JP2002003397A - 出血傾向治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 アンチトロンビンIII の部分ペプチドか
ら誘導した一連のヘパリン親和性ペプチドまたはその薬
学的に許容される塩を有効成分として含有する、出血傾
向治療剤。 【効果】 本発明によれば、人工透析などの際に血液凝
固抑制のために投与されるヘパリンにより引き起こされ
る出血傾向の改善に有用な、出血傾向治療剤が提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘパリン投与によ
り引き起こされる出血傾向の改善に有用な、出血傾向治
療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘパリンは、小腸や肺に主に存在するム
コ多糖の一種で、抗血液凝固作用（抗血栓作用）を有す
る。一方、アンチトロンビンIII はトロンビンをはじ
め、多くのセリンプロテアーゼと複合体を形成し、その
血液凝固活性を阻害する。ヘパリンはアンチトロンビン
III と結合して複合体を形成することによってアンチト
ロンビンIII による上記阻害反応を著しく促進する。

【０００３】従って、ヘパリンは、血液凝固系に異常の
ある疾患の治療や人工透析・人工心肺などを用いた体外
循環血液の凝固抑制など臨床上広く用いられ、さらには
生体内に導入される医療器具に抗血栓性を付与するため
にも用いられる。

【０００４】しかしながら、ヘパリンは用量コントロー
ルが難しく、ヘパリンの用量が過剰であると、時として
出血が止まらなくなるという重篤な反応が生じることが
ある。これは、ヘパリンがアンチトロンビンIII の活性
化を誘起し、それによって血液凝固因子トロンビンを阻
害するためである。従って、ヘパリンの上記臨床上の使
用によって起こりうる出血傾向を改善するための手段が
望まれるところである。

【０００５】Anderssonら [L.O.Andersson et al., Thr
omb. Res., 9, 575 (1976)]、および Hook、Lam らはそ
れぞれ独立して天然ヘパリンの 30-50％の分子種のみが
アンチトロンビンIII（以下、AT IIIと表記する) と結
合し得るが、残りの分子種は結合しないことを発見し
た。その後、このようなAT IIIと高い親和性でもって結
合するヘパリン分子（以下、AT III高親和性ヘパリン分
子という）の構造と活性の相関性について種々の研究が
なされた結果、抗血栓作用の活性部位は、その分子中の
AT III 結合性オリゴ糖鎖部分、詳しくはヘパリンの構
成糖の内の５つの糖からなる部位を含む 18-20ユニット
の糖鎖部分に存在し、その作用は抗第Ｘａ因子活性に基
づくものであることが判明した。

【０００６】先に、本発明者らは、ヘパリンとの親和性
が高い部分ペプチドであると報告される、ATIII の123-
141 位のフラグメント [Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-
Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala-Asn-Lys-Ser-Ser-Lys-Leu-Val;Th
e Journal of Biological Chemistry, 262, 11964-1197
2 (1987)、Biochem. J., 301, 121-129 (1994)] をベー
スにしたペプチド誘導体をはじめ、ATIII 中のその他の
部分ペプチドをベースにした種々のペプチド誘導体を合
成し、それら一群のペプチド誘導体に、ヘパリンと非常
に強い結合性があること確認した（特願2000-104338
号）。

【０００７】上述したように、ATIII はトロンビンをは
じめとする一連のセリンプロテアーゼ（Ｘａ，ＩＸａ，
ＸＩａ，ＸIIａ，カリクレインなど）と複合体を形成す
ることによってその血液凝固活性を阻害する。この複合
体は、ATIII の反応部位のArg(393 番)-Ser(394 番) が
上記プロテアーゼにより特異的に加水分解され、アシル
酵素型の結合を介することにより形成される。さらに、
ヘパリンはATIII のＮ末端側のヘパリン結合部位に結合
すると、プロテアーゼとの三量体が形成され、上記阻害
反応が著しく促進し、その結果、出血が止まらないと状
態になる。従って、ヘパリンの過剰投与による出血傾向
（ヘパリン依存性出血）を起こさないようにするために
は、ヘパリンがATIII に結合して複合体を形成すること
を阻害することが必要である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、人工
透析などの際に血液凝固抑制のために投与されるヘパリ
ンにより引き起こされる出血傾向の改善に有用な、出血
傾向治療剤を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、ATIII の部分ペプチドから誘導した一連の
ヘパリン親和性ペプチドは、ヘパリンの活性部位に特異
的に結合することによって、ヘパリンがATIII と結合す
るのを競合的に阻害し、ヘパリンによる出血傾向が改善
できることを見い出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の(1) 〜(5) の発明である。 (1) 下記式 (I):

