JP2001522864A - 反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体及び抗体断片 - Google Patents

反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体及び抗体断片

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Abstract

(57)【要約】 グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体又は抗体断片を作成する方法が提供される。本方法は糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において1つ又はそれ以上のグリコシル化部位を有する抗体をコードするベクターによりトランスフェクションされた細胞を発現するステップを含み、また、抗体断片の場合は、結果的に生じた抗体を断片化して抗原結合抗体断片の中に入れるステップを含む。グリコシル化抗体又は抗体断片を含む免疫共役体を作成する諸方法もまた提供されるが、そこでは抗体又は抗体断片はケトン反応基を含む薬剤と反応する。グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体と抗体断片、このような抗体と抗体断片を含む免疫共役体、このような抗体、抗体断片、免疫共役体を使用したin vivoでの標的化方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 1. 発明の技術分野 本発明は、特定部位に反応性ケトン基を有するように修飾されたグリコシル化
抗体と抗体断片に関する。ケトン反応基を有するこれらの「景色化された（land
scaped）」抗体と抗体断片は臨床上の適用に有用であり、また in vivoでの標的
部位にその薬剤をデリバリーするのに使用されるリンカー、ペプチド、オリゴ糖
あるいは他の薬剤と共役することができる。
【０００２】 2. 関連先行技術の記載 抗体免疫共役体は現代医療で広く使用されている。薬剤とキレート剤を含む様々
な診断と治療のための化合物のモノクローナル抗体（mabs）に対する効果的な共
役を可能にする化学的方法がよく報告されている。しかし、こうした方法の大半
はチロシン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの一定のアミノ酸残基
に無作為に付着することに依存している。腫瘍を有するマウスで有意な抗腫瘍活
性を示したBR-96-DOX 16771 と LL2-シュードモナス菌体外毒素免疫共役体は、 そうした残基で共役により構築された抗体免疫共役体の実施例である。しかし、
これらの共役は極端な化学的な条件下で作成され（非生理学的なpH、温度、溶媒
、他）、共役は部位-特異的ではないため、結果的に生じる免疫共役体は縮小な らびに異種抗原結合特性を示すことがある。
【０００３】 Rodwellら、Proc. Nat'l Acad. Sci., 83: 2632 (1986) は、放射性核種共役の 都合のよい化学的処理として、CH2ドメイン (Asn297) においてAsnにリンクされ
ている炭水化物 (CHO) を使用するモノクローナル抗体 (mAbs) の部位特異的共 有結合修飾を報告している。この方法により形成された131I共役体では、マウス
におけるin vivoでの標的効率の改善がみられた異種結合特性が示されている。 中間キャリアとして可溶性アミノ-デキストランを使用して、メソトレキセート （MTX）、フルオロウリジンあるいはドキソルビシン（DOX）などの治療薬剤はCH
2付加炭水化物の一部分で共役された。これについては、例えば、米国特許第4,6
99,784号を参照されたい。だが、Asn297関連CHOは2つの隣接CH2ドメイン間に形 成される内腔に位置しているため、立体障害がこの部位での共役の効率を妨害す
ることが予想される。さらに、臨床上の使用に多くの場合好適であるF(ab')2、F
ab'、Fabなどの抗体断片は、Fc部分と関連炭水化物の一部分を欠く。したがって
、これらの種はこの方法では共役することができない。
【０００４】 本明細書の記載の一部としてその全体を引用するHansenらの米国特許第5,443,95
3号とLeungらの米国特許仮出願第60/013,709号は、抗体のVkとCH1（HCN1及びHCN
5部位）ドメインにおける複数のグリコシル化部位の導入を述べている。これら のすべての部位におけるキレートの付着は、結果的に生じる抗体の免疫反応性に
影響を及ぼすことはなく、これについては、Leungら、J.Immunol. 154：5919(19
95)を参照すると分かるが、これらの炭水化物を薬剤又はキレート剤に対する理 想的な部位特異的な共役部位に仕立てられる。しかし、これらの炭水化物におい
て共役するためには、反応性アルデヒド基を生成するよう、リボース環を化学的
に酸化させなければならない。このように形成されたアルデヒド基はシッフ塩基
によりキレート剤又は薬剤のアミノ基に共有的に結合することができる。各炭素
に付着しているヒドロキシル基を伴うC-C結合のみが、2つのアルデヒド基を形成
するように過ヨウ素酸酸化することができるため、最大限度数のこれらの反応性
部位がオリゴ糖の構造とリンケージによって書き取られる。
【０００５】 例えば、2つの抗体、hLL2HCN1とhLL2HCN5由来のCH1付加炭水化物の組成と配列は
蛍光団援用炭水化物電気泳動法（FACE）16411により測定されてきた。これにつ いては、Quら、Glycobiol. 7(6)：803-09(1997)を参照されたい。hLL2HCN1-炭水
化物の構造的なプロフィールからは、オリゴ糖鎖における約2〜4の六炭糖環が過
ヨウ素酸酸化に有用であることが明らかにされた。したがって、平均で8〜16の アルデヒド基最大のものを、各hLL2HCN1 F(ab')2断片の炭水化物側鎖から生成す
ることができる。HCN1の平均サイズよりも大きい3〜4単糖残基であるhLL2HCN5炭
水化物の平均サイズに関しては、hLL2HCN5の最大限度達成可能なアルデヒド基の
数はさらに大きくなることが予想される。温和な化学的な条件下では、DTPAの1.
