 다카히로 가타기리; 히로아키 미츠하시
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤; 토카이 유니버시티 에듀케이셔널시스템
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2022-03-15
Also published as: EP3998108A1; US20220364086A1; TW202117015A; CN114026234A; BR112021024764A2; CA3142925A1; JPWO2021010301A1; WO2021010301A1; IL288596A; AU2020313255A1

Abstract

안면견갑상완형 근이영양증의 새로운 치료법을 확립한다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DUX4-fl mRNA의 뉴클레오티드 번호 502∼556 또는 578∼612의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기 수 15∼30의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단 및/또는 3' 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 올리고뉴클레오티드로서, DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염. 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 의약(예를 들면, 안면견갑상완형 근이영양증 치료약).

Description

DUX4 프리-mRNA의 스플라이싱을 변화시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드

본 발명은 DUX4 프리(pre)-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 변화시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

안면견갑상완형 근이영양증(Facioscapulohumeral muscular dystrophy: FSHD)은 안면협부, 견갑골 주위, 상완의 근육에 강한 근 위축, 근력 저하를 나타내는 근이영양증이다(비특허문헌 1: Tawil R. and Van Der Maarel S.M. Muscle Nerve 2006, 34:1-15). 발증 시기는 0세부터 60대로 매우 폭넓지만, 일반적으로 10대 무렵부터 손목을 올리기 어렵고, 휘파람을 불 수 없고, 표정이 결핍한 등의 증상으로 발증한다. 증상의 진행은 완만하지만, 서서히 하지에도 장해가 미치고, 보행에 지장이 생기는 경우도 많다. 또, 근육의 장해의 정도는 좌우에서 상이한 경우가 많다. 근 병리 소견으로는 근이영양증에서 일반적으로 볼 수 있는 근 섬유의 괴사나 재생이 확인되는 것 외에 염증 세포의 침윤이 보이는 경우가 있다(비특허문헌 2: Arahata et al., Muscle Nerve 1995, 2:S56-S66). 골격근의 증상에 더하여 신경성 난청이나 망막증의 합병도 많이 확인된다(비특허문헌 3: Padberg et al., Muscle Nerve 1995, 2:S73-S80). 뒤센(Duchenne)형 근이영양증은 근 강직형 근이영양증에 이어서 빈도가 높은 근 질환으로 생각되고 있고, 유병률은 구미에서는 1.4만명에서 2만명에 1명으로 보고되어 있다(비특허문헌 4: Padberg et al., Muscle Nerve 1995, 2:S81-S84; Flanigan et al., Neuromuscul Disord 2001, 11:525-529; 비특허문헌 5: Mostacciuolo et al., Clin Genet 2009, 75:550-555; 비특허문헌 6: Norwood et al, Brain 2009, 132:3175-3186; 비특허문헌 7: Deenen et al., Neurology 2014, 83:1056-1059).

FSHD의 원인이 되는 유전적 소인은 매우 복잡하지만, 2010년에 Lemmers 등에 의해 발표된 「DUX4 유전자의 탈억제」설이 현재 넓리 신뢰되고 있다(비특허문헌 8: Lemmers et al., Science 2010, 329:1650-1653). FSHD는 우성 유전의 형식을 취하고, 병기는 제4번 염색체 장완(長腕)의 말단(4q35 영역)에 연쇄(連鎖)한다(비특허문헌 9: Wijmenga et al., Nat Genet 1992, 2:26-30). 이 4q35 영역에는 D4Z4로 불리는 3.3 kb의 서열이 반복된 영역(D4Z4 리피트(repeat))이 존재하며, 정상에서는 11-100회 반복하고, 고도로 DNA 메틸화된 헤테로크로마틴 상태를 취하고 있다. FSHD 환자의 약 95%에서는 한쪽의 제4번 염색체의 D4Z4 리피트가 10회 이하로 단축하고, 그 결과 4q35 영역의 DNA 메틸화가 감소하고 있다(비특허문헌 10: van Overveld et al., Nat Genet 2003, 35:315-317). 이 D4Z4 리피트의 단축이 보여지는 형태를 FSHD 1형으로 부른다. 또, 약 5%의 FSHD 환자에서는 D4Z4 리피트 수는 정상적이지만, DNA 메틸화의 감소가 일어나고 있고, FSHD 2형으로 불린다. 현재, FSHD 2형에서의 메틸화 감소의 원인은 D4Z4 리피트의 메틸화에 관련되는 SMCHD1 유전자의 기능 결손 변이에 의함을 알고 있다(비특허문헌 11: Lemmers et al., Nat Genet 2012, 44:1370-1374).

D4Z4 서열 중에는 전사 인자 단백질을 코드하는 개방해독틀(ORF)이 존재하며, DUX4로 불린다(비특허문헌 12: Gabriels et al., Gene 1999, 236:25-32). 골격근에서의 DUX4의 발현은 이하의 2개의 조건이 갖추어진 경우에만 고빈도로 일어난다. 첫번째는 D4Z4 영역의 DNA 메틸화가 감소하여 헤테로크로마틴 구조가 느슨해지는 것이다. 두번째는 D4Z4 리피트의 3' 측에 존재하는 4qA, 4qB로 불리는 하플로타입(haplotype)이 4qA인 것이다(비특허문헌 13: Lemmers et al., Am J Hum Genet 2007, 81:884-894). 4qA 서열은 폴리A 부가 서열(ATTAAA)을 포함하고 있고, DUX4의 mRNA를 안정화시키는 폴리A 부가 서열로서 작용한다(비특허문헌 14: Lemmers et al., Science 2010, 329:1650-1653). 4qB 서열은 폴리A 부가 서열을 포함하지 않기 때문에, 4qB 서열을 갖는 대립유전자(allele)의 D4Z4 리피트가 10 이하로 단축된 인간에서는 FSHD를 발증하지 않는다.

DUX4는 전사 인자를 코드하고 있고, 선택적 스플라이싱에 의해 DUX4-fl과 DUX4-s라고 하는 전사 산물을 생성할 수 있다(비특허문헌 15: Snider et al., PLoS Genet 2010, 6:e1001181). FSHD 환자에서는 고빈도로 전장형의 DUX4-fl이 발현하고 있고(비특허문헌 16: Jones et al., Hum Mol Genet 2012, 21:4419-4430), C 말단의 전사 활성화 도메인을 통해 강력한 전사 활성화능을 발휘한다(비특허문헌 17: Choi et al., Nucleic Acids Res 2016, 44:5161-5173; 비특허문헌 18: Mitsuhashi et al., Biol Open 2018, 7:bio033977). 한편, 쇼트(short)형의 DUX4-s는 정상인 유래의 세포에 있어서도 약간 발현이 확인되지만, 전사 활성화 도메인을 갖지 않기 때문에, 전사 인자로서 기능하지 않는다. DUX4-fl 단백질은 PRAMEF2, TRIM43, ZSCAN4 등 초기 배나 정소에서 발현하는 유전자의 발현을 활성화시킨다(비특허문헌 19: Geng et al., Dev Cell 2012, 22:38-51). DUX4-fl의 발현은 아폽토시스(apoptosis)(비특허문헌 20: Kowaljow et al., Neuromuscul Disord 2007, 17:611-623; 비특허문헌 21: Wallace et al., Ann Neurol 2011, 69:540-552)나 근 발생 이상(비특허문헌 22: Bosnakovski et al., EMBO J 2008, 27:2766-2779; 비특허문헌 23: Banerji et al., Nat Commun 2017, 8:2152), 난센스 코돈 개재(介在) mRNA 분해의 저해(비특허문헌 24: Feng et al., eLife 2015, 4:e04996), 세포내 2본쇄(二本鎖) RNA의 형성(비특허문헌 25: Shadle et al., PLoS Genet 2017, 13:e1006658), 단백질 응집(비특허문헌 26: Homma et al., Ann Clin Transl Neurol 2015, 2:151-166) 등을 일으키는 것이 보고되어 있다. 초파리(비특허문헌 27: Jones et al., PLoS One 2016, 11:e0150938), 제노푸스(비특허문헌 28: Wuebbles et al. Int J Clin Exp Pathol 2010, 3:386-400), 제브라피쉬(비특허문헌 29: Mitsuhashi et al., Hum Mol Genet 2013, 22:568-577), 마우스(비특허문헌 30: Jones and Jones, PLoS One 2018, 13:e0192657; 비특허문헌 31: Bosnakovski et al., Nat Commun 2017, 8:550)에 DUX4-fl을 발현시킨 개체 모델에 있어서도 세포 독성이나 FSHD에 유사한 증상을 유발하는 것이 나타나 있어, DUX4-fl이 FSHD의 발증에 관여하고 있다고 생각되고 있다. 또한, DUX4의 생리적인 기능으로서 초기 배 발생 시기의 4 세포기 특이적으로 발현하고, 상술한 ZSCAN4 등을 포함하는 난할기 특이적 유전자군을 활성화하는 마스터 전사 인자인 것이 나타났지만, 그 상세에 대해서는 아직 충분히 알고 있지 않다(비특허문헌 32: De laco et al., Nat Genet 2017, 49:941-945; 비특허문헌 33: Hendrickson et al., Nat Genet 2017, 49:925-934).

DUX4-fl과 DUX4-s는 N 말단 측에 공통의 DNA 결합 도메인을 갖고 있다. 그 때문에, DUX4-fl과 DUX4-s가 동시에 존재하는 경우, 동일한 DNA에 경합적으로 결합한다고 생각된다. 배양 세포를 이용한 실험에서는 DUX4-fl과 DUX4-s를 1:1 비율로 유전자 도입한 경우, DUX4-fl에 의한 루시퍼라아제(luciferase)의 활성화가 약 20%로 억제되었다(비특허문헌 34: Geng et al., Dev Cell 2012, 22:38-51). 또, DUX4-fl과 동시에 20배 양의 DUX4-s를 제브라피쉬에 도입한 실험에서는 DUX4-fl에 의한 근이영양증 모양 증상이 경감되었다(비특허문헌 35: Mitsuhashi et al., Hum Mol Genet 2013, 22:568-577). DUX4-s는 전사 촉진 활성이 없기 때문에, 표적 유전자에 대해 경합 저해가 일어난 결과라고 생각된다.

