JP2002128794A - ヒト血清アルブミンのミスホールディングを抑制する方法 - Google Patents
ヒト血清アルブミンのミスホールディングを抑制する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ヒト血清アルブミンの製造の際に行われるアル
カリ性溶液処理によって形成されるヒト血清アルブミン
の分子内又は分子間ミスホールディングを抑制する方法
を提供すること。 【解決手段】ヒト血清アルブミンの多量体をアルカリ性
溶液で処理して単量体化する際に、ヒト血清アルブミン
のミスホールディングを抑制する方法であって、該ヒト
血清アルブミン溶液をＳＨ基含有化合物の存在下、アル
カリ性溶液で処理することを特徴とする方法。
カリ性溶液処理によって形成されるヒト血清アルブミン
の分子内又は分子間ミスホールディングを抑制する方法
を提供すること。 【解決手段】ヒト血清アルブミンの多量体をアルカリ性
溶液で処理して単量体化する際に、ヒト血清アルブミン
のミスホールディングを抑制する方法であって、該ヒト
血清アルブミン溶液をＳＨ基含有化合物の存在下、アル
カリ性溶液で処理することを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト血清アルブミ
ンの精製方法に関する。より詳細には、血漿由来のヒト
血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）又
は遺伝子組換え技術により得られる組換え型ヒト血清ア
ルブミン（以下、ｒＨＳＡと称することもある）を精製
する際に、その製造工程において行われるアルカリ性溶
液処理により形成されるヒト血清アルブミンの分子内又
は分子間ジスルフィド結合の掛け違いによるミスホール
ディングを、ＳＨ基含有化合物を添加することによって
抑制する方法に関する。
ンの精製方法に関する。より詳細には、血漿由来のヒト
血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）又
は遺伝子組換え技術により得られる組換え型ヒト血清ア
ルブミン（以下、ｒＨＳＡと称することもある）を精製
する際に、その製造工程において行われるアルカリ性溶
液処理により形成されるヒト血清アルブミンの分子内又
は分子間ジスルフィド結合の掛け違いによるミスホール
ディングを、ＳＨ基含有化合物を添加することによって
抑制する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト血清アルブミン(以下、ＨＳＡと称
することもある)は、血漿中の主要な蛋白成分で、585個
のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、約66,000ダル
トンの分子量を有する(Minghetti, P. P. et al.(1986)
Molecular structure of thehuman albumin gene is r
evealed by nucleotide sequence within 11-22 of chr
omosome 4. J.Biol.Chem. 261, 6747-6757)。ＨＳＡ
は、主に血液の正常な浸透圧の維持や血中に現れるカル
シウムイオン、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、
薬物など様々なものと結合し、これらを運搬するキャリ
アーとしての役割を果たすことが知られている。純化し
たＨＳＡは、例えば、外科手術、出血性ショックあるい
は熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による
低アルブミン血症の治療に使用される。
することもある)は、血漿中の主要な蛋白成分で、585個
のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、約66,000ダル
トンの分子量を有する(Minghetti, P. P. et al.(1986)
Molecular structure of thehuman albumin gene is r
evealed by nucleotide sequence within 11-22 of chr
omosome 4. J.Biol.Chem. 261, 6747-6757)。ＨＳＡ
は、主に血液の正常な浸透圧の維持や血中に現れるカル
シウムイオン、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、
薬物など様々なものと結合し、これらを運搬するキャリ
アーとしての役割を果たすことが知られている。純化し
たＨＳＡは、例えば、外科手術、出血性ショックあるい
は熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による
低アルブミン血症の治療に使用される。
【０００３】従来、ＨＳＡは、ヒト血漿からコーンの低
温エタノール分画法あるいは該方法に準じて、ＨＳＡ画
