JP2002017396A - エチル−α−グルコシドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酵素の製造が簡便・安価であること、生産菌
株の安全性が高いこと、活性安定性が高く再利用が可能
であること、ハンドリングしやすいこと等の利点を備え
た酵素剤を使用したエチル−α−グルコシドの製造方法
を提供する。 【解決手段】 アスペルギルス属糸状菌由来の高エチル
アルコール耐性の菌体結合性α−グルコシダーゼを有す
る液体培養菌体あるいは同固定化菌体を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エチル−α−グル
コシドの効率的な製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エチル−α−グルコシドは、α−グルコ
シド基を有する糖類であるマルトースやマルトオリゴ糖
とエチルアルコールを基質としてこれに触媒としてのα
−グルコシダーゼを作用させて製造する。これは、マル
トースやマルトオリゴ糖のα−グルコシド結合をα−グ
ルコシダーゼで加水分解し、得られたα−グルコシド基
にエチル基を導入しエチル−α−グルコシドが生成され
るというものである。

【０００３】エチル−α−グルコシドは、元来清酒やみ
りん中に含まれる非発酵性の糖質で、清酒やみりん独特
の風味構成に関わっている。また、調理に用いると味質
の改善など有用な効果を示す物質である。

【０００４】また、α−グルコシダーゼは広く生物界に
存在し、酵母類、カビ類、細菌類、哺乳動物、植物種子
等にはさまざまなタイプのα−グルコシダーゼが存在し
ている。

【０００５】ここで、従来は、微生物由来および植物種
子由来のもの等さまざまなタイプのα−グルコシダーゼ
が製造されていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、従来のα−グ
ルコシダーゼには、以下のような問題点があった。

【０００７】エチル−α−グルコシド生成反応は、エチ
ルアルコール存在下で行われるので、用いるα−グルコ
シダーゼにはエチルアルコール溶液中で安定してその触
媒活性を維持していることが要求される。しかし、一般
に酵素は、エチルアルコールなどの有機溶媒に対する耐
性が低く、酵素の立体構造の変化により、変性・失活し
てしまうことが知られている。従来得られているα−グ
ルコシダーゼも多くのものがエチルアルコールに対する
耐性がなく、効率的なエチル−α−グルコシド生成には
不向きであった。

【０００８】ただし、アスペルギルス属に属する微生物
であるアスペルギルス・ニガーが生産するα−グルコシ
ダーゼの中には、６０％（ｖ／ｖ）エチルアルコール濃
度条件下でもエチル−α−グルコシド生成を行うことの
できるものがあり、その酵素を用いた製造法が報告され
ている（特公平６−３０６０８号）。

【０００９】しかしながら、その報告で用いられた酵素
は、液体培養あるいは固体培養の培養濾液より、精製ま
たは粗精製することにより調製されたものであり、培養
液からの分離・精製を伴う実際の製造においては、多大
の労力を要するとともに製造コストが高くなり、さらに
上記製造法では酵素を再利用できないという問題点があ
った。

【００１０】そこで、本発明は、酵素の製造が簡便・安
価であること、生産菌株の安全性が高いこと、活性安定
性が高く再利用が可能であること、ハンドリングしやす
いこと等の利点を備えた酵素基材を使用したエチル−α
−グルコシドの製造方法を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
解決するにあたり、従来のフリー状態の精製したα−グ
ルコシダーゼを用いる方法に代えて、酵素の分離・精製
を必要とせず、かつ繰り返し再利用しうる酵素剤の開発
を目的に、高エチルアルコール耐性でかつ安定性の高い
菌体結合性α−グルコシダーゼを生産する菌株を保存菌
株（国内菌株保存機関が有する菌株を含む）より選択し
た。

【００１２】各請求項に記載の菌体は、上記課題をすべ
てクリアしうる特性を有し、それらの液体培養菌体ある
いは同固定化菌体を用いることにより、効率的にエチル
−α−グルコシドを製造しうることを見いだし、本発明
を想到するに至った。