Tawil R. and Van Der Maarel S.M. Muscle Nerve 2006, 34:1-15 Arahata et al., Muscle Nerve 1995, 2:S56-S66 Padberg et al., Muscle Nerve 1995, 2:S73-S80 Padberg et al., Muscle Nerve 1995, 2:S81-S84; Flanigan et al., Neuromuscul Disord 2001, 11:525-529 Mostacciuolo et al., Clin Genet 2009, 75:550-555; Norwood et al, Brain 2009, 132:3175-3186 Norwood et al, Brain 2009, 132:3175-3186 Deenen et al., Neurology 2014, 83:1056-1059 Lemmers et al., Science 2010, 329:1650-1653 Wijmenga et al., Nat Genet 1992, 2:26-30 van Overveld et al., Nat Genet 2003, 35:315-317 Lemmers et al., Nat Genet 2012, 44:1370-1374 Gabriels et al., Gene 1999, 236:25-32 Lemmers et al., Am J Hum Genet 2007, 81:884-894 Lemmers et al., Science 2010, 329:1650-1653 Snider et al., PLoS Genet 2010, 6:e1001181 Jones et al., Hum Mol Genet 2012, 21:4419-4430 Choi et al., Nucleic Acids Res 2016, 44:5161-5173 Mitsuhashi et al., Biol Open 2018, 7:bio033977 Geng et al., Dev Cell 2012, 22:38-51 Kowaljow et al., Neuromuscul Disord 2007, 17:611-623 Wallace et al., Ann Neurol 2011, 69:540-552 Bosnakovski et al., EMBO J 2008, 27:2766-2779 Banerji et al., Nat Commun 2017, 8:2152 Feng et al., eLife 2015, 4:e04996 Shadle et al., PLoS Genet 2017, 13:e1006658 Homma et al., Ann Clin Transl Neurol 2015, 2:151-166 Jones et al., PLoS One 2016, 11:e0150938 Wuebbles et al. Int J Clin Exp Pathol 2010, 3:386-400 Mitsuhashi et al., Hum Mol Genet 2013, 22:568-577 Jones and Jones, PLoS One 2018, 13:e0192657 Bosnakovski et al., Nat Commun 2017, 8:550 De laco et al., Nat Genet 2017, 49:941-945 Hendrickson et al., Nat Genet 2017, 49:925-934 Geng et al., Dev Cell 2012, 22:38-51 Mitsuhashi et al., Hum Mol Genet 2013, 22:568-577

본 발명은 안면견갑상완형 근이영양증의 새로운 치료법을 확립하는 것을 목적으로 한다.

DUX4-fl과 DUX4-s는 1개의 DUX4 유전자로부터 전사되는 상이한 스플라이싱 이소형(isoform)이기 때문에, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하고(도 1), 상대적인 DUX4-fl의 전사량을 감소시킴으로써 세포사를 억제할 수 있는 가능성이 있다. 본 발명은 이 착상에 근거하여 완성된 것이다.

본 발명의 요지는 이하와 같다.

(1) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DUX4-fl mRNA의 뉴클레오티드 번호 502∼556 또는 578∼612의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기 수 15∼30의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단 및/또는 3' 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 올리고뉴클레오티드로서, DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(2) 서열번호 2∼85 중 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 (1) 기재의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(3) 올리고뉴클레오티드의 염기 수가 16∼18인 (1) 또는 (2)에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(4) 올리고뉴클레오티드의 염기 수가 18인 (3) 기재의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(5) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당 및/또는 인산 디에스테르 결합 중 적어도 1개가 수식되어 있는 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(6) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2' 위(位)의 수산기의 수식인 (5) 기재의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(7) 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-O,4'-C-알킬렌화인 (6) 기재의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(8) 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-메틸화 및/또는 2'-O,4'-C-에틸렌화인 (6)에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(9) 인산 디에스테르 결합의 수식이 포스포로티오에이트인 (5)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(10) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 506에서 549의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기 수 15∼30의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(11) 서열번호 5∼31 중 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 (10) 기재의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(12) 이하 중 어느 하나의 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염;

HO-G^m1s-G^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-C^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-006);

HO-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-A^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-C^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1t-H (DUX4-009);

HO-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-A^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1t-H (DUX4-011);

HO-G^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1t-H (DUX4-014);

HO-G^m1s-A^e2s-G^m1s-C^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-G^e2s-C^m1t-H (DUX4-036);

HO-G^m1s-G^e2s-A^m1s-G^m1s-C^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1s-U^m1sG^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-G^m1t-H (DUX4-037);

HO-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-C^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1t-H (DUX4-040);

HO-C^m1s-G^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-C^m1s-A^e2s-G^m1t-H (DUX4-044);

HO-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-A^m1t-H (DUX4-047);

HO-C^m1s-G^e2s-A^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1t-H (DUX4-048);

HO-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1t-H (DUX4-049);

HO-U^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-052);

HO-G^m1s-T^e2s-G^m1s-U^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-053);

HO-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.7);

HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.10);

HO-C^m1s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-A^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.11);

HO-C^e2s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.12);

HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.14);

HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.15);

HO-C^m1s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.19);

HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.20);

HO-T^e2s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^e2T-H (DUX4-52.1);

HO-T^e2s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1t-H (DUX4-52.2);

HO-T^e2s-G^m1s-U^m1s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^e2T-H (DUX4-52.7);

HO-U^m1s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-52.9)

[상기의 서열 중, A^e2s, G^e2s, C^e2s 및 T^e2s는 3' 측에 인접하는 구조와 포스포로티오에이트 결합한 대응하는 ENA(C의 염기 부위는 5-메틸시토신임)를 표시한다. A^m1s, G^m1s, C^m1s, U^m1s는 3' 측에 인접하는 구조와 포스포로티오에이트 결합한 대응하는 2'-OMe-RNA를 표시한다. C^e2t는 3' 측에 인접하는 구조와 인산 디에스테르 결합한 대응하는 ENA(C의 염기 부위는 5-메틸시토신임)를 표시한다. A^m1t, G^m1t, C^m1t는 3' 측에 인접하는 구조와 인산 디에스테르 결합한 대응하는 2'-OMe-RNA를 표시한다].

(13) 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 지방산을 포함하는 아미노알킬 인산기가 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 (1)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(14) 지방산이 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 및 베헨산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 (13)에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(15) DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료에서의 사용을 위한 것인 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(16) DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이 면견갑상완형 근이영양증인 (15)에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.

(17) (1)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 의약.

(18) (1)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함한, DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료약.

(19) DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이, 면견갑상완형 근이영양증인 (18)에 기재된 치료약.

(20) (1)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하는 약제.

(21) (1)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 대상에게 투여하는 것에 의한 상기 대상에서의 DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료 방법.

(22) DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이 면견갑상완형 근이영양증인 (21)에 기재된 치료 방법.

(23) DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료약의 제조를 위한 것인 (1)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염의 사용.

(24) DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이 면견갑상완형 근이영양증인 (22)에 기재된 사용.

본 발명에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환함으로써 DUX4-fl의 전사량을 감소시킬 수 있다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 특원2019-129735의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하는 방법을 나타내는 도면이다.
도 2는 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체(minigene construct)와 실시예의 화합물(DUX4-004 내지 DUX4-010)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 3은 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-011 내지 DUX4-016)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석.
도 4는 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-022 내지 DUX4-030)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 5는 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-031 내지 DUX4-040)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 6은 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-041 내지 DUX4-050)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 7은 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-051 내지 DUX4-058)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 8a는 DUX4가 전사를 활성화하는 표적 유전자(상단: ZSCAN4, 하단: MBD3L2, TRIM43)의 발현량을 나타내는 그래프이다. 세로축은 내부 표준인 RPL13A 유전자의 발현량에 대한 상대 발현 레벨이다. 도면 중, 「NO」는 DUX4 미니진 구조체, 실시예의 화합물(DUX4-009, DUX4-031, DUX4-036, DUX4-048) 모두 형질주입하지 않은 세포, 「D4Z4」는 DUX4 미니진 구조체만을 형질주입한 세포, 「DUX4-009」, 「DUX4-031」, 「DUX4-036」및 「DUX4-048」은 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-009, DUX4-031, DUX4-036, DUX4-048)의 양방(兩方)을 형질주입한 세포 각각의 상대 발현 레벨을 나타낸다. 실험은 N=3으로 행하고, 결과의 해석은 D4Z4와 비교한 던넷(Dunnett) 검정에 의해 p<0.05의 경우에는 "*", p<0.01의 경우에는 "**"를, p<0.001의 경우에는 "***"를 각각 부여하였다.
도 8b는 DUX4가 전사를 활성화하는 표적 유전자(상단: ZSCAN4, 하단: MBD3L2, TRIM43)의 발현량을 나타내는 그래프이다. 세로축은 내부 표준인 RPL13A 유전자의 발현량에 대한 상대 발현 레벨이다. 도면 중, 「NO」는 DUX4 미니진 구조체, 실시예의 화합물(DUX4-48.7, DUX4-48.11, DUX4-48.12, DUX4-48.13, DUX4-52.2) 모두 형질주입하지 않은 세포, 「D4Z4」는 DUX4 미니진 구조체만을 형질주입한 세포, 「DUX4-48.7」, 「DUX4-48.11」, 「DUX4-48.12」, 「DUX4-48.13」및 「DUX4-52.2」는 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-48.7, DUX4-48.11, DUX4-48.12, DUX4-48.13, DUX4-52.2)의 양방을 형질주입한 세포 각각의 상대 발현 레벨을 나타낸다. 실험은 N=3으로 행하고, 결과의 해석은 D4Z4와 비교한 던넷 검정에 의해 p<0.05의 경우에는 "*", p<0.01의 경우에는 "**"를, p<0.001의 경우에는 "***"를 각각 부여하였다.
도 9는 D4Z4 mRNA를 주입한 제브라피쉬 수정란에서의 PCR 산물을 나타내는 도면이다. RT(1)은 역전사 반응 전, RT(+)는 역전사 반응 후의 RNA 샘플의 결과를 나타낸다. 「D4」는 DUX4 미니진 구조체만을 주입한 수정란, 「D4 + DUX4-048」은 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-048)의 양방을 주입한 수정란 각각의 PCR 산물을 나타낸다. 「M1」, 「M2」는 마커를 나타내고, [UI]는 주입하지 않은 수정란으로부터의 PCR 산물을 나타낸다.
도 10은 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-48.1 내지 DUX4-48.10)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 11은 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-48.11 내지 DUX4-48.13, DUX4-52.1 및 DUX4-52.2)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 12는 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-48.14 내지 DUX4-48.23, 및, DUX4-048)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.
도 13은 HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-52.3 내지 DUX4-52.12, 및, DUX4-052)을 형질주입한 결과, 얻어진 DUX4 전사 산물의 겔 전기영동에 의한 해석이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DUX4-fl mRNA의 뉴클레오티드 번호 502∼556 또는 578∼612의 영역(바람직하게는, 506∼549의 영역)에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기 수 15∼30의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단 및/또는 3' 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 올리고뉴클레오티드로서, DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 약학상 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제공한다.

DUX4-fl mRNA의 서열 정보는 GenBank에 등록되어 있고, 등록 번호(accession number)는 HQ266761이다. 그 염기 서열을 서열목록의 서열번호 1에 나타낸다. DUX4-s mRNA의 서열은 서열번호 1의 염기 서열의 염기 번호 1∼477의 서열이다.

