JP2002218978A - 核酸遊離方法 - Google Patents
核酸遊離方法Info
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- JP2002218978A JP2002218978A JP2001013606A JP2001013606A JP2002218978A JP 2002218978 A JP2002218978 A JP 2002218978A JP 2001013606 A JP2001013606 A JP 2001013606A JP 2001013606 A JP2001013606 A JP 2001013606A JP 2002218978 A JP2002218978 A JP 2002218978A
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- virus
- nucleic acid
- surfactant
- substance
- releasing
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ウィルスの核酸をウィルス本体から遊離さ
せる方法及び遊離したウィルスを直接検出方法の提供。 【解決手段】 ウィルス含有生体試料と界面活性作用
を含有する物質とを液状媒体中で接触させることを特徴
とするウィルスの核酸遊離方法並びに得られる核酸遊離
液の核酸増幅法によるウィルス核酸検出方法。
せる方法及び遊離したウィルスを直接検出方法の提供。 【解決手段】 ウィルス含有生体試料と界面活性作用
を含有する物質とを液状媒体中で接触させることを特徴
とするウィルスの核酸遊離方法並びに得られる核酸遊離
液の核酸増幅法によるウィルス核酸検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウィルスの核酸を
ウィルス本体から遊離させる方法および遊離したウィル
スを直接検出する方法に関する。
ウィルス本体から遊離させる方法および遊離したウィル
スを直接検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウィルスから核酸を遊離する方法として
は、飽和濃度に近いグアニジン塩酸塩、イソチオシアン
酸塩、ヨウ化ナトリウムのような高濃度カオトロピック
試薬を使用するのは一般的である。これらカオトロピッ
ク試薬は、タンパク質を変性させ、可溶化することによ
り、核酸の遊離を実現する。これらカオトロピック試薬
は、その飽和濃度とほぼ同一レベルになるほど高い濃度
で使用されるため、得られる核酸遊離液の中には遊離さ
れたウィルス核酸以外に、ウィルス膜、タンパク質等多
くの可溶性組成も含まれる。従って、核酸遊離液を再度
精製し、不要な可溶性蛋白等の除去をしなければ、ＰＣ
Ｒのような酵素反応に基づく核酸増幅法を適用できなか
った。核酸遊離液の精製方法としては、フェノールによ
り夾雑物を変性させて沈殿させ、水相に核酸を回収する
フェノール−クロロホルム抽出法や、核酸をシリカビー
ズに吸着させる方法、限外ろ過、カラムクロマトグラフ
ィー等があるが、いずれ操作に手間暇がかかり、大量多
数検体の迅速処理に不向きである。
は、飽和濃度に近いグアニジン塩酸塩、イソチオシアン
酸塩、ヨウ化ナトリウムのような高濃度カオトロピック
試薬を使用するのは一般的である。これらカオトロピッ
ク試薬は、タンパク質を変性させ、可溶化することによ
り、核酸の遊離を実現する。これらカオトロピック試薬
は、その飽和濃度とほぼ同一レベルになるほど高い濃度
で使用されるため、得られる核酸遊離液の中には遊離さ
れたウィルス核酸以外に、ウィルス膜、タンパク質等多
くの可溶性組成も含まれる。従って、核酸遊離液を再度
精製し、不要な可溶性蛋白等の除去をしなければ、ＰＣ
Ｒのような酵素反応に基づく核酸増幅法を適用できなか
った。核酸遊離液の精製方法としては、フェノールによ
り夾雑物を変性させて沈殿させ、水相に核酸を回収する
フェノール−クロロホルム抽出法や、核酸をシリカビー
ズに吸着させる方法、限外ろ過、カラムクロマトグラフ
ィー等があるが、いずれ操作に手間暇がかかり、大量多
数検体の迅速処理に不向きである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来のカオトロピック
試薬を用いた核酸の遊離法における煩雑工程を回避し、
ウィルス核酸を簡単な方法で短時間操作にウィルス本体
から遊離させ、得られる核酸遊離液を精製工程なしでＰ
ＣＲ反応に使用できる効率的かつ簡便な手段が必要とさ
れていた。
試薬を用いた核酸の遊離法における煩雑工程を回避し、
ウィルス核酸を簡単な方法で短時間操作にウィルス本体
から遊離させ、得られる核酸遊離液を精製工程なしでＰ
ＣＲ反応に使用できる効率的かつ簡便な手段が必要とさ
れていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者の鋭意検討の結
果、上記の問題の解決手段として、ウィルス含有生体試
料と界面活性作用を有する物質とを液状媒体中で接触さ
せることを特徴とするウィルスから核酸を遊離させる方
法を提供するものである。
果、上記の問題の解決手段として、ウィルス含有生体試
料と界面活性作用を有する物質とを液状媒体中で接触さ