【００１０】

【化１】 X-A-B-Val-Trp-Glu-Leu-Ser-C-Ala (I) （式中、A, B, C は Lysまたは Argを; X は、Lys-Ile-
Pro-Glu-Ala-Thr-Asn 又はIle-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn 又
はGlu-Ala-Thr-Asn を示す。Ｃ末端のＯＨはＮＨ ₂ で置
換されていてもよく、Ｎ末端のＨは置換基で置換されて
いてもよい。）で示されるペプチドまたはその薬学的に
許容される塩を有効成分とする、出血傾向治療剤。 (2) 下記式 (II):

【００１１】

【化２】 Pro-A-Pro-Glu-B-Ser-Leu-Ala-C-Val- (II) Glu-D-Glu-Leu-Thr-Pro （式中、A, B, C, Dは Lysまたは Argを示す。Ｃ末端の
ＯＨはＮＨ₂ で置換されていてもよく、Ｎ末端のＨは置
換基で置換されていてもよい。）で示されるペプチドま
たはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、出血
傾向治療剤。 (3) 下記式 (III):

【００１２】

【化３】 Phe-Ala-A-Leu-Asn-Cys-B-Leu-Tyr-C- (III) D-Ala-Asn-E-Ser-Ser-F (式中、A, B, C, Dは Lysまたは Argを；E は、Lys ま
たはAla を；F は、Lys-Leu-Val を示す。Ｃ末端のＯＨ
はＮＨ₂ で置換されていてもよく、Ｎ末端のＨは置換基
で置換されていてもよい。）で示されるペプチドまたは
その薬学的に許容される塩を有効成分とする、出血傾向
治療剤。 (4) 下記式（IV）：

【００１３】

【化４】 Phe-A-Ala-B-Asn-Cys-C-Leu-Tyr-D- (IV) Ala-E-Ser-Ser-Asn-Leu （式中、A, B, C, D, E は Lysまたは Argを示す。Ｃ末
端のＯＨはＮＨ₂ で置換されていてもよく、Ｎ末端のＨ
は置換基で置換されていてもよい。）で示されるペプチ
ドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、
出血傾向治療剤。 (5) 下記式（V) ：

【００１４】

【化５】 Phe-Ala-A-Leu-Asn-B-C-Leu-Tyr-D- (V) E-Ala-Asn-F-Ser-Ser-G （式中、A, C, D, E, F, Gは Lysまたは Arg；B はCys
または Serを示す。Ｃ末端のＯＨはＮＨ₂ で置換されて
いてもよく、Ｎ末端のＨは置換基で置換されていてもよ
い。）で示されるペプチドまたはその薬学的に許容され
る塩を有効成分とする、出血傾向治療剤。以下、本発明
を詳細に説明する。

【００１５】

【発明を実施するための形態】本発明の出血傾向治療剤
の有効成分であるペプチド誘導体は、配列番号１に記載
のアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは配列番号１
に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端に、配
列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列が付加し
たアミノ酸配列からなるペプチドである。

【００１６】Xaa-Xaa-Val-Trp-Glu-Leu-Ser-Xaa-Ala
（配列番号１） Lys-Ile-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn （配列番号２） Ile-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn （配列番号３） Glu-Ala-Thr-Asn （配列番号４）

