JP2002051780A - プロモーター、それを有するベクター、および組換え微生物、並びにタンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ホスフォリパーゼＤなどのタンパク質を効率
良く生産できる、プロモーター、それを用いたベクタ
ー、および組換え微生物、並びにタンパク質の製造方法
を提供する。 【解決手段】 ストレプトバーティシリウム・シンナモ
ニウムのＤＮＡ由来の塩基配列であり、タンパク質生産
のためのタンパク質用塩基配列の上流側に結合されて、
上記タンパク質生産能の向上活性を有しているプロモー
ター、それを用いたベクター、および組換え微生物、並
びにタンパク質の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホスフォリパーゼ
Ｄ（phospholipase D 、以下、ＰＬＤという）などの酵
素のタンパク質を効率良く生産できる、プロモーター、
それを用いたベクター、および上記ベクターを組み込ん
だ組換え微生物、並びに上記組換え微生物によるタンパ
ク質の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＰＬＤは、高いエステル交換反応活性を
有するため、有用な各種のリン脂質合成反応への応用が
可能なものであり、その応用範囲を広げるために、ＰＬ
Ｄの工業化つまり大量生産による低廉化が期待されてい
る。

【０００３】このようなＰＬＤの有用性から、ＰＬＤを
大量分泌生産する微生物のスクリーニングが広範に行わ
れてきた。そのスクリーニングの結果、現時点では、放
線菌群のみが大量のＰＬＤを分泌生産することが知られ
ている。

【０００４】それら放線菌群の中でも、ストレプトバー
ティシリウム・シンナモニウム( ＩＦＯ12852)（Strept
overticillium cinnamoneum 、以下、Stv. cinnamoneum
(ＩＦＯ12852)と略記する）は、現時点において、分泌
ＰＬＤ活性の最も高い菌株であることが判っている(Nak
ajima et al., Biotechnol. Bioeng., Vol.44, 1193-11
98 (1994))。

【０００５】上記のＩＦＯ番号は、微生物の国内寄託機
関である、財団法人醗酵研究所（所在、大阪市）にて入
手できる微生物のカタログ番号である。なお、ストレプ
トバーティシリウムについては、分類上、ストレプトマ
イセス（Streptomyces）に分類されることがある。

【０００６】また、従来、野性株のStv. cinnamoneumに
ついて、肉エキスをベースとする培地を用い、培地組成
や培養条件を種々変更して、ＰＬＤの発現活性量を最大
化することが試みられたが、その発現活性は最大でも20
00単位／リットル（以下、U/L と略記する）程度であっ
た。本明細書では、単位中のL は、特に断らないかぎ
り、1000 cm³を示すものとする。

【０００７】また、得られたＰＬＤの精製が容易な、よ
り夾雑タンパク質の少ない TSB培地を用いた場合では、
野性株のStv. cinnamoneumにおける、ＰＬＤの発現活性
量はさらに低く、1500 U/L程度にとどまっていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ところが、上記従来で
は、培地中に分泌されるＰＬＤの含量割合が、まだ低い
ことから、得られたＰＬＤは、培地からＰＬＤを精製す
るのに手間取り、ＰＬＤの生産コストが高くなることに
よって高価なものとなり、ＰＬＤの適用可能範囲が制限
されるという問題を生じている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明のプロモーター(p
romoter)は、以上の課題を解決するために、ストレプト
バーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来の塩基
配列であり、ＰＬＤ等のタンパク質生産のためのタンパ
ク質用塩基配列(mat peptide) の上流側に結合されて、
上記タンパク質生産能の向上活性を有していることを特
徴としている。

【００１０】上記プロモーターとしては、配列番号１の
配列表における、塩基番号３８から塩基番号１４０７ま
での塩基配列を有する、または、上記塩基配列において
１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加さ
れた塩基配列からなり、タンパク質生産のためのタンパ
ク質用塩基配列の上流側に結合されて、上記タンパク質
生産能の向上活性を有しているものであってもよい。

【００１１】上記の構成によれば、ストレプトバーティ
シリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来の上記塩基配列
を有することにより、ＰＬＤなどのタンパク質の生産能
を向上させることができる。

【００１２】本発明のベクターは、以上の課題を解決す
るために、上記プロモーターと、上記プロモーターの下
流側にタンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列と
を有していることを特徴としている。

【００１３】上記ベクターでは、タンパク質用塩基配列
は、ＰＬＤの生産用であってもよく、また、ストレプト
バーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来のもの
であってもよい。

【００１４】さらに、上記タンパク質用塩基配列は、配
列番号１の配列表における、塩基番号１５１２から塩基
番号３０３０までの塩基配列、または上記塩基配列にお
いて１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付
加された、タンパク質生産能を備えた塩基配列であって
もよい。

【００１５】上記の構成によれば、上記プロモーターを
有することにより、例えば、ストレプトバーティシリウ
ム・シンナモニウムのＤＮＡ由来の、ホスフォリパーゼ
Ｄの生成用等のタンパク質用塩基配列によるタンパク質
生産能を向上させることが可能となる。

【００１６】上記ベクターにおいては、タンパク質用塩
基配列の下流側に、タンパク質の翻訳を停止するための
パリンドローム配列(terminator)を有していることが好
ましい。上記構成によれば、ＰＬＤなどのタンパク質の
生産能を向上させることができる。

【００１７】本発明の組換え微生物は、前記の課題を解
決するために、上記の何れかのベクターが宿主内に組み
込まれていることを特徴としている。上記組換え微生物
では、宿主は、放線菌であってもよく、また、ストレプ
トマイセス・リヴィダンスであってもよい。

【００１８】上記組換え微生物では、ベクターに組み込
まれたタンパク質用塩基配列に沿ったタンパク質の生産
能が、組み込まれたプロモーターによって、向上してお
り、上記タンパク質を効率よく、かつ、培地中にて高純
度にて生産できる。

【００１９】本発明のタンパク質の製造方法は、前記の
課題を解決するために、上記の何れかに記載の組換え微
生物を培養液中にて培養して、タンパク質用塩基配列に
基づくタンパク質を生産することを特徴としている。上
記製造方法では、培養液に、グルコースを添加すること
が好ましい。

【００２０】上記方法によれば、ベクター中に、上記プ
ロモーターが組み込まれていることによって、ＰＬＤな
どのタンパク質を効率よく、培地中に高純度にて分泌し
て生産することができる。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明の実施の形態について図１
ないし図１０に基づいて説明すれば、以下の通りであ
る。