6と3分子のみが、おそらくこれら条件下での六炭糖環の不十分な酸化のために、
それぞれhLL2HCN1とhLL2HCN5部位のF(ab')2に共役していた。さらに多くのアル デヒド基を生成するのにより厳しい条件を使用することができるが、そうした条
件下では抗体の三次元構造が変わり、また抗体の免疫反応性が損なわれることが
ある。
【０００６】 Brumeanuら、J.Immuno.Meth. 183：185-97(1995)は、ガラクトースオキシダーゼ
（GAO）により脱シアル酸化免疫グロブリン(Igs)の末端ガラクトース(Gal)残基 を酸化することによりC-6アルデヒドが生成された、その酵素的手順によって、 炭水化物の一部分にペプチドを結合させることを報告している。ペプチドの付着
はその後、温和な還元でシッフ塩基の同時安定化により達成される。この共役は
生理学的な条件下で起こり、また、ガラクトース等価の推定数と一致するIg当た
りで結合するペプチドの平均数に関して特異的であり、また効率的である。しか
し、この方法は非常に数多くの時間を消費するステップを必要とし、また、事前
標的化に関しては、in vivoでの共役に採用することはできない。
【０００７】 したがって、癌や感染症の診断ならびに治療などの臨床上の適用に有用な免疫共
役体を形成するため、特異的な部位で共役することができる抗体と抗体断片にが
要望されていた。共役が特定部位で起こり、また、抗体又は抗体断片の特異的結
合を干渉しない抗体及び抗体断片作成法が要望されていた。
【０００８】発明の要約 したがって、本発明の目的の1つは、免疫反応性免疫共役体を産生するために、 特異的な部位で容易に共役することができる抗体と抗体断片を提供することであ
り、抗体と抗体断片を含む免疫共役体を提供することである。
【０００９】 本発明の目的の1つはまた、特異的な部位で共役が起こり、また抗体又は抗体断 片の特異的結合を干渉しない抗体及び抗体断片を作成する方法を提供することで
ある。
【００１０】 本発明の目的の1つはまた、免疫反応性免疫共役体を産生するために、特異的な 部位で、容易に共役することができる抗体又は抗体断片を使用して、あるいはこ
うした抗体又は抗体断片を含む免疫共役体を使用して、in vivoでの標的部位に 活性のある薬剤を向ける方法を提供することである。
【００１１】 これらの、また他の目的を達成するにあたって、本発明の1つの形態は、糖又は 糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において1つ又はそれ以上のグリコシル 化部位を有する抗体をコードするベクターによりトランスフェクションされた細
胞を発現させるステップを含む、また、抗体断片の場合は、結果的に生じる抗体
を断片化して抗原結合抗体断片の中に入れるステップを含む、グリコシル化部位
に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片を作成する方
法を提供する。
【００１２】 もう1つの実施形態により、本発明は、糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培 養培地の中で1つ又はそれ以上のグリコシル化部位を有する抗体を含むベクター によりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップと、結果的に生じ
る抗体を断片化して抗原結合抗体断片の中に入れるステップと、ヒドラジド、ヒ
ドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成されるグループか
ら選択されたケトン反応基を含む薬剤と抗体とを反応させるステップとを含む、
グリコシル化部位により薬剤に共役するグリコシル化抗体を含む免疫共役体を作
成する方法を提供する。
【００１３】 もう1つの実施形態では、本発明は、糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養 培地において、1つ又はそれ以上のグリコシル化部位を有する抗体を含むベクタ ーによりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップと、結果的に生
じる抗体を抗原結合抗体断片の中に断片化して入れるステップと、またヒドラジ
ド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成されるグル
ープから選択されたケトン反応基を含む薬剤と抗体断片とを反応させるステップ
とを含む、グリコシル化部位により薬剤に共役するグリコシル化抗原結合抗体断
片を含む免疫共役体を作成する方法を提供する。
【００１４】 他の実施形態により、本発明は、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグ
リコシル化抗体又は抗原結合抗体断片と、グリコシル化部位により薬剤に共役す
るグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片を含む免疫共役体を提供する。
【００１５】 他の実施形態により、本発明は、in vivoでの標的部位を標的として活性のある 薬剤を向ける方法を提供する。1つの実施形態により、本方法はグリコシル化部 位により活性のある薬剤に共役されるグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片を
含む免疫共役体を投与するステップを含む。もう1つの実施形態により、本方法 はグリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体又は抗原結合抗
体断片を投与するステップと、抗体又は抗体断片が標的部位に局在することを可
能にするステップとを含む。任意には、非局在抗体又は抗体断片を血液循環から
取り除く除去薬剤を投与するステップを含む。また、ヒドラジド、ヒドラジン、
ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成されるグループから選択され
るケトン反応基を含む活性のある薬剤を投与するステップを含み、それによって
活性のある薬剤は事前標的化されている抗体又は抗体断片による共役を介して標
的部位に局在する。
【００１６】 本発明のこれらの、また他の目的と形態は、本出願書に含められている教示内容
に鑑み、当業者には明らかであろう。
【００１７】発明の好適な実施の形態の詳細な説明 本発明は、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するように景色化されるグリ
コシル化抗体と抗体断片を提供する。「反応性ケトン基」が意味しているものは
、生理学的条件下でヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラキシルアミノ、チオセミカ
ルバジド基と反応するケトン基である。こうした反応性ケトン基は自然発生する
タンパク質と糖タンパク質には存在せず、また臨床上の適用に有用である、リン
カー、ペプチド、オリゴ糖や他の薬剤などのケトン反応性を有する一部分を含む
薬剤取り付けのための効率的な分子ハンドルとして役に立てることができる。
【００１８】 本発明はまた、共役がグリコシル化部位で起こり、また抗体又は抗体断片の特異
的結合を干渉しない、抗体又は抗体断片免疫共役体を作成する、簡単で、効率的
な方法を提供する。景色化された抗体と抗体断片と免疫共役体を使用するin viv
oでの方法もまた提供される。
【００１９】 Mahalら、Science 276：1125（1997）は、オリゴ糖生合成経路はL-レブリノイル
マンノースアミン（ManLev）由来の代謝シアル酸基により細胞表面関連末端シア
ル酸残基を置換するのに使用することができ、その結果、反応性ケトン残基によ
