ES2226135T3 - Nuevos reactivos de transferencia de azufre para la sintesis de oligonucleotidos. - Google Patents
Nuevos reactivos de transferencia de azufre para la sintesis de oligonucleotidos.Info
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Abstract
De nuestras investigaciones para la invención, se han descubierto que dos compuestos comercialmente disponibles son potenciales reactivos con trasferencia de azufre, a saber la 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (1) y el hidruro de xantano (2) así como sus derivados. El estudio de la eficacia y de la optimización de estos nuevos reactivos ha sido realizado mediante síntesis en fase sólida de fosforotioatos de dinucleótido y de oligonucleótido. Los resultados muestran que los dos compuestos (1) y (2) son reactivos de sulfurización muy eficaces, y que una eficacia de sulfurización superior al 99% puede obtenerse en cada etapa. Contrariamente al reactivo de Beaucage, los nuevos reactivos considerados son muy estables en diversos solventes, y están disponible en cantidad y a un coste módico. Teniendo en cuenta las ventajas que presentan, dichos compuestos (1) y (2) pueden considerarse como alternativas al reactivo de Beaucage, particularmente en la elaboración a gran escala de fosforotioatos de oligonucleótido. Además, se han modificado los compuestos (1) y (2) para mejorar su solubilidad en acetonicrilo. Se estima, después de los resultados de las investigaciones realizadas, que los tres tipos de estructuras (fórmulas I, II y III) representan potencialmente reactivos eficacescon transferencia de azufre.
Description
Nuevos reactivos de transferencia de azufre para
la síntesis de oligonucleótidos.
La invención se relaciona con la síntesis química
de oligonucleótidos y con las sustancias químicas útiles en dicha
síntesis. Más en particular, la invención se relaciona con la
sulfuración de los enlaces entre nucleósidos de los
oligonucleótidos.
Los oligonucleótidos se han convertido en
herramientas imprescindibles en la biología molecular moderna,
utilizándose en una amplia variedad de técnicas, que abarcan desde
métodos diagnósticos con sonda al RCP para la inhibición de la
hebra complementaria (antisentido) de la expresión génica.
Los fosforotioatos de oligonucleótidos son de
considerable interés en la investigación de los ácidos nucleicos y
se encuentran entre los análogos probados como oligonucleótidos
terapéuticos.
Los fosforotioatos de oligonucleótidos contienen
enlaces internucleotídicos en los que uno de los átomos de oxígeno
del grupo fosfato que no está formando puente es reemplazado por un
átomo de azufre. Este uso generalizado de los oligonucleótidos ha
conducido a una demanda en aumento de métodos rápidos, de bajo
costo y eficaces, para la síntesis de oligonucleótidos.
La síntesis de los oligonucleótidos para las
aplicaciones antisentido y de diagnóstico puede ahora realizarse
sistemáticamente. Consulte p. ej., Methods in Molecular
Biology (Métodos en Biología molecular), Vol 20:
Protocols for Oligonucleotides and Analogs (Protocolos
para los oligonucleótidos y análogos), pág.
165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993);
Oligonucleotides and Analogues (Oligonucleótidos y análogos): A
Practical Approach (Un enfoque práctico), pág.
87-108 (F. Eckstein, ed., 1991); y Uhlmann y
Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584
(1990); Agrawal e Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12
(1995); y Antisense Research and Applications (Investigación y
aplicaciones de antisentido) (Crooke y Lebleu eds., CRC Press,
Boca Raton, 1993). Los primeros métodos de síntesis incluían la
química de los fosfodiésteres y fosfotriésteres. Khorana et
al, J. Molec. Biol. 72: 209 (1972) divulga la
química de los fosfodiésteres para la síntesis de oligonucleótidos.
Reese, Tetrahedron Lett. 34 3143-3179
(1978), divulga la química de los fosfotriésteres para la síntesis
de oligonucleótidos y polinucleótidos. Estos primeros métodos le
han dejado paso hace tiempo a los métodos de las fosforamiditas y
los H-fosfonatos más eficaces para la síntesis
automatizada. Beaucage y Carruthers, Tetrahedron Lett.
22: 1859-1862 (1981), divulgan el uso de
fosforamidita de desoxinucleósidos en la síntesis de
polinucleótidos. Agrawal y Zamecnik, Patente de los EE.UU. Nº
5,149,798 (1992), divulgan la síntesis optimizada de
oligonucleótidos mediante el método del
H-fosfonato.
Estos últimos métodos se han usado para
sintetizar oligonucleótidos que tienen una variedad de enlaces
internucleotídicos modificados. Agrawal y Goodchild, Tetrahedron
Lett. 28: 3539-3542 (1987), muestra la
síntesis de metilfosfonatos de oligonucleótidos utilizando la
química de la fosforamidita. Connolly et al,
Biochemistry 23: 3443 (1984), divulga la síntesis de
fosforotioatos de oligonucleótidos utilizando la química de la
fosforamidita. Jager et al, Biochemistry 27:
7237 (1988), divulga la síntesis de fosforamidatos de
oligonucleótidos utilizando la química de la fosforamidita. Agrawal
et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
7079-7083 (1988), divulga la síntesis de
fosforamidatos y fosforotioatos de oligonucleótidos utilizando la
química del H-fosfonato.
