JP2002253249A - 転移性遺伝因子の活性化が検出可能な植物細胞及びこの細胞を用いる転移性遺伝因子の活性化検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】植物細胞における転移性遺伝因子の移動活動の
活性化を検出できるようにする。 【解決手段】転移性遺伝因子の高頻度転移挿入配列と、
この配列の近傍に配置されるレポーター遺伝子をコード
する配列と、このレポーター遺伝子に作用可能に配置さ
れるプロモーター配列、とを有する、植物細胞とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】イネのゲノムについては、大
量の遺伝子情報が蓄積しつつある。しかしながら、多く
の遺伝子の機能は未解明であり、これらの遺伝子を有効
利用するには、生体中での機能解析が必須である。動物
では相同組換えを利用した遺伝子破壊法（Ｇｅｎｅ Ｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ）が開発され、遺伝子ノックアウトマ
ウスが作られ、これらノックアウトマウスの形質を調べ
ることにより遺伝子の機能が解明されつつある。一方、
植物では、遺伝子機能解析の方法として、トランスポゾ
ンやＴ−ＤＮＡ等の転移性遺伝因子による遺伝子破壊法
が注目されている。特に、内在性のトランスポゾンを利
用して遺伝子破壊法は、動物ではショウジョウバエで、
植物ではトウモロコシで初めて開発され、その後、線虫
やキンギョソウの系が報告されている。植物のトランス
ポゾンに関しては大別してＤＮＡ型トランスポゾンとレ
トロトランスポゾンの２種類に大別され、イネからは後
者にあたるレトロトランスポゾンの存在が多数確認され
ている。その中で、組織培養によって活性化され、最も
転移活性の高いＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９３：７７８３−７７８８（１９９６））を利用し
て遺伝子破壊系が開発され、遺伝子の機能解析に利用さ
れている（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ Ｈ., Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｉｃｅ,Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ ｐｐ．４３−５８（１９９９））。この
遺伝子破壊技術は公知の技術であり、特長として、１）
組織培養によって転移が活性化し、再分化により不活性
化して、転移したトランスポゾンは後代まで保存される
ことから、転移を人為的に制御しうる、２）培養期間に
比例して転移コピー数が増加する、３）転移は遺伝子領
域にランダムに起こる可能性が高い、４）Ｔｏｓ１７の
塩基配列が既知であるため、Ｔｏｓ１７を指標に破壊遺
伝子の解析及び単離が容易である、５）内在性のトラン
スポゾンを利用するため、組換えＤＮＡ実験ではなく特
殊な設備等を必要としない等が挙げられる。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、レトロ
トランスポゾンＴｏｓ１７の活性化には長期間を有し、
５ヶ月間程度の組織培養が必要とされている。また、組
織培養でＴｏｓ１７が活性化するものの、Ｔｏｓ１７の
活性化が起こったかどうかは植物体に再生してみないと
確認できないこと、最終的に得られた変異体のうち、Ｔ
ｏｓ１７に由来するものは、５〜１０％と低く、しかも
培養系列によって転移程度に差があり、系列によっては
変異体を得られないという、問題がある。さらに、Ｔｏ
ｓ１７については、組織培養以外のその他の活性化因子
については不明である。

【０００３】このように、Ｔｏｓ１７等の転移性遺伝因
子の挿入転移を利用して、遺伝子破壊系統を作製し、遺
伝子の機能解析を行うにあたっては、時間と労力を要す
る一方、得られる変異系統が相対的に少ないというのが
現状である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、独自に作
製したイネ遺伝子破壊個体集団の解析により、レトロト
ランスポゾンＴｏｓ１７が高頻度に転移挿入している領
域を見出した。本発明は、かかる高頻度転移挿入配列
と、その利用に関し、本発明は、このような転移因子が
高頻度に挿入転移するＤＮＡ配列（高頻度転移挿入配
列）を、活性化した転移因子の転移挿入をトラップする
領域として利用して、転移因子の移動活動の活性化を検
出することにある。すなわち、本発明によれば、転移性
遺伝因子の高頻度転移挿入配列と、この配列の近傍に配
置されるレポーター遺伝子をコードする配列と、このレ
ポーター遺伝子に作用可能に配置されるプロモーター配
列、とを有する、植物細胞ならびにコンストラクトが提
供される。また、本発明によれば、かかる植物細胞にお
けるレポーター遺伝子の発現を検出して、転移性遺伝因
子の活性化を検出する方法ならびに植物細胞を選択する
方法が提供される。さらに、本発明によれば、このよう
な検出工程および選択工程を備える、植物変異体の製造
方法も提供される。これらの発明によれば、転移性遺伝
因子の移動活動の活性化を容易に検出でき、転移因子の
活性化した細胞系列を選択することができる。これによ
り、効率的に変異体を製造できる。特に、転移因子が、
植物細胞の培養の段階において活性化される場合、この
活性化によって得られる変異体は、植物細胞の植物個体
への再生を経て製造されるが、従来、培養細胞系列にお
ける転移因子の活性化の程度は、培養状態では確認でき
ず、すべてを個体へ再生する必要があった。しかし、こ
れらの発明によれば、トランスポゾンが活性化した培養
細胞系列を選択できるため、選択した細胞系列のみを個
体再生することにより、効率的に変異体が得られること
になる。

【０００５】また、本発明の別の態様によれば、転移性
遺伝因子の高頻度転移挿入配列候補と、この配列候補の
近傍に配置されるレポーター遺伝子と、このレポーター
遺伝子に作用可能に配置されるプロモーター配列とを有
する植物細胞における、レポーター遺伝子の発現を検出
して、転移性遺伝因子の高頻度転移挿入配列を探索する
方法が提供される。この方法によれば、転移因子の高頻
度転移挿入配列を効率的に探索することができる。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明は、転移性遺伝因子の高頻度
転移挿入配列（以下、単に高頻度転移挿入配列とい
う。）と、この配列の近傍に配置されるレポーター遺伝
子をコードする配列と、このレポーター遺伝子に作用可
能に配置されるプロモーター配列とを構成要素とする配
列（以下、単に捕獲検出配列カセットともいう。）に関
する。すなわち、本発明においては、かかる配列カセッ
トを、植物細胞の染色体上に配置しておき、この配列カ
セット中に、活性化した転移性遺伝因子を捕獲し、その
捕獲によりレポーター遺伝子の発現が阻止されるように
する。これにより、高頻度挿入配列を、転移性遺伝因子
の捕獲手段として、および、転移性遺伝因子の活性化な
いし移動活動の検出手段、さらには、転移挿入のある植
物細胞（系統）の選択手段とすることができる。

