JP2002326953A

JP2002326953A - 経粘膜法により吸収されるワクチン

Info

Publication number: JP2002326953A
Application number: JP2002077103A
Authority: JP
Inventors: Rolando Wyss; ウィスロナルド; Bernard Bizzini; ビッツィニベルナルド; Ivo Volpat; ヴォルパトイヴォ
Original assignee: Grisotech SA
Current assignee: Grisotech SA
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2002-11-15
Also published as: US6936250B2; US7186411B2; EP1243256A1; DE60228154D1; ATE404174T1; US20050260228A1; EP1243256B1; ITMI20010571A1; US20030049279A1

Abstract

(57)【要約】【課題】医薬品用途のためのレクチンで誘導体化され
た多糖類被覆済み抗原から成るワクチンを提供する【解決手段】前記ワクチンにおいて、多糖類は好まし
くは、キトサン；高度に脱アセチル化された低分子量キ
トサン；メチルグリコールキトサン；アルギン酸；ポリ
マンヌロン酸；並びにそれらの塩又は誘導体から成る群
から選ばれる。本発明のワクチンにおいて、抗原は、微
生物；病原菌又はそれらの構成物質；ホルモン；酵素；
プロ酵素；麻酔剤；生理活性ペプチド；代謝物；生理的
前駆体；細胞構成物質；アレルゲンであり、また、レク
チンは植物由来の蛋白質である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は人間及び動物への経
口及び経粘膜投与のためレクチンと誘導体化した、内因
性や外因性の抗原に対するワクチンの生産に関する。

【０００２】

【従来の技術】周知の如く、活性ワクチンとして使用さ
れる抗原構造はキトサンに組込まれた時経鼻法により吸
収される。

【０００３】本題に関する幾つかの論文は記しておく価
値がある、即ちインフルエンザウイルス抗原（米国特許
第６０４８５３６号）、ジフテリア菌毒素抗原（Ｅ．
Ａ．ＭｃＮｅｅｌａ，Ｖａｃｃｉｎｅ２０００，１
９：１１８８−１１９８）、及び百日咳菌抗原（Ｉ．Ｊ
ａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌほか，Ｖａｃｃｉｎｅ１９９
８，１６：２０３９−２０４６）のキトサンへの結合に
関するものである。

【０００４】キトサンへの抗原組込みの方法は前述の論
文に常に記述されているわけではないが、それは屡々抗
原−キトサンの化学架橋結合に基づいている。

【０００５】ワクチンの中で種々の分子のキトサンへの
組込みが、特に経鼻法による、粘膜吸収の可能性の第一
の理論的根拠と、この多糖類その他類似のものが免疫刺
激作用を及ぼすと云う事実の第二の理論的根拠を見出
し、そしてそれ故に抗原誘導抗体反応を高めることが出
来ると云うことになる（Ａ．Ｂａｃｏｎほか，Ｉｎｆｅ
ｃｔＩｍｍｕｎ．２０００，６８：５７６４−５７７
０；Ｄ．Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓ
ｔａｎｄ．１９９７，９０：２５７−２６５；Ｐ．Ｇ．
Ｓｅｆｅｒｉａｎほか，Ｖａｃｃｉｎｅ２０００，１
９：６６１−６６８）。従来技術で知られている好まし
い投与法は経鼻法によるものである。

【０００６】抗原物質（又は活性ワクチン）にレクチン
タイプ又はレクチン様の分子を結合させることにより、
ガングリオシドＧＭ１及びＧＭ２で表す粘膜上皮細胞に
向って前記物質を案内することが可能であることも又知
られている（ＤｅＡｉｚｐｕｒｕａほか，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１９８８，１６７：４４０−４５１）、斯
くしてそれらの結合を誘導して免疫応答性細胞に向って
輸送する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】然し、レクチンの使用
はＡ．Ｐｕｓｔｚａｉほかによって検討された成長阻害
のような、同じものによって作られる不都合な副作用に
より制限される（レクチンレビュー、Ｋｉｌｐａｔｒｉ
ｃｋＤ．Ｃ．版、１９９１，Ｖｏｌ．１：ｐｐ１−１
５）。これらの使用の理論的根拠付けが高く望まれるこ
ととなる。

【０００８】本発明の主な目的は薬学的用法のためレク
チンと誘導体化した多糖類でコートされた抗原を提供す
るにある。前記ワクチンでは、多糖類はなるべくならキ
トサン、低分子量で且つ高い脱アセチル度のキトサン、
メチルグリコールキトサン、アルギン酸、ポリマンヌロ
ン酸と塩類又はそれの誘導体より成っているグループか
ら選ばれる。本発明のワクチンでは、抗原は微生物、病
原体又はそれの成分、ホルモン類、酵素、酵素前駆体、
麻薬、生物活性ペプチド、代謝産物、生物学的前駆物
質、細胞成分、アレルゲンであり又レクチンは植物起源
のものである。

【０００９】本発明は又成長関係の障害の予防と治療、
及び骨粗鬆症、潰瘍、高コレステロール血症、肥満症、
不妊症、類脂症、アレルギーの治療についての医薬品の
調製で要求されるワクチンの使用にまで広がる。

【００１０】本発明はその目的に前記ワクチン及び有効
成分としてレクチンと誘導体化した多糖類でコートした
ワクチンを含んでいる合成品の調製の手順の提供も有し
ている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】蛋白質的性質のものでも
ある抗原が多糖類でコートされた時、それらが粘膜によ
って吸収され且つ局所と液素性免疫の両方を刺激するこ
とを出願人は観察した。更に、抗原がレクチンと抱合又
は誘導体化される時、それらは粘膜細胞、特にガングリ
オシドＧＭ１とＧＭ２で表している（Ｍ細胞）に、より
有効に向けられそしてそれは局所及び全身免疫反応の刺
激に影響を及ぼす。レクチンと誘導体化した抗原の多糖
類との結合は多糖類のコーティングにより保護されてい
るレクチンの指向効果の利用で付随する望ましくない副
作用を産出しなくする。多糖類の保護と輸送のレクチン
の指向効果及び例えばキトサンのような多糖類の免疫調
節効果の利用は結果として投薬量の制御とどちらかと云
えばレクチンにより作られる副作用の消去を生じると云
うことになる。本発明のワクチンの主な利点はそれらが
経口又は経粘膜法により吸収され得ることである。更
に、それらが免疫反応に関係する細胞により有効に指向
される点で、それらは対応しているコートされているが
抱合されていないワクチンよりもより有効である。それ
故、本発明の主な目的は薬学的用法のために、レクチン
と誘導体化した抗原より成っている多糖類をコートした
ワクチンを提供するにある。

【００１２】多糖類は抗原−レクチン抱合体の周りに保
護コートを形成し且つ三つの作用を及ぼす：それらは蛋
白質分解酵素及び胃の環境に起因する減成から抗原を保
護し、従って経口投与を可能にする；非特異性及び潜在
性の毒素の吸収からレクチンを分離する；そして免疫刺
激効果を有し得る。それ故、多糖類はそれらの蛋白質構
造を保護し且つ活性形で経口及び経粘膜法によりそれら
の吸収を可能にしながらワクチンを輸送する。

【００１３】経口又は経粘膜吸収は非経口のそれを越え
る更なる利点を有する。例えば免疫グロブリンの様な異
型蛋白質の特定の場合には、より遅くより緩やかな経口
又は経粘膜吸収は免疫グロブリンの投薬量と血液中の分
布のより良い制御が可能であり、又それらの効力を変え
ない。本発明に従うワクチンの経口及び経粘膜法による
吸収は非経口法によるそれよりもより遅く又より緩やか
である：それは抗原−免疫系相互作用の条件が時間につ
いてより良く合理化され得ると云うことになる。

【００１４】様々な物理化学的特性と様々な誘導体化度
を有している多糖類調製法を用いて誘導体化した抗原は
多糖類に組込まれる。

【００１５】多糖類はなるべくならキトサン、例えば低
分子量（１５０，０００）キトサンのようなもののアル
ギン酸塩とその誘導体、中分子量（４００，０００）で
且つ高脱アセチル化度のキトサン、グリコールキトサ
ン、メチルグリコールキトサン、Ｐｒｏｔａｓａｎ（登
録商標）の中から選出されるのがよい。特に好まれるの
はメチルグリコールキトサン、低分子量で且つ高脱アセ
チル化度のキトサン、及び例えばアルギン酸塩分解酵素
でアルギン酸の酵素加水分解により得られたポリマンヌ
ロン酸（ＭＷ５−１０ｋＤ）とそれの誘導体である。前
記多糖類又はそれの誘導体は消化器系統の酵素作用と物
理化学的変動に耐える重合体“薄層”を持ち組込まれる
べき構造（特定の場合、レクチンと誘導体化した抗原）
を取囲むことの出来るグループから選ばれる。それらは
組込まれた構造を粘膜細胞に向け、そうしてその吸収を
容易にすることも可能である。

【００１６】架橋結合していない多糖類はなるべくなら
免疫グロブリンの組込みに使用される。架橋結合のない
ことから結果する更なる利点は：本発明の複合体の調製
工程がより簡単になり且つ最終製品が化学的架橋結合か
ら誘導される毒素の残渣を潜在的に含まないことであ
る。

【００１７】本発明のワクチンの特徴はコートを形成し
ている多糖類とレクチン誘導体化した抗原とが共有結合
していないことである。前記コートは例えばアルギン酸
の場合のような、ゲルの形態の表面被覆物のようなもの
である。多糖類と誘導体化した抗原の間の結合は共有で
はないが、なるべくなら非特異性で、弱い相互作用又は
イオン結合である。

【００１８】本発明のワクチンでは、抗原は内因性又は
外因性の起源のものであってよい。それらは病原体又は
それの成分、アレルゲン又は抗原性成分又はそれの抗原
決定基、ホルモン類、酵素及び酵素前駆体、麻薬、生物
活性ペプチド、代謝産物、生物学的前駆体、細胞成分よ
り成っているグループから選択される。

【００１９】本発明の好ましい特徴に従って、外因性起
源の抗原は病原体から誘導されるか又は病原体を不活性
化させる。好ましい特徴に従って、前記病原体は：単純
ヘルペス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘ウイ
ルス、風疹ウイルス、合胞体層ウイルス、呼吸ウイル
ス、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バールウ
イルス、ニワトリ鼻気管炎ウイルス、ニワトリ呼吸ウイ
ルス、単球症リステリア、腸炎菌、チフス菌、パラチフ
ス菌、ネズミチフス菌、ブタコレラ菌、破傷風菌、ボツ
リヌス菌、フレキシナー菌、鵞口瘡カンジダ、Ｔｏｘｏ
ｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ又は抗原成分又はそれの可
溶性又は不溶性フラクション、から選択される。特に好
ましいものは鵞口瘡カンジダから抽出されたｃａｎｄｉ
ｄｉｎ抗原、リステリア抗原、ＩＲＴ（感染性鼻気管
炎）抗原及びニワトリ呼吸ウイルス抗原より成っている
ワクチンである。本発明に従って、前記抗原はレクチン
との抱合により誘導体化及び／又は不活性化されそして
多糖類に組込まれる。更なる好ましい実施例によれば、
例えば解毒の目的で、抗体形成が有効に誘導されるには
外因性物質は麻薬である。この好ましい実施例によれ
ば、抗原は麻薬であり、特にそれらはコカイン、ヘロイ
ン、リゼルグ酸（ＬＳＤ）又はそれの塩類か誘導体より
成っているグループから選ばれ、それはレクチンと誘導
体化されて多糖類に組込まれる。特に好ましいのはコカ
インである。