La síntesis de los oligonucleótidos en fase
sólida mediante cada uno de los procesos previos incluye el mismo
protocolo generalizado. Brevemente, este método comprende el
anclaje del extremo 3' del nucleósido a un soporte sólido
funcionalizado con porciones amino y/o hidroxilo y posteriormente el
agregado de los nucleósidos adicionales en etapas. Los enlaces
entre nucleósidos se forman entre el grupo funcional 3' del
nucleósido entrante y el grupo hidroxilo 5' del extremo 5' del
nucleósido unido al soporte del oligonucleótido naciente. En el
método de la fosforamidita, el enlace entre nucleósidos es un enlace
fosfito, mientras que en el método del H-fosfonato,
el enlace entre nucleósidos es H-fosfonato. Para
crear el enlace fosforotioato que contiene azufre entre
nucleósidos, el enlace fosfito o H-fosfonato se debe
oxidar mediante un reactivo de transferencia de azufre apropiado. En
el método del H-fosfonato, esta sulfuración se
lleva a cabo en todos los enlaces H-fosfonato en un
único paso después de que se completa el montaje de la cadena del
oligonucleótido, usando habitualmente azufre elemental en una
mezcla de disolventes, como CS_{2}/piridina. En contraste, el
método de la fosforamidita permite que la sulfuración en etapas
tenga lugar después de cada acoplamiento, proporcionando de este
modo la capacidad para controlar el estado de cada enlace de manera
dirigida, en el sitio específico. Sobre la base de la superior
eficiencia de acoplamiento, así como de la capacidad de controlar
el estado de cada enlace de manera dirigida, en el sitio
específico, el método de la fosforamidita parece ofrecer
ventajas.
No obstante, todavía es necesario el refinamiento
de las metodologías, particularmente al hacer una transición a la
síntesis en gran escala (10 \mumol a 1 mmol y más). Consulte
Padmapriya et al., Antisense Res. Dev. 4: 185
(1994). Ya se ha informado de varias modificaciones a los procesos
estándar de fosforamidita para facilitar la síntesis (Padmapriya
et al., supra; Ravikumar et al,
Tetrahedron 50: 9255 (1994); Theisen et al.,
Nucleosides & Nucleotides 12: 43 (1994); y Iyer
et al., Nucleosides & Nucleotides 14: 1349
(1995)) y el aislamiento (Kuijpers et al., Nucl. Acids
Res. 18: 5197 (1990); y Reddy et al.,
Tetrahedron Lett. 35 4311 (1994)) de
oligonucleótidos.
Es imperativo el uso de un reactivo de
transferencia de azufre eficaz para la síntesis de fosforotioatos
de oligonucleótidos mediante el método de la fosforamidita. El
azufre elemental no es eficaz debido a su escasa solubilidad y la
lenta reacción de sulfuración. En los últimos años se ha informado
de algunos reactivos de sulfuración más eficaces. Estos incluyen a
disulfuro de fenilacetilo, (Kamer et al. Tetrahedron
Lett. 30: 6757-6760 (1989)),
H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido
(reactivo de Beaucage) (Iyer et al., J. Org. Chem.
55: 4693-4699 (1990)), disulfuro de
tetraetiltiurama (TETD) (Vu et al., Tetrahedron Lett.
32: 3005-3008 (1991)), tetrasulfuro de
dibenzoilo (Rao et al., Tetrahedron Lett. 33:
4839-4842 (1992)),
(S-Tetra)(disulfuro de
bis(O,O-diisopropoxifosfinotiol) (Stec et al.
Tetrahedron Lett. 33: 5317-5320
(1993)), tetratiomolibdato de benciltrietilamonio (BTTM) (Rao et
al, Tetrahedron Lett. 35:
6741-6744 (1994)), disulfuro de
bis(p-toluensulfonilo) (Effimov et
al., Nucl. Acids Res. 23:
4029-4033 (1995)),
3-etoxi-1,2,4-ditiazolin-5-ona
(EDITH) (Xu et al., Nucleic Acid Res.
24:1602-1607 (1996)), y
1,2,4-ditiazolidin-3,5-diona
(DtsNH) (Xu et al., Nucleic Acid Res.
24:1602-1607 (1996)). Tanto el reactivo de
Beaucage como el TETD están disponibles comercialmente.