【００１３】また、これら培養菌体あるいは固定化菌体
は、α−グルコシダーゼとともに菌体結合性のα−アミ
ラーゼが共存するため、マルトースやマルトオリゴ糖の
みならずデンプンからも効率的にエチル−α−グルコシ
ドを生産しうる利点を備えていることが、従来技術と大
きく異なる点である。

【００１４】さらに、本培養菌体を高濃度のエチルアル
コール溶液に浸漬処理することにより、菌体より、本酵
素反応に不必要なあるいは好ましくないさまざまな成分
や酵素を失活することが可能であり、本処理菌体を用い
ることにより、糖転移反応の増加と不純物のないエチル
−α−グルコシドを含む糖液が得られる利点を備えてい
る。

【００１５】すなわち、本発明の要旨は、アスペルギル
ス属糸状菌由来の高エチルアルコール耐性の菌体結合性
α−グルコシダーゼを有する液体培養菌体あるいは同固
定化菌体を用いることを特徴とするエチル−α−グルコ
シドの製造法に関する。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を詳
細に説明する。

【００１７】本発明で使用されるアスペルギルス属に属
する微生物であるアスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・
オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ア
スペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓ
ａｍｉｉ）、アスペルギルス・シロウサミ（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｓｉｒｏｕｓａｍｉｉ）は、カビ類に属
する微生物である。

【００１８】図１には上記菌株の具体例が示され、それ
ぞれの菌の保存先が示されているがている。このうち、
「アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｋａｗａｃｈｉｉ） Ｎ−３」は工業技術院生命工学工
業技術研究所に、受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１７９２
９」として寄託されている。

【００１９】上記微生物は、何れも麹菌とも呼ばれ、古
くから醸造や発酵食品の製造などに使われてきたカビ類
であり、安全な微生物であることが特徴である。

【００２０】本発明で使用される菌株を培養するために
は、その菌株の胞子、菌糸、または予め培養して得られ
た前培養液を液体培地に接種し培養する。

【００２１】使用できる炭素源は、マルトースまたはデ
ンプンが好ましく、２％程度が適当である。

【００２２】窒素源としては、ペプトンが好ましく、
０.５％程度が適当である。

【００２３】この他、イーストエキス、コーンスティー
プリカー、およびリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム
等を必要とする。

【００２４】ただし、上記の炭素源はマルトースあるい
はデンプンが好ましいが、それ以外は通常のカビ類の培
養培地であればいずれも適用可能である。

【００２５】培養は、好気的条件下、３０℃、ｐＨ５〜
６、３〜４日が最適である。

【００２６】上記培養培地にマイクロキューブ等の市販
の固定化担体を添加し、上記と同様な条件下で液体培養
することにより、容易に上記担体に固定化された固定化
菌体が得られる。

【００２７】また、上記の培地を不織布に染み込ませた
後、気相中で生育させることにより、容易に固定化菌体
が得られる。

【００２８】また、培養終了後、培養液を濾過すること
により、培養菌体が得られる。これら培養菌体あるいは
エチルアルコール溶液に浸漬処理した処理菌体を用い、
マルトースやマルトオリゴ糖、デンプン分解物、あるい
はデンプン類とエチルアルコールを基質として反応させ
るとエチル−α−グルコシドが得られる。

【００２９】さらに、反応終了後、濾過により菌体と反
応液を分離し、得られた菌体を上記の糖類を含むエチル
アルコール溶液中に再度添加することにより、同程度の
エチル−α−グルコシドが得られる。

【００３０】次に、本発明を実施例に基づいてさらに具
体的に説明する。

【００３１】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００３２】〔実施例１〕まず、図１に示したアスペル
ギルス・カワチ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギ
ルス・ウサミ、およびアスペルギルス・シロウサミ由来
の培養菌体によるマルトースあるいはデンプンからのエ
チル−α−グルコシドの生産を行った。