【０００７】（転移性遺伝因子）本発明における転移性
遺伝因子は、植物における転移性遺伝因子であれば、特
にその種類は問わない。挿入配列、トランスポゾン、Ｔ
−ＤＮＡ、ウイルス等その形態は問わないで、植物染色
体において可動性がある配列を含む。本発明において
は、転移活性の高い転移性遺伝因子であることが好まし
い。用いる植物との関係においては内在性の因子であっ
てもよく、外来性のものであってよい。好ましくは内在
性である。かかる転移性遺伝因子として、ＤＮＡ型トラ
ンスポゾンとしては、トウモロコシにおけるＡｃ／Ｄ
ｓ、レトロトランスポゾンとしては、タバコにおけるＴ
ｎｔ１を例示できる。また、細胞培養中において活性化
するトランスポゾンを好ましく用いることができる。例
えば、イネ（Ｏｒｙｚａ属）において見出されているレ
トロトランスポゾンであるＴｏｓ１７を本発明において
好ましく利用できる。

【０００８】（植物細胞）本発明における植物細胞は、
カルス培養、組織培養、器官培養、液体培養等の各種の
培養細胞の他、植物体（種子、根茎等の繁殖媒体も含
む）、植物体内の細胞、各種組織、各種器官も包含す
る。また、プロトプラストも含む。好ましくは、内在性
の転移性遺伝因子を有している植物細胞であるが、内在
性の転移性遺伝因子を有していない場合には、外部から
導入することにより、本発明の植物細胞として使用でき
る。本発明における植物としては、特に限定せず、植物
全体を包含するが、例えば、単子葉植物、双子葉植物な
どの作物植物が挙げられる。単子葉植物の具体例として
は、イネ、小麦，大麦、ライ麦、オート麦、トウモロコ
シ、モロコシ、キビ、オーチャードグラスなどの、禾本
科の植物である。また、双子葉植物の具体例としては、
ウリ科、ナス科、マメ科、タバコ、ジャガイモ、アブラ
ナ科の作物がある。さらに、本発明は、草や樹木など、
リグノセルロース資源となる植物の他、園芸作物や果物
植物も包含する。

【０００９】（高頻度転移挿入配列）高頻度転移挿入配
列とは、植物細胞の染色体上において、少なくとも１種
の転移性遺伝因子が転移挿入されうる配列である。高頻
度転移挿入配列は、好ましくは染色体上の遺伝子領域に
存在し、より好ましくは、他の遺伝子領域よりも高い確
率で転移性遺伝因子が転移挿入されうるような遺伝子領
域に存在する配列である。また、高頻度転移挿入配列と
は、転移性遺伝因子の転移挿入が確認された部位を含む
その近傍の配列、転移挿入部位を含まないがその部位の
近傍の配列、転移挿入部位を含む遺伝子の配列あるいは
その一部の配列、転移挿入部位を含む遺伝子における、
その転移挿入部位を含まない他の領域の配列などであ
る。しかしこれらに限定されず、本発明の目的に合致す
る限り、これらと実質的に同等の機能を有するものを用
いることができる。高頻度転移挿入配列においては、少
なくとも一箇所において転移性遺伝因子の転移挿入され
る可能性があれば足りるが、２箇所以上に当該因子が転
移挿入されうる配列であってもよい。現在までに、例え
ば、Ｔｏｓ１７が転移挿入されやすいとされているイネ
の病害抵抗性遺伝子等が本発明における高頻度転移挿入
配列に含まれる。本発明における高頻度転移挿入配列と
しては、１種類の転移性遺伝因子（例えば、Tos１７）
の挿入転移によって得られた変異体（典型的には植物
体）の集団において、７％以上の系統において転移挿入
が観察される領域あるいはその一部であることが好まし
い。

【００１０】高頻度転移挿入配列は、転移性遺伝因子の
転移挿入のある部位の塩基配列の検索の結果、相対的に
転移挿入頻度が高い領域として見出される場合もある
が、次のようにして見出すことができる。すなわち、高
頻度転移挿入配列の候補配列としての天然由来の配列あ
るいは人工的に合成した所定の配列と、当該候補配列の
近傍に転移挿入が起こった場合に発現が阻害されるよう
に配置されたレポーター遺伝子有する配列カセットを備
える植物細胞を作製し、転移性遺伝因子の移動を生じさ
せて、この因子のこの前記配列カセットへの転移挿入を
レポーター遺伝子の発現抑制により確認することによ
り、当該候補配列が高頻度転移挿入配列であるかどうか
を判断できる。よってこの手法を用いて探索された配列
も、高頻度転移挿入配列として好ましい。

【００１１】高頻度転移挿入配列としては、各種ＮＢＳ
−ＬＲＲ（ヌクレオチド結合部位−ロイシンリッチリピ
ート）様病害抵抗性遺伝子の一部あるいは全部の配列を
挙げることができる。本発明者らが独自に見出した、レ
トロトランスポゾンＴｏｓ１７の高頻度転移挿入配列
を、配列番号１〜３に示す。これらの配列は、イネ（Ｏ
ｒｙｚａ属、日本晴種及び台中６５号種）由来の塩基配
列であり、データベース解析（http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov:80/）を行ったところ、配列番号１は、イネのＹ
Ｒ３８及び大麦ｂ５のＮＢＳ−ＬＲＲ様病害抵抗性領域
とそれぞれ９９％及び６４％、配列番号２は、大麦ｂ８
の当該領域と６１％、配列番号３は、大麦ｂ９の当該領
域と６７％の相当性を有していた。相同性検索からは、
拡大しつつあるＮＢＳ−ＬＲＲ様病害抵抗性遺伝子ファ
ミリーに属する配列であると認められる。さらに、他の
ＮＢＳ−ＬＲＲ様病害抵抗性遺伝子としては、シロイヌ
ナズナＲＰ３２、トマト Ｐｒｆ等を挙げることができ
る。なお、これらの相同性は、NBS-LRR領域におけるア
ミノ酸レベルにおける相同性で示している。本発明の高
頻度挿入配列としては、これらのＮＢＳ−ＮＲＲ様病害
抵抗性遺伝子の全体でも一部であってもよい。特に好ま
しい、高頻度転移挿入配列としては、配列番号１〜３の
各配列の一部あるいは全体を含む。また、これらの配列
の一部を用いる場合には、各配列におけるトランスポゾ
ン挿入確認部位を含むか又はこれを含まない、当該部位
の近傍の２ｋｂｐ〜３ｋｂｐ程度を含むことが好まし
い。本発明においては、このような各種高頻度転移挿入
配列を、１種類用いてもよいが、２種類以上を組み合わ
せて用いることもできる。