【００１７】あるいは、本発明の出血傾向治療剤の有効
成分であるペプチド誘導体は、配列番号５、７、８のい
ずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド；あるい
は配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの
Ｃ末端に、Lys-Leu-Val が付加したアミノ酸配列からな
るペプチドである。

【００１８】Pro-Xaa-Pro-Glu-Xaa-Ser-Leu-Ala-Xaa-Va
l-Glu-Xaa-Glu-Leu-Thr-Pro （配列番号５） Phe-Ala-Xaa-Leu-Asn-Cys-Xaa-Leu-Tyr-Xaa-Xaa-Ala-As
n-Xaa-Ser-Ser （配列番号６） Phe-Xaa-Ala-Xaa-Asn-Cys-Xaa-Leu-Tyr-Xaa-Ala-Xaa-Se
r-Ser-Asn-Leu （配列番号７） Phe-Ala-Xaa-Leu-Asn-Xaa-Xaa-Leu-Tyr-Xaa-Xaa-Ala-As
n-Xaa-Ser-Ser-Xaa （配列番号８）

【００１９】上記ペプチドにおいて、Ｎ末端のＨは置換
基で置換されていてもよく、置換基としては、例えば、
アセチル基、ブチル基、あるいはより長い鎖構造を有し
た脂肪族置換基、ベンゾイル、ガロイルといった芳香族
置換基等を挙げることができる。また、Ｃ末端のＯＨは
ＮＨ₂ で置換されていてもよい。

【００２０】本発明の出血傾向治療剤に使用する上記ペ
プチドは公知のペプチド合成の常法に従って合成でき
る。例えば「ザ．ペプチド(The Peptides)」第1巻(1966
年) [Schreder and Luhke 著、Academic Press, New Yo
rk, U.S.A.] 、あるいは「ペプチド合成」［泉屋ら著、
丸善株式会社(1975年)］の記載に従い、具体的には、ア
ジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物
法、ＤＣＣ法、活性エステル法（P-ニトロフエニルエス
テル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シ
アノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを用
いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ
−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法な
ど、各種の方法により合成することができる。これらの
方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用でき
る。

【００２１】本発明においてペプチド合成は、上記のよ
うな一般的なポリペプチドの合成法に従って、例えば末
端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆ
るステップワイズ法によって、または数個のフラグメン
トに分けてカップリングさせていく方法により行われ
る。

【００２２】例えばステップワイズ法による固相合成
は、具体的には、メリフィールド（Merrifield.R.B.)の
方法 [Solid phase peptide synthesis, J.Amer.Chem.S
oc., 85, 2149-2159 (1963)]に従い、以下のようにして
行うことができる。まず、Ｃ末端アミノ酸（アミノ基を
保護したもの）をそのカルボキシル基によって不溶性樹
脂に結合させ、その後、該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基の
保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性
アミノ基に、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従っ
て、アミノ基を保護したアミノ酸の反応性カルボキシル
基を縮合反応により順次結合させる。このようにして一
段階ずつ全配列を合成した後、ペプチドを不溶性樹脂か
らはずす。

【００２３】上記の固相合成において用いられる不溶性
樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するもの
であればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルア
ミン樹脂（BHA樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチ
ル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂
（MBHA樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹
脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−
オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂などが挙げ
られる。

【００２４】また、α−アミノ基の保護基として９−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc)を使用す
る場合は４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂な
ど、トリフルオロ酢酸(TFA)によって樹脂から脱離でき
るものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)を使用
する場合は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル
樹脂（PAM樹脂）など、フッ化水素などによって樹脂か
ら脱離できるものがよい。樹脂1g当りペプチド濃度は0.
5mmole以下とすることが好ましい。

【００２５】上記の方法においては、アミノ酸のペプチ
ド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護
基の脱離、ならびにアミノ酸のペプチド結合に関与する
カルボキシル基の活性化が必要である。

