JP2002191369A - Ｄｎａを固定化した基体を用いてｐｃｒのサーマルサイクルを行う方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固定化されたＤＮＡをそのままＰＣＲの鋳型
として増幅することができる方法を提供すること。 【解決手段】ＤＮＡを固定化した基体を用いてＰＣＲの
サーマルサイクルを行う。また、この方法において、Ｐ
ＣＲのサーマルサイクルの初期においてＤＮＡを固定化
した基体を取り出した後、引き続きＰＣＲのサーマルサ
イクルを繰り返す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医療分野、生化
学、分子生物学や遺伝子工学等の研究分野において有用
な、ＤＮＡを固定化した基体をそのまま用いてＰＣＲを
行う方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）
は、特定のＤＮＡについて、プライマーとＤＮＡポリメ
ラーゼとを用いて反応温度および時間を調節したサーマ
ルサイクルにより増幅する方法であり、医療分野、生化
学、分子生物学や遺伝子工学等の研究分野において多用
されている。ところで、ＤＮＡを長期間安定に保存すべ
く、ＤＮＡをダイヤモンド等の基体の基板表面に固定化
する技術が開発されている。この技術は、例えば、特定
の疾病の原因となるＤＮＡ基体等を対象とすれば、疾病
の検出に応用することが可能である。従来、このような
固定化されたＤＮＡをＰＣＲの鋳型として増幅しようと
する場合、基体からＤＮＡをいったんはずす必要があ
り、操作が煩雑で迅速な処理ができなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来の問題を解決し、固定化されたＤＮＡをそのままＰ
ＣＲの鋳型として増幅することができる方法を提供する
ことを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく検討した結果、通常のＰＣＲ反応液を用い
ても、ＤＮＡを固定化した基体を取り出せば、基体上の
ＤＮＡの消耗を防ぐことができること、取り出した固定
化ＤＮＡ基体は、その後何度もＰＣＲのサーマルサイク
ルに使用できることを見出した。また、基体上に固定さ
れている微量発現遺伝子の場合において、ＤＮＡ固定化
基体を一度目のＰＣＲサーマルサイクルの１〜５サイク
ル目で取り出した後のＰＣＲで、目的の増幅産物が得ら
れなかった時でも、その増幅産物を用いて再度ＰＣＲ
（ネスティッドＰＣＲ）を行うことにより、目的の増幅
産物が得られることもあることを見出した。本発明は、
このような知見により完成されたものである。

【０００５】請求項１記載の本発明は、ＤＮＡを固定化
した基体を用いてＰＣＲのサーマルサイクルを行う方法
を提供するものである。請求項２記載の本発明は、ＰＣ
Ｒのサーマルサイクルの初期においてＤＮＡを固定化し
た基体を取り出した後、引き続きＰＣＲのサーマルサイ
クルを繰り返すことを特徴とする、請求項１記載のＰＣ
Ｒのサーマルサイクルを行う方法を提供するものであ
る。請求項３記載の本発明の方法は、一度目のＰＣＲの
サーマルサイクルの初期において基体を取り出した後、
引き続きＰＣＲのサーマルサイクルを繰り返し、さらに
一度目のＰＣＲのサーマルサイクルで得られるＰＣＲ産
物を鋳型として、二度目のＰＣＲのサーマルサイクルを
行うことを特徴とする、請求項１記載のＰＣＲのサーマ
ルサイクルを行う方法を提供するものである。請求項４
記載の本発明の方法は、ＤＮＡを固定化した基体を取り
出すのが、一度目のＰＣＲのサーマルサイクルの１〜５
サイクル目である、請求項２又は３に記載のＰＣＲのサ
ーマルサイクル方法を行う提供するものである。請求項
５記載の本発明の方法は、基体表面に固定化したＤＮＡ
が、基体表面にリンカーとしてオリゴｄＴプライマーを
結合し、次いでｍＲＮＡを鋳型とする逆転写反応により
固定化されたｃＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか
に記載のＰＣＲのサーマルサイクルを行う方法を提供す
るものである。請求項６記載の本発明の方法は、基体表
面にリンカーとしてのオリゴｄＴプライマーを結合する
にあたり、基体表面のカルボキシル基を活性エステル化
後に該活性化エステル基とオリゴｄＴプライマーとをア
ミド結合させて得られる、請求項５記載のＰＣＲのサー
マルサイクルを行う方法を提供するものである。請求項
７記載の本発明は、基体表面に固定化したＤＮＡが、２
本鎖ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれかに記載のＰ
ＣＲのサーマルサイクルを行う方法を提供するものであ
る。請求項８記載の本発明は、基体表面に２本鎖ＤＮＡ
を固定化するにあたり、基体表面のカルボキシル基を活
性エステル化後に該活性化エステル基と２本鎖ＤＮＡと
をアミド結合させて得られる、請求項７記載のＰＣＲの
サーマルサイクルを行う方法を提供するものである。請
求項９記載の本発明は、基体表面に２本鎖ＤＮＡを固定
するにあたり、まず基体表面に、制限酵素切断部位を有
する２本鎖オリゴヌクレオチドを結合後、対応する制限
酵素切断部位を有する２本鎖ＤＮＡをライゲーションす
ることにより固定化された２本鎖ＤＮＡである、請求項
７に記載のＰＣＲのサーマルサイクルを行う方法を提供
するものである。請求項１０記載の本発明は、基体表面
に制限酵素切断部位を有する２本鎖ＤＮＡを結合するに
あたり、基体表面のカルボキシル基を活性エステル化後
に該活性化エステル基と制限酵素切断部位を有する２本
鎖ＤＮＡの該切断部位の反対側の末端とをアミド結合さ
せて得られる、請求項９記載のＰＣＲのサーマルサイク
ルを行う方法を提供するものである。請求項１１記載の
本発明は、基体表面に制限酵素切断部位を有する２本鎖
ＤＮＡを結合するにあたり、基体表面のカルボキシル基
を活性エステル化後に１本鎖オリゴヌクレオチドを固定
した後、固定したオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイズさせて制限酵素切断部位
を形成する、請求項９又は１０記載のＰＣＲのサーマル
サイクルを行う方法を提供するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の方法は、ＤＮＡを固定化
した基体をそのまま、すなわち、基体に固定された状態
のＤＮＡをそのままＰＣＲに供するものである。基体と
しては、ダイヤモンド、シリコンの他に、金、銀、銅、
アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上
記金属とセラミックスとの積層体；ポリカーボネート、
フッ素樹脂等のプラスチック等が挙げられる。その他の
材料でも、化学的に安定な材料であれば使用でき、例え
ば、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボンが挙げ
られる。また、プラスチックと上記金属、セラミック
ス、ダイヤモンド等との混合体でもよい。

