JPH0717678B2

JPH0717678B2 - セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物

Info

Publication number: JPH0717678B2
Application number: JP4166079A
Authority: JP
Inventors: シー．トムソン，ロバート; オールソン，クイエル
Original assignee: サイナーゲンバイオロジカルズ，インコーポレーテッド
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1992-06-24
Publication date: 1995-03-01
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: ZA859362B; JPH053880B2; JPH05208999A; JPS62501291A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、精製セリンプロテアー
ゼインヒビターおよびこのプロテアーゼインヒビターを
含有する医薬組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】内因性蛋白分解酵素は、侵入する生物、
抗原−抗体複合体、および生物にとってもはや必要でな
いかまたは有用でないある種の組織蛋白質を分解するの
に役立っている。正常に機能する生物において、蛋白分
解酵素は、限定された量において導かれ、そしてプロテ
アーゼインヒビターの合成を通して部分的に調節され
る。

【０００３】非常に多数の天然に生成するプロテアーゼ
インヒビターは、内因性プロテアーゼを、局所的および
１時間にそれらの反応を限定することにより、制御する
のに役立っている。加えて、プロテアーゼインヒビター
は、感染剤により身体中に導かれるプロテアーゼを阻害
しうる。特に蛋白分解性攻撃および感染を受けやすい組
織、たとえば気道のそれはプロテアーゼインヒビターに
富んでいる。

【０００４】プロテアーゼインヒビターは、約１０％の
人血漿蛋白質からなる。少くとも８種のインヒビターが
この給源から単離されており、そして文献中に特徴づけ
られている。それらは、α₂−マクログロブリン（α₂
Ｍ）、α₁−プロテアーゼインヒビター（α₁ＰＩ）、
α₁−アンチキモトリプシン（α₁Ａｃｈｙ）、β₁−
アンチコラゲナーゼ（β₁ＡＣ）およびインターα−ト
リプシンインヒビター（ＩαＩ）を包含する。

【０００５】プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター
平衡の乱れは、肺気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、
筋萎縮症、腫瘍侵襲、および各種の他の病的状態を包含
するプロテアーゼ−介在組織破壊を導きうる。

【０００６】ある種の状況、たとえば敗血症または急性
白血病のような重篤な病的過程においては、存在する遊
離蛋白分解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の放出に起
因し増加する。加えて、あるいは他の状況において別
に、生物の減少した調節インヒビター容量はまた、プロ
テアーゼ／プロテアーゼインヒビター平衡における変更
を生じうる。そのような減少した調節インヒビター容量
の例は、α₁−プロテアーゼインヒビター欠乏であり、
それは肺気腫の発現と高度に関係している。

【０００７】そのような異常な状態が存在している生物
においては、蛋白分解酵素を制御するための処置を取る
ことができなければ、生物に対する重篤な損傷が生じう
る。従って、蛋白分解酵素を制御するために、生物に対
し投与することのできるプロテアーゼインヒビターが求
められてきた。

【０００８】特に薬理学的興味をひく１つのプロテアー
ゼは、白血球エラスターゼである。白血球エラスターゼ
は、細胞外に放出されるとき、結合組織および他の価値
ある蛋白質を分解する。正常に機能する生物にとって、
ある量の結合組織および他の蛋白質を分解することが必
要であるけれども、過剰量の白血球エラスターゼの存在
は、各種の病的状態、たとえば肺気腫およびリウマチ性
関節炎と結び付いてきた。白血球エラスターゼが正常よ
り大きな量において存在するとき、その効果と対抗する
ために、白血球エラスターゼに特異であるプロテアーゼ
インヒビターが求められてきた。

【０００９】過去において、少くとも２種の白血球エラ
スターゼインヒビターが文献中に同定されている。Ｓｃ
ｈｉｅｓｓｌｅｒ等の“Ａｃｉｄ−ＳｔａｂｌｅＩｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅＮ
ｅｕｔｒａｌＰｒｏｔｅａｓｅｓｉｎＨｕｍａｎ
ＭｕｃｏｕｓＳｅｃｒｅｔｉｏｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｏｓｓｉｂｌｅＢｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎ”、ｉｎＮｅｕｔｒａ
ｌＰｒｏｔｅａｓｅｓｏｆＨｕｍａｎＰｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｏｎｅｕｃｌｅａｒＬｅｕｃｏｃｙｔｅｓ、
Ｈａｖｅｍａｎｎ等（編集）、ＵｒｂａｎａｎｄＳ
ｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．（１９７８）中に
記載されている１つの蛋白質は、人間の精液血漿および
唾液から単離され、そしてＮ−末端アミノ酸としてチロ
シンを有する大きさ約１１Kdaであると特徴づけられ
た。

【００１０】この蛋白質の文献報告は、部分アミノ酸配
列のみを提供しているが、この部分配列さえもがこの蛋
白質は本発明の蛋白質から著しく異っていることを示し
ている。この蛋白質の配列の報告は、本発明の蛋白質に
ついての全アミノ酸配列データとの組合せにおいて、本
発明者等に対し、シースラー等により配列された生成物
は単一ポリペプチド鎖ではない分解された蛋白質であり
えたことを示している。

【００１１】１例において人間血漿から単離される第２
の蛋白質は、α₁−プロテアーゼインヒビターと命名さ
れている。この蛋白質についての業績は、Ｔｒａｖｉｓ
およびＳａｌｖｅｓｅｎによりＡｎｎｕａｌＲｅｖｉ
ｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５２：６５５
〜７０９（１９８３）中に要約されている。

【００１２】本発明の単一ポリペプチド鎖蛋白質と先行
技術の任意の単一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼイ
ンヒビターとの間の構造における著しい相違の故に、先
行技術の単一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒ
ビターは、本発明の蛋白質と“実質的に相同”（“ｓｕ
ｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ”）で
はない。

【００１３】トリプシンは、薬理学的立場から特に興味
深い他のプロテアーゼである。トリプシンは、各種の急
性状態、たとえば膵炎の間の、ある種の軟器官組織、た
とえば膵臓組織の分解を開始させることが知られてい
る。種々の努力が、トリプシンの作用を阻害するであろ
うことが望まれた蛋白質の使用を通して、顕著な成功な
しに、それら状態の治療に向けられてきた。そのような
努力の例は、人間膵炎の治療における外因性牛トリプシ
ンインヒビターを使用する試みである。そのような技術
は欧州において試みられてきたけれども、それらはユー
・エス・フード・アンド・ドラッグ・アドミニストレー
ション（Ｕ．Ｓ．ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍ
ｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって有効とは承認されな
かった。