【００２２】（１）放線菌からＤＮＡ（ゲノム）の抽出 放線菌からのＤＮＡ（ＰＬＤ生成用）抽出は、放線菌に
関する遺伝子操作技術を扱った、「Genetic Manupulati
on of Streptomyces」(Hopwood,D.A., Bibb,M.J., Chat
er,K.F., Kieser,T., Bruton,C.J., Kieser,H.M., Lydi
ate,D.J., Smith,C.P., Ward,J.M., and Schremph,H.
(1985) "Genetic Manupulation of Streptomyces: a La
boratory Manual", the John Innes Foundation, Norwi
ch)に記載の方法に従って行った。

【００２３】放線菌（Stv. cinnamoneum (ＩＦＯ1285
2)）を、滅菌した 100 mL のトリプティクソイブロス培
地（Tryptic Soy Broth 、以下、 TSB培地という）にて
振とう培養を、温度30℃にて48時間行った。この振とう
培養の際、培地中に、直径が２−３cm程の大きさのステ
ンレスコイルを加えた。これにより、振とう培養中にお
ける、フロック状菌体の形成を抑制した。

【００２４】上記TSB 培地としては、pancreatic diges
t of casein 17.0 g/L, papaic digest of soybean mea
l 3.0 g/L, dextrose 2.5 g/L, sodium chloride 5.0 g
/L,dipotassium phosphate 2.5 g/L を含むDifco 社製
のものを用いた。本明細書において、滅菌とは、飽和水
蒸気下、121 ℃で20分間曝すことにより、培地等の溶液
中に含まれる微生物を死滅させることである。

【００２５】培養終了後、得られた菌体を集菌し、ＴＥ
buffer（10mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA をオート
クレーブにて滅菌したもの）にて洗浄を３回行った。洗
浄後、5 mLのＴＥbufferに菌体を懸濁し、溶菌を促進さ
せるために、リゾチーム、アクロモペプチダーゼを、そ
れぞれ、2 mg/mL 、4 mg/mL となるように加え、30℃に
て液体の粘性が高くなるまで保温した（約30分間）。

【００２６】その後、溶菌溶液に対し、プロナーゼ、 E
DTA 、SDS をさらに加え、37℃にて２時間保温した。保
温終了後、溶菌溶液から、フェノール・クロロホルム抽
出法、ポリエチレングリセロール沈殿法にて、用いた放
線菌の染色体ＤＮＡをガラス棒にて取り出した。最後
に、取り出した染色体ＤＮＡにＲＮase 処理を施し、染
色体ＤＮＡ（ゲノム）の抽出操作を終了した。本明細書
では、ＰＬＤの生成に関する遺伝子については、 pld遺
伝子という。

【００２７】次に、 pld遺伝子プロモーター領域および
バリンドローム領域のＤＮＡ配列の決定について説明す
る。

【００２８】上述の取り出した染色体ＤＮＡ（ゲノム）
を制限酵素Ｓau 3Ａ1 で切断した後、断片化させた断片
ＤＮＡをそれぞれクローニングベクターｐＵＣ8 にライ
ゲーションし、大腸菌Nova Blue (Novagen社製）に形質
転換することにより、ゲノムライブラリーを構築した。

【００２９】ＰＬＤのアミノ酸配列解析の結果から、ア
ミノ酸末端側の約25アミノ酸配列が確認されていたた
め、そのアミノ酸配列に相当するＤＮＡプローブを作成
し、コロニーハイブリダイゼーションにより、 pld遺伝
子の同定を行った。その結果、pld遺伝子を部分的に含
む断片ＤＮＡを２種類取得した。

【００３０】一つは、ＰＬＤアミノ酸末端側の塩基配列
と、その上流約１５００ベース（塩基）を含む断片ＤＮ
Ａであり、他方は、ＰＬＤカルボキシル基末端側の塩基
配列とその下流約１０００ベース（塩基）を含む断片Ｄ
ＮＡであった。それぞれの断片ＤＮＡの塩基配列をサン
ガー法により解析し、重複する塩基配列を元に、 pld遺
伝子の地図（塩基配列）を構築した。

【００３１】解析した全塩基配列より、配列表に示すよ
うに、 pld遺伝子の下流側には、タンパク質翻訳を物理
的に終了させる機能を有するパリンドローム配列が存在
することが確認された。

【００３２】また、後述するように、上記 pld遺伝子を
組み込んだ放線菌におけるＰＬＤの高い分泌発現活性量
から、 pld遺伝子の上流側においては、強力な発現プロ
モーター配列が存在すると想定されたため、解析の終了
した上流側約１０００ベース（塩基）の塩基配列の領域
をプロモーター領域と設定した。上記プロモーター領域
は、配列番号１の配列表における、塩基番号３８から塩
基番号１４０７までである。

【００３３】（２）ｐＵＣ702-promoter−pld プラスミ
ドの構築 pld発現カセットを有する放線菌用の pld分泌発現ベク
ター（ｐＵＣ702-promoter-pld）の調製を以下の手順に
て行った〔図１ないし図３、並びに配列表を参照〕。 p
ld発現カセットとは、 pld遺伝子の上流側のプロモータ
ー領域（プロモーターおよびリボソーム結合サイト）、
pld遺伝子（シグナル配列(sig peptide) とmature pld
遺伝子(mat peptide) からなる）、および pld遺伝子の
下流側のパリンドローム配列とを有するものである。

【００３４】上記リボソーム結合サイトは、配列番号１
の配列表における、塩基番号１３９６から塩基番号１４
０３までである。上記シグナル配列は、配列番号１の配
列表における、塩基番号１４０８から塩基番号１５０９
までである。上記mature pld遺伝子は、シグナル配列を
含まない分泌後のＰＬＤ配列に対応する部分であり、配
列番号１の配列表における、塩基番号１５１０から塩基
番号３０３０までである。上記パリンドローム配列は、
配列番号１の配列表における、塩基番号３０３１から塩
基番号３２１３までである。

【００３５】また、配列番号２の配列表における、アミ
ノ酸番号−３４からアミノ酸番号−１は、シグナル配列
を示す。配列番号２の配列表における、アミノ酸番号１
からアミノ酸番号５０５は、ＰＬＤのアミノ酸配列を示
す。

【００３６】プラスミドの構築において、遺伝子操作
は、基本的にMolecular cloning 法に従って行った。ま
た、制限酵素は、New England Biolabs 社製のものを、
ライゲーションには、ＤＮＡライゲーションキットver2
（宝酒造製）を用いた。