せることを特徴とするウィルスから核酸を遊離させる方
法を提供するものである。
【０００５】本発明における界面活性作用を有する物質
としては、ステロイド骨格を持つ界面活性剤を用いるこ
とができる。ステロイド骨格を持つ界面活性剤として
は、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム、ゲノデオキシコール酸ナトリウム、タウロコ
ール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウ
ム、ジギトニンなどを上げることができる。また、本発
明における界面活性作用を有する物質として、一般的な
アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界
面活性剤およびノニオン性界面活性剤、例えば、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸エステルナトリウム、
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウリン酸エ
ステルナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ポリオキ
シエチルラウリルエーテル、ノニルフェノール、ポリエ
チレングリコール、または、Ｔｒｉｔｏｎ， Ｔｗｅｅ
ｎ， Ｎｏｎｉｄｅｔ，Ｂｒｉｊ のような商品名で発
売されているシリーズ品等を用いることも可能である。
本発明において、界面活性作用を有する物質は２種以上
を併用することもできる。界面活性作用を有する液状媒
体の使用量は、ウイルス含有試料と液状媒体の混合物の
当該物質の濃度が通常０．００５〜２重量％となる量で
あることが好ましい。界面活性作用を有する物質の濃度
が０．００５％未満になると、ウィルス殻の破壊が不十
分となる可能性があり、一方２％重量を超えると後続す
るＰＣＲ反応の酵素にダメージを与え、ＰＣＲ反応効率
の低下を招く恐れがあるので好ましくない。界面活性剤
によるウイルス破壊を補助するために、ウイルス含有生
体試料と界面活性剤を有する物質を液状媒体中で処理す
る際に、蛋白分解酵素を添加することも可能である。蛋
白分解酵素としては、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等
が好適に用いられ、前液状媒体中での濃度は０．０１〜
１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、０．１〜５ｍｇ／ｍｌがさ
らに好ましい。
としては、ステロイド骨格を持つ界面活性剤を用いるこ
とができる。ステロイド骨格を持つ界面活性剤として
は、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム、ゲノデオキシコール酸ナトリウム、タウロコ
ール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウ
ム、ジギトニンなどを上げることができる。また、本発
明における界面活性作用を有する物質として、一般的な
アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界
面活性剤およびノニオン性界面活性剤、例えば、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸エステルナトリウム、
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウリン酸エ
ステルナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ポリオキ
シエチルラウリルエーテル、ノニルフェノール、ポリエ
チレングリコール、または、Ｔｒｉｔｏｎ， Ｔｗｅｅ
ｎ， Ｎｏｎｉｄｅｔ，Ｂｒｉｊ のような商品名で発
売されているシリーズ品等を用いることも可能である。
本発明において、界面活性作用を有する物質は２種以上
を併用することもできる。界面活性作用を有する液状媒
体の使用量は、ウイルス含有試料と液状媒体の混合物の
当該物質の濃度が通常０．００５〜２重量％となる量で
あることが好ましい。界面活性作用を有する物質の濃度
が０．００５％未満になると、ウィルス殻の破壊が不十
分となる可能性があり、一方２％重量を超えると後続す
るＰＣＲ反応の酵素にダメージを与え、ＰＣＲ反応効率
の低下を招く恐れがあるので好ましくない。界面活性剤
によるウイルス破壊を補助するために、ウイルス含有生
体試料と界面活性剤を有する物質を液状媒体中で処理す
る際に、蛋白分解酵素を添加することも可能である。蛋
白分解酵素としては、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等
が好適に用いられ、前液状媒体中での濃度は０．０１〜
１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、０．１〜５ｍｇ／ｍｌがさ
らに好ましい。
【０００６】本発明を適用できるウィルスとしては、例
えばヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノ
ウイルス、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘ
ルペスウイルス、（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状
疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス
等）、ポックスウイルス、パルボウイルス（アデノ関連
ウイルス等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ
ウイルス等）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス等）、
レトロウイルス（後天性免疫不全症候群ウイルス等）、
Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルスなどを挙げることができ
る。
えばヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノ
ウイルス、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘ
ルペスウイルス、（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状
疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス
等）、ポックスウイルス、パルボウイルス（アデノ関連
ウイルス等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ
ウイルス等）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス等）、
レトロウイルス（後天性免疫不全症候群ウイルス等）、
Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルスなどを挙げることができ
る。
【０００７】本発明を適用できるウィルスを含む検体試
料は通常の生物、微生物、分子生物学、臨床検査等が適
用されているもので、具体的には、血液、全血、血漿、
血清、組織の溶解液、体液、培養細胞、細菌、培養液等
が挙げられる。本発明のウィルスは上記のような検体試
料中、例えば、全血、血清、血漿、汗、尿、唾液等に含
まれている自然状態であっても良いし、または、検体試
料の前処理により、共存する蛋白、脂質、糖等の夾雑物
を除去した状態であっても良い。特に、検体試料の容量
が２０〜５０μl以上の場合は、続く核酸増幅法におけ
る酵素反応の阻害を回避する目的で、上記夾雑物をウィ
ルス含有試料から除去した試料を使用することが好まし
い。上記夾雑物を除去する方法としては超遠心法やポリ
エチレングリコール沈澱法等の公知の方法を用いること
ができるが、これらの方法は煩雑な操作と多大な時間を
必要とする。そこで本発明の核酸遊離方法では、夾雑物
の除去法として、ウイルス結合性担体によるウイルス吸
着法も同時に提供する。ウイルス結合性担体によるウイ
ルスの吸着・精製の結果、夾雑物が容易に除去できるた
め、対象となるウイルス含有試料の使用量を通常の検査
に用いられる１００〜５００μｌまで増量でき、高感度
と迅速な核酸遊離方法を提供することができる。ウイル
ス結合性担体としては、ウイルス表面あるいは内殻に存
在する分子に結合可能な分子（以下、ウイルス結合性分
子）、例えば、抗体、レクチン、ウイルスレセプタ等
や、イオン性の低分子または高分子等を少なくともその
表面に持つ担体等をあげることができる。抗体としては
種々のウイルス特異抗体、レクチンとしてはフィトエマ
グルチニン（ＰＨＡ）やコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）
等のウイルス結合性レクチン、ウイルスレセプタとして
はウイルスが細胞に感染する際に認識するＰ抗原やＣＤ
４抗原、ヘパリンなどを上げることができる。また、イ
オン性基とは、アニオン性基またはカチオン性基を上げ
ることができる。ここで、アニオン性基としては、スル
ホン酸基、カルボキシル基、リン酸基からなる群から選
ばれる基を有する化合物、カチオン性基としては、アミ
ノ基、アンモニウム基、イミノ基、アミジノ基、ヒドラ
ジノ基、ピリジル基からなる群から選ばれる基を有する
アミン化合物をあげることができる。また、アニオン性
基を含む担体を用いる場合は、ウイルスの吸着を促進す
るために多価金属イオンを添加することも可能である。
ウイルス結合性担体を構成する材料は、上記のウイルス
結合性分子が結合可能で、本発明の核酸遊離方法におけ
る加熱工程に対する耐熱性がある材料であれば特に限定
されないが、ガラスやシリカなどの無機材料、ポリマー
材料、多糖類等を好ましく用いることができる。また、
ウイルス結合性担体の形状としてはプレート状、ビーズ
状、フィルター状、カラム状、繊維状などが上げられる
が、特に粒子状が好ましい。また、粒子状のウイルス結
合性担体を用いる場合には、その粒子内部に磁性体を含
有させることにより、結合したウイルスと夾雑物の分離
を容易に行うことができる。
料は通常の生物、微生物、分子生物学、臨床検査等が適
用されているもので、具体的には、血液、全血、血漿、
血清、組織の溶解液、体液、培養細胞、細菌、培養液等
