JP2002335980A - Ａｉｐ処理により発現の変化する新規遺伝子群 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本アポトーシスと関連する遺伝子を得ること
を目的とする。 【解決手段】 アポトーシス誘導蛋白質ＡＩＰの処理に
より、ヒト細胞中でその発現が増加する遺伝子としてhR
UPP-1 (human homolog 1 of Round-Up Phenotype Prote
in)、及び、hRRCP-1 (human homolog 1 of Real Ring-C
anal Protein)、並びに、減少する遺伝子として小胞体
ストレス センサー蛋白質hERRj-1（human homolog 1 of
Endoplasmic Reticulum Rumenal Dnaj）をクローニン
グした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、寄生虫感染魚から
得られたアポトーシス誘導蛋白質ＡＩＰの処理により、
ヒト細胞中でその発現が変化する新規遺伝子群に関す
る。

【０００２】

【従来技術】ＡＩＰは増殖期にある細胞に特異的にアポ
トーシスを強く誘導する新しい因子として、寄生虫感染
魚から本発明者により精製及びクローニングされた新規
のアポトーシス誘導蛋白質である[Jung,S-K.et al.,J.I
mmunol.165,1491-1497,2000;Murakawa,M.et al.,Cell d
eath Differ.,in press]。ＡＩＰは、10ng/ml以上では
過酸化水素の産生及び培地中のアミノ酸リジンの枯渇を
誘導し、この２つの違うメカニズムにより、増殖性の高
い様々のヒト癌細胞で非常に効率よく細胞死を引き起こ
す。また、1ng/ml以下の低濃度では癌細胞の増殖を阻害
することができる。

【０００３】最近ではアポトーシスを誘導する細胞表面
受容体Fas抗原、アポトーシス誘導に必須のプロテアー
ゼ(カスパーゼ)、アポトーシスを阻害する癌遺伝子bcl-
2、抑制するc-myc等が明らかにされ、アポトーシスに関
する細胞内情報伝達機構が明かになりつつある。Fasは
アポトーシス シグナルの代表的な分子で、Fasリガンド
や抗Fas抗体刺激により細胞死を誘導する受容体として
機能し、自己免疫疾患や癌などに関与している。アポト
ーシスは発生・分化、正常組織や細胞のターン・オーバ
ー等の生理的な生体の恒常性の維持に重要なプロセスに
加え、癌の退縮、放射線や抗癌剤の作用、ＡＩＤＳ等の
ウイルス感染によるリンパ球の減少、炎症等の疾病にも
関与していると考えられている。アポトーシスを調節す
る医薬品の開発は、脳神経系、癌、老化等の幅広い分野
の新薬を生み出す可能性があると考えられている。

【０００４】アポトーシスを検出するマーカーも公知で
ある。例えば、Ｆａｓシグナルにより特異的に分解され
る蛋白質(ＰＡＲＰ、Lamin、DFF45、Caspase等)を検出
する方法が用いられており、アポトーシスを特異的に分
解された蛋白質を検出することにより検出するキット、
または、抗体が市販されている(MBL社、Santa Cruz Bio
technology社、プロメガ社、Chemicon International
社、Affinity Bioreagents社、Stressgen Biotechnolog
ies社等)。

【０００５】近年ユビキチン/プロテアソームによる不
可逆的な蛋白質分解制御が、シグナル伝達経路において
重要な役割を担うことが明かとなった。ユビキチン/プ
ロテアソーム系は真核生物の間で保存性が高く、基本的
な細胞機能を担っているシステムの1つであると考えら
れている。シグナル伝達依存的に分解される蛋白質の多
くは分解に先立ちポリユビキチン化されることが知ら
れ、ポリユビキチン化蛋白質は蛋白質分解装置プロテア
ソームによって速やかに分解され、生体内の蛋白質の動
的平衡状態を保っていると考えられている。シグナル依
存的に活性化または発現誘導される転写因子群Jun、Fo
s、Myc、p53及びNF-κBの抑制性因子I-κB、多くのサイ
クリン関連蛋白質がユビキチン/プロテアソームによる
制御を受け、ユビキチン化による蛋白質分解は細胞の癌
化(分化)、増殖、炎症、ストレス応答等の様々な生理現
象に関わっていると考えられている。

【０００６】例えば、プロテオソームによる分解制御を
受ける癌抑制遺伝子p53は、大腸癌、脳腫瘍、肝癌、膀
胱癌、食道癌等のほとんどのヒト腫瘍で高頻度に変異の
見出される癌制御遺伝子として有名である。DNAの損傷
によるp53の安定化や活性化が起こると、細胞の増殖抑
制活性を伴う細胞死が誘導される。従って、p53遺伝子
に変異を有する細胞は、DNAに異常が生じても細胞の増
殖抑制やアポトーシスの誘導が起こらずに増殖し続け、
異常な染色体を持った細胞(癌細胞)が蓄積することとな
る。

【０００７】Ring-canal蛋白質kelchはドロソフィラの
ミュータント解析より得られた蛋白質で、アクチン結合
蛋白質として働き、ドロソフィラでは細胞質輸送やアク
チンフィラメントの構築等に欠かせない分子である[Xu
e,F.et al.,Cell 72,681-693,1993]。アクチン フィラ
メントは細胞の極性や移動[Lauffenburger,D.A. et a
l.,Cell 84,359-369,1996]、mRNAの輸送[Agutter,P.S e
t al.,.Biochem.Soc.Trans. 19,1094-1098,1991]、神経
突起の形成[Riederer,B.M.,Eur.J.Morphol. 28,347-37
8,1990]等に関わり、アクチン フィラメント形成は様々
なアクチン結合蛋白質によって制御を受ける。ドロソフ
ィアのkelch欠損ミュータントはRing canalが形成でき
なくなることによって、卵子発生過程に細胞質輸送機能
を失い、その結果雌性受精となることが知られている。
哺乳類におけるRing canal構造も細胞内あるいは細胞間
の物質輸送に働き、細胞の正常な機能を維持する可能性
がある。

【０００８】アクチン結合能を有するKeap１が、酸化ス
トレスに応答するセンサー分子として同定されている。
酸化ストレスはDNA、蛋白質等の生体分子に障害を与
え、細胞機能障害や細胞死を引き起こし、発癌、老化、
動脈硬化、痴呆へと到らせると考えられている。

【０００９】生体内での機能分子である蛋白質が正常な
機能と実行するためには、遺伝子の情報をもとに蛋白質
が合成された後に、正しい構造に折りたたまれること
（フォールディング）が必要である。小胞体は、新規に
合成された分泌蛋白質や膜蛋白質のフォールディングが
行なわれる場所であり、小胞体における変性蛋白質の蓄
積は外部要因的なストレス、細胞の分化や増殖、外部環
境への細胞応答、ウイルス感染等に伴って小胞体を通過
する蛋白質が量的に増加する場合に起こると考えられ
る。細胞は小胞体内に変性蛋白質が蓄積したことを感知
し、小胞体シャペロンを誘導して小胞体内のフォールデ
ィング容量を高めること（UPR）により恒常性を維持す
る。従って、UPRは細胞機能にとって普遍的な重要性を
もっているが、細胞がどのように小胞体内に変性蛋白質
が蓄積したことを感知し、適応、反応しているのかはい
まだ明らかになっていない部分が多い。

【００１０】小胞体ストレスは細胞死（アポトーシス）
を引き起こすことが知られており、小胞体ストレスに対
する応答機構には小胞体膜上に存在する２つのキナーゼ
分子IRE 1とPERKが関わっていることが知られている。I
RE 1はUPRを介して小胞体分子シャペロンを誘導し、異
常蛋白質の蓄積を防ぐ。また、IRE 1は小胞体ストレス
の付加に伴うJNK（c-Jun N末端キナーゼ）の活性化に必
須の分子としても同定されている。PERKはeIF2αのSer5
1をリン酸化してmRNAから蛋白質への翻訳を抑制し、異
常蛋白質が小胞体内で蓄積することを防ぐ。これらのキ
ナーゼは小胞体ストレス依存的に活性化され、小胞体ス
トレス対する防御機構として機能すると考えられてい
る。一方、小胞体ストレスを引き起こす刺激が過剰な場
合あるいは長時間持続する場合あるいは何らかの原因で
小胞体ストレスに対する抵抗性が弱くなった場合、細胞
はアポトーシス様の形態変化を起こし死滅するが、家族
性アルツハイマー病の原因遺伝子プレセニリン-1（PS
1）のミスセンス変異はアミロイドβ蛋白質の産生に影
響を与え、また変異PS 1を発現する細胞では小胞体スト
レスに対する抵抗性が弱くなり、神経細胞死の原因とな
っていると考えられている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明ではアポトーシス
と関連する遺伝子を得ることを目的とし、ヒト細胞のＡ
ＩＰ処理により発現の変化する遺伝子をサブトラクショ
ン法によりクローニングし、ＡＩＰ処理により増加する
遺伝子として、hRUPP-1(human homolog 1 of Round-Up
Phenotype Protein)、及び、hRRCP-1(human homolog 1
of Real Ring-Canal Protein)をコードする遺伝子、並
びに、ＡＩＰ処理により減少する遺伝子として小胞体ス
トレス センサー蛋白質hERRj-1(human homolog 1 of En
doplasmic Reticulum Rumenal Dnaj）をコードする遺伝
子をクローニングした。各蛋白質配列は、クローニング
したcDNAの配列に基づいて推定した。

【００１２】即ち、本発明は配列番号２に記載のアミノ
酸配列を含む蛋白質(hRUPP-1)、配列番号４に記載のア
ミノ酸配列を含む蛋白質(hRRCP-1)、及び、配列番号６
に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質(hERRj-1)に関す
る。また、それら各々の断片、及び、それら各々の1若
しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、若しくは、置換
により修飾されているアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドであって、各々の対応する蛋白質と同じ生物活性を有
するポリペプチドに関する。さらに、本発明は、これら
をコードするポリヌクレオチドに関する。

【００１３】本発明のhRUPP-1は、配列番号２に記載の
アミノ酸配列を有する、1148個のアミノ酸残基からなる
蛋白質である。hRUPP-1の生物活性とは、細胞を丸くし
細胞死を誘導する活性と細胞の増殖抑制活性であり、hR
UPP-1はまた、ユビキチン/プロテアソーム系により分解
制御を受ける。

【００１４】hRRCP-1は、配列番号４に記載のアミノ酸
配列を有する568個のアミノ酸からなる蛋白質である。
今まで見つかった哺乳類のkelch蛋白質では観察されな
かったドロソフィラring-canal構造と非常に類似した構
造を持つことから、アクチンとの結合を介して細胞質輸
送やアクチン フィラメントの構築等に欠かせない分子
であると予測された。hRRCP-1の生物活性として、アク
チン結合活性を挙げることができる。また、hRRCP-1を
コードする遺伝子は、酸化ストレス応答するセンサー分
子として同定されたKeap１と相同性を有する。

【００１５】hERRj-1は配列番号６に記載のアミノ酸配
列を有する、793個のアミノ酸からなるチオレドキシン
ドメインとDnajドメインを持つ新規の小胞体内シャペロ
ンである。本発明の遺伝子あるいは蛋白質の細胞内で発
現は細胞死（アポトーシス）を引き起こす。本発明の遺
伝子あるいは蛋白質はc-Jun、及び、eIF2aのSer51をリ
ン酸化（転写活性化）し、また、小胞体内のフォールデ
ィング容量を高める(UPR)。即ち、hERRj-1の生物活性と
は、過剰発現によりアポトーシスを引き起こす活性、c-
Jun及びeIFαのSer51リン酸化活性、並びに、UPRを誘導
する活性のことである。