【００３７】図１ないし図３には、プラスミド構築の手
順を示す。まず、図１に示す、放線菌Stv. cinnamoneum
(ＩＦＯ12852)由来の pld遺伝子プロモーター領域、 p
ld遺伝子、および pld遺伝子下流側のパリンドローム配
列からなる pld発現カセットをＰＣＲ(Polymerase Chai
n (amplification) Reaction) 法により増幅した。一般
に、放線菌はＧＣ含量が高いために、プロモーター領域
と pld遺伝子−パリンドローム配列とに二分割して、Ｐ
ＣＲ増幅を行った。

【００３８】その時に、シグナル配列部分にある開始コ
ドンであるTTG(ロイシン）を、ATG(メチオニン）になる
ようにプライマーを設計した。ＰＣＲ増幅条件として、
熱変性、アニーリング、伸長反応の温度および時間をそ
れぞれ、例えば94℃、60℃、68℃で15秒、30秒、７分と
して、この増幅を30サイクル行った。

【００３９】テンプレートとしては、Stv. cinnamoneum
の染色体を用いた。増幅には、ＫＯＤ-plus-ＤＮＡ-Pol
ymerase （東洋紡製）を使用し、ＰＣＲ増幅の増幅効率
を上げるために、反応系には終濃度10％となるように、
ＧＣ-Melt （Clonetech 社製）を加えた。

【００４０】プライマーとしては、プロモーター領域の
増幅には、5'-GGGTACCACGTCATGGCGGGTCTCTCTCGTCCG-3'
（Ｓ−ＰＬＤ-38-Ｋpn I）および5'-TCTGCATGCTGCATCCT
TAAACGAAGTAACGATTCCGCG-3' （ＡＳ−Ｐro−Ｓph I）を
使用し、 pld遺伝子−パリンドローム配列の増幅には、
5'-ACAGCATGCTCCGCCACCGGCTCCGCCGTTTACACCGCT-3' （Ｓ
−Ｓig−Ｓph I）および5'-GGTAAGCTTGGTACCATTTCCTCGC
TGGTCGGTTCGGGGCCAGCGCAT-3'（ＡＳ−Ｈin dIII ・Ｋpn
I-3213 ）を使用した。

【００４１】ＰＣＲ法で増幅したプロモーター領域のフ
ラグメントは、制限酵素Ｋpn Iおよび制限酵素Ｓph Iで
切断し、同一酵素で切断したｐＵＣ18とライゲーション
した後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラスミド
ｐＵＣ18-promoter を得た。

【００４２】一方、 pld遺伝子−パリンドローム配列の
フラグメントは、制限酵素Ｓph Iおよび、Ｈin dIII サ
イトで切断し、同一酵素で切断したｐＵＣ19とライゲー
ションした後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラ
スミドｐＵＣ19-pldを得た。

【００４３】プラスミドｐＵＣ18-promoter およびプラ
スミドｐＵＣ19-pldの遺伝子配列は、ＤＮＡシーケンサ
ー（ＰＥ-biosystem gene analyzer 310）により確認し
た。

【００４４】次に、図２に示すように、ｐＵＣ19-pldプ
ラスミドから制限酵素Ｓph IおよびＨin dIII により、
pld遺伝子−パリンドローム配列のフラグメントを切り
出し、同じく制限酵素Ｓph IおよびＨin dIII で切断し
たｐＵＣ18-promoter とライゲーションした後に、大腸
菌 Nova Blueに対し形質転換し、プロモーター領域-pld
遺伝子−パリンドローム配列からなる pld発現カセット
を有するプラスミドｐＵＣ18-promoter-pld を得た。

【００４５】一方、図３に示すように、シャトルベクタ
ーｐＵＣ702 を調製した。ｐＵＣ702 は、大腸菌用ベク
ターｐＵＣ19、および放線菌用ベクターｐＩＪ702 をＳ
ac IおよびＫpn Iサイトで結合したもので、以下の報文
に記載の方法に従って調製した（報文名：Molnar et a
l., J. Ferment. Bioeng., 72, 368-372 (1991)）。

【００４６】続いて、ｐＵＣ18-promoter-pld プラスミ
ドから pld発現カセットを含むフラグメントを制限酵素
Ｋpn Iにより切り出し、同じく制限酵素Ｋpn Iにより切
断した上記シャトルベクターｐＵＣ702 とライゲーショ
ンした後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラスミ
ドｐＵＣ702-promoter−pld を得た。このプラスミドｐ
ＵＣ702-promoter−pld の発現カセットが正しい向きに
挿入されたか否かについては、ＤＮＡシーケンサーによ
り確認した。

【００４７】（３）ｐＵＣ702-mature pldプラスミドの
構築 上記のプロモーター領域を持たない放線菌（Stv. cinna
moneum (ＩＦＯ12852)）由来の pld遺伝子発現ベクター
を、比較例として、シャトルベクターｐＵＣ702 を用
い、図３ないし図５に示すように構築した。

【００４８】まず、図４に示すように、二段階のＰＣＲ
法により、 pld遺伝子を増幅させた。First ＰＣＲの条
件として、熱変性、アニーリング、伸長反応の温度およ
び時間を、それぞれ、例えば98℃、52℃、72℃で、45
秒、45秒、４分とし、この増幅を25サイクル行った。テ
ンプレートとしては、Stv. cinnamoneumの染色体を使用
した。増幅には、Pyrobest−ＤＮＡ-polymerase(宝酒造
製）を用い、終濃度10％となるように、ＧＣ-Melt(Clon
etech 社製）を反応系に加えた。

【００４９】増幅用のプライマーとしては、5'-CCCGGGA
GCTGATAGCTTCTCCGCGTTGATCTTCC-3'（Genome-S）および
5'-CCATGATTACGAATTCCCGGGGATCTTGGT-3'（Genome2-AS）
を使用した。 Second ＰＣＲの条件は、テンプレートと
してFirst ＰＣＲ後の生成物を使用し、増幅用のプライ
マーとして、5'-TCGGAATTCGAGGTACCATGCTCCGCCACCGGCTC
CGC-3'（Ｅco−Ｋpn−Ｓig−ＦＷ−ＰＬＤ）および5'-G
CAGGTACCCCCCCTTGGCCGCGATTCCCG-3'（Ｋpn-Palind-ＲＶ
−ＰＬＤ）を使用した。それ以外の増幅条件はFirst Ｐ
ＣＲと同様である。