【０００７】これらのうち、熱伝導性の点からダイヤモ
ンドが好ましい。ダイヤモンドは熱伝導性に優れてお
り、急速な昇温・冷却が可能であるため、ＰＣＲ等の加
熱冷却を繰り返すヒートサイクル時間を効果的に短縮で
きる。本発明の基体の熱伝導率は、０．１Ｗ/ｃｍ・Ｋ
以上、好ましくは０．５Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上、特に好まし
くは１．０Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上であることが好ましい。
１．０Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上とすることにより、ＤＮＡを本
発明の基体の化学修飾部分に固定化させてＰＣＲ等を行
う場合、昇温・冷却の追随性に優れているからである。

【０００８】ダイヤモンド基体の素材として、合成ダイ
ヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或いは天然のダイヤ
モンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が
単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。生
産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶＤ法などの気相
合成法を用いて製造されたダイヤモンドを用いることが
好ましい。

【０００９】基体の形成方法は公知の方法で行うことが
できる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲ
ＣＶＤ法、ＩＰＣ法、直流スパッタリング法、ＥＣＲス
パッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオ
ンプレーティング法、ＥＢ蒸着法、抵抗加熱蒸着法など
が挙げられる。また、金属粉末やセラミック粉末等に樹
脂をバインダーとして混合して結合形成したものが挙げ
られる。また、金属粉末やセラミック粉末等の原料をプ
レス成形機を用いて圧粉したものを高温で焼結したもの
もあげられる。

【００１０】基体の表面は意図的に粗面化されているこ
とが望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が
増えて多量のＤＮＡ等を固定させることに好都合である
からである。基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形
状、粉末状など特に問わない。また、その大きさも特に
問わない。さらに、このダイヤモンド基体は、ダイヤモ
ンドと他の物質との複合体（例えば、２相体）であって
もよい。

【００１１】基体の表面は、化学修飾されていることが
望ましい。すなわち、ＤＮＡを結合可能とすべく、末端
に極性基、例えば、水酸基、カルボキシル基、エポキシ
基、アミノ基等を有する炭化水素基で固体支持体表面が
覆われている。中でも、カルボキシル基で表面が覆われ
ていることが望ましい（図1参照)。

【００１２】続いて、上述の基体表面にＤＮＡを固定化
する。固定の対象となるＤＮＡは、２本鎖ＤＮＡに限定
されず、１本鎖でもよい。

【００１３】[１．１本鎖ＤＮＡの場合]ここで、基体の
表面に固定化したいＤＮＡが、ｃＤＮＡ等１本鎖のＤＮ
Ａの場合には、基体表面にリンカーとしてオリゴヌクレ
オチドプライマーを結合し(図２参照)、次いでｍＲＮＡ
を鋳型とする逆転写反応により固定化することができる
（図３参照）。

【００１４】まず、基体表面にオリゴヌクレオチドプラ
イマーを結合するには、基体表面のカルボキシル基を活
性エステル化後に該活性化エステル基とオリゴヌクレオ
チドプライマーとをアミド結合させることができる。す
なわち、基体表面を塩素化、アミノ化した状態（カルボ
キシル化しない）とし、形成された第１級アミノ基にカ
ルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニ
トロフェノールといったエステル基を有する活性化ジエ
ステルの一方のエステル基を脱水縮合させることにより
形成することができる。そうして形成するカルボキシル
化基体を適宜洗浄後、ハイドロゲンシアナミドとＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドを溶解した１，４−ジオキサン
溶液に浸漬して反応後、洗浄することにより活性エステ
ル化された基体を得ることができる。

【００１５】その他、固定前に、化学修飾の炭化水素基
末端をカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、あるいは、ｐ−ニトロフェノール等の脱水縮合剤で
活性化しておくと、固定が容易となるので望ましい。

【００１６】オリゴヌクレオチドプライマーとしては、
通常の逆転写反応に使われるオリゴｄＴプライマー等を
用いることができる。具体的には、本発明の実施例で用
いるオリゴ（ｄＡ）_３（ｄＴ）_１７（配列表の配列番号
１参照）が挙げられる。

【００１７】このようにして得られた活性エステル基
に、オリゴヌクレオチドプライマーをアミド結合する。
オリゴヌクレオチドのうち、５’末端のアデノシン
（Ａ）かシチジン（Ｃ）の第１級アミノ基とアミド結合
することが好ましい。例えば、オリゴ（ｄＡ）_３（ｄ
Ｔ）_１７水溶液に、活性エステル化処理を施した基体を
浸漬、撹拌し反応させた後、洗浄することによりアミド
結合によってオリゴ（ｄＡ）_３（ｄＴ）_１７（配列表の
配列番号１）を基体表面に固定化することができる。