分（ＨＳＡは画分Vに分画される）を得た後、更に、種
々の精製方法を駆使して製造されている。また近年、原
料をヒト血漿に依存しない方法として、遺伝子組換え技
術を応用して酵母や大腸菌、枯草菌にヒト血清アルブミ
ンを生産させる技術が開発されている。酵母について
は、(1) Production of Recombinant Huma Serum Album
in from Saccharomyces cerevisiae; Alan V. Michael
J. et. al, Biotechnology and Applied Biochemistry
11, 273-287(1989)、(2) Secretory Expression of the
Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomy
ces cerevisiae; Ken. Okabayashi et.al, J. Biochemi
stry、(3) Yeast Systems for the Commercial Product
ion of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz
and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9, 1067-1
072(1991)、大腸菌については(4) Construction of DNA
sequences and their use for microbial production
of proteins, in particular human serum albumin; La
wn, R. M., European Patent Appl. 73,646 (1983)、
(5) Synthesis and Purification of mature human ser
um albuminfrom E. coli; Latta, L. et. al. Biotechn
ique 5, 1309-1314 (1897)、枯草菌については(6) Secr
etion of human serum albumin from Bacillus subtili
s;Saunders, C. W. et. al, J. Bacteriol. 169, 2917-
2925 (1987)参照。
温エタノール分画法あるいは該方法に準じて、ＨＳＡ画
分（ＨＳＡは画分Vに分画される）を得た後、更に、種
々の精製方法を駆使して製造されている。また近年、原
料をヒト血漿に依存しない方法として、遺伝子組換え技
術を応用して酵母や大腸菌、枯草菌にヒト血清アルブミ
ンを生産させる技術が開発されている。酵母について
は、(1) Production of Recombinant Huma Serum Album
in from Saccharomyces cerevisiae; Alan V. Michael
J. et. al, Biotechnology and Applied Biochemistry
11, 273-287(1989)、(2) Secretory Expression of the
Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomy
ces cerevisiae; Ken. Okabayashi et.al, J. Biochemi
stry、(3) Yeast Systems for the Commercial Product
ion of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz
and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9, 1067-1
072(1991)、大腸菌については(4) Construction of DNA
sequences and their use for microbial production
of proteins, in particular human serum albumin; La
wn, R. M., European Patent Appl. 73,646 (1983)、
(5) Synthesis and Purification of mature human ser
um albuminfrom E. coli; Latta, L. et. al. Biotechn
ique 5, 1309-1314 (1897)、枯草菌については(6) Secr
etion of human serum albumin from Bacillus subtili
s;Saunders, C. W. et. al, J. Bacteriol. 169, 2917-
2925 (1987)参照。
【０００４】ヒト血清アルブミンの精製方法としては、
一般に、蛋白質化学において通常使用される精製方法、
例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動