El reactivo de Beaucage ha sido ampliamente
utilizado aunque su síntesis y estabilidad no son óptimas. Además,
el subproducto formado por el reactivo de Beaucage durante la
sulfuración,
3H-2,1-benzoxantiolan-3-ona-1-óxido,
es un potencial oxidante que puede dar lugar a enlaces fosfodiéster
indeseables en determinadas circunstancias. Por consiguiente, su
aplicación en la síntesis a gran escala de fosforotioatos de
oligonucleótidos puede no ser particularmente apropiada. Informamos
sobre dos compuestos comercialmente disponibles, los compuestos 1 y
2 y sobre nuevos análogos de éstos como potenciales reactivos de
sulfuración alternativos. Se conocen algunos análogos de estos
compuestos, por ejemplo; US 3,753,908, 5,502,066, Tittelbach, F,
(1991) en J. Prakt. Chem., 333(1), 107-117,
y Tittelbach, F. et al. (1992) en J. Prakt. Chem.,
334(8), 685-690.
Hay, por consiguiente, una continua necesidad de
desarrollar nuevos reactivos de transferencia de azufre y procesos
para la sulfuración de oligonucleótidos. En condiciones ideales,
tales reactivos de transferencia de azufre deberían tener bajo
costo de fabricación, ser estables durante el almacenamiento y
sumamente eficaces.
La invención proporciona nuevos procesos para el
uso de los reactivos de transferencia de azufre en la sulfuración de
oligonucleótidos. Los procesos de acuerdo con la invención producen
reactivos de bajo costo de fabricación, estables durante el
almacenamiento y sumamente eficaces en la sulfuración.
En un primer aspecto, la invención proporciona
nuevos reactivos de transferencia de azufre que tienen la estructura
de acuerdo con la fórmula I:
donde X es R^{1},
NR^{2}R^{3}, NR^{4}COR^{5}, SR^{6} u OR^{7}; cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} es independientemente H
o un grupo orgánico alquilo o aromático; y cada R^{6} y R^{7}
es independientemente un grupo orgánico alquilo o
aromático.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona
con nuevos reactivos de transferencia de azufre que tienen la
estructura general de acuerdo con la fórmula II:
donde R^{8} es H o un grupo
orgánico; y R^{9} es un grupo
orgánico.
Otro aspecto de la invención provee de nuevos
reactivos de transferencia de azufre con la estructura general de
acuerdo con la fórmula III:
donde R^{10} es un grupo orgánico
y R^{11} es
H,
En un cuarto aspecto, la invención proporciona
nuevos procesos para el agregado de un grupo de azufre a un enlace
entre nucleósidos de un oligonucleótido, el proceso comprende poner
en contacto un oligonucleótido que tiene al menos un enlace entre
nucleósidos que se puede sulfurar, con un reactivo de transferencia
de azufre de fórmula (I);
donde X es R^{1},
NR^{2}R^{3}, NR^{4}COR^{5}, SR^{6} u OR^{7}; cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5}, es independientemente
H o un grupo orgánico alquilo o aromático; y cada R^{6} y R^{7}
es independientemente un grupo orgánico alquilo o aromático:
Fórmula
(II);
donde R^{8} es H o un grupo
orgánico; y R^{9} es un grupo orgánico: o de fórmula
(III);
donde R^{10} y R^{11} son cada
uno independientemente H o un grupo orgánico: por un tiempo
suficiente para que se produzca la sulfuración del enlace o de los
enlaces entre
nucleósidos.
En las materializaciones preferidas, los procesos
nuevos de acuerdo con la invención comprenden poner en contacto un
oligonucleótido que tiene al menos un enlace entre nucleósidos que
se puede sulfurar, con un reactivo de transferencia de azufre nuevo
de acuerdo con la invención, por un tiempo suficiente para que se
produzca la sulfuración del enlace o de los enlaces entre
nucleósidos.
La Figura 1 muestra el análisis por HPLC del
dímero fosfotioato T-T estándar, protegido con DMT.
La Figura 1A muestra el análisis por HPLC del dímero P=S estándar.
La Figura 1B muestra la coinyección de los dímeros P=S y P=O.
La Figura 2 muestra el análisis por HPLC del
dímero fosfotioato T-T protegido con DMT
sintetizado con el compuesto 1 como reactivo de transferencia de
azufre. La Figura 2A representa las condiciones de sulfuración con 4
equiv., 1 min. La figura 2B representa las condiciones de
sulfuración con 4 equiv., 5 min. La figura 2C representa las
condiciones de sulfuración con 12 equiv., 1 min. La figura 2D
representa las condiciones de sulfuración con 12 equiv., 5 min.
La Figura 3 es el análisis por HPLC del dímero
fosfotioato T-T protegido con DMT preparado con el
compuesto 2 como reactivo de transferencia de azufre.
La Figura 4 es el análisis por HPLC del dímero
fosfotioato T-T protegido con DMT preparado usando
el compuesto 3 como reactivo de transferencia de azufre.
La Figura 5 es el análisis por HPLC del dímero
fosfotioato T-T protegido con DMT sintetizado con
el compuesto 4 como reactivo de transferencia de azufre.
La Figura 6 muestra el análisis por HPLC de SEQ
Nº de ID: 1 sintetizado con el compuesto 1 como reactivo de
transferencia de azufre. La Figura 6A representa 1 min de
sulfuración en cada ciclo de síntesis. La Figura 6B representa 2
min de sulfuración en cada ciclo de síntesis.