り充填された細胞表面形成を生じることを報告している。Mahalらは、分子ハン ドルとしてこれら細胞表面ケトンを使用し、アシルヒドラゾンの形成により生理
学的条件下でビオチンアミドカプロイルヒドラジドにそれらを化学選択的に結合
した。ビオチン結合細胞は、リチンA鎖アビジン共役が加えられて、殺傷された 。
【００２０】 Mahalらは、形質転換された細胞がシアル酸と、もう1つの糖であるフコースの両
方を多く含む抗原基を過剰発現するので、またいくつかの腫瘍部位がヒドラジド
-ケトン相互作用をさらに可能にするpH（pH 5）を有するので、腫瘍細胞のin vi
voでの修飾は、その後に、ヒドラジド又は同様の反応基にリンクされる細胞毒性
の薬剤の投与により補われるが、癌や他の疾病を治療するための新しい治療適用
の様式になることも考えられる。しかし、Mahalらはこの方法が有しているかも しれない、ケトンにより景色化された臓器に対して有害効果の可能性については
書いていないし、また、血液循環におけるケトン反応性細胞毒性薬剤と自然発生
ケトンとアルデヒドの一部分の間で起こうる反応効果についても書いていない。
【００２１】 本発明者は、オリゴ糖生合成経路が抗体のN-グリコシル化部位に反応性ケトン基
を導入するのに使用することができ、また、景色化された、こうしたケトン含有
抗体（又はこれら抗体の抗原結合断片）は、in vitro又はin vivoのいずれでも 、免疫反応性免疫共役体を形成するためにケトン反応性薬剤と反応することがで
きることを発見した。
【００２２】 本発明の景色化抗体と抗体断片は以下の一般的な手順により作成される。N-結合
されたグリコシル化部位は遺伝子工学的な処理により抗体の一定の位置に導入さ
れる。トランスフェクションされた抗体を発現させる安定したクローンは、糖の
ケトン誘導体（N-レブリノイルフコースなど）又は糖前駆体（N-レブリノイルマ
ンノースアミン（ManLev）など）で補足された培養培地において増殖され、N-グ
リコシル化部位にある反応性ケトン基を含む抗体に結果的になる。ManLevの場合
、生合成経路は、グリコシル化部位で抗体の中に組み込まれるレブリノイルシア
ル酸にManLevを変換する。N-レブリノイルフコースの場合、N-レブリノイルフコ
ース自体がグリコシル化部位で抗体の中に組み込まれる。
【００２３】 景色化F(ab)、F(ab')、F(ab')2断片を含めた景色化抗原結合抗体断片は、公知の
手順により抗原結合抗体断片の中に景色化抗体を断片化して入れることによって
、作成される。
【００２４】 本発明により、単鎖抗体もまた、例えば、Vκ領域に存在するグリコシル化部位 を使用して、景色化することができる。以下に続く議論では、単鎖抗体が抗体の
代わりに使用できることが理解されて然るべきである。
【００２５】 すべての抗体が糖タンパク質であるが、抗体の炭水化物の大半は、CH2ドメイン の中のAsn297でN-結合されている。ヒト、マウスにおける、またハイブリドーマ
由来のFc-関連炭水化物の高いパーセンテージは不完全に処理されており、構造 タイプ（複合-又は高いマンノース-タイプ）、外部分岐でのSia、Gal及び/又はG
lcNAc残基の分量、コアフコシル化において様々である。Fc-関連炭水化物の12〜
15％のみがシアル酸化される。自然発生Fc-関連炭水化物により抗体を景色化す ることは、したがって、実際的ではない。
【００２６】 その代わりに、1つ又はそれ以上のN-グリコシル化部位を有するように遺伝子工 学的に処理された抗体は、本発明による景色化に関しては好適である。こうした
抗体は公知の手順により作成することができる。その内容が全体として本明細書
の記載の一部として引用される米国仮出願第60/013,709号は、適当な複数のグリ
コシル化抗体を記述している。抗体のVκドメインにおける位置18〜20（Vκ-N）
と、抗体のCH1ドメインにおける位置162〜164（HCN1）で導入されたN-結合グリ コシル化部位は、1つの部位が1つの抗体に導入される場合に、効率的にグリコシ
ル化されることが示された。同様の効率的なグリコシル化が、これらの部位の1 つ以上を含むように遺伝子工学的に処理された抗体から考えられる。したがって
、これらの部位の1つ又はそれ以上を含むように遺伝子工学的に処理された抗体 は、本発明において有用である。
【００２７】 抗体hLL2HCN1とhLL2HCN5は、N-グリコシル化部位を含むように遺伝子工学的に処
理された抗体の実施例である。これについては、その内容が全体として本出願に
記載されている同時係属米国出願第08/690,102号を参照されたい。これらの抗体
の遺伝子工学的に処理された炭水化物は、CH1ドメインの表面上に位置し、相対 的に均質であり、すべてがコア-フコシル化され、複合タイプであり、強くシア ル酸化されている。hLL2をコードするVHとVκ領域が、関心の対象である他の抗 体のそうした領域により置換される抗体もまた、本発明により有用となる。この
置換は、例えば、簡単な切り取りとペースト手順により成し遂げることができ、
連続的に酵素対Xhol/HindIIIとXbal/BamHlをそれぞれ使用することができる。V κ-N部位を含むVκ領域は、同様のアプローチを使用して挿入することができる 。これについてはまた、以下に述べられている実施例を参照されたい。
【００２８】 上述された3つのグリコシル化部位の1つ、あるいはVκ-N/HCN1と Vκ-N/HCN5あ るいはHCN1/HCN5の組み合わせた部位の2つ、あるいはすべての3つの部位を伴う 、遺伝子工学的に処理された抗体などの異なるグリコシル化変異体を含む抗体は
遺伝子工学的に処理することができる。それらはF(ab')2、Fab'又はFab断片にお
いて使用することができるので、これらの部位には利点がある。IgGを使用する 場合は、CH2付加炭水化物が4番目に可能性のある部位として景色化のために役に
立たせることができる。当業者には公知の手順により、付加的なグリコシル化部
位が同定され、またVκ、VH、CH1、CH2、CH3、Cκドメインで遺伝子工学的に処 理することができる。
【００２９】 糖又は糖前駆体のケトン誘導体の存在下で抗体産生細胞を増殖することにより、
生合成過程によるN-グリコシル化部位に反応性ケトン基が効率的に導入される。
糖及び糖前駆体のケトン誘導体は、グリコシル化抗体にケトン基を導入するため
に、単独で、又は組み合わせて使用することができる。任意には、クローンによ
る抗体産生レベルは培養培地にメソトレキセートを加えることによって増加させ
ることができる。
【００３０】 細胞培養培地において糖又は糖前駆体のケトン誘導体の濃度は、抗体の中に導入
されるケトン基の数を最適化するために制御することができる。回転瓶培養法、
流加培養法又は連続還流バイオリアクターなどの抗体培養に関しては、培地が糖
又は糖前駆体のケトン誘導体で補足されているかぎりは、いずれかの方法で増殖
することができる。
【００３１】 これらの景色化抗体又は抗体断片を含む免疫共役体は、生理学的条件下でヒドラ
ジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミノ又はチオセミカルバジド基などのケトン
反応基を含む薬剤と、景色化抗体又は抗体断片を反応させることにより作成され
る。薬剤は、例えば、リンカー、キレート剤又は診断もしくは治療薬剤でありう
る。いずれかのリンカー、キレート剤あるいは診断もしくは治療用薬剤は、それ
がケトン反応基を有しているかぎりは、使用することができる。景色化抗体又は
抗体断片は1つの反応性ケトン基を含み、各ケトン基は薬剤に共役することがで き、抗体又は抗体断片当たりの複数の薬剤の一部分を含む免疫共役体に結果的に
なる。
【００３２】 本発明により景色化抗体又は抗体断片に共役することができる薬剤の実施例には
、リンカー、キレート剤、キレート化金属、ペプチド、オリゴ糖、ビオチンアミ