法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマ
トグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法
等を用いることができる。実際には、生体組織、細胞、
血液などに由来する多種類の夾雑物が混在するため、ヒ
ト血清アルブミンの精製は、上記方法の複雑な組み合わ
せにより行われている。
一般に、蛋白質化学において通常使用される精製方法、
例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動
法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマ
トグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法
等を用いることができる。実際には、生体組織、細胞、
血液などに由来する多種類の夾雑物が混在するため、ヒ
ト血清アルブミンの精製は、上記方法の複雑な組み合わ
せにより行われている。
【０００５】ヒト血清アルブミンの工業的生産において
は、ヒトの体内環境と異なる諸条件で処理する必要があ
り、そのためにヒト血清アルブミンの多量体が生成す
る。ヒト血清アルブミンの臨床応用でこれらの多量体が
人体に悪影響を及ぼすという報告はまだされていない
が、これらの多量体による新たな抗原性の発現等の懸念
がある。このような医薬品としての安全性の観点より、
「ヒト血清アルブミン」の医薬品としての規格試験にお
いて多量体の混入限度が規定されており、製剤中の多量
体の含量を十分低下させることは製造上の非常に重要な
課題となっている。
は、ヒトの体内環境と異なる諸条件で処理する必要があ
り、そのためにヒト血清アルブミンの多量体が生成す
る。ヒト血清アルブミンの臨床応用でこれらの多量体が
人体に悪影響を及ぼすという報告はまだされていない
が、これらの多量体による新たな抗原性の発現等の懸念
がある。このような医薬品としての安全性の観点より、
「ヒト血清アルブミン」の医薬品としての規格試験にお
いて多量体の混入限度が規定されており、製剤中の多量
体の含量を十分低下させることは製造上の非常に重要な
課題となっている。
【０００６】一般に、蛋白質溶液をアルカリ性にする
と、蛋白質分子内のシステイン残基のSH基は、蛋白質分
子内又は蛋白質分子間でジスルフィド結合を形成する
(ジスルフィド結合交換反応を含む)。この時、ジスルフ
ィド結合の掛け違いが起こり、本来の蛋白質とは異なる
立体構造を有する蛋白質を生じることがある。このジス
ルフィド結合の掛け違いは、分子内及び分子間で起こり
得る。したがって、種々の夾雑物が混在すると、該夾雑
物との間でジスルフィド結合が形成され、新規物質を生
成することもある。このような誤ったジスルフィド結合
の形成をミスホールディングと称することがある。
と、蛋白質分子内のシステイン残基のSH基は、蛋白質分
子内又は蛋白質分子間でジスルフィド結合を形成する
(ジスルフィド結合交換反応を含む)。この時、ジスルフ
ィド結合の掛け違いが起こり、本来の蛋白質とは異なる
立体構造を有する蛋白質を生じることがある。このジス
ルフィド結合の掛け違いは、分子内及び分子間で起こり
得る。したがって、種々の夾雑物が混在すると、該夾雑
物との間でジスルフィド結合が形成され、新規物質を生
成することもある。このような誤ったジスルフィド結合
の形成をミスホールディングと称することがある。
【０００７】本発明者等は、ＨＳＡ多量体を含有するヒ
ト血清アルブミン溶液をアルカリ性溶液で処理すること
によって該多量体を効率よく単量体に変換する方法を開
発した。
ト血清アルブミン溶液をアルカリ性溶液で処理すること
によって該多量体を効率よく単量体に変換する方法を開
発した。
【０００８】この方法は、ＨＳＡの製造過程における損
失を防ぐために非常に有用な方法であるが、上述したよ
うに、ＨＳＡの分子内ミスホールディング又はＨＳＡ自
身若しくはＨＳＡと他の夾雑物との間の分子間ミスホー
ルディングが起こる場合がある。一旦、ミスホールディ
ングによって新規物質が形成されると、これを除去する
ことは難しく、厄介である。該新規物質は、新たな抗原
性の発現やその他の原因により、投与された患者にアレ
ルギー等の副作用を発生させる可能性がある。
失を防ぐために非常に有用な方法であるが、上述したよ
うに、ＨＳＡの分子内ミスホールディング又はＨＳＡ自
身若しくはＨＳＡと他の夾雑物との間の分子間ミスホー
ルディングが起こる場合がある。一旦、ミスホールディ
ングによって新規物質が形成されると、これを除去する
ことは難しく、厄介である。該新規物質は、新たな抗原
性の発現やその他の原因により、投与された患者にアレ
ルギー等の副作用を発生させる可能性がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ヒト血清アルブミンの製造過程で行われるアル
カリ性溶液処理(クロマト等を含む)工程において形成さ