La Figura 7 representa la EC de SEQ Nº de ID: 1
sintetizado con el compuesto 1 como reactivo de transferencia de
azufre donde la sulfuración se produjo durante 1 min.
La Figura 8 representa la EC de SEQ Nº de ID: 1
sintetizado con el compuesto 1 como reactivo de transferencia de
azufre donde la sulfuración se produjo durante 2 min.
La invención se relaciona con la síntesis química
de oligonucleótidos y con las sustancias químicas útiles en dicha
síntesis. Más en particular, la invención se relaciona con la
sulfuración de los enlaces entre nucleósidos de los
oligonucleótidos. Las patentes y publicaciones identificadas en esta
especificación están dentro del área de conocimiento de los
técnicos con experiencia en este campo y se incorporan aquí en su
totalidad como referencia.
La invención proporciona nuevos reactivos de
transferencia de azufre y nuevos procesos para su uso en la
sulfuración de oligonucleótidos. Los reactivos de transferencia de
azufre de acuerdo con la invención son de bajo costo de
fabricación, estables durante el almacenamiento y en los procesos de
sulfuración son muy eficaces.
En un primer aspecto, la invención proporciona
nuevos reactivos de transferencia de azufre que tienen una
estructura de acuerdo con la fórmula I:
donde X es R^{1},
NR^{2}R^{3}, NR^{4}COR^{5}, SR^{6} u OR^{7}; cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} es independientemente H
o un grupo orgánico alquilo o aromático; y cada R^{6} y R^{7}
es independientemente un grupo orgánico alquilo o
aromático:
siempre que:
cuando X es NR^{2}R^{3}, R^{2} y R^{3} no
sean ambos H ni sean ambos CH_{3};
cuando X es NHCOR^{5}, R^{5} no sea un grupo
alquilo de C_{8} o más.
En una materialización preferida, el reactivo de
transferencia de azufre que tiene la fórmula I es,
3-N-acetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(3),
3-N-trimetilacetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(4),
3-N-benzoil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(5), o
3-N-bencensulfonil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(6).
En un segundo aspecto, la invención se relaciona
con nuevos reactivos de transferencia de azufre que tienen la
estructura general de acuerdo con la fórmula II:
donde R^{8} es H o un grupo
orgánico; y R^{9} es un grupo
orgánico.
Otro aspecto de la invención provee de nuevos
reactivos de transferencia de azufre que tienen la estructura
general de acuerdo con la fórmula III:
donde cada R^{10} es un grupo
orgánico y R^{11} es
H.
En una materialización preferida, el reactivo de
transferencia de azufre que tiene la fórmula III es
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(1), hidruro de xantano (2),
3-N-acetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(3),
3-N-trimetilacetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(4),
3-N-benzoil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(5), o
3-N-bencensulfonil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(6).
Los compuestos 1 y
2,3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
e hidruro de xantano respectivamente, son comercializados por varias
empresas de productos químicos, incluidas Lancaster, Crescent
Chemicals, Maybridge y TCI América. La pureza de los compuestos 1 y
2 obtenidos es superior al 98 %, y ambos compuestos pueden ser
utilizados directamente en la síntesis de oligonucleótidos sin
ninguna purificación adicional. Estos compuestos han sido
utilizados en la industria del caucho como reactivos de
vulcanización. Sin embargo, estos compuestos, a nuestro leal saber,
no han sido utilizados en la síntesis de oligonucleótidos.
Se pueden sintetizar fácilmente derivados del
compuesto 1. Partiendo del compuesto 1, se prepararon de manera
conveniente
3-N-acetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(3),
3-N-trimetilacetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(4),
3-N-benzoil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(5) y
3-N-bencensulfonil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(6) por el método en fase sólida de fosforamidita con un
rendimiento superior al 70% según el Esquema 1.
Esquema
1
Como se explica más detalladamente a
continuación, las condiciones de la reacción incluyen anhídrido
acético/piridina para 3 (96%); anhídrido trimetilacético/Et_{3}N
para 4 (70%); cloruro de benzoilo/Et_{3}N para 5 (70%); y cloruro
de bencensulfonilo/Et_{3}N para 6 (76%). Los productos finales se
pueden purificar mediante una precipitación simple.
Se realizaron estudios de estabilidad y
solubilidad de los reactivos de transferencia de azufre. Los
compuestos 1-6 son estables en CH_{3}CN,
piridina-CH_{3}CN (1:9), y piridina durante más de
una semana. No se produjo ninguna precipitación durante el período
de prueba. Todos los reactivos de prueba son estables durante la
operación del sintetizador de ADN automático, no se observaron
obstrucción ni otros problemas durante las síntesis.
Los compuestos originales 1 y 2 se pueden
disolver en CH_{3}CN para preparar una solución 0,01 M. Su
solubilidad se puede aumentar mediante el agregado de piridina
[0,02 M en piridina-CH_{3}CN (1:9); 0,5 M en
piridina pura]. La obtención de derivados de los compuestos
originales también puede mejorar la solubilidad en CH_{3}CN
(>0,02 M), p. ej., el compuesto 4 tiene una solubilidad superior
a 1 M en CH_{3}CN puro.
