JP2002293749A - Ｄ−アスパラギン酸含有蛋白質分解酵素の阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 Ｄ−アスパラギン酸含有蛋白質分解酵素、
特にＤ−アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（ＤＡＥ
Ｐ）の阻害剤に関する。既存の阻害剤はプロテアソーム
阻害剤として知られるラクタシスチンだけであったが、
感度が悪く、またプロテアソームにも作用してしまうこ
とが欠点であった。 【解決手段】 本阻害剤ｉ−ＤＡＥＰは、ＤＡＥＰが
Ｄ−Ａｓｐを含む基質を特異的に分解することに着眼
し、その類似体がＤＡＥＰの活性中心をふさぐことによ
ってＤＡＥＰ活性を阻害する化合物を設計することによ
り、ｉ−ＤＡＥＰを得ることができた。Ｄ−Ａｓｐ−Ｃ
Ｈ_２Ｃｌ又はその誘導体を含むアミノ酸配列から成るＤ
−アスパラギン酸含有蛋白質分解酵素の阻害剤であり、
ベンゾイル−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃ
ｌ、ビオチニル−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２
Ｃｌ又はビオチニル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ-Ｄ−Ａｓｐ−Ｃ
Ｈ_２Ｃｌから成ることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、Ｄ−アスパラギ
ン酸含有蛋白質分解酵素、特にＤ−アスパラギン酸エン
ドペプチダーゼ（以下、ＤＡＥＰという。）の阻害剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類の組織、体液などを構成する蛋白
質は、従来Ｌ型のアミノ酸だけからなると考えられてい
た。しかしながら、近年になって、Ｄ型のアミノ酸を含
有する蛋白質が発見され、それらは病態との関係が指摘
されている。例えば、αＡ−クリスタリンでは、１５１
残基目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が、Ｌ体からＤ体に
ラセミ化したものが報告されており、白内障との関係が
指摘されている。また、動脈の構造蛋白質であるエラス
チンやコラーゲンでもＤ−Ａｓｐの蓄積が指摘されてお
り、動脈硬化の原因の一つではないか、と言われてい
る。これらは、いずれも比較的代謝速度の遅い蛋白質で
あり、Ｄ−Ａｓｐ含有蛋白質は、老化とともに増加する
傾向にある。なかでも、アルツハイマー病で脳内に蓄積
するアミロイドβ蛋白質（Ａβ）には、１残基目、もし
くは７残基目のＬ−Ａｓｐが異性化してＤ体になってい
るもの（Ｄ−Ａβ）が発見されている。Ｄ−Ａβは、in
vitroでの凝集が早まることが確認されており、病態と
の関連が示唆されている。また、加齢と共にヒトの脳内
や体液中に遊離のＤ−Ａｓｐが増加していくことも明ら
かになっている。我々は、遊離のＤ−Ａｓｐの一部が、
Ｄ−Ａβのような異常な蛋白質の分解に由来する物質で
はないかと仮定した。すなわち、ＤＡＥＰというべき分
解酵素が我々の生体内に存在し、本酵素が防御システム
として、老化と共に増加するＤ−Ａβのような異常な構
造を持つ蛋白質を分解し、排除していると考えた。