【００１４】従って、各種の急性および慢性状態におい
て、過剰のトリプシンの中和に有効なプロテアーゼイン
ヒビターについての要求がある。上記に論述した白血球
エラスターゼインヒビターの場合における如く、トリプ
シンインヒビターは、もしもそれが精製された形におい
て、そして医薬的に有用であるのに充分な量において単
離されそして製造されうるならば、特に有用であろう。

【００１５】カテプシンＧは、白血球中に大量に存在す
る別のプロテアーゼである。カテプシンＧは、補充経路
のそれらを包含する各種の価値ある蛋白質をインビトロ
で分解しうることが知られている。膵臓エラスターゼ
は、膵炎において役割を有しうる他のプロテアーゼであ
る。従って、それらプロテアーゼのインヒビターはま
た、強力な医薬価値のものである。

【００１６】白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプ
シンＧおよび膵臓エラスターゼはセリンプロテアーゼと
して知られている１つの種類のプロテアーゼの例であ
り、これらは共通の構造および機構の要素を有してい
る。異った基質に対するそれらの活性および異ったイン
ヒビターに対するそれらの感受性は、僅か数個のアミノ
酸残基における変化からの結果と信じられる。類推によ
り、構造および機構の共通の要素をまた有する１つの種
類のセリンプロテアーゼインヒビターを予想することが
可能であり、それにおいては比較的少ないアミノ酸の変
化が異ったプロテアーゼの阻害を生じえ、そしてこの種
類の少くとも１つのものは前者の種類の各セリンプロテ
アーゼを阻害しうる。そこでこの種類のセリンプロテア
ーゼインヒビターは実質的な価値を有するものであろ
う。

【００１７】

【発明の開示】本出願は、１９８４年１２月６日に出願
された米国特許出願第６７８，８２３号の部分継続出願
である。

【００１８】驚くべきことには、本発明者等は、アミノ
酸配列が単一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒ
ビターの報告された配列から非常に異っている、耳下腺
分泌から精製された形において単離される１２Kda プロ
テアーゼインヒビターを見出した。本発明のプロテアー
ゼインヒビターは、少くとも２つの活性部位を有するも
のと信じられる。１つの部位は白血球エラスターゼ阻害
性質を示し、一方第２の部位はトリプシンに対し活性を
示す。本発明者等は、本新規プロテアーゼインヒビター
の全長を正確に配列づけした。この配列は、以後により
完全に示す。

【００１９】

【発明の要旨】本発明は、一般的にはプロテアーゼイン
ヒビター、そしてより特定的には、人間の多形核（ＰＭ
Ｎ）−顆粒球プロテアーゼを指向するインヒビターに関
する。特に、本発明は、人間白血球エラスターゼおよび
トリプシンを包含するセリンプロテアーゼインヒビター
の生物活性同族体に関する。

【００２０】本発明の目的は、１つまたは種々のものの
組合せのセリンプロテアーゼに対し活性である精製され
た形のプロテアーゼインヒビターを提供することにあ
る。本発明の付加的目的は、そのようなプロテアーゼイ
ンヒビターのアミノ酸配列の決定である。本発明の更に
他の目的は、白血球エラスターゼおよび他のセリンプロ
テアーゼに対し活性を発揮する医薬製剤として価値のあ
る精製された形のプロテアーゼインヒビターを提供する
ことを包含する。更に、高められたあるいは等価の性質
を有するそのようなプロテアーゼインヒビターの生物活
性同族体の同定はまた、本発明の目的の１つである。

【００２１】これらの目的を達成するため、そして本発
明の目的に従い、セリンプロテアーゼ、特にエラスター
ゼ、たとえば白血球エラスターゼに対し阻害活性を示す
プロテアーゼインヒビターが開示される。好ましいイン
ヒビターは、耳下腺分泌から精製された形で単離され
た。本プロテアーゼインヒビターは、完全に変性された
後に、ジスルファイド結合を形成または再形成する能力
を有し、そして生化学的刺激の不存在において所望のセ
リンプロテアーゼ阻害活性の発現をなしうる活性三次元
構造を構成または再構成するのに必要である適当な非共
有相互反応を受ける。

【００２２】本発明の好ましいインヒビターは、セリン
プロテアーゼインヒビター活性を示す少くとも１つの活
性部位を有する精製された単一ポリペプチド鎖蛋白質で
あり、そして耳下腺分泌から単離される天然セリンプロ
テアーゼインヒビターと実質的に一致する。好ましく
は、活性部位において示されるセリンプロテアーゼイン
ヒビター活性は、耳下腺分泌から単離される天然インヒ
ビターのそれと生物学的に等価である。

【００２３】本発明の特に好ましいインヒビターは、次
のアミノ酸配列を有する：

【化３】式中、Ｒ₁はセリンまたはプロリンからなる群から選択
され、Ｒ₇はアラニンまたはプロリンからなる群から選
択され、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₈およびＲ₉は、同一または異
なってメチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシン、ロ
イシンまたはアルギニンからなる群から選択され、なら
びにＲ₄、Ｒ₅およびＲ₆は、メチオニンまたはバリン
からなる群から選択される、ただしＲ₁がセリンであ
り、Ｒ₂がアルギニンであり、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅および
Ｒ₆がメチオニンであり、Ｒ₇がアラニンであり、そし
てＲ ₈およびＲ₉がロイシンである場合を除く。

【００２４】上記略語により示されるアミノ酸について
は、好ましい態様の記述において説明する。本発明のプ
ロテアーゼインヒビターの生物学的に活性な改善された
同族体は、インヒビターアミノ酸配列において各種の他
のアミノ酸を置換することにより得ることができる。付
加的に、目的を達成するためおよび本発明の目的に従
い、活性成分、本発明に従うプロテアーゼインヒビター
またはここに示したその生理学的に活性な同族体の少く
とも１つを含有する医薬組成物が開示される。

【００２５】

【好ましい態様の記述】後記の実施例と一緒で、本発明
の原理を説明するのに役立つ論述を、本発明の目下好ま
しい態様について、ここで詳細に行う。上記に示した如
く、本発明は、精製された形において単離されたプロテ
アーゼインヒビターに関する。好ましくは、本発明のセ
リンプロテアーゼインヒビターは、人間の耳下腺分泌か
ら単離される天然セリンプロテアーゼインヒビターと実
質的に均一であり、そして最も好ましくは生物学的に等
価である単一ポリペプチド鎖蛋白質である。明細書およ
び請求の範囲を通して使用される“生物学的に等価”
（“ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｅｑｕｉｖａｌｅｎ
ｔ”）の用語は、本発明の組成物が天然プロテアーゼイ
ンヒビターと同じ程度である必要はないが同じ型のプロ
テアーゼ誘導組織損傷を阻害しうることを意味する。