En consecuencia, se ha demostrado que los
fosforotioatos de oligonucleótido pueden ser preparados eficazmente
mediante el método de fosforamidita en fase sólida usando
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(1), hidruro de xantano (2) y sus correspondientes derivados. Los
compuestos 1 y 2 están comercialmente disponibles y su costo es
relativamente bajo en comparación con los reactivos de sulfuración
que se usan comúnmente, como el reactivo de Beaucage y EDITH.
Debido a su elevada eficacia y bajo costo, los compuestos 1 y 2 y
sus análogos apropiadamente modificados pueden considerarse como una
opción ventajosa al reactivo de Beaucage, especialmente en la
preparación a gran escala de fosforotioatos de oligonucleótido.
En otro aspecto, la invención proporciona
procesos nuevos para agregar un grupo de azufre a un enlace entre
nucleósidos de un oligonucleótido usando los nuevos reactivos de
transferencia de azufre de acuerdo con la invención. En las
materializaciones preferidas, los procesos nuevos de acuerdo con la
invención comprenden poner en contacto un oligonucleótido que tiene
al menos un enlace entre nucleósidos que se puede sulfurar, con un
reactivo de transferencia de azufre nuevo de acuerdo con la
invención, por un tiempo suficiente para que se produzca la
sulfuración del enlace o de los enlaces entre nucleósidos. Cada
enlace entre nucleósidos que se puede sulfurar contiene
preferentemente un átomo de fósforo (III). En una materialización
particularmente preferida el enlace entre nucleósidos que se puede
sulfurar es un enlace entre nucleósidos fosfito, tiofosfito,
H-fosfonato,
tio-H-fosfonato, o alquilfosfito
(especialmente metilfosfito). Preferentemente, se permitirá que la
reacción de sulfuración proceda hasta una eficacia de transferencia
de azufre mayor que la esperada para los compuestos de la técnica
previa, según se midió por ^{31}P-NMR. En las
condiciones de síntesis normal, con los nuevos reactivos de
transferencia, dicha eficacia se logra entre aproximadamente 1 y 5
minutos de tiempo de reacción. De manera característica, la reacción
tiene lugar en piridina, THF o mezclas de éstos. A efectos de este
aspecto de la invención, el término oligonucleótido incluye
polímeros lineales, de dos o más desoxirribonucleótidos,
ribonucleótidos, o monómeros de ribonucleótidos
2'-O-sustituidos, naturales o
cualquier combinación de éstos. El término oligonucleótido también
abarca los polímeros que tienen bases o azúcares modificadas
químicamente y/o análogos no nucleósidos unidos por enlaces
fosfodiéster o análogos de éstos que varían en tamaño de unas pocas
unidades monómeras, p. ej., 2-3, a varias cientos de
unidades monómeras y/o que tienen sustituyentes adicionales,
incluidos entre otros grupos lipófilos, agentes de intercalación,
diaminas y adamantano. En particular, los oligonucleótidos también
pueden incluir oligómeros no naturales que tienen enlaces que
contienen fósforo entre nucleósidos, cuyos precursores de fósforo
(III) son susceptibles de sulfuración (Consulte, p. ej., Takeshita
et al., J. Biol. Chem 282:
10171-10179 (1987).) A efectos de la invención, el
término"2'-O-sustituido" quiere
decir sustitución en la posición 2' de la porción pentosa con un
grupo -O-alquilo de bajo peso molecular que
contenga 1-6 átomos de carbono saturados o
insaturados, o con un grupo -O-arilo u
-O-alilo que tenga 2-6 átomos de
carbono, donde dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede ser no
sustituido o sustituido, p. ej., con grupos halógeno, hidroxi,
trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxi,
carbalcoxi, o amino; o con un grupo hidroxi, amino o halógeno, pero
no con un grupo 2'-H. Dichos oligonucleótidos
pueden incluir cualquiera de los enlaces entre nucleósidos
conocidos por los técnicos, incluidos pero no exclusivamente
enlaces fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato
(especialmente metilfosfonato), fosforamidato, amida (PNA),
carbamato y alquilfosfonotioato. En una materialización preferida
el oligonucleótido está unido a un soporte sólido pero dichos
oligonucleótidos se pueden sulfurar también en solución.
La eficacia de estos nuevos reactivos de
transferencia de azufre fue primero evaluada mediante síntesis en
fase sólida del fosforotioato de dinucleótido,
5'-DMT-TT-OH-3'.
(Figura 1.) La síntesis se realizó a escala de 1,0 \mumol
empleando el protocolo estándar de fosforotioato ("THIO 1
\mumol"). El fosforotioato de dinucleótido se analizó por HPLC
en fase reversa. Los resultados muestran que se logró una eficacia
de transferencia de azufre superior al 99% usando los compuestos 1
y 2. (Figuras 2 y 3, respectivamente). También se encontró que los
compuestos 3-4 eran eficaces reactivos de
transferencia de azufre. (Figuras 4-5.)
