JP2001522231A - 多発性内分泌腺腫瘍１型と関連する遺伝子であるｍｅｎ１、メニンポリペプチド、およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、多発性内分泌腺腫瘍１型に関連する新規な腫瘍サプレッサー遺伝子の発見に関する。この遺伝子はMEN1と称されており、そしてこの遺伝子産物はメニンである。このタンパク質の非存在および対応する遺伝子に関連する変異は、多発性内分泌腺腫瘍１型に罹患している個体において同定されている。多発性内分泌腺腫瘍１型についてのこのマーカーの同定は、診断用の用途を有し、ならびに遺伝子治療のためである。

Description

【発明の詳細な説明】 多発性内分泌腺腫瘍１型と関連する遺伝子であるMEN1、メニンポリペプチド、 およびその使用 発明の分野 本発明は多発性内分泌腺腫瘍１型と関連する新規腫瘍抑制遺伝子の発見に関す る。この遺伝子はMEN1と名付けられ、そして遺伝子産物はメニンである。そのタ ンパク質の非存在、対応する遺伝子における、改変、および／または関連する変 異のいずれかによる、機能的なメニンポリペプチドの欠損が、家族性多発性内分 泌腺腫瘍１型（FMEN1）を有し、かつ多発性内分泌腺腫瘍１型に罹患している個 体において同定されている。多発性内分泌腺腫瘍１型に対するマーカーとしての MEN1の同定は、ガンおよび内分泌腺疾患における診断的使用、ならびに遺伝子治 療に対する適用を有する。 発明の背景 家族性多発性内分泌腺腫瘍１型（FMEN1）は、副甲状腺組織、胃腸内分泌腺組 織（例えば、ガストリノーマ、内分泌腺十二指腸の腫瘍）、腸膵臓内分泌腺組織 、下垂体前葉、および散発的に他の部位での高頻度の腫瘍の発生によって特徴付 けられる常染色体優性家族性ガン症候群である。もともと、Knudsonによって関 連付けられた網膜芽腫についての仮説（Knudson（1971）Proc.Natl.Acad.Sci.U. S.A.68:820を参照のこと）と一致して、家族性ガン症候群の原因である遺伝子の ほとんどが、腫瘍抑制型のものである。このような状況では、罹患した個体は、 罹患した親から原因遺伝子の１つの変化型コピー（これらはヘテロ接合体である ）を遺伝しているが、腫瘍は身体事象の場合に残りの機能的コピー（「野生型対 立遺伝子」）を失っている（非機能的ホモ接合体になる）。生殖細胞系のホモ接 合性は致死性である。従って、症候群の遺伝パターンは優性であるが、腫瘍形成 の機構は劣性である。 このようなガン症候群の原因遺伝子の発見は、腫瘍形成機構への新規の観点を 提供し、正確な早期診断を容易にし、そしてスクリーニングを介してガンになり やすい個体を同定する。MEN1の場合、症候群の古典的な特徴のいずれかひとつを 現す罹患した家系内の患者は、他の関連する腫瘍を発症する危険がある。標準的 な医療行為に従って、罹患した個体と罹患していない近親者の両方を定期的にス クリーニングことは必須だと考えられる。標準的な実施において、少なくとも年 ２回行われること、そして、例えば、消化性潰瘍疾患、下痢、腎石症、低血糖症 、および下垂体機能低下症を示唆する症状歴の再調査；末端肥大症および皮下脂 肪肺の特徴についての身体検査；ならびに血清Ca、リン酸（PO４）、ガストリン およびプロラクチンの測定、が含まれることが推奨される。臨床上示唆された場 合、さらなる実験室での試験、トルコ鞍のCTまたはMRI、および他の診断的操作 もまた、行われるべきである。本発明以前には、タンパク質、および遺伝子に基 づいた診断試験は利用可能でなかった。 同じ腫瘍抑制遺伝子が種々の新生物の散発的な症例において役割を担う（野生 型機能的対立遺伝子に対してホモ接合性に産まれた、個体における両方の対立遺 伝子の体細胞変異による）ことが頻繁に見出される場合、罹患家系を越えてこの ような腫瘍抑制遺伝子の発見の重要性が広がる。これらの非遺伝性腫瘍には代表 的には内分泌腺腫瘍がある。非遺伝的変異の同定は腫瘍の起源およびその予後に ついての情報を与え得る。さらに遺伝子の発見から生じる処置は、このような腫 瘍の回復および／または予防を導く。 従って、MEN1およびFMEN1に関連する遺伝子の同定；MEN1を有するこれらの個 体の同定を可能にするような遺伝子の特徴付けの結果として、救命用診断試験、 治療用処置養生法（regimen）、ならびにFMEN1を有する個体および非遺伝性腫瘍 を生じる両対立遺伝子に関連する体細胞変異を有する個体の予後評価を提供する 強い必要性が存在する。本発明はこれらの必要性および他の必要性を満たす。 図面の簡単な説明 図１は、白血球cDNAクローンに由来するような、明らかに完全長のMEN1 cDNA のヌクレオチド配列（配列番号１）；および対応する推定アミノ酸配列（配列番 号２）を示す。エキソンの境界を、10個の全エキソンを含む9.2kbのセグメント の完全ゲノム配列（配列番号３）との比較によって同定されるように示す。第１ のエキソンは、全く翻訳されない。優れたKozakコンセンサス配列と関連してお り、そしてこの上流にはフレーム内に他のATGコドンが存在しないので、ヌクレ オチド111のATGは開始コドンであると推定される（フレーム内での終止はヌクレ オチド20に生じる）。終止コドン（TGA）および提唱されるポリアデニル化シグ ナル配列（AATACA）は囲いを付けている。ポリアデニル化シグナルは通常のAATA AAからの変異型であり、そして通常よりもアデノシン列に近接して配置されてい るようである；しかし、これらの最初の８個はまた、ゲノムDNA内に表される。 図２は、フレームシフト変異およびナンセンス変異の検出を示す。（Ａ）ジデ オキシフィンガープリント法（ddF）を用いて、可能性のある変異を示すパター ン差（矢印）を示す、MEN1患者および正常コントロールにおけるエキソン２の分 析。（Ｂ）異なる患者由来エキソン９における異常なddFパターン。（Ｃ）（Ａ ）に示されたddFパターンの患者に由来する、クローン化されたエキソン２のPCR 産物の配列決定による、単一のヌクレオチド欠失の同定。示された配列は、アン チセンス鎖のものである；変異は512delCである。この患者および２人の罹患し た近親者由来のPCR増幅されたエキソン２における新しいAfIII部位の存在を検出 することによって、フレームシフト変異が確認された（Ｄ）。（Ｅ）パネル（Ｂ ）由来のエキソン９のPCR産物の、直接配列決定。これによってヘテロ接合性の ＣからＴへの（Ｃ→Ｔ）置換の存在を示す。再び、配列はアンチセンス鎖である ；変異は終止コドンを生成する：TGGから、TAGまたはW436X（TGG→TAGまたはW43 6X）。 図３は、15人の無関係なMEN1患者において同定された変異の概要を示す。５つ のフレームシフト変異の位置は、エキソンに番号を付けたMEN1遺伝子の概略図の 上に示す；斜線を付した領域は翻訳されない。１つのアミノ酸の２つのインフレ ーム欠失、３つのナンセンス変異、および１つのミスセンス変異（W436R）が遺 伝子概略図の下に示される。416delCおよび512delCの変異はそれぞれ２回起きた 。変異の略語を標準命名法に従う（例えば、Beaudet（1993）によって記載され る、「A suggested nomenclature for designating mutations」、Hum Mutat.2( 4):245-248）。 図４は、無関係なMEN1患者において同定された変異の概要である。略語を標準 命名法に従う（Beaudet（1993）前述）。 発明の要旨 本発明は、多発性内分泌腺腫瘍１型の存在に関連する、単離された核酸または 組換え核酸を提供する。ここで上記の核酸は、約67.5kDaの計算上の分子量を有 し；および（a）配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して惹起さ れる抗体に特異的に結合する；または（b）配列番号２に示される配列を有する タンパク質に対して少なくとも60％アミノ酸配列同一性を有する、として規定さ れるタンパク質をコードする。種々の実施態様において、単離された核酸または 組換え核酸は、非コード配列をさらに含み得；およびこの非コード配列はイント ロンを含み得る。１つの実施態様において、単離された核酸または組換え核酸は 、配列番号３に示される配列を有する。 本発明はまた、単離された核酸または組換え核酸を提供し、これは、配列番号 ２に示される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも80％アミノ酸配列同 一性を有するタンパク質をコードする。別の実施態様において、単離された核酸 または組換え核酸は、配列番号２に示される配列を有するメニン（menin）タン パク質をコードする；あるいは単離された核酸または組換え核酸は、配列番号１ に示される配列を有する。 本発明はさらに、約67.5kDaの計算上の分子量を有し；および（a）配列番号２ に示される配列を有するタンパク質に対して惹起される抗体に特異的に結合する ；または（b）配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して、少なく とも60％アミノ酸配列同一性を有する、として規定される、単離されたタンパク 質または組換えタンパク質を提供する。種々の実施態様において、単離されたタ ンパク質または組換えタンパク質は、配列番号２に示される配列を有するタンパ ク質に対して、少なくとも80％アミノ酸配列同一性を有する；あるいは、単離さ れたタンパク質または組換えタンパク質は、配列番号２に示される配列を有する 。 本発明はさらに、免疫学的に反応性の条件下で特異的に免疫反応性の、配列番 号２を含むタンパク質に対する抗体；および免疫学的に反応性の条件下で特異的 に免疫反応性の、タンパク質（ここでこのタンパク質は、約67.5kDaの計算上の 分子量を有し；および（a）配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対 して惹起される抗体に特異的に結合する；または（b）配列番号２に示される配 列を有するタンパク質に対して少なくとも60％アミノ酸配列同一性を有する、と して規定されるタンパク質をコードする核酸によってコードされる）に対する抗 体を提供する。 本発明はさらに、ヒト細胞および組織におけるメニンの存在を検出する方法を 提供し、この方法は以下の工程を包含する：（i）生物学的サンプルを、メニン について試験されるヒトから単離する工程；（ii）この生物学的サンプルを、メ ニン特異的試薬と接触させる工程；および（iii）このサンプルと選択的に結合 するメニン特異的試薬のレベルを検出する工程。この方法は、種々の異なる目的 が意図され、この目的には、MEN1の変異または野生型MEN1のヘテロ接合性の欠失 に由来する、（多発性内分泌腺腫瘍１型（MEN1）のような）任意の細胞または組 織において惹起する散発性（非遺伝性）癌を含む。この方法としては、核酸ハイ ブリダイゼーション技術、核酸の増幅技術、およびイムノアッセイが挙げられる 。 種々の実施態様において、ヒト細胞および組織におけるメニンの存在を検出す る方法において、メニン特異的試薬は、以下を含む群から選択される：メニン特 異的抗体、MEN1増幅プライマー、およびMEN1に選択的に結合する核酸プローブ。 サンプルが単離されるヒトは、多発性内分泌腺腫瘍１型（MEN1）に由来して危険 であると疑われる。この方法において、接触工程は、MEN１遺伝子の領域を増幅 するMEN1特異的PCRプライマー対を使用し得、ここで変異は、多発性内分泌腺腫 瘍１型（MEN1）に関連している。 本発明はまた、試験サンプルにおいて、ヒトメニンを本質的にコードするヌク レオチド配列における変異の存在または非存在を検出するための方法を提供し、 この方法は、以下を包含する：MEN1対立遺伝子を欠如すると疑われる上記の試験 サンプルを接触させるか、あるいはヒトメニンの変異形態をコードする遺伝子を 、野生型と失われたMEN1対立遺伝子または変異形態との間を区別するのにコンピ テントな配列を有する第１オリゴヌクレオチドと接触させる工程；およびb）遺 伝 子と第１オリゴヌクレオチド配列との間の二重鎖の形成を検出する工程。このよ うなアッセイは、第１オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション条件下で 、野生型MEN1遺伝子に結合し得ないものを含み、ここでこの第１オリゴヌクレオ チドは、MEN1の変異体配列に結合する。 本発明はまた、試験サンプルにおいて、メニンをコードする野生型対立遺伝子 に対応するヌクレオチド配列における変異の存在または非存在を検出するための キットを提供し、このキットは以下を含む：a）第１オリゴヌクレオチド配列を 保持し、それによってこの第１ヌクレオチド配列が、野生型遺伝子と変異体形態 との間を識別し得る、容器；およびb）遺伝子と第１オリゴヌクレオチド配列と の間の二重鎖の形成を検出するための試薬を保持する容器。このキットはさらに 、MEN1を含むヒトゲノムDNA配列に特異的に結合する増幅プライマー対を含む。 本発明はさらに、多発性内分泌腺腫瘍１型について危険なヒトにおけるメニン の存在または非存在を検出するためのキットを提供し、このキットは野生型メニ ンまたは変異体メニンに特異的な少なくとも１つの抗体を含む第１容器、および 第１容器中のメニン特異的抗体に特異的に結合する抗原を含む第２容器を含む。 抗体は、野生型メニンタンパク質または変異したメニンタンパク質の存在を検出 し得る。イムノアッセイを用いて任意のメニンポリペプチド異常性を検出するた めのキットはまた、本発明において、上記に引用される種々の目的の全てのため に含まれる。 本発明はまた、メニンタンパク質またはその部分配列をコードする異種核酸を 含む、トランスフェクト細胞を提供する。１つの実施態様において、本発明は、 外因性核酸配列が導入されているトランスフェクト細胞を提供し、この外因性核 酸は、ストリンジェントな条件下で、以下を有する核酸に特異的にハイブリダイ ズする：配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列；または約67.5kDa の計算上の分子量を有する；および（a）配列番号２に示される配列を有するタ ンパク質に対して惹起される抗体に特異的に結合する；または（b）配列番号２ に示される配列を有するタンパク質に対して少なくとも60％アミノ酸配列同一性 を有するとして規定されるタンパク質をコードする核酸；そしてこの細胞は、メ ニンタンパク質のような外因性核酸を発現する。本発明のトランスフェクト細胞 は、配列番号１または配列番号３に示される核酸を含み得る。トランスフェクト 細胞は、ヒト細胞であり得る。 本発明は、外因性核酸配列が導入されている生物を提供し、この外因性核酸は 、ストリンジェントな条件下で、以下を有する核酸に特異的にハイブリダイズす る：配列番号１に示される配列；あるいは約67.5kDaの計算上の分子量を有する ；および（a）配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して惹起され る抗体に特異的に結合する；または（b）配列番号２に示される配列を有するタ ンパク質に対して少なくとも60％アミノ酸配列同一性を有するとして規定される タンパク質をコードする核酸；そしてこの生物は、メニンタンパク質のような外 因性核酸を発現する。１つの実施態様において、この生物は、配列番号１または 配列番号３に示される外因性核酸を含む。 本発明はまた、メニンポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットを提 供する。ここでこの核酸は、プロモーターに作動可能に連結され、そしてメニン ポリペプチドをコードする核酸を含む。１つの実施態様において、この発現カセ ットはさらに、発現ベクターを含む。 最後に、本発明はまた、MEN1遺伝子およびそのタンパク質産物であるメニンに ついての探索用途を含む。従って、メニンを産生するかまたは産生すると疑われ る細胞の検出のための遺伝子または遺伝子産物のいずれかの検出はまた、非メニ ン産生細胞(例えば、細菌細胞から動物またはヒト細胞)からメニン産生細胞を単 純に同定する工程を含む任意の使用のために意図される。 本発明はまた、動物および細胞におけるメニンを研究するためのアンチセンス 方法の使用を包含する。代表的には、任意の時点で、遺伝子が同定され、動物中 の遺伝子をノックアウトすることによって、および動物表現型の効果を観察する ことによって研究され得る。ノックアウトは、相同組換え、アンチセンス、また はマウスのような生物の邪魔する胎児性幹細胞に特異的に指向されるリボザイム によって挿入されるトランスポゾンによって達成され得る。リボザイムは、メニ ンをコードするmRNAを切断するように改変された、任意の種々の型のリボザイム を含み得る。例として、ヘアピンおよびハンマーヘッドリボザイムが挙げられる 。最後に、メニンmRNAに選択的に結合するアンチセンス分子は、メニン遺伝子の 部 分配列に作動可能に連結された発現カセットを介して発現され、そして一般的に 、アンチセンス分子が標的にするmRNAに対して反対方向の20から50塩基長配列を 含む。 定義 「増幅」プライマーとは、選択核酸配列の増幅の基礎として作用し得る、天然 のまたはアナログのヌクレオチドのいずれかを含むオリゴヌクレオチドである。 それらは、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびリガーゼ連鎖反応オリゴヌク レオチドを含む。 「抗体」とは、イムノグロブリン遺伝子または複数のイムノグロブリン遺伝子 によって実質的にコードされるポリペプチド、または分析物（抗原）に特異的に 結合し、そして認識するイムノグロブリンのフラグメントをいう。認識されるイ ムノグロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、 ならびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλの いずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはε（これらは、次 いで、イムノグロブリンクラス、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを 規定する）として分類される。例示的なイムノグロブリン（抗体）構造単位は、 テトラマーを含む。各テトラマーは、２つの同一の対のポリペプチド鎖からなり 、各対は１つの「軽」鎖（約25kD）および１つの「重」鎖（約50〜70kD）を有す る。各鎖のＮ端は、抗原認識を主に担う、約100〜110またはそれを超えるアミノ 酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（V_L）および可変重鎖（V_H）とは、それ ぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。抗体は、例えば、インタクトなイムノグ ロブリン、または種々のペプチダーゼでの消化によって生成される、多数の充分 に特徴付けられたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、 抗体をヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下流を消化して、それ自身がジス ルフィド結合によってV_H-C_H1に結合した軽鎖である、FabのダイマーであるF(ab) '₂を生成する。F(ab)'₂はヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊する緩和 な条件下で還元され得、それによってF(ab)'₂ダイマーがFab'モノマーへと変換 する。Fab'モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の部分を有するFabである（Funda mental Immunology、第三版、W.E.Paul編、Raven Press．N.Y.,1993を参照のこと。）。 種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関して規定されるが、当 業者は、このようなフラグメントが、化学的または組換えDNA方法論を利用する ことによってデノボで合成され得ることを理解する。従って、本明細書中で用い る場合、用語抗体はまた、抗体全体の改変によって得られるか、または組換えDN A方法論を用いてデノボで合成される（例えば、単鎖Fv）かのいずれかの抗体フ ラグメントを含む。 多発性内分泌腺腫症１型の状況において、「関連する」とは、MEN1遺伝子の疾 患との関係をいう。古典的な意味では、これはサプレッサー遺伝子である。しか し、変異の効果が細胞表現型に対して直接なのかまたは間接なのかは公知ではな い。従って、本発明者らは、この関係をサプレッサー効果ではなく関連として言 及する。なぜなら、（機能的）MEN1（の欠失）が直接ガンの表現型を担う、との 証明がないからである。この事実は、多発性内分泌腺腫症１型（MEN1、以下の定 義を参照のこと）自身か、またはこの疾患のおそれのある個体における多発性内 分泌腺腫症１型についての素因のいずれかを診断する際のこの遺伝子の使用を決 して減じない。この疾患のおそれがある個体は、機能性MEN1遺伝子産物を１つだ け有し（野生型MEN1についてヘテロ接合性である）、そして家族性多発性内分泌 腺腫症１型症候群を遺伝している。 「生物学的サンプル」とは、メニンコード核酸を有する任意の組織または液体 サンプルをいい、これには、メッセンジャーDNAまたはゲノムDNA、あるいはMEN1 遺伝子産物が含まれる。これは、染色体の正常の補完物を有する細胞、および少 なくとも１つの（例えば、MEN1における）発ガン性変異を有すると疑われる細胞 の両方を含む。 「野生型遺伝子と変異体形態との間を識別する能力がある（competent）」と は、当業者が、メニンをコードする野生型ヌクレオチド配列に対する塩基変化、 欠失または付加の存在または非存在を検出することを可能にするハイブリダイゼ ーションプローブまたはプライマーの配列を意味する。用語「野生型遺伝子」に は、機能性遺伝子産物をコードするすべての対立遺伝子（例えば、機能性遺伝子 産物であるメニンポリペプチドをコードするMEN1遺伝子）が含まれる。プローブ の配列は、変化、欠失または付加がされている部位を含む配列である。