が挙げられる。本発明のウィルスは上記のような検体試
料中、例えば、全血、血清、血漿、汗、尿、唾液等に含
まれている自然状態であっても良いし、または、検体試
料の前処理により、共存する蛋白、脂質、糖等の夾雑物
を除去した状態であっても良い。特に、検体試料の容量
が２０〜５０μl以上の場合は、続く核酸増幅法におけ
る酵素反応の阻害を回避する目的で、上記夾雑物をウィ
ルス含有試料から除去した試料を使用することが好まし
い。上記夾雑物を除去する方法としては超遠心法やポリ
エチレングリコール沈澱法等の公知の方法を用いること
ができるが、これらの方法は煩雑な操作と多大な時間を
必要とする。そこで本発明の核酸遊離方法では、夾雑物
の除去法として、ウイルス結合性担体によるウイルス吸
着法も同時に提供する。ウイルス結合性担体によるウイ
ルスの吸着・精製の結果、夾雑物が容易に除去できるた
め、対象となるウイルス含有試料の使用量を通常の検査
に用いられる１００〜５００μｌまで増量でき、高感度
と迅速な核酸遊離方法を提供することができる。ウイル
ス結合性担体としては、ウイルス表面あるいは内殻に存
在する分子に結合可能な分子（以下、ウイルス結合性分
子）、例えば、抗体、レクチン、ウイルスレセプタ等
や、イオン性の低分子または高分子等を少なくともその
表面に持つ担体等をあげることができる。抗体としては
種々のウイルス特異抗体、レクチンとしてはフィトエマ
グルチニン（ＰＨＡ）やコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）
等のウイルス結合性レクチン、ウイルスレセプタとして
はウイルスが細胞に感染する際に認識するＰ抗原やＣＤ
４抗原、ヘパリンなどを上げることができる。また、イ
オン性基とは、アニオン性基またはカチオン性基を上げ
ることができる。ここで、アニオン性基としては、スル
ホン酸基、カルボキシル基、リン酸基からなる群から選
ばれる基を有する化合物、カチオン性基としては、アミ
ノ基、アンモニウム基、イミノ基、アミジノ基、ヒドラ
ジノ基、ピリジル基からなる群から選ばれる基を有する
アミン化合物をあげることができる。また、アニオン性
基を含む担体を用いる場合は、ウイルスの吸着を促進す
るために多価金属イオンを添加することも可能である。
ウイルス結合性担体を構成する材料は、上記のウイルス
結合性分子が結合可能で、本発明の核酸遊離方法におけ
る加熱工程に対する耐熱性がある材料であれば特に限定
されないが、ガラスやシリカなどの無機材料、ポリマー
材料、多糖類等を好ましく用いることができる。また、
ウイルス結合性担体の形状としてはプレート状、ビーズ
状、フィルター状、カラム状、繊維状などが上げられる
が、特に粒子状が好ましい。また、粒子状のウイルス結
合性担体を用いる場合には、その粒子内部に磁性体を含
有させることにより、結合したウイルスと夾雑物の分離
を容易に行うことができる。
【０００８】本発明において、ウィルスと界面活性作用
を有する物質を液状媒体中で接触させるには、ウィルス
を含有する試料と界面活性作用を有する物質を溶解した
溶液とを混合することが好ましい。本発明において液状
媒体とは、ウィルスを含有する試料中の液状成分と界面
活性剤を溶解するための溶媒の総和である。界面活性作
用を有する物質を溶解するための溶媒としては、水ある
いは緩衝液などを挙げることができる。
を有する物質を液状媒体中で接触させるには、ウィルス
を含有する試料と界面活性作用を有する物質を溶解した
溶液とを混合することが好ましい。本発明において液状
媒体とは、ウィルスを含有する試料中の液状成分と界面
活性剤を溶解するための溶媒の総和である。界面活性作
用を有する物質を溶解するための溶媒としては、水ある
いは緩衝液などを挙げることができる。
【０００９】本発明におけるウィルスと界面活性作用を
有する物質とは、液状媒体の温度が５０℃〜１００℃、
好ましくは８０℃〜９７℃で接触させることが好まし
い。液状媒体の温度が５０℃未満でウィルス膜が十分に
破壊されず、核酸をウィルスから遊離できないことがあ
る。また、１００℃を超える温度では、常圧での実現が
難しく、加圧装置が必要のため、実施上の設備制限から
好ましくない。さらに、蛋白分解酵素を併用する場合
は、５５℃前後で５〜６０分間処理後、蛋白分解酵素の
失活のため、９０〜９７℃で５〜２０分間処理すること
が好ましい。また、ウィルスと界面活性作用を有する物
質とを接触させる時間は、通常３〜６０分、好ましくは
５〜４０分である。
有する物質とは、液状媒体の温度が５０℃〜１００℃、
好ましくは８０℃〜９７℃で接触させることが好まし
い。液状媒体の温度が５０℃未満でウィルス膜が十分に
破壊されず、核酸をウィルスから遊離できないことがあ
る。また、１００℃を超える温度では、常圧での実現が
難しく、加圧装置が必要のため、実施上の設備制限から
好ましくない。さらに、蛋白分解酵素を併用する場合
は、５５℃前後で５〜６０分間処理後、蛋白分解酵素の
失活のため、９０〜９７℃で５〜２０分間処理すること
が好ましい。また、ウィルスと界面活性作用を有する物
質とを接触させる時間は、通常３〜６０分、好ましくは
５〜４０分である。
【００１０】上記のようにウィルスを界面活性作用を有
する物質と接触させると、ウィルス中の核酸は液状媒体
中に遊離されるので、液状媒体はそのままあるいはさら