【００５０】続いて、ＰＣＲ後、図５に示すように、増
幅されたフラグメント（シグナル配列−mature pld遺伝
子−パリンドローム配列を含む）を制限酵素Ｋpn Iで切
断し、同一酵素で切断したｐＵＣ19とライゲーションし
た後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラスミドｐ
ＵＣ19-pldを得た。このプラスミドの pld遺伝子の配列
をＤＮＡシーケンサーにて確認した。

【００５１】ｐＵＣ19−pld プラスミドをＫpn Iで切断
して、シグナル配列−mature pld遺伝子−パリンドロー
ム配列を含むフラグメント（断片ＤＮＡ）を回収した。
同一酵素で切断した、図３に示すシャトルベクターｐＵ
Ｃ702 とライゲーションした後に、大腸菌 Nova Blueに
形質転換することで、プラスミドｐＵＣ702-pld を得
た。このｐＵＣ702-pld プラスミドの pld遺伝子部分が
正しい向きに挿入されたか否かについては、ＤＮＡシー
ケンサーにより確認した。

【００５２】（４）放線菌のプロトプラスト調製 放線菌プロトプラストの調製および後述する形質転換
は、前述した「GeneticManupulation of Streptomyce
s」の記載に従って行った。放線菌としては、ストレプ
トマイセス・リヴィダンス（Streptomyces lividans 13
26株）、以下、S.lividansと略記する）を使用した。S.
lividansを滅菌した5 mLの TSB培地に植菌し、30℃にて
２〜３日間種培養を行った。

【００５３】続いて、坂口フラスコに 150 mL のYEME培
地と、前述のステンレスコイルとを入れ、種培養液１mL
を植菌し、36時間〜40時間、30℃にて本培養を行った。
上記YEME培地は、Difco yeast extract 3 g/L 、Difco
bacto-peptone 5 g/L 、Difco malt extract 3 g/L、gl
ucose 10 g/L、sucrose 340 g/L を含み、オートクレー
ブにて滅菌した後、 MgCl₂・6H₂O(2.5M) 2 mL/L 添加、
glycine(20％) 25 mL/L を含むものである。

【００５４】培養終了後（S.lividansの色素が赤くなる
前）、培養された菌体を含む培地を取り出し、上記培地
に対し3000 rpm、10分間の遠心操作を行った。遠心され
た培地から上清を除き、残った菌体を50 mL の10.3％ s
ucrose溶液で２回洗浄した。

【００５５】洗浄後の菌体に、15 mL になるまでリゾチ
ーム(lysozyme)溶液（ 2 mg/mL inＬbuffer、フィルタ
ー滅菌）を加えた菌体懸濁液を調製し、上記菌体懸濁液
を30℃にて30分間保温した。上記菌体懸濁液は、沈殿が
生じる度によく攪拌した。

【００５６】その後、上記菌体懸濁液に対し、15 mL の
Ｐbufferを加え、よく攪拌し、続いて、上記菌体懸濁液
を滅菌したコットンウールによりろ過した。ろ過後のろ
液を、3000 rpm、７分間の遠心操作を行った。

【００５７】遠心されたろ液から上清を除くことにより
得られた菌体に対しＰbufferを加えた。Ｐbufferを加え
る量は、血球計による測定において、４〜５×１０⁹/mL
となるよう調節した。そのように調製された菌体プロト
プラスト懸濁溶液を、滅菌チューブに分注し、−70℃で
保存した。

【００５８】Ｌ(Lysis) bufferは、sucrose(10.3％) 10
0 mL、TES buffer(5.73 ％, pH7.2)10 mL、K₂SO₄(2.5
％) 1 mL、trace element solution 0.2 mL 、KH₂PO
₄(0.5％) 1 mL、 MgCl₂・6H₂O(2.5M) 0.1 mL 、CaCl
₂(2.5M) 1 mLに蒸留水を加えて１ Lとしオートクレーブ
滅菌した溶液に対し、使用直前にリゾチーム（ナカライ
製）を、2 mg/mL となるように加えたものである。

【００５９】Ｐ(protoplast)bufferは、sucrose 10.3
g、K₂SO₄ 0.025 g 、 MgCl₂・6H₂O 0.202 g、trace ele
ment solution 0.2 mL を蒸留水で溶かし80 mL として
オートクレーブ滅菌したものに対し、これとは別に、そ
れぞれオートクレーブ滅菌済の、KH₂PO₄(0.5％) 1 mL、
CaCl₂・2H₂O(3.68 ％) 10 mL 、TES buffer( ナカライ
製、TES 粉末を5.73％となるように溶解し、pHを7.2 に
調整したもの）10 mL をそれぞれ添加したものである。

【００６０】trace element solutionは、ZnCl₂ 40 mg/
L 、 FeCl₃・6H₂O 200 mg/L 、 CuCl₂・2H₂O 10 mg/L、
MnCl₂・4H₂O 10 mg/L、 Na₂B₄O₇・10H₂O 10 mg/L 、(N
H₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O 10 mg/Lとなるように、それぞれを蒸
留水に溶解したものである。

【００６１】（５）放線菌の形質転換 宿主として、上述したようにプロトプロスト化した放線
菌であるS.lividansを用いた。上述したように調製した
S.lividansのプロトプラストの懸濁溶液の冷凍物を素早
く解凍し、室温で3000 rpm、７分間の遠心操作を行っ
た。続いて、前述した（２）に記載のプラスミド溶液を
20 μL 加え、次に、0.5 mLのＴbufferを加えて素早く
ピペッティングを行った。

【００６２】Ｔbufferを加えて３分以内に、5 mLのＰbu
fferを加え、軽く遠心操作( 3000 rpm、30秒間）を行っ
た。上清を除き、沈殿した残渣に対し、0.5 mLのＰbuff
erを加え、0.1 mLずつ、各R2YEプレートの表面にほぼ均
一に塗布して30℃にて保温した。

【００６３】１日〜２日後、塗布された各R2YEプレート
に対し、Tiostreptone( 和光純薬製、Stock solutionと
して50 mg/mL in ＤＭＳＯ) を終濃度 500μg/mLとなる
ように加えた 0.7％ soft agar（ナカライ製）を 3 mL
ずつ、それぞれ、ほぼ均一に塗布して、同じく30℃にて
保温した。これにより、宿主である放線菌S.lividansの
形質転換（組換え微生物）を完了した。