【００１６】hRUPP-1、hRRCP-1、及びhERRj-1は以下の
実施例の方法に従ってクローニングすることによって得
ることができるが、当業者であればその配列情報に基づ
いて適当なプローブを作成し、適当な遺伝子プールから
スクリーニングすることにより、または、配列情報に基
づいて化学合成することによって得ることもできる。

【００１７】本発明の蛋白質は、その蛋白質の機能を損
なわない範囲で付加的な構成、或いは、その天然の配列
とは異なる配列、即ち、欠失、置換または付加等を有し
ていてもよい。アミノ酸配列の一部が欠失、置換、また
は、付加されたポリペプチドを得る方法は周知技術であ
る(例えば、部位特異的変異法(Kramer,W.及びFrits,H.
J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987);Kunkel,T.A.ら.,M
eth.in Enzymol.,154,367(1987))等）。特に、側鎖が縁
続きのアミノ酸ファミリー内でなされる置換である同類
アミノ酸置換が予測される。遺伝的にコードされるアミ
ノ酸は、一般に４つのファミリーに分けられる：（１）
酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝
リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フ
ェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び、
（４）非帯電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミ
ン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニ
ルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、ときに
は、合わせて、芳香族アミノ酸として分類される。例え
ば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置換、
アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、スレオニン
のセリンによる置換、または、構造的に関連するアミノ
酸による同様の同類置換などの分離された置換が、生物
学的活性に重要な影響を与えないことが、当然予測され
る。蛋白質として実質的に同じアミノ酸配列を有する
が、実質的に機能面に影響しない、主要でないアミノ酸
置換を有するポリペプチド分子は、蛋白質に含まれる。

【００１８】配列番号１、３、及び、５に記載の核酸配
列は各々、上記hRUPP-1、hRRCP-1、及び、hERRj-1をコ
ードするものであるが、遺伝子暗号の縮重の性質から、
配列番号２、４及び６のアミノ酸配列をコードする多数
の異なる核酸配列を構築することが可能であることが理
解される。配列番号１、３及び５に記載の核酸配列は該
蛋白質をコードする可能な多数の配列のうちの1つに過
ぎない。

【００１９】また、本発明の遺伝子及びアミノ酸配列情
報に基づき、ハイブリダイゼーション等の周知の技術を
用い、異なる臓器や生物種由来の本発明の蛋白質と類似
の構造、及び、機能を有する蛋白質をコードする遺伝
子、並びに、該遺伝子によりコードされる蛋白質を得る
ことは当業者が容易に成し得ることである。

【００２０】蛋白質の一部分が、該蛋白質の或る生物学
的な活性の一部を担っている場合があることが公知であ
り、全長蛋白質が得られている場合にそのような所望の
活性を有する蛋白質断片を、該全長蛋白質の化学的、若
しくは、酵素的な切断により断片化し、または、全長蛋
白質の配列情報に基づき組換技術により製造し、所望の
活性を発揮する断片を得ることは当業者が容易に成し得
ることである。実施例の「３.組換発現系を用いた動物
細胞での蛋白質発現」の中で、hRUPP-1のそのような断
片を得る方法を例示した。hRCPP-1、及び、hERRj-1につ
いても同様な方法で、所望の活性を有する断片を得るこ
とができる。よって、本発明の蛋白質の断片、及び、該
断片をコードするポリヌクレオチドも本発明の態様の1
つである。

【００２１】本明細書中の「ポリヌクレオチド」は、ゲ
ノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のＤＮＡ及びＲ
ＮＡを含むポリヌクレチドを示し、任意の長さのヌクレ
オチドのポリマー形態のことである。この用語は、分子
の一次構造のみを示す。従って、この用語には、二本鎖
及び一本鎖ＤＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチドが
包含される。これにはさらに、既知の型の改変、例え
ば、当該分野で公知の標識の存在、メチル化、末端キャ
ップ構造、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのア
ナログとの置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、ある
型の非荷電性結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホ
トリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸エステ
ル等）、または、荷電性結合（例えば、ホスホチオエー
ト、ホスホロジチオエート等）との置換）、ペンダント
部分の導入（例えば、蛋白質（ヌクレアーゼ、毒素、抗
体、シグナルペプチド、ポリーＬーリシン等）、挿入剤
（例えば、アクリジン、ソラレン）、キレーター（例え
ば、金属、放射性物質、ホウ素、酸化成分等）、アルキ
ル化剤（例えば、αアノマー性核酸）が包含される。

【００２２】hRUPP-1、hRRCP-1、及び、hERRj-1は、生
体試料よりその性質に基づいてクロマトグラフィー等の
周知の方法により精製することも可能であるが、組換技
術により生産することも可能である。本明細書において
組換とは、蛋白質が原核、及び、真核の組換発現系（例
えば微生物、昆虫、植物、動物、好ましくは哺乳類また
は実験管内の系）から誘導されることを意味し、この系
は一般的に知られている技術による、任意の種類の細胞
の形質変換または試験管内発現系を含む。

【００２３】組換発現のため、本発明のポリヌクレオチ
ドをプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファ
ージ等の公知のベクターに組み込むことができる。ま
た、必要に応じ該ポリヌクレオチドを保存等の目的のた
めにベクター中に挿入することも可能である。これらの
ベクターは、例えば、Sambrook"Molecular Cloning-A L
aboratory Manual"(Cold Spring Harbor Laboratory,N
Y)(1989年)、及び、Ausubel"Current Protocols in Mol
ecular Biology"(Green Publishing Associates and Wi
ley Interscience,NY)(1989年)(1994年)に記載の技術を
用いて当業者が容易に構築することができる。場合によ
り、本発明のポリヌクレオチド、及び、該ポリヌクレオ
チドを有するベクターを標的細胞に運搬するリポソーム
中へ導入して用いることも可能である。

【００２４】細胞中でポリヌクレオチドを発現させるた
めには、本発明のポリヌクレオチドを好ましくは、発現
を可能にするような制御ＤＮＡ配列に作動可能なように
結合される。用いる制御配列の種類は選択する宿主細胞
の種類により異なることが公知であり、当業者であれば
選択した宿主細胞に応じ、容易に必要なプロモーター、
ターミネーター、トランスアクチベーター、転写因子等
の必要な因子を選択することができる。また、必要に応
じ、検出可能なマーカーをコードする遺伝子をベクター
中に組み込むこともできる。

【００２５】細胞中にポリヌクレオチドを導入する場
合、染色体外に保持されるように導入しても、相同組換
等により宿主のゲノム中に組み込んでもよい。場合によ
り複数の本発明のポリヌクレオチドが細胞内に導入され
るようにしてもよい。当業者に周知の技術を用いて本発
明のポリヌクレオチドを用い、宿主を形質転換、また
は、トランスフェクトすることができる(Sambrook"Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual"Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989年)参照)。
その後、選択した宿主細胞の種類に応じ、必要な培養条
件を設定することは当業者の技術範囲内である。

【００２６】本発明の蛋白質を検出すること等を目的と
して、該蛋白質に対するポリクローナル抗体、または、
モノクローナル抗体を作製することも当業者が、周知技
術に基づき容易に成し得ることである(Kohler及びMilst
ein、Nature 256:495(1975年)参照)。ところで、抗原蛋
白質をコードする遺伝子が公知である場合、その蛋白質
のアミノ酸配列上の疎水性/親水性を解析する方法(Kyte
-Doolittleの方法;J.Mol.Biol. 第157巻(1982年)第105
〜122頁)、2次構造を解析する方法(Chou-Fasmanの方法;
Ana.Rev.Biochem. 第47巻(1978年)第251〜276頁)等によ
りアミノ酸配列中の抗原性領域を推定すること、さらに
それらの方法に基づくコンピュータープログラム(Anal.
Biochem. 第151巻(1985年)第540空546頁)、または、6〜
9程度の短いペプチドについて合成し且つその抗原性を
確認する簡便法であるＰＥＰＳＣＡＮ法(特表昭60-5006
84号公報)等は周知技術であり、本発明の蛋白質の抗原
決定基を決定し、該部分を含むペプチド、該ペプチドに
対する抗体、及び、該ペプチドをコードするポリヌクレ
オチドをそれらの周知技術に基づいて得ることは当業者
が容易に成し得ることである。

【００２７】また、本発明のポリヌクレオチドを認識す
る抗体には、血清、モノクローナル抗体、ポリクローナ
ル抗体、合成抗体、Fab断片、Fv断片、及び、scFv断片
も含まれる。

【００２８】以下の実施例において各遺伝子のクローニ
ング方法、各々の遺伝子の組織分布、及び、動物細胞で
の蛋白質の発現について述べる。

【００２９】

【実施例】１．クローニング (１)サブトラクション産物の生成 全RNA 調製を0.1ng/ml濃度のAIPで72時間処理したヒト
白血病細胞HL-60（tester）、及び、AIP処理なしのHL-6
0（driver）よりAGPC(Acid Guanidinium-Phenol-Chloro
form)法[Anal.Biochem. 162,156-159]に従って得た。上
で得られた全RNAを65℃で5分間処理し、急冷した。不溶
物を遠心して除き、3M NaCl溶液を0.2ml加え、塩濃度が
0.5Mとなるようにした。RNA溶液をオリゴ（dT）セルロ
ースカラム（Pharmacia）に載せ、素通り分画をもう1度
カラムに載せた。10mM Tri-HCl(pH 7.4)、1mM EDTA、0.
5M NaCl溶液（数カラム量）、及び、10mM Tri-HCl(pH
7.4)、1mM EDTA、0.lM NaCl溶液（数カラム量）で洗浄
した。ポリ(A)を有する吸着したRNAを溶出用緩衝液で溶
出した。得られたRNAを再度上記の操作を繰り返し、1/1
0容量の3M酢酸ナトリウム(pH5.1)、2容量のエタノール
を加え，-20℃で沈殿させ、ポリ(A)を有するmRNA得た。
cDNAの合成及びサブトラクションは、PCR-Selected cDN
A subtraction Kit(CLONTECH Laboratories,Inc.)付属
のマニュアルに従って、各々のポリ(A)RNA 1.5μgを用
いて行なった。AIP処理により増加する遺伝子集団(cDNA
2-cDNA 1)はtester cDNA（cDNA 2）に、AIP処理により
減少する遺伝子集団（cDNA 1-cDNA 2）はdriver cDNA
（cDNA 1）にアダプターを添付して得た。サブトラクシ
ョンのコントロールとしてキット添付のcDNAを用いてマ
ニュアルに従って行なった。上記より得られた各々のサ
ブトラクション産物(cDNA 2-cDNA 1)、及び（cDNA 1-cD
NA 2）をPCRで増幅し、サブトラクション ライブラリー
作製及びライブラリーのクローニングのためのプローブ
の作製に用いた。