【０００３】本発明者らは、このＤＡＥＰが分子量７０
万の高分子複合体であり、その基本的な酵素としての性
質についてＤＡＥＰの活性がプロテアソーム阻害剤のラ
クタシスチンによって阻害されることなどを報告してい
る（木野内忠稔ら「哺乳類におけるＤ−アスパラギン酸
含有蛋白質に特異的な分解酵素について」第７３回日本
生化学会大会（２０００年５月２５日））。これらの性
質は２０Ｓプロテアソームと一致するものであるが、そ
の細胞内の局在が異なること、ＤＡＥＰはＤ−Ａｓｐ含
有蛋白質にのみ特異性を示すことなど、性質上の相違点
も多いこともわかってきている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来、Ｄ−アスパラギ
ン酸エンドペプチダーゼの活性を抑制する既存の阻害剤
はプロテアソーム阻害剤として知られるラクタシスチン
だけであった。ラクタシスチンの本酵素に対する阻害特
性は、感度が悪く、また、プロテアソームにも作用して
しまうことが欠点であり、ＤＡＥＰの特性の調査には不
向きであった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の本阻害剤（ｉ−
ＤＡＥＰ）は、ＤＡＥＰの性質を詳細に調べる過程で開
発されたものであり、ＤＡＥＰがＤ−Ａｓｐを含む基質
を特異的に分解することに着眼し、その類似体がＤＡＥ
Ｐの活性中心をふさぐことによってＤＡＥＰ活性を阻害
する化合物を設計することにより、ｉ−ＤＡＥＰを得る
ことができた。結果的に本発明のｉ−ＤＡＥＰはラクタ
シスチンに比べ１０倍以上感度が良い。即ち、本発明の
目的は、Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌ又はその誘導体を含
み、かつ少なくとも３つのアミノ酸を含むアミノ酸配列
から成るＤ−アスパラギン酸含有蛋白質分解酵素の阻害
剤を提供することである。この阻害剤は、ベンゾイル−
Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌ、ビオチニル
−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌ又はビオチ
ニル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ-Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌから成
ることが好ましい。

【０００６】ＤＡＥＰは、その分子量が70万であり、ラ
クタシスチンでその活性が阻害されることから、その高
次構造は、プロテアソーム様の構造を持つことが推測さ
れる。すでにプロテアソーム阻害剤として市販、利用さ
れている合成ペプチド阻害剤には、ALLN（N-acetyl-L-l
eucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal）やZLLLal(benzylo
xycarbonyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal)が
あり、いずれもトリペプチジル阻害剤である。一方、ア
ミノ酸数が1つ足りないZLLal(benzyloxycarbonyl-L-leu
cinyl-L-norleucinal)では、プロテアソーム活性を阻害
できないことから、2残基では、立体構造上、プロテア
ソームの活性中心へのアクセスに問題が生じるものと考
えられている。従って、ＤＡＥＰにおいても最低３残基
からなる構造が必要である。また、近年発見されたジャ
イアントプロテアーゼも、70万の分子量を持つ超高分子
複合体で、その活性は一部、プロテアソームと類似し、
ラクタシスチンで阻害される。このジャイアントプロテ
アーゼに対して開発された阻害剤、即ち、L-Ala-L-Ala-
L-Phe-chloromethaneも3残基からなるトリペプチジル阻
害剤である。従って、これらのことからラクタシスチン
でその活性が阻害され、分子量が７０万の超高分子複合
体型のプロテアーゼファミリーとしてＤＡＥＰをとらえ
ると、その活性を阻害する目的で合成されるペプチド阻
害剤も、溶液中での安定性などを考慮して、最低３残基
であることが望ましい。

【０００７】

【発明の実施の形態】ＤＡＥＰは、基質となるペプチド
や蛋白質の一次配列中にＤ−Ａｓｐが存在した場合、そ
のカルボキシ末端側で隣のアミノ酸との間を切断する分
解酵素の性質を示す。ただし、Ｄ−Ａｓｐが基質の一番
外側であるＮ末端にあった場合には、作用しない（即
ち、エクソ型のペプチダーゼではない。）。図1に、ウ
サギ肝ミトコンドリアから精製したＤＡＥＰ（ミトコン
ドリアＤＡＥＰ）に、合成した１０残基のペプチド、(D
-Asp)-AEFRH-(D-Asp)-SGY（D-Aβ1-10と略す。）及び(L
-Asp)-AEFRH-(L-Asp)-SGY（L-Aβ1-10と略す。配列番
号：１）を作用させた様子を示す。これらの合成ペプチ
ドは、Ｌ−ＡｓｐもしくはＤ−Ａｓｐを１残基目と７残
基目に含み、アルツハイマー病の原因蛋白質であるアミ
ロイド蛋白質（Aβ）の1〜10残基までの配列を表す。Ｄ
ＡＥＰ酵素溶液と以上のD/L-Aβ1-10を混合し、３７
℃、２１時間インキュベートし、その後、１００℃で1
分間加熱することにより反応を止め、この溶液を逆相カ
ラムにアプライし、分解されたD/L-Aβ1-10の断片を分
画した。クロマトグラムから、変化の見られたピークに
ついてペプチドシーケンサーで分析したところ、D-Aβ1
-10では、２１時間後（図１（ｂ））に０時間（図１
（ａ））で分解の観られなかったD-Aβ1-10のピークが
２つに分かれており、それぞれSGYとdAEFRHであること
が分かった。また、D-Aβ1-10のN末端側にあるＤ−Ａｓ
ｐには作用していないことが分かった。一方、L-Aβ1-1
0は２１時間後（図１（ｄ））もクロマトグラムは変わ
らず、ペプチドシーケンサーによる解析の結果も０時間
（図１（ｃ））と同様、分解されていないことが分かっ
た。即ち、ＤＡＥＰはエンド型のペプチダーゼ活性を持
つことを示す。従って、ＤＡＥＰとは、基質として一次
配列中にＤ−Ａｓｐを含むペプチドや蛋白質を、エンド
形の様式で分解する酵素の一群であるといえる。

