JP2002223749A - 新規酸性プロテアーゼ - Google Patents
新規酸性プロテアーゼInfo
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Abstract
て低分子のペプチドを容易に製造することができ、例え
ば、生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、
飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有
用な新規酸性プロテアーゼを提供すること。 【解決手段】 イカ肝臓由来の新規酸性プロテアーゼ。
Description
のペプチド結合鎖に作用して低分子のペプチドを容易に
製造することができ、例えば、生理活性ペプチドとして
の利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その他のプロテ
アーゼ利用分野において有用な酸性プロテアーゼに関
し、更に詳しくは、イカ肝臓由来の新規酸性プロテアー
ゼに関する。
のペプチド結合を加水分解する一群の酵素であり、これ
まで微生物由来、動植物由来の種々の酵素が開発され、
飲食品分野、医薬品分野、その他の分野で有効に利用さ
れてきた。例えば、飲食品分野においては呈味の改善、
物性の改善等に利用され、また、医薬品分野においては
生理活性ペプチドの生産、生体の生理作用の制御等に利
用されている。
質のC末端、もしくはN末端のペプチド結合から順に作
用してアミノ酸を1個ずつ切り離していくエキソ型ペプ
チダーゼと、タンパク質分子内部のペプチド結合鎖に作
用して低分子のペプチドを生産するエンド型ペプチダー
ゼの2つに分類され、動物の筋肉中等に存在するカテプ
シン系の酵素群の中で、カテプシンB、L、HおよびD
はこのエンド型ペプチダーゼに属する。
シン系の酵素についてはこれまで種々の検討がなされ、
例えば、イカ肝臓中に存在するカテプシンBの精製およ
びその性質(Agric.Biol.Chem.,40
(6),1159−1165(1976))、イカ外套
膜中に存在するカテプシンD様のプロテアーゼの精製
(Comp.Biochem.Physiol.,68
B(3),389−395(1981)、同,70B
(4),791−794(1981)、同,75B
(3),409−414(1983))、イカ消化腺中
のカテプシンDの精製およびその性質(J.Sci.F
ood Agric.,39,85−94(198
7))、イカ塩辛熟成中の組織の軟化に及ぼすカテプシ
ンの影響(日本水産学会誌,59(9),1625−1
629(1993))などが報告されている。
業および医薬品分野等で利用できる生理活性ペプチドを
安全かつ効率よく得ることができる、新規な酸性プロテ
アーゼの開発が望まれている。
肝臓より得られる新規酸性カルボキシペプチダーゼおよ
び該酸性カルボキシペプチダーゼを用いた蛋白質加水分
解物の呈味改善方法について提案した(特許第2901
207号公報、特開平7−115913号公報参照)。
さらに鋭意研究を重ねた結果、イカ肝臓中に上記酸性カ
ルボキシペプチダーゼ以外に新規な酸性のエンド型プロ
テアーゼが存在し、該酸性プロテアーゼが生理活性ペプ
チドとしての利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その
他のプロテアーゼ利用分野において有用であることを見
いだし本発明を完成するに至った。
有する新規な酸性プロテアーゼを提供するものである。 (1)酵素作用:タンパク質分子内部のペプチド結合鎖
に作用して、低分子のペプチドを生産するエンド型プロ
テアーゼである。 (2)基質特異性:酸性条件下において乳カゼイン、ヘ
モグロビン、牛血清アルブミンおよび糖蛋白質である卵
白アルブミンを良く分解する。また、カテプシンDの特
異的基質の1つであるMOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-
Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2(J. Biochem.,12
5(6),1137−1143(1999))をPhe- -
Pheの間で切断し、蛍光強度を増加させる。さらにb-セ
クレターゼの特異的基質の1つであるMOCAc-Ser-Glu-Va
l-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH
2(J. Biochem.,126(1),235−242(1
999))を分解し、蛍光強度を増加させる。カイネテ
ィクパラメーター(kcat/Km)は、基質のP1位が疎水
性のアミノ酸である場合が高い値を示す。 (3)至適pH:カゼインを基質としたときの至適pH
が2.4であり、ヘモグロビンを基質としたときの至適
pHが3.0である。また、MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Le
u-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2を基質とした
場合、至適pHは3.0であり、pH6.0においても
約50%の活性を示す。 (4)安定pH範囲:pH2〜6のpH域で安定である
(基質としてヘモグロビンを用いて測定)。 (5)至適温度:30℃である(基質としてカゼインを
用いて測定)。 (6)安定温度範囲:20〜50℃の温度範囲で安定で
ある(基質としてカゼインを用いて測定)。 (7)55℃、10分の加熱でほぼ完全に失活する(基
質としてカゼインを用いて測定)。 (8)阻害剤:ペプスタチン(Pepstatin)A
により完全に阻害され、1,2−エポキシ−3−(p−
ニトロフェノキシ)−プロパン(EPNP)およびジア
ゾアセチル−DL−ノルロイシンメチルエステル(DA
N)により約50%の活性が阻害される。 (9)相対分子質量:36.5キロダルトン(kDa)
である(SDS−PAGEによる)。 (10)等電点:8.30である(等電点電気泳動によ
る)。 (11)N末端アミノ酸配列:A-P-T-P-E-P-L-S-N-Y-L-
D-A-Q-Y-Y-G-V-I-S-I-G-T-P-A-Q-N-F-K-V-V-F-Dで示さ
れ、各種カテプシンDと高い相同性を有する。例えば、
ミバエ(Drosophila melanogaster)のカテプシンDとは8
4%、ヒトのカテプシンDとは63%の相同性がある。
以下、本発明の酵素の製法、理化学的性質等につい
て、更に詳細に説明する。
プロテアーゼはイカ類の肝臓から採取することができ、
採取することのできるイカ類としては、例えば、アカイ
カ、スルメイカ、マイカ、アオリイカ、ヤリイカ、ケン
サキイカ、コウイカ、ヒナイカ、ミミイカ、ホタルイ
カ、ドスイカ、ダイオウイカ、ソデイカ等の各種のイカ
類を挙げることができるが、殊に、肝臓重量が大きく、
また水揚げ量が多いスルメイカ、アカイカ及びマイカが
好適である。これらのイカ類の肝臓は、生鮮品、冷凍品
及び塩蔵品のいずれも利用することができる。
ゼを分離採取する方法としては、例えば、生鮮イカまた
は冷凍イカの肝臓を分別し、これを磨砕処理した後、磨
砕物1重量部に対して通常約3〜約20重量部、好まし
くは約5〜約10重量部の水もしくはpH約3〜6の緩
衝液を加えて攪拌抽出し、好ましくは抽出液を再度pH
約3〜4に調整した後、得られる抽出水層部を遠心分離
し、脂肪を分離除去し、更にこの水層部をケイソウ土、
セルロースなどの濾過助剤を用いて濾過し、清澄な粗酵
素液を得る方法を例示することができる。得られる粗酵
素液は、場合により、凍結濃縮、減圧濃縮、限外濾過な
どの適宜な濃縮手段を用いて、該酵素の活性低下をきた
さない温度、例えば、約50℃以下の温度で濃縮するこ
とにより粗酵素液濃縮物とすることができる。この濃縮
物はそのまま粗酵素として利用することができるが、更
に望ましくは該濃縮物を直接あるいはデキストリン類な
どの適当なバインダーを添加した後、真空乾燥、凍結乾
燥等によって乾燥粉末化することが保存上有利である。
析、陽イオン交換樹脂、例えば、Resource
S、S Sepharose(ファルマシアバイテク社
製)など、あるいは疎水性カラム、例えば、Pheny
l Sepharose 6FF(ファルマシアバイテ
ク社製)などで分離・溶出し、この溶出液について、例
えば、Superose 12、Superdex 7
5(ファルマシアバイテク社製)などのゲル濾過カラム
を用いて活性画分を分取し、単一成分として分離精製す
ることができる。
アーゼは、タンパク質分子内のペプチド結合鎖に作用し
て低分子のペプチドを生産するエンド型プロテアーゼで
あり、イカ肝臓から初めて見いだされた新規な酵素であ
る。
的性質について説明する。
子のペプチドを生産するエンド型プロテアーゼである。
て作用した結果、図1に示すように低分子のペプチドに
分解した。また、糖蛋白質である卵白アルブミンに作用
した結果、低分子化していることが確認された。さらに