プライマ ーの配列は、塩基変化、欠失、または付加の周囲かまたは隣接する配列にハイブ リダイズし、そしてこの遺伝子配列をテンプレートとして使用することで、塩基 変化または付加を含むヌクレオチド配列のさらなる合成が可能になる。さらに、 プローブは、プライマーとしても作用し得る。本発明は、エキソン全体を増幅し うるPCRプライマーの設計を可能にすることを指摘することが重要である。これ を達成するために、プライマーは、イントロン配列とハイブリダイズする必要が ある。本発明は、このようなイントロン配列を提供する。「野生型遺伝子と変異 体形態との間を識別する能力がある」にはまた、免疫反応性試薬（例えば、抗体 ）が含まれ、これによって、当業者は、非機能性メニンとは異なり、野生型メニ ン（の生物学的に活性である対立遺伝子）の存在または非存在を検出することが 可能である。 用語「発現カセット」とは、任意の細胞（原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫 、または哺乳動物の細胞を含む）において、インビトロまたはインビボ、構成性 または誘導性の、本発明の核酸配列を発現する目的のための任意の組換え発現系 をいう。この用語には、直鎖状または環状の発現系が含まれる。この用語には、 発現カセット（例えば、エピソーム性のままであるか、または宿主細胞ゲノムに 組み込まれるベクター）が含まれる。発現カセットは、自己複製する能力を有し 得るか、またはそうではない（すなわち、細胞において一過的発現のみを駆動す る）。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最小限のエレメントのみを含む 組換え発現カセットが含まれる。 句「ゲノム（性）」とは、エキソン領域およびイントロン領域の両方、ならび に非翻訳配列（これらは、MEN1遺伝子のエキソンIの5'側およびエキソン10の3' 側である）を含むDNAをいう。イントロン1は、エキソンIとエキソンIIとの間に 存在し，イントロン2はエキソンIIとエキソンIIIとの間に存在し、イントロン3 はエキソンIIIとエキソンIVとの間に存在し，そしてイントロン4は，エキソンIV とエキソンVとの間に存在し、以下同様である。用語「ゲノム性」とはまた、任 意のシス作用性転写調節エレメント（例えば、プロモーターおよびエンハンサー ）をいい、これらは、MEN1の発現を調節する。 用語「単離された」とは、分子または組成物（例えば、ポリペプチドまたは核 酸のように）に言及する場合、その分子または組成物が少なくとも１つの他の化 合物（例えば、タンパク質、他の核酸（例えば、RNA）またはインビボまたは天 然に存在する状態でそれに付随する他の夾雑物）から分離されていることを意味 する。したがって、ポリペプチドまたは核酸は、それが天然に付随する任意の他 の成分（例えば、細胞抽出物の場合、細胞膜）から単離された場合、単離されて いるとみなされる。しかし、「単離された」組成物はまた、実質的に純粋で（実 質的に他の細胞成分を含まなく）あり得る。「単離された」組成物は、核酸また はタンパク質が、天然の状態でそれに付随する他の細胞成分を含まない場合であ り得る。それは、均質の状態にあり得るが、それはまた、乾燥物または水溶液の いずれかにおいて存在し得る。純粋度および均質度は、代表的に、ポリヌクレオ チドアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分 析化学技術を用いて決定され得る。１つの実施態様において、調製物に存在する 主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離されたMEN1遺 伝子は、遺伝子に隣接し、そしてMEN1遺伝子産物以外のタンパク質をコードする オープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製されている」と は、電気泳動ゲルにおいて本質的に一つのバンドを生じる核酸またはタンパク質 をいう。特に、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも85％純粋であり、よ り好ましくは少なくとも95％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも99％ 純粋である。 「MEN1]とは、ポリペプチドであるメニンをコードする遺伝子をいう。ヒト集団 が、この遺伝子（機能性で生物学的に活性なメニンをコードする野生型対立遺伝 子）において正常の程度の分散(variacne)を有するとの予測がある。例示的な野 生型MEN1対立遺伝子のゲノム配列を、配列番号１のように対応する転写配列（cD NA）とともに配列番号３に示す。MRN1において、非機能性MEN1対立遺伝子を産生 する（生物学的に活性なメニンポリペプチドを産生し得ない）変異の存在は、ME N1の存在である家族性ガン症候群と関連している。 「メニン」とは、MEN1遺伝子（対立遺伝子）によってコードされるタンパク質 をいう。その全長、野生型形態において、それは、約67.5キロダルトン(kd) （これは、その計算がMEN1遺伝子核酸配列の翻訳に基づいているその理論上の分 子量である）である。用語「メニン」には、MEN1遺伝子産物に対して惹起された 抗体に選択的に結合するポリペプチド（例えば、配列番号２）または配列番号の エキソンに選択的にハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド が含まれる。「野生型メニン」には、腫瘍原性表現型を反転し得るメニンの対立 遺伝子変異体が含まれる。 「メニン特異的試薬」とは、メニンに結合する合成物（例えば、抗体）または MEN1に結合する合成物（例えば、核酸プローブおよび／または増幅プライマー） のいずれかである。 「多発性内分泌腺腫症１型」は、時に、「MEN1」または「MEN1」または「家族 性多発性内分泌腺腫症１型」または「FMEN1」として言及され、種々の内分泌お よび非内分泌腫瘍を併発する罹患した個体における家族性ガン症候群をいい、こ れらの腫瘍には、上皮小体の腫瘍、ランゲルハンス島の腫瘍（インスリノーマ） 、十二指腸内分泌細胞の腫瘍、下垂体前葉の腫瘍、前腸カルチノイド（ガストリ ノーマ）、脂肪腫（非内分泌性）、血管線維肺（非内分泌性）、甲状腺腺腫、副 腎皮質腺腫、血管筋脂肪腫（非内分泌性）、脊髄上衣腫、肺、胸腺、および胃の 神経内分泌腫瘍が含まれる。ガストリノーマを除いて、ほとんどの腫瘍は、非転 移性である。多くは、内分泌物質（例えば、ガストリン、インスリン、副甲状腺 ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、グルカゴン、または副腎皮質ホルモン ）のために、強烈な臨床的な効果を有する。MEN-1症候群の臨床的特徴は、個々 の患者における腫瘍の関与のパターンに依存する。約40％の報告症例は、上皮小 体、膵臓、および下垂体の腫瘍を有していた。上記の腫瘍および症候群複合症の 併発のほとんどは可能性がある。 「多発性内分泌腺腫」（「多発性内分泌腺腫症(Multlple Endocrine Adenomat osis)」、「MEA」、または「家族性内分泌腺腫症」とも称する）の１つの型であ る、MEN1は、いくつかの内分泌腺における腺腫過形成および悪性腫瘍形成を含む 遺伝的に異なる家族性疾患の一群である。３つの異なる症候群、MEN1、MENII、 およびMENIIIが同定されており、各々は、高度の浸透、可変性の発現性、および 有意な多面発現性を伴う常染色性の優性形質として遺伝する。本発明以前では、 遺伝子異常と種々の腫瘍の病因との間の関係は、理解されていなかった。 用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかでのデオキシリボヌ クレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。具体的に限 定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然のヌクレオ チドの公知のアナログを含む核酸を包含し、そして天然に存在するヌクレオチド と同様の様式で代謝される。他に示さない限り、特定の核酸配列はまた、保存的 に改変したその改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明 示的に示される配列を暗示的に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上 の選択された（またはすべての）コドンの第三位が混合塩基および／またはデオ キシイノシン残基と置換されている配列を生成することによって達成され得る（ 例えば、Batzerら(1991)Nucleic Acid Res．19：5081；Ohtsuka(1985)J.Biol.Ch em.260：2605-2608；およびCassol(1992)；Rossolini(1994)Mol.Cell.Probes 8 ：91-98を参照のこと）。用語核酸は、遺伝子、遺伝子によってコードされるcDN A、およびmRNAと交換可能に使用される。 「遺伝子から誘導体化された核酸」とは、その合成のために、遺伝子またはそ の部分配列が最終的にテンプレートとして作用した核酸をいう。従って、mRNA、 mRNAから逆転写されたcDNA、そのcDNAから逆転写されたRNA、そのcDNAから増幅 されたDNA、その増幅されたDNAから転写されたRNAなどはすべて、遺伝子から誘 導体化されており、そしてそのような誘導体化された産物の検出は、サンプル中 のもとの遺伝子および／もしくは遺伝子転写物の存在ならびに/または豊富度の 指標となる。 「核酸プローブ」とは、DNAまたはRNAフラグメントであり得る。DNAフラグメ ントは、例えば、プラスミドDNAの消化によるか、またはPCRの使用によって調製 され得るか、あるいはBeaucageおよびCarruthers、Tetrahedron Lett．22：1859 −1862(1981)（BeaucageおよびCarruthers）によって記載されるホスホルアミダ イト法またはMatteucci(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185(Matteucci)によるトリ エステル法のいずれかによって合成され得る。ついで、二本鎖フラグメントは、 所望の場合、化学合成した一本鎖を適切な条件下でともにアニールすること、ま たはDNAポリメラーゼを適切なプライマー配列とともに用いて相補鎖を合成す ることによって入手され得る。核酸プローブに特異的なプローブが与えられる場 合、相補鎖もまた、同定されそして包含されることが理解される。相補鎖は、標 的が二本鎖核酸である状況において、同等に良好に作用する。 句「核酸配列をコードする」とは、特定のタンパク質またはペプチドの、構造 RNA(例えば、rRNA)、tRNAまたは一次アミノ酸配列についての配列情報を含む核 酸をいう。この用語はまた、トランス作用性調節因子についての結合部位もいい 得る。この句は、特に、特定の宿主細胞におけるコドン優先に合致するように導 入され得る天然配列または複数の天然配列の縮重コドン（すなわち、単一のアミ ノ酸をコードする異なるコドン）を含む。 句「抗体に特異的（または選択的）に結合する」または「と特異的（または選 択的）に免疫反応性」とは、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、 タンパク質または他の生物学的物質（biologics）の不均質集団の存在下での、 そのタンパク質の存在の決定因子である結合反応をいう。従って、所定のイムノ アッセイ条件下で、特定の抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル 中に存在する他のタンパク質とは有意な量で結合しない。このような条件下での 抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に対する特異性について選択された 抗体を必要とし得る。例えば、野生型メニン（例えば、配列番号２にコードされ るアミノ酸配列を有するメニン）に対して惹起された抗体は、すべての野生型メ ニンタンパク質と特異的に免疫反応性であり、メニンタンパク質以外とは免疫反 応性ではない抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を入手するのに選択 され得る。抗体はまた、メニンの（MEN1対立遺伝子によってコードされる）特定 の野生型多型性改変体とのみ反応するように惹起され得る。種々のイムノアッセ イ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し 得る。例えば、固相ELISAイムノアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組 織化学は、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択す るのに日常的に使用される。HarlowおよびLane(1988)Antibodles、A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications、New York「HarlowおよびLane」を 、特異的な免疫反応性を決定するのに使用され得るイムノアッセイ形式および条 件の記載について、参照のこと。本明細書中で用いる場合、特異的反応または 選択的反応は、少なくともバックグラウンドシグナルまたはノイズの２倍である が、代表的には、これは、バックグラウンドの10〜100倍超え得る。 句「に対して特異的にハイブリダイズすること」または「に対して選択的にハ イブリダイズすること」もしくは「選択的にまたは特異的にハイブリダイズする 」とは、その配列が複合体混合物（例えば、全細胞）DNAまたはRNA中に存在する 場合、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的に核 酸分子を結合すること、二重鎖形成すること、またはハイブリダイズすることを いう。核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンおよびノーザンハイブ リダイゼーション）の状況において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーシ ョン」または「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリ ダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、そして異なる環境パラメータ ー下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引書は、Tijssen（199 3）Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridiz ation with Nucleic Acid Probes第１部第２章「overview of principles ofhyb ridization and the strategy of nucleic acid probe assays」,Elsevier，New Yorkに見い出される。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションお よび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびpHで特異的配列について熱融解点 (T_m)よりも約5℃低いように選択される。T_mは、標的配列の50%が、完全に一致す るプローブとタイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびpH下で）である 。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのT_mと等しくされ るように選択される。相補的核酸（100を超える相補的な残基を有する）のサザ ンまたはノーザンブリットにおけるフィルター上のハイブリダイゼーションのた めのストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の例は、ハイブリダイゼ ーションを一晩実施する、42℃で1mgのヘパリンを有する50％のホルマリンであ る。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は：約15分間72℃で0.15M NaClであ る。ストリンジェントな洗浄条件の例は、15分間65℃で0.2×SSC洗浄である。SS C緩衝液については、Sambrook、前出、の記載を参照のこと。しばしば、高度な ストリンジェントな洗浄は、バックグランドプローブシグナルを除くための低度 なストリンジェントな洗浄によって先行される。二重鎖（例えば、100ヌクレ オチドを超える）のための例示的な中程度のストリンジェントな洗浄は、15分間 45℃での1×SSCである。二重鎖（例えば、100ヌクレオチドを超える）のための 例示的低度にストリンジェントな洗浄は、15分間40℃での4〜6×SSCである。本 明細書中で使用される場合、特異的なハイブリダイゼーションアッセイにおいて 無関係なプローブについて観測された信号よりも２倍(またはさらに高い)のノイ ズ比に対する信号は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジ ェントな条件下でお互いでハイブリダイズしない核酸もなお、さらに、これらが コードするポリペプチドが実質的に同一である場合、実質的に同一であり得る。 これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードによって許容される最高のコドン 縮重を使用して作製される場合、生じる。 核酸配列に対して適用される場合に、そして本明細書中で使用される場合に、 用語「実質的な同一性」または「実質的な配列同一性」とはポリヌクレオチド配 列の特徴を示す。ここで、このポリヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチド 位置の比較ウィンドウにわたる参照配列、頻繁には少なくとも25〜50ヌクレオチ ド位置の比較ウィンドウにわたる参照配列と比較して、少なくとも85パーセント 配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセント配列同一性、そしてより好 ましくは少なくとも99パーセント配列同一性を有する配列を含む。ここで配列同 一性のパーセントは、ポリヌクレオチド配列（比較ウィンドウにわたる参照配列 の合計20%以下の欠失または付加を含み得る）に対して参照配列を比較すること によって計算される（以下の詳細な議論を参照のこと）。参照配列は、より大き な配列の下位集合であり得る。 メニンのようなポリペプチドに適用されるように、用語「実質的な同一性」ま たは「実質的に配列同一性」とは、２つのペプチドが、例えば、デフォルトギャ ップウェイトを使用するGAPプログラムまたはBESTFITプログラムによって（以下 の詳細な議論を参照のこと）、最適に整列される場合、少なくとも70%の配列同 一性、好ましくは少なくとも80%配列同一性、より好ましくは90%配列同一性、そ して最も好ましくは少なくとも95%またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を共 有することを意味する。「パーセントアミノ酸同一性」または「パーセントアミ ノ酸配列同一性」は、最適に整列される場合、同じアミノ酸の所定のパーセント をおおよそ有する２つのポリペプチドのアミノ酸の比較をいう。例えば、「95% アミノ酸同一性」は、最適に整列される場合、95%のアミノ酸同一性を有する２ つのポリペプチドがのアミノ酸の比較をいう。好ましくは、同一でない残基位置 は、保存的アミノ酸置換とは異なる。例えば、類似の化学特性（例えば、電荷ま たは極性）を有するアミノ酸の置換は、タンパク質の特性におそらく影響しない 。例は、アスパラギンについてはグルタミン、またはアスパラギン酸については グルタミン酸を含む。 詳細な説明 本発明は、MEN1と称する遺伝子MEN1の変異の存在が、散発性内分泌腺癌を含む 散発性癌、および多発性内分泌腺腫瘍を含む疾患の危険性のある個体に関連する という発見である。これらの変異は、タンパク質発現の欠質、機能しないタンパ ク質形態の発現、または機能形態の有意な過少発現を生じ得る。以下、本発明者 らは、MEN1遺伝子対立遺伝子を得るための方法および同定するための方法を教示 する。また、当業者がメニンの発現および特徴を検出および定量するために使用 し得る種々の便利な方法の説明を含む、MEN1遺伝子産物メニン(menin)を発現す るための方法および精製するための方法が教示される。 MEN-1を発症した個体由来のDNAの配列決定は、本発明者らが野生型MEN1対立遺 伝子および多くの変異型のMEN1の両方を同定することを可能にした。変異遺伝子 は、種々の異なるフレームシフト、ナンセンス、ミスセンス、および/またはイ ンフレーム欠損変異の結果であり得る；発症した個体から単離した変異形態のME N-1の分析は、図３および図４に要約する。 野生型で機能性のMEN1遺伝子は10個のエクソン10を含み、そして9kbにわたっ て広がる。MEN1遺伝子は、2.8kb転写物として遍在して発現されるようである。 本発明者らが名称「メニン」を提唱する、推定の610アミノ酸のタンパク質産物 は、これまでに公知のタンパク質のいずれとも明らかな類似性を示さない。 MEN1遺伝子の同定は内分泌腫瘍形成の機構への新しいウィンドウを提供し、ME N1関連癌の正確な初期診断を容易にし、そしてFMEN1症候群（すなわち、MEN1関 連腫瘍の獲得の高い危険性を有する（素因を有する）癌を有さない個人）を有す る個体の前臨床同定を提供する。MEN1 遺伝子のクローニング、分析および発現 A. 一般的な組換えDNA方法． 本発明は組換え遺伝子の分野における日常的技術に関する。本発明における使 用の一般的方法を開示している基礎的教本は、Sambrookら、Molecular Clonlng ，A Loboratory Manual，Cold Spring Harbor Publish.，Cold Spring Harbor， NY第２版．