【０００８】これまでに本発明の活性測定用基質を用い
て活性を確認できたのは、ミトコンドリアに存在するＤ
ＡＥＰ（以下、「ミトコンドリアＤＡＥＰ」という。）
と、核に存在するＤＡＥＰ（以下、核ＤＡＥＰ）のみで
ある。その基本的な性質について表１に示す。

【表１】 核ＤＡＥＰについては、ミトコンドリアＤＡＥＰに比べ
研究が進んでおらず、満足のいく精製法も開発されてい
ない。また、両者とも一次配列はまだわかっていない。
表２に両者の性格の比較を示す。

【０００９】

【表２】 核ＤＡＥＰについては解析が進んでいないが、多くの点
で両者は非常に性質が似ており、本発明の活性測定用基
質に対する親和性（Km）は、誤差の範囲内であり、両者
の蛋白質分解機能は同じと考えられる。また、臓器によ
ってミトコンドリアＤＡＥＰ：核ＤＡＥＰの活性比が異
なるため、その局在の違いは各臓器の性質と密接に関連
しているようである。一番の性質上の違いは、局在にあ
ると考えられる。ミトコンドリアＤＡＥＰは、膜にしっ
かり結合していて、なかなか回収が難しいが、核画分に
あるＤＡＥＰは、可溶性画分に回収されるため、膜に結
合する力が弱いか、もしくは、ほとんどが核内に存在し
ているものと考えられる。

【００１０】現在のところ、ミトコンドリアＤＡＥＰと
核ＤＡＥＰとを見分けるのは困難であり、精製の段階で
分けてくる以外に方法はない。従って、最終的に、両者
に最適な測定用基質や阻害剤を開発する必要があるかも
しれないが、エンド型Ｄ−Ａｓｐ含有蛋白質分解酵素と
いう定義上では、ミトコンドリアＤＡＥＰと核ＤＡＥＰ
とは同一の範疇に分類される異なる２種類の酵素といっ
てよいと考えられる。

【００１１】一般に、-CH₂Clを持つインヒビター（TLCK
やTPCKなど）は、活性中心のセリンやヒスチジンに対し
て特異的にアルキル化し、酵素を不可逆的に失活させ
る。従って、この活性中心に入るように基質アナログと
してD-Aspを利用し、ＤＡＥＰの作用部位たるカルボキ
シ末端側に-CH₂Clを付けた。このような考え方に基づい
て阻害剤（ｉ−ＤＡＥＰ）を構成した。D-Aβ1-10ペプ
チドを切断する活性がＤＡＥＰに存在することから、D-
AspからN末側3残基を選び、阻害剤の構造をBz-L-Arg-L-
His-D-Asp-CH₂Clにし、また活性中心の標識のためにＮ
末端にビオチンを着けたものを合成した。最初に合成し
たのは、ベンゾイル−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｃ
Ｈ_２Ｃｌであり、その後、ビオチニル−Ａｒｇ−Ｈｉｓ
−Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌ及びビオチニル−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ-Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌも阻害活性を示したの
で、阻害活性の基本構造はＤ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌにあ
ることがわかり、そのＮ末端側の構造には依存しないと
考えられる。