【００１２】高頻度転移挿入配列は、人工的に合成され
たＤＮＡ配列でも、天然のゲノムＤＮＡ配列に由来する
ものであってもよい。ゲノムＤＮＡは、例えば、Ｒｏｇ
ｅｒｓ ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｃｈ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．５：６９（１９８５）の記載の方法に従って
調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、高頻度転移挿入配
列の塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）
を増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲ（Ｓａｉｋｉ
ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８
８））を行うことにより調製することができる。また、
ゲノムＤＮＡは、上方によりゲノムＤＮＡライブラリー
を作製し、このライブラリーに対して、高頻度転移挿入
配列（例えば、配列番号１〜３に記載の塩基配列）を基
に合成したプローブを用いてスクリーニングすることに
よっても調製することができる。なお、得られたＤＮＡ
の塩基配列は、「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ」（ＡＢＩ社製）を利用
するなど、公知の方法で塩基配列を決定できる。なお、
高頻度転移挿入配列が、レトロウイルス等に対応する場
合には、当該配列は、天然のあるいは人工的に合成され
たＲＮＡ配列となる。かかる場合も、常法によってかか
る配列を得ることができる。また、上記したいずれの高
頻度転移挿入配列と実質的に同一の配列も使用できる。
すなわち、当該配列において１あるいは２以上の塩基の
置換、欠失、挿入および／または付加等の変化が生じた
配列であっても、対照される配列と同等に、転移性遺伝
因子が挿入する配列である限り本発明において使用でき
る。

【００１３】（レポーター遺伝子）本発明におけるレポ
ーター遺伝子とは、その発現の抑制により当該遺伝子が
導入された細胞を選択できるような遺伝子である。植物
細胞の染色体には、レポーター遺伝子をコードする配列
が、配列カセットへの転移性遺伝因子の転移挿入前には
発現されるが、転移挿入によりその発現が阻害されるよ
うに配置されている。これにより、配列カセットへの転
移性遺伝因子の転移挿入を容易に検出することができる
ようになる。レポーター遺伝子としては、従来公知の各
種のいわゆるマーカー遺伝子（抗生物質耐性等の薬剤耐
性、あるいは栄養要求性などに関連する遺伝子）等、そ
の発現が阻害されることにより成長障害ないし死滅して
しまうことになる遺伝子は、実質的には採用することが
できない。

【００１４】本発明におけるレポーター遺伝子として
は、その遺伝子の発現が抑制されることにより、例えば
薬剤耐性が発現し、あるいは栄養要求性が消失し、ある
いは外部作用に対する抵抗性が発揮されるような遺伝子
を使用することができる。好ましくは、転移性遺伝因子
の移動活動の活性化した細胞を容易に選抜できるよう
に、発現の阻害が外部から視認できるようなレポーター
遺伝子を使用することが好ましい。すなわち、発現オン
及び発現オフの状態のいずれかが外部から観察できるよ
うなレポーター遺伝子であることが好ましい。なかで
も、活性測定が容易である、発現を定量的に把握でき
る、細胞への影響が少ない、組織化学的に検出できる等
の特性を備えるレポーター遺伝子を使用することが好ま
しい。このような特性を備える、今後新たに見出される
レポーター遺伝子も本発明に有用であるとして使用でき
るであろう。本発明のレポーター遺伝子としては、特に
好ましいのは、発現の抑制が組織化学的に検出可能な遺
伝子である。かかるレポーター遺伝子であれば、転移性
遺伝因子の活性化した細胞を容易に検出し、かつ分離選
択することができる。

【００１５】本発明において好ましいレポーター遺伝子
としては、例えば、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝
子（大橋祐子ら、植物細胞工学 ４：２８１−２６８
（１９９２））、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子（Ｍ
ｉｌｌｅｒ，Ａ． ｅｔａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １０：３２４−３３７（１９
９２））、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Ｐｒ
ａｓｈｅｒ，Ｄ．ｅｔａｌ．Ｕｓｉｎｇ ＧＦＰ ｔｏ
ｓｅｅ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ，ＧＦＰ ｉｎ ｐｌａｎｔ
ｓ，ＴＩＧ １１：３２０−３２９（１９９５））等が
ある。また、各種の植物組織に色素の変化等の何らかの
通常と異なる形態分化を引き起こす遺伝子である形態異
常誘導遺伝子も用いることもできる。なかでも、βグル
クロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子を
使用することが好ましい。なお、レポーター遺伝子の下
流には、レポーター遺伝子及びその転写物を安定化する
ために、ポリアデニレーション部位を含むターミネータ
ー配列を含んでいることが好ましい。

【００１６】レポーター遺伝子を発現させるためのプロ
モーターとしては、植物細胞で作用可能なプロモーター
であって、本発明で使用するレポーター遺伝子を恒常的
にあるいは誘導的に発現させるプロモーターを使用でき
る。好ましくは、恒常発現型プロモーターである。恒常
発現型プロモーターとしては、たとえば、カリフラワー
モザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ
ｅｔ ａｌ．１９８５Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０）、
イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．
１９９１ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１５５）、トウ
モロコシのユビキノンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ
ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２３：５６７）などが挙げられる。

【００１７】捕獲検出配列カセットに、移動する転移性
遺伝因子を捕獲させるには、高頻度挿入配列を含む配列
カセットが、植物の染色体に分散して（好ましくは多数
個）組み込まれていることが好ましい。転移性遺伝因子
のコピー数や転移頻度、得ようとする挿入変異回数によ
って導入する高頻度挿入配列の長さや組み合わせ、さら
に数が適宜選択される。上記した高頻度挿入配列は、複
数個が適当な間隔をおいてタンデムに配置されていても
よいし、また、複数個が隣接して連結されて配置されて
いてもよい。