Para evaluar aún más la utilidad de los
compuestos 1 y 2 como eficaces reactivos de sulfuración, se
sintetizó un fosforotioato de oligonucleótido,
5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3' (SEQ
Nº de ID: l), a escala de 1,0 \mumol empleando una solución 0,02
M en CH_{3}CN/piridina (9:1) durante 1 ó 2 min de sulfuración en
cada ciclo de síntesis. Después de la liberación amoniolítica del
CPG y la desprotección, el fosforotioato de oligonucleótido crudo
se analizó por intercambio iónico-HPLC y EC.
(Figuras 6-8.) Los resultados indican que se
alcanzó una eficiencia de transferencia de azufre de más del 99,5%
en cada paso, y que se obtuvo un rendimiento superior al 80% en
estas síntesis (consulte la figura 3).
Los siguientes ejemplos están destinados a
ilustrar aún más ciertas materializaciones preferidas de la
invención y no están concebidos para ser de carácter
restrictivo.
En general, la piridina anhidra y el
CH_{2}Cl_{2}, fueron adquiridos a Aldrich (Milwaukee, WI). El
CH_{3}CN anhidro fue adquirido a J. T. Baker Inc. (Phillipsburg,
NJ), dT-CPG, cianoetilfosforamidita de
5'-DMT-timidina, Cap A, Cap B, el
activador, las soluciones de oxidación y desbloqueo fueron
adquiridos a PerSeptive Biosystems, (Framingham, MA). El reactivo
de Beaucage
(^{3}H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido)
fue adquirido a R. I. Chemical (Orange, CA). Todos los otros
productos químicos fueron adquiridos a Aldrich. Los espectros
^{31}P NMR (121,65 MHz) y los espectros de ^{1}H NMR (300 MHz)
se registraron en una unidad Varian UNITY 300 (el desplazamiento
químico se correlacionó con 85% de H_{3}PO_{4} y
tetrametilsilano, respectivamente). Las síntesis de dinucleótidos y
oligonucleótidos se realizaron en un sintetizador automático de
ácidos nucleicos (8909 Expedite™, Millipore, Bedford, MA). El HPLC
en fase reversa se realizó en una bomba Waters 600E con un detector
de absorbancia Waters 440, un integrador Waters 746 y una columna
Nova-Pak C18 (3,9 X 150 mm), usando un gradiente
lineal de CH_{3}CN-sol. acuosa de NH_{4}OAc
(0,1 M) (4:1) y sol. acuosa de NH_{4}OAc 0,1 M de 1:9 a 3:2
durante un período de 40 min, velocidad de flujo de 2 mL/min y
detección a 260 nm. Los análisis de intercambio
iónico-HPLC se realizaron en un sistema Beckman
Gold 126 con un detector de absorbancia Beckman 166 en una columna
NUCEOPAC PA-100 (4 x 50 mm) usando un gradiente
lineal de solución amortiguadora A (25 mM de
Tris-HCl y 1 mM de EDTA, CH_{3}CN, pH=8) y de
solución amortiguadora B (NaCl 2 M y solución amortiguadora A)
desde 100% de A a 100% de B durante un período de 5 min, luego se
mantuvieron a 100%de B durante 3 min, velocidad de flujo 2 mL/min y
detección a 254 nm. Se realizó una electroforesis capilar en un
sistema Beckman P/ACE 5010. Las muestras se inyectaron durante 5
segundos y se analizaron durante 40 min.
El compuesto
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(1) es comercializado con una pureza del 98% por varias empresas de
productos químicos, incluidas Lancaster, Crescent Chemicals y
Maybridge y puede ser directamente utilizado sin purificación
adicional.
El hidruro de xantano, compuesto (2) es
comercializado por TCI América con una pureza del 98% y puede ser
directamente utilizado sin ninguna purificación posterior.
Se agregó gota a gota anhídrido acético puro
(1,49 mL, 16 mmol) a la suspensión de
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(compuesto 1, 2,0 g, 13 mmol) en la mezcla de
piridina-CH_{3}CN (1:5, 50 mL) durante un período
de 30 min. La solución transparente resultante de color amarillo se
agitó a 25ºC durante 1 h y después se concentró a presión reducida.
El sólido amarillo resultante se disolvió en EtOAc (500 mL), se
lavó con solución acuosa de ácido cítrico al 10% (500 mL), H_{2}O
(2 x 500 mL) y luego solución saturada de cloruro de sodio (500 mL)
y a continuación se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La evaporación del
disolvente orgánico produjo el sólido amarillo del título.
Rendimiento: 2,50 g (96%); p.f. 229,6-230,1ºC
Se agregó anhídrido trimetilacético puro (3,20
mL, 16 mmol) a la suspensión de
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(compuesto 1, 2,0 g, 13 mmol) en la mezcla de
Et_{3}N-CH_{2}Cl_{2} (1:5, 30 mL) en una
porción. Se obtuvo una solución transparente de color amarillo en
10 min, se agitó a 25ºC durante 2 h, y luego se concentró a presión
reducida. El sólido amarillo resultante se disolvió en EtOAc (100
mL), se lavó con sol ac. de ácido cítrico al 10% (2 x 100 mL),
H_{2}O (2 x 100 mL), luego solución saturada de cloruro de sodio
(100 mL) y a continuación se secó sobre Na_{2}SO_{4}.