(1989)およびKriegler，Gene Transfer and Expression:A Laborator y Manual,W.H．Freeman，N.Y.，(1990)である。特に明記しない限り、すべての 酵素は、製造者の指示に従って使用される。 ヌクレオチドの大きさは、キロベース(kb)または塩基対(bp)のいずれかで提供 される。これらは、アガロースゲル電気泳動またはアクリルアミドゲル電気泳動 から誘導されるかまたは刊行されたDNA配列から誘導される見積もりである。 市販されていないオリゴヌクレオチドは、D.R．Needham Van Devanterら、Nuc leic Acids Res.，126159-6168，1984に記載されるように自動化合成機を使用し て、S.L．BeaucageおよびM.H．Caruthers，Tetrahedron Letts.，22(20):1859-1 862(1981)によって最初に記載される、固層ホスホロアミダイトトリエステル方 法に従って化学合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、J.D．Pearsonおよ びF.E.Reanier，J．Chrom．，255:137-149,1983に記載されるように、ネイティ ブのポリアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換HPLCによってである。 クローン化遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列決定は、A.M．Maxamら 、Methods in Enzymology,65：499560,(1980)の化学的分解方法を使用して確認 され得る。配列は、MaxamおよびGilbert（前出）の方法を使用して、またはR.B ．Wallaceら、Gene，16:21-26,1891の二本鎖テンプレートの配列決定のための鎖 終結方法を使用して二本鎖DNA配列へのオリゴヌクレオチドフラグメントの会合 後に確認され得る。サザンブロットハイブリダイゼーション技術は、Sourthern ら、J．Mol.Blol.,98.503,1975によって実施される。 B.メニンタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニン グ方法． 一般に、メニンをコードする核酸配列は、コピーDNA(cDNA)またはゲノムDNAを コードするように作製されているDNA配列ライブラリーからクローニングされる 。特定の配列は、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることによっ て位置決めされ得、その配列は、PCRプライマーを提供する表１から誘導され得 、そして単離されているMEN1特異的プローブを単離するための適切な領域を規定 する。あるいは、配列が発現ライブラリー中にクローン化される場合、発現され た組換えメニンは、メニンに対して作製された抗血清または精製抗体で免疫学的 に検出される。 cDNAライブラリーを作製するために、mRNAが豊富である供給源を選択すべきで ある。例えば、肝臓はメニンのmRNAに関して豊富である。次いでmRNAはcDNAへと なされ得、組換えベクター中に連結され得、そして増殖、スクリーニングおよび クローニングのために、組換え宿主中にトランスフェクトされ得る。cDNAライブ ラリーを作製するための方法およびスクリーニングするための方法は、周知であ る。Gubler，U.およびHoffman，B.J．Gene 25:263-269，1983およびSambrookを 参照のこと。 ゲノムライブラリーのために、DNAが組織から抽出され、そして約12〜20kbの フラグメントを生じるように、機械的に剪断または酵素的に消化のいずれかでな される。次いでフラグメントは、所望されない大きさから勾配遠心分離によって 分離され、そしてバクテリオファージλベクター中で構築される。これらのベク ターおよびファージは、Sambrookに記載されるようにインビトロでパッケージン グされる。組換えファージは、BentonおよびDavis，Science，196:180-182(1977 )に記載されるようにプラークハイブリダイゼーションによって分析される。コ ロニーハイブリダイゼーションは、M．Grunsteinら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA.，72:3961-3965（1975）に一般的に記載されるように実施される。 別の方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用をmRNAまたはDNAテン プレート上でのポリメラーゼ伸長とを組み合わせる。ポリマラーゼ連鎖反応(PCR )法は、mRNAからの、cDNAからの、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリー 直接由来のMEN1の核酸配列を増幅する。制限エンドヌクレアーゼ部位はプライマ ー中に組み込まれ得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増 幅方法もまた、核酸配列決定または他の目的のための生理学的サンプル中のメニ ンコードmRNAの存在を検出するプローブとして使用する核酸を作製するために、 発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするために有用 であり得る。米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号は、この方法を記載 している。PCR反応によって増幅した遺伝子はアガロースゲルから精製され得、 そして適切なベクター中にクローニングされ得る。別の哺乳動物生物学的サンプ ル（細胞および組織を含む）由来のメニンタンパク質をコードするMEN1遺伝子を 同定するための適切なプライマーおよびプローブは、本明細書中に提供される配 列の比較から生成され得る。PCRの一般的な概要に関しては、PCR Protocols:A G ulde to Methods and Applications(Innis，M，Gelfand，D.,Snlnsky，J．and W hlte，T.,編)，Academic Press，San Diego(1990)を参照のこと。 合成オリゴヌクレオチドはMEN1遺伝子を構築するために使用され得る。例えば 、これは通常40〜120bp長の一連の重複するオリゴヌクレオチドを使用して実施 され得、これは遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方を示す。次いで、これ らのDNAフラグメントはアニーリングされ、連結されそしてクローニングされる 。 メニンのための遺伝子は、発現のための哺乳動物細胞への形質転換前に、中間 体ベクターを使用してクローニングされ得る。これらの中間体ベクターは、代表 的には原核生物ベクターまたはシャトルベクターである。メニンは原核生物また は真核生物かのいずれかで発現され得る。 まとめると、メニン遺伝子は、MEN1配列から生成したプローブおよびプライマ ーを使用して、生物学的サンプル（例えば、混合cDNAまたはゲノムプール）の選 択領域を調査または増幅することによって同定され得、そして調整され得る；例 示的プローブは表１において本明細書中に提供される（配列番号１に基づいて配 列の番号付け）。 C.メニンコード核酸配列の分析 本発明のメニンポリペプチドをコードする核酸配列は、それぞれ、配列番号１ および配列番号２を含む本発明の配列核酸およびタンパク質配列を使用する分析 によって同定されそして特徴づけられた遺伝子および遺伝子産物を含む。比較の ための配列に最適な整列は、当該分野で公知な配列同一性（相同性）を分析する ための任意の手段によって使用し得る（例えば、用語「PILEUP」（以下を参照の こと）の累積的整列方法によって；SmithおよびWaterman(1981)Adv.Appl.Math.2 :482の局所的相同性アルゴニズムによって；Needlemanおよび桧unsch（1970）J ．Mol．Biol．48:443の相同性配列アルゴニズムによって；Pearson（1988）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 85:2444の類似性についての探索方法によって；これら のアルゴニズムのコンピューター化の実施によって(例えば、Wisconsin Genetic s Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.，Madison， WIのGAP、BESTFFIT、FASTA、およびTFASTA）；によって；例えばHiggins（1988 ）Gene 73:237-244;Corpet（1988）Nucleic Acids Res．16:10881-90;Huang（19 92）Computer Applications in the Biosciences 8:155-65およびPearson（1994 ）Methods in Molec．Blol．24:307-31)によって記載される。ClustalW(PC/Gene program by Intelligenetics，Mountain View,CAのCLUSTAL)。他の配列整列コ ンピュータープログラムは、Pfam(Sonnhammer(1998)Nucleic Acids Res．26:322 -325);TreeAlign(Hein（1994）Methods Mol．Biol．25:349-364);MES-ALIGN、お よびSAMプログラムを含む；または目視検査は配列同一性を同定し得る。 有用なアルゴリズムの１つの例は、PILEUPである。PILEUPは、関係および配列 同一性の割合を示すために、順送り対整列(progressive，pairwise alignment) を使用して、一群の関連する配列から多重配列整列を作成する。これはまた、整 列を作成するために使用されるクラスター状の関係を示すツリーまたは系統樹(d endogram)をプロットする。PILEUPは、FengおよびDoolittle(1987)J.Mol.Evol.3 5:351-360の順送り整列法の単純化を使用する；HigginSおよびSharp(1989)CABIO S 5:151-153の方法もまた参照。プログラムは300配列(それぞれ、5,000ヌクレオ チドまたはアミノ酸の最大長)までを整列し得る。多重整列手順は、２つの最も 類似する配列の対整列(２つの整列された配列のクラスターを作成する)から始め る。次いで、このクラスターは、次の最も関連する、配列または整列された配列 のクラスターに対して整列させられる。配列の２つのクラスターは、２つの個々 の配列の対整列の単純な拡張により整列させられる。最終の整列は、一連の順送 り対整列により達成される。プログラムは、配列比較の領域のための特定の配列 およびそのアミノ酸もしくはヌクレオチド座標を指定すること、ならびにプログ ラムのパラメータを指定することによって稼働させる。例えば、参照配列が、以 下のパラメータを使用して、配列同一性の割合の関係を決定するために、他の検 定配列と比較され得る：初期設定のギャップ重み(3.00)、初期設定のギャップ長 重み(0.10)、および加重(重みつき)末端ギャップ。PILEUPの使用の例として、Mo rrison(1977)Mol.Biol.Evol．14:428-441もまた参照。 配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの別の例は、BLASTアルゴリ ズムである。これは、Altschul(1990)J.Mol.Biol．215:403-410に記載される。 BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Blothchnolo gy Information(http://www.ncbi.nlm.hih.gov/；「PowerBLAST」バリエーション については、Zhang(1997)Genome Res．7:649-656(1997)もまた参照)を通じて公 に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さ のワードと整列する場合に、いくらか正であると評価された(some positive-val ued)閾値スコアＴと適合するかまたはこれを満足する、照会配列中の長さＷのシ ョートワードを同定することにより、高いスコアの配列対(HSP)を同定する工程 を包含する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値(Altschul(1990)前出)と呼ばれる。こ れらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むより長いHSPを見出すための検 索を開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、累積整列スコアが増大 し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。それぞれの方向でのワードヒ ットの延長は、次の場合には停止される：累積整列スコアがその最大達成値から 量Ｘだけ低下した場合；１またはそれ以上の負のスコアである残りの整列の蓄積 のために、累積スコアがゼロまたはそれ以下になった場合；またはいずれかの配 列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、整 列の感受性およびスピードを決定する。BLASTプログラムは、初期設定として、1 1のワード長(Ｗ)、BLOSUM62スコア行列(scoring matrix；Henikoff(1992)Proc． Natl．Acad．Sci．USA 89:10915-10919を参照)整列(Ｂ)、10の期待値(Ｅ)、Ｍ＝ ５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。用語BLASTとは、２つの配列間の 類似性の統計学的解析を実行するBLASTアルゴリズムをいう(例えば、Karlin(199 3)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:5873-5787を参照)。BLASTアルゴリズムによ って提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配 列間の適合が偶然に生じる確率の指標を提供する、最小和確率(smallest sumpro bability；P(N))である。 配列同一性の割合を算出することに加えて、BLASTアルゴリズムもまた、２つ の配列間の類似性の統計学的解析を実行する(例えば、KarlinおよびAltschul(19 93)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:5873-5787を参照)。BLASTアルゴリズムによ って提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配 列間の適合が偶然に生じる確率の指標を提供する、最小和確率(P(N))である。 例えば、検定核酸と参照核酸との比較における最小和確率が、約0.1未満、より 好ましくは約0.01未満、そして最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は 、参照配列と類似であると考えられる。 Ｄ．メニンコード核酸の配列決定 例えば、野生型対立遺伝子改変物を同定しそして特徴付けるため、インビボで 見出されるかもしくはインビトロで生成される変異を同定するため、クローニン グもしくは増幅された核酸の配列を確認するなどのために、単離したメニンコー ド核酸の配列決定が使用される。メニンコード配列は、ベクター中の挿入物とし て、ベクターから放出もしくは単離された挿入物として、または種々の他の形態 のうちの任意の形態で(すなわち、増幅産物として)配列決定され得る。メニンコ ード挿入物は、制限酵素によりベクターから放出され得るか、またはPCRにより 増幅され得るか、またはポリメラーゼにより転写され得る。挿入物を配列決定し て、完全長コード配列を同定するため、ＮもしくはＣ末端に基づくかまたは元の ファージもしくは他のベクター中の挿入点に基づくプライマーが使用され得る。 さらなるプライマーは、重複する配列を提供するために合成され得る。核酸配列 決定技術は周知である(例えば、核酸の同定および配列決定のためのバイオセン サーチップの使用については、Rosenthal(1987)前出；Arlinghaus(1997)Anal．C hem．69:3747-3753；Dubliey(1997)Nucleic Acids Res．25:2259-2265を参照)。 Ｅ．原核生物における発現 クローニングした遺伝子(例えば、原核生物系においてメニンをコードするcDN A)の高レベル発現を得るために、転写を導く強力なプロモーター、翻訳開始のた めのリボソーム結合部位、および転写/翻訳ターミネーターを最低でも含む、発 現プラスミドを構築することは必須である。E．coliにおけるこの目的に適した 調節領域の例は、Yanofsky，C.，J.Bacterlol.，158:1018-1024(1984)により記 載されるような、E．coliトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペ レーター領域、およびHerskowitz，I.およびHagen，D.，Ann.Rev.Genet．14:399 -445(1980)により記載されるような、λファージの左方向プロモーター(P_L)であ る。 メニンタンパク質を発現させるための発現系は、E．coli、Bacillus sp.、お よびSalmonella(Palva(1983)Gene 22:229-235(1983)；Mosbach(1983)Nature，30 2:543-545)を含む、種々の細菌を使用して入手可能である。 Ｆ．真核生物における発現 標準的な真核生物トランスフェクション法が、大量のメニンタンパク質を発現 する、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株を産生するために使用される。次いで 、このメニンタンパク質は、標準的な技術を使用して生成される。例えば、Coll ey（1989）J.Blol.Chem．264:17619-17622、およびMethods in Enzymology(Deut scher編，1990)の第182巻のGuide to Protein Purificationを参照。真核生物細 胞の形質転換は、例えば、Morrison(1977)J.Bact.，132:349-351；Clark-Curtis s（1983）Methods in Enzymology 101:347-362により記載されるような標準的な 技術に従って実行され得る。 宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための任意の周知手順が使用され 得る。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロト プラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクショ ン、プラスミドベクター(plasma vector)、ウイルスベクター、およびクローニ ングしたゲノムDNA、cDNA、合成DNAもしくは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入 するための任意の他の周知方法(Sambrookら、前出を参照)の使用を包含する。使 用される特定の遺伝子操作手順が、メニンタンパク質を発現し得る宿主細胞に、 少なくとも１つの遺伝子を首尾良く導入し得ることが、唯一必要である。 遺伝情報を細胞に輸送するために使用される特定の真核生物性発現ベクターは 、特に重要ではない。真核生物細胞における発現のために使用される任意の従来 型ベクターが使用され得る。真核生物のウイルス由来の調節エレメントを含む発 現ベクターが、代表的には使用される。SV40ベクターは、pSVT7およびpMT2を含 む。ウシパピローマウイルスに由来するベクターは、pBV-1MTHAを含み、そして エプスタインバーウイルス由来のベクターは、pHEB0およびp205を含む。他の例 示的なベクターは、pMSG、pAV009/A⁺、pMTO10/A⁺、pMAMneo-5、バキュロウイル スpDSVE、ならびに、SV-40初期プロモーター、SV-40後期プロモーター、メタロ チオネインプロモーター、マウス乳ガンウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイ ルスプロモーター、ポリヘドリン、もしくは真核生物細胞における発現に有効で あるこ とが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする 任意の他のベクターを含む。 本発明のベクターは、遺伝子増幅を生じる選択マーカー(例えば、チミジンキ ナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホス ホトランスフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラー ゼ、CAD(カルバミルホスフェートシンセターゼ、アスパルテートトランスカルバ ミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ)、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉 酸レダクターゼ、およびアスパラギンシンセターゼ)、およびウアバイン選択を 含み得る。あるいは、例えば、ポリヘドリンプロモーターもしくは他の強力なバ キュロウイルスプロモーターの指示下で、メニンコード配列とともに、昆虫細胞 においてバキュロウイルスベクターを使用する、遺伝子増幅を含まない高収率発 現系もまた、適切である。 本発明の発現ベクターはまた、細菌におけるベクターのクローニングを容易に する原核生物性配列、および真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞)においてのみ 発現される、１つ以上の真核生物性転写単位の両方を含み得る。