DUX4-fl과 DUX4-s는 1개의 DUX4 유전자로부터 전사되는 상이한 스플라이싱 이소형이며, DUX4-fl은 전장형(약 55 kDa), DUX4-s는 쇼트형(약 20 kDa)이다. DUX4-fl은 C 말단의 전사 활성화 도메인을 통해 강력한 전사 활성화능을 발휘하며, DUX4-fl이 FSHD의 발증에 관여하고 있다고 생각되고 있다. 한편, 쇼트형의 DUX4-s는 정상인 유래의 세포에 있어서도 약간 발현이 확인되지만, 전사 활성화 도메인을 갖지 않기 때문에 전사 인자로서 기능하지 않는다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환할 수 있다. DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환함으로써, 상대적인 DUX4-fl의 전사량을 감소시킴으로써 세포사를 억제할 수 있고, 안면견갑상완형 근이영양증의 치료 효과를 기대할 수 있다. DUX4-fl은 통상 인트론을 포함하지 않지만, 인트론 1이 잔류한 것을 발현하는 환자가 존재한다. 따라서, DUX4-fl은 인트론을 포함하는 것이어도, 포함하지 않는 것이어도 된다. DUX4-fl로부터 DUX4-s로의 변환의 정도는 한정되지 않지만, 변환율이 10% 이상인 것이 바람직하고, 25% 이상인 것이 보다 바람직하다. DUX4-fl로부터 DUX4-s로의 변환의 정도는 이하와 같은 방법으로 측정할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 세포에 형질주입하고, 형질주입한 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 역전사 반응을 행한 후, DUX4-fl 및 DUX4-s의 양방을 증폭하는 프라이머를 이용한 PCR 반응으로 2본쇄 DNA로 한다. 이것을 겔 전기영동으로 DUX4-fl 및 DUX4-s로부터 증폭한 2본쇄 DNA를 2개의 밴드로서 분리하고, 밴드를 가시화하여 변환의 정도를 측정할 수 있다. 그 때에, 에티디움브로마이드, SYBR Green 등을 사용해 가시화하는 경우, 증폭한 2본쇄 DNA의 크기에 따라 가시화의 정도가 상이하기 때문에, 변환의 정도를 판단하는데 유의할 필요가 있다. 또, DUX4-fl 및 DUX4-s에 특이적인 TaqMan 프로브를 작성하고, 정량적 PCR를 행함으로써, DUX4-fl 및 DUX4-s의 mRNA 양을 정량함으로써 변환의 정도를 측정할 수도 있다. 샘플 중의 DUX4-fl 및 DUX4-s 단백질을 웨스턴 블롯법으로 검출하거나, DUX4-fl 및 DUX4-s 단백질에 특이적인 펩티드 단편을 질량분석법으로 검출하거나 함으로써 변환의 정도를 측정할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 2∼85(바람직하게는, 서열번호 5∼31) 중 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것을 예시할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 염기 수는 15∼30이 적당하고, 16∼18이 바람직하고, 18이 보다 바람직하다.

본 발명이 바람직한 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 506에서 549의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기 수 15∼30의 올리고뉴클레오티드를 예시할 수 있고, 본 발명의 보다 바람직한 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 5∼31 중 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 예시할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA의 키메라, 이들 수식체의 어느 하나이어도 되지만, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드의 적어도 1개가 수식 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

본 발명에서의 수식 뉴클레오티드로는 당이 수식된 것(예를 들면, D-리보푸라노오스의 2' 위의 수산기가 수식된 것(D-리보푸라노오스가 2'-O-알킬화된 것, D-리보푸라노오스가 2'-,4'-가교화된 것(D-리보푸라노오스가 2'-O,4'-C-알킬렌화된 것 등) 등), 인산 디에스테르 결합이 수식된 것(예를 들면, 티오에이트화, 염기가 수식된 것), 그들을 조합한 것 등을 예시할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1개의 D-리보푸라노오스가 2'-O-알킬화(예를 들면, 2'-O-메틸화)된 것이나 2'-O,4'-C-알킬렌화(예를 들면, 2'-O,4'-C-에틸렌화)된 것은 RNA에 대한 결합력이 높은 것, 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 것으로부터 천연형의 뉴클레오티드(즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA)보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 또, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1개의 인산 디에스테르 결합이 티오에이트화된 것도 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 것으로부터 천연형의 뉴클레오티드(즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA)보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 상기와 같은 수식된 당과 수식된 인산의 양자를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 내성이 보다 높은 것으로부터 더욱 높은 치료 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)에 대하여, 당의 수식의 예로는 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화(예를 들면, 2'-O-메틸화, 2'-O-아미노에틸화, 2'-O-프로필화, 2'-O-알릴화, 2'-O-메톡시에틸화, 2'-O-부틸화, 2'-O-펜틸화, 2'-O-프로파길화 등); D-리보푸라노오스의 2'-O,4'-C-알킬렌화(예를 들면, 2'-O,4'-C-에틸렌화, 2'-O,4'-C-메틸렌화, 2'-O,4'-C-프로필렌화, 2'-O,4'-C-테트라메틸렌화, 2'-O,4'-C-펜타메틸렌화 등), S-cEt(2',4'-constrained ethyl), AmNA(Amide-bridged nucleic acid) 등의 2'-,4'-가교화; D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C,4'-C-메틸렌옥시메틸렌화, 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시-D-리보푸라노오스, 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시-2'-플루오로-D-리보푸라노오스 등의 2' 데옥시화와 그 외의 수식의 조합 등을 들 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)에 대하여, 인산 디에스테르 결합의 수식의 예로는 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 결합, 메틸티오포스포네이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 포스포르아미데이트 결합 등을 들 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)에 대하여, 염기의 수식의 예로는 시토신의 5-메틸화, 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오도화, N4-메틸화, 티민의 5-데메틸화(우라실), 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오도화, 아데닌의 N6-메틸화, 8-브로모화, 구아닌의 N2-메틸화, 8-브로모화 등을 들 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드잔기로는 후술하는 실시예에 구조를 기재하는 A^t, G^t, 5meC^t, C^t, T^t, U^t, A^p, G^p, 5meC^p, C^p, T^p, U^p, A^s, G^s, 5meC^s, C^s, T^s, U^s, A^m1t, G^m1t, C^m1t, 5meC^m1t, U^m1t, A^m1p, G^m1p, C^m1p, 5meC^m1p, U^m1p, A^m1s, G^m1s, C^m1s, 5meC^m1s, U^m1s, A^2t, G^2t, C^2t, T^2t, A^e2p, G^e2p, C^e2p, T^e2p, A^e2s, G^e2s, C^e2s, T^e2s, A^1t, G^1t, C^1t, T^1t, A^e1p, G^e1p, C^e1p, T^e1p, A^e1s, G^e1s, C^e1s, T^e1s, A^3t, G^3t, C^3t, T^3t, A^e3p, G^e3p, C^e3p, T^e3p, A^e3s, G^e3s, C^e3s, T^e3s, A^m2t, G^m2t, 5meC^m2t, T^m2t, A^m2p, G^m2p, 5meC^m2p, T^m2p, A^m2s, G^m2s, 5meC^m2s, T^m2s를 들 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드로서 적합한 것은 표 1∼3에 나타내는 올리고뉴클레오티드이고, 보다 적합한 것은 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드이다.

HO-U^m1s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-52.9).

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 시판되는 합성기(예를 들면, 퍼킨엘머사의 포스포르아미다이트법에 의한 모델 392) 등을 이용하고, 문헌(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))에 기재된 방법에 준해 합성할 수 있다. 그 때에 이용되는 포스포르아미다이트 시약은 천연형의 뉴클레오시드 및 2'-O-메틸뉴클레오시드(즉, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸아데노신, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸우리딘)에 대해서는 시판되는 시약을 이용할 수 있다. 알킬기의 탄소수가 2∼6개인 2'-O-알킬구아노신, 아데노신, 시티딘 및 우리딘에 대해서는 이하와 같다.

2'-O-아미노에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 문헌(Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725)에 따라 합성할 수 있다.

2'-O-프로필구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌(Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838)에 따라 합성할 수 있다.

2'-O-알릴구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 시판되는 시약을 이용할 수 있다.

2'-O-메톡시에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 특허(US6261840) 또는 문헌(Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504)에 따라 합성할 수 있다.

2'-O-부틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 문헌(Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838)에 따라 합성할 수 있다.

2'-O-펜틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 문헌(Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838)에 따라 합성할 수 있다.

2'-O-프로파길구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은 시판되는 시약을 이용할 수 있다.

2'-O,4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는 WO99/14226에 기재된 방법에 따라, 알킬렌기의 탄소수가 2∼5개인 2'-O,4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는 WO00/47599에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.

D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C,4'-C-메틸렌옥시메틸렌화된 뉴클레오시드는 문헌(Wang, G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724)에 따라 합성할 수 있다.

S-cEt(constrained ethyl)는 문헌(Seth, P.P. et al. J. Org. Chem (2010), 75, 1569-1581)에 따라 합성할 수 있다.

AmNA는 문헌(Yahara, A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516), 또는 WO2014/109384에 따라 합성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 핵산 염기 서열은 아데닌을 (A) 또는 (a), 구아닌을 (G) 또는 (G), 시토신을 (C) 또는 (c), 티민을 (T) 또는 (t), 및 우라실을 (U) 또는 (u)로 각각 기재할 수 있다. 시토신 대신에 5-메틸시토신을 사용할 수 있다. 핵산 염기 중, 우라실 (U) 또는 (u)와 티민 (T) 또는 (t)는 호환성이 있다. 우라실 (U) 또는 (u)와 티민 (T) 또는 (t)의 어느 쪽도 상보쇄인 아데닌 (A) 또는 (a)와의 염기쌍 형성에 사용할 수 있다.

포스포르아미다이트 시약을 커플링한 후, 유황, 테트라에틸티우람디설피드(TETD, 어플라이드 바이오시스템사), Beaucage 시약(Glen Research사), 또는 크산탄히드리드 등의 시약을 반응시킴으로써 포스포로티오에이트 결합을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다(Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198).

합성기로 이용하는 콘트롤드 포어 글래스(CPG)로는 2'-O-메틸뉴클레오시드가 결합한 것은 시판되는 것을 이용할 수 있다. 또, 2'-O,4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는 WO99/14226에 기재된 방법에 따라, 알킬렌기의 탄소수가 2∼5개인 2'-O,4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는 WO00/47599에 기재된 방법에 따라 제조한 뉴클레오시드를 문헌(Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J. Gait, Oxford University Press, 1984)에 따라 CPG에 결합할 수 있다. 수식된 CPG(일본 특개 평7-87982의 실시예 12b에 기재)를 이용함으로써, 3' 말단에 2-히드록시에틸 인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 또, 3'-아미노-개질제(Modifier) C3 CPG, 3'-아미노-개질제 C7 CPG, 글리세릴 CPG, (Glen Research), 3'-스페이서 C3 SynBase CPG 1000, 3'-스페이서 C9 SynBase CPG 1000(link technologies)을 사용하면, 3' 말단에 히드록시알킬 인산기, 또는 아미노알킬 인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 그 3' 말단 및/또는 5' 말단에 인산 디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합을 통해 뉴클레오티드 이외의 분자 구조와 결합시킴으로써 화학 수식을 할 수 있다. 본 발명은 이와 같이 화학 수식된 올리고뉴클레오티드도 제공한다.

목적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사슬 신장이 종료한 후에, 5'-아미노-개질제 C6(Glen Research), 5'-TFA-아미노-개질제 C6-CE 포스포르아미다이트, 5'-TFA-아미노-개질제-C5-CE 포스포르아미다이트(Link Technologies) 등을 사용하면, 5' 말단에 아미노알킬 인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)의 5' 말단 및/또는 3' 말단에는 소수성기를 가져도 된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)의 5' 말단 및/또는 3' 말단에는 지방산을 포함하는 아미노알킬 인산기가 추가로 결합하고 있어도 되고, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에는 수산기 대신에

로 나타내는 기를 가져도 된다. 목적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사슬 신장이 종료한 후에 2-시아노에틸 (6-팔미트아미도헥실) 디이소프로필포스포르아미다이트(Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044, Link Technologies) 등의 지방산에 대응하는 아미다이트 유닛을 커플링시킴으로써 합성할 수 있다.