El disolvente orgánico se eliminó a presión
reducida, el sólido amarillo resultante se trató con hexano (100
mL) y se almacenó a 4ºC durante 2 h. El precipitado amarillo se
recogió por filtración, se lavó con hexano (3 x 5 mL), y se secó al
vacío. Rendimiento: 2,17 g (70%); p.f.
179,6-179,6ºC
3-Amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona
(compuesto 1, 1,0 g, 6,6 mmol) se suspendió en la mezcla de
Et_{3}N-CH_{2}Cl_{2} (1:5, 20 mL), seguido del
agregado de cloruro benzoico (0,92 mL, 1,2 equiv). Se obtuvo una
solución transparente de color amarillo en 5 min. La solución de
reacción se agitó: a 25ºC durante 2 h y luego se concentró a
presión reducida para eliminar el disolvente orgánico. El sólido
amarillo resultante se trató con EtOAc (200 mL), el sólido insoluble
se separó por filtración, y la capa de EtOAc se lavó con solución
ac. de ácido cítrico al 10% (2 x 200 mL), H_{2}O (2 x 200 mL) y
solución saturada de cloruro de sodio (200 mL) y se secó sobre
Na_{2}SO_{4}. La evaporación de EtOAc produjo un sólido
amarillo, que fue tratado con CH_{2}Cl_{2} (100 mL), seguido
luego del agregado de hexano (100 mL). El sólido resultante se
separó por filtración, y el filtrado se eliminó a presión reducida
para producir un sólido amarillo. Rendimiento: 1,17 g (70%).
Excepto porque se usó cloruro de bencensulfonilo
en vez de cloruro benzoico, las condiciones de reacción y el proceso
de preparación son idénticos al de la preparación del compuesto 5.
Rendimiento: 1,46 g (76%).
En todos los casos, los estudios de solubilidad y
estabilidad se llevaron a cabo en CH_{3}CN,
piridina-CH_{3}CN (1:9), y piridina a 25ºC. La
solución saturada se secó, y se determinó la solubilidad mediante
el peso de los compuestos de análisis en el volumen exacto de
solución de análisis. La estabilidad se determinó sobre la base de
los análisis o bien de TLC o bien de HPLC.
Se montó el dímero sobre un ADN/ARN PerSeptive
(Millipore 8909 Expedite™, Millipore, Bedford, MA) a una escala de
0,1 \mumol empleando el protocolo de síntesis "THIO 1
\mumol" (versión de software Expedite 1.01), comenzando a
partir de
DMT-T-Su-CPG (500
\ring{A}, carga: 60 \mumol/g). Los reactivos de sulfuración se
prepararon o bien en CH_{3}CN o bien en
piridina-CH_{3}CN (1:9) a una concentración 0,02
M a menos que se especifique otra cosa. La sulfuración se llevó a
cabo utilizando 4 equiv. o 12 equiv. de reactivos de sulfuración
durante 1 o 5 min de reacción, respectivamente. La ruptura final se
llevó a cabo mediante tratamiento utilizando hidróxido de amonio
concentrado (1 \mumol/1 mL) a 25ºC durante 1 h. El CPG y otros
residuos insolubles se separaron por filtración, y la solución de
hidróxido de amonio se secó mediante liofilización.
El análisis de HPLC se llevó a cabo utilizando un
gradiente lineal de sol. acuosa de NH_{4}OAc 0,1 M y
CH_{3}CN-sol. acuosa de NH_{4}OAc (0,1 M) (4:1)
de 1:9 a 3:2 durante un período de 40 min, velocidad de flujo 1,0
mL/min y detección a 260 nm. Los diastereoisómeros de
5'-DMT-T(P=S)-T-OH-3'
eluyeron a t_{R}= 31,6 min y t_{R}= 31,7 min. El dímero P=O
correspondiente eluyó a t_{R}= 28,4 min. (Figura 1.)
El montaje de la cadena se llevó a cabo usando el
mismo protocolo que se describió en la síntesis del fosforotioato de
dinucleótido. El reactivo de sulfuración (compuesto 1) se preparó a
una concentración 0,02 M en piridina-CH_{3}CN
(1:9), y la sulfuración se llevó a cabo usando 12 equiv. durante 1
ó 2 min respectivamente. Se realizaron análisis de intercambio
iónico-HPLC y de EC para evaluar la síntesis de este
oligómero.