ベクターは、真 核生物性レプリコンを含んでも含まなくてもよい。真核生物性レプリコンが存在 する場合、ベクターは、真核生物細胞において、適切な選択マーカーを使用して 増幅可能である。ベクターが真核生物性レプリコンを含まない場合、エピソーム 性増幅は可能ではない。代わりに、トランスフェクトDNAは、トランスフェクト 細胞(ここで、プロモーターは所望の遺伝子の発現を導く)のゲノム中に組み込ま れる。発現ベクターは、代表的には、異なる、十分に特徴付けられたウイルスも しくは哺乳動物遺伝子に由来するエレメントから構築される。培養哺乳動物細胞 におけるクローニングされた遺伝子の発現の一般的な議論のために、例えば、Sa mbrook(前出、16章)を参照。 哺乳動物発現ベクターに代表的に含まれる原核生物性エレメントは、E．coli において機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能に するための抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物性配列の挿入を可 能にするための、プラスミドの非必須領域の独特な制限部位を含む。選択された 特定の抗生物質耐性遺伝子は、重要ではなく、当該分野において公知の多くの耐 性遺伝子のうちの任意のものが適切である。真核生物性配列は、好ましくは、そ れらが、真核生物細胞におけるDNAの複製を妨げないように、選択される。 発現ベクターは、真核生物細胞におけるメニンコードDNAの発現に必要な全て のエレメントを含む、少なくとも１つの真核生物性転写単位または発現カセット を含む。代表的な発現カセットは、メニンおよび転写物の効率的なポリアデニル 化に必要なシグナルをコードするDNA配列に作動可能に連結されたプロモーター を含む。真核生物性プロモーターは、代表的には、２つのタイプの認識配列、TA TAボックスおよび上流プロモーターエレメントを含む。TATAボックス(転写開始 部位の25〜30塩基対上流に位置する)は、RNAポリメラーゼをRNA合成の開始に導 くことに関与すると考えられる。他の上流プロモーターエレメントは、転写が開 始される速度を決定する。カセットのさらなるエレメントは、エンハンサー、な らびにゲノムDNAが構造遺伝子として使用される場合、機能的なスプライスドナ ーおよびアクセプター部位を伴うイントロンを含み得る。エンハンサーエレメン トは、連結された同種もしくは異種のプロモーターから、1,000倍まで転写を刺 激し得る。エンハンサーは、転写開始部位の上流または下流に配置された場合に 活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範 囲を有し、そして種々の組織において活性である。例えば、SV40初期遺伝子エン ハンサーは、多くの細胞タイプに適切である。本発明に適切である、他のエンハ ンサー/プロモーターの組合せは、ポリオーマウイルス、ヒトもしくはマウスサ イトメガロウイルス、種々のレトロウイルス(例えば、マウス白血病ウイルス、 マウスもしくはラウス肉腫ウイルスおよびHIV)からの長末端反復(long term rep eat)由来のものを含む。例えば、Enhancers and Eukaryotic Expression，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y．1983を参照。発現カセットの 構築において、プロモーターは、好ましくは、異種の転写開始部位から、天然の 設定における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離に位置する。しかし、当該 分野において公知のように、この距離のいくらかの変動は、プロモーター機能の 損失を伴うことなく、調整され得る。プロモーター配列に加えて、発現カセット はまた、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含 むべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られ得るか、 または異なる遺伝子から得られ得る。構造遺伝子によりコードされるmRNAが、効 率的に翻訳される場合、ポリアデニル化配列もまた、ベクター構築物に通常付加 される。２つの異なる配列エレメントが、正確で効率的なポリアデニル化に必要 である：ポリアデニル化部位から下流に位置するGUもしくはＵリッチ配列、およ び11〜30ヌクレオチド上流に位置する、６個のヌクレオチドの高度に保存された 配列AAUAAA。本発明に適切である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルは 、SV40に由来するもの、または発現ベクター上の既存の遺伝子の部分的なゲノム コピーを含む。 既に記載したエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは、代表的には、ク ローニングした遺伝子の発現レベルを増大させるため、もしくはトランスフェク トされたDNAを有する細胞の同定を容易にするために意図された他の特別のエレ メントを含み得る。例えば、多くの動物ウイルスが、許容される細胞タイプにお いて、ウイルスゲノムの染色体外複製を促進するDNA配列を含む。これらのウイ ルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、宿主細胞のプラスミド上 またはそのゲノム内のいずれかが有する遺伝子により提供される限り、エピソー ム的に複製される。 本発明のメニンはまた、タンパク質の検出、精製、または他の適用を容易にす るために、組換えタンパク質として、これに連結した１つ以上のさらなるポリペ プチドドメインと共に発現され得る。このような検出および精製を容易にするド メインは、金属キレート化ペプチド(例えば、固定された金属上での精製を可能 にするポリヒスチジントラクトおよびヒスチジンートリプトファンモジュール、 固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、なら びにFLAGS伸長/アフィニティ精製系(Immunex Corp.，Seattle WA)において利用 されるドメイン)を含むが、これらに限定されない。精製ドメインとメニンタン パク質との間に、切断可能なリンカー配列(例えば、第Xa因子またはエンテロキ ナーゼ(Invitrogen，San DiegoCA))を含ませることは、精製を容易にするために 有用であり得る。例示的な発現ベクターは、メニン融合タンパク質の発現を提供 し、これは、メニンをコードする配列および６個のヒスチジン残基をコードする 核酸配列、続いてチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位を含む。ヒ スチジン残基は、検出および精製を容易にする一方、エンテロキナーゼ切断部位 は、融合タンパク質の残留物から所望のタンパク質を精製する手段を提供する。 融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の適用に関連する技 術は、特許および科学文献に十分に記載されている。例えば、Kroll(1993)DNA C ell．Biol.，12:441-53を参照。 メニンをコードするDNA配列はまた、形質転換された細胞によってコードされ るタンパク質の分泌を促進するように、切断可能なシグナルペプチド配列に連結 され得る。そのようなシグナルペプチドは、とりわけ、組織プラスミノーゲンア クチベーター、インスリン、および神経成長因子由来のシグナルペプチド、なら びにHeliothis virescensの若年性ホルモンエステラーゼを含む。 Ｇ．細胞培養物における発現 メニンcDNAは、宿主細胞培養物を形質転換する際の使用のための種々の発現ベ クターに連結され得る。ベクターは、代表的には、メニン遺伝子の転写および翻 訳を開始するための遺伝子配列を含む。これらの配列は、選択される宿主細胞と 適合性である必要がある。さらに、ベクターは、好ましくは、ジヒドロ葉酸レダ クターゼまたはメタロチオネインのような、形質転換された宿主細胞の選択のた めの表現型形質を提供するマーカーを含む。さらに、ベクターは、複製起点を含 み得る。 哺乳動物起源の細胞は、メニンの産生に有用な細胞培養物の例である。哺乳動 物細胞系は、しばしば、細胞の単層の形態にあるが、哺乳動物細胞懸濁液もまた 使用され得る。哺乳動物細胞株の例示的な例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニ ーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、WI38、BHK、COS-7、またはMDCK細胞株を含 む。NIH 3T3またはCOS細胞が好ましい。 先に示したように、宿主細胞を形質転換するために使用されるベクター（例え ば、プラスミド）は、好ましくは、転写を開始するDNA配列、およびメニン遺伝 子配列の翻訳を制御する配列を含む。これらの配列を、発現制御配列と呼ぶ。例 示的な発現制御配列は、SV-40プロモーター(Science，222：524-527，(1983))、 CMVI．E．Promoter(Proc．Natl．Acad．Sci．81:659-663(1984))、またはメ タロチオネインプロモーター(Nature 296:39-42(1982))から得られる。発現制御 配列を含むクローニングベクターは、制限酵素を用いて切断され、そして必要か または所望されるサイズに調整され、そして当該分野において周知の手段によっ てメニンをコードする配列と連結される。 酵母と同様に、高等動物の宿主細胞を用いる場合、公知の哺乳動物遺伝子由来 のポリアデニル化または転写ターミネーター配列は、ベクターに組み込まれる必 要がある。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデ ニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列もまた含まれ得 る。スプライシング配列の例は、SV40由来のVPIイントロンである(Sprague，J． ら、J．Virol．45：773−781(1983))。 さらに、ウシパピローマウイルス型ベクターにおいて見出されるような、宿主 細胞において複製を制御する遺伝子配列が、ベクター中に組み込まれ得る。Save ria-Campo，M.，「Bovine Papilloma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector 」、DNA Cloning、第11巻、a Practical Approach、D.M．Glover編、IRL Press ，Arlingt0n，Virglnia、213-238頁(1985)。 形質転換された細胞は、当該分野において周知の手段によって培養される。例 えば、Biochemlcal Methods、Cell Culture and Virology，Kuchler，R.J.，Dow den，Hutchinson and Ross，Inc.，(1977)において公開される。発現されたG-6- Paseタンパク質は、懸濁液または単層として増殖される細胞から単離される。後 者は、周知の機械的手段、化学的手段、または酵素的手段によって回収される。 １．酵母における発現 酵母における異種タンパク質の合成は、周知であり、そして記載されている。 Methods in Yeast Genetics，Sherman，F.，ら、Cold Spring Harbor Laborator y，(1982)は、酵母においてメニンを産生するために利用可能な種々の方法を記 載する、十分に認識された出版物である。 酵母における遺伝子の高レベルな発現のために、原核生物中と同様に強力なプ ロモーター系に遺伝子を連結させること、および酵母遺伝子由来の効率的な転写 終結／ポリアデニル化配列を提供することもまた必須である。有用なプロモータ ーの例には、GAL1,10(Johnson（1984）Mol．and Cell．Blol．4:1440-1448)、AD H2(Russell（1983）J．Biol．Chem．258:2674-2682)、PH05(EMBO J．6:675-680( 1982))、およびMFα-1が挙げられる。選択マーカー(例えば、Leu-2、URA-3、Trp -1、およびHis-3)を有する多コピープラスミドもまた望ましい。MFα-1プロモー ターは、酵母におけるメニンの発現に好ましい。MFα-1プロモーターは、α接合 型の宿主においては構成性であるが、二倍体または接合型を有する細胞において は作動しない。しかし、MFα-1プロモーターは、SIR遺伝子座のうちの１つにts 変異を有する宿主において温度を上昇または下降させることによって調節され得 る。α型細胞に対する35℃でのそのような変異の効果は、α接合型をコードする 通常サイレントな遺伝子をオンにすることである。続いて、接合型遺伝子をコー ドするサイレント遺伝子の発現は、MFα-1プロモーターをオフにする。27℃にま で増殖の温度を下降させることによって、全体のプロセスを逆にする（すなわち 、接合型をオフにし、そしてMFα-1をオンにする）（Herskowits，I．およびOsh ima，Y.，The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，(Strathern，J .N．Jones，E.W.、およびBroach，J.R.編、Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spr ing Harbor，N.Y．181-209頁，(1982)）。ポリアデニル化配列は、ADH1、MFα-1 、またはTPIのような任意の高度に発現される遺伝子の3'末端配列によって提供 される(Alber，T．およびKawasakl，G.，J．of Mol．&Appl．Genet．1:419-434( 1982))。 YEp6、YEp13、YEp4のような多くの酵母発現プラスミドは、ベクターとして使 用され得る。目的の遺伝子は、種々の酵母のベクター中の任意のプロモーターに 融合され得る。上述のプラスミドは、文献（例えば、Botstein（1979）Gene 8:1 7-24;Broach（1979）Gene，8:121-133)において十分に記載されている。 酵母細胞を形質転換する際に、２つの手順を使用する。１つの場合において、 酵母細胞をまず、ザイモリアーゼ、リチカーゼ(lyticase)、またはグルスラーゼ を用いてプロトプラストに転換し、続いてDNAおよびポリエチレングリコール(PE G)を添加する。次いで、PEG処理したプロトプラストを、選択条件下で、３％寒 天培地中で再生する。この手順の詳細は、例えば、Beggs（1978）Nature 275:10 4-109;Hinnen（1978）Proc．Natl．Acad．Sci．USA75:1929-1933によ って、出版物中に提供されている。第２の手順は、細胞壁の除去を含まない。そ の代わりに、細胞を、塩化リチウムまたは酢酸リチウムおよびPEGで処理し、そ して選択プレート上に置く(Ito，H．ら，J．Bact.，153:163-168，(1983))。 メニンは、細胞を溶解すること、および溶解産物に標準的なタンパク質単離技 術を適用することによって酵母から単離され得る。精製プロセスのモニタリング は、ウェスタンブロット技術またはラジオイムノアッセイを用いることによって 達成され得る。 ３．昆虫細胞における発現 １つの実施態様において、本発明の組換えメニンは、バキュロウイルスのよう な発現ベクターに感染した昆虫細胞において発現される。バキュロウイルス発現 ベクターは、外来遺伝子の挿入について改変された、高度に発現され、そして調 節されるAutographa californica核ポリヘドローシス(polyhedrosis)ウイルス(A cMNPV)ポリヘドリンプロモーターを利用する。ポリヘドリンタンパク質の合成は 、感染した昆虫細胞における閉塞体(occlusion body)の形成を生じる。このベク ターを用いて発現される組換えタンパク質は、それらの天然の対応物と、抗原、 免疫原性、および機能が類似していることが、多くの場合において見出されてい る。さらに、バキュロウイルスベクターは、高等真核生物細胞において生じる、 多くのタンパク質改変、プロセシング、および輸送系を利用する。 手短には、メニンをコードするDNA配列は、ポリヘドリンプロモーターから下 流に、適切な方向で移入プラスミドベクターに挿入され、そしてバキュロウイル ス配列と両方の末端で隣接する。培養された昆虫細胞（通常、Spodoptera frugi perda）は、ウイルスDNAとプラスミドDNAとの混合物でトランスフェクトされる 。発生するウイルス（そのうちのいくつかは、２つのDNA間の相同組換えから生 じる組換えウイルスである）は、１プレートあたり100〜1000プラークでプレー ティングされる。組換えウイルスを含むプラークは、閉塞体を形成する能力のた めに視覚的に、またはDNAハイブリダイセーションによって同定され得る。組換 えウイルスは、プラーク(plague)精製によって単離される。メニンを発現し得る 、得られる組換えウイルスは、ヘルパーウイルスが維持または複製のために必要 と されないという点で自己複製している。昆虫培養物を組換えウイルスに感染させ た後、48〜72時間内に組換えタンパク質が見出されると期待され得る。感染は、 ４〜５日以内に本質的に溶解性である。MEN1が挿入され得る種々の移入ベクター が存在する。移入ベクターの要約については、例えば、Luckow（1988）Bio/Tech nology 6:47-55を参照のこと。１つの実施態様において、Bishop（1992）Semina rs in Viroiogy 3:253-264によって記載される移入ベクターpAcUW21を使用する 。 好ましい実施態様において、ヒトメニンの産生のための昆虫発現系は、本発明 のメニンcDNAを含む適切なベクターでトランスフェクトしたDrosophila Schneid er 2細胞(Schneider（1972）J．Embryol．Exp．Morph．27:363-365)を利用する 。１つの実施態様において、pMT/V5-Hisベクターを使用し；pMT/V5-Hisベクター は、挿入（すなわち、メニン）RNAの調節された転写のための誘導性メタロチオ ネインプロモーターを含む（Johansen（1989）Genes and Develop．3:882-889) 。pMT/V5-Hisはまた、メニンタンパク質の精製を容易にするために、メニンのカ ルボキシ末端に連結された６つのヒスチジンンをコードする配列を含む。種々の 実施態様において、制限部位は、選択された発現ベクター（例えば、pMT/V5-HIS ベクター）中の適合性（compatable）の制限部位への挿入前に、例えばPCRを用 いてメニンcDNAに添加される。S2細胞は、pMT/V5-Hisメニンベクターで一過性ま たは安定にトランスフェクトされ得る。後者の場合において、選択プラスミドpC oHYGRO（van der Straten（1989）Curr．Methods Mol．Cell．Blol．1:1-8）は 、ハイグロマイシン-Bの抗生物質選択下で安定な細胞を産生するために、S2細胞 に同時トランスフェクトされなければない。S2細胞は、2mM L-グルタミンを補充 したDES Expression Medium中で23℃にて増殖される。組換え的に発現されるヒ トメニンポリペプチドを特徴付け、そして単離するために、細胞を収集し、そし て50mM Tris HCl(pH7.8)、150mM NaCl、および１％ NonidetP-40(Invitrogen Co rp.，Carlsbad，CA)を含む緩衝液中で溶解させる。 哺乳動物細胞発現系と比較して、昆虫発現系の２つの主要な利点は、以下であ る：昆虫(例えば、Drosophila)系は、クローンの単離を必要としない；および、 数百もの組換えプラスミドのコピーは、通常、Drosophilaゲノムに組み込まれる ようになり、ベクターインサートによってコードされるポリペプチドのより高レ ベルの発現を生じる(Kirkpatrick（1955）J．Biol．Chem．270:19800-1980)。 ３．哺乳動物細胞における発現 本発明は、インビトロおよびインビボでの、哺乳動物細胞中のMEN1をコードす る核酸の発現、組換えメニンの産生およびメニン活性の再構成の両方を、例えば 実験目的または治療目的のために提供する。種々のヒト疾患は、以下で詳細に議 論されるように、遺伝子が転写され得、そして遺伝子産物が細胞において産生さ れ得るように、遺伝子をヒト細胞に安定に導入する工程を包含する遺伝子治療ア プローチによって処置され得る。MEN1をコードする核酸は、当該分野において公 知の任意の技術を用いて、任意の発現カセット/発現ベクターに挿入され得；い くつかの例示的な系および方法は本明細書中に提供される。 組換えワクシニアウイルス感染細胞における発現 メニンをコードする遺伝子は、pGS62のような組換えワクシニアを産生するた めに設計されたプラスミドに挿入され得る(Langford（1986）Mol．Cell．Biol． 6:3191-3199)。このプラスミドは、外来遺伝子の挿入のためのクローニング部位 、挿入された遺伝子の合成を指向するためのワクシニアのP7.5プロモーター、お よび外来遺伝子の両末端に隣接するワクシニアTK遺伝子からなる。MEN1を含むプ ラスミドが構築される場合、遺伝子は、感染細胞における相同組換えによってワ クシニアウイルスに移入され得る。これを達成するために、適切なレシピエント 細胞は、所望のワクシニアウイルス株(例えば、Wyeth、Lister、WR、またはCope nhagen)にすでに感染した細胞に、標準的なリン酸カルシウム沈降技術によって 組換えプラスミドでトランスフェクトされる。相同組換えは、ウイルス中のTK遺 伝子と、プラスミド中の隣接するTK遺伝子配列との間で生じる。これは、ウイル スTK遺伝子に挿入される外来遺伝子を有する組換えウイルスを生じ、従ってTK遺 伝子を不活性にする。組換えウイルスを含む細胞は、5-ブロモデオキシウリジン （これは、TK遺伝子を発現する細胞にとって致死性である）を含む培地を添加す ることによって選択される。