【００１８】次いで、ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写反応
を行う。逆転写反応の手順は、図３に示すようにして行
うことができる。基本的には常法に従って行い、市販の
キットを用いると簡便である。例えば、上述のオリゴヌ
クレオチドプライマーが固定された基体、ＰＣＲ緩衝
液、ＭｇＣｌ_２、ＲＮａｓｅインヒビター、ｄＮＴＰ、
目的とするｍＲＮＡを含む全ＲＮＡ、逆転写酵素を含む
反応液を用意し、所定の温度および時間を設定して行う
ことができる。こうして、固定化されたオリゴヌクレオ
チドプライマーの３’末端側にｃＤＮＡが形成される。
この逆転写反応では、オリゴヌクレオチドプライマーが
予め基体表面に固定されているので、得られるｃＤＮＡ
は、該プライマーを解して基体表面に固定されることと
なる。この方法を採れば、所望のｃＤＮＡライブラリー
を得ると同時に、基体の表面にｃＤＮＡライブラリーが
簡便かつ迅速に固定可能である。

【００１９】本発明の方法において、基体にｃＤＮＡラ
イブラリーを固定した場合には、以下のようにしてＰＣ
Ｒのサーマルサイクルを行うことができる。ここで、本
発明においては、基体の長寿命化の観点から、ＰＣＲの
サーマルサイクル初期で基体を取り出すことが望まし
い。基体を長くＰＣＲ反応液に浸漬した状態としておく
と反応液中で析出してくるピロリン酸マグネシウムのた
め破損するためである。このように取り出しておけば、
基体を何度もＰＣＲのサーマルサイクルに使用すること
ができる。ここで、ＰＣＲサーマルサイクル初期とは、
好ましくは１〜５サイクル終了時、より好ましくは２〜
４サイクル終了時とする。

【００２０】基体を取り出した後、引き続きサーマルサ
イクルを繰り返してＰＣＲ産物を得る。すなわち、基体
を取り出す前に増幅したＰＣＲ産物を鋳型としてさらに
ＰＣＲ産物を得ることになる（以下、第１回目のＰＣＲ
という。）。なお、ＰＣＲのサーマルサイクルの反応条
件については、市販キットを用いた常法に従って行うこ
とができる。

【００２１】ここでもし、目的とする反応物がごく微量
で電気泳動後の蛍光色素での染色バンドが得られない場
合には、第１回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳型
として、再度のＰＣＲのサーマルサイクル（ネスティッ
ドＰＣＲ）を行う。反応条件等については、第１回目の
ＰＣＲにおいて、基体を取り出した後の条件と同様とす
ることができる。目的の増幅産物が得られたか否かは、
電気泳動後の蛍光色素染色等により確認することができ
る（図４参照）。図４において、レーン１、５、９、１
１、１５は分子量マーカー（５００ｂｐ）を示し、レー
ン２はリボゾーマル１８Ｓ（初期）、レーン３はチトク
ロムＰ４５０（初期）、レーン４はＨＧＦレセブター
（初期）、レーン６はリボゾーマル１８Ｓ（１回目終了
時）、レーン７はチトクロムＰ４５０（１回目終了
時）、レーン８はＨＧＦレセプター（１回目終了時）、
レーン１０はＨＧＦレセブター（２回目終了時）、レー
ン１２は１８Ｓレセブター（ＰＣＲｌＯ回目終了時）、
レーン１３は１８Ｓレセプター（ＰＣＲ２０回目終了
時）、レーン１４はＨＧＦレセプターのプライマー（Ｐ
ＣＲ２０回目まで）及び１８Ｓレセプター（ＰＣＲ２０
回目から）の増幅結果を示す。

【００２２】[２．２本鎖ＤＮＡの場合]一方、本発明の
方法は、基体の表面に固定化したいＤＮＡが２本鎖のＤ
ＮＡであっても適用可能であり、以下のようにして行う
ことができる。この場合まず、基体表面に２本鎖ＤＮＡ
を固定化するにあたり、基体表面のカルボキシル基を活
性エステル化後に該活性化エステル基と２本鎖オリゴヌ
クレオチドのうち片方の鎖とをアミド結合させる。活性
エステル化については、先述の１本鎖ＤＮＡの場合と同
様である。

【００２３】このような基体表面に形成された活性エス
テル基に、２本鎖ＤＮＡを結合させ、固定する。ここ
で、基体表面に２本鎖ＤＮＡを固定するにあたり、直接
２本鎖ＤＮＡをアミド結合させることができるが、制限
酵素切断部位を利用して、すなわち制限酵素切断部位を
有する２本鎖オリゴヌクレオチドを結合後、対応する制
限酵素切断部位を有する２本鎖ＤＮＡをライゲーション
することにより固定化することができる。この方法によ
れば、まず、基体表面の活性化エステル基と制限酵素切
断部位を有する２本鎖ＤＮＡの該切断部位の反対側の末
端とをアミド結合させることになる。

【００２４】基体表面に制限酵素切断部位を有する２本
鎖ＤＮＡを結合するには、基体表面のカルボキシル基を
活性エステル化後に１本鎖オリゴヌクレオチドを固定し
た後、固定したオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイズさせて制限酵素切断部位を
形成することができる。なお、ここで制限酵素切断部位
とは、核酸の中で、制限酵素により特異的に切断を受け
た後の配列を意味する。

【００２５】基体表面に制限酵素切断部位を形成する方
法の例を図５に示す。まず、基体表面を活性エステル化
した後に活性エステル基に、１本鎖のオリゴヌクレオチ
ド（図５中のＡ）をアミド結合させる。オリゴヌクレオ
チドの配列は任意であるが、固定される方（図５中の
Ａ）の３’末端と、固定されないオリゴヌクレオチド
（図５ではＢ）の５’末端については、それらのハイブ
リダイズにより得られる二本鎖オリゴヌクレオチドが、
制限酵素切断部位を有するように設計する必要がある。
また、化学修飾した基体とのアミド結合の容易性と立体
構造とを考慮して、固定側にＡかＣの第１級アミンを有
するヌクレオチドを、固定側（５’末端）に１〜５塩基
持つことが望ましい。さらに、次のハイブリダイズにお
けるずれを抑制すべく、ＡかＣに続く約１０塩基がチミ
ジン（Ｔ）またはグアノシン（Ｇ）であることが好まし
い。この結合は、１本鎖ＤＮＡの場合と同様に、活性化
処理を施した基体と結合させたいオリゴヌクレオチドと
をエタノール等に浸漬し、攪拌、洗浄することにより行
うことができる。