【００６４】この組換え微生物は、（財）発酵研究所
（大阪）に対し、名称:Streptomyceslividans /pUC702-
PLD（ＩＦＯ 16465）として寄託されているものです。
また、前述の（３）に記載のプラスミド溶液についても
同様に操作して形質転換した放線菌S.lividans（組換え
微生物）を得た。

【００６５】Ｔ(Transformation)bufferは、75 mL の蒸
留水に、35.8 g PEG1000を溶解したＳＥPEG1000 溶液
と、sucrose(10.3％) 25 mL 、前述のtrace element so
lution0.2 mL 、および、K₂SO₄(2.5 ％) 1 mLとを混合
して、オートクレーブ滅菌したものを、9.3 mLとり、別
々にオートクレープ滅菌済の、CaCl₂(5M) 0.2 mL、Tris
-maleic acid buffer 0.5 mLを加えたものである。上記
のTris-maleic acid buffer は、 1 MのTris buffer 溶
液のpHをリンゴ酸(maleic acid) にて8.0 に調整したも
のである。

【００６６】R2YEプレートは、R2YE培地 100 mL に対し
て、2.2 g のDifco Bacto agarを加えオートクレーブ滅
菌し、そのagarが固化する前に、別々にオートクレーブ
滅菌済の、KH₂PO₄(0.5％) 1 mL、 CaCl₂・2H₂O(5M) 0.4
mL 、L-proline(20％) 1.5mL 、NaOH(1 N) 0.7 mLを加
え、滅菌済のシャーレに所定量注入して、R2YEプレート
としたものである。R2YE培地は、sucrose 103 g 、K₂SO
₄ 0.25 g、 MgCl₂・6H ₂O 10.12 g、glucose 10 g、Difc
o casaminoacids 0.1 g 、trace element solution 2 m
L 、Difco yeast extract 5 g 、および、TES buffer
5.73 g を蒸留水1 Lに溶解して調製したものである。

【００６７】（６）組換えS.lividans（組換え微生物）
の培養 上述した方法により得られた組換えS.lividansを、通気
攪拌型培養装置を用いて培養を行った。まず、前述のTi
ostreptone（終濃度 5μg/mL）を加えた TSB培地 5 mL
を入れた試験管に、R2YEプレートから植菌し、30℃で培
養を２日〜３日間行った。さらに、坂口フラスコに TSB
培地 100 mL と、Tiostreptone（終濃度5μg/mL）を加
え、上記試験管の種培養液 1 mL を植菌し、さらに、30
℃で培養を２日〜３日間行った。

【００６８】本培養として、通気攪拌型培養装置（エイ
ブル社製、2 L のジャーファーメンター(BMJ-02PI)）
に、 TSB培地 1 LとTiostreptone（終濃度 5μg/mL）と
を加え、坂口フラスコの種培養液 50 mLを植菌した。培
養は、培養温度28℃、pH=7.0、DO（溶存酸素濃度）＝ 2
ppm、通気量 2 vvmに設定して制御することで行った。

【００６９】（７）ＰＬＤの活性測定 ＰＣ（ホスファチジルコリン、レシチン(Lecithin)とも
いう）をＰＬＤによって加水分解させたときに生成する
コリンを、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼとフ
ェノールに反応させると、赤色キノン色素を生成する。
この色素をコリンエステラーゼＢ−テストワコー（和光
純薬製）を用いて、分光光度計で測定することにより、
上記ＰＬＤの活性を測定した。１単位（Ｕ）の酵素活性
の定義を、１分間に１μモル（mol)のコリンを遊離する
こととする。

【００７０】まず、反応基質混合溶液を調製する。上記
反応基質混合溶液におけるチューブ１本当たりの混合組
成を、H₂O 40μL 、200 mMのTris-HCl(pH=7.4) 20 μL
、10mM のCaCl₂ 10μL 、１％Triton X-100 10 μL 、
50 mg/mLのLecithin Emulsion 10μL とした。上記Leci
thin Emulsion は、卵から得られたLecithin 500 mgを
1 mL のジエチルエーテルに溶解し、水で 10 mLにメス
アップしたものを超音波懸濁させたものである。

【００７１】ＰＬＤの活性測定では、ＰＬＤ酵素溶液 1
0 μL に対し、上述の反応基質混合溶液 90 μL を混合
し、よく攪拌し、37℃で10分間反応させた。反応後、0.
5 mMのEDTAを加え、反応を停止させた。次に、基質酵素
剤（コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノー
ル）500 μL を加え、37℃で５分間保温し、反応停止液
500 μL を加え、反応を停止させた。

【００７２】次に、検量線を作成する。水と、コリンエ
ステラーゼＢ−テストワコーの基準液とを、それぞれ、
150 μL と0 μL 、140 μL と10μL 、130 μL と20μ
L 、120 μL と30μL で混合し、それらの吸光度（波長
505 nm ）を分光光度計にてそれぞれ測定した。それぞ
れの吸光度の値が、0 U/L 、500 U/L 、1000 U/L、1500
U/LとなるＰＬＤ活性に相当するとして検量線を作成し
た。この検量線を用いて、試料中のＰＬＤ活性を決定し
た。

【００７３】（８）電気泳動法（SDS-PAGE） ＰＬＤの分泌発現を確認するため、12.5％の分離ゲルを
用いて、SDS-PAGE電気泳動を行った。電気泳動において
は、培地サンプル 20 μL を用いた。ゲルの染色は色素
(Coomassie Brilliant Blue)を用いて行った。上記電気
泳動は、文献（Garfin et al., Methods Enzymol. 182,
425-441 (1990) ）に記載の方法に基づいて行った。

【００７４】（９）ＰＬＤの精製 培地中に分泌生産されたＰＬＤの精製は、pH6 におけ
る、陽イオン交換樹脂（Macroprep high S (バイオラッ
ド社製など））によって行った。溶出は、塩化ナトリウ
ムの段階溶出（0.5 M)あるいは直線的濃度勾配法（0-0.
5 M)にて行った。また、ヘパリンアフィニティークロマ
トグラフィーも同等の効果を示した。

【００７５】発明者らは、Stv. cinnamoneum（ＩＦＯ 1
2852) 由来の pld遺伝子のクローニングを行い、各種遺
伝子発現系を利用した組換え微生物による、ＰＬＤの高
効率生産プロセスを見出した。