ドカプロイルヒドラジド、診断用マーカー、薬剤（例えば、メソトレキセート、
フルオロウリジン、ドキソルビシン）、毒素（リチンA鎖など）画像ラジオアイ ソトープ、治療用ラジオアイソトープが含まれる。
【００３３】 本発明により景色化抗体に共役することができるリガンド含有ペプチドの実施例
には、DTPAを有するペプチド、DOTAを有するペプチド、アシルヒドラジドAc-KdD d Kd（TscGC）DdKd-NH（CH2）4CH（NH2）CONH-NH2とAc-KdDdKd（TsdGC）DdKd-NH （CH2）4H（NH2）CONH-NH2、ヒドラジンH2N-NH-CH2-CO-Dd-Kd（TscGC）-Dd-Kd-N
H2が含まれるが、そこではKdとDdはD-アミノ酸D-リシンとD-アスパラギン酸をそ
れぞれ表している。またTscGCがリガンドである場合は、すなわち、
【化５】 また、TsdGCがリガンドである場合は、すなわち、
【化６】 が含まれる。
【００３４】 DTPA-とDOTA-含有ペプチドは111Inと90Yによりキレート化するのに適している
。だが、沸騰などの極端な条件がTc-99mとRe-188をキレート化する場合には必要
となる。これについては、例えば、米国特許第5,175,343号、第5,120,526号、第
5,242,679号を参照されたい。これらの極端な条件は共役抗体又は抗体断片を減 成させるであろう。対照的に、アシルヒドラジドとヒドラジンペプチドの場合は
、Tc-99mとRe-188をより容易にキレート化する。例えば、TscGCリガンドは室温 で標識化することが示されている。これらのペプチドのリガンドは、診断用画像
アイソトープTc99mにより、安定したTc(V)オキソ複合体を形成する。
【００３５】 これらペプチドのヒドラジンは景色化抗体と抗体断片に対してヒドラゾン連鎖
をケトンにより形成するのに使用される。親水性アミノ酸は、抗体に対して遊離
チオール含有ペプチドを共役する間にジスルフィド交換又は混合ジスルフィド形
成が行われるように、そのペプチドを十分に親水性なものにする。驚くべきこと
に、ヒドラジンペプチドは、アシルヒドラジドペプチドよりもさらに安定した抗
体共役を形成し、一方、アシルヒドラジドペプチド抗体共役は24時間後に標識化
ペプチド喪失を示した。これについては、以下の実施例8で論議される。
【００３６】 ペプチドのDアミノ酸は、注射後金属複合ペプチドの代謝を最小化する。した がって、タンパク質が減成されることがあれば、親水性金属含有ペプチドは代謝
されないことになる。さらに、そのペプチドが親水性であるため、細胞から逃れ
出る標識化ペプチドは急速に腎臓から排出されることになる。
【００３７】 抗原エピトープはまた、景色化抗体又は抗体断片に共役することができる。例
えば、-（CH2）n-リンカーを介してヒドラジド基に共有的にリンクされるα-Gal
エピトープを含有するオリゴ糖を使用することができる。こうしたエピトープと
共役した腫瘍特異的抗体又は抗体断片は自然抗-Gal抗体を介する免疫応答を誘発
する。これについては、その内容が全体として参考に値するとして本出願書に記
載されている米国仮出願第60/037,908号を参照されたい。
【００３８】 景色抗体は回収され、少なくとも3つの異なる方法で共役させることができる 。
【００３９】 1. 培養後、抗体は標準的なタンパク質A親和性カラム手順により精製される。 ケトンで景色化された精製抗体はヒドラジド又はヒドラジン基などのケトン反応
基を含む薬剤と混合させる。急速なヒドラジドケトン反応は、部位特異的方法で
アシル-ヒドラゾンを介して遺伝子工学的に処理された炭水化物において共有的 にリンクされる抗体共役を形成する結果となる。
【００４０】 2. 培養後、培地はケトン反応基を含む薬剤を過剰負荷される。過剰ヒドラジド
はいずれかの組み込まれていない糖、景色化細胞糖タンパク質又は糖脂質を中和
化し、景色化抗体と共役される。末端培養から生じる酸性環境は、例えば、ヒド
ラジドとケトンの間の反応を促進する（pH 7.3〜7.6でよりもpH 5での方が10倍 早く起こる）。複合抗体はタンパク質Aカラムを使用して精製される。
【００４１】 3. 培養後、景色化抗体が洗浄されカラムから溶離される前に、その抗体はタン
パク質Aに結合され、薬剤により直接反応を起こす。
【００４２】 以下の反応式は、ヒドラジド含有分子と、ケトン景色化抗体又は抗体断片との間
の反応を図示している。
【化７】 ここでは、Rはヒドラジド含有薬剤を表しており、またグリコシル化Abはグリコ シル化抗体又は抗体断片を表している。
【００４３】 本発明の1つの実施形態により、ケトン反応基はアスパラギン酸のヒドラジド 誘導体を含む。以下の反応式は、このタイプの薬剤と、ケトン景色化抗体又は抗
体断片の間の反応を図示している。
【化８】 Rはヒドラジド含有薬剤を表し、またグリコシル化Abはグリコシル化抗体又は抗 体断片を表す。反応は、他のアシルヒドラジド-ケトン反応と同じ条件下で起こ るであろう。例えば、約pH 5は利点があるが、しかし、反応はpHは約7.3〜7.6に
まで上昇した値で進行するであろう。この反応は急速に反応し、また結果的に生
じる共役は、シアノホウ酸ヒドリドナトリウム還元などの個別の安定化ステップ
を行わないで安定すると考えられる。
【００４４】 臨床上関心の対象となっている腫瘍、病原体、他の分子に特異的な抗体と抗体
断片は、本発明により景色化し、またウイルス、細菌、寄生虫感染を含む癌又は
その他の病理の診断及び治療などの臨床上の適用に使用することができる。景色
化抗体は、ケトン反応基を含む診断又は治療用薬剤に直接共役し、又はケトン反
応基を含むキレート剤により診断もしくは治療用薬剤に共役することができる。
結果的に生じる免疫共役体は、癌又は他の病理学的状態の診断もしくは治療を成
し遂げるために、標準的な免疫診断又は免疫治療手順により、in vivoに投与す ることができる。
【００４５】 代替的には、臨床上の関心の対象となっている腫瘍、病原体、その他の分子に
特異的な景色化抗体又は抗体断片は、事前標的化方法に使用することができる。
本発明による事前標的化方法の1つの実施例では、景色化抗体又は抗体断片が投 与されて、腫瘍又は病変などの標的部位に局在することを可能にする。その後、
ケトン反応基を含む診断又は治療用薬剤（あるいは、ケトン反応基を含むキレー
ト化薬剤によってキレート化された診断又は治療用薬剤）が投与される。この薬
剤は局在化した景色化抗体又は抗体断片と反応し、それによって標的部位に診断
又は治療用薬剤をデリバリーする。ケトン反応薬剤はまた、ケトン基を含む循環
分子と反応するが、Mahalらの方法にあったように、これら分子が細胞表面結合 ではないため、いずれかのこうした反応は問題となる副作用を産生することは予
想されない。
【００４６】 本発明のもう1つの事前標的化方法により、血液循環から非局在化抗体を除去 するために、除去薬剤が景色化抗体が標的部位に局在化した後に（また診断又は
治療薬剤が投与される前に）投与される。好都合なことに、抗イディオタイプ抗
体などの除去薬剤は、景色化抗体に対して抗イディオタイプ的である。全体とし
て参考に値するとしてその内容が本出願書に記載されている、米国出願第08/486
,166号と第08/731,107号は、本発明による有用な、抗イディオタイプ的除去薬剤
を記述している。
【００４７】 本発明の実施形態はさらに、詳細に本発明の実施の形態を示す以下の実施例に
より説明される。これらの実施例は本発明の具体的な形態を説明しており、その
範囲を制限するものではない。
【００４８】 実施例1.ヒト化抗体における自然発生N-結合炭水化物の遺伝子工学的再処理 Vκ FRI領域の潜在的なAsn-結合グリコシル化部位はLL2と称せられる抗B細胞 モノクローナル抗体において同定された。この部位はコンピュータモデリング研