【００２０】本発明のワクチンの更なるそして新規な応
用は被験者の生理学的（内因性）生体機能平衡の制御で
ある。事実、ペプチド、ホルモン又は細胞成分のような
内因性物質への抗体の誘導は体の機能状態の代謝的変動
又はいくらかの病的条件の補正でさえも結果として生じ
る。抗原がコレステロールである時の例によると、本発
明のワクチンにより誘導された特定の抗体の生産が循環
しているコレステロールのレベルを下げることを可能に
する。このタイプの手法によれば、様々な性質の器官の
変性から結果として起っている機能的及び代謝的不平衡
を補正することが可能である。それ故この場合、本発明
のワクチンはなるべくならグルカゴン、ソマトスタチ
ン、コレシストキニン、カルシトニン及びそれの誘導体
及び／又は多糖類中へのレクチンとの抱合体よりなって
いる。すべての内因性の分子と成分により維持された自
然の体、ホメオスタシス、は天然の抗体と特定の抑制因
子により生理学的レベルで実現されている。この平衡状
態は本発明のワクチンの積極的な接種によって損なわれ
ない。逆に、このタイプの接種は例えば本発明で説明し
たように、多数の病的条件におけるホメオスタシスを回
復出来る。

【００２１】特に好ましいのは内因性物質又は内因性細
胞成分、ホルモン又は生物活性ペプチドがレクチンと誘
導体化して且つ本発明に従って多糖類に組込まれたコレ
ステロール又はソマトスタチンであるようなワクチンで
ある。

【００２２】本発明に従うワクチンでは、レクチンは抗
体反応に関係する例えばＭ細胞のような細胞にワクチン
を向ける能力に基づいて選ばれる。特に好ましいのは凝
集反応作用を発揮するレクチン類であり又特にそれらは
蛋白質：Ｌｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ、Ｇｌｙｃｉｎ
ｅｍａｘ、ヨーロッパ産ハリエニシダ（ＵＥＡＩ＋Ｕ
ＥＡＩＩ）、ナンキンマメ、インゲンマメより成ってい
るグループから選ばれる。本発明の好ましい特徴に従っ
て、レクチンは当業界で知られている方法に従って抗原
と化学的に誘導体化される、又なるべくなら、抗原分子
１に対してレクチン分子１乃至１０の比率で誘導体化さ
れる。代って、それらは４℃乃至２０℃で１分間高速機
械攪拌により抗原と直接混合しても良い。

【００２３】本発明のワクチンが脂質を遊離したＣｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｕｍフラ
クションから誘導され、又レクチンと誘導体化した抗原
の組込みに使用される手順通りに、即ち従来の技術で知
られている基準に基づいて選ばれ、２５乃至６５℃に加
熱された適当な緩衝液中の誘導体化した抗原又は脂質を
遊離したＢＶＶフラクション（０．５−５０ｍｇ／ｍ
ｌ）の濃縮溶液をｐＨ３．５乃至８．５を有している緩
衝液中で重量／容積で０．１乃至１０％の濃度にある多
糖類を含んでいる溶液と混合することにより、又３０秒
乃至２分間又は場合によっては３０乃至６０秒を３乃至
５回高速機械攪拌をすることにより多糖類に組込まれた
適当な補助薬と共に投与された時、ワクチン処理に続く
抗体反応が劇的に増加したことを出願人は驚きと共に見
出した。

【００２４】それ故、本発明の更なる目的はキトサン、
例えば低分子量（１５０，０００）キトサンのようなも
ののアルギン酸塩とその誘導体、中分子量（４００，０
００）で且つ高脱アセチル化度のキトサン、グリコール
キトサン、メチルグリコールキトサン、Ｐｒｏｔａｓａ
ｎ（登録商標）の中から選出された多糖類に組込まれ
た、脂質を遊離したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍフラクション（ＢＶＶ）より成っ
ている補助薬複合体を提供することである。特に好まれ
るのはメチルグリコールキトサン、低分子量で且つ高脱
アセチル化度のキトサン、及び例えばアルギン酸塩分解
酵素でアルギン酸の酵素加水分解により得られたポリマ
ンヌロン酸（ＭＷ５−１０ｋＤ）とそれの誘導体であ
る。前記多糖類又はそれの誘導体は消化器系統の酵素作
用と物理化学的変動に耐える重合体“薄層”を持ち組込
まれるべき構造（特定の場合、レクチンと誘導体化した
抗原）の周りを形成することの出来るグループから選ば
れる。治療方式に従って、本発明のワクチンの投与は感
作のための第一ワクチン投与量、続いて追加量より成
り、すべて経口法及び／又は経粘膜吸収により投与され
る。代りの方法として、本発明のワクチンの経口又は経
粘膜投与は非経口法により投与される第一の感作投与量
と組合わされる。どちらの場合とも、経口又は経粘膜投
与量は第一感作及び追加投与量とも１乃至５０ｍｇ／投
与より成る。感作と追加投与の数は３から１０までの範
囲である。プロトコルに従って、非経口法による感作は
１回０．５乃至５ｍｇで成し遂げられる。

【００２５】本発明の更なる特徴に従って、ワクチンは
経口及び経粘膜投与法により投与される。“経粘膜法”
なる語句はここでは口、舌下、直腸、膣法などを意味し
て使用される。

【００２６】尚更なる特徴に従って、本発明のワクチン
は麻薬の過量投与症候群の治療、成長に関係した障害、
骨粗鬆症、潰瘍、高コレステロール血症、肥満症、不妊
症と妊娠及び閉経に関係した障害の予防と治療、ストレ
スに対する身体的抵抗の増加、アレルギー疾患、凝固病
の治療のための医薬品の調製、同様に細菌性、ウイルス
性及び真菌性の感染の予防と治療のための薬品の調製に
使用される。

【００２７】本発明のワクチンはヒトと動物への使用で
あり、又経口投与されるものは食品及び水への添加物の
形で調製される。それらは非経口的使用だけのワクチン
よりもより容易に投与出来ると云うことである。請求し
たワクチンは濾過により捕集及び／又は濃縮出来て；更
に、４℃でＰＢＳの様な生理的食塩水溶液に再懸濁した
時でさえ、それらが長時間活性を残していることは本発
明の更なる利点である。

【００２８】ヒトと動物用の顆粒状食品の調製のため従
来の技術で使用されているもの（コーンスターチなど）
の様な、適当な補助薬及び賦形剤と組合わされた本発明
のワクチンを、有効成分として含んでいる経口投与用の
合成品を提供することは本発明の更なる目的である。特
に好まれるのはレクチンと誘導体化され且つＢＶＶ免疫
刺激複合体、即ち適当な賦形剤及び／又は希釈剤と共に
脂質を遊離したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒ
ａｎｕｌｏｓｕｍフラクションより成っている、と組合
わされた多糖類に組込まれたワクチンを、有効成分とし
て含んでいる合成品である。

【００２９】本質的に以下の段階よりなっている本発明
のワクチンの調製の手順を提供することは本発明の更な
る目的である：ａ）抗原分子１に対してレクチン分子１
乃至１０の比率で、レクチンとの共有結合の形成による
抗原の誘導体化、又はａ’）脂質を遊離したＣｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｕｍフラクシ
ョンの調製；ｂ）段階ａ）で得られた誘導体化された
（又は抱合された）抗原の又は段階ａ’）で得られた脂
質を遊離したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎ
ｕｌｏｓｕｍＢＶＶフラクションの選択された多糖類、
なるべくならアルギン酸、キトサン又はそれの塩又は誘
導体、中への２５℃乃至６５℃で機械的攪拌による組込
み。

【００３０】好ましい実施例に従って、多糖類中への誘
導体化された抗原の組込み（段階ｂ）は従来の技術で知
られている基準に基づいて選ばれ、２５乃至６５℃に加
熱された適当な緩衝液中の誘導体化した抗原又は脂質を
遊離したＢＶＶフラクション（０．５−５０ｍｇ／ｍ
ｌ）の濃縮溶液をｐＨ３．５乃至８．５を有している緩
衝液中で重量／容積で０．１乃至１０％の濃度にある多
糖類を含んでいる溶液と混合することにより、又３０秒
乃至２分間又は場合によっては３０乃至６０秒を３乃至
５回高速機械攪拌をすることにより行われる。

【００３１】

【実施例】実施例１：レクチンと誘導体化した抗原の調
製様々な性質の抗原が以下に示した方式に従って商業的に
利用出来るレクチン（例えばＳｉｇｍａ社から）と誘導
体化された。レクチン類はそれらの屈性に基づいて選ば
れた。

【００３２】１．ａ．腸炎菌抗原。レクチンＬｅｎｓ
ｃｕｌｉｎａｒｉｓによる腸炎菌誘導体化腸炎菌バクテリアのマッシュがｐＨ５．５の０．１Ｍ酢
酸塩緩衝液への０．０２５ＭのＮａＩＯ₄溶液に懸濁さ
れた。その結果の懸濁液は室温で２０乃至６０分間攪拌
された。“酸化された”バクテリアは遠心分離により捕
集され、遠心分離により２回洗滌されそしてｐＨ９の
０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液に再び懸濁された。最
後の洗滌の後（２０ｍｌ懸濁液）、炭酸塩緩衝液にＤ．
Ｏ．（６２０ｎｍ）＝１で懸濁したバクテリアは緩衝液
（１ｍｌ）に溶解したレクチン（シグマ社Ｌ９２６７）
（５μｇ）を攪拌しながら添加されそして室温で４時間
反応させられた。いったん反応が完了すると、バクテリ
アは遠心分離により沈殿させられてＤ．Ｏ．（６２０ｎ
ｍ）＝１乃至４でＰＢＳに再び懸濁させられた。

【００３３】１．ｂ．単球症リステリア抗原。レクチン
Ｇｌｉｃｉｎａｍａｘ（シグマ社Ｌ１３９５）による
単球症リステリア誘導体化使用された方法は腸炎菌バクテリア誘導体化に求められ
たものと同様であった。