【００３０】(２)サブトラクション ライブラリー作製 AIP処理により増加する遺伝子集団については(cDNA 2-c
DNA 1)のPCR増幅産物を、AIP処理により減少する遺伝子
集団については(cDNA 1-cDNA 2)のPCR増幅産物を制限酵
素Eag Iで消化後、QIAquick PCR purification Kit（QI
AGEN）を用いて精製した。上記より作製したcDNA 30ng
とNot I 消化pZErO-2プラスミドベクタ-（Invitrogen）
20ngの混合液を蒸留水で７μlとし、250mM Tris-HCl(pH
7.6)、50mM MgCl₂、5 mM ATP、5mM DTT、25%(w/v)PEG80
00からなる緩衝液２μl、T4 DNAリガーゼ（1unit/ml,Gi
bco BRL）1μlを加え、16℃で4時間反応させ、ベクター
にcDNAをライゲイションし、yeast tRNA（1mg/ml,Gibco
BRL）5μl、7.5M NH₄OAc 12.5μl、冷エタノール70μl
を加え、エタノール沈殿し、5μlの蒸留水に溶かした。
上記ベクターcDNAをエレクトロポレーション用大腸菌
（Electro MAX DH10B Cell,Gibco BRL）にバイオラット
社エレクトロポレーションシステムを用いて導入（1.8
kV, 25mF）し、カナマイシンを含む15cm LB/agar プレ
ートにプレーディングし、約12時間37℃で培養した。上
記プレートより単一のコロニーをLB/カナマイシン培地
入りの９６ウエルマイクロプレートに移して約3時間37
℃で培養後、２枚のLB/agar プレート上のナイロンフィ
ルター（Amersham社）上に移して培養し、溶菌、固定
し、スクリーニング用のフィルターとした。

【００３１】(３)サブトラクション ライブラリーのス
クリーニング サブトラクション産物(cDNA 2-cDNA 1)、及び（cDNA 1-
cDNA 2）の各々のPCR増幅産物を制限酵素Sma I、及び、
Eag Iで消化後、QIAquick PCR精製キット（QIAGEN）を
用いて精製し、ランダムプライム法によりPharmaciaよ
り供給されたキット（Ready To Go DNA Labelling Ki
t）の指示書に従って[α-32P]dCTPで標識して得られた
プローブを用いて、通常のコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72:3961,1975]でス
クリーニングした。この方法で得られるクローンは、50
0bp前後の長さを持つ断片である。

【００３２】（Ａ)AIP処理により増加する遺伝子集団に
ついて (cDNA 2-cDNA 1）及び（cDNA 1-cDNA 2）をプローブに
し、（cDNA 2-cDNA1）ライブラリーから作製した同じレ
プリカーフィルターをハイブリダイゼーションし、（cD
NA 2-cDNA 1）プローブのみと反応する、クローンを得
た(図３、及び、４)。図３の丸印のクローンがhRUPP-1
をコードするcDNA断片を持ち、図４の丸印のクローンが
hRRCP-1をコードするcDNA断片を持つ。本発明のAIP処理
によって起こる細胞の増殖阻害時に増加する遺伝子のサ
ブトラクション法によるクローニング法の流れ図を図１
に示す。

【００３３】（Ｂ)AIP処理により減少する遺伝子集団に
ついて (cDNA 2-cDNA 1）及び（cDNA 1-cDNA 2）をプローブに
し、（cDNA 1-cDNA 2）ライブラリーから作製した同じ
レプリカーフィルターをハイブリダイゼーションし、
（cDNA 1-cDNA 2）プローブのみと反応する、クローン
を得た(図５)。図５の丸印のクローンがhERRj-1をコー
ドするcDNA断片を持つ。本発明のAIP処理によって起こ
る細胞の増殖阻害時に減少する遺伝子のサブトラクショ
ン法によるクローニング法の流れ図を図２に示す。

【００３４】サブトラクション法で得られた断片をプロ
ーブとし、ヒト胎児脳cDNAライブラリー（Gibco BRL）
をスクリーニングすることにより全長のcDNAを取得し、
全塩基配列をジデオキシヌクレオチドを蛍光標識したダ
イターミネーター法によって決定した。本発明のAIP処
理によって起こる細胞の増殖阻害時に増加するhRUPP-
1、及びhRRCP-1をコードする遺伝子のcDNA配列を各々、
配列番号１及び配列番号３に、それらにコードされる蛋
白質のアミノ酸配列を各々、配列番号２及び配列番号４
に示す。また、本発明のAIP処理によって起こる細胞の
増殖阻害時に減少するhERRj-1をコードするcDNA配列を
配列番号５に、hERRj-1のアミノ酸配列を配列番号６に
示す。

【００３５】２．構造解析 本発明のAIP処理によって起こる細胞の増殖阻害時に減
少するhERRj-1のドメイン構造の模式図を図６Ａに、Dna
j様ドメインの比較図を図６Ｂに、チオレドキシン様ド
メインの比較図を図６Ｃに示す。以上により、hERRj-1
はチオレドキシン様ドメインとDnajドメインを持つの
で、小胞体内シャペロンであることが判明したが、今ま
でこのようなドメイン構造を持つ分子は報告されてな
い。

【００３６】３．組織分布 （１）ヒト各組織におけるhRUPP-1の発現 種々のヒト細胞由来cDNAライブラリー（Multiple Tissu
e cDNA Panel Human I及び II）(CLONTECH Laboratorie
s,Inc.)を以下のhRUPP-1遺伝子特異的プライマーを用い
てPCR法で増幅し、組織発現を分析した。対照としてG3P
DH遺伝子特異的プライマーを用いた。反応はTaqポリメ
ラーゼの存在下、95℃20秒、60℃20秒、72℃１分を28サ
イクル繰り返した。 5'-TCAACATCAAAGTGAAGCTGG (配列番号７) 5'-ACAGACGGCTCGACTTCTAC (配列番号８)

【００３７】本発明のAIP処理によって起こる細胞の増
殖阻害時に増加する遺伝子hRUPP-1の組織分布の結果を
図７に示す。hRUPP-1遺伝子はヒトの脳、心臓、腎臓、
肝臓、肺、膵臓、胎盤、筋肉、大腸、卵巣、白血球、前
立腺、小腸、脾臓、精巣及び胸線などに発現が見られ、
特に肺、膵臓、大腸、白血球、前立腺、脾臓、精巣及び
胸線に高い発現が観察された。

【００３８】（２）ヒト各組織におけるhRRCP-1の発現 以下のhRRCP-1遺伝子特異的プライマーを用いて、上述
のhRUPP-1遺伝子特異的プライマーを用いた場合と同様
の方法に従って、hRUPP-1の組織発現を分析した。本発
明のAIP処理によって起こる細胞の増殖阻害時に増加す
る遺伝子hRRCP-1の組織分布の結果を図８に示す。hRRCP
-1遺伝子はヒトの脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎
盤、大腸、卵巣、白血球、前立腺、小腸、脾臓、精巣及
び胸線等に発現が見られ、特に肺、膵臓、前立腺、脾
臓、精巣及び胸線に高い発現が観察された。 5'-CTGAGTCAAGGAGAGGTGGA (配列番号９) 5'-TGGGTCCCTGCATCTGACTC (配列番号１０)

【００３９】（３）ヒト各組織におけるhERRj-1の発現 以下のhERRj-1遺伝子特異的プライマーを用いて、上述
のhRUPP-1遺伝子特異的プライマーを用いた場合と同様
の方法に従って、hERRj-1の組織発現を分析した。本発
明のAIP処理によって起こる細胞の増殖阻害時に増加す
る遺伝子hERRj-1の組織分布の結果を図９に示す。hERRj
-1遺伝子はヒトの脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎
盤、大腸、卵巣、白血球、前立腺、小腸、脾臓、精巣及
び胸線等に発現が見られ、特に肝臓、肺、膵臓、前立
腺、脾臓及び精巣に高い発現が観察された。 5'-CATCCTTGCCAAGTCTTAATGCC (配列番号１１) 5'-CTTTTTCTTCATCTTCAACATTATC (配列番号１２)

【００４０】４．組換発現系を用いた蛋白質発現 (１)hRUPP-1の製造 hRUPP-1の全長をコードするcDNA(配列番号１)を、GSTを
コードする配列を含む大腸菌用発現ベクターpGEX-2T(Am
ersham Pharmacia Biotech)、及び、pQE-30(QUIAGEN)の
BamHI/SmaI領域中にクローニングし発現プラスミドを得
た。得られたプラスミドを大腸菌M15(pREP4)、または、
XL1 Blue中に形質転換し、37℃、NZCYM培地中で生育さ
せた。培養物のOD₆₀₀が約0.5に達した時点で、最終濃度
1mMとなるようイソプロピル-β-チオガラクトピラノシ
ド(IPTG)を添加し、さらに5時間培養した後、細胞を回
収した。

【００４１】組換え蛋白質の精製は、The QIAexpressio
nist(QIAGEN)及びGST Gene FusionSystem(Amersham Pha
rmacia Biotech)の説明書に従って行った。次にpGEX組
換え転写ユニットより得られたGST融合蛋白質からGSTを
除去するために、調製したGST融合蛋白質を約2mg/mlま
で濃縮し、20mM Hepes-NaOH(pH8.0)、150mM NaClに対し
て4℃で、透析した。透析物に最終濃度2mMになるように
CaCl₂を加え、GST融合蛋白質との重量比で約1/200量の
トロンビンを加え、氷上で5時間インキュベートした。
その後、グルタチオン-Sepharose、及び、ベンズアミジ
ン-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotech)と混合し
た。4℃で一晩、回転しながら混合した後、カラムに充
填し、素通り画分と20mM HEPES-NaOH(pH8.0)、150mM Na
Clの洗浄画分を集め親和性に基づき所望の組換え蛋白質
を得る。

【００４２】(２)hRRCP-1の製造 hRRCP-1の全長をコードするcDNA(配列番号３)を、GSTを
コードする配列を含む大腸菌用発現ベクターpGEX-2T(Am
ersham Pharmacia Biotech)、及び、pQE-30(QUIAGEN)の
BamHI/SmaI領域中にクローニングし発現プラスミドを得
た。得られたプラスミドを大腸菌M15(pREP4)、または、
XL1 Blue中に形質転換し、37℃、NZCYM培地中で生育さ
せた。培養物のOD₆₀₀が約0.5に達した時点で、最終濃度
1mMとなるようイソプロピル-β-チオガラクトピラノシ
ド(IPTG)を添加し、さらに5時間培養した後、細胞を回
収した。

【００４３】組換え蛋白質の精製は、The QIAexpressio
nist(QIAGEN)及びGST Gene FusionSystem(Amersham Pha
rmacia Biotech)の説明書に従って行った。次にpGEX組
換え転写ユニットより得られたGST融合蛋白質からGSTを
除去するために、調製したGST融合蛋白質を約2mg/mlま
で濃縮し、20mM Hepes-NaOH(pH8.0)、150mM NaClに対し
て4℃で、透析した。透析物に最終濃度2mMになるように
CaCl₂を加え、GST融合蛋白質との重量比で約1/200量の
トロンビンを加え、氷上で5時間インキュベートした。
その後、グルタチオン-Sepharose、及び、ベンズアミジ
ン-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotech)と混合し
た。4℃で一晩、回転しながら混合した後、カラムに充
填し、素通り画分と20mM HEPES-NaOH(pH8.0)、150mM Na
Clの洗浄画分を集め、親和性に基づき所望の組換え蛋白
質を得る。

【００４４】(３)hERRj-1の製造 成熟hERRj-1(配列番号５のアミノ酸35〜793)をコードす
るcDNAをGSTをコードする配列を含む大腸菌用発現ベク
ターpGEX-2T(Amersham Pharmacia Biotech)、及びpQE-3
0(QUIAGEN)のBamHI/SmaI領域中にクローニングし発現プ
ラスミドを得た。得られたプラスミドを大腸菌M15(pREP
4)またはXL1 Blue中に形質転換し37℃、NZCYM培地中で
生育させた。培養物のOD₆₀₀が約0.5に達した時点で、最
終濃度1mMとなるようイソプロピル-β-チオガラクトピ
ラノシド(IPTG)を添加し、さらに5時間培養した後、細
胞を回収した。