アミロイドb-タンパク質(1〜42)残基に該酸性プロ
テアーゼを作用した結果、図2のHPLCクロマトグラ
ムが示すように3本のペプチド鎖に分解した。
アルブミンおよび糖蛋白質である卵白アルブミンを良く
分解した。また、カテプシンDの特異的基質の1つであ
るMOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dn
p)-D-Arg-NH21mgをDMSO570mlに溶解し、1mM
の基質溶液とし、Buffer980mlに上記保存液
を加え、酵素活性を蛍光強度の増加(Ex=328n
m、Em=398nm)により測定した。その結果、MO
CAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D
-Arg-NH2をPhe- -Pheの間で切断し、蛍光強度を増加さ
せた。さらにb-セクレターゼの特異的基質の1つである
MOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys
(Dnp)-Arg-Arg-NH2を分解し、蛍光強度を増加させた。
カイネティクパラメーター(kcat/Km)は、基質のP1
位が疎水性のアミノ酸である場合が高い値を示した。
よびカゼインを用い、pHはそれぞれの基質について2
種類の緩衝液にてpH1〜3.5の範囲で測定を行い相
対活性を求めた。その結果を図3に示すが、基質として
カゼインを用いたときの至適pHは2.4であり、基質
としてヘモグロビンを用いたときの至適pHは3.0で
あった。この至適pHより本発明の酸性プロテアーゼは
カテプシンDに属する酵素であることが推測された。
用い、pHは5種類の緩衝液にてpH1〜9の範囲での
安定性を調べた。その結果を図4に示すが、本発明の酸
性プロテアーゼはpH2〜6の範囲で約80%の活性を
維持し、pH7においても50%以上の活性を示した。
(pH2.4)、至適温度の測定を行った。その結果を
図5に示すが、基質としてカゼインを用いたときの至適
温度は30℃であった。
(pH2.4)、10〜70℃で10分および30分で
の残存活性を測定した。その結果を図6に示すが、10
分の反応では20〜50℃まで約80%の活性を示した
が、30分の反応では50℃で50%以下の残存活性で
あった。
は55℃、10分の加熱で行えることがわかった。
のプロテアーゼ阻害剤の影響を調べた。反応条件は基質
としてヘモグロビン溶液を用い、pH3.0、5℃にて
24時間(EPNPおよびDANは48時間)反応し、
プロテアーゼ阻害剤を添加していないものの酵素活性と
の比較を行った。その結果を下記表1に示す。
の酵素活性で、表中の活性はこのコントロールを100
としたときの相対活性で示す。
キシ)−プロパン DAN:ジアゾアセチル−DL−ノルロイシンメチルエ
ステル EDTA:エチレンジアミン四酢酸 EGTA:エチレングリコール−ビス−b−アミノエチ
ルエーテル E−64:L-3-トランスカルボキシラン-2-カルボニル-
L-ロイシル-アグマチン NEM:N−エチルマレイミド PCMB:パラクロロマーキュリー安息香酸 PMSF:フェニルメタンスルフォニルフルオライド APMSF:4−(アミヂノフェニル)メタンスルフォ
ニルフルオライド TLCK:トシルリジルクロロメタン ZPCK:ベンジロキシカルボニルフェニルアラニルク
ロロメタン TPCK:トシルフェニルアラニルクロロメタン この結果より、本発明の酸性プロテアーゼはペプスタチ
ンAにより完全に阻害され、EPNPおよびDANによ
り半分以下の活性が阻害されたことから、本発明の酸性
プロテアーゼは活性中心にアスパラギン酸残基を有する
アスパルティックプロテアーゼであることがわかる。ま
た、他のプロテアーゼ阻害剤によってはほとんど阻害を
受けなかった。さらに、ペプスタチンAの濃度の変化に
よる阻害活性の影響(反応時間:30分)について測定
した結果を図7に示し、EPNPおよびDANによる本
発明の酸性プロテアーゼの阻害を経時的に測定した結果
を図8に示すが、30分の反応ではペプスタチンAの濃
度が1mM以上で完全に酵素活性が阻害され、EPNP
およびDANによる阻害は72時間までの測定で経時的
に阻害されてくる傾向が確認された。図8の結果から、
EPNPと比較してDANによる阻害がつよいことから
本発明の酸性プロテアーゼはカテプシンDであると予測
される。
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドスクラブゲ
ル電気泳動法(SDS−PAGE)(Nature22
7,680,1970)により求めたところ、図9に示
した如く36.4kDaであった。
酸性プロテアーゼの等電点は図10に明らかな如く、
8.30であった。
テインシークエンサーにより解析し、その結果を図11
に示す。図11に示す33残基のアミノ酸配列が確認さ
れ、この33残基の分子量は約4.2kDaとなり、全
分子の約1/8.7である。このアミノ酸配列を用い
て、BLASTによるホモロジー検索を試みた結果、本
酵素のN末端アミノ酸配列は各種のカテプシンDと非常
に高い相同性をもつことが確認された。例えば、ミバエ
(Drosophila melanogaster)のカテプシンDとは84
%、ヒトのカテプシンDとは63%の相同性がある。こ
の結果より、本発明の酸性プロテアーゼはカテプシンD
に属することが確認された。
に説明する。
(北海道産)600gを添加し、pH4.0に調整して
充分にかき混ぜた後、30℃で2時間静置した。次にデ
カント分離により水層部を得た。この水層部をセライト
濾過し、抽出液3750gを得た。この抽出液のpH
3.0における0.6%ミルクカゼイン溶液を基質とす
る酵素活性を測定した結果、2.56(nkat/m
l)であった(以下、この抽出液を「酸性プロテアーゼ
1」と称する)。
限外濾過により濃縮し、濃縮液687gを得た。この濃
縮液の酵素活性を測定した結果、13.1(nkat/
ml)であった(以下、この抽出液を「酸性プロテアー
ゼ2」と称する)。
酸アンモニウム120.9gを加え、かき混ぜて溶解し
た後、4℃で 15時間静置した。次いで、遠心分離に
より不溶物を除き分離液802gを得た。この分離液に
硫酸アンモニウム257.7gを加えて溶解し、4℃で
15時間静置して塩析処理をおこない析出物35.7g
を得た。この析出物をpH4.0の20mM酢酸緩衝液
45gに溶解し、得られた溶液を透析チューブ(Uni
on Carbide corp.)を用いて同じ緩衝
液で透析処理して脱塩したその結果、酵素液122.4
gを得た。この酵素液の酵素活性を測定した結果、6
4.9(nkat/ml)であった。
(ニュージーランド産)600gを添加し、pH4.0
に調整して充分にかき混ぜた後、30℃で2時間静置し
た。次にデカント分離により水層部を採取し、ケイソウ
土濾過して濾液2800gを得た。この濾液を減圧下に
濃縮して濃縮液900Kgを得た。この濃縮液の酵素活
性は7.2(nkat/ml)であった。
ゼは、酸性域でカゼイン、ヘモグロビン、コラーゲンな
どのタンパク質、ペプチドを選択的に分解する基質特異
性を有し、ペプチドを容易に製造することができ、例え
ば、生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、
飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有
用である。
示す図である。
作用を示す図である。
る。
る。
ある。
1)
ゼは、酸性域でカゼイン、ヘモグロビンコラーゲンなど
のタンパク質、ペプチドを選択的に分解する基質特異性
を有し、ペプチドを容易に製造することができ、例え
ば、生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、
飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有
用である。
Claims (1)
- 【請求項1】 次の理化学的性質を有する酸性プロテア
ーゼ。 (1)酵素作用:タンパク質分子内部のペプチド結合鎖
に作用して、低分子のペプチドを生産するエンド型プロ
テアーゼである。 (2)基質特異性:酸性条件下において乳カゼイン、ヘ
モグロビン、牛血清アルブミンおよび糖蛋白質である卵
白アルブミンを良く分解する。また、カテプシンDの特
異的基質の1つであるMOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-
Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2をPhe- -Pheの間で切
断し、蛍光強度を増加させる。さらにb-セクレターゼの
特異的基質の1つであるMOCAc-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-As
p-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH2を分解し、