【００３４】１．ｃ．カルシトニン抗原。レクチンヨー
ロッパ産ハリエニシダ（ＵＥＡＩ＋ＵＥＡＩＩ）による
カルシトニン誘導体化ＰＢＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）中のＫＬＨ（キーホールリン
ペットヘモシアニン、シグマ社Ｈ８２８３）溶液（１ｍ
ｌ）がＰＢＳ中の０．２％グルタルアルデヒド（２００
ｍｌ）に対する一晩透析により活性化させられた。過剰
なグルタルアルデヒドは０．１Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝
液（２００ｍｌ）、ｐＨ９．５に対する各４時間の２回
の透析により除かれた。

【００３５】活性化させられたＫＬＨ溶液は３０％ＤＭ
ＳＯを含んでいる０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５中
の鮭カルシトニン（シグマ社Ｔ３６６０）（１．５ｍ
ｇ）とレクチンヨーロッパ産ハリエニシダ（ＵＥＡＩ＋
ＵＥＡＩＩ）（シグマ社Ｌ６７６２）（７．５ｍｇ）よ
り成っている溶液（５ｍｌ）が添加された。混合液は４
℃で一晩攪拌された。反応は２．５Ｍグリシン（５０μ
ｌ）の添加により止められた。その結果の混合液は室温
で２時間放置されてＰＢＳに対して透析された。

【００３６】１．ｄ．グルカゴン抗原。レクチンナンキ
ンマメ（シグマ社Ｌ００８１）によるグルカゴン誘導体
化０．１Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５中に１０
ｍｇ／ｍｌの濃度で、カルシトニン誘導体化について記
述した方式に従って、グルタルアルデヒドにより活性化
させられたＫＬＨ溶液（１ｍｌ）はグルカゴン（シグマ
社Ｇ１７７４）（１３ｍｇ）とレクチン（１．５ｍｇ）
の混合液を含んでいるＮ／５００ＮａＯＨ溶液（５ｍ
ｌ）により添加された。

【００３７】反応は４℃で攪拌しながら夜通し行われ
２．５Ｍグリシン（５０μｌ）の添加により止められ
た。その結果の混合液は室温で２時間放置されてＰＢＳ
に対して透析された。

【００３８】１．ｅ．ソマトスタチン抗原。レクチンヨ
ーロッパ産ハリエニシダ（ＵＥＡＩ＋ＵＥＡＩＩ）によ
るソマトスタチン誘導体化ソマトスタチン（シグマ社Ｓ９１２９）（３ｍｇ）は
０．１ＭＰＢＳ（１．５ｍｌ）に溶解させられ２５％グ
ルタルアルデヒド溶液（０．３ｍｌ）が添加された。そ
の結果の溶液は３時間２４℃で攪拌しながら暗所で反応
させられた、３時間放置されてＰＢＳ中のＵＥＡＩ＋Ｕ
ＥＡＩＩ（シグマ社Ｌ６７６２）（２０ｍｇ）溶液が添
加された。混合液は１時間反応させられ、２Ｍグリシン
溶液（０．１ｍｌ）が添加され、そして１時間２４℃で
反応させられた。

【００３９】１．ｆ．コレシストキニン抗原。レクチン
インゲンマメ（シグマ社Ｌ２７６９）によるコレシスト
キニン誘導体化カルシトニン誘導体化について述べた如く、重炭酸塩緩
衝液、ｐＨ９．５中のグルタルアルデヒドで活性化され
たＫＬＨ溶液（１ｍｌ）は２５％ＤＭＳＯを含んでいる
０．１Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５中にコレ
シストキニン（シグマ社Ｐ４４２９）（１．５ｍｇ）と
レクチンインゲンマメ（５ｍｇ）の混合液を含んでいる
溶液（５ｍｌ）が添加された。いったん混合液が４℃で
夜通し攪拌されたら、反応は２．５Ｍグリシン（５０μ
ｌ）の添加により止められた。その結果の混合液は室温
で２時間反応させられてＰＢＳに対して透析された。

【００４０】１．ｇ．コレステロール抗原。レクチンヨ
ーロッパ産ハリエニシダ（ＵＥＡＩ＋ＵＥＡＩＩ）によ
るコレステロール誘導体化コレステロール（１ｍｇ）が３０％ＤＭＳＯを含んでい
る５％Ｎａ₂ＳＯ₄溶液（２ｍｌ）に溶解させられた。グ
ルタルアルデヒドで活性化させられたＫＬＨ（３．８ｍ
ｌ）の溶液はＰＢＳ中に（１０ｍｇ／ｍｌ）で添加され
そして暫く後で、ＰＢＳ（１ｍｌ）中に３６％ホルムア
ルデヒド溶液（１ｍｌ）とＵＥＡＩ＋ＵＥＡＩＩ溶液
（１０ｍｇ）が添加された。

【００４１】反応は室温で４時間、それから４℃で夜通
し続けられた。反応混合液は２．５Ｍグリシン（５０μ
ｌ）が添加され、２時間後に、ＰＢＳに対して透析され
た。

【００４２】１．ｈ．コカイン抗原。レクチンヨーロッ
パ産ハリエニシダによるコカイン誘導体化コカイン（シグマ社Ｃ５７７６）はＯ．Ｂａｇａｓｒａ
ほかにより記されたように調製された（Ｉｍｍｕｎｏｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９２，２３：１７３）。
コカイン（４ｍｇ）は０．１ＭＮａＩＯ₄水溶液中に溶
解させられた。溶液は０．１Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝
液、ｐＨ９．５中にＫＬＨ（１ｍｇ）とレクチンヨーロ
ッパ産ハリエニシダ（５ｍｇ）を含んでいる溶液（０．
５ｍｌ）を滴下添加させ、２０分間室温で攪拌された、
その間ｐＨは正規の間隔で調整された。溶液は更に４時
間攪拌された。その後、溶液は水（０．５ｍｌ）に溶解
されたＮａＢＨ₄（１０ｍｇ）が添加され、４℃で夜通
し放置されて０．００１ＭＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して
透析された。

【００４３】１．ｉ．鵞口瘡カンジダ抗原。レクチンＬ
ｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓによる鵞口瘡カンジダから
のカンジジン誘導体化カンジジン（１０ｍｇ）はＰＢＳ（５ｍｌ）に溶解させ
られＰＢＳ中の０．２％グルタルアルデヒド（２００ｍ
ｌ）に対する透析により夜通し活性化させられた。活性
化したカンジジン中の過剰のグルタルアルデヒドは０．
１Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液（２００ｍｌ）、ｐＨ９．
５に対する２回続けての４時間の透析により除かれた。

【００４４】活性化したカンジジンは同じ緩衝液（５ｍ
ｌ）に溶解したレクチンＬｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ
（１０ｍｇ）が添加された。反応は４℃で夜通し行われ
２．０Ｍグリシン（１００μｌ）の添加によって止めら
れた。その結果の混合液は室温で２時間反応させられ
た。誘導体化したカンジジンはＰＢＳに対して透析され
た。

【００４５】１．ｌ．鼻気管炎ウイルス抗原。レクチン
ヨーロッパ産ハリエニシダによる鼻気管炎に対するワク
チンの誘導体化ＰＢＳ（１ｍｌ）に溶解したレクチンヨーロッパ産ハリ
エニシダ（５ｍｇ）はＰＢＳ中の０．２％グルタルアル
デヒドに対する透析により夜通し活性化された。活性化
したレクチンは０．１Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液（２０
０ｍｌ）、ｐＨ９．５の２回の交換に対して（各回４時
間）透析された。

【００４６】活性化したレクチンは穏やかな攪拌の下で
ワクチン（１０ｍｌ）に添加されて、更に攪拌しながら
夜通し行われた反応は２．０Ｍグリシン（５０μｌ）の
添加により止められた。

【００４７】それに代って、天然のレクチンはキトサン
又はアルギン酸塩への組込み以前にワクチンと直接混合
された。

【００４８】１．ｍ．呼吸ウイルス抗原。レクチンヨー
ロッパ産ハリエニシダによる呼吸ウイルスに対するワク
チンの誘導体化誘導体化は化学薬品店から入手出来る、鼻気管炎ウイル
スに対するワクチンの調製について記されたように行わ
れた。レクチンはキトサンやアルギン酸塩に組込む前に
混合によってワクチンに添加された。

【００４９】１．ｎ．Ｐｏａｐｒａｔｅｎｓｉｓ抗
原。レクチンＬｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓによるＰｏ
ａｐｒａｔｅｎｓｉｓアレルゲン誘導体化粉末にしたＰｏａｐｒａｔｅｎｓｉｓアレルゲン（シ
グマ社Ｐ８８９５）（１０ｍｇ）は燐酸塩／生理的食塩
水緩衝液ＰＢＳ（５ｍｌ）に再懸濁されＰＢＳ（２００
ｍｌ）中の０．２％グルタルアルデヒドに対する透析に
より夜通し活性化された。活性化したアレルゲン中の過
剰なグルタルアルデヒドは０．１Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩
衝液（２００ｍｌ）、ｐＨ９．５に対する２回続けての
４時間の透析により除かれた。活性化したアレルゲンは
同じ緩衝液（５ｍｌ）に溶解したレクチンＬｅｎｓｃｕ
ｌｉｎａｒｉｓ（１０ｍｇ）が添加された。反応は４℃
で夜通し行われ２．０Ｍグリシン（１００μｌ）の添加
によって止められた。その結果の混合液は室温で２時間
反応させられた。誘導体化したアレルゲンはＰＢＳに対
して透析された。

【００５０】実施例２：多糖類への誘導体化した抗原の
組込み実施例１に従って誘導体化した抗原は多糖類（キトサン
とアルギン酸）中に組込まれた。

【００５１】２．ａ．キトサンへの組込み抗原組込みについては、例えば低分子量（１５０，００
０）キトサン、中分子量（４００，０００）及び高脱ア
セチル化度キトサン、グリコールキトサン、メチルグリ
コールキトサン、Ｐｒｏｔａｓａｎ（登録商標）のよう
な、様々な特性を有しているキトサンの調製が使用され
た。

【００５２】キトサン（ＭＷ７５０ｋＤ，Ｆｌｕｋａ２
２７４２）（０．２％−１％）は０．０２５Ｍ酢酸塩緩
衝液、ｐＨ５．７に溶解された。誘導体化した抗原溶液
は０．０５ＭＮａ₂ＳＯ₄（２．５ｍｌに１０ｍｇ）に溶
解された。

【００５３】各溶液は水槽で５５℃に加熱された。キト
サン溶液（２．５ｍｌ）は誘導体化した抗原溶液（２．
５ｍｌ）に添加されて混合液は２０乃至６０秒間最大速
度で渦動させられた。