【００７６】まず、本発明者らは、以前において、組換
えベクターを用いたＰＬＤの発現系として、大腸菌や酵
母（Pichia pastoris)を用いた発現系の構築を試みた
が、最も発現活性能が高い野性株のStv. cinnamoneumに
対し、大腸菌の場合は１／２０、酵母の場合は１／４の
発現活性量しか確認することができなかった。ただし、
上記の各場合でも、タンパク質としてのＰＬＤの生産量
自体は、大量確認できたことから、これらの発現系で
は、放線菌由来のＰＬＤが天然型の正しい立体構造を形
成することが阻害されているため、発現活性量が低くな
ったものと思料された。

【００７７】山根らも、放線菌（Streptomyces antibio
ticus)由来のＰＬＤを用いた、大腸菌における分泌生産
系の開発を行っているが、最大でも、その発現活性量は
約3500 U/L程度であった（Iwasaki et al., J. Fermen
t. Bioeng., 79, 417-421 (1995) ）。したがって、放
線菌ＰＬＤの高分泌生産系の開発には、放線菌の宿主−
ベクター系の開発が極めて重要であると考えられた。

【００７８】そこで、本発明者らは、放線菌の一種であ
るS.lividansを宿主とし、Stv. cinnamoneum由来の pld
遺伝子を組み込んだ発現系（ｐＵＣ702-pld 、図３ない
し図５に示す）、さらに pld遺伝子に対し、さらにプロ
モーター領域を組み込んだ発現系（ｐＵＣ702-promoter
-pld、図１ないし図３に示す）の構築を行った。構築し
た各組換えプラスミドを、それぞれ、放線菌であるS.li
vidansに形質転換し、形質変換した各S.lividansを試験
管により培養した。

【００７９】その結果、S.lividans／ｐＵＣ702-pld の
発現系においては、野性株のStv. cinnamoneumと同等の
発現量しか確認することができなかったが、S.lividans
／ｐＵＣ702-promoter-pldの発現系（試験管培養では、
20000 U/L ）では、野性株のStv. cinnamoneum（試験管
培養では、1300 U/L）に対し、著しく大きな発現量（約
１５倍量）を確認することができた。

【００８０】したがって、本発明に係るプロモーター
は、所望するＰＬＤ等のタンパク質の菌体外生産におい
て極めて強力であり、ＰＬＤを始めとする種々な組換え
タンパク質の発現において極めて有効であると考えられ
た。

【００８１】そこで、通気攪拌型培養槽を用いて、この
発現系S.lividans／ｐＵＣ702-promoter-pldの培養条件
の最適化に関する検討を行った。条件としては、前述の
TSB培地に初発添加グルコース濃度をそれぞれ、0 g/l
、5 g/l 、15 g/l、30 g/lとし、培養温度28℃、pH=7.
0、およびDO（溶存酸素濃度）＝ 2 ppmにコントロール
することで、それぞれ培養を行った。

【００８２】図６に示すように、グルコースを添加しな
いときは、培地中の分泌ＰＬＤの活性が約 20000 U/Lで
あったが、図７ないし図９に示すように、グルコースの
添加量の増加に従ってＰＬＤ生産量は増加し、グルコー
スを 30 g/l 添加することにより、培地中に約 30000 U
/LのＰＬＤ活性を分泌生産することができることが判
る。このＰＬＤ活性は、野性株のStv. cinnamoneumのＰ
ＬＤ活性（同じ TSB培地では 1500 U/L ）と比べると、
約２０倍の発現量であり、野性株のStv. cinnamoneumの
ＰＬＤ活性（培地は異なるが最適化し場合では 2000 U/
L ）と比べると、約１５倍の発現量である。

【００８３】ただし、初発グルコース濃度を、 30 g/l
を超えて大きくしても、菌体量は増加するものの、ＰＬ
Ｄの生産量は増加しなかった。これは、過剰なグルコー
スの存在に起因するカタボライトリプレッションの影響
によるものと考えられた。上記カタボライトリプレッシ
ョンは、異化産物抑制、つまり、グルコースなどの代謝
産物によって多数の酵素の合成が阻害されることを意味
する。

【００８４】さらに、初発のグルコース濃度 15 g/l の
場合について、培地中に分泌生産されたＰＬＤの純度を
電気泳動（SDS-PAGE）により、図１０に示すように、確
認した。ＣＢＢ色素染色では、夾雑タンパク質がほとん
ど見られず、ほぼＰＬＤがシングルバンドとして確認す
ることができた。

【００８５】この培地中に分泌生産されたＰＬＤタンパ
ク質を、SDS-PAGEのバンドより定量したところ、約 75
mg/Lであった。この定量値からＰＬＤの活性を計算する
と、約 400 U/Lとなった。以前、本発明者らは、Stv. c
innamoneumから精製を行った天然型ＰＬＤの活性は、 4
68 U/Lであった(Ogino et wl., J. Biochem., 125, 263
-269 (1999))。このことから、本発明において得られた
ＰＬＤは、天然型のＰＬＤに極めて近い値を有してい
た。

【００８６】よって、本発明に係るＰＬＤ（タンパク
質）の製造方法では、培地中のＰＬＤは、高濃度で、か
つ高純度であり、その上、得られたＰＬＤの活性も、天
然型のＰＬＤに極めて近いことから、大腸菌を始めとす
る、従来の各種の発現系での問題点を全て解決できたこ
とが判る。

【００８７】また、本発明に係るＰＬＤの製造方法は、
培地中に分泌されるＰＬＤ純度が高いことから、ＰＬＤ
の分離回収が、菌体除去後に、一段のイオン交換カラム
を用いたイオン交換クロマトグラフィーで可能であるの
で、極めて、迅速かつ安価に、上記ＰＬＤを精製でき
て、上記ＰＬＤの生産コストを軽減できるものとなって
いる。

【００８８】以上のように、本発明者らが見出した放線
菌由来のプロモーターをベクターに組み込んだ放線菌
（組換え微生物）由来のＰＬＤ発現系は、天然型に極め
て近い高活性なＰＬＤを培地（つまり菌体外）中に、高
純度、かつ高濃度な形態で大量生産できることから、極
めて有効なＰＬＤ発現系であることが判る。

【００８９】このように、培地中に、組換えタンパク質
を高純度に分泌生産できる発現系は、従来少なく、上記
ＰＬＤ以外の、有用な各種のタンパク質生産への応用が
想定される。つまり、本発明に係るベクター（プラスミ
ド）の発現カセット（プロモーター−シグナル配列−パ
リンドローム配列）は、例えば、コレステロールオキシ
ダーゼ等の、各種放線菌由来の有用タンパク質の分泌生
産を始めとして、各種有用タンパク質の分泌生産におい
て極めて有効なものと想定された。