に核酸を液状媒体から分離精製してウィルス核酸検出工
程に供される。ウィルス核酸の分離精製の手法として
は、目的のウイルスの核酸配列と結合するプローブを固
相した担体を使用しても良いし、アルコールを加えて、
ガラスあるいはポリマー材料に結合させる手法を用いて
も良い。
する物質と接触させると、ウィルス中の核酸は液状媒体
中に遊離されるので、液状媒体はそのままあるいはさら
に核酸を液状媒体から分離精製してウィルス核酸検出工
程に供される。ウィルス核酸の分離精製の手法として
は、目的のウイルスの核酸配列と結合するプローブを固
相した担体を使用しても良いし、アルコールを加えて、
ガラスあるいはポリマー材料に結合させる手法を用いて
も良い。
【００１１】ウイルス核酸の検出方法としては、核酸増
幅検査（ＮＡＴ; nucleic acid amplification test）
が挙げられ、例えば、ロシュ社のＰＣＲ(Polymerizatio
n chain reaction)法、ジェン・プローブ社のＴＭＡ(Tr
anscription Mediated amplification-hybridization p
rotection assay)法、アボット社のＬＣＲ(Ligase chai
n reaction)法、栄研化学社のＬＡＭＰ（Loop-mediated
isothermal amplification of DNA）法、宝酒造社のＩ
ＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated a
mplification of nucleic acid）等を利用することがで
きる。
幅検査（ＮＡＴ; nucleic acid amplification test）
が挙げられ、例えば、ロシュ社のＰＣＲ(Polymerizatio
n chain reaction)法、ジェン・プローブ社のＴＭＡ(Tr
anscription Mediated amplification-hybridization p
rotection assay)法、アボット社のＬＣＲ(Ligase chai
n reaction)法、栄研化学社のＬＡＭＰ（Loop-mediated
isothermal amplification of DNA）法、宝酒造社のＩ
ＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated a
mplification of nucleic acid）等を利用することがで
きる。
【００１２】
【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、本実施例において％および部は重量基準である。 実施例１ ＨＢＶ陽性血清（ウィルス濃度５×１０2ｃｏｐｉｅｓ
／ｍｌ）２５μｌに０．１％デオキシコール酸溶液２５
μｌを加え、９５℃で１０分間加熱し、核酸遊離液を得
た。得られた核酸遊離液からそれぞれ５μｌ検体および
１５μｌ検体を取り、さらにコントロールとしてウィル
スフリー血清２５μｌ検体を上記と同様に処理し、Ｎｅ
ｓｔｅｄ−ＰＣＲ法により検出をおこなった。３５回の
１ｓｔ−ＰＣＲ、２５回の２ｎｄ−ＰＣＲの増幅過程に
よりＤＮＡを増幅した。ＰＣＲのプライマー配列は、Ｈ
ｉｒｏａｋｉ Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｉｇａｋｕ ｎｏ
ａｙｕｍｉ，（１９９２），１６２（９），５４４−５
４９．に従った。得られたＰＣＲ増幅産物を３％アガロ
ースを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染
色によりＤＮＡを検出し、得られた目的ＤＮＡの量をバ
ンドの蛍光が検出されたものを＋、検出されなかったも
のを−として判定した。評価結果は表１にまとめた。
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、本実施例において％および部は重量基準である。 実施例１ ＨＢＶ陽性血清（ウィルス濃度５×１０2ｃｏｐｉｅｓ
／ｍｌ）２５μｌに０．１％デオキシコール酸溶液２５
μｌを加え、９５℃で１０分間加熱し、核酸遊離液を得
た。得られた核酸遊離液からそれぞれ５μｌ検体および
１５μｌ検体を取り、さらにコントロールとしてウィル
スフリー血清２５μｌ検体を上記と同様に処理し、Ｎｅ
ｓｔｅｄ−ＰＣＲ法により検出をおこなった。３５回の
１ｓｔ−ＰＣＲ、２５回の２ｎｄ−ＰＣＲの増幅過程に
よりＤＮＡを増幅した。ＰＣＲのプライマー配列は、Ｈ
ｉｒｏａｋｉ Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｉｇａｋｕ ｎｏ
ａｙｕｍｉ，（１９９２），１６２（９），５４４−５
４９．に従った。得られたＰＣＲ増幅産物を３％アガロ
ースを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染
色によりＤＮＡを検出し、得られた目的ＤＮＡの量をバ
ンドの蛍光が検出されたものを＋、検出されなかったも
のを−として判定した。評価結果は表１にまとめた。
【００１３】実施例２ 実施例１において、デオキシコール酸の代わりに、０．
０２％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液２５