【００５４】２．ｂ．アルギン酸塩への組込みＰＢＳ中の抗原−レクチン誘導体（５０ｍｌに１０ｍ
ｇ）はＰＢＳ中の低粘度アルギン酸ナトリウム（Ｆｌｕ
ｋａ７１２３８）（１乃至５％）の定量と添加された。
混合液は３０乃至１２０秒間最大速度で渦動させられ
た。

【００５５】注記：上記の如く調製されたすべての組込
まれた抗原は濾過によって捕集されて少量のＰＢＳ又は
生理的溶液で冷蔵庫に保管されるのがよい。

【００５６】実施例３：多糖類への補助薬ＢＶＶ複合体
の調製３．ａ．コリネバクテリウムｇｒａｎｕｌｏｓｕｍから
ＢＶＶフラクションの調製コリネバクテリウムｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ粒子フラクシ
ョンに対応する、ＢＶＶフラクションは微生物培養から
得られた。培養は３０分間６０℃に加熱することによっ
て不活性化された。室温まで冷やした培養物はバクテリ
ア捕集のため遠心分離にかけられた。バクテリアの塊は
生理的溶液への再懸濁と遠心分離によって洗滌された。
洗滌は何度も繰返されたそしてバクテリアは有機溶媒で
の抽出により脂質が遊離され混合器によって壊された。
壊れていないバクテリアは１０分の低速遠心分離によっ
て取除かれた。浮遊物はバクテリアのかけらを捕集する
ため高速遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分間）に
掛けられた。主に糖タンパク質とペプチドグリカンより
成っている沈渣はＢＶＶと名付けられた粒子フラクショ
ンを表した。

【００５７】３．ｂ．キトサンへのＢＶＶ複合体の調製５０ｍＭＮａ₂ＳＯ₄中で２００乃至２０００μｇ／ｍｌ
の濃度にあるコリネバクテリウムｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ
からの不溶性粒子懸濁液（ＢＶＶ）は、水槽で５５℃ま
で加熱されて２５ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５．７中の同
じ容量の０．２乃至４％キトサン溶液を添加された。混
合液は５５℃まで加熱されて３０乃至１２０秒間最高速
度で渦動された。

【００５８】３．ｃ．アルギン酸塩へのＢＶＶ複合体の
調製ＰＢＳ中のＢＶＶ懸濁液（２００乃至２０００μｇ／ｍ
ｌ）の一量はＰＢＳ中の低粘度アルギン酸ナトリウム
（１乃至５％）の一量に添加された。混合液は３０乃至
１２０秒間最高速度で渦動された。

【００５９】ワクチンと共に投与されたＢＶＶフラクシ
ョンはワクチン誘導抗体反応の増強より成っている免疫
刺激作用をもたらした。投与はワクチンと誘導体化した
ＢＶＶフラクションを適当な比率で組合わせることによ
り行われた。

【００６０】実施例４：本発明のワクチンによる免疫法
及びワクチン効力（生体内の抗体生産）の解析動物がレクチンと誘導体化され且つ前述の多糖類に組込
まれた抗原より成っている本発明のワクチンで処理され
た。

【００６１】４．ａ．ウサギにおいて多糖類複合腸炎菌
抗原に対する予防接種への抗体反応の評価レクチンと抱合して且つキトサン又はアルギン酸塩に組
込まれたサルモネラ抗原より成っているワクチンが試料
と混合されて丸薬にされた。

【００６２】ウサギは実験スキーム（Ａ）に従ってワク
チンを投与された：１．零日目と次の三日間、毎日の常食に分割された誘導
体化されて且つ組込まれたサルモネラ抗原の１ｍｇ／ｋ
ｇ／型の投与；２．２１日目、毎日の常食に分割されたサルモネラ抗原
の０．５ｍｇ／ｋｇの投与；又は、実験スキーム（Ｂ）に従って：１．零日目、ウサギはサルモネラ抗原の１ｍｇ／ｋｇに
対応したワクチンの単一の投与量を皮下注射された；２．７日目、ウサギはサルモネラ抗原の０．５ｍｇ／ｋ
ｇに対応するワクチンの１回の投与量を毎日の常食と混
ぜて投与された；３．１４と２１日目、ウサギは同じ投与量で且つ上述と
同じ手順に従って食物と混ぜた追加免疫を投与された。

【００６３】２０匹の動物が各実験スキームに使用され
た。感作（第一処理）は生命の３０日目に実行された。

【００６４】抗体反応の評価のために、最後の追加免疫
投与から１５日間、血液試料は動物の耳の縁の静脈から
採取された。

【００６５】抗体生産はマイクロプレートに付着してい
るサルモネラ抗原（可溶化したフラクション）との免疫
酵素（ＥＬＩＳＡ）試験により及び酵素に特定の色原体
の添加によって生じる、過酸化酵素と抱合したウサギの
抗免疫グロブリン抗体の添加により結合した免疫グロブ
リンを検出することにより評価された。

【００６６】色強度は抗血清に含まれた抗サルモネラＩ
ｇＧ類の量に直接比例した。

【００６７】比較のために、同じ手順と投薬量に従っ
て、一群の動物はレクチンと誘導体化はしていないがキ
トサンには組込まれた抗原で処理された。表１は二つの
実験的予防接種スキームに従って得られた、異なった血
清希釈度における平均Ｄ．Ｏ．値を示す。

【００６８】

【表１】

【００６９】表１で報告したデータは実施例１（レクチ
ンと誘導体化して且つキトサンに組込まれた）に従って
調製したワクチンが実験的免疫法プロトコルＡ同じく実
験的免疫法プロトコルＢに従って抗体生産を誘導するこ
とを示す。表は又レクチンとは誘導体化していないがキ
トサンには組込まれたワクチンがレクチンと誘導体化し
たワクチンよりは少ない効力であることも示す。

【００７０】４．ｂ．ウサギにおいて多糖類複合単球症
リステリア抗原に対する予防接種への抗体反応の評価レクチンと抱合して且つキトサン又はアルギン酸塩に組
込まれたリステリア抗原より成っているワクチンがウサ
ギにおける抗体反応をテストされた。ウサギは以下の二
つの薬量スキームに従って、食品と混合したワクチンを
経口法により投与された：

【００７１】スキームＡ：１．零日目と次の三日間、リステリア抗原の１ｍｇ／ｋ
ｇ／型(die)に対応する投与量で食品と混合したワクチ
ンの投与；２．２１と２２日目、同じ手順に従って、毎日の常食に
分割されたリステリア抗原の０．５ｍｇ／ｋｇ／型に対
応する投与量の投与。

【００７２】スキームＢ：１．零日目、リステリア抗原の１ｍｇ／ｋｇに対応す
るワクチンの量の皮下注射（感作反応）；２．１、１４と２１日目、毎日の常食に混合して分割
された、リステリア抗原の０．５ｍｇ／ｋｇに対応する
ワクチンの投与量より成っている追加免疫の経口法によ
る投与。

【００７３】２０匹の動物が各薬量スキームに使用され
た。感作（第一処理）は生命の３０日目に実行された。

【００７４】予防接種に対する抗体反応の評価のため
に、最後の追加免疫投与から１５日間、血液試料は動物
の耳の縁の静脈から採取された。

【００７５】抗体反応はマイクロプレートに付着してい
るリステリア抗原（可溶化したフラクション）との免疫
酵素（ＥＬＩＳＡ）試験により及び酵素に特定の色原体
の添加によって生じる、過酸化酵素と抱合したウサギの
抗免疫グロブリン抗体の添加により結合した、試料に含
まれた免疫グロブリンを検出することにより評価され
た。

【００７６】色強度は抗血清に含まれた抗リステリアＩ
ｇＧ類の量に直接比例した。表２は、レクチンと抱合し
且つキトサン又はアルギン酸塩に組込まれた抗原より成
っているワクチンに関する、二つの実験的プロトコルに
従って得られた、異なった血清希釈度における平均Ｄ．
Ｏ．値を示す。

【００７７】

【表２】

【００７８】表２で報告したデータは実施例１（レクチ
ンと誘導体化して且つキトサンに組込まれた）に従って
調製したワクチンが実験的免疫法プロトコルＡ同じく実
験的免疫法プロトコルＢに従って抗体生産を誘導するこ
とを示す。

【００７９】４．ｃ．ニワトリにおける多糖類複合感
染性鼻気管炎（ＩＲＴ）抗原に対する予防接種への抗体
反応の評価レクチンと抱合して且つキトサン又はアルギン酸塩に組
込まれたＩＲＴ抗原より成っているワクチンがニワトリ
における抗体反応をテストされた。ニワトリは以下の二
つの薬量スキームに従って、飲用水に再懸濁されたワク
チンを経口法により投与された：

【００８０】スキームＡ：１．零日目と次の三日間、ＩＲＴ抗原の０．５ｍｇ／
ｋｇ／型に対応する投与量で飲用水に再懸濁したワクチ
ンの投与；２．２１と２２日目、同じ手順に従って、ＩＲＴ抗原の
０．２ｍｇ／ｋｇ／型に対応する投与量の投与。

【００８１】スキームＢ：１．零日目、ＩＲＴ抗原の０．３ｍｇ／ｋｇに対応す
るワクチンの量の皮下注射（感作反応）；２．７、１４と２１日目、毎日の飲み水に分割され
た、ＩＲＴ抗原の０．２ｍｇ／ｋｇに対応する飲用水に
再懸濁された追加免疫の経口法による投与。

【００８２】予防接種に対する抗体反応の評価のため
に、最後の追加免疫投与から１５日間、血液試料は動物
から採取された。

【００８３】２０羽のひよこが各薬量スキームに使用さ
れた。感作（第一処理）は７日齢のひよこに実行され
た。

【００８４】抗体反応はマイクロプレートに付着してい
るＩＲＴ抗原（可溶化したフラクション）との免疫酵素
（ＥＬＩＳＡ）試験により及び酵素に特定の色原体の添
加によって生じる、過酸化酵素と抱合したニワトリの抗
免疫グロブリン抗体の添加により結合した、試料に含ま
れた免疫グロブリンを検出することにより評価された。

【００８５】色強度は抗血清に含まれた特定の抗ＩＲＴ
ＩｇＧ類の量に直接比例した。表３は、レクチンと抱合
し且つキトサン又はアルギン酸塩に組込まれた抗原より
成っているワクチンに関する、実験的プロトコルに従っ
て得られた異なった血清希釈度における平均Ｄ．Ｏ．値
を示す。

【００８６】

【表３】

【００８７】表３で報告したデータは実施例１（レクチ
ンと誘導体化して且つキトサンに組込まれた）に従って
調製したワクチンが実験的免疫法プロトコルＡ同じく実
験的免疫法プロトコルＢに従って抗体生産を誘導するこ
とを示す。