【００４５】組換え蛋白質の精製は、The QIAexpressio
nist(QIAGEN)及びGST Gene FusionSystem(Amersham Pha
rmacia Biotech)の説明書に従って行った。次にpGEX組
換え転写ユニットより得られたGST融合蛋白質からGSTを
除去するために、調製したGST融合蛋白質を約2mg/mlま
で濃縮し、20mM Hepes-NaOH(pH8.0)、150mM NaClに対し
て4℃で、透析した。透析物に最終濃度2mMになるように
CaCl₂を加え、GST融合蛋白質との重量比で約1/200量の
トロンビンを加え、氷上で5時間インキュベートした。
その後、グルタチオン-Sepharose、及び、ベンズアミジ
ン-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotech)と混合し
た。4℃で一晩、回転しながら混合した後、カラムに充
填し、素通り画分と20mM HEPES-NaOH(pH8.0)、150mM Na
Clの洗浄画分を集め、親和性に基づき所望の組換え蛋白
質を得る。

【００４６】５．機能解析 （１）hRUPP-1の細胞における発現 特異的モノクローナル抗体と可逆的に結合するエピトー
プを提供し、そして発現された蛋白質の検出及び容易な
精製を可能にするため、全長をコードするhRUPP-1遺伝
子のC末端にペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(DYKDDDDK)をコードするヌクレオチドよりなるC末端融
合蛋白質として発現されるようにし、動物細胞発現ベク
ターpcDNA3.1(CMVプロモーター)(Invitrogen社)に組み
込み、組換発現ベクターとし以下のように各動物細胞に
導入した。ミュータント蛋白質をコードする遺伝子はPC
R法で作製し、エピトープ融合蛋白質として発現される
ようにし、動物細胞発現ベクターpCMVに組み込み、組換
発現ベクターとし動物細胞に導入した。

【００４７】細胞形態の変化 Hela及びNIH3T3細胞にhRUPP-1遺伝子とlacZ遺伝子を共
発現させ、Xgalを用いて染色することによりhRUPP-1が
発現されると青くなるようにした。Hela及びNIH3T3細胞
に全長のhRUPP-1遺伝子を導入した時の細胞の形態を図
１０に示す。コントロールとして、hRUPP-1遺伝子を持
たない空のベクターを用いた。NIH3T3細胞にhRUPP-1遺
伝子を導入すると細胞が丸くなったが、Hela細胞にhRUP
P-1遺伝子を導入しても細胞の形態に何の変化も見られ
なかった。すなわち、hRUPP-1は細胞を丸くする活性
（細胞を丸くする活性をRU(Round-Up)と略す）を持ち、
その性質は細胞選択的であり、生体内では組織特異的ま
たは時期特異的に機能することが予測された。

【００４８】機能ドメイン解析 hRUPP-1の機能ドメインを解析するため、ミュータント
蛋白質をコードする遺伝子をエピトープ融合蛋白質とし
て発現されるようにし、動物細胞発現ベクターpCMVに組
み込み、組換発現ベクターとし動物細胞に導入した。ミ
ュータント蛋白質をコードする遺伝子は、hRUPP-1遺伝
子よりPCR法により作製した。ミュータント蛋白質の模
式図を図１１に示す。hRUPP-1遺伝子、或いは、ミュー
タント遺伝子をCHO細胞及びHela細胞に導入した時の細
胞の形態は、lacZ遺伝子と共発現させ、Xgalを用いて染
色することにより、導入した遺伝子が発現すると細胞が
青く染色されるようにして検出した（図１２）。コント
ロールとして、hRUPP-1遺伝子を持たない空のベクター
を用いた。図１１中のａは1148アミノ酸残基からなる全
長hRUPP-1を表し、その下のｂ〜ｇは、該全長ｈRUPP-1
を欠失させた各断片を表す。図１２は、CHO細胞では全
長a、d、e、fは弱いRUを示すが、ミュータントb、c、g
は強いRUを持ち、Hela細胞では、a、d、eはRUがなく、
ミュータントb、c、f、gはRUを伴う細胞の増殖阻害が観
察されたことを示す。

【００４９】以上のことから、配列番号２のアミノ酸残
基1〜305までからなるドメイン、または751〜1148まで
からなるドメインが強いRU及び細胞増殖抑制活性を有
し、該ドメインを利用し強いRU及び細胞増殖抑制活性を
持つミュータントhRUPP-1を作製することができる。ミ
ュータントの作製はこのドメインに制限されるものでは
なく、ミュータントgのようにドメイン間の組み合わ
せ、または一定のドメインを短くすることによっても作
製することができる。

【００５０】hRUPP-1の分解 シグナル依存的に活性化または発現誘導される転写因子
群Jun、Fos、Myc、p53及びNF-κBの抑制性因子I-κB、
多くのサイクリン関連蛋白質がユビキチン-プロテアソ
ームによる制御を受け分解される。NIH3T3細胞でのhRUP
P-1の分解について検証するため、NIH3T3細胞にhRUPP-1
遺伝子を発現させ、10μMのMG132で10時間処理後、細胞
を溶解し、SDS-PAGEに供した。その後、PVDF膜に転写
し、各々の蛋白質を免疫染色した（図１３）。図１３
中、＋は遺伝子導入、または、MG132処置を、−はhRUPP
-1遺伝子を持たない空のベクターの導入、または、MG13
2未処置を表す。

【００５１】NIH3T3細胞にhRUPP-1を導入された蛋白質
はよく分解される（図１３第1レーン）が、プロテアソ
ーム阻害剤であるMG132で処理すると分解が抑制された
（図１３第2レーン）。対照として加えた、ユビキチン
ープロテアソームにより分解される癌抑制蛋白質p53も
プロテアソーム阻害剤であるMG132で処理すると分解が
抑制された（図１３第1〜4）。

【００５２】hRUPP-1のポリユビキチン化 シグナル伝達依存的に分解される蛋白質の多くは分解に
先立ちポリユビキチン化され、蛋白質分解装置プロテア
ソームによって速やかに分解されることが知られていた
ので、hRUPP-1が細胞内でポリユビキチン化されること
を確認するため、hRUPP-1遺伝子とユビキチン遺伝子を2
93細胞に共発現させ、10μMのMG132で6時間処理する
か、処理をしなかった。その後、細胞を溶解し、hRUPP-
1をエピトープ抗体で特異的に免疫沈降し、SDS-PAGEに
付した後、PVDF膜に転写し、導入したユビキチンに対す
る抗体を用いて免疫染色しhRUPP-1のユビキチン化を調
べた（図１４Ａ）。また、細胞溶解後、溶解液を直接SD
S-PAGEに供し、PVDF膜に転写した後、hRUPP-1を直接免
疫染色した(図１４Ｂ)。＋はhRUPP-1遺伝子導入またはM
G132処理を、−はhRUPP-1遺伝子を持たない空のベクタ
ーの導入、または、MG132未処理を表す。

【００５３】その結果、hRUPP-1は細胞内でポリユビキ
チン化されることが示された(図１４レーン４及び８)。
また、293細胞でhRUPP-1はポリユビキチン化されるが、
著しい分解は見られず、プロテオソーム阻害剤MG132処
理によっても著しい増加は観察されなかった（図１４レ
ーン８）。以上のことからhRUPP-1は細胞内でポリユビ
キチン化され、プロテアソームによる分解を受けること
が分かった。また、他のシグナル依存的に活性化または
発現誘導される転写因子群Jun、Fos、Myc、p53及びNF-
κBの抑制性因子I-κB、多くのサイクリン関連蛋白質の
ようにhRUPP-1もシグナル依存的或いは細胞（組織）選
択的な分解制御を受けることが判明した。

【００５４】（２）hRRCP-1の発現 特異的モノクローナル抗体と可逆的に結合するエピトー
プを提供し、そして発現された蛋白質の検出及び容易な
精製を可能にするため、全長をコードするhRRCP-1遺伝
子のC末端にペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(DYKDDDDK）またはGlu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-A
sp-Leu(EQKLISEEDL）をコードするヌクレオチドよりな
るC末端融合蛋白質として発現されるようにし、動物細
胞発現ベクターpME18S（SRαプロモーター）(Hara,T.及
びMiyama,A.,EMBO J. 11,1875〜1884,1992年)に組み込
み、組換発現ベクターとし以下のように各動物細胞に導
入した。ミュータント蛋白質をコードする遺伝子はPCR
法で作製し、エピトープ融合蛋白質として発現されるよ
うにし、動物細胞発現ベクターpME18Sに組み込み、組換
発現ベクターとし動物細胞に導入した。

【００５５】結果 hRRCP-1及び既に報告されているMayven[Soltysik-Espan
ola,M.et al.,Mol.Biol.Cell 10,2361-2375,1999]、Kea
p 1[Itoh,K.et al.,Gene and Dev. 13,76-86,1999]を各
々Hela細胞で発現させ、各々の蛋白質をhRRCP-1遺伝子
のC末端に付加したペプチドに対する蛍光標識抗体を用
いて染色した（緑色が各々の蛋白質の局在を表す、図１
５）。hRRCP-1はドロソフィラkelch[Xue,F.et al.,Cell
72,681-693,1993]と非常に類似したRing-canal構造を
形成し、この構造は他の哺乳類kelch因子群であるMayve
nやKeap 1には観察されなかった。これは、hRRCP-1が真
のドロソフィラkelchの哺乳類ホモログの可能性を強く
示唆するものであり、ドロソフィラkelchのように細胞
質輸送やアクチン フィラメントの構築などに深く関わ
っていると予測された。

【００５６】hRRCP-1のRing-canal構造形成に関わる内
部ドメインの特定 hRRCP-1の持つRing-canal構造形成に関わる内部ドメイ
ンを特定するため、ミュータント蛋白質をコードする遺
伝子をPCR法で作製し、エピトープ融合蛋白質として発
現されるようにしてHela細胞に導入し、各々の局在を調
べた(図１６)。用いたミュータント蛋白質の模式図を図
１７に示す。POZドメインとIVRドメインからなるミュー
タント蛋白質のみRing-canal構造を形成し、この２つの
ドメインはRing-canal構造形成に必須不可欠なドメイン
であることが判明した。POZ及びIVRドメインのみでは細
胞全体に、kelchドメインは核内に斑点様に、POZドメイ
ンとkelchドメインからなるミュータント蛋白質は主に
細胞質に、IVRドメインとkelchドメインからなるミュー
タント蛋白質は細胞質または核内に局在性を示した。以
上より、hRRCP-1はPOZドメインとIVRドメインを介してR
ing-canal構造を形成し、細胞質輸送やアクチン フィラ
メントの構築などに関わっていると予測された。各々の
ミュータント蛋白質の利用は局在についての情報を提供
するのみならず、POZドメインとIVRドメインからなるミ
ュータント蛋白質のようにRing-canal構造の分子設計の
道具にもなる。各々のミュータント蛋白質はhRRCP-1の
正または負の調節分子として利用することもできる。

【００５７】hRRCP-1のアクチンとの結合 hRRCP-1が真のドロソフィラkelchの哺乳類ホモログとし
て機能するためにはhRRCP-1のアクチンとの結合を前提
とする。それを証明するために、hRRCP-1、Mayven及びK
eap 1を各々の293細胞に発現させた後、細胞を溶解し、
hRRCP-1、Mayven及びKeap 1を各々免疫沈降し、SDS-PAG
Eに付し、PVDF膜に転写した。各々の免疫沈降画分を蛋
白質に対する抗体(図１８上)、及び、アクチンに対する
抗体(図１８下)で免疫染色し、アクチンとの結合能を調
べた。コントロールとしてhRUPP-1遺伝子を持たない空
のベクターを用いた(ｐME-Empty)。hRRCP-1はアクチン
と結合できることが判明し、ドロソフィラkelchのよう
に細胞質輸送やアクチン フィラメントの構築などに関
わっていることが強く示唆された。