【００１２】

【発明の効果】ＤＡＥＰの生理的機能として、内在性の
Ｄ−Ａｓｐ含有蛋白質の分解などが挙げられる。活性酸
素や紫外線などの影響により、蛋白質のアスパラギン酸
残基は、その光学異性がＬ型からＤ型に非酵素的に変化
する。こうした局所的な変化は、その蛋白質全体に及
び、構造が崩れ、元来の生理機能を失ったり、場合によ
っては疎水性の局面が露出することによって凝集し、蓄
積することも考えられる。例えば、眼球のレンズに存在
するクリスタリンでは、60歳を過ぎた人で50%以上のア
スパラギン酸がＤ体に変化していることが分かってい
る。この変化と白内障の発症が良く相関するため、Ｄ−
Ａｓｐ含有クリスタリンは、白内障の原因の一つと考え
られるようになった。この他にも、Ｄ−Ａｓｐ含有エラ
スチンと動脈硬化の関係などが考えられている。こうし
て生じたＤ−Ａｓｐ含有蛋白質は、生物にとって不要物
であるので、通常はプロテアソームなどの内在性タンパ
ク質分解酵素によって分解される。ところが、Ｌ型のア
ミノ酸からなるペプチド、もしくは蛋白質を認識して分
解している通常のプロテアーゼでは、Ｄ−Ａｓｐ含有蛋
白質は、その構造の特異性から分解できない。

【００１３】これまでに発見されたＤ−Ａｓｐ含有蛋白
質は、いずれも細胞外に存在し、代謝性の低いものばか
りなので、ＤＡＥＰによる作用から逃れることができ、
我々の目にとまるようになったと考えられる。逆に言え
ば、常に分解されているようでは、その本来の機能が発
揮できない。また、Ｄ型のアミノ酸を含むことにより、
微生物の細胞壁中のペプチドグリカンや、ある種の生物
毒では、分解されづらい性質を逆に利用して、その寿命
を長くし、効果を高めていると考えられる。従って、Ｄ
ＡＥＰの機能を利用することによって、内在性のＤ−Ａ
ｓｐ含有蛋白質を分解することや外来のＤ−Ａｓｐを含
んだ毒物などを分解・解毒することができると考えられ
る。いずれ、ＤＡＥＰの全容を解明し、発現調節法が可
能になれば、また、阻害剤の利用などでＤＡＥＰの活性
を調節できるようになれば、解毒や体内に蓄積するＤ−
Ａｓｐ含有蛋白質の排除を目的とした利用が可能であ
り、様々な疾病の治療法にも使うことが可能になると考
えられる。同時に、特異的な基質によるＤＡＥＰ活性測
定法も必要になると考えられる。

【００１４】ＤＡＥＰの阻害剤であるｉ−ＤＡＥＰの利
用法については、まずは、学術的な分野での利用法が挙
げられる。プロテアーゼの阻害剤は、新規のプロテアー
ゼに対して性質を決定することなどにも用いられてい
る。また、ＤＡＥＰの局在場所であるミトコンドリアに
ｉ−ＤＡＥＰを作用させると、脱共役剤を作用させたと
きのように呼吸が速くなり、また、チトクロームcの放
出が確認された。これらと同様の効果が、唯一既存のＤ
ＡＥＰ阻害剤であるラクタシスチンでも確認されている
ため、ＤＡＥＰは、ミトコンドリアに特有な機能に深く
関与していることが示唆された。特に、チトクロームc
の放出に関与していることは、アポトーシスの誘導と深
く関連するため、今後、さらに改良を進めることによっ
て、既存の抗ガン剤との組み合わせにより、腫瘍細胞に
対して細胞死を誘導する薬剤としての利用可能であると
考えられる。