【００８８】４．ｄ．ニワトリにおける多糖類複合呼
吸ウイルスに対する予防接種への抗体反応の評価レクチンと抱合して且つキトサン又はアルギン酸塩に組
込まれたニワトリ呼吸ウイルスより成っているワクチン
が抗体反応をテストされた。ニワトリは以下の二つの薬
量スキームに従って、飲用水中のワクチンを投与され
た：

【００８９】スキームＡ：１．零日目と次の三日間、レクチンと誘導体化して且
つキトサンに組込まれた、呼吸ウイルス抗原の０．５ｍ
ｇ／ｋｇ／型に対応する投与量で飲用水に再懸濁したワ
クチンの投与；２．２１と２２日目、同じ手順に従って、呼吸ウイル
ス抗原の０．２ｍｇ／ｋｇ／型に対応する投与量の投
与。

【００９０】スキームＢ：１．零日目、呼吸ウイルス抗原の０．３ｍｇ／ｋｇに
対応するワクチンの量の皮下注射（感作反応）；２．７、１４と２１日目、毎日の飲み水に分割され
た、呼吸ウイルス抗原の０．２ｍｇ／ｋｇに対応する飲
用水に再懸濁した追加免疫の経口法による投与。

【００９１】予防接種に対する抗体反応の評価のため
に、最後の追加免疫投与から１５日間、血液試料は動物
から採取された。

【００９２】２０羽のひよこが各薬量スキームに使用さ
れた。感作（第一処理）は７日齢のひよこに実行され
た。

【００９３】抗体反応はマイクロプレートに付着してい
る呼吸ウイルス抗原（可溶化したフラクション）との免
疫酵素（ＥＬＩＳＡ）試験により及び酵素に特定の色原
体の添加によって生じる、過酸化酵素と抱合したニワト
リの抗免疫グロブリン抗体の添加により結合した、試料
に含まれた免疫グロブリンを検出することにより評価さ
れた。

【００９４】色強度は抗血清に含まれた特定の抗呼吸ウ
イルスＩｇＧ類の量に直接比例した。表４は、レクチン
と抱合し且つキトサン又はアルギン酸塩に組込まれた抗
原より成っているワクチンに関する、二つの実験的プロ
トコルに従って得られた異なった血清希釈度における平
均Ｄ．Ｏ．値を示す。

【００９５】

【表４】

【００９６】表４で報告したデータは実施例１（レクチ
ンと誘導体化して且つキトサンに組込まれた）に従って
調製したワクチンが実験的免疫法プロトコルＡ同じく実
験的免疫法プロトコルＢに従って抗体生産を誘導するこ
とを示す。

【００９７】４．ｅ．ネズミにおける多糖類複合鵞口瘡
カンジダ抗原に対する予防接種への抗体反応の評価レクチンと抱合して且つキトサン又はアルギン酸塩に組
込まれた鵞口瘡カンジダ抗原より成っているワクチン
（実施例１に従って調製された）がネズミにおける抗体
反応について、以下の二つの薬量スキームに従って、胃
の探針により、同じく投与によってテストされた：

【００９８】スキームＡ：１．零日目と次の日、２％アラビアゴムの懸濁液に、
抗原の０．３ｍｇ／ｋｇの投与量（２回の投与−感作）
で、胃の探針による組込まれたワクチンの投与；２．１４と２１日目、同じ手順に従って、抗原（カン
ジジン）の０．２ｍｇ／ｋｇに対応する、組込まれたワ
クチンの投与量の経口法による投与。

【００９９】スキームＢ：１．零日目、抗原（カンジジン）の０．３ｍｇ／ｋｇ
に対応するワクチンの量の皮下注射；２．１４と２１日目、２％アラビアゴムの懸濁液で、
処理当たり抗原（カンジジン）の０．１ｍｇ／ｋｇに対
応する組込まれたワクチンの投与量より成っている追加
免疫の胃の探針による投与。

【０１００】スキームＣ：動物は各投与毎にキトサンに
組込まれた１ｍｇ／ｋｇＢＶＶと組合わせることにより
スキームＡ（感作と経口追加免疫）に従って予防接種さ
れた。

【０１０１】予防接種に対する抗体反応の評価のため
に、最後の追加免疫投与から１５日間、血液試料は動物
から心臓内穿刺により採取された。

【０１０２】２０匹羽の成体雄ネズミ（２００±１０
ｇ）が各薬量スキームに使用された。

【０１０３】抗体反応はマイクロプレートに付着してい
るカンジジン抗原との免疫酵素（ＥＬＩＳＡ）試験によ
り及び酵素に特定の色原体の添加によって生じる、過酸
化酵素と抱合したネズミの抗免疫グロブリン抗体の添加
により、試料に含まれた免疫グロブリンを検出すること
により評価された。

【０１０４】色強度は抗血清に含まれた特定の抗カンジ
ジンＩｇＧ類の量に直接比例した。

【０１０５】表５は、レクチンと抱合し且つキトサン又
はアルギン酸塩に組込まれた抗原より成っており、又Ｂ
ＶＶ抱合体と連合しているワクチンに関する、三つの実
験的プロトコルに従って得られた、異なる血清希釈度に
おける平均Ｄ．Ｏ．値を示す。比較のために、同じ手順
と投薬量に従って、一群はレクチンと抱合はしていない
がアルギン酸塩には組込まれた抗原で処理された。

【０１０６】

【表５】

【０１０７】表５で報告したデータは実施例１（レクチ
ンと誘導体化して且つキトサンに組込まれた）に従って
調製したワクチンが実験的免疫法プロトコルＡ同じく実
験的免疫法プロトコルＢに従って抗体生産を誘導するこ
とを示す。更に、上のデータはアルギン酸塩には組込ま
れているがレクチンとは抱合していないカンジジンワク
チンの免疫原性（グループＨ）がレクチンと誘導体化し
たカンジジンのそれよりも低いことを示す。

【０１０８】実施例５：生物学的活性物質又はホルモン
類に対するワクチンとの免疫法。生体内での抗体生産及
び／又は生物学的活性として予防接種の効力の解析。生物学的活性物質又はホルモンに対する予防接種の効力
は抗体反応及び生物学的効果によって評価された：例え
ば、ソマトスタチンに対する予防接種は体の成長を増強
する戦略として使用される。事実、抗ソマトスタチン抗
体は前記ホルモンの成長抑制効果を中和させる。前記予
防接種の効力は、予防接種をしない対照と比較して、抗
体の内容から及び成長増強の生物学的効果から評価され
得ると云うことになる。同じ基準に従って、カルシトニ
ンに対する予防接種は骨からのカルシウム吸収を改善す
る戦略として用いられ、グルカゴンに対する予防接種は
内因的なインスリンの解放を外因的に刺激し又は服用後
にその解放を抑制する（フィーバック効果）、コレシス
トキニンに対する予防接種は飽満にその役割を利用する
のに使用され、コレステロールに対する予防接種は人に
は抗動脈硬化症の目的で、又動物技術の分野ではミル
ク、卵、及び肉のような製品のコレステロールの内容を
減らすのに使用される。

【０１０９】５．ａ．１．ソマトスタチン抗原による予
防接種に対する抗体反応の評価成体ネズミ（約２００ｇ）における特定の抗体反応を決
定するワクチンの効力がテストされた。２０匹の動物の
グループの各々が以下の薬量スキームに従って処理され
た：

【０１１０】スキームＡ：１．零日目と次の二日間（全部で３回の処理）、２％
アラビアゴムの懸濁液に抗原（不活性化したソマトスタ
チン）の０．３ｍｇ／ｋｇに対応するワクチンの投与量
の胃の探針による投与；２．１４と２１日目、同じ手順に従って、抗原の０．
２ｍｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅに対応するワクチンの投与量よ
り成っている追加免疫の胃の探針による投与。

【０１１１】スキームＢ：１．零日目、抗原の０．１ｍｇ／ｋｇに対応するワク
チンの量の皮下注射；２．１４と２１日目、２％アラビアゴムの懸濁液で、
抗原の０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅに対応する、組込ま
れたワクチンの投与量より成っている追加免疫の、胃の
探針による投与。

【０１１２】予防接種に対する抗体反応の評価のため
に、最後の追加免疫投与から１５日間、血液試料は心臓
内穿刺によって動物から採取された。

【０１１３】抗体反応はマイクロプレートに付着してい
る蛋白質−ソマトスタチン（ＢＳＡ−ソマトスタチン）
抱合体との免疫酵素（ＥＬＩＳＡ）試験により及び酵素
に特定の色原体の添加によって生じる、過酸化酵素と抱
合したネズミの抗免疫グロブリン抗体の添加により、血
清に含まれた特定の抗ソマトスタチン免疫グロブリンを
検出することにより評価された。

【０１１４】色強度は試料に含まれた特定の抗ソマトス
タチンＩｇＧ類の量に直接比例した、又それ故に予防接
種により誘導された。表６は二つの実験的プロトコルに
従って得られた、異なった血清希釈度における平均Ｄ．
Ｏ．値を示す。

【０１１５】

【表６】

【０１１６】表６で報告したデータは実施例１（レクチ
ンと誘導体化して且つキトサンに組込まれた）に従って
調製したワクチンが実験的免疫法プロトコルＡ同じく実
験的免疫法プロトコルＢに従って抗体生産を誘導するこ
とを示す。

【０１１７】５．ａ．２．体の成長に関してソマトス
タチン抗原による予防接種の生物学的効果の評価体の成長速度と大きさに関して活性抗ソマトスタチンの
予防接種の影響が、１０匹の動物のグループを細分し
て、ネズミ（８０ｇ）に関して評価された。

【０１１８】グループは以下の処理を受けさせられた：グループ１：対照、予防接種なし。

【０１１９】グループ２：以下の実験プロトコル（薬
量スキームＡ）に従って抗ソマトスタチンワクチンで処
理した： −零日目、２％アラビアゴムの１ｍｌに懸濁した、不活
性ソマトスタチン抗原の０．８ｍｇ／ｋｇに対応するキ
トサンに組込まれたワクチンの投与量の胃の探針による
投与； −１４と２１日目、２％アラビアゴムの１ｍｌに、不活
性ソマトスタチン抗原の０．１ｍｇ／ｋｇに対応する、
キトサンに組込まれたワクチンの投与量より成っている
追加免疫の胃の探針による投与。

【０１２０】グループ３：以下の実験プロトコル（薬量
スキームＢ）に従って抗ソマトスタチンワクチンで処理
した： −キトサンに組込まれた抗ソマトスタチンワクチンで感
作、不活性ソマトスタチン抗原の０．１ｍｇ／ｋｇに対
応する投与量を皮下の非経口法により投与した。 −１４と２１日目、２％アラビアゴムの１ｍｌに、不活
性ソマトスタチン抗原の０．３ｍｇ／ｋｇに対応する抗
ソマトスタチンワクチンの投与量より成っている追加免
疫の胃の探針による投与。