【００２６】明細書および請求の範囲を通して使用され
る“実質的に相同”（“ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ”）の用語は、先に報告された単
一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒビター蛋白
質により示される相同性以上の天然耳下腺インヒビター
に対する相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の程度を意味す
る。好ましくは、この相同性の程度は、４０％以上、最
も好ましくは５０％以上であって、蛋白質の特に好まし
い群は、天然耳下腺インヒビターに対し６０％以上の相
同性を有する。上記のパーセント相同性は、２つの配列
のより大きなもの中にもまた見出されうる２つの配列の
より小さなもの中にみいだされる成分のパーセントとし
て計算され、成分は４つの隣接するアミノ酸の配列とし
て理解される。

【００２７】本発明のプロテアーゼインヒビターは、熱
および酸による変性に著しく抵抗性あり、そしてキモト
リプシン、マウス下顎プロテアーゼおよびクロストリパ
インを包含する多くの蛋白分解酵素にさらしたとき、活
性の損失に抵抗する。それらインヒビターはまた、必要
なジサルファイド結合を形成する能力を有し、そして生
化学的刺激の不存在においてセリンプロテアーゼインヒ
ビター活性を表現しうる活性三次元構造を構成するため
に適当な非共有相互反応をうけ、あるいはもしもジサル
ファイド結合が破壊されそして非共有相互反応が崩壊し
ているならば、生化学的刺激の不存在においてそのよう
な活性第三次元構造を再獲得するためにそのような結合
および相互反応を再形成する能力を有する。

【００２８】本発明の好ましいプロテアーゼインヒビタ
ーは耳下腺分泌中に発見され、そして初めて精製された
形で単離された。本発明の目的のために、“純粋形”
（“ｐｕｒｅｆｏｒｍ”）、あるいは“精製された
形”（“ｐｕｒｉｆｉｅｄｆｏｒｍ”）の用語が、こ
こに開示されているプロテアーゼインヒビターに関して
使用されるとき、セリンプロテアーゼインヒビター蛋白
質ではない他の蛋白質を実質的に含んでいないことを意
味する。好ましく、本発明のプロテアーゼインヒビター
は少くとも９０％の純度、そして好ましく９５％の純度
を有する。

【００２９】本発明の好ましい形においては、耳下腺分
泌は、人間から得られる。しかしながら、他の哺乳動物
給源から得られる耳下腺分泌が本発明のそれと等価の活
性のプロテアーゼインヒビターの製造において有用であ
ろうことは予測される。

【００３０】本発明のプロテアーゼインヒビターは、（ａ）哺乳動物の耳下腺分泌物を採取し；（ｂ）分泌中の蛋白性物質を分画することにより耳下腺
分泌からインヒビターを単離し；（ｃ）セリンプロテアーゼインヒビター活性、好ましく
は白血球エラスターゼインヒビター活性を有する画分を
同定し；（ｄ）セリンプロテアーゼインヒビター活性を示す画分
を濃縮することからなる方法により耳下腺分泌から純粋
形で単離しうる。

【００３１】この方法において、哺乳動物耳下腺分泌
は、任意の公知手段により採取しうる。それらは、イン
ヒビターを実質的に変形させる酵素を含有しうる他の口
中液体の採取される検体中への導入を防止するために耳
下腺導管に取り付けられる吸引装置の使用を通して採取
するのが好ましい。

【００３２】好ましい態様においては、耳下腺分泌中に
存在する蛋白性物質は、各種濃度の塩溶液の存在におい
てカチオン交換物質と結合するその能力に従う物質の分
離により分画される。本発明のプロテアーゼインヒビタ
ーは、クロマトグラフィカラム中に存在する強カチオン
交換物質から、０．００５Ｍから１．０Ｍまでの濃度範
囲、そしてより特定的には０．４Ｍから０．８Ｍまでの
濃度範囲内の塩化ナトリウム溶出の画分により溶出しう
る。しかしながら、特定のカチオン交換カラムの性質に
依存し、他の塩溶液濃度が、プロテアーゼインヒビター
を溶出するために必要でありうる。

【００３３】かく得られた画分は、セリンプロテアーゼ
インヒビター、好ましくは白血球エラスターゼインヒビ
ター活性の存在につきスクリーニングされる。好ましく
は、これは画分を既知濃度のプロテアーゼ、好ましくは
白血球エラスターゼと混合し、そして残留活性酵素を分
光光度計で観察される如きメトキシサクシニルＡｌａ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌｐ−ニトロアニリドを加水分
解するその能力を検定することにより遂行される。同定
された画分の蛋白性物質は、ついで大きさに従い、好ま
しくはゲル濾過により分離される。もしもゲル濾過分離
が使用されるならば、好ましい溶出液は、０．５Ｍ塩化
ナトリウム溶液である。そのような活性を示す画分は、
ついでプロテアーゼインヒビターの精製されそして濃縮
された形を得るために、たとえば限外濾過のような手段
により濃縮される。

【００３４】上記方法により単離されるプロテアーゼイ
ンヒビターは、一般的に、セリンプロテアーゼ、たとえ
ば白血球エラスターゼに関係して理論当量的活性を示
す。理論当量的活性は、プロテアーゼインヒビターの各
分子が１分子の白血球エラスターゼと反応し、そしてそ
れによって活性を著しく減少させることを意味する。イ
ンヒビターおよび白血球エラスターゼが１０^-8Ｍもしく
はそれより大きな濃度で存在する本発明の好ましいイン
ヒビターの溶液において、そのようなインヒビターは、
白血球エラスターゼの等価分子量の少くとも９０％と反
応しうる。

【００３５】上記の如く、本発明者等は、セリンプロテ
アーゼインヒビターを、耳下腺分泌から、従来得られて
いない精製された形で単離することに成功した。この酵
素の精製された形における単離は、インヒビターの正し
い配列決定のため、ならびにプロテアーゼインヒビター
およびその同族体を含有する医薬組成物を開発するため
の必須工程であった。

【００３６】ポリペプチド中のアミノ酸残基は、下記の
略語でそれぞれ示す。アミノ酸略語アラニンＡｌａバリンＶａｌロイシンＬｅｕイソロイシンＩｌｅプロリンＰｒｏフェニルアラニンＰｈｅトリプトファンＴｒｐメチオニンＭｅｔグリシンＧｌｙセリンＳｅｒスレオニンＴｈｒシステインＣｙｓチロシンＴｙｒアスパラギンＡｓｎグルタミンＧｌｎアスパラギン酸Ａｓｐグルタミン酸ＧｌｕリジンＬｙｓアルギニンＡｒｇヒスチジンＨｉｓ