組換えウイルスの産生の確認は、メニンタンパク質 をコードするcDNAを用いるDNAハイブリダイゼーションによって、および発現 されるタンパク質に特異的な抗体を用いる免疫検出技術によって達成され得る。 ウイルスストックは、例えば、HeLA S3スピナー細胞のような細胞の感染、およ びウイルス子孫の収集によって調製され得る。メニンの精製 多くの従来の手順が、組換えまたは合成メニンが精製される場合に用いられ得 る。発現または化学合成の後、メニンは標準的な技術（例えば、硫酸アンモニウ ムのような物質による選択的沈殿；カラムクロマトグラフィー；免疫精製法など を含む）により実質的に純粋にまで精製され得る。例えば、R.Scopes、Protein Purification:Principles and Practic，Springer-Verlag;New York(1982)、米 国特許第4,673,641号、AusubelおよびSambrookを参照のこと。例えば、分子付着 の性質が確立されたタンパク質は、メニンに可逆的に融合（化学的結合）し得る （前出の融合タンパク質についての考察を参照のこと）。適切なリガンドを用い た場合、メニンは精製カラムに選択的に吸着され得、そして比較的純粋な形態で カラムより遊離され得る。次に、融合／結合したメニンでないタンパク質は、例 えば、酵素活性、化学的還元により除去される。メニンはまた、免疫アフィニテ ィーカラムを用いて精製され得る。 Ａ．組換え細菌からのメニンの精製 組換えタンパク質が形質転換細菌より大量に発現される場合（代表的にはプロ モーター誘導の後；発現が構成性であり得る場合以外）、タンパク質は不溶性の 凝集体を形成し得る。メニン封入体の精製のために適切ないくつかのプロトコー ルが存在する。例えば、凝集体タンパク質の精製（本明細書中、以下封入体とい う）は、代表的に、細菌細胞の破壊による封入体の抽出、分離および／または精 製（代表的には、約100〜150μg/mLリゾチームおよび0.1% Nonidet P40（非イオ ン性界面活性剤）の緩衝液中でのインキュベーションによるが、これに限定され ない）を包含する。細胞懸濁液は、Polytronグラインダー（Brinkmaninstrument s，Westbury，N.Y.）を用い、粉砕され得る。あるいは、細胞は氷上で超音波処 理され得る。細菌を溶菌する代替的な方法は、AusubelおよびSambrookに記載さ れ、そして当業者にとって明らかである。細胞懸濁液は一般的に遠心分離され、 封入体を含むペレットは封入体を溶解しないが洗浄する緩衝液（例えば、20mM T ris-HCl(pH7.2)，1mM EDTA，150mM NaClおよび2% Triton-X100（非イオン性界面 活性剤））に再懸濁される。この洗浄工程を繰り返すことは、細胞細片をできる 限り除去するために必要であり得る。残存する封入体のペレットは、適切な緩衝 液（例えば、20mMリン酸ナトリウム，pH6.8，150mM NaCl）に再懸濁され得る。 他の適切な緩衝液は、当業者にとって明らかである。洗浄工程に続き、強力な水 素受容体および強力な水素供与体の両方である溶媒（または、これらの特性の１ つを有する各溶媒の組み合わせ）の添加により、封入体は可溶化される；次に、 封入体を形成するタンパク質は、適合する緩衝液を用いた希釈または透析により 、再生され得る。適切な溶媒としては、尿素（約4M〜約8M）、ホルムアミド（少 なくとも約80容積／容積%）、および塩酸グアニジン（約4M〜約8M）が挙げられ るが、これらに限定されない。凝集体形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの 溶媒、例えば、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、70%ギ酸は、免疫原性および／ または活性の欠損を伴う、タンパク質の不可逆的変性の可能性に起因して、この 手順における使用に不適切である。塩酸グアニジンおよびその類似の薬剤は変性 剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、そして変性剤の除去（例えば、透析 により）または希釈の際に、再生がおこり得、免疫学的におよび／または生物学 的に活性なメニンの再形成を可能とする。可溶化の後、タンパク質は、標準的な 分離技術によって、他の細菌タンパク質より分離され得る。 あるいは、細菌のペリプラズムからメニンを精製することも可能である。メニ ンタンパク質は細菌のペリプラズムに搬出される場合、細菌のペリプラズム画分 は、当業者に公知である他の方法に加え、冷浸透ショックにより単離され得る（ Ausubelを参照のこと）。組換えタンパク質をペリプラズムより単離するために 、細菌細胞は遠心分離され、ペレットを形成する。ペレットは20%ショ糖を含む 緩衝液中に再懸濁される。細胞を溶菌するために、細菌は遠心分離され、そして ペレットは氷冷5mM MgSO₄中に再懸濁され、約10分間氷浴中に保たれる。細胞懸 濁液は、遠心分離され、そして上清をデカントし、保存する。上清中に存在する 組換えタンパク質は、当業者に周知である標準的な分離技術によって、宿主タン パク質より分離され得る。 Ｂ．メニン精製のための標準的なタンパク質分離技術 １．溶解度分画 しばしば初期工程としておよびタンパク質混合物が複合体である場合、初期の 塩分画は望まれない宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地由来のタンパク質 ）の多くを、目的の組換えタンパク質より分離し得る。好ましい塩は、硫酸アン モニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水量を効果的に減 少させることにより、タンパク質を沈殿させる。次に、タンパク質は、その溶解 度に基づき沈殿する。タンパク質がより疎水的であると、より低濃度の硫酸アン モニウムで沈殿するようである。代表的なプロトコールは、生じる硫酸アンモニ ウム濃度が20%〜30%の間であるように、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウム を加えることである。これは、最も疎水的なタンパク質を沈殿させる。沈殿物を 捨て（目的のタンパク質が疎水的でない限り）、そして硫酸アンモニウムを、目 的のタンパク質を沈殿させることが公知の濃度に、上清に加える。次に、沈殿物 は緩衝液中で可溶化され、そして必要ならば過剰の塩を、透析またはダイアフィ ルトレーションのいずれかで除去する。タンパク質の溶解度に依存する他の方法 （例えば、冷エタノール沈殿）は、当業者に周知であり、そして複雑なタンパク 質混合物の分画に用いられ得る。 ２．サイズ差濾過 メニンは67.5キロダルトンの算定分子量を有し、そしてこの知識は、異なる孔 サイズの膜（例えば、AmiconまたはMillipore膜）を通過する限外濾過を用い、 より大きなまたはより小さなサイズのタンパク質からメニンを単離するために、 用いられ得る。第１工程として、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子 量よりも小さな分子量カットオフ（cut-off）を有する孔サイズの膜を通過し、 限外濾過される。次に、限外濾過の保留物は、目的のタンパク質の分子量よりも 大きな分子量カットオフの膜に対し、限外濾過される。組換えタンパク質は膜を 通過して濾液に濾過される。次に、濾液は、下記の記載のとおりクロマトグラフ され得る。 ３．カラムクロマトグラフィー メニンはまた、他のタンパク質から、そのサイズ、正味表面電荷、疎水性、リ ガンドについての親和性に基づき、分離され得る。さらに、タンパク質に対して 惹起された抗体は、カラムマトリックスと結合し得、そしてタンパク質を免疫精 製し得る。これら全ての方法は、当該分野で周知である。クロマトグラフ技術は 、任意のスケールで、多くの異なる製造者（例えば、Pharmacla Biotech）から の機器を用い行われ得ることが、当業者にとって明らかである。MEN1 の検出および分析 当業者にとって明らかであるべきであるように、本発明は、MEN1遺伝子、メニ ンポリペプチド、MEN1遺伝子の変異とガンおよび良性腫瘍に対する予測との関係 （１つの野生型機能性MEN1対立遺伝子および１つの非機能性MEN1対立遺伝子を有 するヘテロ接合体）、ならびにガン性細胞において機能性メニンポリペプチドを 産生し得るMEN1対立遺伝子の不在（ヘテロ接合性の欠損（LOS）、すなわち１つ の残存野生型機能性対立遺伝子の欠損により生ずる制御されない細胞増殖）の同 定である。本発明はまた、MEN1機能性欠損変異の多くの異なる系統があること、 すなわち、多発性内分泌腺腫瘍１型（MEN1）に罹患する異なる患者はそのMEN1遺 伝子において異なる変異を有すること、の発見である。従って、本発明はまた、 生理学的標本において、MEN1 DNAまたはRNAの存在、変化または不在、あるいは 機能性または非機能性メニンポリペプチドの存在または不在を検出するための方 法を包含する。本発明の方法は、個体のMEN1遺伝子型、および従って、MEN1に対 する変異と関連した疾患の罹患の危険度を決定する。 個体のゲノムを有する細胞を有する任意の組織が用いられ得るが、最も簡便な 標本は、個体の生殖系列DNAまたは体細胞性DNAを有する疑われる組織の血液サン プルまたは生検である。ある状況においては、顕微鏡可視下で単離された細胞に つきアッセイを行うことがまた可能であり、そして好まれる。特に有用な方法は 、PCT出願WO/95/23960に記載の顕微解剖技術である。顕微鏡可視下で単離された 細胞は、本明細書記載の任意のアッセイ（ゲノムに基づくアッセイおよび免疫性 に基づくアッセイの両方を含む）において使用され得る。 本発明は、親類が多発性内分泌腺腫瘍１型と診断された家族構成員の遺伝子型 分類する方法を提供する。従来の遺伝子型分類の方法は、本明細書中に提供され る。１つの実施態様において、ゲノム分析が好ましい。ここでMEN1の変異は、ME N1遺伝子のエクソンまたはイントロンのいずれかに結合するプライマーおよびプ ローブを用いて決定される。MEN1遺伝子地図は、図１に提供される。 核酸ハイブリダイゼーション技術を用い特異的DNAおよびRNAを測定する種々の 方法は、当業者に公知である。Sambrookを参照のこと。例えば、サンプル中のME N1 DNAの存在または非存在を評価する１つの方法は、サザン転写である。手短に 言えば、消化したゲノムDNAを緩衝液中のアガローススラブゲルで泳動し、そし て膜に転写する。ハイブリダイゼーションは上記のプローブを用いて行われる。 ハイブリダイズした部分の可視化は、MEN1の存在、変化または非存在の定性的な 決定を可能にする。 同様に、ノーザン転写は、MEN1発現細胞からのRNAサンプル中のメニンmRNAの 検出に用いられ得る。手短に言えば、酸グアニジニウム−フェノール−クロロホ ルム抽出法により、所定の細胞サンプルより、mRNAを単離する。次にmRNAは、mR NA種を分離するために電気泳動をし、そしてmRNAはゲルからニトロセルロース膜 に転写される。サザンブロットと同様に、標識化プローブは、MEN1転写物の存在 または非存在を同定するために用いられる。 核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は決定的ではない。種々の核酸ハイブ リダイゼーション形式は当業者に公知である。例えば、一般的な形式としては、 サンドイッチアッセイおよび競合アッセイまたは置換アッセイが挙げられる。ハ イブリダイゼーション技術は一般的に「Nucleic Acid Hybridization，A Practi cal Approach」Hames,B.D.およびHiggins,S.J.編、IRL Press，1985；Gallおよ びPardue(1969)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,63:378-383；ならびにJohn，Bu rnsteilおよびJones(1969)Nature，223:582-587に記載されている。例えば、サ ンドイッチアッセイは、核酸配列を検出または単離する市販の有用なハイブリダ イゼーションアッセイである。このようなアッセイは、固体支持体に共有結合で 固定化された「捕獲」核酸および溶液中の標識「シグナル」核酸を用いる。臨床 サンプルは標的核酸を提供する。「捕獲」核酸および「シグナル」核酸プローブ は標的核酸とハイブリダイズし、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合 体を形成する。効果的にするために、シグナル核酸は捕獲核酸とはハイブリダイ ゼーションし得ない。 核酸ハイブリダイゼーションアッセイはまた、Fodorら(1991)Science，251:76 7-777；Sheldonら(1993)Clinical Chemistry 39(4):718-719、およびKozalら(19 96)Nature Medicine 2(7):753-759に記載されるようにアレイーベース形式で行 われ得る。このアプローチにおいて、アレイは複数の異なる「プローブ」核酸（ 通常増幅されたDNA）は標的核酸に対してハイブリダイズされる。この様式にお いて、多数の異なるハイブリダイゼーション反応は、本質的に「平行に」行われ 得る。これは、多数の反応物の、迅速で、本質的に同時の評価を提供する。アレ イーベース形式のハイブリダイゼーション反応を行う方法は、当業者に周知であ る（例えば、Jacksonら(1996)Nature Biotechnology,14:1685-1691、およびChee ら(1995)Science，274:610-613を参照のこと）。 本発明に用いる核酸配列は、ポジティブプローブまたはネガティブプローブの いずれかであり得る。ポジティブプローブは標的に結合し、そして２重鎖形成の 存在は標的の存在の証拠である。ネガティブプローブは疑われる標的に結合せず 、２重鎖形成の非存在は標的の存在の証拠である。例えば、野生型特異的核酸プ ローブまたはPCRプライマーの使用は、変異型MEN1のみが存在するアッセイサン プルにおいてネガティブプローブとして作用し得る。 代表的に、標識したシグナル核酸を、ハイブリダイゼーションを検出するため に使用し得る。相補核酸またはシグナル核酸を、ハイブリダイズしたポリヌクレ オチドの存在を検出するために代表的に使用されるいくつかの方法の任意の１つ によって標識し得る。検出の最も一般的な方法は、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、または³² P標識されたプローブなどによるオートラジオグラフィーの使用である。他の 標識は、標識された抗体に結合したリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵 素、および標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして役立ち得る 抗体を含む。 ハイブリダイゼーション複合体の検出は、シグナル生成複合体の、標的の２本 鎖およびプローブヌクレオチドまたは核酸への結合を源とし得る。代表的に、こ のような結合は、リガンド結合プローブおよびシグナルと結合した抗リガンド結 合との間でのリガンドおよび抗リガンド相互作用を介して起こる。シグナル生成 複合体の結合はまた、超音波エネルギーの照射によって加速度的に容易に受け入 れられる。 標識はまた、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出を可能にする。例 えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、そのサンプルを、抗体を使用して 、検出し得る。これらの系において、シグナルは、蛍光または酵素分子を、抗体 に結合することによって、またはある場合は、放射活性標識に結合することによ って生じる（Tijssen,P.，「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」La boratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burdon,R.H.,va n Knippenberg,P.H．編、Elsevier(1985),pp.9-20）。 ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増幅する核 酸増幅系の使用によって増幅され得る。このような系の例は、ポリメラーゼ連鎖 反応(PCR)系およびリガーゼ鎖反応(LCR)系を含む。当該分野で最近記載された他 の方法は、核酸配列基づく増幅(NASBA^TM、Cangene、Mississauga、Ontario)およ びQβレプリカーゼ系である。これらの系は、選択配列が存在する場合でのみ、P CRまたはLCRプライマーが伸長または連結するように設計される場合、変異体を 直接同定するために使用され得る。あるいは、選択配列は、例えば、非特異的PC Rプライマー、および後に変異の指標である特異的な配列をプローブされる増幅 された標的領域を使用することにより一般的に増幅され得る。 好ましい実施態様は、野生型特異的または対立遺伝子特異的増幅の使用である 。PCRの場合、増幅プライマーは、MEN1遺伝子の部分に結合するように設計され るが、3'末端の末端塩基は、変異体またはMEN1の野生型形態の間を識別するため に使用する。末端塩基が点変異または野生型と一致するならば、ポリメラーゼ依 存性の3'末端伸長は進行し、そして増幅産物が検出され得る。点変異または多形 性を検出するためのこの方法は、Sommer(1989)Mayo Clin.Proc.64:1361-1372に よって詳細に記載される。適当なコントロールを使用することによって、ポジテ ィブおよびネガティブの増幅産物の両方を有するキットを開発し得る。その産物 は、特異的なプローブを使用することによってまたはその存在または非存在を単 に検出することによって検出され得る。PCR方法の変法は、識別部位(すなわち、 点変異または野生型塩基のいずれか)がLCRオリゴヌクレオチドの間に落ちるLCR を使 用する。オリゴヌクレオチドの連結は、変異体とMEN1の野生型形態との間を識別 するための手段になる。 MEN1の発現のレベルを決定するための代替の手段は、インサチュハイブリダイ ゼーションである。インサチュハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、 一般的に、例えば、Angerer(1987)Methods Enzymol.152:649-660に記載されてい る、インサチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞、好ましくはウ シのリンパ球は、固体支持体、代表的にはガラススライドに固定化される。DNA をプローブし、細胞を熱またはアルカリで変性させる。細胞を、次に、中程度の 温度でハイブリダイゼーション溶液を接触させ、標識されるMEN1特異的プローブ をアニーリングさせる。そのプローブを、好ましくはラジオアイソトープまたは 蛍光レポーターで標識する。メニンの免疫学的検出 核酸ハイブリダイゼーション技術(増幅技術を含む)を使用する、MEN1またはME N1遺伝子発現(メッセージ)の検出に加えて、メニンポリペプチドを検出するため の免疫アッセイもまた使用し得る。メニンが内分泌組織の疾患と関連するので、 野生型または変異メニンの存在の検出は、好ましくはこれらの器官からの組織生 検において行われる。免疫アッセイを、メニンの定性的または定量的な分析に使 用し得る。応用できる技術の一般的な概要は、例えば、HarlowおよびLane、Anti bodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pubs.,N.Y．(1988)で見られ 得る。 A.メニンの抗体 メニンと特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生す る方法は、当業者において公知である。例えば、Coligan(1991),CURRENT PROTOC OLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY;およびHarlowおよびLane;Stitesら編、BAS IC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第４版)Lane Medical Publications,LOS Altos,CA ,および本明細書中に引用される文献;Godlng(1986),MONOCLONALANTIBODIES:PRIN CIPLES AND PRACTICE(第２版)Academic Press,New York,NY;ならびにKohlerおよ びMilsteln(1975),Nature,256:495-497を参照のこと。このような技術は、ファ ージまたは類似のベクターにおいて組換え抗体のライブラリーからの抗体の選別 にる抗体調製を含む。Huseら(1989),Science,246:1275-1281;およびWardら(1989 ),Nature,341:544-546を参照のこと。例えば、免疫アッセイにおいて使用するた めの抗血清を産生するために、メニンまたはその抗原性フラグメントは、本明細 書中に記載のように単離される。例えば、組換えタンパク質は、形質転換細胞株 中で産生される。マウスまたはウサギの同種交配系を、フロイントのアジュバン トのような標準アジュバント、および標準免疫化プロトコルを使用してタンパク 質で免疫化する。あるいは、本明細書中に開示された、およびキャリアタンパク 質と複合体化された配列由来の合成ペプチドを、免疫原に使用し得る。 ポリクローナル血清を回収し、そして免疫アッセイ(例えば、固支持体に固定 化される免疫原での固相免疫アッセイ)における免疫原タンパク質に対して滴定 する。10⁴以上の力価のポリクローナル抗血清を選択し、そして競合結合免疫ア ッセイを使用して、異なる野生型メニン対立遺伝子変異体、または別の器官から のさらに他の同種タンパク質との間の非メニンタンパク質に対する交差反応性を 試験した。