【００１８】捕獲検出配列カセットへの転移性遺伝因子
の転移挿入（捕獲）によって、レポーター遺伝子配列の
発現を阻害させて、挿入転移を検出できるようにするた
めには、レポーター遺伝子をこの遺伝子に作用するプロ
モーターとともに、高頻度転移挿入配列の近傍に配置す
ることが好ましい。高頻度挿入配列に対するレポーター
遺伝子及びプロモーターの配列を図１〜６に例示する。
図１に示すように、高頻度転移挿入配列の下流側に、プ
ロモーター、レポーター遺伝子の順で配置してもよい
し、図２に示すように、レポーター遺伝子を高頻度転移
挿入配列の上流側に隣接させて配置し、このプロモータ
ーに作用可能にプロモーターを配置してもよい。また、
図３及び４に示すように、タンデムに配置された複数個
の高頻度転移挿入配列の間に、プロモーターとともにレ
ポーター遺伝子を配置してもよい。さらに、図５に示す
ように、複数個の高頻度転移挿入配列を連結させて、こ
れに隣接してプロモーターとレポーター遺伝子とを配し
ても良く、図６に示すように、高頻度転移挿入配列の両
側にそれぞれ反対の転写方向に異なるレポーター遺伝子
を配しても良い。

【００１９】（形質転換細胞の作製）次に、このような
植物細胞を得る方法について説明する。かかる植物細胞
は、上記した高頻度転移挿入配列、レポーター遺伝子、
プロモーター等を有するベクターあるいはコンストラク
トを、植物細胞に導入して形質転換させることにより作
製できる。かかるベクターあるいはコンストラクトにお
ける、高頻度転移挿入配列、レポーター遺伝子、プロモ
ーター等の配列は、上述したこれら各配列についての記
載を同様に適用し、それぞれにつき各種選択採用できる
とともに、上記記載にしたがって好ましい要素を選択で
きる。これらの配列を構成要素とする転移性遺伝因子の
捕獲検出配列カセットは、使用する遺伝子導入法に応じ
て好ましい形態に作製されるが、例えば、プラスミドベ
クターとする場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、
ｐＢＩ１０１（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを
使用できる。遺伝子導入は、アグロバクテリウムを利用
した導入方法（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｔｒａ
ｎｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２：２１８、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａ
ｌ．１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：６２１）、エレクト
ロポレーション法（Ｔａｄａｅｔ ａｌ．１９９０ Ｔｈ
ｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ ８０：４７５）、ポリ
エチレングリコール法（Ｌａｚｚｅｒｉ ｅｔ ａｌ．１
９９１ Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ ８１：４３
７）、パーティクルガン法（Ｓａｎｆｏｒｄｅｔ ａ
ｌ．１９８７ Ｊ．Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．５：
２７）などの方法を使用できる。また、これらの捕獲検
出配列カセットは、１種類のみを導入してもよいが、２
種類以上を導入してもよく、この場合には、レポーター
遺伝子の種類を異ならせるか、あるいは薬剤耐性等のマ
ーカー遺伝子を異ならせることにより、植物細胞内に導
入された捕獲検出配列を同定できる。

【００２０】なお、形質転換細胞は、必要に応じて、前
記した高頻度転移挿入配列に代えて、その候補配列を使
用して作製されうる。また、捕獲検出配列カセットを含
むベクターやコンストラクトとは別個に、用いる植物に
は内在しない外来の転移性遺伝因子を当該植物細胞に導
入することもできる。ウイルスやＴ−ＤＮＡの他、トラ
ンスポゾンやレトロトランスポゾンでも、その由来する
植物と異なる種類の植物に導入された場合において、そ
の移動活動をすることが多く知られている。このような
トランスポゾンの例としては、トウモロコシのＡｃ／Ｄ
ｓ、タバコのＴｎｔ１等がある。この場合、このような
転移性遺伝因子を有する別のベクターあるいはコンスト
ラクトを、同時にあるいは時期を異ならせて導入する。

【００２１】なお、ある種の転移性遺伝因子、例えばト
ランスポゾンが移転性でない場合、移転可能とする配列
もまた、植物細胞に導入するようにする。なお、この場
合においても、高頻度転移挿入配列を、候補配列に置き
換えることもできる。

【００２２】なお、この形質転換細胞を、再分化させる
ことにより、植物体を再生して、形質転換された植物体
を得ることができる。このような植物体（種子を含
む）、その組織（培養も含む）、器官（培養も含む）、
あるいはこれらから採取した細胞も、本発明における植
物細胞として、転移性遺伝因子の活性化を検出するのに
使用することができる。好ましくは、形質転換後の培養
細胞の形態で使用する。

【００２３】（転移性遺伝因子の活性化の検出・活性化
細胞の選択）形質転換細胞は、そのレポーター遺伝子自
身の発現および／または付随して導入したマーカー遺伝
子によって選択される。形質転換された植物細胞の染色
体には、このような高頻度転移挿入配列とレポーター遺
伝子配列とプロモーターとを備えることにより、その植
物細胞において、転移性遺伝因子の活性化をレポーター
遺伝子の発現活性を指標として検出できるようになる。
かかる植物細胞において、転移性遺伝因子が活性化して
いないか、あるいは活性化していても転移挿入が発生し
ていない状態では、レポーター遺伝子は、同時に組み込
まれるプロモーターの作用により発現している。レポー
ター遺伝子のその特異的表現型を確認することにより、
転移性遺伝因子の非活性化状態を確認することができ
る。一方、転移性因子が活性化して、転移挿入が発生し
ていれば、ある確率で高頻度転移挿入配列に転移挿入
し、それにより、近傍のプロモーターやレポーター遺伝
子が破壊・欠損したり、また、高頻度転移挿入配列の近
傍のプロモーター及びレポーター遺伝子にも転移性因子
が転移挿入したりする。このような転移挿入により、レ
ポーター遺伝子の発現が抑制される。レポーター遺伝子
の表現型の低下・消失を検出することにより、挿入転移
現象（転移性因子の活性化）を確認することができる。
この場合、形態的、組織化学的に（換言すれば可視的
に）表現型の変化を検出できることが好ましい。特に、
発色、発光、蛍光を組織化学的に検出することが好まし
い。これにより培養細胞（特に組織培養）や植物個体に
おける検出・選抜が容易になる。例えば、組織化学的に
検出する場合、転移挿入が起こった細胞では、発色等が
抑制あるいは喪失し、周囲に対してスポット状に色抜け
等した状態が観察されることになる。