れるヒト血清アルブミンの分子内ミスホールディング又
はＨＳＡ自身若しくはＨＳＡと他の夾雑物との間の分子
間ミスホールディングを抑制する方法を提供することに
ある。
目的は、ヒト血清アルブミンの製造過程で行われるアル
カリ性溶液処理(クロマト等を含む)工程において形成さ
れるヒト血清アルブミンの分子内ミスホールディング又
はＨＳＡ自身若しくはＨＳＡと他の夾雑物との間の分子
間ミスホールディングを抑制する方法を提供することに
ある。
【００１０】また、本発明の他の目的は、医薬品として
安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにあ
る。
安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにあ
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、ヒト血清アルブミンを
製造する際に行われるアルカリ性溶液処理において、そ
のアルカリ性溶液で処理液中にシステインのようなＳＨ
基含有化合物を添加すると、ＨＳＡの分子内及び／又は
分子間ミスホールディングが抑制されることを見出し、
本発明を完成するに至った。
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、ヒト血清アルブミンを
製造する際に行われるアルカリ性溶液処理において、そ
のアルカリ性溶液で処理液中にシステインのようなＳＨ
基含有化合物を添加すると、ＨＳＡの分子内及び／又は
分子間ミスホールディングが抑制されることを見出し、
本発明を完成するに至った。
【００１２】本発明は、ヒト血清アルブミンの多量体を
アルカリ性溶液で処理して単量体化する際に、ヒト血清
アルブミンのミスホールディングを抑制する方法であっ
て、該ヒト血清アルブミン溶液をＳＨ基含有化合物の存
在下、アルカリ性溶液で処理することを特徴とする方法
を提供するものである。本発明はまた、該方法により得
られた該複合体を含有しないＨＳＡを提供するものであ
る。以下、本発明について詳述する。
アルカリ性溶液で処理して単量体化する際に、ヒト血清
アルブミンのミスホールディングを抑制する方法であっ
て、該ヒト血清アルブミン溶液をＳＨ基含有化合物の存
在下、アルカリ性溶液で処理することを特徴とする方法
を提供するものである。本発明はまた、該方法により得
られた該複合体を含有しないＨＳＡを提供するものであ
る。以下、本発明について詳述する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、ヒト血清アルブ
ミンの製造工程の中でヒト血清アルブミン多量体を単量
体化する際に使用されるアルカリ性溶液に、ＳＨ基含有
化合物を存在させることを特徴とする。この方法を実施
することにより、ヒト血清アルブミンの分子内又は分子
間ミスホールディングが抑制され、高純度のヒト血清ア
ルブミンの製造が可能となる。
ミンの製造工程の中でヒト血清アルブミン多量体を単量
体化する際に使用されるアルカリ性溶液に、ＳＨ基含有
化合物を存在させることを特徴とする。この方法を実施
することにより、ヒト血清アルブミンの分子内又は分子
間ミスホールディングが抑制され、高純度のヒト血清ア
ルブミンの製造が可能となる。
【００１４】本発明に使用されるヒト血清アルブミン多
量体の由来については特に制限はなく、血漿由来のＨＳ
Ａ又は遺伝子組換え技術により生産されるｒＨＳＡから
生じたものをアルカリ性溶液処理に供することができ
る。以下、ＨＳＡ及びｒＨＳＡの多量体を単に多量体と
称することもある。
量体の由来については特に制限はなく、血漿由来のＨＳ
Ａ又は遺伝子組換え技術により生産されるｒＨＳＡから
生じたものをアルカリ性溶液処理に供することができ
る。以下、ＨＳＡ及びｒＨＳＡの多量体を単に多量体と
称することもある。
【００１５】血漿からＨＳＡを製造する際、各製造工程
で多量体を生じることが予測されるが、いずれの工程で
生じた多量体含有水溶液も使用可能である。例えば、低
温アルコール分画の画分Ｖの水溶液、画分Ｖを更なる精
製工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際
に生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられ
る。
で多量体を生じることが予測されるが、いずれの工程で
生じた多量体含有水溶液も使用可能である。例えば、低
温アルコール分画の画分Ｖの水溶液、画分Ｖを更なる精
製工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際
に生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられ
る。
【００１６】ｒＨＳＡ製造の際に生じた各製造工程の多
量体含有水溶液も同様に使用することができる。例え
ば、ｒＨＳＡ産生宿主の培養物、該培養物を更なる製造
工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際に