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、少 なくとも約0.1mM、より通常には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1 μMまたはそれより多く、および最も好ましくは0.01μMまたはそれより多くのK_D で通常連結する。 特異的にまたは選択的にメニンと反応する抗体の産生において、メニンの特異 的な野性型多形性変異体(MEN1対立遺伝子によってコードされる)、または変異型 メニン(生物活性の喪失を生じる代表的な変異)、組換えタンパク質または合成ペ プチドは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産物のための好ましい免 疫原である。自然に存在するタンパク質はまた、純粋または不純の形態のいずれ かにおいて使用され得る。合成ペプチドは本明細書中に記載されタンパク質配列 を使用して作られ得る。組換えタンパク質は、上記に記載したように真核生物細 胞または原核生物細胞中でに発現し得、一般的に上記に記載したように精製され 得る。その産物を、次に、抗体を産生し得る動物に注射する。モノクローナルま たはポリクローナル抗体のいずれかを、タンパク質を測定するための免疫アッセ イにおける後続の使用のために生成し得る。 ポリクローナル抗体産生方法は、当業者に公知である。手短に言えば、免疫原 好ましくは、精製タンパク質を、アジュバントと混合し、そして動物を免疫化し た。免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、試験採血を行うことおよびメニン に対する反応性の力価を測定することによりモニターする。免疫原に対して適切 に高い力価の抗体が得られた場合、血液を動物から収集し、そして抗血清を調製 した。所望であれば、タンパク質に対して反応性の抗体を富化するために、さら なる抗血清の分画を行い得る。（上述のHarlowおよびLane参照）。 モノクローナル抗体は、当業者に精通した様々な技術によって得られ得る。１ つの例示的な方法において、所望の抗原で免疫化した動物由来の脾臓細胞を、通 常の骨髄腫細胞の融合によって不死化した(例えば、KohlerおよびMilstein,Eur. J.Immunol.6.511-519(1976)を参照のこと)。不死化の代替的な方法は、Epstein Barrウイルス、癌遺伝子、またはレトロウイルス、または当該分野で周知の他の 方法での形質転換を含む。単一の不死化細胞から生じたコロニーを、抗原につい て所望特異性および親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングし、そし てこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿 主の腹腔への注入を含む様々な技術によって増強し得る。あるいは、Huseら、(1 989)Science 246:1275-1281による概要を述べた一般的なプロトコルにより、ヒ トB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクロー ナル抗体をコードしたDNA配列またはその結合フラグメントを単離し得る。この ような技術はまた、ファージにおいて示された組換え抗体のライブラリー（「フ ァージディスプレイライブラリー」）由来の抗体または細胞上の類似物の選択を 含む。Ward(1989)Nature 341:544;Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15:62-7 0;Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45もまた参照のこと。組 換え抗体は、哺乳動物細胞において(Norderhaug(1997)J.Immunol.Methods 204:7 7-87のように)、および酵母細胞において（Boder(1997)Nat.Biotechnol.15:553- 557のように）、一過性のまたは安定な発現ベクターによって発現され得る。 一旦メニン特異的抗体が利用可能になると、メニンを、臨床医に利用可能な定 性的および定量的な結果を有する様々な免疫アッセイ方法によって測定し得る。 一般的な免疫学的および免疫アッセイ手順の概要については、Basic and Clinic al Immunology第７版(D.StitesおよびA.Terr編)1991を参照すること。さらに、 本発明の免疫アッセイは、いくつかの構成のいずれかで行われ得、これらは、En zyme Immunoassay,E.T.Magglo編,CRC Press,BocaRaton,Florlda(1980)；「Pract ice and Theory of Enzyme Immunoassays」Tijssen;ならびにHarlowおよびLane に広く概要されている。 ヒトのサンプルにおいてメニンを測定するための免疫アッセイは、完全にまた は部分的に配列番号２によってをコードされるタンパク質、またはそのフラグメ ントに対して惹起されたポリクローナル抗血清を使用し得る。この抗血清は、非 メニンタンパク質に対する、低い交差反応性、またはメニンの異なる野生型多形 性変異体（MEN1対立遺伝子によってコードされる）との低い交差反応性、または 免疫するために使用されたものとは異なる任意のメニン形体での低い交差反応性 、すなわち、メニン変異ポリペプチドが免疫原の場合、メニン任意の他の形体に 対する低い交差反応性、を有するように選択され得る。任意のこのような交差反 応性は、免疫アッセイにおいて使用される前の免疫吸着によって除去され得る。 免疫アッセイにおける使用のための抗血清を産生するために、メニンまたはそ のフラグメントを、本明細書に記載したように単離する。例えば、組換えタンパ ク質は、形質転換細胞株で産生される。Balb/cのようなマウスの同種交配系は、 フロイントのアジュバントのような標準アジュバント、および標準マウス免疫化 プロトコルを使用してタンパク質またはペプチドで免疫化する。あるいは、本明 細書に記載した配列由来、およびキャリアタンパク質と複合体化された合成ペプ チドを、免疫原として使用し得る。ポリクローナル血清を回収し、そして免疫ア ッセイ(例えば、固体支持体に固定された免疫原を用いる固相免疫アッセイ)にお いて免疫原タンパク質に対して滴定する。１０⁴以上の力価を有するポリクロー ナル抗血清を選択し、そしてHarlowおよびLane(前出)５７０〜５７３ページおよ びそれ以降に記載されるような競合結合免疫アッセイを使用して、非メニンタン パク質に対する交差反応性について試験される。 Ｂ.免疫学的結合アッセイ。 上記で説明されるように、メニンの発現は、正常細胞の表現型と関連し、そし て機能的な野生型メニンの発現を不可能にするメニンの不十分な発現を生じる変 異は、多発性内分泌腺腫症I型の存在または可能性のいずれかを示す。好ましい 実施態様において、メニンは、任意の多くの十分に認識された免疫学的結合アッ セイを使用して、検出および／または定量される（例えば、米国特許第4,366,24 1号；同第4,376,110号；同第4,517,288号；および同第4,837,168号を参照のこと ）。一般的なイムノアッセイの総説のために、Methods in Cell Biology第37巻 ；Antibodies in Cell Biology、Asai編Academic Press，Inc．New York（1993 ）；Basic and Cllnical Immunology第７版、Stites & Terr編（1991）もまた参 照のこと。免疫学的結合アッセイ（あるいはイムノアッセイ）は、分析物に特異 的に結合するために、およびしばしば分析物（この場合において、メニンまたは その抗原性のサブ配列）を固定するために、代表的に「捕獲剤」を利用する。捕 獲剤は、分析物に特異的に結合する部分である。好ましい実施態様において、捕 獲剤は、メニン（または特異的対立遺伝子形態または変異体形態）に特異的に結 合する抗体である。抗体（抗メニン）は、当業者に周知の任意の多くの手段によ って、および上記のように産生され得る。 イムノアッセイはまた、捕獲剤と分析物とによって形成される結合複合体に特 異的に結合し、そしてこれを標識するための標識化剤を、しばしば利用する。標 識化剤は、それ自体、抗体／分析物複合体を含む部分であり得る。従って、標識 化剤は、標識化メニンポリペプチドまたは標識化抗メニン抗体であり得る。ある いは、標識化剤は、抗体／メニン複合体に特異的に結合する、第３の部分（例え ば、別の抗体）であり得る。好ましい実施態様において、標識化剤は、標識を有 する第２のメニンである。あるいは、第２の抗体は、標識を欠損し得るが、次い でこれは、第２の抗体が由来する種の抗体に特異的な、第３の標識化抗体によっ て結合され得る。第２の抗体は、第３の標識化分子（例えば、酵素標識化ストレ プトアビジン）が特異的に結合し得る検出可能な部分（例えば、ビオチン）で改 変され得る。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質（例 えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）はまた、標識剤として使用され得る。 これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成成分である。これらは、 多様な種からの免疫グロブリン定常領域とともに、強力な非免疫原性の反応性を 示す（一般的には、Kronvalら（1973）J．Immunol.、111:1401-1406、およびAke rstromら（1985）J．Immunol.、135:2589-2542を参照のこと）。 アッセイを通じて、インキュベーション工程および／または洗浄工程が、試薬 の各組合せの後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒間〜数時 間まで、好ましくは約５分間〜約24時間まで変化し得る。しかし、インキュベー ション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容量、濃度などに依存する。通常 、アッセイは、環境の温度で行われるが、それらは、温度の範囲（例えば、10℃ 〜40℃）にわたって行われ得る。 １．非競合アッセイ形式。 生物学的サンプルまたは組識サンプルにおけるメニンを検出するためのイムノ アッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。非競合イムノアッセ イは、捕獲された分析物（この場合において、タンパク質）の量が、直接的に測 定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、 例えば、捕獲剤（抗メニン抗体）が、固体基質（ここで、捕獲剤が固定化される ）に直接的に結合され得る。次いで、これらの固定化された抗体は、試験サンプ ルに存在するメニンを捕獲する。次いで、このように固定化されたメニンは、標 識化剤（例えば、標識を有する第２のメニン抗体）によって結合される。あるい は、第２の抗体は、標識を欠損し得るが、次いで、第２の抗体が由来する種の抗 体に特異的な第３の標識化抗体によって結合され得る。第２の抗体は、第３の標 識化分子（例えば、酵素標識化ストレプトアビジン）が特異的に結合し得る検出 可能な部分（例えば、ビオチン）で標識され得る。 ２．競合アッセイ形式。 競合アッセイにおいて、サンプルに存在するメニン（分析物）の量は、添加さ れた（外因性の）分析物（すなわち、メニン）であって、サンプルに存在する分 析物によって捕獲剤（抗メニン抗体）から置換された（または競合して除かれた ）、の量を測定することによって間接的に測定される。１つの競合アッセイにお いて、この場合、メニンの既知の量が、サンプルに添加され、次いでサンプルは 、捕獲剤（この場合、メニンに特異的に結合する抗体）と接触される。抗体に結 合されるメニンの量は、サンプルに存在するメニンの濃度に反比例する。特に 好ましい実施態様において、抗体は、固体基質に固定化される。抗体に結合され るメニンの量は、メニン／抗体複合体に存在するメニンの量を測定することによ って、または、代替的には、残存する非複合体化タンパク質の量を測定すること によってのいずれかで、決定され得る。メニンの量は、標識化メニン分子を提供 することによって検出され得る。 ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合アッセイである。このアッセイに おいて、既知の分析物（この場合において、メニン）は、固体基質上に固定化さ れる。既知の量の抗メニン抗体が、サンプルに添加され、次いで、サンプルは、 固定化メニンと接触される。この場合において、固定化メニンに結合された抗メ ニン抗体の量は、サンプルに存在するメニンの量に反比例する。さらに、固定化 された抗体の量は、抗体の固定化画分または溶液中に残存する抗体の画分のいず れかを検出することによって、検出され得る。検出は、抗体が標識される場合、 直接的であり得るか、または上記のように、それに続く抗体に特異的に結合する 標識化部分の続く添加によって、間接的であり得る。 競合的結合形式におけるイムノアッセイは、交差反応性の決定のために使用さ れ得る。例えば、配列番号２によって部分的にコードされるタンパク質が、固体 支持体に固定化され得る。タンパク質が、固定化抗原に対する抗血清の結合を競 合するアッセイに添加される。上述のタンパク質が固定化タンパク質に対する抗 血清の結合と競合する能力が、配列番号２のメニンに比較される。標準的な計算 を使用して、上述のタンパク質についての交差反応性のパーセントが算定される 。上述で列挙されるタンパク質のそれぞれと、10%未満の交差反応性を有する抗 血清が選択され、そしてプールされる。交差反応性の抗体は、必要に応じて、研 究されるタンパク質（例えば、離れて関連するホモログ）との免疫吸着によって プールされた抗血清から除去される。 免疫吸着され、そしてプールされた抗血清は、次いで、メニンの野生型多型改 変体としておそらく本発明のタンパク質であると考えられる第２のタンパク質を 、免疫原タンパク質（すなわち、配列番号２のメニン、または配列番号１によっ てコードされるポリペプチド）と比較するために、上記のような競合的結合イム ノアッセイにおいて使用される。この比較をなすために、２つのタンパク質はそ れ ぞれ、広範囲の濃度でアッセイされ、そして固定化タンパク質に対する抗血清の 結合の50%を阻害するために必要とされる各タンパク質の量が、決定される。必 要とされる第２のタンパク質の量が、（抗血清の結合の50%を阻害するために） 必要とされる免疫原の量の１０分の１よりも低い場合、第２のタンパク質は、免 疫原に対して惹起された抗体に特異的に結合するといわれる。 ３．他のアッセイ形式。 特に好ましい実施態様において、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析 が、サンプルにおけるメニンの存在を検出および定量するために使用される。こ の技術は、一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動によってサンプルタンパク 質を分離する工程、適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、 ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に分離された タンパク質を移す工程、およびメニンに特異的に結合する抗体とともにサンプル をインキュベートする工程を包含する。抗メニン抗体は、固体支持体上のメニン ペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は、直接的に標識され得るか、また は、代替的には、抗メニン抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化 ヒツジ抗マウス抗体）を用いて、続いて検出され得る。 他のアッセイ形式は、リポソームイムノアッセイ（LIA）を含み、これは結合 特異的分子（例えば、抗体）に結合し、そしてカプセル化された試薬またはマー カーを遊離するように設計されるリポソームを使用する。次いで、遊離された化 学物質は、標準的な技術に従って検出される（例えば、Monroeら（1986）Amer． Clin．Prod．Rev．5:34-41を参照のこと）。 ４．非特異的結合の減少。 当業者は、イムノアッセイにおいて非特異的結合を使用することが、しばしば 所望されることを理解する。特に、アッセイが固体支持体に固定化された抗原ま たは抗体を含む場合、基質への非特異的結合の量を最小化することが所望される 。このような非特異的結合を使用する手段は、当業者に周知である。代表的に、 これは、基質を、タンパク質性組成物でコートする工程を包含する。特に、タン パク質組成物（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）、脱脂粉乳、およびゼラチ ン）は、広範に使用され、粉乳が、最も好ましい。 ５．標識。 アッセイにおいて使用される特定の標識または検出可能な基は、これが、アッ セイにおいて使用される抗体の特異的な結合を有意に妨げない限り、本発明の重 要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有す る任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野 において十分に開発されており、一般に、このような方法において有用な大部分 の任意の標識は、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光学的、光化学的 、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可 能な任意の組成物である。本発明において有用な標識は、磁性ビーズ（例えば、 Dynabeads^TM）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキ サスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、また は³²P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファター ゼ、およびELISAにおいて一般に使用される他の酵素）、ならびに比色標識（例 えば、金コロイド、または着色ガラス）、あるいはプラスチック（例えば、ポリ スチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズを含む。標識は、当該分 野において周知の方法に従って、アッセイの所望される成分に、直接的または間 接的に結合され得る。上述で示されるように、広範に多様な標識が使用され得、 標識の選択は、必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要性、 利用可能な機器、および処理規定に依存する。 非放射性標識は、しばしば、間接的な手段によって付着される。一般に、リガ ンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いで、リガンドは 、本来検出可能であるか、またはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化 合物、もしくは化学発光化合物）に共有結合されるかのいずれかである抗リガン ド（例えば、ストレプトアビジン）分子に、結合する。多くのリガンドおよび抗 リガンドが、使用され得る。チロキシンおよびコルチゾールは、標識された天然 に存在する抗リガンドと組合せて使用され得る。あるいは、任意のハプテン性化 合物または抗原性化合物が、抗体と組合せて使用され得る。 分子はまた、例えば、酵素または発蛍光団との結合によって、シグナル発生化 合物に直接的に結合され得る。標識としての目的の酵素は、おもに、加水分解酵 素（特に、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ）、またはオ キシドターゼ（oxldotase）（特に、ペルオキシダーゼ）である。蛍光化合物と しては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダン シル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学蛍光化合物は、ルシフェリン、 および2,3-ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）を含む。使用され 得る種々の標識化系およびシグナル発生系の総説のために、米国特許第4,391,90 4号を参照のこと）。 標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性 標識である場合、検出のための手段としては、シンチレーションカウンター、ま たは、オートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムを含む。標識が蛍光 標識である場合、標識は、蛍光色素を光の適切な波長で励起し、そして得られる 蛍光を検出することにより、検出され得る。蛍光は、写真フィルムの手段によっ て、電荷結合素子（CCD）のような電子検出器の使用によって、または光電子増 倍管の使用によってなどで、視覚的に検出され得る。同様に、酵素学的標識は、 酵素についての適切な基質を提供し、そして得られる反応産物を検出することに よって、検出され得る。最後に、単純な比色標識は、単に標識と関連する色を観 察することによって検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイ において、結合された金は、しばしばピンクに見えるが、種々の結合されたビー ズは、ビーズの色に見える。 いくつかのアッセイ形式は、標識化成分の使用を必要としない。例えば、凝集 アッセイは、標的抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合において 、抗原コート化粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式 において、成分のいずれも標識される必要はなく、そして標的抗体の存在は、単 純な視覚的な観察によって検出される。