【００３７】これらのプロテアーゼインヒビターは、１
つ以上の明確な領域を有することが見出された。１つ以
上の明確な領域は、蛋白質が各種酵素に対し機能的であ
る複数の活性部位を有することを意味する。それら部位
の存在および位置は、プロテアーゼインヒビターの少く
とも２つの部分の間に実質的相同性の発見により決定さ
れた。明確な領域の存在は、本プロテアーゼインヒビタ
ーに、白血球エラスターゼおよびトリプシンの両者を包
含する各種のセリンプロテアーゼを阻害する能力を付与
するものと信じられる。

【００３８】これらプロテアーゼインヒビターの明確な
領域の複数性に起因して、プロテアーゼインヒビター
は、各種の他の活性部位が付加性質を有するプロテアー
ゼインヒビターを創製するために構成されうる骨格とし
て役立ちうることが更に認められた。本発明の好ましい
態様は、白血球エラスターゼ、カテプシンＧおよびトリ
プシンを阻害するプロテアーゼインヒビターである。こ
れらの酵素はすべて、共通の機構および多くの構造特徴
を分けあうセリンプロテアーゼとして知られているプロ
テアーゼの１つの種類のものである。

【００３９】本発明のプロテアーゼインヒビター上の数
個のアミノ酸側鎖の改変を通して、インヒビターの多様
性が創製されるものと信じられ、各々は全種類のセリン
プロテアーゼの少くとも１つのものを阻害しうる。更
に、そのような側鎖変形は、上記のセリン蛋白質の種類
の特定のものに関して改善された阻害性質を有する複数
個のインヒビターを生成させることが期待できる。

【００４０】これらの目標を達成するために必要とされ
るアミノ酸側鎖変化は、インヒビターの重要な機能部分
がＸ線結晶学を通して説明されてきた本発明の好ましい
インヒビターと他のセリンプロテアーゼインヒビターと
の間の構造類似性のある種の要素により示唆される。構
造類似性のそれら要素は、上記の本発明の好ましいセリ
ンプロテアーゼインヒビターのアミノ酸１７から２９ま
で、およびアミノ酸７０から８３までを包含する。トリ
プシン様セリンプロテアーゼに向けての、量または質の
いずれかにおけるインヒビター活性を改善することを示
唆する変化は、２０位のアミノ酸におけるＡｒｇからＬ
ｙｓへの、７２位または７４位のアミノ酸におけるＬｅ
ｕからＬｙｓまたはＡｒｇへの、および７３位のアミノ
酸のＭｅｔからＬｙｓまたはＡｒｇへの１つもしくはそ
れ以上の変化を包含する。

【００４１】キモトリプシン様のセリンプロテアーゼに
向けての、量または質のいずれかにおけるインヒビター
活性を改善することを示唆する変化は、２０位のアミノ
酸におけるＡｒｇ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへの７
２位または７４位のアミノ酸におけるＬｅｕからＰｈ
ｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへのおよび７３位のアミノ酸に
おけるＭｅｔからＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへの１つ
もしくはそれ以上の変化を包含する。膵臓エラスターゼ
様セリンプロテアーゼに向けての、量または質のいずれ
かにおけるインヒビター活性を改善することを示唆する
変化は、２０位のアミノ酸におけるＡｒｇからＡｌａへ
の、７２位または７４位のアミノ酸におけるＬｅｕから
Ａｌａへの、および７３位のアミノ酸におけるＭｅｔか
らＡｌａへの１つもしくはそれ以上の変化を包含する。

【００４２】本発明の実施において、本蛋白質に対し新
しいプロテアーゼ阻害性質を賦与するためのアミノ酸配
列の変更は、白血球エラスターゼに向けて、またはトリ
プシンに向けてのインヒビター活性を破壊しうることを
心に留めなければならない。そのような効果は、本発明
に従い定常的実験により決定しうる。

【００４３】更に、上記に示した如き別個のアミノ酸、
またはアミノ酸の別個の配列の置換は、本プロテアーゼ
インヒビターの白血球エラスターゼ阻害性質またはトリ
プシン阻害性質のいずれかを高めることが意図され、一
方高められていない領域の若干の活性を殺す。実際に、
インヒビター蛋白質の任意の領域の活性は適当なアミノ
酸置換により完全に不活性化しえ、それにより蛋白質が
正常に活性である酵素の１つもしくは若干のサブセット
に特異のインヒビター蛋白質を創製する。たとえば、２
０位のＡｒｇのＧｌｙへの置き換えはトリプシン阻害領
域を不活性化し、一方７３位のＭｅｔ、あるいは７２ま
たは７４位のＬｅｕのＧｌｙへの置き換えは、白血球阻
害領域を不活性化する。領域はまた分離蛋白質に分離し
え、その各々は所望の阻害機能を保持する。本請求の範
囲は、それら手段により導かれる他のインヒビターに拡
張される。

【００４４】上記アミノ酸配列は好ましいものであり、
そして上記に列挙した特徴を有する白血球エラスターゼ
インヒビターを生成するけれども、本発明はまた、医薬
的立場からまた望ましいものである白血球エラスターゼ
阻害活性を包含する特徴を示すこのインヒビターのある
種の同族体を提供する。従って、そのような同族体はま
た、本発明の好ましい組成物である。特に、もしもアミ
ノ酸メチオニンがアミノ酸バリンに置換されたならば、
生成したインヒビターは、酸化的不活性化に対し改善さ
れた抵抗性を示し、従って改善された白血球エラスター
ゼおよびカテプシンＧインヒビター性質を示す。同様の
変化はタバコタールによる不活性化に対するインヒビタ
ーの抵抗性を改善するためになされうる。

【００４５】追加置換は、特許請求されたプロテアーゼ
インヒビターの他の各種性質を高めえ、そして生成蛋白
質を蛋白分解酵素インヒビターとしてより有用なものと
するのに役立ちうる、本発明の実施を通して、この技術
分野において通常の熟練度の者には明らかとなるであろ
うことが可能である。そのような更に他の置換は本発明
の範囲内にあることが意図される。

【００４６】更に、蛋白質のアミノ酸配列における僅か
な変化は、たとえそれらが蛋白質の機能を高めないとし
ても、著しく減少した活性を有しない同族体を創製する
ことが、この技術分野において熟練している者により認
識される。従って、配列が上記に示した好ましい配列の
それから僅かの変化を含有する上記に論述したプロテア
ーゼインヒビターの同族体は、本発明の範囲内に包含さ
れることが意図される。特に、Ｃ−およびＮ−末端にお
けるアミノ酸配列の僅かな変更は、開示されたプロテア
ーゼインヒビターの活性を顕著には変化しないであろう
と信じられる。特に、Ｃ−またはＮ−末端における環化
アミノ酸たとえばプロリンでの置換は、所望のセリンプ
ロテアーゼ阻害活性を有するプロテアーゼインヒビター
を生成すると信じられる。また、Ｃ−またはＮ−末端に
おける変更を有し、その変更が同族体のセリンプロテア
ーゼインヒビター性質を破壊しない開示されたプロテア
ーゼインヒビターの同族体は、本発明の範囲内に包含さ
れる。