【００２６】その後、結合したオリゴヌクレオチドに、
これと相補的であり、かつ制限酵素切断部位を形成する
ようなオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。ハ
イブリダイゼーションは、常法によることができる。例
えば、基体に結合させたオリゴヌクレオチドと、ハイブ
リダイズさせたいオリゴヌクレオチドの水溶液を混合し
て室温あるいはそれ以下で行うことができる。こうし
て、制限酵素切断部位が形成される。

【００２７】次に、目的とする２本鎖ＤＮＡを固定する
こととなるが、まず、該ＤＮＡに目的とする制限酵素切
断部位を設けることとなる。そのような制限酵素切断部
位を有するＤＮＡは、対応する制限酵素により目的とす
るＤＮＡを断片化し、電気泳動を行って分離精製でき
る。制限酵素による断片化は、用いる制限酵素類に応じ
た条件で行う。電気泳動後、１００ｂｐ〜５０ｋｂｐ程
度のＤＮＡを切り出して、遠心分離、エタノール沈殿等
の手段により精製する。また、末端にＡやＣといった第
１級アミンを持つ塩基を有するプライマーを用いて行っ
たＰＣＲのサーマルサイクルで得たＤＮＡ断片を、活性
化した基板に直接固定化することもできる。なお、制限
酵素切断部位を有する２本鎖ＤＮＡが平滑末端の場合に
も、後から別の制限酵素切断部位を付加することにより
同様の効果を得ることもできる。

【００２８】こうして精製した制限酵素切断部位を有す
る２本鎖ＤＮＡを、制限酵素切断部位を形成した基体に
ライゲーションによって固定化することとなる。ライゲ
ーションは、市販のライゲーションキットを用いて行う
と簡便である。条件は、キットを用いる場合、それに応
じた条件とすることができる。

【００２９】本発明の方法は、基体表面に固定された２
本鎖ＤＮＡをそのまま用いてＰＣＲのサーマルサイクル
を行う。ＰＣＲは、１本鎖ＤＮＡの場合と同様、市販の
キットを用いることができ、その条件に応じて反応液、
サーマルサイクルの温度、時間幅等を調節することがで
きる。また、基体の長寿命化の観点から、ＰＣＲのサー
マルサイクル初期で基体を取り出すことが望ましい。基
体を長くＰＣＲ反応液に浸漬した状態としておくと、反
応液中に析出するピロリン酸マグネシウムのため破損す
るためである。このように取り出しておけば、基体を何
度もＰＣＲに使用することができる。ここで、ＰＣＲサ
ーマルサイクル初期とは、好ましくは１〜５サイクル終
了時、より好ましくは２〜４サイクル終了時とする。

【００３０】基体を取り出した後、引き続きサーマルサ
イクルを繰り返してＰＣＲ産物を得る。すなわち、基体
を取り出す前に増幅したＰＣＲ産物を鋳型としてさらに
大量のＰＣＲ産物を得ることになる（以下、第１回目の
ＰＣＲという。）。なお、ＰＣＲの反応条件について
は、市販キットを用いた常法に従って行うことができ
る。

【００３１】ここでもし、目的とする反応物がごく微量
で、電気泳動後の蛍光色素での染色バンドが得られない
場合には、第１回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳
型として、再度のＰＣＲ（ネスティッドＰＣＲ）を行う
（以下、第２回目のＰＣＲという）。反応条件等につい
ては、第１回目のＰＣＲにおいて、基体を取り出した後
の条件と同様とすることができる。目的の増幅産物が得
られたか否かは、電気泳動後の蛍光色素染色等により確
認することができる（図６参照）。

【００３２】

【実施例】実施例１（ダイヤモンドに固定したｃＤＮＡ
ライブラリーでのＰＣＲのサーマルサイクルＩ） ラット肝臓より抽出精製した全ＲＮＡ中のｍＲＮＡを鋳
型として合成されるｃＤＮＡを固定化し、この固定化ｃ
ＤＮＡライブラリー中のβ−アクチンあるいはグリセル
アルデヒド−３リン酸脱水素酵素に対応するｍＲＮＡに
対するＰＣＲのサーマルサイクルを行った。

【００３３】１．ダイヤモンド表面へのオリゴヌクレオ
チドの固定化 （１）カルボキシル化されたダイヤモンド基体の洗浄 表面がカルボキシル基で覆われた３ｍｍ角のカルボキシ
ル化ダイヤモンド基体（図１参照）を、ピンセットで２
００ｍＬエッペンドルフチューブに移し、エタノール１
００μＬを注入して、室温で５分間超音波洗浄した。

【００３４】（２）活性エステル化（図２の第１段目参
照） １．５ｍＬ反応チューブに、ハイドロゲンシアナミド
２．５ｍｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．５ｍｇ
を採り、１ｍＬの１，４−ジオキサンで溶解する。この
溶液１００μＬをエッペンドルフチューブに採り、エタ
ノール洗浄ダイヤモンド基体を浸漬し、室温で５分間超
音波を照射した後、時折ボルテックスミキサーで攪拌を
加えつつ１５分間放置した。

【００３５】（３）洗浄 等量の滅菌水を徐々に加え、５分間攪拌し、その後滅菌
水により２回洗浄する。

【００３６】（４）オリゴヌクレオチドのアミド結合に
よる固定化（図２の第２段目参照） １ｎｍｏｌ／ｍＬのオリゴ（ｄＡ）_３（ｄＴ）_１７（配
列表の配列番号１参照）水溶液１００μＬをエッペンド
ルフチューブに採り、活性エステル化処理を施したダイ
ヤモンド基体を浸漬し、時折ボルテックスチューブで攪
拌を加えつつ、室温で６０分間放置した。

