JP2002199887A - 分裂酵母ゲノム上ｌｙｓ１座位へ外来ＤＮＡを効率よく導入する方法とそれに用いるベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分裂酵母ゲノムｌｙｓ１座位へ外来ＤＮＡを
効率よく導入する方法と該方法に使用する使い易いベク
ターを提供する。 【解決手段】分裂酵母に対する外来遺伝子を挿入可能な
マルチクローニングサイトと、配列番号１の塩基配列で
表されるＤＮＡ断片を有するベクターのマルチクローニ
ングサイトに目的とする外来遺伝子を挿入後、該ベクタ
ーをｌｙｓ１＋の変異遺伝子ｌｙｓ１−１３１を有する
分裂酵母株に導入し、リジン非要求性を示す形式転換体
を選別することにより、目的とする外来遺伝子をｌｙｓ
１座位に組込んだ分裂酵母株を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、分裂酵母ゲノム上
ｌｙｓ１座位へ外来ＤＮＡを効率よく導入する方法とそ
れに用いるベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術】外来の特定遺伝子、もしくはＤＮＡ配列
をある生物細胞に導入する実験は、そのような遺伝子の
発現や機能などの分子遺伝学解析において、不可欠のも
のとなっている。分裂酵母における最も一般的な外来遺
伝子導入方法は、分裂酵母細胞内で機能する自律複製配
列とマーカー遺伝子をもつベクターに導入したいＤＮＡ
配列を結合させて、分裂酵母細胞を形質転換し、染色体
外多コピープラスミドとして細胞に保持させる方法であ
る。しかし、この方法では、系代して保持させるために
はマーカー遺伝子による選択圧が必須となり、加えて導
入された外来遺伝子は常に多コピーが存在するうえにコ
ピー数は、一定しない。特定遺伝子の精細な機能解析な
どの目的には、こうした染色体外多コピープラスミドを
用いた方法ではなく、単一コピーの特定遺伝子を安定し
て保持させる方法が必要である。

【０００３】分裂酵母において単一コピーの外来ＤＮＡ
を安定に保持させるためには、染色体上のある領域に組
込む方法が考えられる。この目的のために従来いくつか
の組込みベクターが開発されてきたが、それらは、単純
に、先の多コピーベクターから、自律複製配列を除いた
だけのものであった。自律複製配列をもたないプラスミ
ドは安定に保持されないから、マーカー遺伝子が安定な
形質転換体を得ることができれば、その中には、目的の
外来ＤＮＡがベクターとともに染色体上に組込まれた株
が高頻度に含まれている。しかし、その場合、導入プラ
スミドと染色体の間に相同組換えが生じること、この組
換えによって細胞の生育に必須な遺伝子が破壊されない
こと、そのような相同組換えの再現性がよいこと、など
が必要条件となる。

【０００４】そのために、従来の組込みベクターでは、
目的のＤＮＡの他に相同組換えのための標的配列を挿入
する必要があった。こうした標的配列は、相同組換えが
再現性よく生じ、組換えによって生育阻害を誘因せず、
かつ、自らは自律複製配列を含まない、そのような配列
が注意深く選ばれてきた。しかし、そのようにしても、
目的のＤＮＡ配列自体に自律複製配列を含む場合に効率
よい組込み体を得ることが難しいし、目的の遺伝子が分
裂酵母自身に由来する場合（実際にはそのような場合が
多い）には、それ自体が相同組換えを生ずる可能性があ
り、それだけ標的配列において組込まれる効率が低下す
る。こうしたことから、従来、分裂酵母では、単一コピ
ーの外来ＤＮＡを効率よく導入するための、使いやすい
ベクター系が不在であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、分裂酵母ゲ
ノムｌｙｓ１座位へ外来ＤＮＡを効率よく導入する方法
と該方法に使用する使い易いベクターを提供することを
目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明では、上記課題を
解決するためにつぎのような構成をとるものである。 １．分裂酵母に対する外来遺伝子を挿入可能なマルチク
ローニングサイトと、配列番号１の塩基配列で表される
ＤＮＡ断片を有するベクター。 ２．配列番号１の塩基配列で表されるＤＮＡ断片の両側
にＮｏｔＩ部位を有することを特徴とする１に記載のベ
クター。 ３．図３のｐＹＣ３６に示される制限酵素地図を有する
ことを特徴とする２に記載のベクター。 ４．１〜３のいずれかに記載のベクターのマルチクロー
ニングサイトに目的とする外来遺伝子を挿入後、該ベク
ターをｌｙｓ１＋の変異遺伝子ｌｙｓ１−１３１を有す
る分裂酵母株に導入し、リジン非要求性を示す形式転換
体を選別することを特徴とする、目的とする外来遺伝子
をｌｙｓ１座位に組込んだ分裂酵母株の製造方法。