Claims (19)
1. Un reactivo de transferencia de azufre que
tiene la estructura general de acuerdo con la fórmula I.
donde X es R^{1},
NR^{2}R^{3}, NR^{4}COR^{5}, SR^{6} u OR^{7}; cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} es independientemente H
o un grupo orgánico alquilo o aromático; y cada R^{6} y R^{7}
es independientemente un grupo orgánico alquilo o
aromático:
siempre que:
cuando X es NR^{2}R^{3}, R^{2} y R^{3} no
sean ambos H ni ambos CH_{3}; y
cuando X es NHCOR^{5}, R^{5} no sea un grupo
alquilo de C_{8} o más.
2. El reactivo de transferencia de azufre de
acuerdo con la reivindicación 1 donde la fórmula I es
3-N-acetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
3-N-trimetilacetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
3-N-benzoil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
o
3-N-bencensulfonil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
3. Un reactivo de transferencia de azufre que
tiene la estructura general de acuerdo con la fórmula II
donde R^{8} es H o un grupo
orgánico; y R^{9} es un grupo
orgánico.
4. Un reactivo de transferencia de azufre que
tiene la estructura general de acuerdo con la fórmula III
donde R^{10} es un grupo orgánico
y R^{11} es
H.
siempre que R^{10} no sea un NCOalquilo en el
que el grupo alquilo es C_{8} o mayor.
5. Un proceso para el agregado de un grupo de
azufre a un enlace entre nucleósidos de un oligonucleótido; donde
el proceso comprende poner en contacto un oligonucleótido que tiene
al menos un enlace entre nucleósidos que se puede sulfurar con un
reactivo de transferencia de azufre de fórmula (I);
donde X es R^{1},
NR^{2}R^{3}, NR^{4}COR^{5}, SR^{6} u OR^{7}; cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5}, es independientemente
H o un grupo orgánico alquilo o aromático; y cada R^{6} y R^{7}
es independientemente un grupo orgánico alquilo o aromático:
Formula
(II);
donde R^{8} es H o un grupo
orgánico; y R^{9} es un grupo orgánico: o de Fórmula
(III);
donde R^{10} y R^{11} son cada
uno independientemente H o un grupo
orgánico:
por un tiempo suficiente para que se produzca la
sulfuración del enlace o de los enlaces entre nucleósidos.
6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5
en que el agente de transferencia de azufre es
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
hidruro de xantano,
3-N-acetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
3-N-trimetilacetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
3-N-benzoil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
o
3-N-bencensulfonil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
7. El proceso de acuerdo o bien con o la
reivindicación 5 o bien con la reivindicación 6, donde cada enlace
entre nucleósidos que se puede sulfurar contiene un átomo de
fósforo (III).
8. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, donde el enlace entre nucleósidos que se
puede sulfurar es un enlace entre nucleósidos fosfito, tiofosfito,
H-fosfonato,
tio-H-fosfonato, o
alquilfosfito.
9. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, donde se permite que la reacción de
sulfuración proceda de 1 a 5 minutos aproximadamente.
10. Un proceso para la síntesis de
oligonucleótidos que comprende poner en contacto un oligonucleótido
que tiene al menos un enlace entre nucleósidos que se puede
sulfurar con un reactivo de transferencia de azufre, en el que el
agente de transferencia de azufre tiene la fórmula (I);
donde X es R^{1},
NR^{2}R^{3}, NR^{4}COR^{5}, SR^{6} u OR^{7}; cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5}, es independientemente
H o un grupo orgánico alquilo o aromático; y cada R^{6} y R^{7}
es independientemente un grupo orgánico alquilo o aromático:
Formula
(II);
donde R^{8} es H o un grupo
orgánico; y R^{9} es un grupo orgánico: o de fórmula
(III);
donde R^{10}y R^{11} son cada
uno independientemente H o un grupo
orgánico.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 donde el reactivo de transferencia de azufre es
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 donde el reactivo de transferencia de azufre es hidruro de
xantano.
13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 donde el reactivo de transferencia de azufre es
3-N-acetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 donde el reactivo de transferencia de azufre es
3-N-trimetilacetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 donde el reactivo de transferencia de azufre es
3-N-benzoil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 donde el reactivo de transferencia de azufre es
3-N-bencensulfonil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
17. Un proceso para la síntesis de
oligonucleótidos que comprende un proceso para agregar un grupo de
azufre a un enlace entre nucleósidos según se describe en
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.
18. El uso de un compuesto de fórmula (I);
donde X es R^{1},
NR^{2}R^{3}, NR^{4}COR^{5}, SR^{6} u OR^{7}; cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5}, es independientemente
H o un grupo orgánico alquilo o aromático; y cada R^{6} y R^{7}
es independientemente un grupo orgánico alquilo o aromático: Fórmula
(II);
\newpage
donde R^{8} es H o un grupo
orgánico; y R^{9} es un grupo orgánico: o de fórmula
(III);
donde R^{10} y R^{11} son cada
uno independientemente H o un grupo orgánico; para la síntesis de
oligonucleótidos.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18
donde el compuesto de fórmula (I), (II) o (III) es seleccionado
entre el grupo constituido por
3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
hidruro de xantano,
3-N-acetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
3-N-trimetilacetil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
3-N-benzoil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona,
o
3-N-bencensulfonil-3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona.
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