【００２４】例えば、レポーター遺伝子が、ＧＵＳ遺伝
子の場合、β−グルクロニダーゼの基質である５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−グルクロニ
ド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）溶液に植物細胞を浸すことにより、
ＧＵＳ遺伝子が発現している細胞では、酵素反応が起こ
り、青色（インジゴチン）色素が生成するので、実体顕
微鏡等で転移細胞（発色しない細胞）を観察することが
できる。また、分光光度計を使用して、転移が起こって
いない細胞における発色量と転移が認められた細胞にお
ける発色量とを測定することにより、転移頻度の定量も
可能となる。また、例えば、ＬＵＣ遺伝子を用いた場合
には、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを細胞
内に取り込ませることによって発光が起こり、冷却ＣＣ
ＤカメラあるいはＡＲＧＵＳ（浜松ホトニクス株式会社
製）等のフォトンカウンティング方式のＶＩＭカメラで
転移細胞（発光しない細胞）を捕らえることが可能であ
る。また、ルミノメーターを使用して，転移挿入が起こ
っていない細胞における発光量と、転移挿入が認められ
た細胞における発光量とを測定することにより、転移挿
入頻度の定量も可能となる。レポーター遺伝子がＧＦＰ
遺伝子の場合、蛍光顕微鏡で観察することにより、転移
細胞（蛍光発色しない細胞）を捕らえることが可能であ
る。また、蛍光分光光度計を使用して、転移挿入が起こ
っていない細胞における発光量と転移が認められた細胞
における発光量とを測定することにより、転移挿入頻度
の定量も可能となる。

【００２５】（変異体の作出）このようにして転移性遺
伝因子の活性化が確認された細胞（組織、植物体を含
む）を選択的に採取する。培養細胞等の場合には、個別
の系統として培養し、植物体に再分化させる。なお、形
質転換細胞の再分化の方法は、植物細胞の種類により異
なるが、例えば、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｐ
ｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．
２：７４（１９９５））の方法を挙げることができる。
これにより作出した植物体及びその種子は、再びカルス
誘導することにより、さらに、変異体の効率的作出方
法、活性化因子探索方法に用いることができる。かかる
活性化検出工程を経ることにより、効率よく、転移性遺
伝因子の転移挿入により遺伝子に変異を有する系統（遺
伝子破壊系統）を得ることができ、遺伝子破壊ライブラ
リーを得ることができる。すなわち、転移性遺伝因子の
高頻度転移挿入配列と、この配列の近傍に配置されるレ
ポーター遺伝子をコードする配列と、このレポーター遺
伝子に作用可能に配置されるプロモーター配列とを有
し、転移性遺伝因子の転移挿入によって前記レポーター
遺伝子の発現が抑制された、変異した植物細胞（好まし
くは植物体あるいは種子）並びにかかる植物細胞（好ま
しくは植物体あるいは種子）のライブラリーが提供され
る。

【００２６】特に、形質転換した培養細胞の培養工程
を、トランスポゾンの活性化及びその検出工程として実
施し、次いで選択工程、再分化工程、植物体再生工程を
実施することにより、より効率的に変異体を得ることが
できる。特に、この方法は、培養によって活性化される
転移性遺伝因子（特に、トランスポゾン、典型的にはＴ
ｏｓ１７）において有用である。また、特に、組織化学
的に挿入転移を検出できるレポーター遺伝子を用いた場
合、容易に転移活性化細胞を選択できるとともに、転移
挿入頻度を定量的に把握することができるため、適切な
転移挿入頻度を備えた培養系列のみを選択的に再生すれ
ば、さらに効率よく変異体を作出できるようになる。

【００２７】かかる植物細胞及び活性化検出法によれ
ば、その転移性遺伝因子の活性化因子を探索することが
できる。すなわち、細胞培養や植物体に対して各種刺激
やストレスなどの活性化に関連すると思われる作用を与
えた後、１〜２日後、１週間後等、そのレポーター遺伝
子の経時変化を観察することにより、転移性遺伝因子の
転移挿入が起こりやすい条件（因子）を調べることがで
きる。また、因子と転移挿入頻度との量的関係も把握す
ることができる。したがって、適切な活性化因子を選択
し、及びその条件を調整して、所望の転移挿入頻度の変
異体を得ることもできるようになる。活性化因子として
は、温度、ヒートショック、凍結、ｐＨ、浸透圧、高
塩、乾燥、光量、電磁波、超音波等の環境ストレスある
いは外傷あるいはウイルスや細菌感染等の傷害ストレス
に関するものの他、タバコのレトロトランスポゾンで認
められているようなエリシター由来のものが挙げられ
る。特に、培養のみしか活性化因子として知られていな
い転移性遺伝子因子（例えばＴｏｓ１７）において、培
養以外の活性化因子の探索が可能となる。本発明の変異
体の製造方法において、本活性化検出法により見出され
た活性化因子を作用させれば、従来の培養による活性化
期間（Ｔｏｓ１７では、例えば５ヶ月）を顕著に短縮す
ることができるようになるであろう。

【００２８】さらに、本来その植物細胞に内在していな
い外来性トランスポゾンと、その外来性トランスポゾン
の高頻度転移挿入配列、レポーター遺伝子、及びプロモ
ーターとが、それぞれ導入された植物細胞によれば、そ
の植物体において外来性トランスポゾンによる新たな遺
伝子破壊系統を効率よく作製することができる。また、
活性化因子も検索することができる。例えば、Ｔｏｓ１
７と、その高頻度転移挿入配列を含む捕獲検出配列と
を、それぞれ導入したイネ以外の組換え植物細胞を利用
して、その植物細胞からの遺伝子破壊系統を作成できる
とともに、また、トランスポゾンの活性化因子の探索も
可能となる。また、かかる系を利用することにより、ト
ランスポゾンが異種の植物細胞由来であっても転移挿入
するかどうかを簡易に判断することができる。

【００２９】また、高頻度転移挿入配列に代えて、ある
トランスポゾンに対する高頻度転移挿入配列の候補配列
を備える植物細胞によれば、かかる候補配列がそのトラ
ンスポゾンにとって高頻度転移挿入配列か否かを判定す
ることができる。さらに、そのトランスポゾンの活性化
因子は何であるかを、その培養細胞や植物体等において
確認し、探索することができる。

【００３０】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に
説明するが、本発明は、以下の実施例に制限されるもの
ではない。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転
換、遺伝子の塩基配列決定等一般の遺伝子組換えに必要
な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に
添付されている説明書のほか、実験書（例えば、「Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓ
Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」に基本的に従っ
た。また、イネの寒天培地や土壌を用いた育成、交配、
ゲノムＤＮＡの調製は、実験書（例えば「モデル植物の
実験プロトコール（秀潤社）」）に基本的に従った。