【０００７】

【発明の実施の形態】リジン合成に必須のアミノアジペ
ートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aminoadipate
semialdehyde dehydrogenase）をコードする遺伝子
（ｌｙｓ１＋）の変異遺伝子ｌｙｓ１−１３１を持つ分
裂酵母株は、リジン要求性を示す。ｌｙｓ１＋のＮ末端
側を含む２８１４ｂｐのＤＮＡ断片（ｌｙｓ１−Ｎ：配
列番号１）は、完全長のｌｙｓ１＋遺伝子を含まないた
めに、仮にこの断片により染色体外多コピーベクターを
用いてｌｙｓ１−１３１変異を持つ分裂酵母を形質転換
しても、宿主菌のリジン要求性は回復されない。

【０００８】同じ理由で、このｌｙｓ１−Ｎ断片が染色
体上のｌｙｓ１座位以外の部分に組込まれたとしても、
やはり宿主菌のリジン要求性は回復されない。このＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドが、染色体上のｌｙｓ１座に相
同組換えによって組込まれた場合にのみ、ｌｙｓ１−１
３１変異が相補され宿主菌はリジン非要求性となる。本
発明では、このｌｙｓ１−Ｎ断片を用いて、外来ＤＮＡ
導入用組込みベクターｐＹＣ３６を作製したものであ
る。

【０００９】本発明では、汎用ベクターＢｌｕｓｃｒｉ
ｐｔＫＳ＋のマルチクローニングサイト中にあるＮｏｔ
Ｉ部位にＮｒｕＩ部位を挿入し、ＮｏｔＩ部位を欠失さ
せ、ＮａｅＩ部位に新たなＮｏｔＩ部位を挿入後、この
ＮｏｔＩ部位にｌｙｓ１−Ｎの両末端にＮｏｔＩ部位を
付加した断片を挿入することにより、目的とする外来Ｄ
ＮＡ導入用組込みベクターｐＹＣ３６を作成する。そし
て、このベクターｐＹＣ３６のマルチクローニングサイ
トに目的の外来ＤＮＡを挿入後、ｌｙｓ１−１３１を持
つ分裂酵母株へ導入し、リジン非要求性を示す形質転換
株を得ることにより高効率に、目的の外来ＤＮＡを染色
体上ｌｙｓ１座位に組込んだ分裂酵母株を得るものであ
る。また仮に、目的のＤＮＡ中に分裂酵母で働く自律複
製配列を含んでいたとしても、あるいは、分裂酵母ゲノ
ム中に相同配列を含んでいたとしても、ｌｙｓ１−Ｎ
は、それ自体ではｌｙｓ１−１３１の変異を相補出来な
いので、染色体プラスミド、あるいは、ｌｙｓ１座位以
外の染色体上に組込まれたとしても、宿主菌のリジン要
求性を回復させることは出来ない。

