JP2001520890A - 機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる核酸配列および（ポリ）ペプチドを得、同定し、応用するための新規方法 - Google Patents
機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる核酸配列および（ポリ）ペプチドを得、同定し、応用するための新規方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、（ポリ）ペプチドとペリプラズム性タンパク質の同時発現により機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列を得る方法に関する。本発明は該（ポリ）ペプチドの同定方法も提供する。さらに本発明は、（ポリ）ペプチド、例えばＳｋｐ、ＦｋｐＡ、またはＳｋｐもしくはＦｋｐＡの相同体を細菌中で同時発現させることにより機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる方法に関する。
Description
【０００１】 本発明は、（ポリ）ペプチドとペリプラズム性タンパク質の同時発現により機
能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる（ポリ）ペプチドをコ
ードする核酸配列を得る方法に関する。本発明は、該（ポリ）ペプチドを同定す
るための方法も提供する。さらに、本発明は、細菌において（ポリ）ペプチド、
例えば、Ｓｋｐ、ＦｋｐＡ、またはＳｋｐもしくはＦｋｐＡの相同体を同時発現
させることにより機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる方
法に関する。 細菌ペリプラズムにおける発現は、細菌のジスルフィド形成および異性体化機
構（Barswell, 1994)を利用することができるので、外来組換えタンパク質、特 にジスルフィド含有タンパク質を発現させるのに最も好都合な経路である。しか
しながら、E.coliペリプラズム中ですべてのタンパク質を高い機能的収量で産生
させることができるわけではなく、該ペリプラズム中に分泌される機能形の不完
全にホールディングされたタンパク質の発現を最適化する一般的な方法は存在し
ない。
能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる（ポリ）ペプチドをコ
ードする核酸配列を得る方法に関する。本発明は、該（ポリ）ペプチドを同定す
るための方法も提供する。さらに、本発明は、細菌において（ポリ）ペプチド、
例えば、Ｓｋｐ、ＦｋｐＡ、またはＳｋｐもしくはＦｋｐＡの相同体を同時発現
させることにより機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる方
法に関する。 細菌ペリプラズムにおける発現は、細菌のジスルフィド形成および異性体化機
構（Barswell, 1994)を利用することができるので、外来組換えタンパク質、特 にジスルフィド含有タンパク質を発現させるのに最も好都合な経路である。しか
しながら、E.coliペリプラズム中ですべてのタンパク質を高い機能的収量で産生
させることができるわけではなく、該ペリプラズム中に分泌される機能形の不完
全にホールディングされたタンパク質の発現を最適化する一般的な方法は存在し
ない。
【０００２】 該ペリプラズムにおけるタンパク質の正しいホールディングが極めて重要であ
る別の領域はファージ表現である。この方法は、過去１０年間にわたり、ペプチ
ドだけでなく広範囲のタンパク質のライブラリーをスクリーニングするのに用い
られてきた（Dunn, 1996, McGregor, 1996 )。この表現されたタンパク質はファ
ージコートタンパク質、例えば、完全遺伝子−３−タンパク質（ｇ３Ｐ）のＮ−
末端またはそのＣ−末端ドメインと融合する。したがって、該タンパク質は、フ
ァージコート中に組み込まれる前に、ｇ３ｐのＣ−末端疎水性伸長部により内膜
に固定されたままでペリプラズム中でホールドされる。したがって、ｇ３ｐ融合
タンパク質は、ペリプラズム性に発現するタンパク質と同じ環境でほぼ確実にホ
ールドされ、同じ機構で用いられよう。不完全にホールドされたタンパク質はそ
の結合特性にも関わらず、複数回のスクリーニングにおいておそらくほぼ失われ
るだろう。Ｆａｂ表現のためのＭ１３ファージの組み立て時における細胞質チャ
ペロニン（chaperonin）ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳの同時発現は、ファージ力価を
２００倍増加させると報告された（Soederlind, 1993）。しかしながら、ファー
ジ粒子により表現される機能的抗体断片の相対量には影響がなかった。ＧｒｏＥ
Ｌ／ＧｒｏＥＳはファージパッキングおよび組み立てを助けるが、これら工程は
ペリプラズムで生じると推定された。ファージにおけるタンパク質の機能的発現
を増加させるのに利用できる一般的方法はまだない。
る別の領域はファージ表現である。この方法は、過去１０年間にわたり、ペプチ
ドだけでなく広範囲のタンパク質のライブラリーをスクリーニングするのに用い
られてきた（Dunn, 1996, McGregor, 1996 )。この表現されたタンパク質はファ
ージコートタンパク質、例えば、完全遺伝子−３−タンパク質（ｇ３Ｐ）のＮ−
末端またはそのＣ−末端ドメインと融合する。したがって、該タンパク質は、フ
ァージコート中に組み込まれる前に、ｇ３ｐのＣ−末端疎水性伸長部により内膜
に固定されたままでペリプラズム中でホールドされる。したがって、ｇ３ｐ融合
タンパク質は、ペリプラズム性に発現するタンパク質と同じ環境でほぼ確実にホ
ールドされ、同じ機構で用いられよう。不完全にホールドされたタンパク質はそ
の結合特性にも関わらず、複数回のスクリーニングにおいておそらくほぼ失われ
るだろう。Ｆａｂ表現のためのＭ１３ファージの組み立て時における細胞質チャ