【００４７】本プロテアーゼインヒビターのＣ−または
Ｎ−末端に対するポリペプチド鎖の付加は、本発明の範
囲内にあることがまた意図される。特に、ポリペプチド
鎖は、蛋白融合技術を通していずれかの末端に結合しう
る。それらの追加ポリペプチドは、本プロテアーゼイン
ヒビターの薬学的有効性を高めるのに役立ちうる。たと
えば、ポリペプチドは、他の蛋白質との融合により、粘
膜に固定されうるようになって、プロテアーゼインヒビ
ターが特定部位、たとえば肺に留ることを生じるように
なしうる。

【００４８】これら同族体において、アミノ酸配列の変
化は、プロテアーゼインヒビターが投与される生物にお
いて悪い免疫応答を生じさせるようなものであってはな
らない。生物学的分子が悪い免疫応答を生じさせるかど
うかを決定する方法は、この技術分野において通常の熟
練度の者には知られている。

【００４９】上記の置き換えは、各種の方法により行い
うる。たとえば、リコンビナントＤＮＡ法によりインヒ
ビターを導くために使用される一般的指示を、宿主微生
物が所望の同族体の合成を生じるように変更しうる。そ
のようなリコンビナント法は、１９８４年１２月６日に
出願された、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒＩｓｏｌａｔｉｏｎ０ｆＳｅｒｉｎｅ
ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｂｉｖｉｔｏｒｓａｎｄＤ
ＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｓＵｓｅｆｕｌｆｏｒＳ
ａｍｅと題するＰｒａｄｉｐＫ．Ｂａｎｄｙｏｐａｄ
ｈｙａｙ等の米国特許出願第６７８，８２２号、および
それと同日に出願されたＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭｅ
ｔｈｏｄｓｆｏｒＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＳｅ
ｒｉｎｅＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓａ
ｎｄＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｓＵｓｅｆｕｌｆ
ｏｒＳａｍｅと題するＰｒａｄｉｐＫ．Ｂａｎｄｙ
ｏｐａｄｈｙａｙ等の米国特許出願第６７８，８２３号
中に示されている。蛋白質同族体を生化学的に合成する
他の方法は、この技術分野において通常の熟練度の者に
は知られており、そしてそれらおよび他の同族体の創製
のために、本発明の範囲内に包含することが意図されて
いる。

【００５０】本発明のプロテアーゼインヒビターおよび
その同族体は、セリンプロテアーゼインヒビター活性、
特に白血球エラスターゼインヒビター活性を所有する医
薬製品の形において、人間および動物用途を意図され
る。活性成分少くとも１つ、本セリンプロテアーゼイン
ヒビター１つを含有する医薬製剤はまた、意図される投
薬形に依存し、適当な医薬的に受容しうる担体、希釈
剤、充填剤、結合剤および他の賦形薬を含有することが
期待される。

【００５１】経口投与のためには、工程は、消化管中に
おける活性蛋白質の分解を防止するようになされなけれ
ばならない。腸溶被覆投薬形が、経口投与に適当な１つ
の形として意図される。もしも経口投与が選択されるな
らば、製剤は、水、または塩溶液、または他の医薬的に
受容しうる懸濁化剤を含有しうる。一般的に、非経口投
与が意図される製剤は、全製剤を体液と等張にするのに
充分な濃度における塩化ナトリウムを含有するのが好ま
しい。

【００５２】本発明のセリンプロテアーゼインヒビタ
ー、特に白血球エラスターゼインヒビター蛋白質を含有
する医薬製剤は、局所化酵素不均衡の治療のために、注
射または局所適用により局所的に投与されうることがま
た意図される。本インヒビター、特に白血球エラスター
ゼインヒビターはまた、特に肺気腫の治療における如く
肺に適用するとき、エアロゾルとして投与しうる。それ
らの場合、適当な担体、希釈剤およびプロペラントが使
用される。

【００５３】投与されるプロテアーゼインヒビターの量
は、各投薬状態において、生物中に存在する過剰の蛋白
分解酵素の量に依存する。適当な用量を決定するために
は、存在する蛋白分解酵素の過剰量を定量し、そして投
与される特定の種のプロテアーゼインヒビターまたはそ
れらの混合物の活性に基き、過剰の蛋白分解酵素を中和
するのに必要なプロテアーゼインヒビターの総量を決定
しうる。そのような決定は免疫学的障害の治療における
治療用量の決定において、この技術分野において通常の
熟練度の者により定常的になされ、そして特に標準検定
およびここに開示された検定の知識の下に、彼等により
過度の実験なしに定常的に遂行される課業の範囲内にあ
る。しかしながら、本発明のプロテアーゼインヒビター
の大過剰量は、過剰の蛋白分解酵素を有する生物に投与
するとき、毒性でなくまたは悪い反応を生じないと信じ
られることは認識されるべきである。最適量に比し少な
い量よりはむしろプロテアーゼインヒビターの最適量の
過剰における量を使用するのが好ましい。

【００５４】特定の問題または環境に対する本発明の教
示の適用は、ここに含まれる教示の知識の下に、この技
術分野において通常の知識を有する者の能力の範囲内に
あることは理解されるべきである。

【００５５】

【実施例】以下の実施例は本発明に係る生成物の例、な
らびにそれらの単離および製造のための例示的方法を示
すものである。

【００５６】例１耳下腺分泌からの人間白血球エラスターゼインヒビター
の精製耳下腺分泌を、志願者から、耳下腺導管の出口に付した
吸引器具で採取した。分泌は、酢っぱいキャンデーをし
ゃぶることにより刺激した。２〜３リットルの集めた耳
下腺分泌を、水酸化ナトリウムで pＨ６．０にもってい
き、そして遠心分離して、沈澱を除去した。上澄液を
０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、 pＨ６．０およ０．００５
Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したＳＰセファデックス（Ｓ
ＥＰＨＡＤＥＸ：登録商標）Ｃ５０の２．５×４０．０
cmカラムに適用した。カラムを０．００５から１Ｍまで
の塩化ナトリウムの線状グラジエントで溶出した。得ら
れた画分を、インヒビターの存在につき免疫検定により
試験した。