【００３１】（レトロトランスポゾン高頻度転移挿入配
列の単離）発明者らは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１
７による遺伝子破壊変異体を得るために以下の方法を実
施した。カルス誘導は以下に述べる方法で実施した。日
本晴及び台中６５号種籾から籾を手で取り除いた。未熟
なもの、変色したもの、ひび割れのある玄米は省き、充
実した玄米を選び、滅菌操作に移した。滅菌シャーレ内
に玄米を入れ、７０％エタノールにて１分間ロータリー
シェーカーで振とうさせ、表面殺菌を行った。エタノー
ル殺菌後、滅菌水にて表面を洗浄し、１０％次亜塩素酸
ナトリウム溶液にて１時間表面殺菌を行った。カルス誘
導は、以下の表１に示す構成のＭＳ基本培地を使用し
た。

【表１】 ゲル化剤として、ゲランガムを用いた。滅菌後、シャー
レにてプレートを作製した。籾を除去した玄米を表面殺
菌した後、カルス誘導培地プレート上に無菌的に玄米の
胚の部分を上部にし、置床した。プレート上には、５，
６粒の玄米を等間隔に置床した。置床後、３０℃、暗条
件のインキュベーターにて３週間から一ヶ月培養を行っ
た。

【００３２】液体培養は、以下の表２に示す構成のＮ６
基本培地を用いた。

【表２】 培地の液量は、１００ｍｌの三角フラスコ（植物培養用
リム無し）の場合、３０ｍｌ、２００ｍｌ三角フラスコ
の場合は５０ｍｌとした。

【００３３】カルスをＮ６基本培地に移植後、３０℃、
暗条件下で旋回培養（１００ｒｐｍ）を行った。１〜２
週間毎に新しい培地に交換し、継代培養を行った。

【００３４】継代培養後、再分化個体（遺伝子破壊個
体）を得るために、カルスを再分化培地へと移植した。
再分化には、Ｒ２基本培地を使用した。Ｒ２基本培地の
組成を表３に示す。

【表３】 ゲル化剤としてゲランガムを用い、シャーレにてプレー
トを作製した。植物細胞からの再分化は通常植物ホルモ
ンのバランスを変えることが刺激となる。カルス段階の
維持にはオーキシン濃度がサイトカイニン濃度より高い
状態で加えられているが、再分化時には、サイトカイニ
ン濃度がオーキシン濃度より高い状態で加えられること
により植物体が再生する。

【００３５】オーキシンとしてインドール酢酸（ＩＡ
Ａ）、サイトカイニンとしてカイネチン（ｋｉｎｅｔｉ
ｎ）を使用した。ＩＡＡについては、熱に弱いため、ろ
過滅菌し、オートクレーブ後添加した。カルスは、約１
〜２ｍｍの大きさに切断し、再分化培地上に無菌的に置
床した。置床後、３０℃、６０００Ｌｘの連続照明下で
培養した。２週間後、グリーンスポット（緑点）が観察
された。グリーンスポット及び白色カルスを再分化培地
上に移植した。カルスの移植は２週間毎に行った。芽が
２ｃｍ程度に生育したら、付着した寒天培地を除去後、
ホルモンフリーのＲ２基本培地（培養用丸ポット）に移
植した。

【００３６】再生された植物体を土壌に移植する際、培
地容器内の環境から外部の栽培環境に適応できるように
馴化を行った。植物体が丸ポットの蓋につくまで生育さ
せた後、植物体に付着した寒天培地を水道水で洗浄、除
去した後、５０％のバーミキュライトと５０％くみあい
肥鉄培土（水田土）を混合したミニポットに移植した。
Ｔｏｓ１７の転移により破壊された遺伝子を分離するた
めに、公知のＴｏｓ１７の配列（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ９３：７７８３−７７８８（１９９６））
に基づいて作製したＰＣＲプライマーを用いて、ＴＡＩ
Ｌ−ＰＣＲ（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｗｈｉｔｔｅｒ，ＧＥＮＯ
ＭＩＣＳ ２５：６７４−６８１（１９９５））を行っ
た。具体的には、Ｔｏｓ１７の挿入部位に隣接するゲノ
ムＤＮＡ領域を増幅することができる３種類のＰＣＲプ
ライマー配列番号４、配列番号５、及び配列番号６を合
成し、これらを用いて、Ｔｏｓ１７挿入部位に隣接した
ゲノムＤＮＡをＴＡＩＬ−ＰＣＲ法を用いて増幅させ、
アガロース電気泳動で調べた。該断片をベクターにサブ
クローニング（ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉ
ｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）し、塩基配列の決定を行
ったところ、Ｔｏｓ１７の３’ＬＴＲ側の配列とそれに
続く染色体ゲノムＤＮＡと思われる領域を含んでいた。
次に、該断片についてデータベース解析（http://www.n
cbi.nlm.nih.gov:80/））を行ったところ、染色体ゲノ
ムＤＮＡと思われる領域の一部に、「ＮＢＳ−ＬＲＲ様
病害抵抗性遺伝子」と相同性が見られた。すなわち、解
析した再分化体のうち、同一の病害抵抗性遺伝子内の異
なった位置にＴｏｓ１７が転移した系統（Ｎ（日本晴）
４−３＃５）が存在した。そのゲノム遺伝子断片４００
１ｂｐの塩基配列を配列番号１に記載した。

【００３７】本発明者らが、単離した遺伝子のゲノム領
域の０位と1位との間、あるいは２７５８位と２７５９
位の間において、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿
入が確認された。データベースの検索により、いくつか
の「ＮＢＳ−ＬＲＲ様病害抵抗性遺伝子」と高い相同性
が認められた。例えば、イネから単離されたＹＲ３８
（Ｙａｎｇ，Ｑ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｐｕｂｌｉ
ｓｈｄ（２０００））と９９％の相同性を、大麦から単
離されたｂ５（Ｌｅｉｓｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：
３７０−３７５（１９９８））と６４％の相同性を示し
た。

【００３８】ＮＢＳ−ＬＲＲ様病害抵抗性遺伝子領域に
転移挿入している他の系統に関しても、同様の手法を用
いて調べた。Ｎ４−３＃３６系統のゲノム遺伝子断片１
０７８ｂｐの塩基配列を配列番号２に記載した。Ｔｏｓ
１７の挿入は、３６８位と３６９位の間において確認さ
れた。この配列は、大麦から単離されたｂ８（Ｌｅｉｓ
ｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３７０−３７５（１９９
８））と６１％の相同性を示した。Ｔ（台中６５号）４
−７＃３８系統のゲノム遺伝子断片４３１ｂｐの塩基配
列を配列番号３に記載した。Ｔｏｓ１７の挿入は、４３
１位の後に確認された。この配列は、大麦から単離され
たｂ９（Ｌｅｉｓｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３７
０−３７５（１９９８））と６７％の相同性を示した。