究によって予測されていたように、グリコシル化と付着CHOに対して使用される べきものであることが確認され、抗原結合部位（ABS）からは離れて位置決めさ れた。このV-付加CHOへのキレート剤、DTPA、又はDTPA誘導体の共役は、結果生 じる共役体の免疫反応性に対して何らかの悪影響を有することは観察されなかっ
たが、一方、リシン残基に匹敵する数のキレート剤の無作為な共役は免疫反応性
における実質的な減少という結果になった。これについては、以下にある表1を 参照されたい。普遍的な共役部位として、とくにFcドメインの抗体断片欠失に対
して役に立つこのV-付加CHOの能力は、LL2グリコシル化部位がhMN14のVドメイン
の対応する領域に移植されたときに示され、また遺伝子工学的に再処理されたmA
bの中にあるその移植部位は、グリコシル化されていることを示した。この部位 のグリコシル化も遺伝子工学的に再処理されたCHOへのキレート取付けもmAbの結
果的に生じた免疫反応に影響を与えることは観察されなかった。研究された全CH
O共役体は効率的に111Inと90Yにより標識化された。
【００４９】
【表１】
【００５０】 実施例2. hLL2のCH1ドメインにおけるN-結合CHOsの設計と遺伝子工学的処理 新規なCHOの一部分を遺伝子工学的に処理するために、グリコシル化受容体配列 、Asn-X-Ser/Thrが部位特異的突然変異誘発によりhLL2のCκとCH1ドメインに導 入された。トリペプチド配列がタンパク質におけるN-結合グリコシル化を指示す
るために必要であるが、効率的なグリコシル化は適切に位置決めされた受容体で
のみ起こる。部位は次のように設計された。すなわち、効率的なグリコシル化に
適当な位置を同定するために、（1）他の抗体の定常ドメインで自然な状態でみ つかり、（2）コンピュータモデリングにより同定されていたように表面位置で 、あるいは（3）CκとCH1ドメインに沿って「均等に」分散する、無作為に選択 された部位である。合計で、5つのCH1部位（HCN1〜5）と5つのCκ部位（KCN1〜5
）が設計され、また遺伝子工学的に処理された。
【００５１】 表2には、hLL2のCH1とCκドメインにおけるN-グリカン受容体の位置と配列を示 す。部位を指示された突然変異誘発はトリペプチド受容体配列（太字）を生成す
るのに使用された。hLL2のCH1（H鎖）とCκ（L鎖）ドメインの部分的なペプチド
配列が示され、また、遺伝子工学的に処理された潜在的なAsn-結合グリコシル化
部位（HCN1〜HCN5とKVN1〜KCN5）の間の位置関係を示すために配列と構造相同性
により並べられた。β-鎖配列（C〜F）は箱の中に押し込められている。残基はK
abatのシステムにより番号が付けられた。すなわち、以前に不連続に番号付けら
れた重鎖残基はアステリスク（*）で示され、また残基は左から右に、156、162 、171、182、203、205とそれぞれ番号が付けられた。
【００５２】
【表２】
【００５３】 KCN5を除くすべてのケースで、最終的な三次構造で可能な摂動に関しては、1 つの潜在的なグリコシル化部位になるように、ただ1つのアミノ酸置換のみを必 要とする配列を注意深く選択することにより最小限度のものにされた。KCN5の場
合は、配列Asn-Val-Ser（166〜168）を形成するように2つのアミノ酸残基が変え
られた。これらの部位は、コンピュータモデリング分析により評価されているよ
うに、「埋め込まれている」、あるいは2つの並列したドメインの間のインター フェイスにあるようにはみえなかった。
【００５４】 これらの遺伝子工学的に処理された部位は効率的にグリコシル化されたかどうか
を調べるために、抗体突然変異体は安定的にトランスフェクションされた細胞か
ら精製され、また還元条件下でSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動）により分析された。遺伝子工学的に処理された部位での
グリコシル化のために、遅めの速度で移動させた突然変異体抗体hLL2HCN1〜5の 重鎖は、そのCH1ドメインには何らの潜在的なグリコシル化部位も含んではいな い親抗体hLL2の重鎖と比較された。分子サイズに逆比例している、SDS-PAGEでの
ペプチドの相対移動速度から、異なる部位でのグリコシル化の程度がHCN5＞HCN1
＞HCN3＞HCN2＞HCN4となっており、hLL2HCN5とhLL2HCN1が2つの最も高度にグリ コシル化された抗体であることが推定された。対照的に、突然変異体hLL2KCN1〜
5の軽鎖における移動遅延がないことから、これらCκ関連部位はグリコシル化さ
れていなかったという結論につながった。
【００５５】 すべてのヒトIgGsはAsn297でCH2ドメインでは自然にグリコシル化されるので、S
DS-PAGEでみられる突然変異体抗体とhLL2との間のサイズの差異は、培養条件に おける変化の結果として、遺伝子工学的に処理された部位でよりも、Asn297で示
されたグリコシル化による差異であると考えられる可能があった。hLL2HCN1、hL
L2HCN5、hLL2のF(ab')2断片がSDS-PAGE分析のために作成されたとき、抗体間の サイズの差異は、Fc部分の欠失であり、また付加されたオリゴ糖であるFd断片（
VH-CH1）と実際に関連していたことが確かめられた。したがって、SDS-PAGEでみ
られた突然変異体抗体とhLL2の間のサイズの差異は、Asn297で示されたグリコシ
ル化の差異のせいではなかった。
【００５６】 これらのCH1付加オリゴ糖のサイズを定量的に評価するために、hLL2、hLL2HCN1 （Asn162でのグリコシル化部位；トリペプチド受容体NGS）とhLL2HCN5（Asn198 でのグリコシル化部位；トリペプチド受容体NGT）が作成され、質量分析計によ る分析（Mass consortium社製、カリフォルニア州サンディエゴ市）にかけられ た。hLL2、hLL2HCN1、hLL2HCN5のF(ab')2断片の質量分析計により測定された分 子質量は、それぞれ99,471、102,884、104,345であった。CH2付加CHOを含むFc部
分は除外されたので、非グリコシル化hLL2のF(ab')2断片とグリコシル化突然変 異体との間の質量差は、遺伝子工学的に処理されたCH1負荷CHOsを表すはずであ る。したがって、HCN1-とHCN5-付加CHOsの分子サイズはそれぞれ、およそ3,400 と4,900ダルトンであると算出された。平均単糖残基の分子量が240であるとして
、我々は、HCN5-付加CHOには、HCN1部位に付着しているものよりも3つから4つさ
らに多くの単糖残基が含まれていたと推定した。これは遺伝子工学的に処理され
たCHOsの詳細な構造分析により確認された。
【００５７】 実施例3. HCN1とHCN5部位に関連するCHOsの構造決定 糖タンパク質から複合オリゴ糖を放出し、分離し、定量化し、配列決定すること
を含め、FACEを使用して、HCN1-とHCN5-付加CHOsの構造が決定された。N-結合オ
リゴ糖は、PNGアーゼF加水分解によりhLL2HCN1又はhLL2HCN5から放出され、精製
され、またその後、遊離還元末端で蛍光団8-アミノナフタリン-1,3,6-三スルホ ン酸（ANTS）で標識化された。ANTSの1つの分子が、オリゴ糖の1つの分子に付着
するため、異なるCHO種の相対量を高濃度ポリアクリルアミドゲルの中で分画後 正確に測定することができる。これについては、Quら、Glycoviol. 7(6)：803-0
9(1997)を参照されたい。
【００５８】 オリゴ糖の異種集団がhLL2HCN1とhLL2HCN5のF(ab')2断片から放出された。HCN5 オリゴ糖のプロフィールはHCN1のそれとは非常に異なる。例えば、N1-bは最も豊
富な種であり、HCN1部位由来の全標識化オリゴ糖の55％を数えたが、構造的には
N1-bと同じであったN5-b1は標識化HCN5オリゴ糖の20％未満を数えるのみであっ た。