【００３７】（５）洗浄 エッペンドルフチューブ内でボルテックス攪拌しつつ、
１００μＬの滅菌水で２回洗浄した。

【００３８】２．ダイヤモンド基体表面に固定化された
オリゴ（ｄＡ）_３（ｄＴ）_１７をプライマーとし、ｍＲ
ＮＡを鋳型とする逆転写反応によるダイヤモンド表面へ
のｃＤＮＡライブラリーの固定化（図３参照）

【００３９】（１）まず、以下の組成からなる逆転写反
応液を、２００μＬエッペンドルフチューブ内に調製し
た。

【００４０】 ・逆転写反応液の組成 ＭｇＣｌ_２ １０ μＬ １０×ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ２０ μＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ７．５ μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １．２５μＬ Rat Liver total ＲＮＡ（１．３６４μｇ／μＬ） ２．５ μＬ 逆転写酵素 ３．７５μＬ オリゴｄＴ固定化ダイヤモンド基体 − 合計 ５０ μＬ

【００４１】（２）反応液をボルテックスミキサーで軽
く撹拌後、ＰＣＲシステムにセットし、以下のプログラ
ムで逆転写反応を行った。

【００４２】・逆転写反応のプログラム（以下の１）〜
３）を１サイクル） １）４２℃×６０ｍｉｎ ２）９９℃×５ｍｉｎ ３） ５℃×５ｍｉｎ

【００４３】３．第１回目のＰＣＲ ダイヤモンド表面に固定化されたｃＤＮＡライブラリー
について、ＰＣＲのサーマルサイクルＩを行った。

【００４４】（１）まず、以下の組成からなるＰＣＲ反
応液を用意し、ボルテックスミキサーで軽く撹拌後、Ｐ
ＣＲシステムにセットした。

【００４５】 ・ＰＣＲ反応液の組成 ２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ Ｓｏｌｎ． ４ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ 蒸留水 ３５．５ μＬ ｄＧＴＰ １ μＬ ｄＡＴＰ １ μＬ ｄＴＴＰ １ μＬ ｄＣＴＰ １ μＬ 上流プライマー ０．５ μＬ 下流プライマー ０．５ μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５ μＬ 合計 ５０ μＬ

【００４６】（２）初期ＰＣＲプログラムを以下のプロ
グラムで実行した。

【００４７】・初期ＰＣＲのサーマルサイクル（以下の
２）〜４）につき４サイクル繰り返し） １）９４℃×１２０ｓｅｑ ２）９４℃× ３０ｓｅｑ ３）５６℃× ３０ｓｅｑ ４）６８℃× ９０ｓｅｑ ５）７２℃× ４２０ｓｅｑ

【００４８】（３）このプログラムを実行した時点で、
ダイヤモンド基体上のＤＮＡの長寿命化のために、ダイ
ヤモンドＤＮＡ基体をピンセットで取り出し１００μＬ
の７０％ エタノール水溶液を充填したエッペンドルフ
チューブに保管した。初期ＰＣＲプログラム終了時の増
幅産物の電気泳動図を図４の左から２番目のレーンに示
す。なお、図４の左から１，５，９，１２，１５番目の
レーンは、１００ｂｐラダーマーカーを示す。

【００４９】（４）残りの反応液につき、引き続き以下
に示すＰＣＲプログラムを実行した。

【００５０】・ＰＣＲのサーマルサイクル（以下の２）
〜４）につき２５サイクル繰り返し） １）９４℃×１２０ｓｅｑ ２）９４℃× ３０ｓｅｑ ３）５６℃× ３０ｓｅｑ ４）６８℃× ９０ｓｅｑ ５）７２℃×４２０ｓｅｑ

【００５１】（５）得られた反応液の一部（２〜５μ
Ｌ）につきアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウム
ブロミドで染色し、反応物を蛍光色素（エチジウムブロ
マイド）で確認した。得られた増幅産物の電気泳動図を
図４の左から６番目のレーンに示す。また、１０サイク
ル目、２０サイクル目の結果をそれぞれ図４の左から１
０番目、１１番目のレーンに示す。

【００５２】実施例２（ダイヤモンドに固定したｃＤＮ
ＡライブラリーでのＰＣＲのサーマルサイクルII） 実施例１におけるβ−アクチンをコードするｍＲＮＡの
代わりに、チトクロムＰ４５０（ｃｙｐ４５０）をコー
ドするｍＲＮＡに対するプライマー（配列表の配列番号
２および３参照）を用いてＰＣＲのサーマルサイクルを
行った。初期ＰＣＲプログラム終了時の増幅産物及び、
最終的なＰＣＲ終了時の増幅産物の電気泳動図を、それ
ぞれ、図４の左から３番目、７番目のレーンに示す。

【００５３】実施例３（ダイヤモンドに固定したｃＤＮ
ＡライブラリーのＰＣＲのサーマルサイクルIII） 実施例１におけるβ−アクチンのｍＲＮＡに対するプラ
イマーの代わりに、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコード
するｍＲＮＡに対するプライマー（配列表の配列番号４
および５参照）を用いてＰＣＲを行った。第１回目のＰ
ＣＲにおける初期ＰＣＲプログラム終了時の増幅産物及
び、最終的なＰＣＲ終了時の増幅産物の電気泳動図を、
それぞれ、図４の左から４番目、８番目のレーンに示
す。

【００５４】しかし、図からも明らかなとおり、第１回
目のＰＣＲで目的とする反応物に対応した蛍光色素バン
ドが得られなかったので、第１回目のＰＣＲ反応液を鋳
型として第２回目のＰＣＲを行った。まず、下記に示す
ＰＣＲ反応液を、エッペンドルフチューブ内で調節し
た。