遺伝子治療の適用 遣伝子が転写され得、そして遺伝子産物が細胞中に生成され得るように、遺伝 子をヒト細胞に安定的に導入する工程を包含する治療学的アプローチによって、 多様なヒト疾患が処置され得る。このアプローチによる処置を受け入れられる疾 患としては、遺伝性疾患、特にMEN1のような疾患（ここでは、欠損が単一の遺伝 子のMEN1を伴う）が挙げられる。遺伝子疾患および後天性疾患の処置に対する遺 伝子治療の出願に対する考察のために、Miller，A.D．(1992)Nature 357:455-46 0、およびMulligan，R.C．(1993)Science 260:926-932を参照のこと。遺伝子治 療手順の総説のために、例えば、Zhang（1996）Cancer Metastasis Rev．15:385 -401；Anderson、Science（1992）256:808-813；Nabel（1993）TIBTECH 11:211- 217；Mitanl（1993）TIBTECH 11:162-166；Mulligan（1993）Science、926-932 ；Dillon（1993）TIBTECH 11:167-175；Miller（1992）Nature 357:455-460；Va n Brunt（1988）Biotechnology 6(10):1149-1154；Vigne（1995）Restorative N eurology and Neuroscience 8:35-36；Kremer（1995）British Medical Bulleti n 51(1)31-44:Haddada（1995）Current Topics in Microbiology and Immunolog y、DoerflerおよびB6hm（編）Springer-Verlag、Heidelberg Germany；およびYu （1994）Gene Therapy、1:13-26を参照のこと。 本発明の実施において有用なベクターは、代表的にウイルスゲノムに由来する 。用いられ得るベクターは、組換え的に改変された、包膜されたまたは包膜され ないDNAウイルスおよびRNAウイルス（好ましくは、バキュロウイルス科、パルボ ウイルス科、ピコルノウイルス科（picornoviridiae）、ヘルペスウイルス科、 ポックスウイルス科、アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科より選択さ れる）を含む。親ベクター特性のそれぞれの有利な局面を利用するキメラベクタ ーがまた、用いられ得、例えば、Feng（1997）Nature Biotechnology 15:866-87 0を参照のこと。このようなウイルスゲノムは、腫瘍抑制遺伝子を含むために組 換えDNAによって改変され得、そして複製欠損、条件付き複製、または複製コン ピテントになるように操作され得る。本発明の好ましい実施において、ベクター は、複製欠損であるか、または条件付き複製をする。好ましいベクターは、アデ ノウイルスゲノム、アデノ随伴ウイルスゲノム、およびレトロウイルスのゲノム に由来する。 条件付き複製するウイルスベクターは、都合の悪い広い範囲の感染を回避しな がら、特定の細胞型における選択的な発現を達成するために使用される。条件付 きで複製をするベクターの例は、例えば、Bischoff（1996）Science 274:373-37 6；Pennisi（1996）Science 274:342-343：Russell（1994）Eur．J．of Cancer 30A(8):1165-1171において記載される。さらに、ウイルスゲノムは、一定の条件 下でのみトランスジーンの複製または発現を達成する誘導性のプロモーターを含 むように改変され得る。誘導性のプロモーターの例は、科学文献において公知で ある（例えば、Yoshida（1997）Biochem．Biophys．Res．Comm．230:426-430；I ida（1996）J．Vlrol．70(9):6054-6059；Hwang（1997）J．Virol 71(9):7128-7 131；Lee（1997）Mol．Cell．Blol．17:5097-5105；Dreher（1997）J．Blol．Ch em 272:29364-29371を参照のこと）。トランスジーンはまた、特定の細胞型にお いてのみトランスジーンの発現を許容する組織特異的なプロモーター領域の制御 下にあり得る。 レトロウイルスベクター レトロウイルスベクターは、移入された遺伝子配列を、標的細胞の染色体DNA に安定的に組み込む能力を有する。レトロウイルスベクターは、標的細胞の高い パーセントを安定的に形質導入する場合に非常に効率的であるので、特に魅力的 である。従って、ほとんどの認可された遺伝子治療の臨床学的なプロトコルは、 レトロウイルスベクターを使用する。Miller，A.D．(1992）前出を参照のこと。 レトロウイルスベクターが標的細胞を形質導入し、そして標的細胞ゲノムに組み 込む高い効率のために、細胞を改変するためにレトロウイルスベクターは特に有 用である。さらに、レトロウイルスベクターを保有するレトロウイルスは、広範 に多様な組識由来の細胞に感染し得る。 レトロウイルスベクターは、遺伝子操作されたレトロウイルスによって産生さ れる。レトロウイルスは、ウイルスゲノムがRNAであるので、RNAウイルスと呼ば れる。感染の際、このゲノムRNAは、高い程度の安定性および効率を伴って、形 質導入された細胞の染色体DNAに組み込まれるDNAコピーに、逆転写される。組み 込まれたDNAコピーは、プロウイルスといわれ、そして任意の他の遺伝子のよう に、娘細胞によって受け継がれる。野生型レトロウイルスゲノムおよびプロウイ ルスDNAは、３つの遺伝子：gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を有し、こ れは、２つの長末端反復（LTR）配列によって隣接される。gag遺伝子は、内部構 造（ヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし；pol遺伝子は、RNA指向性DNA ポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし；そしてenv遺伝子は、ウイルス包膜糖 タンパク質をコードする。5'LTRおよび3'LTRは、ビリオンRNAの転写およびポリ アデニル化を促進するように作用する。5'TRの近接は、ゲノムの逆転写に必要な 配列（tRNAプライマー結合部位）、およびウイルスRNAの粒子への効率的なカプ セル化に必要な配列（Psi部位）である。Mulligan，R.C.、Experimental Manipu lation of Gene Expression、M．Inouye（編）、155-173(1983)；Mann、R．ら、 Cell、33:153-159（1983）；Cone，R.D.およびR.C.Mulligan、Proceedings of t he National Academy of Sciences、U.S.A.、81:6349-6353（1984）を参照のこ と。 レトロウイルスベクターの設計は、当業者に周知である。Singer，M.およびBe rg，P．(前出)を参照のこと。簡潔には、キャプシド形成（または感染性ビリオ ンへのレトロウイルスRNAのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムか ら欠けている場合、結果は、ゲノムRNAのキャプシド形成を妨げるシス作用性の 欠損（cis acting defect）である。しかし、得られる変異体はなお、全てのビ リオンタンパク質の合成を指向し得る。これらの配列が欠失されたレトロウイル スゲノム、および染色体に安定に組み込まれる変異体ゲノムを含む細胞株は、当 該分野において周知であり、そしてレトロウイルスベクターを構築するために使 用される。レトロウイルスベクターの調製およびそれらの使用は、欧州特許出願 第EPA 0 178220号、米国特許第4,405,712号、Gilboa、Biotechniques 4:504-512 （1986）、Mannら、Cell 33:153-159（1983）、ConeおよびMulligan、Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 81:6349-6353（1984）、Eglitis、M.A.ら（1988）Biotechni ques 6:608-614、Miller，A.D.ら（1989）Biotechniques 7:981-990、Miller，A .D．(1992)Nature，前出、Mulligan，R.C．(1993)、前出、ならびにGould，B.ら 、および「遺伝子治療において有用なレトロウイルスベクター」と題された国際 特許出願第WO 92/07943号を含む多くの刊行物において記載される。 レトロウイルスベクター粒子は、野生型MEN1をレトロウイルスに組換え的に挿 入し、そしてパッケージング細胞株の使用により、レトロウイルスキャプシドタ ンパク質でベクターをパッケージングすることによって、調製される。得られる レトロウイルスベクター粒子は、宿主細胞において複製可能ではなく、およびME N1を含むプロウイルス配列として宿主細胞ゲノムに組み込み可能である。結果と して、患者は、メニンを生成し得、従って、細胞を、正常な、非ガン性の表現型 に復帰（restore）させる。 パッケージング細胞株は、レトロウイルスベクター粒子を調製するために使用 される。パッケージング細胞株は、遺伝学的に構築された哺乳動物組織培養細胞 株であり、これはパッケージングのために要求される必要なウイルス構造タンパ ク質を生成するが、感染性のビリオンを生成し得ない。他方、レトロウイルスベ クターは、構造遺伝子を欠損するが、パッケージングのために必要な核酸配列を 有する。パッケージング細胞株を調製するために、所望のレトロウイルスの感染 性のクローン（ここでは、パッケージング部位が欠失される）が、構築される。 この構築物を含有する細胞は、全ての構造タンパク質を発現するが、導入された DNAは、パッケージングされ得ない。あるいは、パッケージング細胞株は、適切 なコアタンパク質およびエンベロープタンパク質をコードする１つ以上の発現プ ラスミドで、細胞株を形質転換することによって生成され得る。これらの細胞に おいて、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子は、同じかまたは異なるレト ロウイルスに由来し得る。 本発明に適切な、多くのパッケージング細胞株はまた、先行技術において利用 可能である。これらの細胞株の例は、Crip、GPE86、PA317、およびPG13を含む。 Millerら、J．Virol．65:2220-2224（1991）を参照のこと。他のパッケージング 細胞株の例は、Cone，R.およびMulligan，R.C.、Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 81:6349-6353（1984）、ならびにDanos，O.およびR. C.MUlligan、Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，85:646 0-6464（1988）、Eglitis，M.A.ら（1988）前出、ならびにMiller，A.D．(1990) 前出において記載される。キメラエンベロープタンパク質を有するレトロウイル スベクター粒子を生成し得るパッケージング細胞株が、使用され得る。あるいは 、広宿主性または異種栄養性のエンベロープタンパク質（例えば、PA317およびG PXパッケージング細胞株によって生成されるエンベロープタンパク質）が、レト ロウイルスベクターをパッケージングするために使用され得る。 アデノ随伴ウイルス（AAV）に基づくベクター アデノ随伴ウイルス（AAV）に基づくベクターはまた、例えば、核酸およびペ プチドのインビトロ生成において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子治 療手順における、標的核酸を用いて細胞を形質導入するために使用される。Okad a（1996）Gene Ther．3:957-964；West（1987）Virology 160:38-47；Carter（1 989）米国特許第4,797,368号；CarterらWO 93/24641（1993）；Kotin（1994）Hu man Gene Therapy 5:793-801；Muzyczka（1994）J．Clin．Invst．94:1351（AAV ベクターの全体像について）を参照のこと。組換えAAVベクターの構築は、多く の刊行物において記載され、これにはLebkowski、米国特許第5,173,414号；Trat schin（1985）Mol．Cell．Biol．5(11):3251-3260；Tratschin（1984）Mol．Cel l．Biol．4:2072-2081；Hermonat（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81.6466 -6470；McLaughlin（1988）およびSamulski（1989）J．Virol.、63:03822-3828 を含む。rAAVによって形質転換され得る細胞株は、Lebkowski（1988）Mol.Cell ．Biol.、8:3988-3996において記載される細胞株を含む。 アデノウイルスベクター 本発明はまた、遺伝子治療に適切なアデノウイルスベクターにおいてメニンを コードする核酸のインビボ発現を提供する。ヒトの臨床的研究は、アデノウイル スベクターが、腫瘍に感染し、そして腫瘍細胞によりトランスジーンおよびウイ ルス産物を発現させるための有効な手段であり、有意な抗腫瘍免疫応答を生じる ことが実証された（例えば、Gahery-Segard（1997）J．Clin．Invest．100:2218 -2226を参照のこと）。インビボでの、および遺伝子治療のための、アデノウイ ルスベクターの使用は、特許および科学文献において十分に記載される（例えば 、Horellou（1997）Mol．Neurobiol．15:241-256；Hermens（1997）J．Neurosci ．Methods.、Jan．71(1):85-98；Zeiger（1996）Surgery 120:921-925；Channon （1996）Cardiovasc Res.32:962-972；Huang（1996）Gene Ther．3:980-987；Ze peda（1996）Gene Ther．3:973-979；Yang（1996）Hum．Mol．Genet5:1703-1712 ；Crauso（1996）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:11302-11306；Rothmann（199 6）Gene Ther．3.919-926；Haecker（1996）Hum．Gene Ther．7:1907-1914を参 照のこと）。アデノウイルスベクターの使用は、WO 96/25507において詳細に記 載される。アデノウイルス５型およびアデノウイルス２型のゲノムは、例えば、 Chroboczek（1992）Virology 186:280-285によって記載される。遺伝子治療のた めのアデノウイルスベクターは、代表的には、アデノウイルス初期（「E」）領 域１（「E1」）領域遺伝子の欠失によって複製欠損にされる。 このようなベクターの単離、増殖、および大規模生成のために、E1機能は、安 定な細胞株から、トランスで供給される。代表的には、臨床的研究のために使用 されるアデノウイルスベクターは、293細胞（アデノウイルス（Ad）５型（Ad5） ゲノムの左末端の組み込まれたセグメントからE1機能を発現するヒト胎児腎細胞 株）において生成される（例えば、Hehir（1996）J．Virol．70:8459-8467を参 照のこと）。他の細胞株は、初期領域１が欠失されたアデノウイルスベクターの 増殖のために使用され得る（例えば、Ad5ゲノムの塩基対79〜5789を含むプラス ミドを有するヒト胎児網膜芽（HER）株911、Fallaux（1996）Hum．Gene．Ther． 7:215-222を参照のこと）。多くのアデノウイルスベクターは、挿入された目的 の遺伝子（例えば、トランスジーン、野生型メニン）が、アデノウイルスE1a、E 1b、およびE3遺伝子を置換するように操作され；続いて、複製欠損ベクターは、 欠失されたE1遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞においてのみ増殖さ れ得る。あるいは、アデノウイルスのE1、E3、およびE2b遺伝子機能が欠失され るか（例えば、Amalfitano（1998）J．Virol．72:926-933を参照のこと）；また は、E1および／またはE4遺伝子が欠失される（例えば、Brough（1996）J．Virol ．70:6497-6501；Armentano（1995）Hum．Gene．Ther．6:1343-1353を参照のこ と）。アデノウイルスベクターはまた、アデノウイルス初期領域３および／また は初期領域４における欠失を含み得る。 あるいは、インビボでの組換え複製欠損アデノウイルスのトランスジーンの発 現の増幅を達成するために、トランス補完（complementation）アプローチが使 用され得、ここで、細胞への、欠失されたE1機能を含むプラスミドを有するE1- 欠損アデノウイルスの同時形質導入は、これらの細胞によるE1欠損ウイルスの生 成をもたらす（例えば、Dion（1996）Cancer Gene Ther．3:230-237；Goldsmith （1994）Hum．Gene Ther．5:1341-134を参照のこと）。アデノウイルスベクター は、タンパク質IX遺伝子のうちのいくつかまたは全ての欠失を含み得る（Adタン パク質IXの４つのトリマーは、ウイルスヘキソン（hexon）の上部表面中に包埋 され、非常に安定なアセンブリを作製する。例えば、Babiss（1991）J．Virol.6 5:598-605；Furcinitti（1989）EMBO J．8:3563-3570を参照のこと。Ad pIX欠失 ベクターについては、例えば、Krougliak（1995）Hum．Gene Ther．6:1575-1586 を参照のこと。１つの実施態様において、アデノウイルスベクターは、E1aおよ び／またはE1b配列の欠失を含む。 以下の実施例は、説明の手段としてのみ提供されるが、限定の手段として提供 されない。当業者は容易に、本質的に同様な結果を得るために変化または改変さ れ得る、種々の重要でない（noncritical）パラメーターを容易に認識する。 実施例 実施例１：MEN1変異の同定 以下の実施例は、多くのMEN1変異の特徴付けおよび定義を詳述する。 上述の方法を使用して、多くのMEN1変異を定義することが可能であった。本発 明は、MEN1における変異が、多発性内分泌腺腫瘍１型（MEN1）の原因であるとい う発見、およびMEN1の対立遺伝子の両方におけるいくつかの非遺伝性の（すなわ ち、体細胞性のまたは後天性の）変異が、多くの異なる内分泌腺腫瘍の原因とな り得るという発見を提供する。 多発性内分泌腺腫瘍１型（MEN1）を有するとして臨床的に診断された患者を、 研究のために選択した。研究した１つの集団は、15の典型的な多発性内分泌腺腫 瘍１型を罹患した家族からであった。MEN1の診断は、３つの主要な系（上皮小体 、腸膵臓（enteropancreatic）内分泌腺組識、下垂体前葉）のうちの２つにおけ る腫瘍の存在に基づいた。家族性MEN1の診断は、これらの系の１つ以上の腫瘍を 有する少なくとも１人の第１等級の親族（relative）を必要とした。各家系にお いて１〜47人の生存する罹患したメンバーが存在し、中央値（median）は５であ った。全ての参加した家族のメンバーは、NIDDK Institutional Review Boardに よって認められたプロトコルにおいて、十分なインフォームドコンセントを受け た。 ゲノムDNAを、Qiagen Kit（Chatsworth，CA）を使用して、血液サンプルから 単離した。MEN1のエキソン２〜10を、イントロン配列から設計されたプライマー を使用して、個々にまたは群において、ゲノムDNAから増幅した。関連するPCRプ ライマーおよびddFプライマー配列は、表１において見出され得る。PCRを、100n g DNA、0.2μMの各プライマー、200μM dNTP、10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl 、1.5mM MgCl2、0.001％（w/v）ゼラチン、および0.5U Amplitaq Gold（Perkin Elmer，Branchburg、NJ）を含有する25μlの反応液中で行った。Perkin Elmer S ystem 9600における温度サイクル（thermal cycling）を、92℃で10分間、次い で9４℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で１〜２分間の35サイクル、続いて、72 ℃で５分間の最後の伸長で行った。５%の最終濃度でのDMSOが、エキソン２、９ 、および10について含まれた。 ５μlをアガロース上に電気泳動することによってPCR産物の純度を確認した後 、ジデオキシフィンガープリント法（ddF）を、変更を伴ってSarkar（1992）Gen omics 13:441によって記載されるように行った。一次PCR産物を、１μlの一次PC R鋳型（20ng）、0.15μM末端標識化ddFプライマー（Dupont-NEN、Boston，MAか らのγ-³³P ATPおよびPromega、Madison、WIからのT4ポリヌクレオチドキナーゼ を使用した）、25μM dNTP、200μM ddGTP、10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、1 .5mM MgCl2、0.001%（w/v）ゼラチン、および1U Amplitaq Goldを含有する10μl 反応において、ddGTP（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）を用いてジデ オキシ鎖終結反応に供した。