【００５９】 HCN1-とHCN5-付加CHOsの間の構造的な類似と差異を調べ、また比較するために、
我々は個々のANTS-標識化された種を配列決定し、位相幾何学的構造を解明した 。配列決定された全HCN1-とHCN5-CHO種は、コア-フコシル化され、複合タイプで
あり、すべての分岐が完全に伸長され、GalとGlcNAc残基を含んでいるのが発見 された。これは、部位（HCN1とHCN5）は抗体上の曝露位置にあるはずであるとい
う点では、我々が目標としているものに合致している。
【００６０】 HCN1とHCN5部位の両方がグリコシル化に効率的に利用される。HCN1上のCHOsは独
占的に二分岐（100％）であり、HCN5上のCHOは大半が三分岐(60％)である。有意
に、HCN1-とHCN2-CHOsの60と90％にものぼるものがそれぞれシアル酸化されたも
のであった。シアル酸化されたそれらのうち、Sia残基は二分岐かないしは三分 岐構造かのいずれかのすべての外部分岐で同定することができる。したがって、
これらの遺伝子工学的に処理されたCHOsは抗体景色化の豊富な潜在的部位を提供
する。付加的には、すべてのHCN1-とHCN5-CHO種には五糖コアに付着したフコー ス残基が含まれるという事実から、遺伝子工学的に処理されたCHOsの中に生合成
的にN-レブリノイルフコース（FucLev）を組み込むことにより、ケトンハンドル
をIgGの表面上に部位特異的に導入することができることが示される。
【００６１】 実施例4. 複数のグリコシル化部位を運ぶ抗体の生成 Leungら、J.Immunol. 154：5919(1995)に説明されているPCR方法を使用して、V κ-N（NVT）グリコシル化部位は、公知のDNA配列により、抗体のVκ-ドメインに
導入される。Sculptor IVMシステム（Amersham社製、イリノイ州アーリントンハ
イツ市）を使用して、部位指示された突然変異誘発により単一CH1ドメインの中 にHCN1（NSS）とHCN5(NGT)部位の両方を遺伝子工学的に処理して入れられる。手
短に言うと、ヒトIgG1［CH1イントロン-ヒンジ-イントロン-CH2-イントロン-CH3
］をコードするゲノムDNAのセグメントは、重鎖発現ベクターhLL2pdHLからスプ ライシングされた。これについては、Losmanら、Cancer Supp.(1997)印刷中を参
照されたい。酵素対HindIII/Eaglを使用。2 kb断片はその後pBlueScript SKベク
ター（Strategene社製、カリフォルニア州ラジョラ市）の対応するクローニング
部位の中に結合された。オリゴヌクレオチドHCN1（5'-GTG TCG TGG AAC TCA AGC
GCT CTG ACC AGC GGC-3'）は、CH1ドメインにG164S（Kabatの番号付けにより番
号が付けられた）置換を導入するのに使用される。成功した突然変異はDNA配列 決定により確認される。鋳型としてCH1にHCN1突然変異を含む重鎖断片を使用し て、第2の突然変異が、オリゴヌクレオチドHCN5（5'-G CCC TCC AGC AGC AAC GG
T ACC CAG ACC TAC ATC TGC-3'）をL198N置換に使用して導入される。所定位置 にHCN1とHCN5部位の両方が存在するかどうかはDNA配列決定により確認される。 突然変異を起こしたヒトIgG1重鎖ゲノム配列を含むHindIII/EagI断片は、hLL2pd
HL2の対応する位置に結合させて戻される。結果的に生じるベクターはhLL2pdHL2
（HCN1/5）と称される。
【００６２】 実施例5. 景色化グリコシル化抗体 発現ベクターhLL2pdHL2(HCN1/5)は、標準的な手順を使用してSP2/0の中にトラン
スフェクションされる。これについては、例えば、Leungら、Int. J. Cancer 60
：534 (1995) を参照されたい。トランスフェクションされた抗体を産生するク ローンはELISA測定法によって同定される。これらのクローンによる抗体産生の レベルは培養培地でのメソトレキセートの増加濃度により増幅することによって
促進される。これについては、Leungら、Tumor Target. 2：184（96）（1996） ；Losmanら、Tumor Target. 2：155(41)(1996)を参照されたい。
【００６３】 高いレベルの抗体を発現する安定したクローンが、ManLevの約5mMにより補足さ れた培養培地で増殖される。結果的には、生合成経路によりグリコシル化部位に
反応性ケトン基を形成する。
【００６４】 実施例6． キレート剤に対する景色化抗体の共役 グリコシル化突然変異体抗体であるhLL2HCN1とhLL2HCN5は、親抗体の結合親和性
と比較して、ELISA測定法ではWNに対する同等の結合親和性を示した。CHO共役に
対して特異的な温和な化学的条件下で、DTPAの平均1.6と2.97の分子がそれぞれ 、hLL2HCN1とhLL2HCN5の各F(ab')2断片に組み込まれた。両方の共役は111In組込
みに対して高い効率を示した（hLL2HCN1に対して92％、hLL2HCN5に対して91％）
。グリコシル化突然変異体断片のDTPA共役前後で免疫反応性における有意な変化
は観察されなかった。HCN5-付加CHOは、HCN5部位に組み込まれたDTPA分子のほぼ
2倍であったHCN1付加CHOに比較した場合、キレート共役に関してはさらにアクセ
ス可能であるようにみえた。これは、HCN5部位に付着したCHOsがHCN1部位のCHOs
よりも大きかったという発見と一致する。
【００６５】
【表３】
【００６６】 実施例7．大きな薬剤分子に対する景色化抗体の共役 景色化ケトン基により、大きな薬剤複合体であるDOX-デキストランの抗体への部
位特異的付着効果もまた研究された。DOX-デキストラン複合体は、18 kDaアミノ
-デキストラン高分子上に平均10 DOX分子を化学的に組込むことにより生成され た。
【００６７】 抗体結合部位にその位置が物理的に近位であることで、除外又は修飾の結果、そ
の免疫反応性を変えてしまう可能性がある大半のV領域関連CHOsとは対照的に、 コンピュータモデリング研究では、マウスのLL2のVκドメインの自然発生CHOを 抗体結合部位から遠位に位置決めしている。これは、そのVκ-付加CHOが適度に 修飾され、DTPAなどの小さなキレートと共役されたときには、LL2の抗原結合親 和性は強化されなかったという事実と一致する。しかし、DOX用のキャリアとし てアミノ-デキストランを使用してLL2 のF(ab')2当たりの 5.1 DOX分子の組込み
率が細胞結合とELISA測定法により評価され、免疫反応性の60％に近い減少とい う結果になり、いわゆる遠位のCHOsであっても大きな薬剤複合体との共役のため
の抗体結合部位に近すぎることが明らかになった。
【００６８】 hLL2HCN1とhLL2HCN5の遺伝子工学的に処理されたCHOsは、抗体結合部位から離れ
ているという利点を有しており、また重要なことだが、V領域からは分離してい る球状構造（CH1ドメイン）の中にある。したがって、これらCHOsは、大きな組 成物に共役される場合には、抗体結合部位にはより少ししか干渉しておらず、ま
たそのため、免疫反応性における減少が少ないことを示している。同じ条件下で
hLL2HCN1のF(ab')2に対するDOX-デキストランの共役は、6.8のDOX-組込み率とい
う結果を生じているが、これに結合親和性における比較的に少ない有害な効果（
30%減少）を伴う。DOX分子の同様の数（7.1）がhLL2HCN5のF(ab')2に対して共役
した場合、結果的には免疫複合体は95%の抗原結合親和性を保持していた。これ らの結果は遺伝子工学的に処理されたCHOsと抗体結合部位の間の空間的な関係を
示しており、またHCN1-CHOはCβ-鎖の中央セクションにつなぎ止められ、抗体結