【００５７】活性のピークに相当する画分は、０．６Ｍ
付近で得られたものであった。それら画分をアミコン
（ＡＭＩＣＯＮ：登録商標）ＵＭ２フィルターに通す限
外濾過により３mlに濃縮し、そして濃縮物を０．０５Ｍ
トリス、 pＨ７．４および０．５Ｍ塩化ナトリウムで平
衡化したセファデックスＧ５０の１．６×１００cmカラ
ムに適用した。カラムをついでこのバッファーで溶出
し、そして画分を免疫検定により試験した。活性画分を
貯蔵し、そして上記の如く限外濾過により濃縮した。２
〜４mgのインヒビターが回収され、これは実質的に１０
０％活性であった。

【００５８】例２化膿性気管支粘膜から人間白血球エラスターゼインヒビ
ターの精製気管支粘液を、小吸気疾患の病院患者から採取し、そし
て貯蔵した。貯蔵物を凍結し、そして凍結乾燥した。凍
結乾燥粉末を５％過塩素酸の冷溶液に懸濁し、そしてこ
の混合物を２時間激しく撹拌し、そして４Ｍ水酸化カリ
ウムの添加により中和した。混合物を、０℃において１
２，０００ｇで３０分間遠心分離して、不溶物を除去し
た。

【００５９】この蛋白質の粗溶液を、１００，０００ダ
ルトンより大きい、そして１０，０００ダルトンより小
さい分子量のすべての物質を除去するように設計された
膜に通す限外濾過により分画した。第１工程中におい
て、溶液は、薄チャンネル限外濾過装置中のアミコンＸ
Ｍ１００Ａ膜に再循環した。膜を通した物質を、つい
でＭＸ１００Ａ膜をＹＭ１０に置換した同じ装置に
通した。物質は、ミニタン（ＭＩＮＩＴＡＮ：登録商
標）装置中におけるミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ：登
録商標）１００Ｋ膜上の最初の再循環により分画するこ
とがまた可能であった。この場合、フィルターを通過す
る物質は、ついで１０Ｋ膜を有する同じ装置に通した。
両方の場合において、膜により保持された物質は、引続
く処理のために回収された。

【００６０】限外濾液を、逆相高圧液体クロマトグラフ
ィ（ＨＰＬＣ）カラム上、クロマトグラフィに付した。
蛋白質総量約２０mgおよびインヒビター約０．６mgを含
有する約１mlを、ＲＰ８カラム（ＳｙｎｃｈｒｏｍＩ
ｎｃ．製、Ｌｉｎｄｅｎ，Ｉｎｄｉａｎａ）上に、１分
当たり１mlの流速でのせた。蛋白質を、水中のトリフル
オロ酢酸の０．０５％溶液、ついでアセトニトリル中の
０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の０％溶液から
５０％溶液までの線状グラジエントで溶出した。画分を
採取し、そして既知量のキモトリプシンと混合し、引続
いて上記標準方法を使用して残留活性キモトリプシンを
決定することにより、プロテアーゼインヒビター活性に
つき検定した。活性物質は、２５％および３０％アセト
ニトリル溶液の間で溶出した。それら画分を、更に処理
するために貯蔵した。

【００６１】ＲＰ８カラムからの集めた画分を凍結乾燥
し、そして、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、 pＨ６．０
に溶かし、そして同じバッファーで平衡化したブラウン
リーＣＸ３００カチオン交換カラムに適用した。カラム
を０から１００％までの０．５Ｍリン酸ナトリウム、 p
Ｈ６．０の線状グラジエントで溶出した。活性画分を、
それらのキモトリプシンを阻害する能力につき、再び検
出した。０．２４Ｍ、０．２６Ｍおよび０．２８Ｍホス
フェートで溶出する３つの活性ピークを検出した。活性
物質の３つの貯蔵物を作り、そしてそれらを凍結して貯
蔵するのに先立ち、ＹＭ１０膜を有するアミコン装置
中で脱塩および濃縮した。

【００６２】各画分の活性をキモトリプシンに対する検
定により決定し、そして蛋白質濃度はプラッドフォード
検定法（Ｂｒａｄｆｏｒｄａｓｓａｙ）［Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８（１９７
６）］により決定した。各画分は、例１の耳下腺分泌か
ら精製されたインヒビターにつき観察されたそれの約８
０％であるキモトリプシンに対する活性を有した。

【００６３】例３耳下腺分泌から単離された白血球エラスターゼインヒビ
ターのアミノ酸配列の決定天然インヒビターを、標準方法により還元およびカルボ
キシメチル化した。インヒビター１．０mg（８０ｎｍ
ｏｌ）を、ジチオスレイトール１．３２ｍｏｌおよびト
リスバッファー、 pＨ８．０を含有する０．１Ｍトリス
ＨＣｌ、 pＨ８．０中の６Ｍグアニジウム塩酸塩溶液６
００リットル中に溶かした。３７℃で一時間後に、（２
−³Ｈ）ヨウド酢酸３．３２ｎｍｏｌを加え、そして
インキュベーションを３７℃で更に一時間継続した。ジ
チオスレイトール０．６６ｎｍｏｌ、そして３７℃で一
時間インキュベート後に、別の（２−³Ｈ）ヨウド酢酸
１．３６ｎｍｏｌを加えた。

【００６４】３７℃で一時間インキュベートの後、反応
混合物を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有するトリスバ
ッファー、 pＨ８．０に対し広範に透析した。生成した
溶液をシンクロムＲＰ８ＨＰＬＣカラムに適用し、そ
して生成物を水中の０．０５％ＴＦＡ、ついでアセトニ
トリル中の０．０５％ＴＦＡの線状グラジエントで、カ
ラムから溶出した。還元されたカルボキシメチル化蛋白
質は、２１５および２８０ｎｍにおける吸収、ならびに
それら画分の（³Ｈ）含量により決定される如く、２２
％のアセトニトリル溶液において溶出した。この物質
を、次の使用のために真空下に乾燥した。

【００６５】還元されたカルボキシメチル化蛋白質は、
アミノ酸配列の残基１から４１までの同定を生じる自動
エドマン分解により配列づけした。それらは次の如くで
ある：

【化４】

【００６６】還元されたカルボキシメチル化蛋白質を、
マウス下顎プロテアーゼでの消化に付し、そして生成し
たペプチドをシンクロムＲＰ８カラム上、上記と同じ溶
液およびグラジエントを使用する逆相ＨＰＬＣにより分
離した。２０％アセトニトリル溶液で溶出するそれらペ
プチドの１つを自動化エドマン分解により配列づけし、
そして次の結果を得た：