【００５５】 ・ＰＣＲ反応液の組成 ２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ Ｓｏｌｎ． ４ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ 蒸留水 ３３．２５μＬ ｄＧＴＰ ０．５ μＬ ｄＡＴＰ ０．５ μＬ ｄＴＴＰ ０．５ μＬ ｄＣＴＰ ０．５ μＬ 上流プライマー（配列表の配列番号６） ０．２５μＬ 下流プライマー（配列表の配列番号７） ０．２５μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２５μＬ 第１回目ＰＣＲ反応液 ５ μＬ 合計 ５０ μＬ

【００５６】この反応液について、第１回目のＰＣＲサ
ーマルサイクルと同様のサイクルを２５回繰り返して、
対応したＰＣＲ産物を得た。結果を図４の左から１３番
目のレーンに示す。第１回目のＰＣＲと第２回目のＰＣ
Ｒとで結果を比較すると明らかなとおり、第１回目のＰ
ＣＲ産物を得られないような微量の場合でも、第１回目
の反応液を鋳型として第２回目のＰＣＲを行うことによ
り、目的の産物を得られることが明らかである。

【００５７】実施例４（２本鎖ＤＮＡの制限酵素切断部
位を用いた固定化とＰＣＲのサーマルサイクルIV） λファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得ら
れる２１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをダイヤモンド基
体表面に固定化し、これを用いてＰＣＲのサーマルサイ
クルを行った。概略を図５に示す。

【００５８】１．ダイヤモンド基体の活性化およびＥｃ
ｏＲＩサイトの形成 （１）カルボキシル化基体の洗浄 ３ｍｍ角のカルボキシル化ダイヤモンド基体を、ピンセ
ットでエッペンドルフチューブに移し、エタノール１０
０μＬを注入し、室温で５分間超音波洗浄した。

【００５９】（２）活性エステル化 １．５ｍＬ 反応チューブにハイドロゲンシアナミド
２．５ｍｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．５ｍｇ
を採り、１ｍＬの１，４−ジオキサンで溶解した。この
溶液１００μＬをエッペンドルフチューブに採り、エタ
ノール洗浄ダイヤモンド基体を浸漬し、室温で５分間超
音波洗浄をした後、時折ボルテックスミキサーで攪拌を
加えつつ１５分間放置した。

【００６０】（３）洗浄 等量の滅菌水を徐々に加え、５分間攪拌し、その後滅菌
水により２回洗浄した。

【００６１】（４）オリゴヌクレオチドの固定化 １ｎｍｏｌ／ｍＬのオリゴヌクレオチドＡ（配列表の配
列番号８参照）の水溶液を、１００μＬエッペンドルフ
チューブに採り、活性化処理を施したダイヤモンド基体
を浸漬し、時折ボルテックスチューブで攪拌を加えつ
つ、室温で６０分間放置した。

【００６２】（５）洗浄 エッペンドルフチューブ内でボルテックス攪拌しつつ、
１００μＬの滅菌水により２回洗浄した。

【００６３】（６）ハイブリダイゼーション １ｎｍｏｌ／ｍＬのオリゴヌクレオチドＢ（配列表の配
列番号９参照）の水溶液を、１００μＬエッペンドルフ
チューブに採り、オリゴヌクレオチドＡを固定化したダ
イヤモンド基体を浸漬した。時折ボルテックスチューブ
で攪拌を加えつつ、室温で６０分間放置した。

【００６４】（７）洗浄 エッペンドルフチューブ内でボルテックス攪拌しつつ、
１００μＬの滅菌水により２回洗浄した。こうして、Ｅ
ｃｏＲＩサイトが形成された。

【００６５】２．２１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメントの
精製 続いて、ＥｃｏＲＩによりλＤＮＡを断片化した後、電
気泳動を行って２１ｋｂｐフラグメントを分離精製し
た。

【００６６】（１）２１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメント
の精製のプロトコル まず、２００μＬ エッペンドルフチューブに以下の組
成で溶液を調整し、３７℃で１時間反応させた。

【００６７】・ＥｃｏＲＩ反応溶液 ＥｃｏＲＩ ５μＬ １０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ λＤＮＡ １５μＬ 滅菌水 ７０μＬ 合計 １００μＬ

【００６８】（２）電気泳動 アガロースゲル（濃度０．６％）を作成し、１ｋｂｐラ
ダーマーカーとともにＥｃｏＲＩ反応産物の電気泳動を
行った。

【００６９】（３）２１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメント
の精製 電気泳動後、アガロースゲルの２１ｋｂｐフラグメント
の部分をカッターナイフで切り出し、ゲルをＳｕｐｅｒ
ｅｃ−０１に入れ、−２０℃で１時間凍結した。その
後、３７℃で５分間保持し、解凍した。次に、遠心分離
機を用いて、４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
した。遠心分離終了後、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ
加え、さらに４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
した。次にフィルターを用いてＮａＣｌおよびエタノー
ルを加えて室温で１０分間放置した後、４℃、１５００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ピペットで上澄みを
捨て、７０％エタノールを１ｍＬ加えた。チューブを軽
く混ぜ、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
た。上澄みを捨てを開けたまま、室温で乾燥した。

【００７０】３．ライゲーションによる２１ｋｂｐのλ
ＤＮＡフラグメントの固定 上記２で精製した２１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメントの
溶液に、１で作成したＥｃｏＲＩサイトを形成したダイ
ヤモンド基体を浸漬し、ライゲースを加えて、１６℃で
３０分間反応させ、２１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメント
をダイヤモンド基体に固定化した。

【００７１】４．ＰＣＲ 固定化した２１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメント内に含ま
れる５００ｂｐ長の領域を鋳型としたＰＣＲを行った。
まず、次の組成からなるＰＣＲ反応液を用意し、ボルテ
ックスミキサーで軽く撹拌後、ＰＣＲシステムにセット
した。

【００７２】・ＰＣＲ反応液の組成 滅菌水 ３９．７５μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４ μＬ 上流プライマー ０．５ μＬ 下流プライマー ０．５ μＬ ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（商標） ０．２５μＬ 合計 ５０ μＬ