【００１０】このベクターｐＹＣ３６では、マルチクロ
ーニングサイトのＮｏｔＩ部位の欠失とＮｒｕＩ部位挿
入によっても、ｌａｃＺのアルファ相補能は保っている
ので、コロニーカラーアッセイはもともとのＢｌｕｓｃ
ｒｉｐｔＫＳ＋と同様に行うことができ、目的遺伝子断
片のクローニングが容易である。また、ｌｙｓ１−Ｎの
両端にＮｏｔＩ部位が付加されているので、組込み体か
ら挿入ＤＮＡを再回収する場合に便宜を与える。一般
に、相同組換えによって組込まれた外来ＤＮＡを再び回
収する場合には、外来ＤＮＡおよび大腸菌での増幅に必
須のベクター領域などに含まれない制限酵素を注意深く
選んだ後に、この制限酵素で全染色体ＤＮＡを切断後、
セルフライゲーション反応させ、大腸菌を形質転換する
ことによって行う。ｐＹＣ３６では、ｌｙｓ１−Ｎの両
末端に低頻度切断制限酵素であるＮｏｔＩ部位を付加し
てあるので、挿入した外来ＤＮＡにＮｏｔＩ部位が含ま
れない限り、ＮｏｔＩ消化により目的のＤＮＡの回収を
容易に行うことができる。

【００１１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、これらの具体例は本発明を限定するものではない。
図中のＭＣはマルチクローニングサイトを表す。 （実施例１：ベクターｐＹＣ３６の構築）市販の汎用ベ
クターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋（図１のＡ）のＮｏ
ｔＩ部位を欠失しＮｒｕＩ部位を挿入する手順、及びＮ
ａｅＩ部位に新たなＮｏｔＩ部位を挿入する（図１のＢ
が得られる）手順、を以下に示す。 （１）ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋を制限酵素
ＮａｅＩで消化する。 （２）（１）の産物の切断端をＤＮＡポリメラーゼＩの
クレナウ断片処理により平滑化する。 （３）（２）の産物に５’リン酸化ＢｇｌIIリンカー配
列ＣＡＧＡＴＣＴＧをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結す
る。 （４）（３）の産物を制限酵素ＮｏｔＩで消化する。 （５）（４）の産物の切断端をＤＮＡポリメラーゼＩの
クレナウ断片処理により平滑化する。 （６）（５）の産物に５’リン酸化ＮｒｕＩリンカー配
列ＣＴＣＧＣＧＡＧをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結す
る。 （７）（６）の産物を制限酵素ＢｇｌIIで消化する。 （８）（７）の産物の切断端をＤＮＡポリメラーゼＩの
クレナウ断片処理により平滑化する。 （９）（８）の産物に５’リン酸化ＮｏｔＩリンカー配
列ＧＣＧＧＣＣＧＣをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結す
る。ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋のＮａｅＩ部
位は、ＮａｅＩによる切断効率が悪いために、直接Ｎｏ
ｔＩリンカーを挿入することは困難である。したがっ
て、上記手順では切断効率のよいＢｇｌII部位を１度挿
入して用いる方法を採用した。

【００１２】つぎに、２８１４ｂｐのｌｙｓ１−Ｎ断片
（京都大学柳田充弘教授より分与）の両端末にＮｏｔＩ
部位を付加する手順（図２参照）、さらに目的とするベ
クターｐＹＣ３６を得る手順（図３参照）を以下に示
す。 （１０）ｌｙｓ１−Ｎ断片の両末端をＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレナウ断片処理により平滑化し、Ｂｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＫＳ＋（図２のＡ）を制限酵素ＳｍａＩで消化
したものとＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結する。 （１１）（１０）の産物を制限酵素ＰｓｔＩで切断しＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレナウ断片処理により平滑化す
る。 （１２）（１１）の産物に５’リン酸化ＮｏｔＩリンカ
ー配列ＧＣＧＧＣＣＧＣをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連
結する。 （１３）（１２）の産物を制限酵素ＸｂａＩ、ＢａｍＨ
Ｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ断片処理
により平滑化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結する。 （１４）（１３）の産物（図２のＣ）から両端にＮｏｔ
Ｉ部位が付加されたｌｙｓ１−Ｎ断片を精製する。 （１５）（１４）の産物（図３のＥ）と（９）の産物を
制限酵素ＮｏｔＩで消化したもの（図３のＤ）をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結し、目的とするベクターｐＹＣ
３６を得る。