5' 말단 및/또는 3' 말단에 아미노알킬 인산기(예를 들면, 알킬로는 3 내지 9의 탄소수를 가짐)를 갖고 또한 목적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드에 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산 등의 지방산의 펜타플루오로페닐 에스테르 등의 활성 에스테르를 반응시킴으로써 합성할 수 있다(Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044). 또, 목적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 고상 합성 시에, 5' 말단에 아미노알킬 인산기(예를 들면, 알킬로는 3 내지 9의 탄소수를 가짐)를 갖게 한 고상 담체 상에서 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산 등의 지방산을 HATU 등의 축합제를 이용해 축합한 후, 탈보호·정제함으로써 합성할 수도 있다(PCT/WO2017/192679).

추가로, 5'-토코페롤-CE 포스포르아미다이트, 5'-콜레스테롤-CE 포스포르아미다이트, 5'-콜레스테롤-TEG-CE 포스포르아미다이트(Link Technologies) 등을 사용하면 5' 말단에 콜레스테롤이나 토코페롤이 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 의약으로서 구체적으로는 안면견갑상완형 근이영양증 치료에 이용할 수 있다. 치료는 발증 전(예방), 발증과 동시 또는 발증 후의 어느 시기에 행해도 된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 그 약학상 허용 가능한 염의 형태로 이용해도 된다. 「그 약학상 허용 가능한 염」이란 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)의 염을 말하고, 그러한 염으로는 나트륨 염, 칼륨 염, 리튬 염과 같은 알칼리 금속 염, 칼슘 염, 마그네슘 염과 같은 알칼리 토류 금속 염, 알루미늄 염, 철 염, 아연 염, 구리 염, 니켈 염, 코발트 염 등의 금속 염; 암모늄 염과 같은 무기 염, t-옥틸아민 염, 디벤질아민 염, 모르폴린 염, 글루코사민 염, 페닐글리신알킬 에스테르 염, 에틸렌디아민 염, N-메틸글루카민 염, 구아니딘 염, 디에틸아민 염, 트리에틸아민 염, 디시클로헥실아민 염, N,N'-디벤질 에틸렌 디아민 염, 클로로프로카인 염, 프로카인 염, 디에탄올아민 염, N-벤질페네틸아민 염, 피페라진 염, 테트라메틸 암모늄 염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 염과 같은 유기 염 등의 아민 염; 불화수소산 염, 염산 염, 브롬화수소산 염, 요오드화수소산 염과 같은 할로겐화수소산 염, 질산 염, 과염소산 염, 황산 염, 인산 염 등의 무기산 염; 메탄설폰산 염, 트리플루오로메탄설폰산 염, 에탄설폰산 염과 같은 저급 알칸 설폰산 염, 벤젠설폰산 염, p-톨루엔설폰산 염과 같은 아릴 설폰산 염, 아세트산 염, 말산 염, 푸마르산 염, 숙신산 염, 시트르산 염, 타르타르산 염, 옥살산 염, 말레산 염 등의 유기산 염; 글리신 염, 리신 염, 아르기닌 염, 오르니틴 염, 글루탐산 염, 아스파라긴산 염과 같은 아미노산 염 등을 들 수 있다. 이들 염은 공지의 방법으로 제조할 수 있다.

또, 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 용매화물(예를 들면, 수화물)로도 존재하는 경우가 있고, 그러한 용매화물도 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 약학상 허용 가능한 염에 포함되는 것으로 한다.

따라서, 본 발명은 상기의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 의약을 제공한다. 또, 본 발명은 상기의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료약, 특히 안면견갑상완형 근이영양증 치료약을 제공한다.

DUX4-fl 단백질은 PRAMEF2, TRIM43, ZSCAN4 등 초기 배나 정소에서 발현하는 유전자의 발현을 활성화한다(비특허문헌 19: Geng et al., Dev Cell 2012, 22:38-51). DUX4-fl의 발현은 아폽토시스(비특허문헌 20: Kowaljow et al., Neuromuscul Disord 2007, 17:611-623; 비특허문헌 21: Wallace et al., Ann Neurol 2011, 69:540-552)나 근 발생 이상(비특허문헌 22: Bosnakovski et al., EMBO J 2008, 27:2766-2779; 비특허문헌 23: Banerji et al., Nat Commun 2017, 8:2152), 난센스 코돈 개재 mRNA 분해의 저해(비특허문헌 24: Feng et al., eLife 2015, 4:e04996), 세포내 2본쇄 RNA의 형성(비특허문헌 25: Shadle et al., PLoS Genet 2017, 13:e1006658), 단백질 응집(비특허문헌 26: Homma et al., Ann Clin Transl Neurol 2015, 2:151-166) 등을 일으키는 것이 보고되어 있어 여러가지 질환이나 증상의 원인이 될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DUX4 유전자의 스플라이싱을 강한 전사 활성을 갖는 DUX4-fl로부터 전사 활성을 갖지 않는 DUX4-s로 변환하기 때문에, DUX4-fl이 갖는 전사 활성에 기인하는 질환 또는 증상을 치료하는 효과를 갖는다.

본 발명의 안면견갑상완형 근이영양증 치료약은 DUX4-fl을 발현하고 있는 환자를 대상으로 하면 된다. Lemmers 등의 보고(비특허문헌 8: Lemmers et al., Science 2010, 329:1650-1653)를 시작으로 한 여러가지 조사로부터, FSHD 1형에 있어서도, FSHD 2형에 있어서도, 하플로타입 4qA를 갖는 환자에서는 DUX4-fl이 발현하고 있는 것이 나타나 있기 때문에, 본 발명은 FSHD 1형에도 FSHD 2형에도 적용된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 안면견갑상완형 근이영양증의 치료에 사용하는 경우에는 그 자체 혹은 적절한 약학상 허용 가능한 부형제, 희석제 등과 혼합하고, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 혹은 시럽제 등에 의해 경구적으로, 혹은 주사제, 좌제, 첨부제 혹은 외용제 등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다.

이들 제제는 부형제(예를 들면, 유당, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비톨과 같은 당 유도체; 옥수수 전분, 고구마 전분, α 전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체; 결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 아라비아 검; 덱스트란; 풀루란과 같은 유기계 부형제; 경질 무수 규산, 합성 규산알루미늄, 규산칼슘, 메타규산알루민산마그네슘과 같은 규산 염 유도체; 인산수소칼슘과 같은 인산 염; 탄산칼슘과 같은 탄산 염; 황산칼슘과 같은 황산 염 등의 무기계 부형제 등), 활택제(예를 들면, 스테아르산; 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘과 같은 스테아르산 금속 염; 탈크; 콜로이드 실리카; 비즈 왁스, 경랍과 같은 왁스류; 붕산; 아디프산; 황산나트륨과 같은 황산 염; 글리콜; 푸마르산; 벤조산나트륨; DL 로이신; 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산마그네슘과 같은 라우릴 황산 염: 무수 규산, 규산 수화물과 같은 규산류; 상기 전분 유도체 등), 결합제(예를 들면, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 마크로골, 상기 부형제와 동일한 화합물 등), 붕괴제(예를 들면, 저치환도 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 내부 가교 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 카르복시메틸 전분, 카르복시메틸 전분 나트륨, 가교 폴리비닐 피롤리돈과 같은 화학 수식된 전분·셀룰로오스류 등), 유화제(예를 들면, 벤토나이트, 비감과 같은 콜로이드성 점토; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 금속 수산화물; 라우릴 황산나트륨, 스테아르산칼슘과 같은 음이온 계면활성제; 염화 벤잘코늄과 같은 양이온 계면활성제; 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르와 같은 비이온 계면활성제 등), 안정제(메틸파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥시 벤조산 에스테르류; 클로로부탄올, 벤질 알코올, 페닐에틸 알코올과 같은 알코올류; 염화 벤잘코늄; 페놀, 크레졸과 같은 페놀류; 티메로살; 데히드로아세트산; 소르브산 등), 교미교취제(예를 들면, 통상 사용되는 감미료, 산미료, 향료 등), 희석제 등의 첨가제를 이용해 주지의 방법으로 제조된다.

본 발명의 치료약은 0.1∼250 μmoles/㎖의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 함유하면 되고, 바람직하게는 1∼50 μmoles/㎖의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 그 약학상 허용 가능한 염, 0.02∼10% w/v의 탄수화물 또는 다가 알코올 및 0.01∼0.4% w/v의 약학상 허용 가능한 계면활성제를 함유시켜 두어도 된다.

상기 탄수화물로는 단당류 또는 이당류가 특히 바람직하다. 이들 탄수화물 및 다가 알코올의 예로는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 락토오스, 말토오스, 만니톨 및 소르비톨을 들 수 있다. 이들은 단독으로 이용해도, 병용해도 된다.

또, 본 발명에서의 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노∼트리-에스테르, 알킬페닐 폴리옥시에틸렌, 나트륨타우로콜레이트, 나트륨콜레이트, 및 다가 알코올 에스테르를 들 수 있다. 이 중 특히 바람직한 것은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노∼트리-에스테르이며, 여기에 있어서 에스테르로서 특히 바람직한 것은 올레에이트, 라우레이트, 스테아레이트 및 팔미테이트이다. 이들은 단독으로 이용해도, 병용해도 된다.

또, 본 발명의 치료약은 더욱 바람직하게는 0.03∼0.09 M의 약학상 허용 가능한 중성염, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨 및/또는 염화칼슘을 함유시켜 두어도 된다.

또, 본 발명의 치료약은 더욱 바람직하게는 0.002∼0.05 M의 약학상 허용 가능한 완충제를 함유할 수 있다. 바람직한 완충제의 예로는 시트르산나트륨, 나트륨 글리시네이트, 인산나트륨, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 들 수 있다. 이들 완충제는 단독으로 이용해도, 병용해도 된다.

또한, 상기의 치료약은 용액 상태로 공급해도 된다. 그러나, 일정 기간 보존할 필요가 있는 경우 등을 위하여, 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)를 안정화하여 치료 효과의 저하를 방지할 목적으로 통상은 동결건조해 두는 것이 바람직하고, 그 경우에는 사용 시에 용해액(주사용 증류수 등)으로 재구성(reconstruction)하여, 즉 투여되는 액체 상태로 하여 이용하면 된다. 따라서, 본 발명의 치료약은 각 성분이 소정의 농도 범위가 되도록 용해액으로 재구성해 사용하기 위한 것, 동결건조된 상태인 것도 포함한다. 동결건조물의 용해성을 촉진할 목적으로 알부민, 글리신 등의 아미노산을 추가로 함유시켜 두어도 된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 인간에게 투여하는 경우에는, 예를 들면, 성인 1일 당 약 0.01∼100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.1∼20 ㎎/㎏(체중)의 투여량으로, 1회 또는 수회로 나누어 피하 주사, 링거 정맥 주사, 또는 정맥 주사하면 되지만, 그 투여량이나 투여 횟수는 질환의 종류, 증상, 연령, 투여 방법 등에 의해 적절히 변경할 수 있다.

인간, 예를 들면, DUX4-fl을 발현하고 있는 환자에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 그 약학상 허용 가능한 염의 투여는, 예를 들면, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 통상의 기술자에게 주지인 방법으로 제조하고, 이것을 상법에 의해 멸균 처리하여, 예를 들면 125 ㎎/㎖의 주사용 용액을 조제한다. 이 용액을, 환자 정맥 내에 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드)의 투여량이 체중 1 ㎏ 당 예를 들면 10 ㎎이 되도록, 예를 들면 수액의 형태로 링거 투여한다. 투여는, 예를 들면 1주간의 간격으로 행하고, 그 후에도 치료 효과의 확인을 하면서 적절히 이 치료를 반복한다.