【００２６】アミノ基の保護基として、例えば、ベンジ
ルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル
（Boc）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Aoc）、イソボ
ニルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカル
ボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダ
マンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フ
タロイル、ホルミル、o-ニトロフェニルスルフェニル、
ジフェニルホスフイノチオイルなどの基が挙げられる。

【００２７】また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有
するもの、例えばTyr、Thr、Lys、Glu、Arg 、Ser 、Hi
s 及び Aspは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好
ましい。官能基の保護は、通常用いられている方法で、
下記のような通常の保護基を結合させることにより行わ
れ、反応終了後、該保護基は脱離される。Hisのイミノ
基の保護基としては、例えばベンジルオキシメチル（Bo
m）、p-トルエンスルホニル（Tos)、ベンジル（Bzl）、
ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙
げられる。

【００２８】Ser及びThrの水酸基は、例えばエステル化
またはエーテル化によって保護することができるが、こ
の保護は必須ではない。エステル化に適する基として
は、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルな
どのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチル
オキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙
げられる。またエーテル化に適する基としては、ベンジ
ル（Bzl）、テトラヒドロピラニル、tert−ブチル基な
どが挙げられる。

【００２９】Tyrの水酸基の保護基としては、例えばベ
ンジル（Bzl）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Br-
Z) 、ジクロロベンジル（Cl₂-Bzl) 、ベンジルオキシカ
ルボニル（Ｚ）、アセチル、p-トルエンスルホニル（To
s)基などが挙げられる。Lysのアミノ基の保護基として
は、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベ
ンジルオキシカルボニル（Cl-Z) 、ジクロロベンジル
（Cl₂-Bzl)、ｔ−ブトキシカルボニル基（Boc）、p-ト
ルエンスルホニル（Tos）基などが挙げられる。

【００３０】Argのグアニジノ基の保護基としては、例
えばp-トルエンスルホニル（Tos）、ニトロ、ベンジル
オキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル
（Aoc）基などが挙げられる。Glu 、Aspのカルボキシル
基の保護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、
エタノール、tert−ブタノール、シクロヘキシル(cHex)
などによるエステル化により行われる。

【００３１】その他のアミノ酸の保護基として、Trpの
インドリル基の保護基としては、例えばホルミル、カル
ボベンゾキシル、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼ
ンスルホニル、2,2,2-トリクロロエチルオキシカルボニ
ルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。Met
のチオメチル基の保護基としては予めメチルスルホキシ
ドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は
必須ではない。

【００３２】一方、カルボキシル基の活性化は、従来公
知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公
知のものから適宜選択しえる。例えば、カルボキル基の
活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応さ
せ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水
物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、
p-ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等との
エステル）などを形成させることにより行う。

【００３３】上記の固相における反応性アミノ基と反応
性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反
応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用で
きるものであればいずれでもよい。例えば無水または含
水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホ
キシド（DMSO）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロロメタン（DCM)、テトラヒドロフラン（TH
F)、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチル
リン酸トリアミド（HMPA)などを単独で、あるいは２種
以上の混合溶媒として使用することができる。

【００３４】また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジ
シクロヘキシルカルボキシイミド（DCC)、カルボジイミ
ダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロ
ホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシト
リスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化
物塩（Bop試薬）などの存在下に行うこともできる。

【００３５】得られたペプチドは、通常の方法に従い脱
塩、精製することができる。例えば、DEAE−セルロース
などのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックス
LH-20 、セファデックスG-25 などの分配クロマトグラ
フィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、OD
S−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００３６】上記のようにして精製したペプチドは、各
種の酸を用いて、所望により薬学的に許容される塩、例
えば、酢酸塩、塩酸塩、リン酸塩等にすることができ
る。上記ペプチドおよびその塩は、医薬的に許容できる
溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の
常法に従って液剤、注射剤、錠剤、散剤、顆粒剤、坐
剤、腸溶剤およびカプセル剤などの医薬製剤とする。