【００１５】

【実施例】以下本発明を実施例にて例証するが、それら
は本発明を制限するものではない。ＤＡＥＰの精製 ＤＡＥＰはミトコンドリアと核に局在しているので、細
胞抽出液でも十分に活性は測定できる。破砕に用いる緩
衝液には通常HEPESやPBSを用いる。培養細胞などのＤＡ
ＥＰを測定する場合には、細胞を回収し、懸濁後、超音
波破砕して上清を回収すればよい。ただし、ＤＡＥＰは
膜タンパクでなので、半分以上が膜に残る。したがっ
て、高度に定量するのであれば、ミトコンドリアと核を
丁寧に分画する必要がある。本実施例で用いたミトコン
ドリアＤＡＥＰは以下の手順で精製した。まず、ウサギ
肝臓に１０倍量以上の等張液（０．２５Ｍ ショ糖、
０．２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、ポッター型ホモジナイザ
ーで破砕した。その後遠心分離（１００×ｇ、５分、４
℃）し、その上澄みに１／２倍量の高張液（０．３５Ｍ
ショ糖、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、遠心分離（８
００×ｇ、１５分、４℃）し、その上澄みを更に遠心分
離（９０００×ｇ、１０分、４℃）し、その沈殿物に１
０倍量以上の等張液（０．２５Ｍ ショ糖、０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加え、遠心分離（９０００×ｇ、７分、４
℃）し沈殿物を回収した。この沈殿物に等張液（０．２
５Ｍ ショ糖、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ホモジナ
イザーで軽く懸濁し、２０ｍｇ／ｍｌに調製し、Ｏｐｔ
ｉｐｒｅｐを用いた密度勾配遠心分離（１．１１７〜
１．１８５ｇ／ｍｌ）を行い、１．１３０〜１．１４０
ｇ／ｍｌを分画し、ミトコンドリア画分を得た。

【００１６】このミトコンドリア画分に超音波処理（５
０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ、２分）を行い、遠心分離
（１０００００×ｇ、６０分、４℃）し、その沈殿物に
抽出緩衝液（１．０％ＣＨＡＰＳを含むＴ^１０Ｅ^１）を
加え、チューブローテーター（〜１ｒｐｍ、４５分、４
℃）で処理し、超遠心分離（１０００００×ｇ、６０
分、４℃）し、その沈殿物を上記抽出緩衝液に懸濁し再
抽出を繰り返し、その上澄みに順次１００Ｋ限外ろ過
（ＭＡＣＲＯＳＥＰ）、強陰イオン交換（ＲＥＳＯＵＲ
ＣＥ Ｑ）、強陽イオン交換（ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓ）
を行い、ヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ
ＣＨＴ２−１）を加えて、ゲルろ過し（Ｓｕｐｅｒｒｏ
ｓｅ ６ＨＲ１０／３０）、ＤＡＥＰ精製品を得た。

【００１７】ＤＡＥＰの活性測定 測定用基質として、合成したNma-Phe-Arg-His-D-Asp-Se
r-Gly-Tyr-Lys-2,4-Dinitrophenyl-Arg-NH₂を用い、以
下の手順で活性測定を行った。通常、プロテアーゼの活
性測定には、測定用の蛍光基質を1mMに調製し（まず10m
MのDMSOで溶解した濃い基質溶液を調製し、これを10倍
に蒸留水で希釈する）、これを1/10量含む測定条件を設
定して、プロテアーゼの活性を測定する。反応液は、測
定すべきプロテアーゼの至適pHに調整した緩衝液、塩な
どを含み、最大活性が見られる反応温度で、15-30分間
反応させる。反応の終了操作は、反応液と同量の10％SD
Sを加え、さらに、念のため反応液に含まれる緩衝液のp
Hと逆のpHをもつ緩衝液を加え、完全に酵素反応を停止
する。（なお、96穴プレートを用いて蛍光プレートリー
ダーで蛍光強度を読みとってもよく、この場合には反応
停止操作は行わない。性能の良い蛍光プレートリーダー
を用いるとリアルタイムで蛍光強度が測れる。）。普通
のプロテアーゼであれば、10％SDSを加えただけで失活
するが、その後蛍光強度を測るときに用いる石英キュベ
ットの容積も考慮して、さらに至適pHと逆のpHをもつ緩
衝液を大量に加えてもよい。ＤＡＥＰについては、反応
液として 1.0 M Tris/HCl (pH 8.5), 1 μｌ、5 MNaCl,
4 μｌ及び0.1 M MnCl₂, 3 μｌ、蛍光基質（1mM）10
μｌ、並びに蒸留水72 μｌから成る計90 μｌの反応液
を用い、これに酵素液10 μｌを加え、総量100 μｌと
して、30℃でＤＡＥＰの場合15分間インキュベートし
た。蛍光強度は、10％SDS、100 μｌ、さらに0.1 M 酢
酸緩衝液 (pH 5.0)を加えて総量1.5 mlとして、蛍光光
度計（日立・F-2000形分光蛍光光度計）で測定した（測
定条件：励起波長380 nm、蛍光波長460 nm）。