μｌを添加した以外は実施例１と同様にして核酸の遊離
を行い、実施例１と同様にしてＰＣＲ法によりウィルス
検出核酸を行った。
０２％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液２５
μｌを添加した以外は実施例１と同様にして核酸の遊離
を行い、実施例１と同様にしてＰＣＲ法によりウィルス
検出核酸を行った。
【００１４】
【表１】
【００１５】実施例３スチレンスルホン酸シード重合磁性粒子の調製 （１）油性磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０」［タイ
ホー工業（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿
させた後、これを乾燥することにより、親油化処理され
た表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：
０．０１μｍ）を得た。ついで、超常磁性体４０部にシ
クロヘキシルメタクリレート９５部、メタクリル酸５部
およびベンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３部を添
加し、この系を混合攪拌することにより超常磁性体を均
一に分散させてモノマー組成物を調整した。一方、ポリ
ビニルアルコール１０部、ラウリル酸ナトリウム０．０
５部およびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテ
ル０．１部を水１０００部に溶解してモノマー組成物を
調整した。得られた水性媒体（水相）中に上記のモノマ
ー組成物を添加し、ホモジナイザーで予備攪拌した後、
超音波分散機で分散処理することにより平均粒子径が１
μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸濁液
（油滴分散体）を調整した。次に、得られた懸濁液を容
量２リットルの攪拌機付き三つ口フラスコに仕込み、こ
の系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しな
がら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合（懸濁重
合）させ磁性ポリマー粒子を製造した。 （２） 上記（１）で得られた磁性ポリマー粒子を１０
部を、ドデシル硫酸ナトリウム０．０３部を含む水１０
０部に分散した。スチレン４部ｇおよびスチレンスルホ
ン酸ナトリウム４部を加え、８０℃に加温した後、過硫
酸カリウム０．０１ｇを加え１０時間反応を行った。反
応終了後、蒸留水、続いて生理食塩水にて粒子を洗浄
し、スチレンスルホン酸シード重合磁性粒子（以下、磁
性スルホン酸粒子）を得た。抗ＨＢｓ抗体結合磁性粒子の調製 （１）上記アニオン磁性粒子の調製（１）で得られた磁
性ポリマー粒子１０部を水５０部に分散し、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（ＥＤＣ）０．１部を加え、４℃で１時間反応後、冷水
で洗浄し、次いで０．５部の抗ＨＢｓ抗体を加え、4℃
で１時間反応した。反応終了後、生理食塩水にて粒子を
洗浄し、抗ＨＢｓ抗体結合磁性粒子（以下、磁性抗体粒
子）を得た。
ホー工業（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿
させた後、これを乾燥することにより、親油化処理され
た表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：
０．０１μｍ）を得た。ついで、超常磁性体４０部にシ
クロヘキシルメタクリレート９５部、メタクリル酸５部
およびベンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３部を添
加し、この系を混合攪拌することにより超常磁性体を均
一に分散させてモノマー組成物を調整した。一方、ポリ
ビニルアルコール１０部、ラウリル酸ナトリウム０．０
５部およびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテ
ル０．１部を水１０００部に溶解してモノマー組成物を
調整した。得られた水性媒体（水相）中に上記のモノマ
ー組成物を添加し、ホモジナイザーで予備攪拌した後、
超音波分散機で分散処理することにより平均粒子径が１
μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸濁液
（油滴分散体）を調整した。次に、得られた懸濁液を容
量２リットルの攪拌機付き三つ口フラスコに仕込み、こ
の系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しな
がら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合（懸濁重
合）させ磁性ポリマー粒子を製造した。 （２） 上記（１）で得られた磁性ポリマー粒子を１０
部を、ドデシル硫酸ナトリウム０．０３部を含む水１０
０部に分散した。スチレン４部ｇおよびスチレンスルホ
ン酸ナトリウム４部を加え、８０℃に加温した後、過硫
酸カリウム０．０１ｇを加え１０時間反応を行った。反