【００３７】上記ペプチドおよびその塩は、後記実施例
に示すように、抗第Ｘａ因子活性阻害作用が確認され
る。これは、当該ペプチドがヘパリンの活性部位に特異
的に結合することによって、ヘパリンがATIII と結合す
るのを阻害する作用を有することを意味する。従って、
当該ペプチドおよびその塩を有効成分とした医薬製剤
は、ヘパリンの過剰投与により起こる副作用、具体的に
は、出血傾向を改善にするのに有効である。

【００３８】当該製剤は、例えばヒト、マウス、ラッ
ト、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的
にまたは経口的に安全に投与することができる。当該製
剤の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変
更しうるが、例えばヒトを含む哺乳動物に投与する場
合、ペプチド量として１人１日当たり約1pg 〜1 mg/kg
程度を適用することが例示される。

【００３９】

【実施例】以下に本発明を実施例を挙げてより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、実施例において合成した各ペプチドの高速液
体クロマトグラフィー（HPLC) 及びアミノ酸分析条件は
以下の通りである。 ・高速液体クロマトグラフィー（HPLC) 高速液体クロマトグラフィーはLC-Module-1 （日本ウォ
ーターズ・リミテッド社製）を用いて分析を行った。

【００４０】（HPLC分析条件） カラム： TSK-gel ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒： Ａ 0.1% TFA Ｂ アセトニトリル/0.1% TFA 溶媒Ｂを20％から60％に毎分２％変化させる直線勾配グ
ラジェント 流 速：1ml/min 検出波長：220nm ・アミノ酸分析 アミノ酸分析条件は、6N-HCl 0.1%フェノール含有）中
で 110℃、20時間の加水分解反応を行った後に、日立ア
ミノ酸分析Ｌ−8500型（日立製作所社製）によって分析
した。

【００４１】〔実施例１〕 ペプチドの合成 固相合成用反応槽（ガラス製、φ6.0×29.5 cm；三商社
製）を用い、ペプチドHBP-1-1（H-Lys-Ile-Pro-Glu Ala
-Thr-Asn-Arg-Arg-Val-Trp-Glu-Leu-Ser-Lys-Ala-N
H₂ ：配列番号９）の固相合成を行った。

【００４２】まず、MBHA樹脂（ペプチド研究所社製、ア
ミノ基 0.66 mmol/g） 10 g を出発原料として DCM 150
ml (2 回)、50% TEA含有DCM 150ml (2回)で洗浄後、16
番目のアミノ酸 Boc-Ala-OH 13.2 mmol、1-ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(HOBt) 13.2 mmole 、DCM 100ml を
加えて攪拌し、さらに DCC (1 M-DCM 溶液）13.2 mlを
加えて 2時間反応させた。反応液を濾過した後、MeOH 1
50 ml (2回)、DCM 150ml（2 回）の順に攪拌下処理し、
各々の処理後濾過した。同じく 16 番目のアミノ酸 Boc
-Ala-OH 6.6 mmol、HOBt 6.6 mmol、DCM 100 mlを加え
て攪拌し、さらに DCC (1 M-DCM 溶液）6.6 mlを加えて
2時間反応させた。反応液を濾過した後、MeOH 150 ml
(2回)，DCM 150 ml（2 回）の順に攪拌下処理し、各々
の処理後濾過した。

【００４３】さらに、Boc-Lys (Cl-Z)-OH 13.2 mmol、H
OBt 13.2 mmol、DCM 100 mlを加えて攪拌し、DCC (1M-D
CM溶液）13.2 mlを加えて 2時間反応させた。反応液を
濾過した後、MeOH 150 ml (2回)、DCM 150 ml（2 回）
の順に攪拌下処理し、各々の処理後濾過して、Boc-Lys
(Cl-Z)-Ala-MBHA 樹脂を得た。

【００４４】なお、未反応の Ala-MBHA 樹脂は、20％無
水酢酸含有 DCM溶液 150 mlを加えて 5分間攪拌し、濾
過後 MeOH 150 ml (2 回)、DCM 150 ml（2 回）の順に
攪拌下処理し、各々の処理後濾過して副反応が進まない
ようにした。以下、次に示す保護アミノ酸を用いて順次
16 番目から 1番目までのアミノ酸をカップリングし
た。