【化５】

【００６７】この同じペプチドを、キモトリプシンでの
消化に付して２つの新しいペプチドを得、それを再び上
記に示した如くシンクロムＲＰ８カラム上の逆相ＨＰＬ
Ｃにより分離した。１７％ＭｅＣＮアセトニトリルで溶
出するそれらの１つを自動化エドマン分解により配列づ
けし、そして次の配列を得た：

【化６】

【００６８】還元されたカルボキシメチル化蛋白質を、
Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼで消化し、そして生成したペプ
チドをシンクロムＲＰ８カラム上の逆相ＨＰＬＣにより
分離した。１３％および１５％アセトニトリルの間で溶
出する（³Ｈ）含有物質のピークをエドマン分解に付
し、それは次の配列を与えた。

【化７】

【００６９】還元されたカルボキシメチル化インヒビタ
ーのマウス下顎プロテアーゼ消化から得られ、そして２
６％および２８％アセトニトリルの間で溶出するペプチ
ドを自動化エドマン分解により配列づけし、そして次の
配列を得た：

【化８】

【００７０】還元されたカルボキシメチル化インヒビタ
ーをＶ８プロテアーゼでの消化に付し、そしてペプチド
をシンクロムＲＰ８カラム上の逆相ＨＰＬＣにより分離
した。１９％アセトニトリルで溶出するペプチドを自動
化エドマン分解により配列づけし、そして次の配列を得
た：

【化９】

【００７１】還元されたカルボキシメチル化インヒビタ
ーの下顎プロテアーゼ消化から生成し、そしてシンクロ
ムＲＰ８カラムから２６％および２８％アセトニトリル
の間で溶出するペプチドを、更にトリプシンで消化し
た。生成したペプチドを同じカラム上の逆相ＨＰＬＣに
より分離し、９％アセトニトリルで溶出するペプチドを
手操作エドマン分解により配列づけして、次の配列を得
た。

【化１０】

【００７２】同じ組成および配列のペプチドは、蛋白質
のＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ消化から単離しうる。このペ
プチドは、シンクロムＲＰ８カラムから８および１０％
アセトニトリルの間で溶出する。

【００７３】還元されたカルボキシメチル化蛋白質を６
Ｍ塩酸中で加熱することにより加水分解し、そしてＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動からの分子量約１
４，０００に基くその構成アミノ酸は次のものであると
決定された：Ａｌａ３．５Ａｒｇ５．８Ａｓｐ８．５Ｃｙｓ１５．７Ｇｌｕ５．２Ｇｌｙ１０．６Ｈｉｓ０．０Ｉｌｅ１．０Ｌｅｕ５．０Ｌｙｓ１６．２Ｍｅｔ４．０Ｐｈｅ２．１Ｐｒｏ１４．８Ｓｅｒ３．７Ｔｈｒ２．４Ｔｙｒ２．１Ｖａｌ４．７

【００７４】上記データは、還元されたカルボキシメチ
ル化インヒビターから得られる１組の重なり合うペプチ
ドを限定することが決定された。従って、本インヒビタ
ーの全配列は次の如くである：

【化１１】

【００７５】この蛋白質の塩酸加水分解物から予測され
たアミノ酸組成は、次の如くである：Ａｌａ３Ａｒｇ５Ａｓｐ９Ｃｙｓ１６Ｇｌｙ９Ｇｌｕ７Ｈｉｓ０Ｉｌｅ１Ｌｅｕ５Ｌｙｓ１５Ｍｅｔ４Ｐｈｅ２Ｐｒｏ１３Ｓｅｒ６Ｔｈｒ４Ｔｙｒ２Ｔｒｐ１Ｖａｌ５更に、Ｃｙｓ残基のすべてはお互いに結合してジスルフ
ァイド結合を形成するものと信じられる。

【００７６】例４気管支粘膜からのエラスターゼインヒビターの、耳下腺
からのそれとの同定ブラウンリーＣＸ３００カラムから０．２８Ｍホスフェ
ートで溶出されるインヒビターは、次の如く特徴づけら
れた：（ａ）インヒビターの検体を、標準条件下に、６Ｍ塩酸
中で加熱することにより加水分解した。本インヒビター
のアミノ酸組成は、Ａｌａ３．８Ａｒｇ５．０Ａｓｐ８．８Ｇｌｙ１１．３Ｇｌｕ６．３Ｈｉｓ０Ｉｌｅ１．３Ｌｅｕ５．０Ｌｙｓ１３．８Ｍｅｔ３．８Ｐｈｅ２．５Ｐｒｏ１２．５Ｓｅｒ６．３Ｔｈｒ３．８Ｔｙｒ１．３Ｖａｌ５．０である。これは、耳下腺からのインヒビターのアミノ酸
組成、あるいは上記配列から計算されるそれと著しくは
相違していない。

【００７７】（ｂ）インヒビターを、耳下腺からのイン
ヒビターにつき上に記した条件下に還元し、そしてカル
ボキシメチル化した。この蛋白質をついでマウス下顎プ
ロテアーゼで消化し、そして生成物をシンクロムＲＰ８
カラム上の逆相ＨＰＬＣにより分析した。消化パターン
は、ピークが耳下腺インヒビターの異った検体間でさえ
も溶出位置において異っている３１および３５％アセト
ニトリルの間で溶出するピークの形状を除いて、同時に
操作した耳下腺からの還元されたカルボキシメチル化イ
ンヒビターのそれと区別できないようにみえる。これは
多分、単一ペプチドの化学的変形から生じる。

【００７８】（ｃ）本インヒビターを自動化エドマン分
解に付し、そして第１の１４アミノ酸について次のアミ
ノ酸配列を得た：

【化１２】そのＸ、ＹおよびＺは、同定するには低すぎる水準で回
収されるアミノ酸である。気管支粘液から単離されたイ
ンヒビターと耳下腺分泌から単離されたそれとの間の強
い類似製は、それら２つの蛋白質の間の相違についてど
のような証拠も不存在であることと一緒で、それらが同
一かほぼ同一であることを示す。

【００７９】例５それを白血球エラスターゼのインヒビターとして臨床使
用に適当なものとするインヒビターの特徴の同定（ａ）例１の耳下腺インヒビターの溶液 pＨ８．０バッ
ファーおよび人間血清アルブミンの存在において白血球
エラスターゼの溶液に加え、そして残留遊離酵素を、メ
トキシサクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
ｐ−ニトロアニリドを加水分解するその能力を検定する
ことにより決定した。データーは、１インヒビターが１
酵素を不活性化し、そして酵素−インヒビター複合体の
解離定数が５×１０^-10Ｍである酵素−インヒビター相
互反応の標準モデルに適合する。