【０１２１】グループ４：グループ２に採用したのと同
じ薬量スキーム（薬量スキームＡ）に従って、但しアル
ギン酸塩に組込まれたワクチンで処理した。

【０１２２】グループ５：グループ３に採用したのと同
じ薬量スキーム（薬量スキームＢ）に従って、但しアル
ギン酸塩に組込まれたワクチンで処理した。

【０１２３】全テストの間、動物たちは自由に食物や飲
用水に接近した、後者にはＬ−アルギニンとＤＬ−アス
パラギン酸が添加してあった。この方法で、ネズミたち
は毎日各アミノ酸の２５ｍｇ／ｋｇを受取った（アミノ
酸は成長ホルモンの外因性活性剤として投与された）。

【０１２４】各ネズミの体重はテストの始まりと７日毎
に管理された；ネズミの一般状態は毎日管理された。表
７はソマトスタチンに対する予防接種をしたグループの
時間に伴う体重変動を対照と比較した平均パーセントを
示す。

【０１２５】

【表７】

【０１２６】表７に示されたデータはソマトスタチンに
対する活性予防接種がフィードバックによって作られる
抑制因子の内因性部分の中性化に起因する成長ホルモン
の活性化を、外因性食事により可能とすることを証明す
る。従って、予防接種をしなかった対照との比較におい
て、成長は実質上大いに高められる。

【０１２７】５．ｂ．レクチンと活性化して且つキトサ
ン又はアルギン酸塩に組込まれたカルシトニン抗原に対
する予防接種の反応の評価。抗体反応の評価成体ネズミ（２００ｇ）における特定の反応を決定する
ワクチンの効力がテストされた。２０匹の動物のグルー
プは各々以下の薬量スキームに従って処理された：

【０１２８】グループＣ、スキームＡ：キトサン中の抗
カルシトニンワクチンが前記実施例のスキームＡと同じ
手順と投与量に従って投与された。

【０１２９】グループＤ、スキームＢ：キトサン中の抗
カルシトニンワクチンが前記実施例のスキームＢと同じ
手順と投与量に従って投与された。

【０１３０】グループＥ、スキームＡ：アルギン酸塩中
の抗カルシトニンワクチンが前記実施例のスキームＡと
同じ手順と投与量に従って投与された。

【０１３１】グループＦ、スキームＢ：アルギン酸塩中
の抗カルシトニンワクチンが前記実施例のスキームＢと
同じ手順と投与量に従って投与された。

【０１３２】更なるグループ（Ｂ）は対照として使用さ
れどんな処理も受けなかった。

【０１３３】予防接種に対する抗体反応の評価のため
に、最後の追加免疫投与から１５日間、血液試料は心臓
内穿刺によって動物から採取された。

【０１３４】抗体反応はマイクロプレートに付着してい
る、レクチンとの抱合について記述した方式通りに調製
された、蛋白質−カルシトニン（カルシトニン−ＫＬ
Ｈ）抱合体との免疫酵素（ＥＬＩＳＡ）試験により及び
酵素に特定の色原体の添加によって生じる、過酸化酵素
と抱合したネズミの抗免疫グロブリン抗体の添加により
血清（試料）に含まれた特定の抗カルシトニン免疫グロ
ブリンを検出することにより評価された。

【０１３５】色強度は試料に含まれた特定の抗カルシト
ニンＩｇＧ類の量に直接比例した。表８は二つの実験的
プロトコルに従って得られた、異なった血清希釈度にお
ける平均Ｄ．Ｏ．値を示す。

【０１３６】

【表８】

【０１３７】表８で報告したデータは実施例１（レクチ
ンと誘導体化して且つキトサンに組込まれた）に従って
調製したワクチンが実験的免疫法プロトコルＡ同じく実
験的免疫法プロトコルＢに従って抗体生産を誘導するこ
とを示す。

【０１３８】５．ｃ．レクチンと誘導体化して且つキ
トサン又はアルギン酸塩にに組込まれたグルカゴン抗原
に対する予防接種効果の評価。抗体反応の評価成体ネズミ（約２００ｇ）における特定の反応を決定す
るワクチンの効力がテストされた。２０匹の動物のグル
ープの各々が以下の薬量スキームに従って処理された：

【０１３９】グループＢ：対照：予防接種なし。

【０１４０】グループＣ：動物たちはもくろんでいる薬
量スキームＡ）に従って抗グルカゴン予防接種の処理を
受けた：１．零日目と翌日の投与、アラビアゴムの２％懸濁液
中で、抗原（感作）の０．３ｍｇ／ｋｇの投与量でキト
サンに組込まれたワクチン、胃の探針による；２．１４と２１日目、同じ手順に従って、抗原（不活
性化したグルカゴン−追加免疫）の０．２ｍｇ／ｋｇに
対応する、キトサンに組込まれたワクチンより成ってい
る追加免疫の経口法による投与。

【０１４１】グループＤ：動物たちはもくろんでいる薬
量スキームＢ）に従って抗グルカゴン予防接種の処理を
受けた：１．零日目、抗原（不活性化したグルカゴン−感作）
の０．１ｍｇ／ｋｇに対応した、キトサンに組込まれた
抗グルカゴンワクチンの或量の皮下注射；２．１４と２１日目、２％アラビアゴムの懸濁液中
で、抗原（不活性化したグルカゴン−追加免疫）の０．
３ｍｇ／ｋｇに対応する、キトサンに組込まれた抗グル
カゴンワクチンの投与量より成っている追加免疫の胃の
探針による投与。

【０１４２】グループＥ：動物たちは薬量スキームＡ）
に従ってアルギン酸塩に組込まれたワクチンで抗グルカ
ゴン予防接種を受けた。

【０１４３】グループＦ：動物たちは薬量スキームＢ）
に従ってアルギン酸塩に組込まれたワクチンで抗グルカ
ゴン予防接種の処理を受けた。

【０１４４】予防接種に対する抗体反応の評価のため
に、最後の追加免疫投与から１５日間、血液試料は心臓
内穿刺によって動物から採取されそして血清収集のため
遠心分離（３０００ｒｐｍ，１５分間）にかけられた。

【０１４５】抗体反応はマイクロプレートに付着してい
る、抗原（前述の抱合方式通りに調製され且つレクチン
不在のグルカゴン−ＫＬＨ）との免疫酵素（ＥＬＩＳ
Ａ）試験により及び酵素に特定の色原体の添加によって
生じる、過酸化酵素と抱合したネズミの抗免疫グロブリ
ン抗体の添加により試料に含まれた特定の抗グルカゴン
免疫グロブリンを検出することにより評価された。

【０１４６】マイクロプレート（グルカゴン抗原−ＫＬ
Ｈ付着）は０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５中１０μ
ｇ／ｍｌの濃度で抗原溶液（１２５μｌ／ｗｅｌｌ）を
各ｗｅｌｌに添加することにより調製された又それを３
７℃恒温槽で３時間ｗｅｌｌと接触させた。

【０１４７】付着しなかった余分な抗原を除去するため
繰返し洗滌が行われた、ｗｅｌｌの表面は０．０５Ｍ燐
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４中の２％カゼ
イン溶液の２００μｌ／ｗｅｌｌを各ｗｅｌｌに添加す
ることにより飽和させられた；飽和は三回の洗滌により
カゼインを除去するために３７℃恒温槽で２時間行われ
た。

【０１４８】試験に供される抗血清（サンプル）は、ｐ
Ｈ７．４の０．１Ｍリン酸塩緩衝食塩液(phosphate-sal
ine buffer)（ＰＢＳ）用いて異なるレベルに希釈され
た。異なる血清希釈液（１００μＬ）は、ウェル(well
s)に添加され、３７℃で１時間それとの接触が保たれ
た。付着しない物質は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含
有し、ｐＨ７．４で０．０１Ｍ−ＰＢＳからなる洗浄液
で洗浄することによって除去された。

【０１４９】検出のため、各々のウェルには、ラット抗
ＩｇＧ抱合体(conjugate)（１００μＬ／ウェル）が添
加された。ＨＲＰ（ＳｉｇｍａＡ９５４２）は、０．
１％（ｐ／ｒ）カゼインを含有し、ｐＨ７．４の０．１
Ｍ−ＰＢＳを用いて製造業者により指示された濃度に希
釈された。抗ＩｇＧＨＲＰ抱合体は、３７℃で１時間
ウェルとの接触が保たれた。

【０１５０】前述の洗浄液による３回の洗浄が行われた
時点で、ｐＨ５．５の０．１Ｍ−クエン酸塩／リン酸塩
緩衝液中で製造業者の指示により調製された１００・Ｌ
ＯＰＤ（過酸化尿素）（ＳｉｇｍａＰ６６６２）が
各々のウェルに添加され、３７℃の温度自動調節装置中
で３０分間培養された。

【０１５１】反応は、各々のウェルに１Ｍ−Ｈ₂ＳＯ
₄（５０μＬ）を添加することにより停止された。

【０１５２】読みは、４９０ｎｍで行った。

【０１５３】着色強度は、サンプル（血清）中に含まれ
る特異性抗グルカゴンＩｇＧｓの量に直接比例した。

【０１５４】表９は、２つの実験的プロトコル(protoco
ls)に従って、レクチンでの抱合(conjugation)、次いで
キトサンまたはアルギン酸塩中での抱合取り込み(conju
gated incorporation)によって調製された抗グルカゴン
ワクチンにより得られた、異なる血清希釈液における平
均Ｄ．Ｏ．値を示す。

【０１５５】

【表９】

【０１５６】表９に報告されたデータは、本発明の抗原
（レクチンで誘導体化され、次いで多糖類中に結合され
る）が、実験的免疫法プロトコルＢの他に実験的免疫法
プロトコルＡに従って抗体の生産を引き起こすことを示
す。

【０１５７】５．ｄ．レクチンで誘導体化され、次いで
キトサンまたはアルギン酸塩中に結合されるコレシスト
キニン抗原に対するワクチン接種の効果の評価。抗体反
応の評価。

【０１５８】成体ラット（約２００ｇ）における特異性
抗体反応を決定するワクチン効力が試験された。２０匹
の動物からなる各々のグループは、以下の薬量学的機構
に従って処置された。グループＢ，コントロール：ワクチン接種なしグループＣ，薬量スキームＡに従ってキトサン中に結合
されたワクチンを用いた抗コレシストキニンワクチンの
動物への接種（抗グルカゴンワクチンレクチンを用いた
ワクチン接種のスキームＡに従う、前記５ｃに記載）：グループＤ，薬量スキームＡに従ってキトサン中に結合
されたワクチンを用いた抗コレシストキニンワクチンの
動物への接種（抗グルカゴンワクチンレクチンを用いた
ワクチン接種のスキームＢに従う、記載場所５ｃ）：グループＥ，薬量スキームＡに従ってアルギン酸塩中に
結合されたワクチンを用いた抗コレシストキニンワクチ
ンの動物への接種：グループＦ，薬量スキームＢに従ってアルギン酸塩中に
結合されたワクチンを用いた抗コレシストキニンワクチ
ンの動物への接種：グループＧ，レクチンには抱合されていないが、キトサ
ン中には結合されたワクチンを用いた抗コレシストキニ
ンワクチンの動物への接種（薬量スキームＡ）：