【００４５】

【表１】

【００４６】この様にして、下記式:Boc-Lys (Cl-Z)-Il
e-Pro-Glu (OcHex)-Ala-Thr (Bzl)-Asn (Xan)-Arg (To
s)-Arg (Tos)-Val-Trp-Glu (OcHex)-Leu-Ser (Bz)-Lys
(Cl-Z)-Ala-MBHA 樹脂 9.05 g を得た。

【００４７】ここで得られた保護ペプチド-MBHA 樹脂
9.05 g にアニソール 11.5 ml、1,2-エタンジチオール
11.5 mlを加え、さらに無水フッ化水素 80 mlを加えて
０℃で1時間撹拌した。反応後、無水フッ化水素を減圧
下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに 20 ％酢酸
100 mlを加えて 10 分撹拌してペプチドを抽出した。

【００４８】抽出液を以下に示す条件で逆相カラムクロ
マトグラフィーにより精製した。 逆相カラムクロマトグラフィー カラム：ＯＤＳ−１０２０ＴＴ（φ 40×400 mm） 溶 媒：平衡化および溶出 15％アセトニトリル/0.1％
ＴＦＡ 流 速：５ml/min

【００４９】得られた溶出液を凍結乾燥し、ペプチドHB
P-1-1 を得た。この精製ペプチドの収量およびアミノ酸
配列分析結果を下記に示す。 ・収量 170 mg（純度 99 %） ・アミノ酸分析 Asp (1) 0.91, Thr (1) 0.85, Ser (1) 0.83, Glu (2)
1.83, Ala (2) 1.88,Val (1) 0.783, Ile (1) 0.75, Le
u (1) 1.00, Lys (2) 1.59, Arg (2) 1.50,Pro (1) 0.8
64

【００５０】上記と同様にして、下記のペプチド：ペプ
チドHBP-1-2（H-Ile-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Arg-Arg-Val
-Trp-Glu-Leu-Ser-Lys-Ala-NH₂ ；配列番号１０）、ペ
プチドHBP-1-3（H-Glu-Ala-Thr-Asn-Arg-Arg-Val-Trp-G
lu-Leu-Ser-Lys-Ala-NH₂ ；配列番号１１）、ペプチドH
BP-1-4（H-Arg-Arg-Val-Trp-Glu-Leu-Ser-Lys-Ala-N
H₂ ；配列番号１２）、ペプチドHBP-2 （H-Pro-Lys-Pro
-Glu-Lys-Ser-Leu-Ala-Lys-Val-Glu-Lys-Glu-Leu-Thr-P
ro-NH₂ ；配列番号１３）、ペプチドHBP-3（H-Phe-Ala-
Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala-Asn-Lys-Se
r-Ser-Lys-Leu-Val-NH₂ ；配列番号１４）、ペプチドHB
P-4（H-Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg-Lys
-Ala-Asn-Lys-Ser-Ser-NH₂ ；配列番号１５）、ペプチ
ドHBP-5（H-Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg
-Lys-Ala-Asn-Ala-Ser-Ser-NH₂ ；配列番号１６）、ペ
プチドHBP-6（H-Phe-Lys-Ala-Lys-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr
-Arg-Ala-Lys-Ser-Ser-Asn-Leu-NH₂ ；配列番号１
７）、ペプチドHBP-7 ( H-Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Ser-Ar
g-Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala-Asn-Lys-Ser-Ser-Lys-NH₂ ；配
列番号１８） ペプチドHBP-8 ( H-Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Ser-Arg-Leu-
Tyr-Arg-Lys-Ala-Asn-Lys-Ser-Ser-Lys-OH ；配列番号
１８） ペプチドHBP-9 （Acetyl-Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Ser-Arg
-Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala-Asn-Lys-Ser-Ser-Lys-OH；配列
番号１８） ペプチドHBP-10（H-Phe-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Arg-Leu-
Tyr-Arg-Arg-Ala-Asn-Arg-Ser-Ser-Arg-OH；配列番号１
９） ペプチドHBP-11（H-Phe-Ala-Arg-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-
Tyr-Arg-Arg-Ala-Asn-Arg-Ser-Ser-Arg-NH₂；配列番号
２０）をそれぞれ合成した。