生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられ
る。ここで、培養物とは、上記宿主を培養した培養液及
び宿主を通常使用される方法で破砕した宿主破砕液を含
むものとする。
量体含有水溶液も同様に使用することができる。例え
ば、ｒＨＳＡ産生宿主の培養物、該培養物を更なる製造
工程（クロマトグラフィー、熱処理など）に供した際に
生じた各精製段階の多量体含有水溶液などが挙げられ
る。ここで、培養物とは、上記宿主を培養した培養液及
び宿主を通常使用される方法で破砕した宿主破砕液を含
むものとする。
【００１７】ｒＨＳＡの生産に用いる宿主としては、ｒ
ＨＳＡを生産することができる宿主であれば特に制限は
なく、例えば、酵母、細菌、動物細胞、植物細胞などが
挙げられ、好ましくは、酵母が使用される。
ＨＳＡを生産することができる宿主であれば特に制限は
なく、例えば、酵母、細菌、動物細胞、植物細胞などが
挙げられ、好ましくは、酵母が使用される。
【００１８】製造過程でＨＳＡ又はｒＨＳＡ中に含まれ
る多量体をアルカリ性溶液処理する際のＨＳＡ又はｒＨ
ＳＡの濃度は、該ＨＳＡ又はｒＨＳＡが溶解する濃度で
あれば特に制限はないが、好ましくは、100 mg/ml以下
の濃度である。
る多量体をアルカリ性溶液処理する際のＨＳＡ又はｒＨ
ＳＡの濃度は、該ＨＳＡ又はｒＨＳＡが溶解する濃度で
あれば特に制限はないが、好ましくは、100 mg/ml以下
の濃度である。
【００１９】ＨＳＡ又はｒＨＳＡの多量体を単量体化す
る際のアルカリ性溶液のｐＨは、好ましくは8〜11、さ
らに好ましくは、ｐＨ8.5〜9.5、最も好ましくは9.0で
ある。
る際のアルカリ性溶液のｐＨは、好ましくは8〜11、さ
らに好ましくは、ｐＨ8.5〜9.5、最も好ましくは9.0で
ある。
【００２０】アルカリ処理液のｐＨをアルカリ性にする
のに使用される化学物質は、特に限定されない。例え
ば、アルカリ性有機化合物、アルカリ性無機化合物、具
体的には、アンモニア、アンモニウム塩、塩基性金属水
酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム）、ホウ酸塩、リン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、クエン酸
塩、トリスヒドロキシアミノメタン及びこれらの2種以
上の混合物からなる群より選ばれる物質が挙げられる。
のに使用される化学物質は、特に限定されない。例え
ば、アルカリ性有機化合物、アルカリ性無機化合物、具
体的には、アンモニア、アンモニウム塩、塩基性金属水
酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム）、ホウ酸塩、リン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、クエン酸
塩、トリスヒドロキシアミノメタン及びこれらの2種以
上の混合物からなる群より選ばれる物質が挙げられる。
【００２１】かかる化学物質は、多量体を含有する水溶
液の濃度により異なるが、ＨＳＡ又はｒＨＳＡを変性さ
せない濃度範囲で使用される。ヒト血清アルブミンの多
量体の単量体化は、多量体を含有する水溶液をアルカリ
性にした後、所定時間、好ましくは15分以上、さらに好
ましくは３時間以上放置することにより行われる。放置
時間の上限は特に限定されない。アルカリ処理を行う際
の温度は、ＨＳＡ及びｒＨＳＡを変性させない温度以下
であれば良く、例えば、0〜65℃、好ましくは10〜40
℃、さらに好ましくは室温(約25℃)である。アルカリ性
溶液処理の際にＨＳＡ又はｒＨＳＡ溶液中に存在させる
ＳＨ基含有化合物としては、官能基ＳＨ基を含む化合物
であれば特に限定されないが、ＳＨ基を有する低分子化
合物が好ましい。具体的には、システイン、システアミ
ン、シスタミン、メチオニンなどが挙げられるが、好ま
しくは、システインが用いられる。ＳＨ基含有化合物
は、1〜100 mg/mlのＨＳＡ又はｒＨＳＡ濃度に対して、
好ましくは0.1〜50 mM、さらに好ましくは0.2〜15 mM、
最も好ましくは、0.5〜5mMの終濃度となるように添加さ
れる。
液の濃度により異なるが、ＨＳＡ又はｒＨＳＡを変性さ
せない濃度範囲で使用される。ヒト血清アルブミンの多
量体の単量体化は、多量体を含有する水溶液をアルカリ
性にした後、所定時間、好ましくは15分以上、さらに好
ましくは３時間以上放置することにより行われる。放置
時間の上限は特に限定されない。アルカリ処理を行う際
の温度は、ＨＳＡ及びｒＨＳＡを変性させない温度以下
であれば良く、例えば、0〜65℃、好ましくは10〜40
℃、さらに好ましくは室温(約25℃)である。アルカリ性
溶液処理の際にＨＳＡ又はｒＨＳＡ溶液中に存在させる
ＳＨ基含有化合物としては、官能基ＳＨ基を含む化合物
であれば特に限定されないが、ＳＨ基を有する低分子化
合物が好ましい。具体的には、システイン、システアミ
ン、シスタミン、メチオニンなどが挙げられるが、好ま