合部位に向かって傾いており、一方、HCN5-CHOはCH1ドメインを形成するβ-バレ
ルの底部ループにある先端に位置しており、また抗体結合部位からは離れてある
角度をもって方向付けられていることを示す、コンピュータモデルの結果と一致
していた。
【００６９】
【表４】
【００７０】 実施例8. 景色化抗体又は抗体断片を含む二価ペプチド 抗体又は抗体断片への連鎖のためのグリシルヒドラジンリンカーと、金属結合リ
ガンド基を含む二価ペプチドであるIMP-155が設計された。ペプチドはまた、い くつかの親水性Dアミノ酸を含む。IMP-155といくつかの類似体は最新式Chemtech
348複数ペプチド合成装置上での標準Fmocをベースとしたペプチド合成により合
成された。精製IMP-155の分子量はMH+808であることが質量分析計（ESMS）によ り測定されたが、これは算出されていた値と同じであった。
【００７１】 予備的な共役実験では、我々は、グリシルヒドラジンリンカーとアシルヒドラジ
ドリンカーを共役と安定性について比較し、アシルヒドラジドは不安定であるこ
とが判明した。24時間室温でpH 7.3にて精製アシルヒドラジド共役を加温放置し
た後、付着したペプチドの約20〜40％が抗体から放出された。対照的に、グリシ
ルヒドラジンリンカーは、同じ貯蔵条件下での分解がほとんどなかった（＜3％ ）を示した。したがって、グリシルヒドラジンはIMP-155の合成のためにリンカ ーとして選択された。
【００７２】 IMP-155の構造は、 H2N-NH-CH2-CO-Dd-Kd-(TscGC)-Dd-Kd-NH2であり、そこではKdとDdがそれぞれD- アミノ酸D-リシンとD-アスパラギン酸を表し、またTscGCは、
【化９】 であり、 IMP-155は室温で2時間酢酸緩衝液生理食塩水の中でpH 5.3にて1：100ペプチド：
抗体のモル比で精製景色化抗体又は抗体断片に共役される。複合抗体又は抗体断
片は、非結合過剰ペプチドを除去するため、セファデックスG 50-80ゲルスピン カラムにより2度精製される。
【００７３】 実施例9. 活性のある薬剤に共役される景色化抗体に関する直接標的化 臨床上関心の対象になっている腫瘍、病原体あるいは他の部位（総称的に「標
的部位」と称せられる）に特異的な景色化抗体又は抗体断片はケトン反応基を含
む診断又は治療用薬剤などの活性のある薬剤にin vitroで共役される。結果的に
生じる共役（共役体）は患者に注射され、抗体又は抗体断片によって特異的な結
合を介して標的部位に局在する。
【００７４】 実施例10. 反応性ケトン基を運ぶ景色化抗体に関する事前標的化 標的部位に特異的な景色化抗体又は抗体断片は患者に直接注射される。抗体が
標的部位に標的化された後、また任意には、非結合抗体が、ケトン反応基を含む
除去薬剤により血液循環から除去された後、活性のある薬剤（例えば、診断又は
治療用薬剤）が投与される。この活性のある薬剤は、標的-結合-景色化抗体と反
応し、それによって活性のある薬剤を標的部位にデリバリーする。
【００７５】 本発明の方法と構成に対して、様々な修飾と変更を作成することができること
は当業者には明らかであろう。したがって、それらの修飾と変更が請求項記載の
発明と同等なものの範囲内で実施される場合には、本発明は本発明のその修正と
変更を包含する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/531 Ｃ１２Ｎ 5/00 // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マクブライド，ウィリアム・ジェイ アメリカ合衆国、07901 ニュー・ジャー ジー、サミット、スプリングフィールド 767、＃６ (72)発明者 クー，ツェンシン アメリカ合衆国、07059 ニュー・ジャー ジー、ウォレン、シカモア・ウェイ 15 (72)発明者 ハンセン，ハンス アメリカ合衆国、08087 ニュー・ジャー ジー、ミスティック・アイランド、ノー ス・バージー・ドライヴ 133

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗
    体を作成する方法であって、糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地にお
    いて１つ又はそれ以上のグリコシル化部位を有する抗体をコードするベクターに
    よりトランスフェクションされた細胞を発現させるステップを含む方法。
  2. 【請求項２】 糖又は糖前駆体のケトン誘導体がＮ−レブリノイルマンノー
    スアミンとＮ−レブリノイルフコースより構成されるグループから選択される請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記抗体が、ＶκドメインとＣＨ１ドメインより構成される
    グループから選択されるドメインにグリコシル化部位を有する請求項１に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 前記抗体が１つ以上のグリコシル化部位を有する請求項１に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記抗体が単鎖抗体である請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗
    原結合抗体断片を作成する方法であって、 糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において１つ又はそれ以上のグ
    リコシル化部位を有する抗体を含むベクターによりトランスフェクションされる
    細胞を発現させるステップと、 結果的に生じる抗体を抗原結合抗体断片の中に断片化して入れるステップとを
    含む方法。
  7. 【請求項７】 断片がＦ（ａｂ'）2断片である請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 そのグリコシル化部位により１つの薬剤に共役されるグリコ
    シル化抗体を含む免疫共役体を作成する方法であって、 糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において１つ又はそれ以上のグ
    リコシル化部位を有する抗体を含むベクターによりトランスフェクションされた
    細胞を発現させるステップと、 ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成
    されるグループから選択されたケトン反応基を含む薬剤と結果的に生じた抗体と
    を反応させるステップとを含む方法。
  9. 【請求項９】 前記抗体がその薬剤との反応前に精製される請求項８に記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】 前記薬剤が培養培地に直接加えられる請求項８に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記抗体が前記薬剤との反応以前にタンパク質Ａカラム上
    に固定され、また前記薬剤との反応後にそのタンパク質Ａカラムから溶離される
    請求項８に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記薬剤が、診断用薬剤、治療用薬剤、キレート剤、連結
    薬剤より構成されるグループから選択される請求項８に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記薬剤が、ペプチド、オリゴ糖、ビオチンアミドカプロ
    イルヒドラジド、診断用マーカー、薬物、毒素、画像ラジオアイソトープ、治療