【０１５９】ワクチン接種に対する抗体反応を評価する
ために、最後のブースター(booster)投与から１５日後
に、動物から血液サンプルを採取し、上記血清コレクシ
ョンの試験に従って試験した。

【０１６０】抗体反応は、既に述べたレクチン添加なし
の合成スキームに従って得られたコレシストキニン−Ｋ
ＬＨ抗原を付着させたマイクロプレート(microplates)
を用いて、実施例４）に記載された方法に従ってＥＬＩ
ＳＡ試験により評価した。

【０１６１】試験の実行、読み取りの他、ミクロプレー
ト、抱合、色原体(chromogen)／基質及びサンプル調製
の方法については、抗グルカゴンワクチン接種で述べた
通りである。

【０１６２】着色強度は、サンプル（血清）中に含まれ
る特異性抗コレシストキニンＩｇＧｓの量に直接比例し
た。

【０１６３】表１０は、２つの実験的プロトコルに従っ
て、レクチンでの抱合(conjugation)、次いでキトサン
またはアルギン酸塩中の抱合取り込み(conjugated inco
rporation)によって調製された抗コレシストキニンワク
チンにより得られた、異なる血清希釈液における平均
Ｄ．Ｏ．値を示す。

【０１６４】

【表１０】

【０１６５】表１０において報告されているデータから
明らかなことは、（レクチンで誘導体化され、また、キ
トサン(chitosan)中に取り込まれた）抗原により、実験
免疫化プロトコルＢ(experimental immunisation proto
col B)と同様に実験免疫化プロトコルＡに従って抗体生
産が誘発されることである。更に、前記データから明ら
かなことは、アルギン酸塩に取り込まれているにもかか
わらず、（グループＧの）レクチンで抱合されるに至っ
ていない(not conjugated)抗コレシストキニンワクチン
の免疫抗原性が、レクチンで誘導体化されたカンジジン
(candidin)の免疫抗原性よりもずっと低いことである。

【０１６６】５．ｅ．レクチンで誘導体化され、か
つ、キトサンまたはアルギン酸塩中に取り込まれている
コレステロール抗原に対するワクチン接種効果の評価

【０１６７】５．ｅ．１．抗体反応の評価成体ラット(adult rat)（約２００ｇ）における特定の
抗体反応を定量測定するためにワクチン効力を試験し
た。各グループ共２０匹の動物からなり、以下の薬量ス
キーム(posologic schemes)に従って処置した。

【０１６８】グループＢ、対照動物：ワクチン接種なしグループＣ：抗コレステロールワクチンを用いて処置し
た動物。キトサン中に取り込まれたワクチンは、薬量ス
キームＡ（抗グルカゴンワクチン接種のスキームＡ、ポ
イント５ｃ）と同様な手続および投薬量に従って投与し
た。グループＤ：抗コレステロールワクチンを用いて処置し
た動物。そのワクチンは、薬量スキームＢ（抗グルカゴ
ンワクチン接種のスキームＢ、ポイント５ｃ）と同様な
手続および投薬量に従って投与した。グループＥ：抗コレステロールワクチンを用いて処置し
た動物。そのワクチンは、薬量スキームＢ（抗グルカゴ
ンワクチン接種のスキームＢ、ポイント５ｃ）と同様な
手続および投薬量に従って投与した。グループＦ：抗コレステロールワクチンを用いて処置し
た動物。そのワクチンは、薬量スキームＢ（抗グルカゴ
ンワクチン接種のスキームＢ、ポイント５ｃ）と同様な
手続および投薬量に従って投与した。グループＧ：薬量スキームＡに従って、キトサン中のＢ
ＶＶと連携して、補助薬として、１ｍｇ／ｋｇ／用量の
割合で、キトサン中に取り込まれた抗コレステロールワ
クチンを用いて処置した動物。

【０１６９】抗体反応を評価するために、最後のブース
ター用量(booster dose)から１５日後、血液サンプルを
その動物から採取し、前記血清採集用標本と同様に処置
した。抗体反応は、そのものに付着しているコレステロ
ール−ＫＬＨ抗原付きのマイクロプレート(microplate
s)を用いて、ポイント５ｃの下で記述された手続と同様
にしてＥＬＩＳＡ試験により評価した。その抗原は前述
した合成スキームに従って得られている。

【０１７０】マイクロプレート、抱合体(conjugate)、
色原体／基質、およびサンプル調製の方法は、試験パフ
ォーマンス(test performance)の方法および結果の読み
取り方法と同様に、抗グルカゴンワクチン接種用に記述
されている。

【０１７１】表１１には、２種類の実験プロトコルにつ
いて、抗コレステロールワクチンを用いて得られた、血
清の希釈溶液ごとに平均Ｄ．Ｏ．値が示されている。そ
の溶液は、レクチンと共役させて調製し、続いてキトサ
ンまたはアルギン酸塩中において共役取り込みする。

【０１７２】

【表１１】

【０１７３】表１１において報告されているデータから
明らかなことは、（レクチンを用いて誘導体化され、ま
た多糖類中に取り込まれている）コレステロール抗原に
より、実験免疫化プロトコルＢと同様に実験免疫化プロ
トコルＡに従って抗体生産が誘発されることである。

【０１７４】５．ｅ．２．本発明に従った、抗コレス
テロールワクチンの生物学的効果の評価実験はオスのウイスターラット(Wistar rats)１００±
１０ｇについて行った。各グループについて１０単位ず
つに小区分された。前記ラットには以下の処置が加えら
れた。

【０１７５】グループ１、対照ラット：ワクチン接種な
し。ラットにラット用標準食事が全試験期間中供給され
た。グループ２：高コレステロール血症対照：ワクチン接種
なし。ラットにラット用標準食事が第１日から第３０日
まで供給された。また、コレステロールに富んだ、高脂
質食事(脂肪組成物の１０％)が第３１日から供給され
た。

【０１７６】グループ３：薬量スキームＡ（スキームＡ
は抗グルカゴンワクチン接種、５ｃ単位）に基づいて、
ラットには、キトサン中の抗コレステロールワクチンの
接種をゼロ時には口腔より、次に１４日及び２１日には
ブースター投与を口腔より行い感作に関する免疫を考察
した。ラットにはゼロ時から３０日は標準食を、３１日
以降は高コレステロール高脂肪食（３０％脂肪構成）を
与えた。

【０１７７】グループ４：薬量スキームＢ（スキームＢ
は抗グルカゴンワクチン接種、５ｃ単位）に基づいて、
ラットにはキトサン中の抗コレステロールワクチンの接
種をゼロ時には注射より、また、１４日及び２１日には
経口経由のブースター投与により、感作に関する免疫を
考察した。ラットには０時から３０日は標準食を、３１
日以降は高コレステロール高脂肪食（３０％脂肪構成）
を与えた。

【０１７８】グループ５：薬量スキームＢに基づいて、
ラットにはキトサン中の抗コレステロールワクチンの接
種を、０時には注射より、また、１４日及び２１日には
経口経由のブースター投与により、関する免疫を考察し
た（グループ４と同じスキーム）。

【０１７９】ラットには０時からは高コレステロール高
脂肪食（３０％脂肪構成）与えた。この実験は、アルギ
ン酸塩中に取り込まれた対応ワクチンに関しては行わな
かった。２つの取り込み形式の分析において見出された
抗体反応は一致しなかった。

【０１８０】０時から４５日，６０日及び９０日経過し
た（グループ２，３及び４は脂肪食開始から１５日，３
０日及び６０日）ラットの心臓内に穿刺し血液サンプル
を採取し、血清を分離してコレステロールレベルを測定
するため遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間）した。
前記測定は酵素の比色定量方法により実施した（キッド
シグマｃｏｄ．３５２−８０）。

【０１８１】表１２に、（標準食の濃度を１００と見な
して）標準食を供給した対照と比べて血清中の総コレス
テロール濃度変化パーセントを比較評価したのを示す。

【０１８２】

【表１２】

【０１８３】表１２の高脂肪食を与えたラットの脂質蓄
積において抗コレステロールワクチン接種の生物学的な
効果の結果より；特に、コレステロールに対する活性ワ
クチン接種により、高コレステロールの脂肪食を与えた
ラットの血中脂質レベルを標準以下に維持することがで
きることを示している。

【０１８４】５．ｆ．レクチンで誘導体化され、また
キトサン又はアルギン酸塩中に取り込まれたコカイン抗
原に対するワクチン接種効果の評価

【０１８５】５．ｆ．１．抗体反応の評価成体ラット（およそ２００ｇ）の抗体反応を測定するた
めのワクチン効力を試験した。ラット２０匹のグループ
を次の様に薬量スキームに基づいてそれぞれ処置した。

【０１８６】グループＢ，対照：ワクチン接種なしグループＣ：薬量スキームＡ（スキームＡは抗グルカゴ
ンワクチン接種、５ｃ単位）に基づきキトサン中の抗コ
カインワクチンで処置した動物。グループＤ：薬量スキームＢ（スキームＢは抗グルカゴ
ンワクチン接種、５ｃ単位）に基づきキトサン中の抗コ
カインワクチンで処置した動物。グループＥ：グループＣと同じ処置を受けたが、アルギ
ン酸塩中のワクチンで処置した動物。グループＦ：グループＢと同じ処理を受けたが、アルギ
ン酸塩中のワクチンで処置した動物。

【０１８７】前述したのと同じ方法により、最後のブー
スターから１５日経過してから、血清採集用動物から血
液サンプルを取った。抗体反応は、ＥＬＩＳＡ法で評価
した。その方法は、前記したとおり、また、コカイン抗
原付きのマイクロプレートウエル(microplate wells)
を用いて行うものであり、Ｏ．Ｂａｇａｓｒａ（Ｉｍｍ
ｕｎｏｐｈａｒｍａｃｈｏｌｏｇｙ，１９９２，２３，
１７３）により以前に記述されたものである。

【０１８８】表１３に、前述のレクチンで抱合して調製
され、次にキトサン又はアルギン酸塩中に合体抱合させ
た、抗コカインワクチンを用いて、２つの実験プロトコ
ルについて得られた、種々の希釈血清の平均Ｄ．Ｏ．値
を示す。

【０１８９】

【表１３】

【０１９０】表１３の実験レポートより、免疫実験プロ
トコルＢのみらならず免疫実験プロトコルAにおいても
（レクチンで誘導体化され及びキトサン中に取り込まれ
た）コカイン抗原は抗体生産を誘発する。