【００５８】hRRCP-1によるMayvenやKeapの機能の調節 実験により、hRRCP-1だけでなくMayvenやKeap 1もアク
チン結合能を有することが示された(図１８下)。このこ
とは、hRRCP-1はアクチンとの結合或いはMayvenやKeap
との結合を介してMayvenやKeapの機能を調節できること
を意味し、それを証明するために次のような実験を行っ
た。293細胞に各々、hRRCP-1/MycエピトープとMayven/F
lagエピトープ、ｈRRCP-1/MycエピトープとKeap 1/Flag
エピトープ、及び、Keap 1/FlagエピトープとMayven/My
cエピトープ遺伝子を共導入し、細胞を溶解した後、各
々の細胞溶解物を抗Mycエピトープ抗体で免疫沈降し、
免疫沈澱物をSDS-PAGEに供した。その後、PVDF膜に転写
し、抗Flag抗体を用いて(図１９Ａ)、または、抗Myc抗
体を用いて(図１９Ｂ)免疫染色した。図中、＋は各々の
遺伝子導入を、−は遺伝子を持たない空のベクターの導
入を表す。図１９の免疫沈降の結果よりhRRCP-1はMayve
nと結合できるが、Keap1とは結合できないことが示され
た。

【００５９】さらに、Hela細胞に各々、hRRCP-1/Mycエ
ピトープとMayven/Flagエピトープ、hRRCP-1/Mycエピト
ープとKeap 1/Flagエピトープ、及び、Keap 1/Flagエピ
トープとMayven/Mycエピトープを共導入し、各々の細胞
を抗Mycエピトープ抗体(赤)、及び、抗Flagエピトープ
抗体(緑)で免疫染色した(図２０)。その結果、hRRCP-1
はMayvenの局在を完全に壊すだけでなく、Mayvenを取り
込むことが判明した。以上より、hRRCP-1アクチン或い
はMayvenとの結合を介し、ドロソフィラkelchのような
細胞質輸送やアクチン フィラメントの構築等に関わる
だけでなく、Mayvenの機能の負または正の調節因子とし
ても機能することが示唆された。

【００６０】hRRCP-1のアポトーシスへの関与 hRRCP-1はAIP処理により起こる細胞増殖阻害時に発現誘
導される遺伝子としてクロニーングされたものである。
細胞増殖阻害は細胞のアポトーシス誘導シグナルにもな
る。hRRCP-1のアポトーシスへの関与を調べるため、Fas
分子を恒常的に発現している細胞293/Fas細胞にhRRCP-1
を導入し、抗Fas抗体刺激による選択的分解を受けるか
を調べた。

【００６１】293/Fas細胞にhRRCP-1を導入し、抗Fas抗
体で一定時間刺激した後、細胞を溶解した。溶解物をSD
S-PAGE後、PVDF膜に転写し、hRRCP-1(図２１Ａ)及びカ
スパーゼ3(図２１Ｂ)で免疫染色した。その結果、hRRCP
-1は抗Fas抗体刺激により特異的に分解されることが判
明した。対照として、アポトーシス実行分子カスパーゼ
3（アポトーシス誘導に関与する蛋白分解酵素）の活性
化も観察した。Fasによるアポトーシス誘導シグナルは
プロテアーゼ（カスパーゼ）カスケードへ移行し、カス
パーゼ基質の選択的分解を介し、細胞を死へと導くと考
えられている。アポトーシスに関与するカスパーゼの基
質については種々の候補が報告されているが、いまだ最
終的な基質は分かっていない。従って、Fasシグナル(Fa
sリガンド、及びFas抗体を含む)によるhRRCP-1の特異的
分解はアポトーシス研究の新しい分野を提供し、hRRCP-
1が自己免疫疾患や癌などに関与する可能性を示唆す
る。また、hRRCP-1の特異的分解はアポトーシスのマー
カーとして利用可能である。

【００６２】（３）hERRj-1蛋白質の発現 特異的モノクローナル抗体と可逆的に結合するエピトー
プを提供し、そして発現された蛋白質の検出及び容易な
精製を可能にするため、全長をコードするhERRj-1遺伝
子の内部にペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(DYKDDDDK)をコードするヌクレオチドよりなる内部融合
蛋白質として発現されるようにし、動物細胞発現ベクタ
ーpME18S（SRαプロモーター）またはpCMV（CMVプロモ
ーター）に組込み、組換発現ベクターとし動物細胞に導
入した。ミュータント蛋白質をコードする遺伝子はPCR
法で作製し、エピトープ融合蛋白質として発現されるよ
うにし、動物細胞発現ベクターpME18SまたはpCMVに組み
込み、組換発現ベクターとし動物細胞に導入した。

【００６３】hERRj-1の局在 hERRj-1をHela細胞で発現させ、小胞体内マーカー蛋白
質であるBipとの共局在の様子を表す細胞の写真を図２
２に示す。図６に示すドメイン解析の結果と一致し、hE
RRj-1は小胞体内に存在することが証明された。

【００６４】hERRj-1による細胞形態の変化 Hela細胞、及び、CHO細胞にhERRj-1遺伝子とlacZ遺伝子
を共発現させ、Xgalを用いて染色し、hERRj-1が発現さ
れると青くなるようにし、Hela及びCHO細胞にhERRj-1遺
伝子を導入した時の細胞の形態を図２３に示した。コン
トロールとしてhERRj-1遺伝子を持たない空のベクター
を用いた。hERRj-1の細胞への導入は細胞死を誘導する
ことが分かった。小胞体ストレスは細胞死（アポトーシ
ス）を引き起こすことが知られている。従って、hERRj-
1は小胞体ストレスによる細胞死の原因分子の１つであ
ると予測される。小胞体ストレスに対する応答機構には
小胞体膜上に存在する２つのキナーゼ分子IRE 1とPERK
が関わっていることが知られている。IRE 1はUPRを介し
て小胞体分子シャペロンを誘導させて、異常蛋白質の蓄
積を防ぐ。また、IRE 1は小胞体ストレスの付加に伴うJ
NK（c-Jun N末端キナーゼ）の活性化に必須の分子とし
ても同定されている。PERKはeIF2αのSer51をリン酸化
してmRNAから蛋白質への翻訳を抑制し、異常蛋白質が小
胞体内で蓄積することを防ぐ。これらのキナーゼは小胞
体ストレス依存的に活性化され、小胞体ストレス対する
防御機構として機能すると考えられている。一方、小胞
体ストレスを引き起こす刺激が過剰な場合あるいは長時
間持続する場合あるいは何らかの原因で小胞体ストレス
に対する抵抗性が弱くなった場合、細胞はアポトーシス
様の形態変化を起こし死滅するが、家族性アルツハイマ
ー病の原因遺伝子プレセニリンーのミスセンス変異はこ
れらの小胞体ストレスを介した神経細胞死の原因となっ
ていると考えられている。従って、hERRj-1は、IRE 1若
しくはPERKを介した過剰の小胞体ストレスを誘導する
か、または、小胞体ストレスに対する抵抗性を弱めるこ
とが予測される。

【００６５】hERRj-1によるIRE 1、または、PERKの活性
化 hERRj-1が、IRE 1またはPERKの活性化を誘導できること
を証明するため、hERRj-1を293細胞に導入した後、小胞
体ストレスを引き起こす薬剤（ツニカマイシン、DTT、
タプスガルジン）を処理し、GST-ｃJunを用いて免疫沈
降し、免疫沈降物をイン・ヴィトロ キナーゼ分析に付し
た。イン・ヴィトロ キナーゼ分析産物をSDS-PAGEに付
し、PVDF膜に転写後、c-Junのリン酸化Ser63を特異的に
認識する抗体を用いて免疫染色し(図２４(Ａ)上)、コン
トロールとして同じ細胞溶解物をJNK(c-Jun N-terminal
kinase)を用いて免疫染色し(図２４(Ａ)下)、内在性JN
Kの活性及びeIF2αのリン酸化を調べた。また、293細胞
にhERRj-1遺伝子を導入し、小胞体ストレスを引き起こ
す薬剤で処理し、細胞を溶解した後、溶解物を直接SDS-
PAGEに付し、PVDF膜に転写後、eIF2αまたはeIF2αのリ
ン酸化Ser51を特異的に認識する抗体を用いて免疫染色
した(図２４(Ｂ))。図中、−はhERRj-1遺伝子を持たな
い空のベクターの導入、または薬剤処理なしを表す。Tm
は、2.5μｇ/mlのツニカマイシンでの3時間にわたる処
理を、DTTは5ｍMのジチオスレイトールでの3時間にわた
る処理を、Tgは1μMのthapsigarginでの1時間にわたる
処理を表す。

【００６６】それにより、hERRj-1の細胞への導入によ
り、小胞体ストレス対するc-Jun及びeIF2αのSer51のリ
ン酸化が亢進されることが判明し、hERRj-1はIRE 1及び
PERKの活性化を誘導することが分かった。以上の結果
より、hERRj-1は過剰に、または、持続的にIRE 1及び P
ERKの活性化を誘導し、細胞死を引き起こすことが示唆
された。

【００６７】hERRj-1によるUPR誘導 hERRj-1がIRE 1を活性化することは、hERRj-1はUPRを誘
導できることを意味する。それを証明するため、hERRj-
1を293細胞あるいはCHO細胞に導入し、UPRにより誘導さ
れる遺伝子BipやCHOPの発現をRT-PCR法で調べた。ま
ず、293細胞、及び、CHO細胞にhERRj-1、または、Bip遺
伝子を導入し、5μg/mlのツニカマイシンで6時間処理し
た細胞より、全RNAをtotal RNA Isolation Reagent(GIB
CO BRL)を用いて抽出した。各々の全RNA 5μgよりProST
AR First-Strand RT-PCR Kit(STRATAGENE)を用いてcDNA
を作製し、内在性hERRj-1、Bip及びCHOP遺伝子を遺伝子
特異的プライマーを使用してPCR法で検出した。反応はT
aqポリメラーゼの存在下、96度25秒、60度20秒、72度1
分を28サイクル繰り返した。

【００６８】結果を図２５に示す。hERRj-1は小胞体ス
トレスを引き起こすツニカマイシン処理により誘導さ
れ、また、hERRj-1の細胞への導入はUPRにより誘導され
る遺伝子BipやCHOPの発現を引き起こすことも判明し
た。以上のことより、hERRj-1は小胞体ストレスにより
誘導され、IRE 1及び PERKの活性化とUPRを誘導する新
規の小胞体分子シャペロンであることが判明した。

【００６９】hERRj-1のIRE 1alpha、IRE 1beta及びBip
との結合 hERRj-1がUPRを活性化することを示した。BipはIRE 1ま
たはPERKと結合し、IRE 1またはPERKの活性を阻害して
いることが報告されている（Bertolotti, A. etal., Na
ture Cell Biol. 2, 326-332, 2000）。hERRj-1によるU
PRの活性はhERRj-1とIRE 1もしくはBipとの結合を介し
て起こっている可能性を検討するため、hERRj-1とIRE 1
をCHO細胞に共発現させ、hERRj-1を免疫沈降し、免疫沈
降物をSDS-PAGEに付し、PVDF膜に転写した後、IRE 1も
しくはBipに対する抗体で免疫染色し、hERRj-1との結合
能を調べた。その結果を図２６に示す。hERRj-1はIRE 1
または内在性Bipと結合し、小胞体ストレスはその結合
を増強させることが明らかとなった。以上のことより、
hERRj-1はIRE 1またはBipとの結合を介し、UPRを調節す
ることが判明した。