【００５１】〔実施例２〕（各精製ペプチドによるヘパ
リンの抗第Ｘａ因子活性阻害試験） 実施例１にて合成した精製ペプチドについて、ATIII へ
のヘパリンとの競合的結合能を調べることによって、こ
れらのペプチドによるヘパリンの抗第Ｘａ因子活性阻害
試験を以下のようにして行った。

【００５２】0.5 低分子ヘパリン国際単位 (以下 IU)/m
l ダルテパリンナトリウムトリス緩衝液（pH 8.4）150
μl 、トリス緩衝液 150μl 、AT III溶液 50μl 及び
ヒト正常血漿 50μl をプラスチック製試験管内に入れ
た。これに、各精製ペプチドをトリス緩衝液で任意の濃
度に希釈したサンプルを 100μl 加えて混和した。別の
プラスチック製試験管に、試料溶液を 200μl ずつ加
え、37±1 ℃に正確に 30分間保った。その後、第Ｘａ
因子溶液 (7.1 nKat S-2222/ml) 100μl を加えて混和
し、37±1 ℃に正確に 30 秒間保った後、直ちに S-222
2 基質溶液 (N-ベンゾイル-L-イソロイシル-L-グルタミ
ル-グリシル-L-アルギニル-p-ニトロアニリド・塩酸塩
15 mg/20 ml) 200μl を加え、混和後さらに 37±1 ℃
に正確に 3分間保った。反応を停止させるべく、50 %酢
酸 300μl を加え、これを検体１とした。さらに別のプ
ラスチック製試験管に生理食塩液 100μl をとり、pH
8.4のトリス緩衝液 700μl 、AT III溶液 100μl 及び
ヒト正常血漿 100μl を加えて混和した。この溶液を 2
00μl 測り取り、水 300μl 及び 50 % 酢酸 300μl を
加えて混和したものを検体２とした。検体２を対照と
し、波長 405 nm における吸光度を測定した。結果を図
１に示す。

【００５３】図１に示されるように、全てのペプチドが
ヘパリンの抗第Ｘａ因子活性を阻害した。特に、HBP-3,
4, 11が強い阻害を示した。従って、一連のペプチドは
強いヘパリン結合性を有するだけでなく、その結合部位
はヘパリンとAT IIIのそれと同じくすることが明らかと
なった。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、人工透析などの際に血
液凝固抑制のために投与されるヘパリンにより引き起こ
される出血傾向の改善に有用な、出血傾向治療剤が提供
される。

【００５５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ITOHAM FOODS INC. <120> Agent for teatment of bleeding tendency <130> P00-0343 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> 1 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 2 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 8 <223> Xaa represents Lys or Arg <400> 1 Xaa Xaa Val Trp Glu Leu Ser Xaa Ala 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <400> 2 Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <400> 3 Ile Pro Glu Ala Thr Asn 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <400> 4 Glu Ala Thr Asn 1 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> 2 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 5 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 9 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 12 <223> Xaa represents Lys or Arg <400> 5 Pro Xaa Pro Glu Xaa Ser Leu Ala Xaa Val Glu Xaa Glu Leu Thr Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> 3 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 7 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 10 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 11 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 14 <223> Xaa represents Lys or Arg <400> 6 Phe Ala Xaa Leu Asn Cys Xaa Leu Tyr Xaa Xaa Ala Asn Xaa Ser Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> 2 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 4 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 7 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 10 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 12 <223> Xaa represents Lys or Arg <400> 7 Phe Xaa Ala Xaa Asn Cys Xaa Leu Tyr Xaa Ala Xaa Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> 3 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 6 <223> Xaa represents Cys or Ser <220> <221> PEPTIDE <222> 7 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 10 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 11 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 14 <223> Xaa represents Lys or Arg <220> <221> PEPTIDE <222> 17 <223> Xaa represents Lys or Arg <400> 8 Phe Ala Xaa Leu Asn Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Xaa Ala Asn Xaa Ser Ser 1 5 10 15 Xaa <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <400> 9 Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 10 15 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 11 Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 12 Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 13 Pro Lys Pro Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro 1 5 10 15 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Lys Leu Val <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Ala Ser Ser 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 Phe Lys Ala Lys Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Ala Lys Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 18 Phe Ala Lys Leu Asn Ser Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Lys <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 19 Phe Ala Arg Leu Asn Ser Arg Leu Tyr Arg Arg Ala Asn Arg Ser Ser 1 5 10 15 Arg <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 20 Phe Ala Arg Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Arg Ala Asn Arg Ser Ser 1 5 10 15 Arg