또, 본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 및 그 약학상 허용 가능한 염은 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하기 위해 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기의 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하는 약제를 제공한다. DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하는 약제로는, DUX4-fl을 발현하는 세포에 있어서, DUX4-s의 발현량을 대조군과 비교하여 약 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상으로 증가시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 이용할 수 있지만, DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하는 기능을 갖고 있는 한, 상기의 범위에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제는 의약으로서 혹은 실험용 시약으로서 이용할 수 있다.

실험용 시약으로서 이용하는 경우에는 DUX4-fl을 발현하는 세포, 조직 또는 기관을 본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 및 그 약학상 허용 가능한 염으로 처리함으로써 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 및 그 약학상 허용 가능한 염은 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하는데 유효한 양으로 이용하면 된다. DUX4-fl을 발현하는 세포로는 ES 세포, iPS 세포나, FSHD 환자 유래 근아세포 등의 천연 유래의 세포를 예시할 수 있다. 또, 천연 유래의 세포 외에 DUX4 유전자를 도입한 재조합 세포를 예시할 수도 있다. DUX4-fl을 발현하는 조직 및 기관으로는 정소, 4 세포기의 발생 초기 배나, FSHD 환자의 골격근 등을 예시할 수 있다. DUX4-fl의 발현은 샘플 중의 DUX4-fl(전사 산물)를 RT-PCR로 해석하거나, 샘플 중의 DUX4-fl 단백질을 웨스턴 블롯법으로 검출하거나, DUX4-fl 단백질에 특이적인 펩티드 단편을 질량분석법으로 검출하거나 함으로써 해석할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1) HO-C^m1s-T^e2s-G^m1s-U^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1t-H (DUX4-035)(서열번호 2)의 합성

핵산 자동 합성기(「MerMade 192X」BioAutomation제)를 이용하여 포스포르아미다이트법(Nucleic Acids Research, 12, 4539(1984))을 이용해 표기 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 단, 축합에는 활성화제 용액-3(0.25 mol/L 5-벤질티오-1H-테트라졸·아세토니트릴 용액, 와코준야쿠코교사제, 제품 번호 013-20011)에 1-메틸이미다졸(와코준야쿠코교사제, 제품 번호 134-12801)을 0.4% 가한 용액을 이용하고, 반응 시간은 약 10분으로 하였다. 포스포로티오에이트 결합을 형성하기 위한 티오화 시약으로서, 0.2 M이 되도록 페닐아세틸디설피드(CARBOSYNTH제, 제품 번호 FP07495)를 탈수 아세토니트릴(칸토카가쿠제, 제품 번호 01837-05):탈수 피리딘(칸토카가쿠제, 제품 번호 11339-05) = 1:1(v/v) 혼합액을 이용하여 용해해 이용하였다. 그 외 사용한 시약으로는 CAP A for AKTA(1-메틸이미다졸·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L040050), Cap B1 for AKTA(무수 아세트산·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L050050), Cap B2 for AKTA(피리딘·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L050150), DCA Deblock(디클로로아세트산·톨루엔 용액, Sigma-Aldrich제, 제품 번호 L023050)을 이용하였다. 아미다이트 시약으로는 2'-O-Me 뉴클레오시드의 포스포르아미다이트(아데노신체 제품 번호 ANP-5751, 시티딘체 제품 번호 ANP-5752, 구아노신체 제품 번호 ANP-5753, 우리딘체 제품 번호 ANP-5754)는 ChemGenes제의 것을 이용하였다. 비천연형의 포스포르아미다이트는 일본 특개 2000-297097의 실시예 14(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-6-N-벤조일아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트), 실시예 27(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-2-N-이소부티릴구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트), 실시예 22(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-4-N-벤조일-5-메틸시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트), 실시예 9(5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-5-메틸우리딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트)의 화합물을 이용하였다. 고상 담체로서 Glen Unysupport FC 96 웰 포맷 0.2 μmol(GlenResearch제)을 이용해 표기의 화합물을 합성하였다.

목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체(類緣體)를 600 ㎕의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라내는 것과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼었다. 올리고머의 혼합 용액을 Clarity QSP DNA 로딩 버퍼(Phenomenex제) 300 ㎕와 혼합하고, Clarity SPE 96 웰 플레이트(Phenomenex제) 상에 채웠다. Clarity QSP DNA 로딩 버퍼:물 = 1:1 용액 1 ㎖, 0.1 M 테트라부틸암모늄브로마이드 수용액:아세토니트릴 = 8:2(v/v) 용액 2 ㎖, 3% 디클로로아세트산(DCA) 수용액 3 ㎖, 물 4 ㎖, 20 mM Tris 수용액 2 ㎖의 순서로 첨가한 후, 20 mM Tris 수용액:아세토니트릴 = 9:1 용액에서 추출되는 성분을 모았다. 용매를 증류제거(留去)한 후, 목적 화합물을 얻었다. 본 화합물은 역상 HPLC(컬럼(Phenomenex, Clarity 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A(2.1×50 ㎜)), A 용액: 100 mM 헥사플루오로이소프로판올(HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액: 메탄올, B%: 10%→25%(4분, 선형 구배); 60℃; 0.5 ㎖/분; 260 nm)로 분석하면, 3.384분에 용출되었다. 화합물은 부(負)이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다(계산 값: 6446.76, 실측 값: 6446.75).

본 화합물의 염기 서열은 호모 사피엔스 클론 60-1 더블 호메오도메인 단백질 DUX4-fl(DUX4) mRNA(NCBI-GenBank 등록 번호 HQ266761)의 뉴클레오티드 번호 595-612에 상보적인 서열이다.

또한, 서열목록에는 천연 뉴클레오시드와 2'-O,4'-C-에틸렌 뉴클레오시드를 구별하는 일 없이 염기 서열을 나타낸다.

(실시예 2∼47)

표 1에 나타내는 실시예 2 내지 실시예 47의 화합물을 실시예 1과 동일하게 합성하였다.

표 중의 서열에 있어서 소문자는 2'-OMe-RNA, 밑줄을 친 대문자는 ENA를 나타낸다. 단, ENA의 C의 염기 부위는 5-메틸시토신이다. 각 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트로 결합하고 있다. 표적 영역은 호모 사피엔스 클론 60-1 더블 호메오도메인 단백질 DUX4-fl(DUX4) mRNA(NCBI-GenBank 등록 번호 HQ266761)의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 분자량은 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측 값을 나타낸다.

(실시예 48-95)

실시예 1과 동일한 조건에서 합성함으로써 하기의 표 2에 기재된 화합물도 합성할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, A^t, G^t, 5meC^t, C^t, T^t, U^t, A^p, G^p, 5meC^p, C^p, T^p, U^p, A^s, G^s, 5meC^s, C^s, T^s, U^s, A^m1t, G^m1t, C^m1t, 5meC^m1t, U^m1t, A^m1p, G^m1p, C^m1p, 5meC^m1p, U^m1p, A^m1s, G^m1s, C^m1s, 5meC^m1s, U^m1s, A^2t, G^2t, C^2t, T^2t, A^e2p, G^e2p, C^e2p, T^e2p, A^e2s, G^e2s, C^e2s, T^e2s, A^1t, G^1t, C^1t, T^1t, A^e1p, G^e1p, C^e1p, T^e1p, A^e1s, G^e1s, C^e1s, T^e1s, A^3t, G^3t, C^3t, T^3t, A^e3p, G^e3p, C^e3p, T^e3p, A^e3s, G^e3s, C^e3s, T^e3s, A^m2t, G^m2t, 5meC^m2t, T^m2t, A^m2p, G^m2p, 5meC^m2p, T^m2p, A^m2s, G^m2s, 5meC^m2s, T^m2s는 하기에 나타내는 구조를 갖는 기이다.

(시험예 1)

(A) DUX4 미니진 구조체의 구축

DUX4 유전자를 포함하는 BAC 클론 RP11-242C23(Morioka et al., PLoS One 2016, 11:e0151963)을 유지하는 유전자 재조합 대장균을 오클랜드 어린이 병원의 BAC PAC Resources Center로부터 구입하였다. LB/클로람페니콜 한천 배지에서 배양하고, QIAGEN 플라스미드 미디 키트(QIAGEN, 카탈로그 번호 12143)를 이용해 프로토콜 QP01에 따라 BAC DNA를 정제하였다.

BAC DNA를 주형으로 하여 프라이머 207(5'-CGCGTCCGTCCGTGAAATTCC-3')(서열번호 86), 프라이머 209(5'-CAGGGGATATTGTGACATATCTCTGCAC-3')(서열번호 87), PrimeStar GXL(Takara; 카탈로그 번호 R050A)을 이용한 PCR에 의해 DUX4 엑손 1로부터 엑손 3을 포함하는 영역 2163 bp를 증폭하였다. PCR 산물을 MinElute 겔 추출 키트(QIAGEN, 카탈로그 번호 28606)를 이용해 정제하고, Mighty 믹스(Takara; 카탈로그 번호 6023)를 이용해 pCR blunt 벡터(Thermofisher scientific; 카탈로그 번호 K275020)에 라이게이션하였다. 재조합 플라스미드 DNA를 대장균 TOP10 수용성 세포(competent cell)(Thermofisher; 카탈로그 번호 C404010)에 형질전환하고, LB/카나마이신 한천 배지에서 선택하였다. 형질전환체의 콜로니를 액체 배양하고, GenElute 플라스미드 미니프렙 키트(SIGMA; 카탈로그 번호 PLN350)로 재조합 플라스미드 DNA를 정제하였다. 얻어진 재조합 플라스미드 DNA의 염기 서열을 ABI 3500xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)로 해독하여, DUX4의 엑손 1로부터 엑손 3까지가 삽입되어 있음을 확인하고, 플라스미드 318로 이름 붙였다.

플라스미드 318을 주형으로 하여, EcoRI 인식 서열과 kozak 서열을 포함하는 프라이머 216(5'-GAATTCTGCCACCATGGCCCTCCCG-3')(서열번호 88)과 XhoI 인식 서열을 포함하는 프라이머 218(5'-CTCGAGCTATAGGATCCACAGGGAGG-3')(서열번호 89)을 이용하고, 다시 PrimeStar GXL에 의한 PCR를 행하여, DUX4 엑손 1로부터 엑손 3을 포함하는 영역의 5' 말단에 EcoRI 인식 서열과 kozak 서열을, 3' 말단에 XhoI 인식 서열을 부가하였다. 제한 효소 인식 서열과 kozak 서열이 부가한 DUX4 유전자 DNA를 pCR blunt 벡터에 라이게이션하고, 플라스미드 320으로 이름 붙였다.

플라스미드 320으로 발현 벡터 pcDNA3.1(+)(Thermofisher scientific; 카탈로그 번호 V79020)를 각각 EcoRI, XhoI로 37℃, 2시간 처리하고, 아가로오스 전기영동으로 밴드를 확인하였다. DUX4 유전자 서열과 pcDNA3.1(+) 벡터에 상당하는 밴드로부터 DNA를 MinElute 겔 추출 키트(QIAGEN, 카탈로그 번호 28606)를 이용해 정제하고, Mighty 믹스를 이용해 DUX4 유전자 서열과 벡터를 라이게이션하였다. ABI 3500xL Genetic Analyzer로 염기 서열을 확인하고, DUX4 미니진 구조체로 이름 붙였다.