【００７３】以下の条件で、初期のＰＣＲサーマルサイ
クルを実行した。なお、下記のサーマルサイクルが２回
終了した時点で一時停止して、ダイヤモンド基体をピン
セットで取り出し、１００μＬのエタノールを充填した
エッペンドルフチューブに保管した。

【００７４】・ＰＣＲサーマルサイクル（１〜２を２５
サイクル） １）９４℃×３０ｓｅｑ ２）６８℃×３０ｓｅｑ ３）７２℃×３０ｓｅｑ

【００７５】その結果得られる増幅産物につきアガロー
ス電気泳動を行い、エチジウムブロミドで染色し、反応
物を蛍光で確認した。電気泳動の結果を図６に示す。図
６中、最左側のレーンは１００ｂｐラダ−マーカーを、
左から２番目のレーンから右に向かって、それぞれＰＣ
Ｒのサーマルサイクルの同一基体での１回目、１０回
目、２０回目、３０回目、４０回目、５０回目及び６０
回目の結果を示す。図６より、ダイヤモンド基体には２
１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメントが固定化しており、５
０回以上のＰＣＲ使用にも耐え得ることがわかる。

【００７６】実施例５（２本鎖ＤＮＡの直接固定化とＰ
ＣＲのサーマルサイクル） 実施例４において用いたのと同様の２１ｋｂｐのλＤＮ
Ａフラグメントを、実施例３と同様にして活性エステル
化したダイヤモンド基体に、ＴＡＫＡＲＡ Ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、直接固定化した。固定後２回
洗浄して、実施例３と同様の条件でＰＣＲを行った。蛍
光染色後のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を図７に示す。
図７中、最左側のレーンは１００ｂｐラダ−マーカー
を、左から２番目のレーンから右に向かって、それぞれ
ＰＣＲのサーマルサイクル１回目、１０回目、２０回
目、３０回目、４０回目、５０回目及び６０回目の結果
を示す。図７に示すように実施例４で得たのと同様、目
的の配列が増幅可能であることが判明した。

【００７７】実施例６（２本鎖ＤＮＡの直接固定化とＰ
ＣＲ） 活性エステル化したダイヤモンド基体に、ＥｃｏＲＩサ
イトを予め設計しておいたプライマーを実施例４と同様
の方法で固定化後、２１ｋｂｐのλＤＮＡフラグメント
をＴＡＫＡＲＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて固
定化した。固定後２回洗浄して、実施例４と同様の条件
でＰＣＲを行った。蛍光染色後のＰＣＲ増幅産物の電気
泳動図を図８に示す。図８中、最左側のレーンは１００
ｂｐラダ−マーカーを、左から２番目のレーンから右に
向かって、それぞれＰＣＲのサーマルサイクル１回目、
１０回目、２０回目、３０回目、４０回目、５０回目及
び６０回目の結果を示す。すなわち、図８において、レ
ーン１は１００ｂｐラダーマーカーを、レーン２はＰＣ
Ｒ１サイクル終了時の結果を、レーン３はＰＣＲｌＯサ
イクル終了時の結果を、レーン４はＰＣＲ２０サイクル
終了時の結果を、レーン５はＰＣＲ３０サイクル終了時
の結果を、レーン６はＰＣＲ４０サイクル終了時の結果
を、レーン７はＰＣＲ５０サイクル終了時の結果を示
す。図８に示すように実施例４で得たのと同様、目的の
配列が増幅可能であることが判明した。

【００７８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、通常のＰＣＲ反
応液を用いても、基体に固定化したＤＮＡを取り出せ
ば、基体上のＤＮＡの消耗を防ぐことができ、また、取
り出した固定ＤＮＡは、その後何度もＰＣＲで再使用で
きる。また、基体を取り出した後のＰＣＲで目的の増幅
産物が得られなかったような場合でも、微量発現してい
れば、その増幅産物を用いて再度ＰＣＲ（ネスティッド
ＰＣＲ）を行うことにより、目的の増幅産物が得られ
る。したがって、本発明の方法は、医療、生化学、分子
生物学、遺伝子工学等の分野において有用である。

【配列表】SEQUENCE LISTING ＜110＞ Toyo Kohan Co,. Ltd. ＜120＞ ＤＮＡを固定化した基体を用いてＰＣＲのサー
マルサイクルを行う方法 ＜130＞ Ｐ１７３５ ＜160＞ 12 ＜210＞ 1 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 1 aaattttttt tttttttttt 20 ＜210＞ 2 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 2 gaactgagga aaacaaaagg ctcacc 26 ＜210＞ 3 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 3 gccaatcaca cggtcaatct cttc 24 ＜210＞ 4 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 4 gcccgaagtg taagccccaa c 21 ＜210＞ 5 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 5 ggtggtgaac ttttgcgtct gc 22 ＜210＞ 6 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 6 gactctctaa agccataaac t 21 ＜210＞ 7 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 7 gcccaactac agagatggtc 20 ＜210＞ 8 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 8 aaaggttttt tttttttttt tttg 24 ＜210＞ 9 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 9 aattcaaaaa aaaaaaaaaa aaacctt 24 ＜210＞ 10 ＜211＞ 配列の長さ ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 13 gatgagttcg tgtccgtaca act 23 ＜210＞ 11 ＜211＞ 配列の長さ ＜212＞ DNA ＜213＞ artifical sequence ＜400＞ 11 ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 基体表面の性状の一例を示す図である。