【００９０】また、本発明の組換え微生物であるS.livi
dans／ｐＵＣ702-promoter-pldは、Stv. cinnamoneumと
同様に（Fukuda et al., Biotechnol. Lett., 18, 951-
956(1996)）、微生物保持粒子（ＢＳＰs)への効率的な
固定化を行うことができるため、固定化菌体を利用し
た、ＰＬＤを始めとする有用タンパク質の連続生産も可
能であり、有用タンパク質の生産能を飛躍的に向上させ
て、上記有用タンパク質の低廉化を図ることができるも
のである。

【００９１】

【発明の効果】本発明のプロモーターは、以上のよう
に、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのＤ
ＮＡ由来の塩基配列であり、タンパク質生産のためのタ
ンパク質用塩基配列の上流側に結合されて、上記タンパ
ク質生産能の向上活性を有している構成である。

【００９２】本発明のベクターは、以上のように、上記
プロモーターと、上記プロモーターの下流側に、ＰＬＤ
等のタンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列とを
有している構成である。

【００９３】本発明の組換え微生物は、以上のように、
上記ベクターが、放線菌等の宿主内に組み込まれている
構成である。

【００９４】本発明のタンパク質の製造方法は、以上の
ように、上記組換え微生物を培養液中にて培養して、タ
ンパク質用塩基配列に基づくタンパク質を生産する方法
である。

【００９５】それゆえ、上記構成および方法は、上記プ
ロモーターを用いたことにより、ＰＬＤ等のタンパク質
の生産能を向上させることができ、上記タンパク質を工
業化により低廉化できて、適用範囲を広げることができ
るという効果を奏する。

【００９６】

【配列表】 <110> 財団法人新産業創造研究機構 ＴＬＯひょうご Zaidanhoujin Shinsangyosouzoukenkyukikou TLO Hyogo <120> プロモーター、それを有するベクター、および組換え微生物、並びにタン パク質の製造方法 <160> 2 <210> 1 <211> 3477 <212> DNA <213> Streptoverticillium cinnamoneum <400> 1 tgcggggaga cccgggccgc ctgcaggccg gtctgtgacg tcatggcggg tctctctcgt 60 ccggtggcgg atgcgtcggt gtacggggct gccgtggccg gcacgtcagc gggccggggc 120 cgtcgggacg tccgtgagcc ccagctcggc ccgcgccgcg tcgaccatgt ccctggcgtg 180 cagcagcccc agttcgccga gcgtgcgacg cagcgcctcc aggtcggcgg ccgtctccgc 240 cgccgcccgg cccagccggg cccgggcctt gaccaggccg agcgtggcca gcgcggcgcc 300 ccgcggctcg tccatcgccc ggaactcctc cagcgccccg ccgtaggtgg cccgtgcctc 360 ctcgaaccgg ccggcgcgga agaggacgtt gccgcgcatc ttatggttgt aggccagcgc 420 gctgaccagc cgcatccggc ggcaggtggc ctcggcctcg gtcagcagct ccagcgcgcg 480 ggcggtttcg ccccgcagcg agagcacgtc ggctatgccg cgcagggccc aggcgcggcc 540 gcgcgcgtcg tcggcgccac cggctatctc cgccgcctcc tcgaacatcg ccagggcggt 600 gtcgtaggag ccggtgttgc ggtgcatctg cgcgatgccc tccagcgccc acacggtgtg 660 ccgggcctcg 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ggagattcaa tggagccatg tgggggaagt gcggtccgcc 3255 gctggggagc ggcgctgacc gcgtcggccg cggccatcgc ggtcgccctc ccgagcgcga 3315 acgccgaggc ggctgccggg ccgccgggaa tcgcggccaa gggggccttc ctgctcgaca 3375 gcgacgccaa ccgctccctg tggggcaagg cggccgacac ccggcggcag atggccagca 3435 ccaccaagat ccccgggaat tcgtaatcat ggtcatagct ga 3477 <210> 2 <211> 540 <212> PRT <213> Streptoverticillium cinnamoneum <400> 2 Leu Leu Arg His Arg Leu Arg Arg Leu His Arg Leu Thr Arg Ser Ala -30 -25 -20 Ala Val Ser Ala Val Val Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Pro Ala Phe -15 -10 -5 Ala Ser Ser Pro Ser Pro Ala Pro His Leu Asp Ala Val Glu Lys Ala -1 1 5 10 Leu Arg Glu Val Ser Pro Gly Leu Glu Gly Asp Val Trp Gln Arg Thr 15 20 25 Asp Gly Asn Lys Leu Asp Ala Ser Ala Ala Asp Pro Ser Asp Trp Leu 30 35 40 45 Leu Gln Thr Pro Gly Cys Trp Gly Asp Ala Ala Cys Lys Glu Arg Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Arg Leu Leu Ala Lys Val Thr Glu Asn Ile Ser Lys Ala 65 70 75 Arg Arg Thr Val Asp Ile Ser Thr Leu Ala Pro Phe Pro Asn Gly Ala 80 85 90 Phe Gln Asp Ala Ile Ala Ala Gly Leu Lys Ala Ser Val Ala Ser Gly 95 100 105 Asn Lys Pro Lys Val Arg Val Leu Val Gly Ala Ala Pro Val Tyr His 110 115 120 125 Met Asn Val Leu Pro Ser Lys Tyr Arg Asp Asp Leu Lys Ala Arg Leu 130 135 140 Gly Lys Ala Ala Asp Asp Ile Thr Leu Asn Val Ala Ser Met Thr Thr 145 150 155 Ser Lys Thr Ser Phe Ser Trp Asn His Ser Lys Leu Leu Val Val Asp 160 165 170 Gly Glu Ser Ala Val Thr Gly Gly Ile Asn Ser Trp Lys Asp Asp Tyr 175 180 185 Val Asp Thr Gln His Pro Val Thr Asp Val Asp Leu Ala Leu Thr Gly 190 195 200 205 Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Arg Tyr Leu Asp Thr Leu Trp Thr Trp 210 215 220 Thr Cys Gln Asn Lys Ser Asn Ile Ala Ser Val Trp Phe Ala Ala Ser 225 230 235 Gly Gly Asp Cys Met Ala Thr Met Glu Lys Asp Ala Asn Pro Arg Pro 240 245 250 Ala Gly Pro Thr Gly Asn Val Pro Val Ile Ala Val Gly Gly Leu Gly 255 260 265 Val Gly Ile Lys Asp Ser Asp Pro Ala Ser Thr Phe Arg Pro Gln Leu 270 275 280 285 Pro Ser Ala Pro Asp Thr Lys Cys Val Val Gly Leu Pro Asp Lys Thr 290 295 300 Asn Ala Asp Arg Asp Tyr Asp Thr Val Asn Pro Glu Glu Ser Ala Leu 305 310 315 Arg Ala Leu Val Ala Ser Ala Asp Arg Gln Ile Val Ile Ser Gln Gln 320 325 330 Asp Leu Asn Ala Thr Cys Pro Pro Ile Ala Arg Tyr Asp Val Arg Leu 335 340 345 Tyr Asp Ile Leu Ala Ala Lys Met Ala Ala Gly Val Lys Val Arg Ile 350 355 360 365 Val Val Ser Asp Pro Ala Asn Arg Gly Ala Val Gly Ser Gly Gly Tyr 370 375 380 Ser Gln Ile Lys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asp Thr Leu Arg Asn Arg 385 390 395 Leu Ala Leu Leu Lys Gly Gly Asp Gln Gln Lys Ala Lys Ala Ala Met 400 405 410 Cys Ser Thr Leu Gln Leu Gly Thr Phe Arg Ser Ser Ala Ser Ala Thr 415 420 425 Trp Ala Asp Gly His Pro Tyr Ala Leu His His Lys Leu Val Ala Val 430 435 440 445 Asp Ser Ser Ala Phe Tyr Ile Gly Ser Lys Asn Leu Tyr Pro Ser Trp 450 455 460 Leu Gln Asp Phe Gly Tyr Ile Val Glu Ser Pro Glu Ala Ala Lys Gln 465 470 475 Leu Glu Ala Lys Leu Leu Asp Pro Glu Trp Lys Phe Ser Gln Glu Thr 480 485 490 Ala Thr Val Asp His Ala Arg Gly Val Cys Ser Leu 495 500 505