【００７０】hERRj-1の細胞死誘導ドメインの同定 CHO細胞にhERRj-1あるいはhERRj-1の各々のミュータン
ト遺伝子をlacZ遺伝子と共発現させ、Xgalを用いて染色
し、hERRj-1が発現される細胞を青くなるようにした。
細胞死による細胞の形態の変化を指標にして細胞死誘導
活性を調べ、その結果を図２７に示した。コントロール
としてhERRj-1遺伝子を持たない空のベクターを用いた
（生細胞１００％）。図６で示したように、hERRj-1はD
najドメインと４つのチオレドキシン（TRX１から４）ド
メインを持っている。hERRj-1では生細胞２５％、Dnaj
ドメインの６３番目のアミノ酸HisをGlnに変えたミュー
タント（Dnajミュータント）は生細胞５２％、TRX１ド
メインの活性部位の１５８番目と１６１番目のCysをSer
にかえたミュータント（TRX 1ミュータント）は生細胞
６０％、TRX２ドメインの活性部位の４８０番目と４８
３番目のCysをSerにかえたミュータント（TRX 2ミュー
タント）は生細胞６２％、TRX３ドメインの活性部位の
５８８番目と５９１番目のCysをSerにかえたミュータン
ト（TRX 3ミュータント）は生細胞５５％、TRX４ドメイ
ンの活性部位の７００番目と７０３番目のCysをSerにか
えたミュータント（TRX 4ミュータント）は生細胞９０
％であった。さらに、TRX１から４の全ての活性部位のC
ysをSerに変えたミュータント（TRX-allミュータント）
は生細胞９５％、DnajドメインとTRX１から４までのド
メインの全てのミュータント（Dnaj/TRXミュータント）
は生細胞１００％の活性を示した。以上のことから、hE
RRj-1の活性は主にTRXドメインにより誘導され、Dnajド
メインは調節ドメインとして機能していることが予測さ
れた。

【００７１】hERRj-1による細胞内でのIRE 1の局在の変
化 IRE 1はN-末端を小胞体のルーメン側に露出して小胞体
ストレスを感知し、C-末端のキナーゼドメインとエンド
ヌクレアーゼドメインの機能ドメインを細胞質側に露出
している小胞体膜タンパク質として機能していると考え
られている。しかし、JNKの活性にはキナーゼドメイン
を必要とし（Urano, F. el al., Science287, 664-666,
2000）、UPRにはエンドヌクレアーゼドメインのみを必
要としている（Tirasophon, W. et al., Genes Dev. 1
4, 2725-2736, 2000）と予測されているが、IRE 1によ
る小胞体ストレスに対する応答に関する両ドメインの協
調性などの詳しいことは未知である。NIH3T3細胞にhERR
j-1またはIRE 1を単独または共発現させ、IRE 1の局在
を調べ、その結果を図２８に示した。IRE 1単独ではIRE
1は小胞体の局在性を示すが、hERRj-1を共発現させる
と、IRE 1の局在は大きく変化して凝集体として顕われ
た。しかし、hERRj-1のDnajミュータントまたはTRXミュ
ータントはIRE 1の凝集体の形成を誘導しないことか
ら、IRE 1の凝集体の形成にはhERRj-1の機能が必須であ
ることが判明された。さらに、IRE 1のキナーゼドメイ
ンミュータントまたはエンドヌクレアーゼドメインミュ
ータントは凝集体を形成しないことから、hERRj-1によ
るIRE 1の凝集体形成にはIRE 1のキナーゼドメインとエ
ンドヌクレアーゼドメインの両方を必要とすることも明
らかとなった。以上から、hERRj-1によるIRE 1の凝集体
形成誘導を新しく同定し、IRE 1の機能にhERRj-1が深く
関わっていることを示唆した。

【００７２】マウスの臓器でのmERRj-1（hERRj-1のマウ
ス相同体）の局在 以上のことから、hERRj-1の過剰発現は細胞死を誘導
し、IRE 1またはBipとの結合を介し、あるいはIRE 1の
凝集体の形成を介し、小胞体の機能を調節していること
が判明した。hERRj-1の持つ体内での役割を探るため、h
ERRj-1の内部配列（合成ペプチド）に対するウサギポリ
クローナル抗体を作製し、膵臓、脳及び精巣の固定切片
を用いて組織染色を行った。その結果を図２９に示し
た。膵臓のランゲルハンス島のbeta細胞、脳及び精細管
の中の特種の細胞が選択的に染色された。膵臓のbeta細
胞は非常に発達した小胞体を持つインスリン産生細胞
で、PERKの異常による小胞体の機能異常はbeta細胞の死
を伴う膵臓異常と糖尿病を引き起こす（Delepine, M. e
t al., Nat. Genet. 25, 406-409, 2000; Harding, H.
P.et al., Mol. Cell 7, 1153-1163, 2001）。また、Bi
pの発現低下などの小胞体の機能異常による神経細胞死
がアルツハイマー病の原因の一つと考えられている（Ka
tayama, T. et. al., Nature Cell Biol. 1, 479-485,
1999）。さらに、糖尿病やアルツハイマー病は変性蛋白
質の蓄積により起こるアミロイドーシスの一つでもあ
る。以上のことから、hERRj-1は膵臓のbeta細胞、神経
細胞及び精細胞の機能維持に必要であり、その発現異常
は膵臓異常や神経変性疾患または精細胞などの分化異常
の原因となることが示唆された。

【００７３】EST検索によるhERRj-1及びmERRj-1の発現
様式 ESTデータベースは任意のcDNAライブラリーから無作為
に選ばれたcDNAの部分的配列を集めたデータベースであ
り、そのデータベースを検索することで、ある遺伝子の
ある組織での発現頻度を予測することができる。hERRj-
1の持つ体内での役割を探る手段として、EST検索による
hERRj-1及びmERRj-1の発現様式を検討し、その結果を図
３０Aに示した。ヒトの１３２個のcDNAの中に６８個
（５１％）、マウスの８８個の中の３０個（３５％）が
癌組織由来であり、さらに癌組織中のヒトの５３個（７
８％）、マウスの３０個（１００％）が腺癌由来であ
る。さらに、腺癌の中のヒトの２３個（４３％）が子宮
腺癌由来であり、マウスの２５個（８３％）が乳腺癌由
来であった。この結果は、ERRj-1がヒトまたはマウスの
腺癌、特に、子宮腺癌及び乳腺癌に非常に高く発現して
いることを表している。腺は非常に発達した小胞体を持
つ分泌器官であり、腺細胞でのERRj-1の発現異常による
小胞体の機能異常が腺癌の発生の原因の一つになること
が示唆された。また、乳腺癌と子宮腺癌はホルモン、特
にエストロゲンの分泌と応答異常により発生する場合も
多くある。ERRj-1と同じくTRXドメインを二つ持つ小胞
体シャペロンPDIはエストロゲンと結合し、細胞内のエ
ストロゲンの濃度を調節していると予測されている（Pr
imm, T and Gilbert, H., JBC, 276, 281-286, 200
1）。したがって、ERRj-1はホルモンとの結合またはPDI
の機能を調節することにより、細胞内でのホルモンの濃
度を調節している可能性も考えられる。

【００７４】また、乳腺癌と子宮腺癌は互いに転移しや
すい性質があり、乳腺癌と子宮腺癌でのERRj-1の異常発
現は癌の転移に関わっている可能性もある。癌細胞は主
要組織適合抗原（MHC）クラスIによる癌抗原提示が正常
に行われると、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）によりその
癌細胞は排除されるが、免疫グロブリンH鎖とbeta2ミク
ログロブリンの２量体から成るMHCクラスIのフォールデ
ィング異常やそれに伴う分解などの原因で癌抗原提示が
正常に行われないとCTLからの攻撃から逃れて、癌細胞
の転移が成立する。hERRj-1がMHCクラスIによる癌抗原
提示に関与可能性を証明するため、MHCクラスIのフォー
ルディングに必須の分子であり、TRXドメインを持つ小
胞体シャペロンERp57のhERRj-1による酸化還元状態の変
化（図３０B）とhERRj-1による免疫グロブリンH鎖（mu
鎖）の発現量（図３０C）を調べた。アルキル化試薬AMS
は蛋白質の還元状態のCysと反応するし、500ダルトンの
分子量の上昇をもたらす。したがって、AMS反応後の蛋
白質の分子量の上昇を目安に蛋白質の酸化還元状態を推
測することが可能になる。図３０Bに示したように、細
胞でのERp57は完全酸化フォームと部分酸化フォームと
完全還元フォームの混合状態で存在することが分かる。
しかし、hERRj-1が存在するとERp57の完全酸化フォーム
と部分酸化フォームが完全還元フォームに変化すること
が判明した。さらに、図３０Cに示したように、hERRj-1
は免疫グロブリンH鎖（mu鎖）に結合でき、その発現量
を低下させることも判明した。ERp57はMHCクラスIの免
疫グロブリンH鎖と結合し、免疫グロブリンH鎖の分解を
防ぐことによりMHCクラスIによる抗原提示に寄与する。
以上により、hERRj-1は免疫グロブリンH鎖と直接な結合
を介し、またはERp57の機能を調節することにより、MHC
クラスIによる抗原提示に関与することが分かり、hERRj
-1の異常発現はMHCによる癌細胞癌抗原の低下を引き起
こし、癌の転移に深く関わっている可能性が示唆され
た。

【００７５】

【発明の効果】本発明のhRUPP-1は細胞を丸くする(RU)
活性、細胞増殖抑制活性、及び、細胞死誘導活性を有す
る。細胞が丸くなる現象は細胞分裂時、接着阻害時また
は細胞移動時に良く見られことから、これらの現象に機
能すると予測された。全長またはミュータントhRUPP-1
を細胞に導入することにより細胞にRU活性及び増殖抑制
活性を付与して細胞死を誘導することができる。細胞内
のhRUPP-1の持つRU活性を制御することにより細胞の運
動能を制御が可能であると考えられ、例えばhRUPP-1に
対するアンチセンス遺伝子を投与することにより癌細胞
の原発巣からの転移や癌細胞の浸潤を抑制できると考え
られる。

【００７６】また、hRUPP-1、hRUPP-1をコードする遺伝
子、それに対するアンチセンスポリヌクレオチドを含む
スクリーニング系を用いることにより、該蛋白質の活性
を阻害、または、活性化する化合物をスクリーニングす
ることも可能である。そのような化合物は、細胞の増
殖、転移及び分裂、並びに、細胞死を調節する薬剤とし
て役立つと考えられる。

【００７７】また、hRUPP-1は本明細書において示した
ようにポリユビキチン化され分解されるが、hRUPP-1を
ポリユビキチン化されないように改変することにより、
hRUPP-1の生体内における分解を調節することが可能に
なると考えられる。

【００７８】本発明のhRRCP-1は、Fasシグナルにより特
異的に分解されるので、従来のカスパーゼ等に代えてア
ポトーシス（細胞死）のマーカーとして利用することが
できる。また、従来知られていないhRRCP-1のRing-cana
l構造を介した生理現象や疾病について基礎的知識を提
供することができる。