    用ラジオアイソトープより構成されるグループから選択される請求項１２に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 前記薬剤が、ＤＴＰＡを有するペプチド、ＤＯＴＡを有す
    るペプチド、ＡｃＫdＤdＫd （ＴｓｃＧＣ） ＤdＫd−ＮＨ （ＣＨ2）4 ＣＨ （ＮＨ2） ＣＯＮＨ−ＮＨ2、 ＡｃＫdＤdＫd （ＴｓｄＧＣ） ＤdＫd−ＮＨ （ＣＨ2）4 Ｈ（ＮＨ2） ＣＯＮＨ−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−Ｄd −Ｋd（ＴｓｃＧＣ）−Ｄd−Ｋd−ＮＨ2より構成されるグループから選択される
    リガンド含有ペプチドであり、そこではＫdとＤdがそれぞれＤ−アミノ酸Ｄ−リ
    シンとＤ−アスパラギン酸を表し、また、ＴｓｃＧＣが次のようなリガンドであ
    り、 【化１】 また、ＴｓｄＧＣが次のようなリガンドである 【化２】 請求項８に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記薬剤がＨ2Ｎ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−Ｄd−Ｋd（Ｔｓｃ
    ＧＣ）−Ｄd−Ｋd−ＮＨ2である請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 グリコシル化部位により薬剤に共役されるグリコシル化抗
    原結合抗体断片を含む免疫共役体を作成する方法であって、 糖又は糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地において１つ又はそれ以上のグ
    リコシル化部位を有する抗体を含むベクターによりトランスフェクションされた
    細胞を発現させるステップと、 抗原結合抗体断片の中に結果的に生じる抗体を断片化して入れるステップと、 ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドラキシルアミン、チオセミカルバジドより構成
    されるグループから選択されるケトン反応基を含む薬剤と前記抗体断片とを反応
    させるステップとを含む方法。
  17. 【請求項１７】 前記断片がＦ（ａｂ'）2断片である請求項１６に記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】 前記薬剤が、診断用薬剤、治療用薬剤、キレート剤、連結
    薬剤より構成されるグループから選択される請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化
    抗体又は抗原結合抗体断片。
  20. 【請求項２０】 前記抗体又は抗体断片がＶκドメインとＣＨ１ドメインよ
    り構成されるグループから選択されるドメインでグリコシル化されることを特徴
    する請求項１９に記載のグリコシル化抗体又は抗原結合抗体断片。
  21. 【請求項２１】 前記抗体又は抗体断片が１つ以上のグリコシル化部位を有
    し、その各グリコシル化部位が反応性ケトン基を有する請求項１９に記載のグリ
    コシル化抗体又は抗原結合抗体断片。
  22. 【請求項２２】 グリコシル化部位により薬剤に共役されるグリコシル化抗
    体又は抗原結合抗体断片を含む免疫共役体。
  23. 【請求項２３】 前記グリコシル化部位がＶκドメインとＣＨ１より構成さ
    れるグループから選択されるドメインの中にある請求項２２に記載の免疫共役体
    。
  24. 【請求項２４】 前記抗体が１つ以上のグリコシル化部位を有し、その各グ
    リコシル化部位が薬剤に共役される請求項２２に記載の免疫共役体。
  25. 【請求項２５】 前記薬剤が、診断用薬剤、治療用薬剤、キレート剤、連結
    薬剤より構成されるグループから選択される請求項２２に記載の免疫共役体。
  26. 【請求項２６】 前記薬剤が、ペプチド、オリゴ糖、ビオチンアミドカプロ
    イルヒドラジド、診断用マーカー、薬物、毒素、画像ラジオアイソトープ、治療
    用ラジオアイソトープより構成されるグループから選択される請求項２５に記載
    の免疫共役体。
  27. 【請求項２７】 前記薬剤が、ＤＴＰＡを有するペプチド、ＤＯＴＡを有す
    るペプチド、ＡｃＫdＤdＫd（ＴｓｃＧＣ）ＤdＫd−ＮＨ（ＣＨ2）4ＣＨ（ＮＨ2 ）ＣＯＮＨ−ＮＨ2、ＡｃＫdＤdＫd（ＴｓｄＧＣ）ＤdＫd−ＮＨ（ＣＨ2）4Ｈ（ ＮＨ2）ＣＯＮＨ−ＮＨ2より構成されるグループから選択されるリガンド含有ペ
    プチドであり、そこではＫdとＤdはそれぞれＤ−アミノ酸Ｄ−リシンとＤ−アス
    パラギン酸を表しており、またそこではＴｓｃＧＣは次のようなリガンドであり
    、 【化３】 そして、ＴｓｄＧＣは次のようなリガンドである 【化４】 請求項２５に記載の免疫共役体。
  28. 【請求項２８】 前記薬剤がＨ2Ｎ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−Ｄd−Ｋd−（Ｔｓ
    ｃＧＣ）−Ｄd−Ｋd−ＮＨ2である請求項２７に記載の免疫共役体。
  29. 【請求項２９】 前記薬剤が、診断用又は治療用ラジオアイソトープに対し
    てキレート化されるキレート剤である請求項２２に記載の免疫共役体。
  30. 【請求項３０】 グリコシル化部位により活性薬剤に共役されるグリコシル
    化抗体又は抗原結合抗体断片より構成される免疫共役体を投与するステップを含
    むｉｎ ｖｉｖｏでの標的部位を標的として活性薬剤を向ける方法。
  31. 【請求項３１】 前記活性薬剤が診断用及び治療用薬剤より構成されるグル
    ープから選択される請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記抗体又は抗体断片が複数のグリコシル化部位を有し、
    その各グリコシル化部位が活性薬剤に共役される請求項３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 ｉｎ ｖｉｖｏでの標的部位を標的として活性薬剤を向け
    る方法であって、 グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するグリコシル化抗体又は抗原結合抗体
    断片を投与し、また前記抗体又は抗体断片が標的部位に局在することを可能にす
    るステップと、 任意には、血液循環から非局在化抗体又は抗体断片を除去するために除去薬剤
    を投与するステップと、 ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオセミカルバジドより構成
    されるグループから選択されるケトン反応基を含む活性薬剤を投与し、それによ
    って前記活性薬剤が事前標的化抗体又は抗体断片との共役を介して標的部位に局
    在するステップとを含む方法。
  34. 【請求項３４】 前記活性薬剤が、診断用及び治療用薬剤より構成されるグ
    ループから選択される請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記除去薬剤が投与される請求項３３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記除去薬剤が抗イディオタイプの除去薬剤である請求項
    ３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記抗体又は抗体断片が１つ以上のグリコシル化部位を有
    することを特徴とし、また、１つ以上の活性薬剤の一部分が前記事前標的化抗体
    又は抗体断片に共役される請求項３３に記載の方法。
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