反応を、Perkin Elmer System 9600において：Taq Goldを活性化するための92℃で10分間、次いで94℃で30秒間、65℃で30秒間、お よび72℃で１分間の35サイクルで、サイクルし；72℃で５分間の最終伸長工程の 後、その反応物を４℃に保った。10μl ddF反応物に、７M尿素、50%ホルムアミ ド、ブロモフエノールブルー、およびキシレンシアノールを含有する40μlの緩 衝液を添加した。反応を、94℃で５分間、加熱し、そして氷中で冷却し、配列決 定装置において、５μlを、0.5×TBE中の非変性ゲル（0.75×MDE、FMC Bioprodu cts，Rockland、ME）上にロードした。ゲルを、上部リサーバーにおいて0.5×TB E、および底部リサーバーにおいて0.5M酢酸ナトリウムを含有する0.8×TBEから なる緩衝液系中で、室温にて、８ワットの一定力で、ブロモフェノールブルーが ゲルの底に達するまで、電気泳動した。ゲルを、Whatman紙上に取り出し、そし て配列決定ゲル乾燥器中で、30分間乾燥して、一晩オートラジオグラフした。 １つのddFプライマーは、約250bp領域をスクリーニングし得；一次PCR産物に おいてスクリーニングされる領域がより大きな場合、さらなるプライマーをddF のために使用した。バンドパターンの変化を示すサンプルを、ddF反応において 使用したものと同じ一次PCR産物および同じ末端標識化プライマーを使用して、 サイクル配列決定に供した。実際に含まれる塩基がヘテロ接合体の患者のサンプ ルの配列から確認され得ない挿入型または欠失型の変化について、一次PCR産物 を、TAクローニングベクターpCRII（Invitrogen、San Diego、CA）中にクローン 化し、次いで配列決定した。 分離された変異がMEN1を有することの確認は、他の罹患した家族のメンバーか らのPCR産物を直接配列決定することによって達成した。罹患した個体における 配列変化とは独立した確認は、512delC（AflII部位を作製する）、W436R（MspI およびNcII部位を作製する）、およびR527X（Bsu36I部位を作製する）について の適切なエキソンPCR産物の制限消化によって達成した。残りについて、Lyons（ 1990）Science 249:655に記載されるように、エキソンPCR産物のスロットブロッ ト（slot blot）にハイブリダイズされる野生型または変異体の配列に対応する 放射標識された対立遺伝子特異的な16〜20マーを用いて、分析を行った。 例えば、図２は、フレームシフトのおよびナンセンスなMEN1変異体の欠失を示 す。ジデオキシフィンガープリント法（ddF）を使用する、MEN1患者および正常 なコントロールにおけるエキソン２の分析は、MEN1変異を示すパターンの差異（ 矢印、図２Ａ）を示した。異なる患者からのエキソン９における異常なddFパタ ーンを、図２Ｂに示す。図２Ａに示されるddFパターンの患者からのクローン化 されたエキソン２のPCR産物の配列決定による、単一のヌクレオチド欠失の同定 は、図２Ｃにおいて示される。示される配列は、アンチセンス鎖であり；変異は 512delCである。このフレームシフト変異は、この患者および２人の罹患した親 族からの、PCR増幅されたエキソン２における新しいAflII部位の存在を検出する ことによって確認した（図２Ｄ）。パネル（Ｂ）からのエキソン９のPCR産物の 直接的な配列決定は、ヘテロ接合体のＣからＴへの（Ｃ→Ｔ）置換の存在を示し た（図２Ｄ）。さらに、配列はアンチセンス鎖であり；変異は、停止コドンを作 製した：TGGからTAGまたはW436X（TGG→TAGまたはW436X）（変異を示す略語は、 標準的な命名法に従う、Beaudet（1993）前出を参照のこと）。 図３は、15人の無関係のMEN1患者（unrelated MEN1 patient）において同定さ れた変異の概略を示す。５つのフレームシフト変異の位置を、番号付けされたエ キソンとともにMEN1遺伝子の図の上部に示す：斜線領域は、翻訳されない。単一 のアミノ酸の２つのインフレーム欠失、３つのナンセンス変異、および１つのミ スセンス変異（W436R）を、遺伝子図の下に示す。416delCおよび512delC変異は 、それぞれ、２回、出現する（encounter）。 図４は、同様な技術を使用して、無関係のMEN1患者において同定された変異の 概略を示す（MEN1変異を示す略語は、標準的な命名法に従う、Beaudet（1993） 前出を参照のこと）。 異常なddFパターンの２つの例を、図２Ａ（エキソン２）および３Ｂ（エキソ ン９）において示す。PCR増幅した材料（図２Ｅ）、またはいくつかの例におい てクローニングした産物（図２Ｃ）の配列決定を使用して、異常性の性質を同定 した。他の罹患した家族のメンバーが、研究のために利用可能である９つの異な る変異（E363delおよびW436Xを除く全て）について、観察される変化がMEN1表現 型と一致して遺伝したことの確認を行った（図２Ｄ）。総計５つのフレームシフ ト変異、３つのナンセンス変異、２つのインフレーム欠失、および１つのミスセ ンス変化が同定された（図３）。２つの変異（416delCおよび512delC）は、関連 することが知られていない家族において２回出現した。ミスセンス変異（W436R ）は、71個の正常なDNAサンプルの分析において観察されなかった。３つの比較 的共通の多型である、L432L（CTG/CTA）、D418D（GAC/GAT）、およびA541T（GCA /ACA）がまた、出現し、そしてそれぞれ、正常な染色体（n=142）の0.7%、42%、 および４%において観察された。 15人の無関係の罹患個体のうちの13人における有意な変異の同定は、多発性内 分泌腺腫瘍１型（MEN1）の原因遺伝子が同定されたことを確立する。検出された 多くの変異（図３）がタンパク質産物の機能喪失を最も生じるであろうという観 察は、腫瘍抑制機構と一致し、そして関連障害の多発性内分泌腺腫瘍２型からME N1を区別する。 実施例２：組換えヒトMEN1遺伝子産物の発現 以下の実施例は、組換えヒトメニンの発現、単離、および特徴づけを詳述する 。この実施例はまた、ヒトメニンポリペプチドに対する抗血清の生成、およびウ エスタンブロットを使用するメニンの特徴付けにおけるその使用を説明する。 ヒトメニンの生成のための昆虫発現系は、本発明のメニンcDNAを含む適切なベ クターでトランスフェクトされたDrosophila Schneider２細胞（Schneider（197 2）J．Embryol．Exp．Morph．27:363-365）を利用する。pMT/V5-Hisベクターを 使用した；これは、挿入（すなわち、メニン)RNAの調節された転写のための誘導 性メタロチオネインプロモーターを含む（Johansen（1989）前出）。pMT/V5-His はまた、メニンタンパク質の精製を容易にするためにメニンのカルボキシ末端に 連結された６つのヒスチジンをコードする配列を含む。pMT/V5-Hisにおける適切 な部位へのメニンcDNAの挿入を容易にする前に、制限部位を、PCRを用いてメニ ンcDNAに付加した。S2細胞は、pMT/V5-Hisメニンベクターで安定にトランスフェ クトされた。選択プラスミドのpCoHYGRO（van der Straten（1989）前出）を、S 2細胞に同時トランスフェクトして、ハイグロマイシンＢの抗生物質選択下で安 定な細胞を生成した。S2細胞を、２mM L-グルタミンを補充したDES発現培地にお いて、23℃で増殖させた。 組換え的に発現されたヒトメニンポリペプチドを特徴付けおよび単離するため に、細胞を収集し、そして50mM Tris HCl（pH7.8）、150mM NaCl、および1% Non idet P-40（Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA）を含む緩衝液中に溶解した。 メニンの分子量を、還元条件下でのSDS-PAGE、続いてゲルのウエスタンブロッ ト分析によって測定した。アミノ酸番号583〜610に対応するメニンペプチドをウ サギに注射することによって、ヒトメニンに特異的な抗血清を作製し；そしてGo ldsmith（1987）J．Biol．Chem．262:14683-14688によって記載されるように精 製した。抗メニンペプチド抗血清でのウエスタンブロット分析は、組換えメニン が、68,000ダルトンの見かけの分子量を有することを示した。 本明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊 行物または特許出願が、参考として援用されるべきであることを、詳細に、およ び個々に示されたかのように、本明細書中で参考として援用される。 前述の発明は、理解の明瞭さの目的のために、説明および例示の手段によって いくらか詳細に記載されたが、本発明の教示を考慮して、特定の変化および変更 が、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらになされ 得ることが当業者には容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 48/00 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 グル，スラダンハリ シー. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル ヒューマン ジノーム リサーチ イ ンスティチュート，ラボラトリー オブ ジーン トランスファー内 (72)発明者 マニクカム，パチャパン アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル ヒューマン ジノーム リサーチ イ ンスティチュート，ラボラトリー オブ ジーン トランスファー内 (72)発明者 コリンズ，フランシス エス. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル ヒューマン ジノーム リサーチ イ ンスティチュート，ラボラトリー オブ ジーン トランスファー内 (72)発明者 エメルト−バック，マイケル アール. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル キャンサー インスティチュート，ラ ボラトリー オブ パソロジー内 (72)発明者 デベレンコ，ラリサ ブイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル キャンサー インスティチュート，ラ ボラトリー オブ パソロジー内 (72)発明者 ルベンスキー，インナ エイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル キャンサー インスティチュート，ラ ボラトリー オブ パソロジー内 (72)発明者 リオッタ，ランス エイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル キャンサー インスティチュート，ラ ボラトリー オブ パソロジー内 (72)発明者 アガーウォル，スニタ ケイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル インスティチュート オブ ダイアベ ッツ アンド ダイジェスティブ アンド キドニー ディジージズ，メタボリック ディジージズ ブランチ内 (72)発明者 スピーゲル，アレン エム. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル インスティチュート オブ ダイアベ ッツ アンド ダイジェスティブ アンド キドニー ディジージズ，メタボリック ディジージズ ブランチ内 (72)発明者 バーンズ，エイ．リー アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル インスティチュート オブ ダイアベ ッツ アンド ダイジェスティブ アンド キドニー ディジージズ，メタボリック ディジージズ ブランチ内 (72)発明者 マルクス，スティーブン ジェイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20892, ベセスダ（番地なし），ナショナル イン スティチュート オブ ヘルス，ナショナ ル インスティチュート オブ ダイアベ ッツ アンド ダイジェスティブ アンド キドニー ディジージズ，メタボリック ディジージズ ブランチ内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．多発性内分泌腺腫瘍１型の存在に関連する単離された核酸または組換え核酸 であって、該核酸が以下： （i）約67.5kDaの計算上の分子量を有する；および （ii） (a) 配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して惹起され る抗体に特異的に結合する；または (b) 配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して少なくと も60％アミノ酸配列同一性を有する、 ように規定されるタンパク質をコードする、単離された核酸または組換え核酸。 ２．非コード配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸または組換え 核酸。 ３．前記非コード配列がイントロンを含む、請求項２に記載の単離された核酸ま たは組換え核酸。 ４．前記配列が配列番号３である、請求項３に記載の単離された核酸または組換 え核酸。 ５．前記核酸配列が、配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して、 少なくとも80％アミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１ に記載の単離された核酸または組換え核酸。 ６．前記核酸配列が、配列番号２に記載の配列を有するメニンタンパク質をコー ドする、請求項５に記載の単離された核酸または組換え核酸。 ７．前記配列が配列番号１である、請求項１に記載の単離された核酸または組換 え核酸。 ８．前記核酸配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号１に特異的にハイブ リダイズする、請求項１に記載の単離された核酸または組換え核酸。 ９．単離された核酸または組換えタンパク質であって、以下： （i）約67.5kDaの計算上の分子量を有する；および （ii） (a) 配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して惹起され る抗体に特異的に結合する；または (b) 配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して少なくと も60％アミノ酸配列同一性を有する、 のように規定される、単離されたタンパク質または組換えタンパク質。 １０．前記タンパク質が、配列番号２に示される配列を有するタンパク質に対し て、少なくとも80％アミノ酸配列同一性を有する、請求項９に記載の単離された タンパク質または組換えタンパク質。 １１．前記タンパク質が、配列番号２に示される配列を有する、請求項１０に記 載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。 １２．配列番号２を含むタンパク質に、免疫学的に反応性の条件下で、特異的に 免疫反応性である、抗体。 １３．タンパク質に、免疫学的に反応性の条件下で、特異的に免疫反応性である 抗体であって、ここで該タンパク質は核酸によってコードされ、 ここで該核酸は、約67.5kDaの計算上の分子量を有する；および（a）配列番号 ２に示される配列を有するタンパク質に対して惹起される抗体に特異的に結合す る；または（b）配列番号２に示される配列を有するタンパク質タンパク質に対 して少なくとも60％アミノ酸同一性を有する、と規定されたタンパク質をコード する、抗体。 １４．ヒト細胞または組織中のメニンの存在を検出するための方法であって、該 方法は以下： （i）生物学的サンプルを、メニンについて試験されるヒトから単離する工程 ； （ii）該生物学的サンプルを、メニン特異的試薬と接触させる工程；および （iii）該サンプルと選択的に結合するメニン特異的試薬のレベルを検出する 工程、を包含する方法。 １５．前記メニン特異的試薬が：メニン特異的抗体、MEN1増幅プライマー、およ びMEN1に選択的に結合する核酸プローブからなる群より選択される、請求項１４ に記載の方法。 １６．前記接触させる工程が、メニン特異的試薬を使用する、請求項１４に記載 の方法。 １７．前記サンプルが単離されたヒトが、多発性内分泌腺腫瘍１型に由来して危 険であると疑われる、請求項１４に記載の方法。 １８．前記接触させる工程が、変異が多発性内分泌腺腫瘍１型と関連付けられた MEN1遺伝子の領域を増幅するMEN1特異的PCRプライマーを使用する、請求項１４ に記載の方法。 １９．試験サンプルにおいて、ヒトメニンを本質的にコードするヌクレオチド配 列における変異の存在または非存在あるいはMEN1対立遺伝子の存在または非存在 を検出するための方法であって、以下の工程： a）MEN1対立遺伝子を欠失しているかまたは該ヒトメニンの変異体形態をコー ドする遺伝子を含むと疑われる該試験サンプルを、野生型遺伝子と該失われた対 立遺伝子もしくは変異体形態との間の識別するのにコンピテントな配列を有する 第１オリゴヌクレオチドと接触させる工程；および b）該遺伝子と該第１オリゴヌクレオチド配列との間の二重鎖の形成を検出す る工程、 を包含する、方法。 ２０．前記第１オリゴヌクレオチドが、該第１ヌクレオチドがMEN1の変異体配列 に結合するハイブリダイゼーション条件下で、前記野生型MEN1遺伝子に結合し得 ない、請求項１９に記載の方法。 ２１．前記接触させる工程が、前記ヒトMEN1遺伝子の一部を増幅させる工程をさ らに包含し、そしてここで前記第１核酸が、MEN1のイントロンに結合するポリメ ラーゼ連鎖反応増幅プライマーである、請求項１９に記載の方法。 ２２．前記接触させる工程が、MEN1の一部を増幅させる工程をさらに包含し、そ してここで前記第１核酸が、MEN1の野生型と変異体形態との間を、対立遺伝子特 異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて識別する、ポリメラーゼ連鎖反応増幅プライ マーである、請求項１９に記載の方法。 ２３．前記第１核酸が、前記ヒトメニン遺伝子をコードするゲノムDNAのエキソ ンまたはイントロンのいずれかに結合する、請求項１９に記載の方法。 ２４．試験サンプルにおいて、メニンをコードする野生型対立遺伝子に対応する ヌクレオチド配列における変異の存在または非存在を検出するためのキットであ って、以下： a）第１オリゴヌクレオチド配列を保持し、それによって該第１ヌクレオチド 配列が、野生型遺伝子と変異体形態との間を識別し得る、容器；および b）遺伝子と該第１オリゴヌクレオチド配列との間の二重鎖の形成を検出する ための試薬を保持する容器、 を含む、キット。 ２５．試験サンプルにおいて、メニンを本質的にコードするヌクレオチド配列に おける変異の存在または非存在を検出するためのキットであって、以下： a）第１ヌクレオチド配列を保持し、それによって該第１ヌクレオチド配列が 、野生型と変異体形態との間を識別し得る、容器；および b）遺伝子と該第１オリゴヌクレオチド配列との間の二重鎖の形成を検出する ための試薬を保持する容器、 を含む、キット ２６．MEN1を含むヒトゲノムDNA配列に特異的に結合する増幅プライマー対をさ らに含む、請求項２５に記載のキット。 ２７．多発性内分泌腺腫瘍１型についての危険なヒトにおいてメニンの存在また は非存在を検出するためのキットであって、メニンに特異的な抗体を含む第１容 器、および該第１容器中の該メニン特異的抗体に特異的に結合する抗体を含む第 ２容器、を含むキット。 ２８．前記抗体が、野生型メニンタンパク質の存在を検出し得る、請求項２５に 記載のキット。 ２９．前記抗体が、変異したメニンタンパク質の存在を検出し得る、請求項２５ に記載のキット。 ３０．メニンタンパク質またはその配列をコードする異種核酸を含む、トランス フェクト細胞。 ３１．外因性核酸配列が導入されているトランスフェクト細胞であって、該外因 性核酸が、ストリンジェントな条件下で核酸に特異的にハイブリダイズし、該核 酸が以下： 配列番号１または配列番号３に示される拡散配列：または 約67.5kDaの計算上の分子量を有し；および（a）配列番号２に示される配列を 有するタンパク質に対して惹起される抗体に特異的に結合する；または（b）配 列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して少なくとも60％アミノ酸配 列同一性を有する、と規定されるタンパク質をコードする核酸；ならびに 該細胞がメニンタンパク質のような外因性核酸を発現する、トランスフェクト 細胞。 ３２．前記異種または外因性核酸が、配列番号１または配列番号３に示される核 酸を含む、請求項３０または３１に記載のトランスフェクト細胞。 ３３．前記細胞がヒト細胞である、請求項３０または３１に記載のトランスフェ クト細胞。 ３４．外因性核酸配列が導入されている生物であって、該外因性核酸が、以下： 配列番号１に示される配列；または 約67.5kDaの計算上の分子量を有し；および（a）配列番号２に示される配列を 有するタンパク質に対して惹起される抗体に特異的に結合する；または（b）配 列番号２に示される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも60％アミノ酸 配列同一性を有する、と規定されるタンパク質をコードする核酸； を有する核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、ならび に 該生物がメニンタンパク質のような外因性核酸を発現する、生物 ３５．前記外因性核酸が、配列番号１または配列番号３に示される核酸を含む、 請求項３４に記載の生物。 ３６．メニンポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットであって、該核 酸がプロモーターに作動可能に連結され、そしてメニンポリペプチドをコードす る核酸を含む、発現カセット。 ３７．発現ベクターをさらに含む、請求項３６に記載の発現カセット。