【０１９１】５.ｆ.２. 抗コカインワクチンの生物学
的効果の評価ラットにおける麻酔反応がオー．バガスラ等（免疫薬理
学1992，23，173）に従うホットプレートテストによっ
て評価された。スイス雄ハツカネズミ（２０ｇ）がそれ
ぞれ２０匹のネズミの群に分けられ以下のとおり処理さ
れた：グループ１：対照、処理なし；グループ２：ポロソジィックスキームＡ（抗グルカゴ
ンワクチン接種、ポイント５Ｃ）に従ってキトサンに配
合された誘導抗コカインワクチンによるワクチン接種さ
れたネズミ；グループ３：スキームＢ（抗グルカゴンワクチン接種、
ポイント５Ｃ）に従ってキトサン中に配合された抗コカ
インワクチンによってワクチン接種されたネズミ；グループ４：グループ２と同じ処理をうけ、しかしアル
ギネート中に配合されたワクチンを用いたネズミ；グループ５：グループ３と同じ処理をうけ、しかしアル
ギネート中に配合されたワクチンを用いたネズミ。

【０１９２】タイムゼロから３６日間（最初のワクチン
投与−感作）、即ち最後のブースターから１５日、ネズ
ミは腹腔内投入方法により、生理的溶液中の２５mg／kg
コカインが投与された。１時間後、ネズミは５５℃ に
安定した状態のプレート上に置かれ、熱的刺激までの動
物反応時間（秒）がコントロールされた。表１４にコカ
インのみ投与された対照物と比較したパーセント反応変
動が示されている。

【０１９３】

【表１４】

【０１９４】表１４の結果は、コカインに対する活性な
ワクチン接種が特定の抗コカイン抗体の製造のおかげ
で、その麻酔作用に著しく拮抗することができそしてそ
の薬理的活性に拮抗することを示す。

【０１９５】５.ｇ. ポア・プラテンシス・アレルギー
（Poa pratensis allergies）に対するワクチン効能評価は、診断テストから、回帰性臨床症状発現（鼻炎）
の必然的実証発生を伴うポア・プラテンシスへの明らか
なアレルギーを示した、大人のボランティアについて行
なわれた。

【０１９６】サンプルは無作為に１０グループに分けら
れ次の処理に付された：グループ１：対照、処理なし；グループ２：次の薬量スキームに従って、レクチンと共
役しかつキトサン中に配合された抗ポアプラテンシスワ
クチンを２ｍｇワクチン分量の濃度で経口処理された：
Ｎｏ．７投与、１月〜２月の間５日毎に１度＋Ｎｏ．７
投与、８月〜９月の間５日毎に１度。グループ３：グループ２と同じく処理された、但しキト
サン中に配合された０．５ｍｇＢＶＶ免疫調整剤と混合
されたワクチン投与量を用いる。ワクチン接種のスター
トから次の１８ヶ月の間アレルギー臨床的症状発現の回
数が適当なフォーム上の同じ対象物によって報告された
データに基づいてチェックされた。

【０１９７】表１５は、対照物に発生するエピソードと
比較してワクチン接種の対象物の臨床的エピソードにお
けるパーセント減少率を示す（前者は１００に等しいと
思われる）。

【０１９８】

【表１５】

【０１９９】表１５のデータは、キトサン中に配合され
た誘導ポア・プラテンシス抗原による免疫のおかげで、
対照と比較して、処理された被験物における臨床的症状
の発現数が著しく減少することを示す。

【０２００】

【発明の効果】本発明によれば、レクチンで誘導体化さ
れ、多糖類で被覆された抗原から構成されるワクチンが
提供される。このワクチンにより臨床的症状の発現が抑
制される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/112 Ａ６１Ｋ 39/112 39/12 39/12 39/145 39/145 39/20 39/20 39/245 39/245 39/25 39/25 39/35 39/35 39/39 39/39 47/36 47/36 47/48 47/48 Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/04 3/02 3/02 3/04 3/04 3/06 3/06 15/00 15/00 19/10 19/10 31/04 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 33/00 33/00 37/08 37/08 39/00 39/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 ＣＥ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:15 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者イヴォヴォルパトイタリア国、06070 サンマリアノ、ヴィアカルロカッタネオ、22 Ｆターム(参考） 4B065 AA24X CA45 4C076 AA12 BB01 BB02 BB21 BB22 BB25 BB29 BB30 CC03 CC09 CC16 CC17 CC21 CC31 CC34 CC35 EE30 EE36 EE41 EE59 FF67 FF68 4C085 AA03 BA01 BA02 BA07 BA08 BA12 BA20 BA24 BA49 BA51 BA55 BA63 BA78 BA79 BA80 BA82 BA83 BB03 BB06 BB11 BB22 BB50 CC07 CC08 CC21 CC33 EE01 EE06 FF19 FF21 GG08 GG10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】医薬品用途のためのレクチンで誘導体化
された多糖類被覆済み抗原から成るワクチン。
【請求項２】前記多糖類が、キトサン；高度に脱アセ
チル化された低分子量キトサン；メチルグリコールキト
サン；アルギン酸；ポリマンヌロン酸；並びにそれらの
塩又は誘導体；から成る群から選ばれる、請求項１記載
のワクチン。
【請求項３】前記多糖類が化学的には架橋されていな
い、請求項２記載のワクチン。
【請求項４】該レクチンで誘導体化された抗原と該被
覆性多糖類とが、非共有結合によって結合されている、
請求項１記載のワクチン。
【請求項５】前記非共有結合がイオン結合である、請
求項４記載のワクチン。
【請求項６】前記抗原が、微生物；病原菌又はそれら
の構成物質；ホルモン；酵素及びプロ酵素；麻酔剤；生
理活性ペプチド；代謝物；生理的前駆体；細胞構成物
質；アレルゲンから成る群から選ばれる、請求項４記載
のワクチン。
【請求項７】前記病原菌が、ヘルペス単体ウイルス；
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；水痘ウイルス；風疹
ウイルス；シンシチウムウイルス；呼吸器ウイルス；イ
ンフルエンザウイルス；エプスタイン−バー・ウイル
ス；リステリア菌；腸炎菌；チフス菌；パラチフス菌；
ねずみチフス菌；ブタコレラ菌；破傷風菌；ボツリヌス
菌；フレクスナー赤痢菌；カンジダ・アルビカンス；ゴ
ンディ・トキソプラズマ；又はそれらの抗原成分から成
る群から選ばれる、請求項６記載のワクチン。
【請求項８】前記麻酔剤が、コカイン；ヘロイン；リ
ゼルギン酸（ＬＳＤ）；又はそれらの誘導体から成る群
から選ばれる、請求項６記載のワクチン。
【請求項９】前記ホルモンが、絨毛性性腺刺激ホルモ
ン；パラソルモン；グルカゴン；甲状腺ホルモンから成
る群から選ばれる、請求項６記載のワクチン。
【請求項１０】前記生理活性ペプチドが、ソマトスタ
チン、コレシストキニン、カルシトニンである、請求項
６記載のワクチン。
【請求項１１】前記構成物質がコレステロールであ
る、請求項６記載のワクチン。
【請求項１２】前記アレルゲンが、ポア・プラテンシ
ス(Poa pratensis)である、請求項６記載のワクチン。
【請求項１３】前記レクチンが植物由来の蛋白質であ
る、請求項１記載のワクチン。
【請求項１４】前記レクチンが、レンズマメ、ダイ
ズ、ウレックス・ヨーロッパエウス(Ulex Europaeus)
（ＵＥＡ I ＋ＵＥＡ II）、ナンキンマメ、インゲン
マメ、大豆レクチンから選ばれる、請求項１３記載のワ
クチン。
【請求項１５】前記レクチンが、抗原で化学的に誘導
体化されている、請求項１３記載のワクチン。
【請求項１６】前記レクチンが、アルデヒド基とアミ
ノ基の間の反応によって、抗原で化学的に誘導体化され
ている、請求項１５記載のワクチン。
【請求項１７】経口投与及び経粘膜投与を行うため
の、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１８】前記経粘膜投与が、口、舌下(perling
ual)、直腸、膣、または鼻を経由する方法である、請求
項１７記載のワクチン。
【請求項１９】麻酔薬過量症候群を処置するための薬
剤を調製するに際し、請求項６〜８のいずれか１項に記
載のワクチンを使用する方法。
【請求項２０】成長関連異常を予防し処置するための
薬剤；骨粗鬆症、潰瘍、高コレステロール血症、肥満
症、不妊症、リポイド症、アレルギーを処置するための
薬剤；を調製するに際し、請求項６、９、１０、１１の
いずれか１項に記載のワクチンを使用する方法。
【請求項２１】細菌性感染症、ウイルス性感染症、真
菌性感染症及び寄生虫感染症を予防し処置するに際し、
請求項６又は７に記載のワクチンを使用する方法。
【請求項２２】固体及び液体の栄養剤を調製するに際
し、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のワクチンを
使用する方法。
【請求項２３】ヒト及び畜産技術用途のために、請求
項２２に記載のワクチンを使用する方法。
【請求項２４】アジュバントとして使用するための、
多糖類の中に組み入れられた脱脂質済みコリネバクテリ
ウム・グラニュロジュウム（ＢＶＶ）フラクション。
【請求項２５】前記多糖類が、キトサン；高度に脱ア
セチル化された低分子量キトサン；メチルグリコールキ
トサン；アルギン酸；ポリマンヌロン酸；並びにそれら
の塩又は誘導体から成る群から選ばれる、請求項２４に
記載の脱脂質済みコリネバクテリウム・グラニュロジュ
ウム（ＢＶＶ）フラクション。
【請求項２６】前記多糖類が化学的には架橋されてい
ない、請求項２５に記載の脱脂質済みコリネバクテリウ
ム・グラニュロジュウム（ＢＶＶ）フラクション。
【請求項２７】経口及び経粘膜で使用するための、請
求項２４〜２６のいずれか１項に記載の脱脂質済みコリ
ネバクテリウム・グラニュロジュウム（ＢＶＶ）フラク
ション。
【請求項２８】適切なアジュバント及び／又は賦形剤
と共に、活性成分として、請求項１〜１６のいずれか１
項に記載のワクチンを含有する組成物。
【請求項２９】経口及び／又は経粘膜で使用するため
の、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】前記アジュバントが、請求項２４〜２
７のいずれか１項に記載の脱脂質済みコリネバクテリウ
ム・グラニュロジュウム（ＢＶＶ）フラクションであ
る、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】請求項１〜１６のいずれか１項に記載
のワクチンを調製するための方法。
【請求項３２】請求項２４〜２７のいずれか１項に記
載の脱脂質済みコリネバクテリウム・グラニュロジュウ
ム（ＢＶＶ）フラクションを調製するための方法。