【００１８】検量線については以下のようにして作成し
た。活性測定に用いる蛍光基質の終濃度が0.1mMなの
で、当然、基質が完全分解されても、それ以上の蛍光物
質は遊離されない。そこで、検量線の上限に相当するNm
a濃度を0.1mMとして、1/10きざみで0.1μl位までの検量
線を蛍光光度計や蛍光プレートリーダーにインプットし
ておく。それに極めて近い結果が得られた場合は、反応
がプラトーに達していることを示しているので、酵素の
希釈率を高めるか、反応時間をもっと短くすることによ
り、酵素反応の一次反応領域で測定する必要性がある。
こうして作った検量線により、酵素の比活性を求めた。

【００１９】Nma-Phe-Arg-His-D-Asp-Ser-Gly-Tyr-Lys-
(DNP)-Arg-Arg-NH ₂ の合成 保護ペプチド樹脂の合成は、パラメチルベンズヒドリル
アミン樹脂(MBHA resin)を出発原料とし、第三ブチルオ
キシカルボニル(Boc)法を適用したABI430A自動ペプチド
合成機(アプライドバイオシステム社製)を用いて行っ
た。1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステルで
縮合する標準的なプロトコールに従い、0.5 mmolスケー
ルで、逐次アミノ酸誘導体を伸長した。用いたアミノ酸
側鎖保護基は以下に示すとおりである。アルギニンはト
シル(Tos)基、アスパラギン酸はシクロヘキシル(cHex)
基、セリンはベンジル(Bzl)基、チロシンは2-ブロモベ
ンジルオキシカルボニル(BrZ)基、ヒスチジンはベンジ
ルオキシメチル(Bom)基、リジンは2,4-ジニトロフェニ
ル(DNP)基で側鎖官能基が保護されている。得られたH-P
he-Arg(Tos)-His(Bom)-D-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)-Gly-Tyr
(BrZ)-Lys(DNP)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-MBHA樹脂に、N-メ
チルアントラニル酸(Nam)を縮合した。保護ペプチド樹
脂をパラクレゾール存在下に無水フッ化水素で-5℃、1
時間処理し、Nma基（N-メチルアントラニロイル基）及
びDNP基（2,4-ジニトロフェニル基）を除く全ての保護
基を除去することにより当該粗ペプチドを得た。粗ペプ
チドは、YMC Pack ODS (SH-363-5, 30 x 250 mm)カラム
を用いた19.8%アセトニトリル/0.1% TFAから39.8%アセ
トニトリル/0.1% TFAへの直線勾配による溶出(80分、流
速:20 ml/分)で精製した。 アミノ酸分析 (水解条件: 6 N HCl, 110℃, 22時間)：
Asp(1) 1.00, Ser(1)0.91, Gly(1) 0.98, Tyr(1) 0.9
9, Phe(1) 0.99, His(1) 1.00, NH3(1) 1.25,Arg(3) 3.
06 ESI MS： 測定分子量 1619.55 (理論値: 1619.72)