【００３９】このように、発明者らが調製したＴｏｓ１
７による遺伝子破壊変異体ライブラリーにおいては、全
変異個体のうち、７％である３系統においてＮＢＳ−Ｌ
ＲＲ様病害抵抗性遺伝子領域へのＴｏｓ１７の転移挿入
が観察された。以上の結果から、このようなＤＮＡ配列
領域を本発明の高頻度転移挿入配列として利用すれば、
転移性遺伝因子の移動活動の活性化を把握することがで
きることがわかった。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、転移性遺伝因子の移動
活動の活性化を検出できる。

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA TOYOTA CHUO KENKYUSHO <120> Method of producing mutants <160> 6 <210> 1 <211> 4001 <212> DNA <213> RICE (Oryza sativa) <400> 1 aaggcgagga tggcttttcg gacgggctac aggagcatct tcgacagtgt tttcgcgcta 60 acatgttggc tgctgtggaa agaatgcaat gcgcgtgtct ttgaacagaa atttcgaagc 120 atagaacagc ttgtgcaaga tatcaaggaa gaggccattg tctggaagac gacaggagtg 180 ttcacaacgt gcaatagcga gatcacgtaa tatgcattgt aatctgtaga agttttctag 240 cttaccgggt cagggctttt gccccaatct gttttcgaca gcatactgtc gttgtaagct 300 ctttaattgt attgtaccct tcctttctta atgaaattgg tcgaccgaac ctttcggctg 360 acccggcaaa aaaaaaagga aaacataata aagctgttaa caagtgggaa acctagtgat 420 ctaggtgttc tgccattagt tggtgtcggt ggtgttggga aaacaacgct tgctagattt 480 gtataccatg atgaaagaat caaagaacat tttgatttgc gaatgtgggt ttgtgtatct 540 gattatttca gtgaagagag actaacacac gagatgttag aggtcctgtg taaagataga 600 tgaggttatg aaaatataac cagttttgat gcactgcagg agagcctttt agataaaatt 660 agacacaaaa gatttctgct tgtattggat gatatctggg aagataagga caggagcaga 720 tgggataagc tgttagctcc actaagattt aatgaagcaa atggttgcat gattttagca 780 acaactcaaa ggacatcggt tgcaagaatg ataggaacaa tgcataaggt tgaagtgaat 840 ggcctgagtg acacagagtt ttggttgctc ttcaaagcat gggctttttt tggtaacgag 900 aaccaggagc atgatccaac tatgcagtcc attgggcaac acattgctaa agcactaaag 960 ggcaatccac tggctgcacg gagtgttggt gctcttctaa acaggaatgt tggctatgag 1020 cactggagga aagttcagta caaatggaga tatcttctag aacaggatga tgatattcta 1080 accatcttga agttcagtta tgaatttcta ccggtccacc tgcagcagtg tttctcatac 1140 tgctcactgt ttccaaagga tcacaaactt agaggggaaa atttggtccg tgcttgggta 1200 tcacaaaatt ttgtggagtg cgaatgccat tccaagagat tggaggaaac agggaagcaa 1260 tatttggata atttagttga ttggggcttc ctcgaagagg ttgagtcaca ctacattatg 1320 catgacttaa tgcatgactt ggcagaaaag gtttcatcaa atgagtgtgc tattatagat 1380 ggattgggat ctaagaatat accaccaaat gtccgtcatt tgtcaatcat aactactgct 1440 tatgatgaga aacgatcttg cgattttcct agtagtgaga agtttgagaa catactacat 1500 aagatcgtgc ctttgcaaaa actcaggacc ttgatgttct ttggtgaaag cagcataatg 1560 ttattaagat ccttacatac tttatgcaag gagtcaaaag gtttacgatt actacggata 1620 tatgtgacag ctgatgacat atgcactaca cacaatttgt tgaatccgta tcatcttcgc 1680 tatgttgaat tcattgttgt cccgaccacg aatatttttg gatctctaga ttttgtaaat 1740 actcctattc ctcaagcttt gacaaaattt taccacctcc aagtgttgga tgctagcagt 1800 cgagtcaatc ttgtggtacc aactgatatg aataatctcg ttaatttacg tcatcttatt 1860 gctcacgaga aagtgcactc aacgattgct ggtgttgcaa cttggcctct cttcaggaac 1920 tgatattcaa agttcaagat gctagtaatt tcaatatagg acaacttcga tctatgaatg 1980 agctcgtaat acttggaatt tctcaacttg aaaatgtgaa aactaaagaa gaagccaaga 2040 gcgcaagatt gattgataaa gagcatcttc aagagttgtc gttgtcatgg gatgataaaa 2100 acatgaactc tggacctact gcagagaaaa caagagacgg tgtgtttgag ggtcttgagc 2160 cacaccacaa cctcaaacac ctacagttga ctcgatacag tggtgctaca tcgccaacct 2220 ggcttgccag taacgttaag tcactgcagg tacttcatct agagaactgt agagaatggc 2280 aaattattaa ctctcttgaa atgcttccag tacttaggaa gttgaagtta atcaggatgt 2340 ggaatttgat gtcagtctca attccttctt atttggaaga gttgatctta gttaatacac 2400 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agatcacctt gtcctcccat ctctcaggtt tctcaaaatt tcctcgtgtg gcatagtagg 3300 tagatggcta acacaaatgc ttccccatct gctgtccctt gaaacttttt atnatcggac 3360 tgtccacaga taaattgctg tcaatcaacc aaccaacaga aacagaagca accagcagtt 3420 tggcttcagt agagacagcc tcatctaggg atgaacagat tctgaaaatt ccatgcaatc 3480 tccttcgttc tctaaagtgg ttgcgaattt gggaatgtgc agacctggaa ttttctggag 3540 tcaatagagg attttcagga ttcacctctc ttgtgatgct acaaattagg gaatgcccca 3600 agctggtatc atcattggtg accgaaacaa atgatactaa tgtattacta ccacagtcac 3660 ttgaacatct tgatatcggt cctcttccag caaacctgca gtcctacttt cctaaaggcc 3720 tgccctgcct caagaagtta agcctaaata gcggcgaata tttgaagtct gtacaattgc 3780 attcatgttc gggtttggag tatttgcaga tactcgcggt gtccacacct tagtgtgttg 3840 gagggcctgc agcacctcag ctcccttcga agattatgca tccagatgaa tcctgagctg 3900 tccgctgcat gggatcttaa actgtttcct actgtcactt gtagaacttg gggtcagaaa 3960 agtcgagggc agcttccatt cccgctctct gtaccttccc a 4001 <210> 2 <211> 1078 <212> DNA <213> RICE (Oryza sativa) <400> 2 tattattaag tgcacactac cagatggtaa tagttgcagc agaatactga tcacgacaga 60 aattgaggat ctagctctgc aatcttgtgg ttatgagtcg aactatattt tcaagatgaa 120 accacttagt gaggatgact caagaaattt atttttcagt acagtttttg gttctcattc 180 taattgtcct ccagaactct gtgaagtttc gtatgatatt gtaaggaaat gtggtggttt 240 gccgctagcc gttgtcacta ttgcaagcct cttagcaact cagcttgaga aacatgagca 300 atgggattat ataaacgaga ccttaggtta cagtttgatg gcaaatccta atttggaagg 360 gatgaaacaa ctattgaacc tttgttacaa cagtcttcct cagcatttga aggcatgcat 420 gttatatctc agaatgtacc aagagaatag cataatttgg aaggatgatt tggtgaatca 480 atggatagct gaaggtttca tctgtcctag tgaagggcat gaaaaggaag aaatttcaag 540 agcctatttc agtgagcttg ttgatagaaa atttatccag cctgtacata tcaatgacaa 600 tggtgaggtt ttgtcttgtg tggttcacca tatggtactc aatcttatta catacatgtc 660 aacagaagaa aattttgcta ttgcaataga ccacacacaa gcgactacaa ggctcgctga 720 caaggttcga cgattatcta ttcacttcgg taatgtagag gatgcaactc caccaactaa 780 tatgagactg tctcaagttc ggacacttgc cttttgcggg gtcttgaatt gtatgccttc 840 tattacgggg tttcaacttc ttaaagttct aattctacat ttctgcggtg atgaggacag 900 catcagtttt gatactcact gaaatttcgg aacttgtccg actgagatat ttgaaggtca 960 cctccaatat caccttaaaa atgccaaccc atatgcaagg tctacaatat ttggaggcta 1020 ctgaaaatag aggaaaaata gatgcagttc catcagacat cgttcatgtc actcggcg 1078 <210> 3 <211> 431 <212> DNA <213> RICE (Oryza sativa) <400> 3 gcaatgcttt gcgttctgtg caattttccc ccaagattac gagatggtta aagacgaact 60 aatccaacta tggatggcaa atggttttat tcaagaagag gagaacatgg atttgacaca 120 taaaggagaa atgatcttcc atgatttggt atggagatcg ttcctccaag acgtgaaaga 180 ggagttcata atcggttatc actgtgattc aattgtctgt aaaatgcatg atttaatgca 240 tgacctagca aaagatgtta ctgatgaatg tgctagtaca acaaaagagt tggatcagct 300 gaaaggctcg ataaaagatg tccgtcactt gcgaattcct gaagaaatgg aagaaacgat 360 gaccgagtta ttcaaaggca catcatctct gcatactctg atagatcaat catggcgatc 420 aacattatgg a 431 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 4 actgtatagt tggcccatgt ccag 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 5 cccatcggat gtccagtcca ttgg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 6 gctaatacta ttgttaggtt gcaa 24