【図面の簡単な説明】

【図１】各精製ペプチドによる抗第Ｘａ因子活性阻害能
評価を示す。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA08 BA17 BA18 BA23 CA59 DC13 DC35 NA14 ZA532 4H045 AA30 BA17 EA24 FA33 FA41

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式 (I): X-A-B-Val-Trp-Glu-Leu-Ser-C-Ala (I) （式中、A, B, C は Lysまたは Argを; X は、Lys-Ile-
   Pro-Glu-Ala-Thr-Asn 又はIle-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn 又
   はGlu-Ala-Thr-Asn を示す。Ｃ末端のＯＨはＮＨ ₂ で置
   換されていてもよく、Ｎ末端のＨは置換基で置換されて
   いてもよい。）で示されるペプチドまたはその薬学的に
   許容される塩を有効成分とする、出血傾向治療剤。
2. 【請求項２】 下記式 (II): Pro-A-Pro-Glu-B-Ser-Leu-Ala-C-Val- (II) Glu-D-Glu-Leu-Thr-Pro （式中、A, B, C, Dは Lysまたは Argを示す。Ｃ末端の
   ＯＨはＮＨ₂ で置換されていてもよく、Ｎ末端のＨは置
   換基で置換されていてもよい。）で示されるペプチドま
   たはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、出血
   傾向治療剤。
3. 【請求項３】 下記式 (III): Phe-Ala-A-Leu-Asn-Cys-B-Leu-Tyr-C- (III) D-Ala-Asn-E-Ser-Ser-F (式中、A, B, C, Dは Lysまたは Argを；E は、Lys ま
   たはAla を；F は、Lys-Leu-Val を示す。Ｃ末端のＯＨ
   はＮＨ₂ で置換されていてもよく、Ｎ末端のＨは置換基
   で置換されていてもよい。）で示されるペプチドまたは
   その薬学的に許容される塩を有効成分とする、出血傾向
   治療剤。
4. 【請求項４】 下記式（IV）： Phe-A-Ala-B-Asn-Cys-C-Leu-Tyr-D- (IV) Ala-E-Ser-Ser-Asn-Leu （式中、A, B, C, D, E は Lysまたは Argを示す。Ｃ末
   端のＯＨはＮＨ₂ で置換されていてもよく、Ｎ末端のＨ
   は置換基で置換されていてもよい。）で示されるペプチ
   ドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、
   出血傾向治療剤。
5. 【請求項５】 下記式（V) ： Phe-Ala-A-Leu-Asn-B-C-Leu-Tyr-D- (V) E-Ala-Asn-F-Ser-Ser-G （式中、A, C, D, E, F, Gは Lysまたは Arg；B はCys
   または Serを示す。Ｃ末端のＯＨはＮＨ₂ で置換されて
   いてもよく、Ｎ末端のＨは置換基で置換されていてもよ
   い。）で示されるペプチドまたはその薬学的に許容され
   る塩を有効成分とする、出血傾向治療剤。