【００３３】すなわち、上記の培養菌体を予め７０％
（ｖ／ｖ）エチルアルコール溶液中に保持（３０℃、３
〜６時間）し、濾過後この処理菌体を酵素として用い
た。基質として、マルトースあるいはデンプン５％（ｗ
／ｖ）、３０％（ｖ／ｖ）エチルアルコールの条件下
で、反応液１００ｍｌあたり湿菌体として４ｇ相当（酵
素活性として２００〜３００Ｕ／ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ
ｗｅｉｇｈｔ）の菌体を酵素として添加し、３０℃、
ｐＨ６．０、２４時間反応させた。反応終了後、生成し
たエチル−α−グルコシドは液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）により定量分析した。酵素活性は、ｐ−ニ
トロフェニル−α−グルコシドを基質とし、３０℃、５
分間反応で、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノー
ルを生成する酵素力価を１ユニット（Ｕ）とした。

【００３４】試験した上記菌体によるエチル−α−グル
コシドの収率は、図１に示す如く、マルトースでは５〜
１５％、デンプンでは３〜１７％であった。また、反応
液中のエチル−α−グルコシドとグルコースとの存在比
（α−ＥＧ／Ｇ）は、マルトースでは０．２０〜０．３
１、デンプンでは０．１５〜０．５２であった。

【００３５】なお、反応終了後、濾過により菌体を分離
し、その反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーを行
うと７〜１０％エチルアルコール溶出画分中に精製され
たエチル−α−グルコシドが８０〜９０％の収率で得ら
れ、容易に結晶標品が得られた。

【００３６】〔実施例２〕上記実施例と同様の条件で、
基質濃度およびエチルアルコール濃度を変化させた場合
のエチル−α−グルコシド生産に関する結果を図２およ
び図３に示す。

【００３７】図２の縦軸は２４時間反応後のエチル−α
−グルコシドの収率、横軸は基質濃度、折れ線はα−Ｅ
Ｇ／Ｇを示す。エチル−α−グルコシドの収率およびα
−ＥＧ／Ｇ値はともに基質濃度に関係し、その濃度の増
加に従って低下する。

【００３８】図３の縦軸はエチル−α−グルコシドの収
率、横軸はエチルアルコール濃度、折れ線はα−ＥＧ／
Ｇを示す。エチルアルコール濃度３０〜６０％の範囲で
高いエチル−α−グルコシドの収率が得られた。特にデ
ンプン基質では、α−ＥＧ／Ｇ値がエチルアルコール濃
度の増加に伴い高い値を示し、実用的生産においては大
きな利点である。

【００３９】〔実施例３〕上記と同様な条件下で、酵素
剤としての培養菌体を繰り返し再利用した場合のエチル
−α−グルコシドの収率およびα−ＥＧ／Ｇ値を図４に
示す。

【００４０】縦軸はエチル−α−グルコシドの収率、横
軸は使用回数、折れ線はα−ＥＧ／Ｇを示す。２４時間
ごとに反応を繰り返し計５回、１２０時間行ったが、酵
素活性の低下はほとんどなく、さらに長時間の使用が可
能である。

【００４１】なお、上記に記載した方法により調製した
同菌体の固定化菌体を用いた場合も同様に長期間の利用
が可能である。

【００４２】〔実施例４〕上記の培養菌体を予め７０％
（ｖ／ｖ）エチルアルコール溶液中に保持（３０℃、３
〜６時間）し、濾過後この処理菌体を酵素として用い
た。基質として、グルコース０．１％（ｗ／ｖ）、３０
％（ｖ／ｖ）エチルアルコールの条件下で、反応液１０
０ｍｌあたり湿菌体として４ｇ相当（酵素活性として２
００〜３００Ｕ／ｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈ
ｔ）の菌体を酵素として添加し、３０℃、ｐＨ６．０で
２４時間反応させた。反応終了後、生成したエチル−α
−グルコシドは液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より定量分析した。酵素活性は、ｐ−ニトロフェニル−
α−グルコシドを基質とし、３０℃、５分間反応で、１
分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵
素力価を１ユニット（Ｕ）とした。