【００８０】同様の実験において、いくつかの他の人間
プロテアーゼを阻害する本インヒビターの能力を決定し
た。それらの解離定数を下記表に示す。

【表１】２５℃および pＨ７．８における例１のインヒビターとの複合体のセリンプロテアーゼ解離定数人間白血球エラスターゼ５×１０^-10Ｍ人間カテプシンＧ１．５×１０^-8Ｍ人間トリプシン１．５×１０^-9Ｍ人間キモトリプシン１．５×１０^-10Ｍ人間膵臓エラスターゼ２×１０^-8Ｍ

【００８１】（ｂ）０．２ＭトリスＨＣｌ、 pＨ７．８
中の耳下腺の溶液を栓つきチューブ中で７０℃に加熱
し、そして検体を各時間に検定のために採取した。結果
は、インヒビターが大略第１次カイネチックスで活性を
失い、そして約１０時間の半減期を有することを示し
た。この安定性の程度は、溶液中の蛋白質につき例外的
であり、そしてエラスターゼインヒビターとしての臨床
使用のための蛋白質の製剤において、顕著な利点を構成
する。

【００８２】（ｃ）７０％のギ酸中の本インヒビターの
溶液を３７℃で４０時間維持し、そして検定したとき、
そのもとの活性の少くとも８０％を維持することが認め
られた。（ｄ）本インヒビターの溶液を、マウス下顎プロテアー
ゼ、クロストリパインおよびサーモリシンで処理した。
後者酵素のみが、３７℃において３時間で、阻害活性の
著しい損失を生じた。この酵素により分解に対する抵抗
性は、それが化膿性気管支粘液中に存在しうる型の他の
酵素に対するインヒビターの一般的抵抗性を支持するの
で、インビボにおける白血球エラスターゼインヒビター
としてのこの蛋白質の使用において著しい利点を構成す
る。

【００８３】（ｅ）すべての限定された小僧を失った他
の蛋白質との類似性により予測して、６Ｍグアニジウム
塩酸塩および３０ｍＭジチオスレイトール中の本インヒ
ビターの溶液は、酸化グルタチオンを使用したジチオス
レイトールの１０倍過剰において加え、そして溶液を２
５ｍＭトリスＨＣｌ、 pＨ９．０で１０倍希釈したと
き、その天然の阻害活性の少くとも９０％が回収され
た。この結果は、本蛋白質の活性構造がポリペプチド鎖
の安定な構造であることを示す。結果は更に、本蛋白質
が各種の苛酷な処理下に活性を保ち、そして活性を破壊
する若干の条件下においてさえも、それら条件が逆転さ
れたとき活性を回復する能力を保持しうることを意味す
る。

【００８４】この技術分野において熟練している者に
は、各種の変形および変化が本発明の方法および生成物
に対しなしうることは明らかであろう。従って、本発明
は、それらが添付された請求の範囲およびそれらの均等
内に入ると言う条件で、本発明の変形および変化を包含
する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単一の非断片化ポリペプチド鎖を有し、
少なくとも１種のセリンプロテアーゼのプロテアーゼ活
性を阻害可能であり、次のアミノ酸配列を有する精製セ
リンプロテアーゼインヒビター。【化１】式中、Ｒ_１はセリンまたはプロリンからなる群から選択され；Ｒ_７は、アラニンまたはプロリンからなる群から選択さ
れ；Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_８およびＲ_９は、同一または異なってメ
チオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロ
シン、トリプトファン、リジン、ロイシンまたはアルギ
ニンからなる群から選択され；ならびにＲ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、メチオニンまたはバリンから
なる群から選択される、但し、Ｒ_１がセリンであり、Ｒ
_２がアルギニンであり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６が
メチオニンであり、Ｒ_７がアラニンであり、そしてＲ_８
およびＲ_９がロイシンである場合を除く。
【請求項２】Ｒ_１がセリンであり、およびＲ_７がアラ
ニンである請求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒ
ビター。
【請求項３】Ｒ _３がメチオニンである請求項１に記載
のセリンプロテアーゼインヒビター。
【請求項４】Ｒ_２およびＲ_３がアルギニンである請求
項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビター。
【請求項５】Ｒ_２がアルギニンであり、およびＲ_３が
メチオニンである請求項１に記載のセリンプロテアーゼ
インヒビター。
【請求項６】Ｒ _３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６がメチオニ
ンであり、ならびにＲ_８およびＲ_９がロイシンである請
求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビター。
【請求項７】Ｒ _３、Ｒ_４、Ｒ_５またはＲ _６の１個以上
がバリンであり、天然セリンプロテアーゼインヒビター
に比して酸化的不活性化に対してより抵抗性である請求
項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビター。
【請求項８】Ｒ_２、Ｒ _３、Ｒ_８またはＲ_９の１個以上
がアラニンであり、天然セリンプロテアーゼインヒビタ
ーに比して膵臓エラスターゼの阻害においてより活性で
ある請求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビタ
ー。
【請求項９】Ｒ_２、Ｒ _３、Ｒ _８またはＲ_９の１個以上
がフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンか
らなる群から選択され、天然セリンプロテアーゼインヒ
ビターに比してカテプシンＧの阻害においてより活性で
ある請求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビタ
ー。
【請求項１０】Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_８
またはＲ_９の１個以上がリジンまたはアルギニンからな
る群から選択され、天然セリンプロテアーゼインヒビタ
ーに比してトリプシンの阻害においてより活性である請
求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビター。
【請求項１１】Ｒ_１およびＲ_７の少なくとも１つがプ
ロリンであり、セリンプロテアーゼの少なくとも１種を
阻害する請求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビ
ター。
【請求項１２】単一の非断片化ポリペプチド鎖を有
し、少なくとも１種のセリンプロテアーゼのプロテアー
ゼ活性を阻害可能であり、次のアミノ酸配列：【化２】式中、Ｒ_１はセリンまたはプロリンからなる群から選択され；Ｒ_７は、アラニンまたはプロリンからなる群から選択さ
れ；Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_８およびＲ_９は、同一または異なってメ
チオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロ
シン、トリプトファン、リジン、ロイシンまたはアルギ
ニンからなる群から選択され；ならびにＲ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、メチオニンまたはバリンから
なる群から選択される、但し、Ｒ_１がセリンであり、Ｒ
_２がアルギニンであり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６が
メチオニンであり、Ｒ_７がアラニンであり、そしてＲ_８
およびＲ_９がロイシンである場合を除く；を有する精製セリンプロテアーゼインヒビターおよび医
薬的に許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項１３】経口投与、非経口投与、局所投与およ
びエアロゾル投与からなる群から選択される経路による
投与に適した形態である請求項１２に記載の組成物。