応終了後、蒸留水、続いて生理食塩水にて粒子を洗浄
し、スチレンスルホン酸シード重合磁性粒子（以下、磁
性スルホン酸粒子）を得た。抗ＨＢｓ抗体結合磁性粒子の調製 （１）上記アニオン磁性粒子の調製（１）で得られた磁
性ポリマー粒子１０部を水５０部に分散し、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（ＥＤＣ）０．１部を加え、４℃で１時間反応後、冷水
で洗浄し、次いで０．５部の抗ＨＢｓ抗体を加え、4℃
で１時間反応した。反応終了後、生理食塩水にて粒子を
洗浄し、抗ＨＢｓ抗体結合磁性粒子（以下、磁性抗体粒
子）を得た。
【００１６】磁性スルホン酸粒子および磁性抗体粒子に
より捕獲したウィルスの核酸遊離およびウィルス検出 上記で得られた磁性スルホン酸粒子および磁性抗体粒子
を実施例１と同様なウィルス濃度を持つＨＢＶウィルス
含有血清１００μｌ検体にそれぞれ加えた。磁性スルホ
ン酸粒子とＨＢＶウイルス含有血清の混合物にはさらに
１Ｍ酢酸亜鉛水溶液を２μｌ加えた。両者とも室温で１
０分間インキュベートした。その後市販磁石により集磁
した磁性スルホン酸粒子および磁性抗体粒子を生理食塩
水で２回洗浄した。それぞれの粒子に２０μｇのプロテ
ネイナーゼＫを含む０．１％デオキシコール酸溶液５０
μｌを加え、55℃で３０分、続いて９５℃で１０分間加
熱した。磁石により磁性スルホン酸粒子および磁性抗体
粒子を集磁し、核酸遊離液をそれぞれ５μｌおよび１５
μｌを取り、ＰＣＲを実施例１と同様にして実施した。
コントロールとしてウイルスフリー血清１００μｌを同
様に処理した。結果を表２に示す。
より捕獲したウィルスの核酸遊離およびウィルス検出 上記で得られた磁性スルホン酸粒子および磁性抗体粒子
を実施例１と同様なウィルス濃度を持つＨＢＶウィルス
含有血清１００μｌ検体にそれぞれ加えた。磁性スルホ
ン酸粒子とＨＢＶウイルス含有血清の混合物にはさらに
１Ｍ酢酸亜鉛水溶液を２μｌ加えた。両者とも室温で１
０分間インキュベートした。その後市販磁石により集磁
した磁性スルホン酸粒子および磁性抗体粒子を生理食塩
水で２回洗浄した。それぞれの粒子に２０μｇのプロテ
ネイナーゼＫを含む０．１％デオキシコール酸溶液５０
μｌを加え、55℃で３０分、続いて９５℃で１０分間加
熱した。磁石により磁性スルホン酸粒子および磁性抗体
粒子を集磁し、核酸遊離液をそれぞれ５μｌおよび１５
μｌを取り、ＰＣＲを実施例１と同様にして実施した。
コントロールとしてウイルスフリー血清１００μｌを同
様に処理した。結果を表２に示す。
【００１７】実施例４ 実施例３において、デオキシコール酸の代わりに、２０
μｇのプロテイナーゼＫを含む０．１％Ｎ−ラウロイル
サルコシン酸ナトリウム１００μｌを添加した以外には
実施例３と同様にして核酸の遊離を行い、実施例３と同
様にしてＰＣＲ法によりウィルス検出核酸を行った。結
果を表２に示す。 実施例５ 実施例３で得られた核酸遊離液１５μｌにＨＢＶ ＤＮ
Ａ Ｓ領域に対する３’末端−ビオチン化プローブ（Ｃ
ＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴ
ＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴ−Ｂｉｏｔｉｎ、２００
ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ加え、５５℃で２０分反応さ
せた後、磁性アビジン粒子（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、
ＪＳＲ（株）製）を０．５ｍｇ加え、室温で１０分反応
させた。その後市販磁石により集磁した磁性アビジン粒
子を生理食塩水で２回洗浄、実施例３と同様にＰＣＲに
よりウイルス核酸の検出を行った。結果を表２に示す。
μｇのプロテイナーゼＫを含む０．１％Ｎ−ラウロイル
サルコシン酸ナトリウム１００μｌを添加した以外には
実施例３と同様にして核酸の遊離を行い、実施例３と同
様にしてＰＣＲ法によりウィルス検出核酸を行った。結
果を表２に示す。 実施例５ 実施例３で得られた核酸遊離液１５μｌにＨＢＶ ＤＮ
Ａ Ｓ領域に対する３’末端−ビオチン化プローブ（Ｃ
ＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴ
ＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴ−Ｂｉｏｔｉｎ、２００
ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ加え、５５℃で２０分反応さ
せた後、磁性アビジン粒子（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、
ＪＳＲ（株）製）を０．５ｍｇ加え、室温で１０分反応
させた。その後市販磁石により集磁した磁性アビジン粒
子を生理食塩水で２回洗浄、実施例３と同様にＰＣＲに
よりウイルス核酸の検出を行った。結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】
【発明の効果】本発明は、ウィルス含有生体試料と界面
活性作用を含有する物質とを液状媒体中で接触させ、加