(B) HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물의 형질주입

인간 자궁 경부암 유래 배양 세포주인 HeLa 세포는 이연(理硏) BRC Cell Bank로부터 구입하였다(카탈로그 RCB0007, Tsukuba, Japan). HeLa 세포는 10% FBS(Thermofisher scientific; 카탈로그 번호 10270-106)를 포함하는 DMEM(SIGMA; 카탈로그 번호 D5796) 중에서 37℃, CO₂ 농도 5%의 조건에서 배양하였다. 6 웰 디쉬(Thermofisher scientific; 카탈로그 번호 140675)에 HeLa 세포를 56×10⁴개 접종하고, 다음날 DUX4 미니진 구조체 1 ㎍과 실시예의 화합물(최종 농도 100 nM)을 리포펙타민 2000(Thermofisher scientific; 카탈로그 번호 11668027)을 이용해 도입하였다.

(C) DUX4 미니진 구조체로부터의 전사 산물의 검출

DUX4 미니진 구조체를 형질주입한 후, 24시간에 세포를 회수하고, RNeasy 미니 키트(QIAGEN; 카탈로그 번호 74104)로 RNA를 추출하였다. PrimeScript(Takara; 카탈로그 번호 2680A)를 이용해 역전사를 행하고, DUX4-fl, DUX4-s 양방을 증폭하는 프라이머(프라이머 222: 5'-GGATTCAGATCTGGTTTCAGAATCGAAGG-3'(서열번호 90), 프라이머 225: 5'-CCAGGAGATGTAACTCTAATCCAGGTTTGC-3'(서열번호 91))로 PCR를 행하였다. 4.8% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 DUX4-fl과 DUX4-s의 밴드를 분리하고, 밴드 강도를 LAS3000(Fujifilm)으로 가시화하였다. 마커로서 λ/EcoT14I 마커(Takara; 카탈로그 번호 3010을 Takara; 카탈로그 번호 1038A로 처리, 도면 중, M1로서 사용), 100 bp마커(Takara; 카탈로그 번호 3422B, 도면 중, M2로서 사용)을 사용하였다.

그 겔 전기영동의 결과를 도 2 내지 도 7에 나타낸다. 도면 중, 대조군은 DUX4 미니진 구조체, 실시예의 화합물 모두 형질주입하지 않은 것을 나타낸다. D4는 DUX4 미니진 구조체만을 형질주입한 것을 나타낸다. 실시예의 화합물(DUX4-004 내지 DUX4-016, DUX4-025 내지 DUX4-058)을 형질주입한 세포에 있어서, DUX4-s 유래라고 생각되는 300 bp 정도의 밴드가 D4의 레인보다도 강한 밴드가 확인되었다.

(D) 실시예의 화합물에 의해 생성된 DUX4-s 밴드의 염기 서열의 확인

DUX4 미니진 구조체를 형질주입한 후, 24시간에 세포를 회수하고, RNeasy 미니 키트로 RNA를 추출하였다. PrimeScript를 이용해 역전사를 행하고, DUX4-fl, DUX4-s 양방을 증폭하는 프라이머(프라이머 222, 225)로 PCR를 행하였다. 2% 아가로오스 겔 전기영동으로 DUX4-fl과 DUX4-s의 밴드를 분리하고, 약 300 bp의 밴드를 잘라내어 MinElute 겔 추출 키트로 DNA를 정제하고, Mighty 믹스를 이용해 pCR blunt 벡터에 라이게이션하였다. 재조합 플라스미드 DNA를 대장균 TOP10 수용성 세포에 형질전환하고, LB/카나마이신 한천 배지에서 선택하였다. 형질전환체의 콜로니를 액체 배양하고, GenElute 플라스미드 미니프렙 키트로 재조합 플라스미드 DNA를 정제하였다. 얻어진 재조합 플라스미드 DNA를 주형에 M13 전방 프라이머(5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'(서열번호 92)), M13 후방 프라이머(5'-ggaaacagctatgaccatgattac-3'(서열번호 93))로 생어-반응을 행하고, ABI 3500xL Genetic Analyzer로 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, DUX4-s의 서열(Genbank HQ266762)과 비교하여 엑손 2의 3' 말단 10 bp가 결실된 서열이었다. DUX4-s의 정지 코돈은 에손 2의 선두에 존재하기 때문에, 본 실험에서 확인된 서열로부터도 전장의 DUX4-s 단백질(GenBank: ADN68617.1)이 생산된다고 생각된다.

(E) DUX4 표적 유전자의 발현량의 측정

DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-009)을 형질주입한 후, 24시간에 세포를 회수하고, RNeasy 미니 키트로 RNA를 추출하였다. PrimeScript를 이용해 역전사를 행하여 cDNA를 합성하였다. 그 cDNA를 주형으로 이용하여, DUX4가 전사를 활성화하는 표적 유전자로 알려져 있는 ZSCAN4, MBD3L2, TRIM43의 발현량을 PowerUP SYBR Green PCR 마스터 믹스(Thermofisher scientific; 카탈로그 번호 A25742)를 이용한 실시간 PCR로 측정하였다. PCR은 StepOne Plus(Thermofisher scientific)를 이용하고, 내부 표준으로서 RPL13A 유전자를 이용한 ΔΔCt 법으로 수치화하였다. 이용한 프라이머의 서열은 이하와 같다.

ZSCAN4-Fw: 5'-TGGAAATCAAGTGGCAAAAA-3'(서열번호 94); ZSCAN4-Rv: 5'-CTGCATGTGGACGTGGAC-3'(서열번호 95)

MBD3L2-Fw: 5'-GCGTTCACCTCTTTTCCAAG-3'(서열번호 96); MBD3L2-Rv: 5'-GCCATGTGGATTTCTCGTTT-3'(서열번호 97)

TRIM43-Fw: 5'-ACCCATCACTGGACTGGTGT-3'(서열번호 98); TRIM43-Rv: 5'-CACATCCTCAAAGAGCCTGA-3'(서열번호 99)

그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타낸다. DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(도 8a: DUX4-009, DUX4-031, DUX4-036, DUX4-048, 도 8b: DUX4-48.7, DUX4-48.11, DUX4-48.12, DUX4-48.13, DUX4-52.2)을 형질주입한 세포는 DUX4 미니진 구조체만을 형질주입한 세포와 비교하여 ZSCAN4, MBD3L2, TRIM43의 발현량의 저하가 확인되었다.

(시험예 2)

(A) DUX4 프리-mRNA (D4Z4 mRNA)의 조제

HeLa 세포의 실험에서 이용하고 있는 DUX4 미니진 구조체를 EcoRI와 XhoI로 절단하고, 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하였다. 겔로부터 DNA를 정제하고, SP6 프로모터를 갖는 pCS2-V5 벡터에 라이게이션하였다. 얻어진 플라스미드 DUX4_pCS2를 NotI로 선형화하고, 그것을 주형으로 mMessage mMachine SP6 전사 키트(ThermoFisher scientific; 카탈로그 번호 AM1340)를 이용해 mRNA를 시험관내 합성하고, RNeasy MinElute Cleanup 키트(QIAGEN; 카탈로그 번호 74204)로 정제하였다.

(B) 제브라피쉬에 대한 D4Z4 mRNA와 실시예의 화합물의 주입, 및 DUX4 프리-mRNA의 스플라이싱 변화의 검출

야생형 제브라피쉬 계통 RIKEN WT의 수정란 약 100개에 DUX4 프리-mRNA(최종 농도: 10 ng/㎕)만을, 또는 DUX4 프리-mRNA와 실시예 화합물 DUX-048(최종 농도: 500 μM)의 혼합액을 마이크로인젝터(Eppendorf)로 1 nL 주입하였다. 5시간 후에 TRIzol 시약(ThermoFisher scientific; 카탈로그 번호 15596026)을 가해 수정란을 균질화하고, RNeasy 미니 키트를 이용해 RNA를 정제하였다. RNase-부재 DNase 세트(QIAGEN; 카탈로그 번호 79254)를 이용해 DNase 처리를 행하였다. 얻어진 RNA의 일부를 RT-용 샘플로 하고, 1.2 ㎍ 분을 PrimeScript 제1 가닥 cDNA 합성 키트를 이용해 역전사하였다. 얻어진 cDNA를 주형으로 프라이머 222(서열번호 90), 프라이머 225(서열번호 91)를 이용해 PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제(Takara; 카탈로그 번호 R050A)에 의한 PCR를 행하였다. 4.8% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 DUX4-fl과 DUX4-s의 밴드를 분리하고, 밴드 강도를 LAS3000(Fujifilm)으로 가시화하였다. λ/EcoT14I 마커(Takara; 카탈로그 번호 3010을 Takara; 카탈로그 번호 1038A로 처리, 도면 중, M1로서 사용), 100 bp 마커(Takara; 카탈로그 번호 3422B, 도면 중, M2로서 사용)를 사용하였다.

그 결과를 도 9에 나타낸다. 역전사를 행하지 않은 음성 대조(RT-)에서는 예상대로 밴드가 검출되지 않은 것으로부터 프라이머의 특이성이 확인되었다. 한편, 역전사를 행한 샘플(RT+)에서는 실시예 화합물(DUX-048)을 주입함으로써 DUX4-fl 상당의 밴드가 감소하고, DUX4-s 상당의 밴드가 증가하였다.

(실시예 96-130)

실시예 1과 동일한 조건에서 합성함으로써 하기의 표 3에 기재된 화합물을 합성하였다.

표 중의 서열에 있어서 소문자는 2'-OMe-RNA, 대문자는 ENA를 나타낸다. 단, ENA의 C의 염기 부위는 5-메틸시토신이다. 각 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트로 결합하고 있다. 표적 영역은 호모 사피엔스 클론 60-1 더블 호메오도메인 단백질 DUX4-fl(DUX4) mRNA(NCBI-GenBank 등록 번호 HQ266761)의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 분자량은 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측 값을 나타낸다.

(시험예 3)

(A) HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물의 형질주입, 및 DUX4 미니진 구조체로부터의 전사 산물의 검출

HeLa 세포에 대한 DUX4 미니진 구조체와 실시예의 화합물(DUX4-048, DUX4-48.1 내지 DUX4-48.23, DUX4-052, DUX4-52.1 내지 DUX4-52.12)의 형질주입, 및 DUX4 미니진 구조체로부터의 전사 산물의 검출은 시험예 1의 (B), (C)와 동일하게 행하였다.

그 겔 전기영동의 결과를 도 10 내지 도 13에 나타낸다. 도면 중, 대조군은 DUX4 미니진 구조체, 실시예의 화합물 모두 형질주입하지 않은 것을 나타낸다. D4는 DUX4 미니진 구조체만을 형질주입한 것을 나타낸다. 실시예의 화합물(DUX4-048, DUX4-48.1 내지 DUX4-48.23, DUX4-052, DUX4-52.1 내지 DUX4-52.12)을 형질주입한 세포에 있어서, DUX4-s 유래라고 생각되는 300 bp 정도의 밴드가 D4의 레인보다도 강한 밴드가 확인되었다. 또, 실시예의 화합물(DUX4-48.7, DUX4-48.12, 및, DUX4-52.2)을 형질주입한 세포에 있어서, DUX4-fl 유래라고 생각되는 밴드가 현저하게 감소하였다.