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプロモータを含む、ＰＬＤ生産用のＤ
ＮＡの説明図である。

【図２】上記プロモータを含むベクターの説明図であ
る。

【図３】上記ベクターを作成するための他の前駆体の説
明図である。

【図４】比較のための、上記プロモーターを省いた、Ｐ
ＬＤ生産用のＤＮＡの説明図である。

【図５】上記ＰＬＤ生産用のＤＮＡを含むベクターの説
明図である。

【図６】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組
換え微生物による、グルコース無添加における、ＰＬＤ
の生産能を示すグラフである。

【図７】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組
換え微生物による、グルコース濃度 5 g/Lにおける、Ｐ
ＬＤの生産能を示すグラフである。

【図８】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組
換え微生物による、グルコース濃度 15 g/L における、
ＰＬＤの生産能を示すグラフである。

【図９】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組
換え微生物による、グルコース濃度 30 g/L における、
ＰＬＤの生産能を示すグラフである。

【図１０】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の
組換え微生物による、グルコース濃度 15 g/L における
培養において、安定期での培養液中のＰＬＤを示すSDS-
PAGEの図面代用写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:625） (72)発明者 谷澤 克行 大阪府豊能郡豊能町希望ヶ丘２−30−２ (72)発明者 徳山 真治 静岡県静岡市国吉田６−１−11 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA11 CA01 CA04 DA08 EA04 FA02 FA07 FA08 FA15 GA19 GA21 HA01 HA03 4B064 AG01 CA04 CA19 CC09 CC12 CC24 CD09 CE11 CE12 4B065 AA50X AA52Y AB01 AC14 BA02 BA10 BC05 BC08 BD36 CA27 CA60

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ストレプトバーティシリウム・シンナモニ
   ウムのＤＮＡ由来の塩基配列であり、タンパク質生産の
   ためのタンパク質用塩基配列の上流側に結合されて、上
   記タンパク質生産能の向上活性を有していることを特徴
   とするプロモーター。
2. 【請求項２】配列番号１の配列表における、塩基番号３
   ８から塩基番号１４０７までの塩基配列を有する、また
   は、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が
   欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、タン
   パク質生産のためのタンパク質用塩基配列の上流側に結
   合されて、上記タンパク質生産能の向上活性を有してい
   ることを特徴とするプロモーター。
3. 【請求項３】請求項１または２記載のプロモーターと、
   上記プロモーターの下流側にタンパク質生産のためのタ
   ンパク質用塩基配列とを有していることを特徴とするベ
   クター。
4. 【請求項４】タンパク質用塩基配列は、ホスフォリパー
   ゼＤの生成用であることを特徴とする請求項３記載のベ
   クター。
5. 【請求項５】タンパク質用塩基配列は、ストレプトバー
   ティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来のものであ
   ることを特徴とする請求項４記載のベクター。
6. 【請求項６】タンパク質用塩基配列は、配列番号１の配
   列表における、塩基番号１５１２から塩基番号３０３０
   までの塩基配列、または上記塩基配列において１もしく
   は数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された、タ
   ンパク質生産能を備えた塩基配列であることを特徴とす
   る請求項５記載のベクター。
7. 【請求項７】タンパク質用塩基配列の下流側に、タンパ
   ク質の翻訳を停止するためのパリンドローム配列を有し
   ていることを特徴とする請求項３ないし６の何れかに記
   載のベクター。
8. 【請求項８】パリンドローム配列は、配列番号１の配列
   表における、塩基番号３０３１から塩基番号３２１３ま
   での塩基配列、または上記塩基配列において１もしくは
   数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された、タン
   パク質の翻訳を停止する機能を備えた塩基配列であるこ
   とを特徴とする請求項７記載のベクター。
9. 【請求項９】請求項３ないし８の何れかのベクターが宿
   主内に組み込まれていることを特徴とする組換え微生
   物。
10. 【請求項１０】宿主は、放線菌であることを特徴とする
    請求項９記載の組換え微生物。
11. 【請求項１１】宿主は、ストレプトマイセス・リヴィダ
    ンスであることを特徴とする請求項１０記載の組換え微
    生物。
12. 【請求項１２】請求項９ないし１１の何れかに記載の組
    換え微生物を培養液中にて培養して、タンパク質用塩基
    配列に基づくタンパク質を生産することを特徴とするタ
    ンパク質の製造方法。
13. 【請求項１３】培養液に、グルコースを添加することを
    特徴とする請求項１２記載のタンパク質の製造方法。