【００２０】Bz-Arg-His-D-Asp-CH₂Clの合成 １．HCl・H-D-Asp(OcHex)-CH₂Cl Boc-D-Asp(OcHex)-OH 6.31 g(20.0 mmol)をテトラヒド
ロフラン(100 ml)に溶かし、氷冷撹拌下にクロロギ酸イ
ソブチル2.71 ml(21.0 mmol)およびN-メチルモルフォリ
ン 2.31 ml(21.0 mmol)を加えた。10分間撹拌した後析
出した塩を濾去し、濾液にジアゾメタン/エーテル溶液
(200 ml)を加え、冷却下に1時間撹拌した。この反応液
に4.5 N塩酸/ジオキサン17.8 ml(80.0 mmol)を加え20分
間撹拌した後、水を加え洗浄した。有機層を飽和炭酸水
素ナトリウム水・飽和食塩水・10%クエン酸水・飽和食
塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウム上乾燥した。
有機層を減圧濃縮して油状物を得た。油状物に、4.5 N
塩酸/ジオキサン44 ml(0.20 mol)加え室温で30分間撹拌
した後、減圧濃縮した。残査にイソプロピルエーテルを
加え固化、5.40 g(95%)得た。 ２．Boc-His(Bom)-OPac Boc-His(Bom)-OH 40 g (0.107 mol)のN,N-ジメチルホル
ムアミド(DMF)溶液(50ml)に、炭酸セシウム20.8 g (0.0
64 mol)水溶液を加え撹拌した。反応液を減圧濃縮し、
再びDMFに溶かし、氷冷撹拌下に臭化フェナシル(Pac-B
r)19.1 gを加えた。室温で４時間撹拌した後、反応液に
酢酸エチル(500 ml)と水(500 ml)を加え抽出した。酢酸
エチルを留去し、残査にヘキサンを加え固化した。47.3
g(74%)

【００２１】３．Boc-Arg(Tos)-His(Bom)-OPac Boc-His(Bom)-OPac 10g(20.2 mmol)にトリフルオロ酢酸
(TFA, 70 ml)を加え、-5℃冷却化に10分間、室温で50分
間撹拌した。TFAを留去し、残査に4.5 N塩酸/ジオキサ
ン(9 ml, 40.5 mmol)を加え混ぜ合わせた後に、エーテ
ルより固化した。得られた塩酸塩およびBoc-Arg(Tos)-O
H 12.1 g (24.3 mmol)、HOBt（1-ヒドロキシベンゾトリ
アゾール） 2.87 g(21.2 mmol)をDMF(100 ml)に溶か
し、-10℃冷却撹拌下にEDC 3.89 ml(21.2 mmol)を加え
た。室温で2時間撹拌した後、反応液に酢酸エチル(500
ml)と水(500 ml)を加え抽出した。酢酸エチルを留去
し、残査にイソプロピルエーテルを加え固化した。8.0
g(49%) ４．Bz-Arg(Tos)-His(Bom)-OPac Boc-Arg(Tos)-His(Bom)-OPac 8.0 g(10.0 mmol)にTFA(6
0 ml)を加え、-5℃冷却化に10分間、室温で50分間撹拌
した。TFAを留去し、残査に4.5 N-HCl/ジオキサン(4.4
ml, 20.0 mmol)を加え混ぜ合わせた後に、エーテルよ
り固化した。得られた塩酸塩および安息香酸 1.46 g (1
2.0 mmol)、HOBt 1.61 g(12.0 mmol)をDMF(80 ml)に溶
かし、-10℃冷却撹拌下にEDC 2.19 ml(12.0 mmol)を加
えた。室温で4時間撹拌した後、反応液に酢酸エチル(50
0 ml)と水(500 ml)を加え抽出した。酢酸エチルを留去
し、残査にジエチルエーテルを加え固化した。固体を濾
取した。6.8 g(84.6%)