(참고예 1) 2-시아노에틸(6-스테아르아미도헥실)디이소프로필포스포르아미다이트

스테아르산(5.00 g)의 디클로로메탄(100 ㎖) 현탁액을 약 10℃로 냉각하고, 6-아미노-1-헥산올(3.09 g), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(3.37 g), 디이소프로필 에틸아민(3.06 ㎖)을 가해 실온에서 17시간 교반하였다. MeOH를 가하고, 농축해 얻어진 잔사에 아세톤-MeOH-헥산-톨루엔과 ISOLUTE HM-N(bulk, Biotage)을 가해 분산시키고, 용매를 감압 하 증류제거하고, 얻어진 잔분을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸/메탄올)에 부여하여 중간체인 조(粗)정제물(3.98 g)을 얻었다. 이 조정제물(3.86 g)의 디클로로메탄(100 ㎖) 현탁액을 0℃로 냉각하고, 디이소프로필 에틸아민(7.01 ㎖), 2-시아노에틸 디이소프로필클로로포스포르아미다이트(3.37 ㎖)를 가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 용매를 감압 하 증류제거하고, 얻어진 잔분을 NH-실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(DCM/아세트산에틸)에 부여하고, 추가로 NH-실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸)에 부여하여 표기 화합물(785 ㎎)을 무색 고체로서 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88 (3H, T, J = 6.3 Hz), 1.15-1.20 (12H, m), 1.22-1.66 (38H, m), 2.14 (2H, T, J = 7.6 Hz), 2.65 (2H, T, J = 6.3 Hz), 3.24 (2H, dT, J = 6.7, 6.7 Hz), 3.53-3.92 (6H, m), 5.44 (1H, br s). MS (m/z): 423.6 (M-N(iPr)₂+OH+NA)⁺.

(실시예 131-134)

실시예 1과 동일한 조건에서 합성함으로써 하기의 표 4에 기재된 화합물을 합성하였다. 단, 목적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사슬 신장이 종료한 후에, 2-시아노에틸(6-팔미트아미도헥실)디이소프로필포스포르아미다이트(Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044)를 농도가 0.1 M이 되도록 아세토니트릴:디클로로메탄(1:2 v/v)으로 용해한 용액을 이용해 커플링하였다. 커플링 후에는 산화 용액[요오드 용액(약 0.05 mol/L)][피리딘:물(9:1)](시그마 알드리치제)을 이용해 산화하였다.

목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 600 ㎕의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라내는 것과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼었다. 올리고머의 혼합 용액을 Clarity QSP DNA 로딩 버퍼(Phenomenex제) 300 ㎕와 혼합하고, Clarity QSP 카트리지 60 ㎎/3 ㎖ 30 ㎛(Phenomenex제) 상에 채웠다. Clarity QSP DNA 로딩 버퍼:물 = 1:1 용액 1 ㎖, 0.1 M 테트라부틸암모늄브로마이드 수용액:아세토니트릴 = 8:2(v/v) 용액 2 ㎖, 물 4 ㎖, 20 mM Tris 수용액 4 ㎖의 순서로 첨가한 후, 20 mM Tris 수용액:아세토니트릴 = 8:2 용액 800 ㎕에서 추출되는 성분을 모았다. 용매를 증류제거한 후, 목적 화합물을 얻었다. 본 화합물은, 역상 HPLC(컬럼(Phenomenex, Clarity 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A(2.1×50 ㎜)), A 용액: 100 mM 헥사플루오로이소프로판올(HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액: 메탄올, B%: 10%→25%→40%→65%(4분→6분→8분, 선형 구배); 60℃; 0.5 ㎖/분; 260 nm)로 분석하면, 5.7분에 용출되었다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다.

실시예 131-134의 화합물의 5' 말단에는 수산기 대신에

로 나타내는 기를 갖고 있다.

(실시예 135-138)

실시예 1과 동일한 조건에서 합성함으로써 하기의 표 5에 기재된 화합물을 합성하였다. 단, 목적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사슬 신장이 종료한 후에, 참고예 1의 화합물을 농도가 0.1 M이 되도록 아세토니트릴:디클로로메탄(1:2 v/v)으로 용해한 용액을 이용해 커플링하였다. 커플링 후에는 산화 용액[요오드 용액(약 0.05 mol/L)][피리딘:물(9:1)](시그마 알드리치제)을 이용해 산화하였다.

목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 600 ㎕의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라내는 것과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼었다. 올리고머의 혼합 용액을 Clarity QSP DNA 로딩 버퍼(Phenomenex제) 300 ㎕와 혼합하고, Clarity QSP 카트리지 60 ㎎/3 ㎖ 30 ㎕(Phenomenex제) 상에 채웠다. Clarity QSP DNA 로딩 버퍼:물 = 1:1 용액 1 ㎖, 0.1 M 테트라부틸암모늄브로마이드 수용액:아세토니트릴 = 8:2(v/v) 용액 2 ㎖, 물 4 ㎖, 20 mM Tris 수용액 4 ㎖의 순서로 첨가한 후, 20 mM Tris 수용액:아세토니트릴 = 8:2 용액 800 ㎕에서 추출되는 성분을 모았다. 용매를 증류제거한 후, 목적 화합물을 얻었다. 본 화합물은 역상 HPLC(컬럼(Phenomenex, Clarity 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A(2.1×50 ㎜)), A 용액: 100 mM 헥사플루오로이소프로판올(HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액: 메탄올, B%: 10%→25%→40%→65%(4분→6분→8분, 선형 구배); 60℃; 0.5 ㎖/분; 260 nm)로 분석하면, 6.2분에 용출되었다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다.

실시예 135-138의 화합물의 5' 말단에는 수산기 대신에

로 나타내는 기를 갖고 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

본 발명은 안면견갑상완형 근이영양증의 치료에 이용할 수 있다.

＜서열번호 1＞ DUX4-fl 등록 번호: HQ266761의 염기 서열을 나타낸다.
atggccctcccgacaccctcggacagcaccctccccgcggaagcccggggacgaggacggcgacggagactcgtttggaccccgagccaaagcgaggccctgcgagcctgctttgagcggaacccgtacccgggcatcgccaccagagaacggctggcccaggccatcggcattccggagcccagggtccagatttggtttcagaatgagaggtcacgccagctgaggcagcaccggcgggaatctcggccctggcccgggagacgcggcccgccagaaggccggcgaaagcggaccgccgtcaccggatcccagaccgccctgctcctccgagcctttgagaaggatcgctttccaggcatcgccgcccgggaggagctggccagagagacgggcctcccggagtccaggattcagatctggtttcagaatcgaagggccaggcacccgggacagggtggcagggcgcccgcgcaggcaggcggcctgtgcagcgcggcccccggcgggggtcaccctgctccctcgtgggtcgccttcgcccacaccggcgcgtggggaacggggcttcccgcaccccacgtgccctgcgcgcctggggctctcccacagggggctttcgtgagccaggcagcgagggccgcccccgcgctgcagcccagccaggccgcgccggcagaggggatctcccaacctgccccggcgcgcggggatttcgcctacgccgccccggctcctccggacggggcgctctcccaccctcaggctcctcgctggcctccgcacccgggcaaaagccgggaggaccgggacccgcagcgcgacggcctgccgggcccctgcgcggtggcacagcctgggcccgctcaagcggggccgcagggccaaggggtgcttgcgccacccacgtcccaggggagtccgtggtggggctggggccggggtccccaggtcgccggggcggcgtgggaaccccaagccggggcagctccacctccccagcccgcgcccccggacgcctccgcctccgcgcggcaggggcagatgcaaggcatcccggcgccctcccaggcgctccaggagccggcgccctggtctgcactcccctgcggcctgctgctggatgagctcctggcgagcccggagtttctgcagcaggcgcaacctctcctagaaacggaggccccgggggagctggaggcctcggaagaggccgcctcgctggaagcacccctcagcgaggaagaataccgggctctgctggaggagctttaggacgcggggttgggacggggtcgggtggttcggggcagggcggtggcctctctttcgcggggaacacctggctggctacggaggggcgtgtctccgccccgccccctccaccgggctgaccggcctgggattcctgccttctaggtctaggcccggtgagagactccacaccgcggagaactgccattctttcctgggcatcccggggatcccagagccggcccaggtaccagcagacctgcgcgcagtgcgcaccccggctgacgtgcaagggagctcgctggcctctctgtgcccttgttcttccgtgaaattctggctgaatgtctccccccaccttccgacgctgtctaggcaaacctggattagagttacatctc
＜서열번호 2∼85＞ 실시예 1∼118, 131∼133, 135∼137에서 합성한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA의 키메라, 이들 수식체의 어느 하나이어도 되고, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드의 적어도 1개가 수식 뉴클레오티드이어도 된다.
＜서열번호 86∼99＞ 프라이머의 서열을 나타낸다.
＜서열번호 100∼102＞ 실시예 119∼130, 134 및 138에서 합성한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA의 키메라, 이들 수식체의 어느 하나이어도 되고, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드의 적어도 1개가 수식 뉴클레오티드이어도 된다.