しくは、システインが用いられる。ＳＨ基含有化合物
は、1〜100 mg/mlのＨＳＡ又はｒＨＳＡ濃度に対して、
好ましくは0.1〜50 mM、さらに好ましくは0.2〜15 mM、
最も好ましくは、0.5〜5mMの終濃度となるように添加さ
れる。
【００２２】遺伝子組換え技術を応用した製造において
は、ｒＨＳＡを分泌する宿主の培養液又は該ｒＨＳＡ産
生宿主を破砕した直後の破砕物を低速遠心分離した後、
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、塩析、キレー
トクロマト、疎水性クロマト及び吸着クロマトなどの種
々の精製方法又はこれらの組み合わせによる方法により
高純度に精製される。
は、ｒＨＳＡを分泌する宿主の培養液又は該ｒＨＳＡ産
生宿主を破砕した直後の破砕物を低速遠心分離した後、
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、塩析、キレー
トクロマト、疎水性クロマト及び吸着クロマトなどの種
々の精製方法又はこれらの組み合わせによる方法により
高純度に精製される。
【００２３】また、血漿由来のＨＳＡは、例えば、ヒト
由来の血漿を低温エタノール分画し、約90％のＨＳＡを
含む画分Ｖを得た後、前記の精製方法を駆使して精製さ
れる。低温エタノール分画の前に、プロテアーゼによる
分解を防ぐために加熱処理されることもある。
由来の血漿を低温エタノール分画し、約90％のＨＳＡを
含む画分Ｖを得た後、前記の精製方法を駆使して精製さ
れる。低温エタノール分画の前に、プロテアーゼによる
分解を防ぐために加熱処理されることもある。
【００２４】本発明の方法は、前記のＨＳＡ又はｒＨＳ
Ａの製造過程におけるいずれの工程で使用しても良い。
好ましくは、ｐＨが５以下の条件でヒト血清アルブミン
溶液を処理する工程、例えば、陽イオン交換クロマトグ
ラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー後に生じた
多量体をアルカリ性溶液処理して単量体化する際に使用
するのが効果的である。
Ａの製造過程におけるいずれの工程で使用しても良い。
好ましくは、ｐＨが５以下の条件でヒト血清アルブミン
溶液を処理する工程、例えば、陽イオン交換クロマトグ
ラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー後に生じた
多量体をアルカリ性溶液処理して単量体化する際に使用
するのが効果的である。
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、血漿中のＨＳＡ又は遺
伝子組換え技術を応用して得たｒＨＳＡの製造工程中の
酸化雰囲気において、特異的に生じるヒト血清アルブミ
ンの分子内又は分子間ミスホールディングを効果的に抑
制することができる。
伝子組換え技術を応用して得たｒＨＳＡの製造工程中の
酸化雰囲気において、特異的に生じるヒト血清アルブミ
ンの分子内又は分子間ミスホールディングを効果的に抑
制することができる。
【００２６】また、本発明の方法により、ヒトに投与さ
れた場合アレルギーなどの副作用の原因となり得るミス
ホールディングによって生じた新規物質が低減された高
純度のヒト血清アルブミンを得ることができる。
れた場合アレルギーなどの副作用の原因となり得るミス
ホールディングによって生じた新規物質が低減された高
純度のヒト血清アルブミンを得ることができる。
【００２７】
【実施例】調製例：多量体を含有するヒト血清アルブミ
ン溶液の調製 特表平１１−５０９５２５に述べられている方法に従っ
て、酵母（Saccharomyces cerevisiae）によりｒＨＳＡ
を生産させた。このｒＨＳＡを含む培養液を精製水で約
２倍容量になるように希釈後、酢酸水溶液を用いてｐＨ
4.5に調整した。50 mM塩化ナトリウムを含む50 mM酢酸
ナトリウム緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化したストリームラ
インＳＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社製）(径60cm×16cm)に適用した。次に、カラムの平
衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄し、次に、300
mM塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)を
送液してｒＨＳＡ含有画分を得た。
ン溶液の調製 特表平１１−５０９５２５に述べられている方法に従っ
て、酵母（Saccharomyces cerevisiae）によりｒＨＳＡ
を生産させた。このｒＨＳＡを含む培養液を精製水で約
２倍容量になるように希釈後、酢酸水溶液を用いてｐＨ
4.5に調整した。50 mM塩化ナトリウムを含む50 mM酢酸
ナトリウム緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化したストリームラ
インＳＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社製）(径60cm×16cm)に適用した。次に、カラムの平
衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄し、次に、300
mM塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)を
送液してｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００２８】調製例に従って得られたｒＨＳＡ含有画分
50 mlに、終濃度0〜15 mMとなるようにシステインを添
加し、さらに0.5 N水酸化ナトリウム液（2.8 ml）を添
加してｐＨ約9.0に調整し、室温で５時間放置した。次
いで、該溶液に酢酸水溶液を加え、ｐＨ7.0に調整し、
アルカリ性溶液で処理を終了した。定法に従って、該溶
液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(10-20%グラディエントゲル)に続
き、ウェスターンブロットを行った。1次抗体には、ヤ
ギ抗-ヒト血清アルブミン、2次抗体には抗-ヤギIgG-HRP
コンジュゲートを用い、化学発光により発色させフィル
ムに転写後現像した。図1は、システイン無添加の際の
アルカリ性溶液で処理前後のウェスターンブロット分析
の結果を示す。アルカリ性溶液で処理後の試料では、
分子量約68,000に分子内ミスホールディングによるｒＨ
ＳＡのバンドが見られる。各種濃度のシステインを添加
し、アルカリ性処理して得られた試料について、このバ
ンドをクマシー染色し、解析ソフト(Collage Ver.3)で
各バンドの濃度を測定した。結果を表１に示す。各数値
は、システイン無添加時のバンドの濃度を100%とした相
対値である。
50 mlに、終濃度0〜15 mMとなるようにシステインを添
加し、さらに0.5 N水酸化ナトリウム液（2.8 ml）を添
加してｐＨ約9.0に調整し、室温で５時間放置した。次
いで、該溶液に酢酸水溶液を加え、ｐＨ7.0に調整し、
アルカリ性溶液で処理を終了した。定法に従って、該溶
液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(10-20%グラディエントゲル)に続
き、ウェスターンブロットを行った。1次抗体には、ヤ
ギ抗-ヒト血清アルブミン、2次抗体には抗-ヤギIgG-HRP
コンジュゲートを用い、化学発光により発色させフィル
ムに転写後現像した。図1は、システイン無添加の際の
アルカリ性溶液で処理前後のウェスターンブロット分析
の結果を示す。アルカリ性溶液で処理後の試料では、
分子量約68,000に分子内ミスホールディングによるｒＨ
ＳＡのバンドが見られる。各種濃度のシステインを添加
し、アルカリ性処理して得られた試料について、このバ
ンドをクマシー染色し、解析ソフト(Collage Ver.3)で
各バンドの濃度を測定した。結果を表１に示す。各数値
は、システイン無添加時のバンドの濃度を100%とした相
対値である。
【００２９】
【表１】
【００３０】アルカリ性処理の際にシステインを存在さ
せることにより、ヒト血清アルブミンの分子内ミスホー
ルディングが効果的に抑制されることがわかる。
せることにより、ヒト血清アルブミンの分子内ミスホー
ルディングが効果的に抑制されることがわかる。
【図１】調製例で得られたヒト血清アルブミン溶液のア
ルカリ性溶液で処理前後の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、
ウェスターンブロットを行った結果を示す写真である。
はアルカリ性溶液で処理前、はアルカリ性溶液で処
理後の試料を示す。
ルカリ性溶液で処理前後の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、
ウェスターンブロットを行った結果を示す写真である。
はアルカリ性溶液で処理前、はアルカリ性溶液で処
理後の試料を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横手 公幸 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 菊池研究所内 (72)発明者 宮津 嘉信 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 菊池研究所内 (72)発明者 牛尾 義高 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 菊池研究所内 (72)発明者 柴田 伸一 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 菊池研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AG24 CA06 CA19 CC24 CE20 DA01 4H045 AA20 BA10 CA42 EA20 FA73 FA74 HA06