【００１３】（実施例２：分裂酵母株への外来遺伝子の
導入）外来遺伝子として分裂酵母遺伝子ｔａｚ１＋のプ
ロモーターとコード領域を含むＤＮＡ配列にレポーター
遺伝子としてオワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱく質
（ＧＦＰ）遺伝子、および、末端に分裂酵母遺伝子ｎｍ
ｔ１＋のターミネーター領域を連結させた４．５ｋｂの
ＤＮＡ断片（ｔａｚ１−ＧＦＰ−ｔｅｒ、配列２）を、
常法によりｐＹＣ３６のＰｓｔＩ−ＳａｃＩ部位へ挿入
したプラスミドを調製した（図４参照）。このプラスミ
ドを用いて、ｌｙｓ１−１３１を持つ分裂酵母に対し酢
酸リチウム法により形質転換を行った。相同組換えによ
って、分裂酵母のｌｙｓ１座位にｌｙｓ１−Ｎ断片と外
来遺伝子を含むプラスミドが組込まれた場合には、分裂
酵母のｌｙｓ１−１３１変異が相補され、形質転換体は
リジン非要求性となる。

【００１４】リジン非要求性を示す形質転換体を８個選
び、以下の２通りの方法により外来遺伝子ｔａｚ１−Ｇ
ＦＰ−ｔｅｒが分裂酵母ｌｙｓ１座位に組み込まれたこ
とを確認した。 （１）染色体上ｌｙｓ１−Ｎの上流に位置する配列から
なる下記プライマーｌｙｓｌｏｕｔＦＷ（配列番号３）
と、ｐＹＣ３６中ｌｙｓ１−Ｎの隣に位置する配列をも
つプライマーｓｕｐ３（配列番号４）とを用い、リジン
非要求性となった形質転換体ゲノムＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲをおこなったところ、８個の形質転換体のうち７
個から予想される約２．８ＫＢの断片の増幅が認められ
た。 ｌｙｓｌｏｕｔＦＷ（配列番号３）：ＧＴＣＡＴＣＴＡ
ＣＡＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣ ｓｕｐ３（配列番号４）：ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＣＡＣＧ

【００１５】（２）蛍光顕微鏡によって上述した８個の
形質転換体を観察したところ、ＰＣＲにより２．８ｋｂ
断片の増幅のみられた７個において、期待されるＧＦＰ
のシグナルが検出された。