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における、高頻度転移挿入配列とレポー
ター遺伝子配列とプロモーター配列の配列状態の一例を
示す図である。

【図２】本発明における、高頻度転移挿入配列とレポー
ター遺伝子配列とプロモーター配列の配列状態の他の一
例を示す図である。

【図３】本発明における、高頻度転移挿入配列、レポー
ター遺伝子配列、及びプロモーター配列の配列状態の他
の一例を示す図である。

【図４】本発明における、高頻度転移挿入配列、レポー
ター遺伝子配列、及びプロモーター配列の配列状態の他
の一例を示す図である。

【図５】本発明における、高頻度転移挿入配列、レポー
ター遺伝子配列、及びプロモーター配列の配列状態の他
の一例を示す図である。

【図６】本発明における、高頻度転移挿入配列、レポー
ター遺伝子配列、及びとプロモーター配列の配列状態の
他の一例を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 宮崎 力 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 平井 正名 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD14 CD21 2G045 AA31 BB20 BB50 CB01 CB20 DA12 DA13 4B024 AA08 AA11 BA07 CA03 CA04 DA01 DA06 EA04 FA02 GA11 GA17 GA19 HA01 HA12 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ04 QQ09 QQ22 QQ30 QQ42 QR58 QR60 QR66 QR69 QS05 QS24 QX01 QX02 4B065 AA26X AA88X AA88Y AB01 AC14 AC20 BA01 BA25 CA46 CA53

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】転移性遺伝因子の高頻度転移挿入配列と、
   この配列の近傍に配置されるレポーター遺伝子をコード
   する配列と、このレポーター遺伝子に作用可能に配置さ
   れるプロモーター配列とを有する、植物細胞。
2. 【請求項２】請求項１記載の植物細胞におけるレポータ
   ー遺伝子の発現を検出する工程を備える、転移性遺伝因
   子の活性化検出方法。
3. 【請求項３】請求項１記載の植物細胞におけるレポータ
   ー遺伝子の発現を検出する工程と、 前記検出により、レポーター遺伝子の発現が抑制された
   植物細胞を選択する工程、とを備える、植物の変異体の
   製造方法。
4. 【請求項４】転移性遺伝因子の高頻度転移挿入配列と、
   この配列の近傍に配置されるレポーター遺伝子をコード
   する配列と、このレポーター遺伝子に作用可能に配置さ
   れるプロモーター配列とを有する、コンストラクト。
5. 【請求項５】転移性遺伝因子の高頻度転移挿入配列と、
   この配列の近傍に配置されるレポーター遺伝子をコード
   する配列と、このレポーター遺伝子に作用可能に配置さ
   れるプロモーター配列、とを有する植物細胞を培養し
   て、レポーター遺伝子の発現を検出する工程と、 前記検出に基づいて、植物細胞を選択する工程と、 前記選択した植物細胞を再分化して植物体を再生する工
   程、とを備える、植物変異体の製造方法。
6. 【請求項６】前記高頻度転移挿入配列は、ＮＢＳ−ＬＲ
   Ｒ様病害抵抗性遺伝子の少なくとも一部である、請求項
   ５記載の製造方法。