熱操作するのみで、カオトロピック剤等の毒性の強い薬
品を使用せずに、ウィルス核酸の遊離を非常に簡便なも
のとし、得られた核酸は種々の核酸増幅法に対応でき
る。また、ウイルス含有生体試料中のウイルスをウイル
ス結合性担体に吸着させることによりサンプル中の夾雑
物を大幅に低下させることができる。そのため、ウイル
ス結合性担体に吸着したウイルスと界面活性作用を含有
する物質とを液状媒体中で接触させて得られた核酸は、
より高い感度でのＰＣＲ反応に適用できる。
活性作用を含有する物質とを液状媒体中で接触させ、加
熱操作するのみで、カオトロピック剤等の毒性の強い薬
品を使用せずに、ウィルス核酸の遊離を非常に簡便なも
のとし、得られた核酸は種々の核酸増幅法に対応でき
る。また、ウイルス含有生体試料中のウイルスをウイル
ス結合性担体に吸着させることによりサンプル中の夾雑
物を大幅に低下させることができる。そのため、ウイル
ス結合性担体に吸着したウイルスと界面活性作用を含有
する物質とを液状媒体中で接触させて得られた核酸は、
より高い感度でのＰＣＲ反応に適用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA35 BB02 BB29 BB50 CB21 DA12 DA13 DA14 FB01 FB04 4B024 AA14 CA01 CA09 CA11 HA12 HA13 4B063 QA01 QA07 QA18 QA19 QQ03 QQ10 QQ42 QQ52 QQ58 QR10 QR32 QR35 QR39 QR41 QR48 QR51 QR54 QR56 QR66 QR83 QS03 QS10 QS12 QS16 QS20 QS25 QS33 QS34 QS36 QX02
Claims (8)
- 【請求項１】 ウィルス含有生体試料と界面活性作用を
含有する物質とを液状媒体中で接触させることを特徴と
するウィルスの核酸遊離方法。 - 【請求項２】 前記界面活性剤を有する物質が、イオン
性界面活性剤、両性界面活性剤およびノニオン性界面活
性剤から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とす
る請求項１の核酸遊離方法。 - 【請求項３】 前記界面活性作用を有する物質が、ステ
ロイド骨格を持つ界面活性剤であることを特徴とする請
求項１の核酸遊離方法。 - 【請求項４】 前記界面活性作用を有する物質が、アニ
オン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１の核
酸遊離方法。 - 【請求項５】 前記液状媒体中に蛋白分解酵素を含有す
ることを特徴とする請求項１の核酸遊離方法。 - 【請求項６】 液状媒体を５０℃〜１００℃の温度で処
理することを特徴とする請求項１記載の核酸遊離方法。 - 【請求項７】 前記ウイルス含有生体試料がウイルス結
合性担体にウイルスを吸着させたものであることを特徴
とする請求項１の核酸遊離方法。 - 【請求項８】 請求項１の方法でウィルスから遊離した
核酸を核酸増幅法で検出することを特徴とするウィルス
核酸検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001013606A JP2002218978A (ja) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | 核酸遊離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001013606A JP2002218978A (ja) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | 核酸遊離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002218978A true JP2002218978A (ja) | 2002-08-06 |
Family
ID=18880430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001013606A Pending JP2002218978A (ja) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | 核酸遊離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002218978A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011177045A (ja) * | 2010-02-26 | 2011-09-15 | Jsr Corp | ウイルスの検出方法 |
-
2001
- 2001-01-22 JP JP2001013606A patent/JP2002218978A/ja active Pending
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2011177045A (ja) * | 2010-02-26 | 2011-09-15 | Jsr Corp | ウイルスの検出方法 |
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