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED TOKAI UNIVERSITY EDUCATIONAL SYSTEM <120> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE CAPABLE OF ALTERING SPLICING OF DUX4 pre-mRNA <130> 2021-FPA-0902 <150> JP2019-129735 <151> 2019-07-12 <160> 102 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1655 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggccctcc cgacaccctc ggacagcacc ctccccgcgg aagcccgggg acgaggacgg 60 cgacggagac tcgtttggac cccgagccaa agcgaggccc tgcgagcctg ctttgagcgg 120 aacccgtacc cgggcatcgc caccagagaa cggctggccc aggccatcgg cattccggag 180 cccagggtcc agatttggtt tcagaatgag aggtcacgcc agctgaggca gcaccggcgg 240 gaatctcggc cctggcccgg gagacgcggc ccgccagaag gccggcgaaa gcggaccgcc 300 gtcaccggat cccagaccgc cctgctcctc cgagcctttg agaaggatcg ctttccaggc 360 atcgccgccc gggaggagct ggccagagag acgggcctcc cggagtccag gattcagatc 420 tggtttcaga atcgaagggc caggcacccg ggacagggtg gcagggcgcc cgcgcaggca 480 ggcggcctgt gcagcgcggc ccccggcggg ggtcaccctg ctccctcgtg ggtcgccttc 540 gcccacaccg gcgcgtgggg aacggggctt cccgcacccc acgtgccctg cgcgcctggg 600 gctctcccac agggggcttt cgtgagccag gcagcgaggg ccgcccccgc gctgcagccc 660 agccaggccg cgccggcaga ggggatctcc caacctgccc cggcgcgcgg ggatttcgcc 720 tacgccgccc cggctcctcc ggacggggcg ctctcccacc ctcaggctcc tcgctggcct 780 ccgcacccgg gcaaaagccg ggaggaccgg gacccgcagc gcgacggcct gccgggcccc 840 tgcgcggtgg cacagcctgg gcccgctcaa gcggggccgc agggccaagg ggtgcttgcg 900 ccacccacgt cccaggggag tccgtggtgg ggctggggcc ggggtcccca ggtcgccggg 960 gcggcgtggg aaccccaagc cggggcagct ccacctcccc agcccgcgcc cccggacgcc 1020 tccgcctccg cgcggcaggg gcagatgcaa ggcatcccgg cgccctccca ggcgctccag 1080 gagccggcgc cctggtctgc actcccctgc ggcctgctgc tggatgagct cctggcgagc 1140 ccggagtttc tgcagcaggc gcaacctctc ctagaaacgg aggccccggg ggagctggag 1200 gcctcggaag aggccgcctc gctggaagca cccctcagcg aggaagaata ccgggctctg 1260 ctggaggagc tttaggacgc ggggttggga cggggtcggg tggttcgggg cagggcggtg 1320 gcctctcttt cgcggggaac acctggctgg ctacggaggg gcgtgtctcc gccccgcccc 1380 ctccaccggg ctgaccggcc tgggattcct gccttctagg tctaggcccg gtgagagact 1440 ccacaccgcg gagaactgcc attctttcct gggcatcccg gggatcccag agccggccca 1500 ggtaccagca gacctgcgcg cagtgcgcac cccggctgac gtgcaaggga gctcgctggc 1560 ctctctgtgc ccttgttctt ccgtgaaatt ctggctgaat gtctcccccc accttccgac 1620 gctgtctagg caaacctgga ttagagttac atctc 1655 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 2 ctgtgggaga gccccagg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 3 agggtgaccc ccgccggg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 4 agcagggtga cccccgcc 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 5 gagcagggtg acccccgc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 6 ggagcagggt gacccccg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 7 gggagcaggg tgaccccc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 8 agggagcagg gtgacccc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 9 gagggagcag ggtgaccc 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 10 cgagggagca gggtgacc 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 11 acgagggagc agggtgac 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 12 cacgagggag cagggtga 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 13 ccacgaggga gcagggtg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 14 cccacgaggg agcagggt 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 15 acccacgagg gagcaggg 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 16 gacccacgag ggagcagg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 17 cgacccacga gggagcag 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 18 gcgacccacg agggagca 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 19 ggcgacccac gagggagc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 20 aggcgaccca cgagggag 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 21 aaggcgaccc acgaggga 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 22 gaaggcgacc cacgaggg 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 23 cgaaggcgac ccacgagg 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 24 gcgaaggcga cccacgag 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 25 ggcgaaggcg acccacga 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 26 gggcgaaggc gacccacg 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 27 tgggcgaagg cgacccac 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 28 gtgggcgaag gcgaccca 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 29 tgtgggcgaa ggcgaccc 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 30 gtgtgggcga aggcgacc 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 31 ggtgtgggcg aaggcgac 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 32 cggtgtgggc gaaggcga 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 33 ccggtgtggg cgaaggcg 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 34 gccggtgtgg gcgaaggc 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 35 cgccggtgtg ggcgaagg 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 36 gcgccggtgt gggcgaag 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 37 cgcgccggtg tgggcgaa 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 38 acgcgccggt gtgggcga 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 39 gagccccagg cgcgcagg 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 40 caggcgcgca gggcacgt 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 41 cccaggcgcg cagggcac 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 42 ccccaggcgc gcagggca 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 43 agccccaggc gcgcaggg 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 44 gagccccagg cgcgcagg 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 45 gagagcccca ggcgcgca 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 46 ggagagcccc aggcgcgc 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 47 tgggagagcc ccaggcgc 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 48 gtgggagagc cccaggcg 18 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 49 agcagggtga cccccgc 17 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 50 gagcagggtg acccccg 17 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 51 ggagcagggt gaccccc 17 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 52 gggagcaggg tgacccc 17 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 53 cgagggagca gggtgac 17 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 54 acgagggagc agggtga 17 <210> 55 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 55 acccacgagg gagcagg 17 <210> 56 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 56 gacccacgag ggagcag 17 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 57 cgacccacga gggagca 17 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 58 aaggcgaccc acgaggg 17 <210> 59 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 59 gaaggcgacc cacgagg 17 <210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 60 cgaaggcgac ccacgag 17 <210> 61 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 61 gtgggcgaag gcgaccc 17 <210> 62 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 62 tgtgggcgaa ggcgacc 17 <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 63 gtgtgggcga aggcgac 17 <210> 64 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 64 ggtgtgggcg aaggcga 17 <210> 65 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 65 gcagggtgac ccccgc 16 <210> 66 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 66 agcagggtga cccccg 16 <210> 67 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 67 gagcagggtg accccc 16 <210> 68 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 68 ggagcagggt gacccc 16 <210> 69 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 69 gggagcaggg tgaccc 16 <210> 70 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 70 gagggagcag ggtgac 16 <210> 71 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 71 cgagggagca gggtga 16 <210> 72 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 72 acgagggagc agggtg 16 <210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 73 cccacgaggg agcagg 16 <210> 74 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 74 acccacgagg gagcag 16 <210> 75 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 75 gacccacgag ggagca 16 <210> 76 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 76 cgacccacga gggagc 16 <210> 77 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 77 aggcgaccca cgaggg 16 <210> 78 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 78 aaggcgaccc acgagg 16 <210> 79 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 79 gaaggcgacc cacgag 16 <210> 80 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 80 cgaaggcgac ccacga 16 <210> 81 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 81 tgggcgaagg cgaccc 16 <210> 82 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 82 gtgggcgaag gcgacc 16 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 83 tgtgggcgaa ggcgac 16 <210> 84 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 84 gtgtgggcga aggcga 16 <210> 85 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 85 ggtgtgggcg aaggcg 16 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 cgcgtccgtc cgtgaaattc c 21 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 caggggatat tgtgacatat ctctgcac 28 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 gaattctgcc accatggccc tcccg 25 <210> 89 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 ctcgagctat aggatccaca gggagg 26 <210> 90 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 ggattcagat ctggtttcag aatcgaagg 29 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 ccaggagatg taactctaat ccaggtttgc 30 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 cgacgttgta aaacgacggc cagt 24 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 ggaaacagct atgaccatga ttac 24 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 tggaaatcaa gtggcaaaaa 20 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 ctgcatgtgg acgtggac 18 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 gcgttcacct cttttccaag 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 gccatgtgga tttctcgttt 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 acccatcact ggactggtgt 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 cacatcctca aagagcctga 20 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 100 tgtgggcgaa ggcgaccc 18 <210> 101 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 101 tgugggcgaa ggcgaccc 18 <210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 102 ugtgggcgaa ggcgaccc 18

Claims

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DUX4-fl mRNA의 뉴클레오티드 번호 502∼556 또는 578∼612의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기 수 15∼30의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그 5' 말단 및/또는 3' 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 올리고뉴클레오티드로서,
DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 1에 있어서,
서열번호 2∼85 중 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
올리고뉴클레오티드의 염기 수가 16∼18인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 3에 있어서,
올리고뉴클레오티드의 염기 수가 18인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드를 구성하는 당 및/또는 인산 디에스테르 결합 중 적어도 1개가 수식되어 있는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 5에 있어서,
올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노오스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2' 위(位)의 수산기의 수식인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 6에 있어서,
당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-O,4'-C-알킬렌화인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 6에 있어서,
당의 수식이 D-리보푸라노오스의 2'-O-메틸화 및/또는 2'-O,4'-C-에틸렌화인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 5 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
인산 디에스테르 결합의 수식이 포스포로티오에이트인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 506에서 549의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기 수 15∼30의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 10에 있어서,
서열번호 5∼31 중 어느 하나의 서열(단, 서열 중의 t는 u이어도 되고, u는 t이어도 됨) 중의 연속하는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
이하 중 어느 하나의 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염:
HO-G^m1s-G^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-C^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-006);
HO-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-A^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-C^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1t-H (DUX4-009);
HO-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-A^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1t-H (DUX4-011);
HO-G^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1t-H (DUX4-014);
HO-G^m1s-A^e2s-G^m1s-C^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-G^e2s-C^m1t-H (DUX4-036);
HO-G^m1s-G^e2s-A^m1s-G^m1s-C^e2s-A^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1s-U^m1sG^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-G^m1t-H (DUX4-037);
HO-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-C^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1t-H (DUX4-040);
HO-C^m1s-G^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-C^m1s-A^e2s-G^m1t-H (DUX4-044);
HO-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-G^e2s-A^m1t-H (DUX4-047);
HO-C^m1s-G^e2s-A^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1t-H (DUX4-048);
HO-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1t-H (DUX4-049);
HO-U^m1s-G^e2s-U^m1s-G^m1s-G^e2s-G^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-A^m1s-G^e2s-G^m1s-C^m1s-G^e2s-A^m1s-C^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-052);
HO-G^m1s-T^e2s-G^m1s-U^m1s-G^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-053);
HO-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^e2s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.7);
HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^e2s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.10);
HO-C^m1s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^e2s-C^m1s-A^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.11);
HO-C^e2s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.12);
HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.14);
HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.15);
HO-C^m1s-G^m1s-A^e2s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^m1s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.19);
HO-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-C^m1s-C^m1s-C^m1s-A^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1t-H (DUX4-48.20);
HO-T^e2s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^e2T-H (DUX4-52.1);
HO-T^e2s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-A^e2s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^m1t-H (DUX4-52.2);
HO-T^e2s-G^m1s-U^m1s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^m1s-C^e2s-C^m1s-C^e2T-H (DUX4-52.7);
HO-U^m1s-G^m1s-T^e2s-G^m1s-G^m1s-G^m1s-C^m1s-G^m1s-A^m1s-A^m1s-G^m1s-G^m1s-C^e2s-G^m1s-A^e2s-C^m1s-C^e2s-C^m1t-H (DUX4-52.9)
[상기의 서열 중, A^e2s, G^e2s, C^e2s 및 T^e2s는 3' 측에 인접하는 구조와 포스포로티오에이트 결합한 대응하는 ENA(C의 염기 부위는 5-메틸시토신임)를 표시한다. A^m1s, G^m1s, C^m1s, U^m1s는 3' 측에 인접하는 구조와 포스포로티오에이트 결합한 대응하는 2'-OMe-RNA를 표시한다. C^e2t는 3' 측에 인접하는 구조와 인산 디에스테르 결합한 대응하는 ENA(C의 염기 부위는 5-메틸시토신임)를 표시한다. A^m1t, G^m1t, C^m1t는 3' 측에 인접하는 구조와 인산 디에스테르 결합한 대응하는 2'-OMe-RNA를 표시한다].
청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 지방산을 포함하는 아미노알킬 인산기가 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 13에 있어서,
지방산이 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 및 베헨산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료에서의 사용을 위한 것인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 15에 있어서,
DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이 면견갑상완형 근이영양증인 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 의약.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료약.
청구항 18에 있어서,
DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이 면견갑상완형 근이영양증인 치료약.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 포함하는 DUX4 유전자의 스플라이싱을 DUX4-fl로부터 DUX4-s로 변환하는 약제.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염을 대상에게 투여하는 것에 의한, 해당 대상에서의 DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료 방법.
청구항 21에 있어서,
DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이 면견갑상완형 근이영양증인 치료 방법.
DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상의 치료약의 제조를 위한 것인 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 그 약학상 허용 가능한 염의 사용.
청구항 22에 있어서,
DUX4-fl 유전자의 발현에 기인하는 질환 또는 증상이 면견갑상완형 근이영양증인 사용.