【００２２】５．Bz-Arg(Tos)-His(Bom)-OH Bz-Arg(Tos)-His(Bom)-OPac 6.8 g(8.4 mmol)を酢酸(10
0 ml)に溶かし、45℃で加温しながら亜鉛末(15 g)を加
え1時間撹拌した。亜鉛末を除き、酢酸を留去した。残
査を、クロロホルム・メタノール混合溶媒(v/v = 4/1,
60 ml)に溶かし、1 N塩酸(17 ml)を加えた後減圧濃縮し
た。残査にジエチルエーテルを加え結晶化した。5.7 g
(98.3%) ６．Bz-Arg(Tos)-His(Bom)-D-Asp(OcHex)-CH₂Cl Bz-Arg(Tos)-His(Bom)-OH 576 mg(0.835 mmol)、HCl・H
-D-Asp(OcHex)-CH₂Cl237 mg(0.835 mmol)およびHOBt 12
5 mg(0.918 mmol)のDMF(5 ml)溶液を撹拌しながら、EDC
（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミド） 0.168 ml(0.918 mmol)を加えた。2時間後、反応
液に水を加え析出した個体を濾取した。水洗した後、減
圧乾燥し、811 mg(106%)得た。

【００２３】７．Bz-Arg-His-D-Asp-CH₂Cl Bz-Arg(Tos)-His(Bom)-D-Asp(OcHex)-CH₂Cl 1.70 g(1.8
5 mmol)およびパラクレゾール2.86 ml(27.7 mmol)をフ
ッ化水素(HF)反応管に入れ、無水HF(約26 ml)を導入し
た。反応管を氷冷し、1時間撹拌した。過剰のHFを留去
し、残査にジエチルエーテルを加え固化した。0.91 g得
た。この固体を水(30 ml)に溶かし、YMCPack ODS (SH-3
63-5, 30 x 250 mm)カラムに適用した。5%アセトニトリ
ル/0.1%TFAから30%アセトニトリル/0.1% TFAへの直線勾
配による溶出(60分、流速:20 ml/分)で精製した。当該
ペプチドを含む画分を集め、1 N塩酸(3 ml)を加え凍結
乾燥した。褐色粉末235 mg得た。 元素分析：C₂₄H₃₁N₈O₆Cl・2HClとしての計算値： C, 4
0.51; H, 5.86; N, 15.75%； 実測値：C, 40.36; H,
5.82; N, 15.87% アミノ酸分析 (水解条件: 6 N HCl, 150℃, 1時間)：
Asp(0) 0.008, His(1)0.849, NH₃ (1) 1.050, Arg (1)
1.000 ESI MS： m/z 563.3 ([M+H]⁺: 563.213), 282.1 ([M+
H]²⁺: 282.111)

【００２４】実施例１ 図２には、ＤＡＥＰとして上記のように用意したミトコ
ンドリアＤＡＥＰを用い、阻害剤としてBz-Arg-His-D-A
sp-CH₂Clを用い、更に比較のためラクタシスチン（協和
メディックス株式会社、コードNo：OP18）とプロテアソ
ーム阻害剤のＡＬＬＮ（シグマアルドリッチジャパン株
式会社、コードNo：A6185）を用いたときのＤＡＥＰの
阻害活性を示す。阻害剤としての活性の測定条件は、ま
ず酵素液に阻害剤を加えて10μリットルとし、その後、
上記の方法によりＤＡＥＰの活性を測定した。この図か
らもわかるように本発明の阻害剤はＤＡＥＰの活性を有
効に阻害している。

【００２５】

【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Ｄ−アスパラギン酸含有蛋白質分解酵素の阻害剤 <130> PS01-961 <160> 1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＡＥＰによる２種のペプチドの切断活性の検
索を示す図である。

【図２】ＤＡＥＰに対する阻害剤の効果を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 5/09 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA02 BA09 BA15 BA23 BA31 BA32 BA44 DC32 NA14 ZA162 ZA332 ZA452 ZB262 ZC201 4H045 AA10 AA20 AA30 BA12 DA55 EA20 FA33

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｄ−Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌ又はその誘導体
   を含み、かつ少なくとも３つのアミノ酸を含むアミノ酸
   配列から成るＤ−アスパラギン酸含有蛋白質分解酵素の
   阻害剤。
2. 【請求項２】 ベンゾイル−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｓ
   ｐ−ＣＨ_２Ｃｌ、ビオチニル−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａ
   ｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌ又はビオチニル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ-Ｄ
   −Ａｓｐ−ＣＨ_２Ｃｌから成る請求項１に記載の阻害
   剤。