蛍光強度を増加させる。カイネティクパラメーター(kc
at/Km)は、基質のP1位が疎水性のアミノ酸である場
合が高い値を示す。 (3)至適pH:カゼインを基質としたときの至適pH
が2.4であり、ヘモグロビンを基質としたときの至適
pHが3.0である。また、MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Le
u-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2を基質とした
場合、至適pHは3.0であり、pH6.0においても
約50%の活性を示す。 (4)安定pH範囲:pH2〜6のpH域で安定である
(基質としてヘモグロビンを用いて測定)。 (5)至適温度:30℃である(基質としてカゼインを
用いて測定)。 (6)安定温度範囲:20〜50℃の温度範囲で安定で
ある(基質としてカゼインを用いて測定)。 (7)55℃、10分の加熱でほぼ完全に失活する(基
質としてカゼインを用いて測定)。 (8)阻害剤:ペプスタチン(Pepstatin)A
により完全に阻害され、1,2−エポキシ−3−(p−
ニトロフェノキシ)−プロパン(EPNP)およびジア
ゾアセチル−DL−ノルロイシンメチルエステル(DA
N)により約50%の活性が阻害される。 (9)相対分子質量:36.5キロダルトン(kDa)
である(SDS−PAGEによる)。 (10)等電点:8.30である(等電点電気泳動によ
る)。 (11)N末端アミノ酸配列:A-P-T-P-E-P-L-S-N-Y-L-
D-A-Q-Y-Y-G-V-I-S-I-G-T-P-A-Q-N-F-K-V-V-F-Dで示さ
れ、各種カテプシンDと高い相同性を有する。例えば、
ミバエ(Drosophila melanogaster)のカテプシンDとは8
4%、ヒトのカテプシンDとは63%の相同性がある。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001021556A JP4717225B2 (ja) | 2001-01-30 | 2001-01-30 | 新規酸性プロテアーゼ |
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---|---|---|---|
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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JP4717225B2 JP4717225B2 (ja) | 2011-07-06 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001021556A Expired - Lifetime JP4717225B2 (ja) | 2001-01-30 | 2001-01-30 | 新規酸性プロテアーゼ |
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---|---|
JP (1) | JP4717225B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102392010A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-03-28 | 华南农业大学 | 以鱿鱼内脏为原料提取得到的蛋白酶及其提取方法与应用 |
-
2001
- 2001-01-30 JP JP2001021556A patent/JP4717225B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6010071897, 水産大学校研究報告, 1999, Vol.47 No.3, p.121−127 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102392010A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-03-28 | 华南农业大学 | 以鱿鱼内脏为原料提取得到的蛋白酶及其提取方法与应用 |
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---|---|
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