【００７９】hERRj-1はチオレドキシン ドメインとDnaj
ドメインを持つ新規の小胞体内シャペロンである。本発
明の遺伝子あるいは蛋白質の細胞内での発現は細胞死
（アポトーシス）を引き起こす。本発明のhERRj-1は、c
-Jun及びeIF2aのSer51をリン酸化（転写活性化）する。
本発明の遺伝子あるいは蛋白質はUPRを誘導する。本発
明のhERRj-1はIRE 1、Bip、免疫グロブリンと結合す
る。本発明のhERRj-1はIRE1による凝集体の形成を誘導
する。本発明のhERRj-1はERp57を還元させる。本発明の
hERRj-1は免疫グロブリンの発現を調節する。本発明のh
ERRj-1は膵臓のランゲルハンス島のbeta細胞、脳及び精
細胞などの小胞体の機能維持に必須である。本発明のhE
RRj-1は腺癌、特に、子宮腺癌及び乳腺癌に高発現して
いる。本発明の遺伝子または蛋白質がUPRを誘導すると
いう知見は、本発明の遺伝子または蛋白質が小胞体スト
レス対する防御分子として利用できることを意味する。

【００８０】また、hERRj-1は細胞死を誘導する活性を
有するので、hRUPP-1と同様に、hERRj-1を投与すること
により腫瘍細胞等において、細胞死を誘導することがで
きるかもしれない。さらに、hERRj-1、hERRj-1をコード
する遺伝子、それに対するアンチセンスポリヌクレオチ
ドを含むスクリーニング系を用いることにより、該蛋白
質の活性を阻害、または、活性化する化合物をスクリー
ニングすることも可能である。そのような化合物は細胞
死を調節する薬剤として役立つと考えられる。

【００８１】JNKの活性化はストレスによるアポトーシ
ス、特に神経細胞死に必須である。hERRj-1の持つc-Jun
リン酸化活性(JNKの活性化)を制御することにより細胞
死を制御することが可能となるかも知れない。例えば、
hERRj-1に対するアンチセンス遺伝子を投与することに
より、ERストレスにより起こる細胞死を抑制でき、ERス
トレスによる神経細胞死が原因とされるアルツハイマー
病の治療や治療薬の開発に利用可能であると期待され
る。

【００８２】eIF2αリン酸化の起こらないミュータント
は低血糖症を引き起こし、eIF2αリン酸化は血糖値調節
に必須であることから、hERRj-1遺伝子を投与すること
により低血糖症の治療や治療薬の開発に利用可能である
と期待される。

【００８３】hERRj-1はIRE 1と結合でき、IRE 1の凝集
体形成などを介しIRE 1の機能を調節する分子であると
予測されるので、hERRj-1を利用することにより、UPRな
どのIRE 1を介する信号を調節し、B細胞の分化誘導や神
経変性疾患の治療に利用できると期待される。

【００８４】hERRj-1は膵臓のランゲルハンス島のbeta
細胞に高発現し、その機能維持に必須であると予測され
るので、hERRj-1を利用することにより、糖尿病の治療
や糖尿病の治療のための薬剤の開発に利用できる。

【００８５】家族性アルツハイマー病(FAD)の原因遺伝
子PS1の遺伝子変異は小胞体分子シャペロンBipの転写誘
導の減弱を引き起こし、Bipの転写誘導阻害が神経細胞
死の原因の一つとされている。hERRj-1はBipの転写誘導
を活性化でき、さらにBipとの結合を介してBipの機能を
調節すると予測できることから、hERRj-1遺伝子または
アンチセンス遺伝子を投与することによりこれらの病気
の治療や治療薬の開発に利用可能であると期待される。

【００８６】腺細胞でのERRj-1の発現異常は腺癌、特
に、子宮腺癌及び乳腺癌発生の原因の一つになることが
示唆されるので、hERRj-1を利用することにより、腺癌
の治癒や治療のための薬剤の開発が期待できる。

【００８７】hERRj-1は免疫グロブリンH鎖と直接な結合
を介し、またはERp57の機能を調節することにより、MHC
クラスIによる抗原提示に関与すると予測されるので、h
ERRj-1を利用することにより、癌の治癒が期待でき、さ
らに癌の転移を防ぐことが可能になると期待できる。

【００８８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tensei Suisan Co.,Ltd. <120> Newly identified genes whose expression level changes by AIP treatment <130> 182174 <140> <141> <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tagttttatt taagcggccg ccagtcggaa gcgccagccc agagcctggg aagtggccgc 60 agaggctgct cggccccgct gcccgccagg tcgtgggctc ccgctccggg cccggggcca 120 ccggctgtgg acttcaaaat gagcgtccct gactacatgc agtgtgctga ggaccaccag 180 acgctgctcg tggtggtcca gcctgtgggc atcgtctccg aggagaactt cttcaggatc 240 tataagagga tttgctctgt gagtcagatc agcgtgcggg actcccagcg agtcctctac 300 atccgctaca ggcaccacta cccacccgag aacaacgagt ggggcgactt ccagacccac 360 cgcaaagtcg tgggcctcat caccatcaca gactgcttct cggccaagga ctggccacag 420 accttcgaga agttccacgt gcagaaggag atctacggct ccacactgta tgactcccgg 480 ctctttgtct tcgggctgca gggggagatc gtggagcagc cgcgcaccga cgtggctttc 540 taccccaact acgaggactg ccagacggtg gagaagagaa tcgaggactt catcgagtca 600 ctgttcatcg tgctggagtc caagcgtctg gacagagcca cagacaagtc 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agagcatcaa atcttcttta tggtcagctt aagtttggta cactagattg 1920 tacagttcat gagggactct gtaacatgta taacattcag gcttatccaa caacagtggt 1980 attcaaccag tccaacattc atgagtatga aggacatcac tctgctgaac aaatcttgga 2040 gttcatagag gatcttatga atccttcagt ggtctccctt acacccacca ccttcaacga 2100 actagttaca caaagaaaac acaacgaagt ctggatggtt gatttctatt ctccgtggtg 2160 tcatccttgc caagtcttaa tgccagaatg gaaaagaatg gcccggacat taactggact 2220 gatcaacgtg ggcagtatag attgccaaca gtatcattct ttttgtgccc aggaaaacgt 2280 tcaaagatac cctgagataa gattttttcc cccaaaatca aataaagctt atcagtatca 2340 cagttacaat ggttggaata gggatgctta ttccctgaga atctggggtc taggattttt 2400 acctcaagta tccacagatc taacacctca gactttcagt gaaaaagttc tacaagggaa 2460 aaatcattgg gtgattgatt tctatgctcc ttggtgtgga ccttgccaga attttgctcc 2520 agaatttgag ctcttggcta ggatgattaa aggaaaagtg aaagctggaa aagtagactg 2580 tcaggcttat gctcagacat gccagaaagc tgggatcagg gcctatccaa ctgttaagtt 2640 ttatttctac gaaagagcaa agagaaattt tcaagaagag cagataaata ccagagatgc 2700 aaaagcaatc gctgccttaa taagtgaaaa attggaaact ctccgaaatc aaggcaagag 2760 gaataaggat gaactttgat aatgttgaag atgaagaaaa agtttaaaag aaattctgac 2820 agatgacatc agaagacacc tatttagaat gttacattta tgatgggaat gaatgaacat 2880 tatcttagac ttgcagttgt actgccagaa ttatctacag cactggtgta aaagaagggt 2940 ctgcaaactt tttctgtaaa gggccggttt ataaatattt tagactttgc aggctataat 3000 atatggttca cacatgagaa caagaataga gtcatcatgt attctttgtt atttgctttt 3060 aacaaccttt aaaaaatatt aaaacgattc ttagctcaga gccatacaaa agtaggctgg 3120 attcagtcca tggaccatag attgctgtcc ccctcgacgg acttataatg tttcaggtgg 3180 ctggcttgaa catgagtctg ctgtgctatc tacataaatg tctaagttgt ataaagtcca 3240 ctttcccttc acgttttttg gctgacctga aaagaggtaa cttagttttt ggtcacttgt 3300 tctcctaaaa atgctatccc taaccatata tttatatttc gttttaaaaa cacccatgat 3360 gtggcacagt aaacaaaccc tgttatgctg tattattatg aggagattct tcattgtttt 3420 ctttccttct caaaggttga aaaaatgctt ttaatttttc acagccgaga aacagtgcag 3480 cagtatatgt gcacacagta agtacacaaa tttgagcaac agtaagtgca caaattctgt 3540 agtttgctgt atcatccagg aaaacctgag ggaaaaaaat tatagcaatt aactgggcat 3600 tgtagagtat cctaaatatg ttatcaagta tttagagttc tatattttaa agatatatgt 3660 gttcatgtat tttctgaaat tgctttcata gaaattttcc cactgatagt tgatttttga 3720 ggcatctaat atttacatat ttgccttctg aaaaaaaaaa aaaaaa 3766 <210> 6 <211> 793 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gly Val Trp Leu Asn Lys Asp Asp Tyr Ile Arg Asp Leu Lys Arg 1 5 10 15 Ile Ile Leu Cys Phe Leu Ile Val Tyr Met Ala Ile Leu Val Gly Thr 20 25 30 Asp Gln Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Ser Ser 35 40 45 Arg Glu Ile Arg Gln Ala Phe Lys Lys Leu Ala Leu Lys Leu His Pro 50 55 60 Asp Lys Asn Pro Asn Asn Pro Asn Ala His Gly Asn Phe Leu Lys Ile 65 70 75 80 Asn Arg Ala Tyr Glu Val Leu Lys Asp Glu Asp Leu Arg Lys Lys Tyr 85 90 95 Asp Lys Tyr Gly Glu Lys Gly Leu Glu Asp Asn Gln Gly Gly Gln Tyr 100 105 110 Glu Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Phe Gly Ile Tyr Asp Asp Asp 115 120 125 Pro Glu Ile Ile Thr Leu Glu Arg Arg Glu Phe Asp Ala Ala Val Asn 130 135 140 Ser Gly Glu Leu Trp Phe Val Asn Phe Tyr Ser Pro Gly Cys Ser His 145 150 155 160 Cys His Asp Leu Ala Pro Thr Trp Arg Asp Phe Ala Lys Glu Val Asp 165 170 175 Gly Leu Leu Arg Ile Gly Ala Val Asn Cys Gly Asp Asp Arg Met Leu 180 185 190 Cys Arg Met Lys Gly Val Asn Ser Tyr Pro Ser Leu Phe Ile Phe Arg 195 200 205 Ser Gly Met Ala Pro Val Lys Tyr His Gly Asp Arg Ser Lys Glu Ser 210 215 220 Leu Val Ser Phe Ala Met Gln His Val Arg Ser Thr Val Thr Glu Leu 225 230 235 240 Trp Thr Gly Asn Phe Val Asn Ser Ile Gln Thr Ala Phe Ala Ala Gly 245 250 255 Ile Gly Trp Leu Ile Thr Phe Cys Ser Lys Gly Gly Asp Cys Leu Thr 260 265 270 Ser Gln Thr Arg Leu Arg Leu Ser Gly Met Leu Asp Gly Leu Val Asn 275 280 285 Val Gly Trp Met Asp Cys Ala Thr Gln Asp Asn Leu Cys Lys Ser Leu 290 295 300 Asp Ile Thr Thr Ser Thr Thr Ala Tyr Phe Pro Pro Gly Ala Thr Leu 305 310 315 320 Asn Asn Lys Glu Lys Asn Ser Ile Leu Phe Leu Asn Ser Leu Asp Ala 325 330 335 Lys Glu Ile Tyr Leu Glu Val Ile His Asn Leu Pro Asp Phe Glu Leu 340 345 350 Leu Ser Ala Asn Thr Leu Glu Asp Arg Leu Ala His His Arg Trp Leu 355 360 365 Leu Phe Phe His Phe Gly Lys Asn Glu Asn Ser Asn Asp Pro Glu Leu 370 375 380 Lys Lys Leu Lys Thr Leu Leu Lys Asn Asp His Ile Gln Val Gly Arg 385 390 395 400 Phe Asp Cys Ser Ser Ala Pro Asp Ile Cys Ser Asn Leu Tyr Val Phe 405 410 415 Gln Pro Ser Leu Ala Val Phe Lys Gly Gln Gly Thr Lys Glu Tyr Glu 420 425 430 Ile His His Gly Lys Lys Ile Leu Tyr Asp Ile Leu Ala Phe Ala Lys 435 440 445 Glu Ser Val Asn Ser His Val Thr Thr Leu Gly Pro Gln Asn Phe Pro 450 455 460 Ala Asn Asp Lys Glu Pro Trp Leu Val Asp Phe Phe Ala Pro Trp Cys 465 470 475 480 Pro Pro Cys Arg Ala Leu Leu Pro Glu Leu Arg Arg Ala Ser Asn Leu 485 490 495 Leu Tyr Gly Gln Leu Lys Phe Gly Thr Leu Asp Cys Thr Val His Glu 500 505 510 Gly Leu Cys Asn Met Tyr Asn Ile Gln Ala Tyr Pro Thr Thr Val Val 515 520 525 Phe Asn Gln Ser Asn Ile His Glu Tyr Glu Gly His His Ser Ala Glu 530 535 540 Gln Ile Leu Glu Phe Ile Glu Asp Leu Met Asn Pro Ser Val Val Ser 545 550 555 560 Leu Thr Pro Thr Thr Phe Asn Glu Leu Val Thr Gln Arg Lys His Asn 565 570 575 Glu Val Trp Met Val Asp Phe Tyr Ser Pro Trp Cys His Pro Cys Gln 580 585 590 Val Leu Met Pro Glu Trp Lys Arg Met Ala Arg Thr Leu Thr Gly Leu 595 600 605 Ile Asn Val Gly Ser Ile Asp Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Cys Ala 610 615 620 Gln Glu Asn Val Gln Arg Tyr Pro Glu Ile Arg Phe Phe Pro Pro Lys 625 630 635 640 Ser Asn Lys Ala Tyr Gln Tyr His Ser Tyr Asn Gly Trp Asn Arg Asp 645 650 655 Ala Tyr Ser Leu Arg Ile Trp Gly Leu Gly Phe Leu Pro Gln Val Ser 660 665 670 Thr Asp Leu Thr Pro Gln Thr Phe Ser Glu Lys Val Leu Gln Gly Lys 675 680 685 Asn His Trp Val Ile Asp Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly Pro Cys Gln 690 695 700 Asn Phe Ala Pro Glu Phe Glu Leu Leu Ala Arg Met Ile Lys Gly Lys 705 710 715 720 Val Lys Ala Gly Lys Val Asp Cys Gln Ala Tyr Ala Gln Thr Cys Gln 725 730 735 Lys Ala Gly Ile Arg Ala Tyr Pro Thr Val Lys Phe Tyr Phe Tyr Glu 740 745 750 Arg Ala Lys Arg Asn Phe Gln Glu Glu Gln Ile Asn Thr Arg Asp Ala 755 760 765 Lys Ala Ile Ala Ala Leu Ile Ser Glu Lys Leu Glu Thr Leu Arg Asn 770 775 780 Gln Gly Lys Arg Asn Lys Asp Glu Leu 785 790 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tcaacatcaa agtgaagctg g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 acagacggct cgacttctac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ctgagtcaag gagaggtgga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tgggtccctg catctgactc 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 catccttgcc aagtcttaat gcc 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctttttcttc atcttcaaca ttatc 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 AIP処理によって起こる細胞の増殖阻害時に
増加する遺伝子のサブトラクション法によるクローニン
グ法の流れを示す。