【００４３】試験した上記菌体によるエチル−α−グル
コシドの収率は１０％、反応液中のエチル−α−グルコ
シドとグルコースとの存在比（α−ＥＧ／Ｇ）は、０．
１３であった。このように、縮合反応によってもエチル
−α−グルコシド生産が可能である。

【００４４】

【発明の効果】以上説明したようにこの発明によれば、
糖類、デンプンまたはその分解物とエチルアルコールよ
りなる原料にα−グルコシダーゼを作用させ、α−グル
コシダーゼの触媒する糖転移反応によりエチル−α−グ
ルコシドを製造するエチル−α−グルコシドの製造方法
において、上記α−グルコシダーゼとしてアスペルギル
ス属糸状菌由来の液体培養菌体を用いるようにしたの
で、酵素の製造が簡便・安価であること、生産菌株の安
全性が高いこと、活性安定性が高く再利用が可能である
こと、ハンドリングしやすいこと等の利点を備えた酵素
剤を使用したエチル−α−グルコシドの製造方法を提供
することができる等の効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で使用されるアスペルギルス属に属する
菌株の具体例と、それぞれの菌体によるエチル−α−グ
ルコシドの収率及び反応液中のエチル−α−グルコシド
とグルコースとの存在比（α−ＥＧ／Ｇ）を示す図。

【図２】基質濃度を変化させた場合のエチル−α−グル
コシド生産に関する結果を示す図。

【図３】エチルアルコール濃度を変化させた場合のエチ
ル−α−グルコシド生産に関する結果を示す図。

【図４】酵素剤としての培養菌体を繰り返し再利用した
場合のエチル−α−グルコシドの収率およびα−ＥＧ／
Ｇ値を示す図。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 糖類、デンプンまたはその分解物とエチ
   ルアルコールよりなる原料にα−グルコシダーゼを作用
   させ、α−グルコシダーゼの触媒する糖転移反応により
   エチル−α−グルコシドを製造するエチル−α−グルコ
   シドの製造方法において、 上記α−グルコシダーゼとしてアスペルギルス属糸状菌
   由来の液体培養菌体を用いることを特徴とするエチル−
   α−グルコシドの製造方法。
2. 【請求項２】 上記培養菌体は、高エチルアルコール耐
   性の菌体結合性α−グルコシダーゼよりなることを特徴
   とする請求項１に記載のエチル−α−グルコシドの製造
   方法。
3. 【請求項３】 上記アスペルギルス属に属する微生物
   は、アスペルギルス・カワチであることを特徴とする請
   求項１に記載のエチル−α−グルコシドの製造方法。
4. 【請求項４】 上記アスペルギルス属に属する微生物
   は、アスペルギルス・オリゼであることを特徴とする請
   求項１に記載のエチル−α−グルコシドの製造方法。
5. 【請求項５】 上記アスペルギルス属に属する微生物
   は、アスペルギルス・ウサミであることを特徴とする請
   求項１に記載のエチル−α−グルコシドの製造方法。
6. 【請求項６】 上記アスペルギルス属に属する微生物
   は、アスペルギルス・シロウサミであることを特徴とす
   る請求項１に記載のエチル−α−グルコシドの製造方
   法。
7. 【請求項７】 上記培養菌体は、不織布またはマイクロ
   キューブを固定化担体として固定化菌体とされることを
   特徴とする請求項１に記載のエチル−α−グルコシドの
   製造方法。
8. 【請求項８】 上記液体培養菌体または固定化菌体は繰
   り返し再利用できることを特徴とする請求項１に記載の
   エチル−α−グルコシドの製造方法。
9. 【請求項９】 グルコースとエチルアルコールよりなる
   原料にα−グルコシダーゼを作用させ、α−グルコシダ
   ーゼの触媒する縮合反応によりエチル−α−グルコシド
   を製造するエチル−α−グルコシドの製造方法におい
   て、 上記α−グルコシダーゼとしてアスペルギルス属糸状菌
   由来の液体培養菌体を用いることを特徴とするエチル−
   α−グルコシドの製造方法。