【図２】 基体表面へのオリゴヌクレオチドの固定化の
プロセスを示す図である。

【図３】 基体表面へのｃＤＮＡの固定化のプロセスを
示す図である。

【図４】 ｃＤＮＡを固定化した基体のＰＣＲ反応の増
幅産物の電気泳動図である。

【符号の説明】

レーン１、５、９、１１、１５は分子量マーカー（５０
０ｂｐ）を示し、レーン２はリボゾーマル１８Ｓ（初
期）、レーン３はチトクロムＰ４５０（初期）、レーン
４はＨＧＦレセブター（初期）、レーン６はリボゾーマ
ル１８Ｓ（１回目終了時）、レーン７はチトクロムＰ４
５０（１回目終了時）、レーン８はＨＧＦレセプター
（１回目終了時）、レーン１０はＨＧＦレセブター（２
回目終了時）、レーン１２は１８Ｓレセブター（ＰＣＲ
ｌＯ回目終了時）、レーン１３は１８Ｓレセプター（Ｐ
ＣＲ２０回目終了時）、レーン１４はＨＧＦレセプター
のプライマー（ＰＣＲ２０回目まで）及び１８Ｓレセプ
ター（ＰＣＲ２０回目から）の増幅結果を示す。

【図５】 ２本鎖ＤＮＡの基体へのＥｃｏＲＩサイトを
利用した固定化のプロセスを示す図である。

【図６】 ２本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩサイト形成により
固定した基体のＰＣＲ反応の増幅産物の電気泳動図であ
る。

【図７】 ２本鎖ＤＮＡを直接固定した基体において、
ＰＣＲで５００ｂｐを増幅した試験の結果を示す泳動写
真である。

【図８】 ２本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩサイトを有するプ
ライマーにより直接固定した基体において、ＰＣＲで５
００ｂｐを増幅した試験の結果を示す泳動写真である。

【符号の説明】

レーン１は１００ｂｐラダーマーカーを、レーン２はＰ
ＣＲ１サイクル終了時の結果を、レーン３はＰＣＲｌＯ
サイクル終了時の結果を、レーン４はＰＣＲ２０サイク
ル終了時の結果を、レーン５はＰＣＲ３０サイクル終了
時の結果を、レーン６はＰＣＲ４０サイクル終了時の結
果を、レーン７はＰＣＲ５０サイクル終了時の結果を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡村 浩 山口県下松市東豊井1296番地の１ 東洋鋼 鈑株式会社技術研究所内 (72)発明者 高橋 浩二郎 広島県広島市南区宇品御幸１丁目９番26号 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA01 CA09 CA10 HA11 4B063 QA01 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR62 QR63 QR82 QS03 QS25 QS32 QX02

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＮＡを固定化した基体を用いてＰＣＲ
   のサーマルサイクルを行う方法。
2. 【請求項２】 ＰＣＲのサーマルサイクルの初期におい
   てＤＮＡを固定化した基体を取り出した後、引き続きＰ
   ＣＲのサーマルサイクルを繰り返すことを特徴とする、
   請求項１記載のＰＣＲのサーマルサイクルを行う方法。
3. 【請求項３】 一度目のＰＣＲのサーマルサイクルの初
   期において基体を取り出した後、引き続きＰＣＲのサー
   マルサイクルを繰り返し、さらに一度目のＰＣＲのサー
   マルサイクルで得られるＰＣＲ産物を鋳型として、二度
   目のＰＣＲのサーマルサイクルを行うことを特徴とす
   る、請求項１記載のＰＣＲのサーマルサイクルを行う方
   法。
4. 【請求項４】 ＤＮＡを固定化した基体を取り出すの
   が、一度目のＰＣＲのサーマルサイクルの１〜５サイク
   ル目である、請求項２又は３に記載のＰＣＲのサーマル
   サイクルを行う方法。
5. 【請求項５】 基体表面に固定化したＤＮＡが、基体表
   面にリンカーとしてオリゴｄＴプライマーを結合し、次
   いでｍＲＮＡを鋳型とする逆転写反応により固定化され
   たｃＤＮＡである、請求項１〜４のいずれかに記載のＰ
   ＣＲのサーマルサイクルを行う方法。
6. 【請求項６】 基体表面にリンカーとしてのオリゴｄＴ
   プライマーを結合するにあたり、基体表面のカルボキシ
   ル基を活性エステル化後に該活性化エステル基とオリゴ
   ｄＴプライマーとをアミド結合させて得られる、請求項
   ５記載のＰＣＲのサーマルサイクルを行う方法。
7. 【請求項７】 基体表面に固定化したＤＮＡが、２本鎖
   ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれかに記載のＰＣＲ
   のサーマルサイクルを行う方法。
8. 【請求項８】 基体表面に２本鎖ＤＮＡを固定化するに
   あたり、基体表面のカルボキシル基を活性エステル化後
   に該活性化エステル基と２本鎖ＤＮＡとをアミド結合さ
   せて得られる、請求項７記載のＰＣＲのサーマルサイク
   ルを行う方法。
9. 【請求項９】 基体表面に２本鎖ＤＮＡを固定するにあ
   たり、まず基体表面に、制限酵素切断部位を有する２本
   鎖オリゴヌクレオチドを結合後、対応する制限酵素切断
   部位を有する２本鎖ＤＮＡをライゲーションすることに
   より固定化された２本鎖ＤＮＡである、請求項７に記載
   のＰＣＲのサーマルサイクルを行う方法。
10. 【請求項１０】 基体表面に制限酵素切断部位を有する
    ２本鎖ＤＮＡを結合するにあたり、基体表面のカルボキ
    シル基を活性エステル化後に該活性化エステル基と制限
    酵素切断部位を有する２本鎖ＤＮＡの該切断部位の反対
    側の末端とをアミド結合させて得られる、請求項９記載
    のＰＣＲのサーマルサイクルを行う方法。
11. 【請求項１１】 基体表面に制限酵素切断部位を有する
    ２本鎖ＤＮＡを結合するにあたり、基体表面のカルボキ
    シル基を活性エステル化後に１本鎖オリゴヌクレオチド
    を固定した後、固定したオリゴヌクレオチドと相補的な
    オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて制限酵素切
    断部位を形成する、請求項９又は１０記載のＰＣＲのサ
    ーマルサイクルを行う方法。