【図２】 AIP処理によって起こる細胞の増殖阻害時に
減少する遺伝子のサブトラクション法によるクローニン
グ法の流れを示す。

【図３】 サブトラクション ライブラリーのスクリー
ニングにより（cDNA2-cDNA 1）プローブのみと反応する
hRUPP-1のcDNA断片を持つクローン。

【図４】 サブトラクション ライブラリーのスクリー
ニングにより（cDNA2-cDNA 1）プローブのみと反応する
hRRCP-1のcDNA断片を持つクローン。

【図５】 サブトラクション ライブラリーのスクリー
ニングにより（cDNA2-cDNA 1）プローブのみと反応する
hERRj-1のcDNA断片を持つクローン。

【図６】 hERR-1のドメイン構造と各々のドメイン配列
の比較図。

【図７】 hRUPP-1の組織分布。

【図８】 hRRCP-1の組織分布。

【図９】 hERRj-1の組織分布。

【図１０】 Hela及びNIH3T3細胞に全長のhRUPP-1遺伝
子を導入した時の細胞の形態。

【図１１】 hRUPP-1遺伝子の機能ドメイン解析のため
に作成したミュータント蛋白質の模式図。

【図１２】 図１１に示したミュータント蛋白質をCHO
細胞、及び、Hela細胞に導入した時の細胞の形態。

【図１３】 NIH3T3細胞でのhRUPP-1、及び、p53の分
解。

【図１４】 hRUPP-1遺伝子及びユビキチン遺伝子の293
細胞での共発現による、hRUPP-1の細胞内でのポリユビ
キチン化の確認。

【図１５】 hRRCP-1、Mayven、Keap 1のHela細胞にお
ける局在を示す。

【図１６】 hRRCP-1の持つRing-canal構造形成に関わ
る内部ドメインを特定するため、ミュータント蛋白質を
コードする遺伝子はPCR法で作製し、エピトープ融合蛋
白質として発現されるようにしてHela細胞に導入し、各
々の局在を調べた。

【図１７】 hRRCP-1のミュータント蛋白質の模式図。

【図１８】 hRRCP-1、Mayven及びKeap 1を各々の293細
胞に発現させた後、細胞を溶解し、hRRCP-1、Mayven及
びKeap 1を各々免疫沈降し、SDS-PAGEに付し、PVDF膜に
転写した。各々の免疫沈降画分を蛋白質に対する抗体
(図１７上)、及び、アクチンに対する抗体(図１７下)で
免疫染色し、アクチンとの結合能を調べた。

【図１９】 293細胞に各々、hRRCP-1/Mycエピトープと
Mayven/Flagエピトープ、ｈRRCP-1/MycエピトープとKea
p 1/Flagエピトープ、及び、Keap 1/FlagエピトープとM
ayven/Mycエピトープ遺伝子を共導入し、細胞を溶解し
た後、各々の細胞溶解物を抗Mycエピトープ抗体で免疫
沈降し、免疫沈澱物をSDS-PAGEに供した。その後、PVDF
膜に転写し、抗Flag抗体を用いて(Ａ)、または、抗Myc
抗体を用いて(Ｂ)免疫染色した。

【図２０】 Hela細胞に各々、hRRCP-1/Mycエピトープ
とMayven/Flagエピトープ、hRRCP-1/MycエピトープとKe
ap 1/Flagエピトープ、及び、Keap 1/Flagエピトープと
Mayven/Mycエピトープを共導入し、各々の細胞を抗Myc
エピトープ抗体(赤)、及び、抗Flagエピトープ抗体(緑)
で免疫染色した。

【図２１】 293/Fas細胞にhRRCP-1を導入し、抗Fas抗
体で一定時間刺激した後、細胞を溶解し、SDS-PAGE後、
PVDF膜に転写し、hRRCp-1(Ａ)及びcaspase3(Ｂ)で免疫
染色した。

【図２２】 hERRj-1をHela細胞で発現させ、小胞体内
マーカー蛋白質であるBipとの共局在の様子を表す細胞
の写真。

【図２３】 Hela及びCHO細胞にhERRj-1遺伝子を導入し
た時の細胞の形態。

【図２４】 hERRj-1のIRE 1、または、PERKの活性化。

【図２５】 hERRj-1を293細胞あるいはCHO細胞に導入
し、UPRにより誘導される遺伝子BipやCHOPの発現。

【図２６】 CHO細胞に各々、IRE1-alpha/T7エピトープ
あるいはIRE1-beta/Mycエピトープあるいは空ベクター
とhERRj-1/Flagエピトープ遺伝子を共導入した後、Tm
（2.5μｇ/mlのツニカマイシン）、DTT（5ｍMのジチオ
スレイトールで）、Tg（1μMのthapsigargin）で細胞を
処理した。細胞を溶解した後、各々の細胞溶解物を抗Fl
agエピトープ抗体で免疫沈降し、免疫沈澱物をSDS-PAGE
に供した。その後、PVDF膜に転写し、抗T７抗体と抗Fla
g抗体を用いて(Ａ)、抗Myc抗体と抗Flag抗体を用いて
(Ｂ)、抗Bip抗体と抗Flag抗体を用いて（C）免疫染色し
た。

【図２７】 CHO細胞に空ベクター導入時の生細胞の割
合を１００％とした時の各々のミュータント導入時の生
細胞の割合を表した。

【図２８】 NIH細胞における図で表した各々の遺伝子
を共発現させた時のIRE 1-alphaの局在を示す。

【図２９】 マウスの各々の固定組織切片を抗hERRj-1
ペプチド抗体を用いて免疫染色した写真。矢印で囲んだ
部分あるいは矢印で指した部分がmERRj-1の存在場所を
表す。

【図３０】 A: hERRj-1のESTデータベース検索の結
果。B: CHO細胞におけるhERRj-1遺伝子導入によるERp57
蛋白の酸化還元状態。C: CHO細胞に空ベクターあるいは
免疫グロブリンH（mu）鎖あるいは免疫グロブリンH（m
u）鎖とhERRj-1/Flagエピトープ遺伝子を導入した後、
細胞を溶解し、各々の細胞溶解物をそのまま（Total）
あるいは抗免疫グロブリンH（mu）鎖抗体で免疫沈降
し、SDS-PAGEに供した。PVDF膜に転写し、図で示した各
々の抗体で免疫染色した。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 35/00 25/28 43/00 １０５ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 HA17 4C084 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 NA14 ZA162 ZB212 ZB262 ZC352 4C086 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA16 ZB21 ZB26 ZC35 4H045 AA10 BA10 CA45 EA28 FA74

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む
   蛋白質(hRUPP-1)、または、その断片、及び、配列番号
   ２に記載のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のア
   ミノ酸が欠失、付加、若しくは、置換により修飾されて
   いるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、hRUP
   P-1と同じ生物活性を有する蛋白質。
2. 【請求項２】 配列番号２のアミノ酸配列1〜305、また
   は、751〜1148までの部分を含む請求項１に記載の蛋白
   質。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の蛋白質をコー
   ドするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む
   蛋白質(hRRCP-1)、または、その断片、及び、配列番号
   ４に記載のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のア
   ミノ酸が欠失、付加、若しくは、置換により修飾されて
   いるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、hRRC
   P-1と同じ生物活性を有する蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項３に記載の蛋白質をコードするポ
   リヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む
   蛋白質(hERRj-1)、または、その断片、及び、配列番号
   ６に記載のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のア
   ミノ酸が欠失、付加、若しくは、置換により修飾されて
   いるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、hERR
   j-1と同じ生物活性を有する蛋白質。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の蛋白質をコードするポ
   リヌクレオチド。