【００１６】

【発明の効果】本発明のベクターは、任意の外来遺伝子
を挿入可能なマルチクローニングサイトと、分裂酵母の
ｌｙｓ１−Ｎ断片を有するものであり、外来遺伝子を挿
入した後に、相同組換えによってｌｙｓ１＋の変異遺伝
子ｌｙｓ１−１３１を有するリジン要求性の分裂酵母に
導入することができる。ベクターの組込まれた形質転換
体は、リジン非要求性となり容易に選別することができ
るので、目的とする外来遺伝子をｌｙｓ１座位に組込ん
だ分裂酵母株を効率よく製造することができる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Communications Research Laboratory, Ministry of Posts and Telecomm unications CHIKASHIGE Yuji <120> A method to introduce foreign genes on to the lys1 locus of fissio n yeast genome efficiently and a vector for use of the method <130> CRL-00-AM <160> 4 <210> 1 <211> 2814 <212> DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 1 aagcttactg acacgtaggg ttgttgataa atacaaatat cgaagaaata aaattgaaga 60 ctaactttgt gatatgacac tttgtacaaa tgtttattat aaaattaaat tattattatt 120 attttgcaca atagtttaat aattgcaata ataagcagta catttgaatt tacaaaatat 180 gtacgataaa taacttaaac actaatttga aatgatataa caaaacaatt tcattattgg 240 agtatattaa acatatgttt tggattttgt ttgtgaatga agattatcaa tttatcatct 300 acaacgaagg ttttaggcag ttcgaacatt tgacactctc cgttaccaac aacatatcat 360 actttcaaaa tgagccagac ggctccaagt gatactgagt acaatcagcg tcttgaacga 420 tggtctgaga gacttaagag tcaaacaatt tctcatcttc caacagatta tagtcgtccc 480 gtgcctagca gactcgttga agccgtgttt gaacgaacac ttcctgagga tgcaaaaaca 540 gctcttatta 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ggtttagatg agataataga 3600 aaaattcttg atctccgaca acgagtactt ttattttttt tgctaatcac tttactcaat 3660 attagctcga aatcgtagaa acgtagacgg gtgcgggata ccgagtggtg tagttaagaa 3720 tttttataaa ccacgtggcc caaaaatatg aacccaaaac gtttatacat gagtatactt 3780 taagaaggct ataccccttc gtgttagatg tagttttagc tacccaaccc gagtctatga 3840 gcttgacttc agatgtagaa ggcattaaat cgttttgaat attaattaaa aaacgatgaa 3900 aattaaatat ttaaaagcaa tcatacgctg aaaatttagt gctgtggcta atccttcaac 3960 atggaaatgc cataaaagtg actttgacaa aaaaaaaagt atatacaggt agtaaactca 4020 tctacttcat tgactttgtt tacagcatgt ggaaggagga atatttattg ctaaatcgta 4080 gtttaacatt caataagtaa tactattgaa attcgacaag attggccgca tggatgaaaa 4140 agaggcattt tgctttggga gaattagttc aaattagaac tgaaaaaaaa aactttacga 4200 ggcaaaaatg tcggattgag atcgtaaaag ttcgctcgtc gtcttttgct ttgtgattgt 4260 tttcatggat acatcttgct ggatatttaa attttagtac tatgtataag atattctata 4320 aatgttttat cacccaaacc tgttagcgcc ttcttaattc tattcaatct ggcttttgct 4380 ctgagactac ttcttggact ttcactactt gttagttata cggaatttgt gtaattagaa 4440 gtgaaataat cctttctatt agtaatgcga igctc 4475 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 3 gtcatctaca atactggctt tgcacatc 28 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 cgggatccct tcctttctcg ccacg 25

【図面の簡単な説明】

【図１】ベクターpYC36を構築する手順の一部を示す図
である。

【図２】ベクターpYC36を構築する手順の一部を示す図
である。

【図３】ベクターpYC36を構築する手順の一部を示す図
である。

【図４】ベクターpYC36に外来遺伝子を挿入する手順を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:85）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分裂酵母に対する外来遺伝子を挿入可能
   なマルチクローニングサイトと、配列番号１の塩基配列
   で表されるＤＮＡ断片を有するベクター。
2. 【請求項２】 配列番号１の塩基配列で表されるＤＮＡ
   断片の両側にＮｏｔＩ部位を有することを特徴とする請
   求項１に記載のベクター。
3. 【請求項３】 図３のｐＹＣ３６に示される制限酵素地
   図を有することを特徴とする請求項２に記載のベクタ
   ー。
4. 【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のベクター
   のマルチクローニングサイトに目的とする外来遺伝子を
   挿入後、該ベクターをｌｙｓ１＋の変異遺伝子ｌｙｓ１
   −１３１を有する分裂酵母株に導入し、リジン非要求性
   を示す形式転換体を選別することを特徴とする、目的と
   する外来遺伝子をｌｙｓ１座位に組込んだ分裂酵母株の
   製造方法。