Claims (17)
- 【請求項１】ヒト血清アルブミンの多量体をアルカリ性
溶液で処理して単量体化する際に、ヒト血清アルブミン
のミスホールディングを抑制する方法であって、該ヒト
血清アルブミン溶液をＳＨ基含有化合物の存在下、アル
カリ性溶液で処理することを特徴とする方法。 - 【請求項２】ヒト血清アルブミンが遺伝子組換え技術に
より生産される組換えヒト血清アルブミンである請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】アルカリ性溶液のｐＨが、８〜１１である
請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】アルカリ性溶液のｐＨが、８．５〜９．５
である請求項３記載の方法。 - 【請求項５】アルカリ性溶液のｐＨが、９．０である請
求項４記載の方法。 - 【請求項６】アルカリ性溶液での処理時間が、１５分以
上である請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】アルカリ性溶液での処理時間が、２〜８時
間である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】アルカリ性溶液での処理時間が、３〜４時
間である請求項７記載の方法。 - 【請求項９】アルカリ性溶液での処理が、０〜６５℃で
行われる請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】アルカリ性溶液での処理が、室温で行わ
れる請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】アルカリ性溶液が、アルカリ性有機化合
物又はアルカリ性無機化合物からなる群より選ばれる物
質で調製される請求項１ないし１０のいずれか１項記載
の方法。 - 【請求項１２】アルカリ性溶液が、アンモニア、アンモ
ニウム塩、塩基性金属水酸化物、ホウ酸塩、リン酸塩、
酢酸塩、蓚酸塩、クエン酸塩、トリスヒドロキシアミノ
メタン及びこれらの２種以上の混合物からなる群より選
ばれる物質で調製される請求項１ないし１１のいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項１３】ＳＨ基含有化合物の濃度が、０．１〜５
０ｍＭである請求項１ないし１２のいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項１４】ＳＨ基含有化合物の濃度が、０．２〜１
５ｍＭである請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】ＳＨ基含有化合物の濃度が、０．５〜５
ｍＭである請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】ＳＨ基含有化合物が、低分子化合物であ
る請求項１ないし１５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１７】ＳＨ基含有化合物が、システイン、シス
テアミン、シスタミン、及びメチオニンからなる群より
選ばれる物質である請求項１ないし１６のいずれか１項
記載の方法。
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| CA2395587A CA2395587C (en) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Method of monomerizing human serum albumin polymers |
| CNA2004101000611A CN1651462A (zh) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | 人血清白蛋白多聚体的单体化方法 |
| ES01978881T ES2261487T3 (es) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Metodo de monomerizacion de polimeros de albumina de suero humano. |
| AU10934/02A AU783571B2 (en) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Method of monomerizing human serum albumin polymers |
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| CNB018056474A CN1275981C (zh) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | 人血清白蛋白多聚体的单体化方法 |
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