ペロニン（chaperonin）ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳの同時発現は、ファージ力価を
２００倍増加させると報告された（Soederlind, 1993）。しかしながら、ファー
ジ粒子により表現される機能的抗体断片の相対量には影響がなかった。ＧｒｏＥ
Ｌ／ＧｒｏＥＳはファージパッキングおよび組み立てを助けるが、これら工程は
ペリプラズムで生じると推定された。ファージにおけるタンパク質の機能的発現
を増加させるのに利用できる一般的方法はまだない。
【０００３】 したがって、ペリプラズム性チャペロン（chaperone）の存在の問題には大き な興味が持たれる。しかしながら、よく特徴づけられたE.coli、ＤｎａＫ／Ｄｎ
ａＪ／ＧｒｐＥおよびＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳの細胞質機構、ならびに考えられ
るその他の機構（Makrides, 1996; Martin & Hartl, 1997; Buchner, 1996; EP0
774512 A3）とは異なり、該ペリプラズムのチャペロン組成は完全には理解され ていない(Wall & Plueckthun,1995; Missiakasら, 1996）。ペリプラズム性スト
レスのシグナル形質導入の解明は進歩してきており（Missiakas & Raina, 1997 ）、ＦｋｐＡまたはＳｕｒＡのようないくつかのタンパク質は、全体的にペリプ
ラズム性ホールディングの触媒として作用すると考えられたが（Missiakasら、1
996）、ペリプラズム性ホールディングを制御する最終的なエフェクター分子は 不明のままである。ＦｋｐＡは、最初、高分子脂質のＦＫ５０６により阻害され
ることがわかっているよく特徴づけられたペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａ
ｎｓイソメラーゼ（ＰＰＩ）のクラスである真核性ＦＫ５０６結合タンパク質（
ＦＫＢＰ）（HorneおよびYound、1995）と非常に類似したものとして記載された
。Missiakasらは、成熟ＦｋｐＡがペリプラズムに局在することを示し、その活 性をアッセイした（Missiakasら, 1996）。サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒ ｏ−Ｐｈｅ−４−ニトロアニリドを基質として用いるＡｌａ−Ｐｒｏ−ペプチジ
ル−プロリル結合のｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化反応の推定Ｋｃａｔ／Ｋｍは９０
ｍＭ−１ｓ−１であった。ＦｋｐＡは、そのプロモーター領域に結合するσEに より直接制御される（DaneseおよびSilhavy, 1997）。σE経路は、外膜タンパク
質（ＯＭＰ）の過剰発現やｓｕｒＡ遺伝子の不活化といったＯＭＰのミスホール
ディングや間違った組み立てを生じる条件および加熱ストレスにより誘導される
。
ａＪ／ＧｒｐＥおよびＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳの細胞質機構、ならびに考えられ
るその他の機構（Makrides, 1996; Martin & Hartl, 1997; Buchner, 1996; EP0
774512 A3）とは異なり、該ペリプラズムのチャペロン組成は完全には理解され ていない(Wall & Plueckthun,1995; Missiakasら, 1996）。ペリプラズム性スト
レスのシグナル形質導入の解明は進歩してきており（Missiakas & Raina, 1997 ）、ＦｋｐＡまたはＳｕｒＡのようないくつかのタンパク質は、全体的にペリプ
ラズム性ホールディングの触媒として作用すると考えられたが（Missiakasら、1
996）、ペリプラズム性ホールディングを制御する最終的なエフェクター分子は 不明のままである。ＦｋｐＡは、最初、高分子脂質のＦＫ５０６により阻害され
ることがわかっているよく特徴づけられたペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａ
ｎｓイソメラーゼ（ＰＰＩ）のクラスである真核性ＦＫ５０６結合タンパク質（
ＦＫＢＰ）（HorneおよびYound、1995）と非常に類似したものとして記載された
。Missiakasらは、成熟ＦｋｐＡがペリプラズムに局在することを示し、その活 性をアッセイした（Missiakasら, 1996）。サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒ ｏ−Ｐｈｅ−４−ニトロアニリドを基質として用いるＡｌａ−Ｐｒｏ−ペプチジ
ル−プロリル結合のｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化反応の推定Ｋｃａｔ／Ｋｍは９０
ｍＭ−１ｓ−１であった。ＦｋｐＡは、そのプロモーター領域に結合するσEに より直接制御される（DaneseおよびSilhavy, 1997）。σE経路は、外膜タンパク
質（ＯＭＰ）の過剰発現やｓｕｒＡ遺伝子の不活化といったＯＭＰのミスホール
ディングや間違った組み立てを生じる条件および加熱ストレスにより誘導される
。
【０００４】 ペリプラズム性ホールディングおよびタンパク質輸送の面から議論されてきた
別のタンパク質はＳｋｐである。Ｓｋｐは、最初に間違ってＤＮＡ結合タンパク
質と分類され（Holckら、1987）、後に外膜関連タンパク質とされた（Hirvasら 、1990、Koskiら、1990、Koskiら、1989）きわめて塩基性のタンパク質であるが
、種々の同意語（ＯｍｐＨ、ＨｌｐＡ）がその未知の機能を物語っている。類似
体が、Salmonella typhimurium (Koskiら、1990、Koskiら、1989）、Yersinia e
nterocolitica (Hirvasら、1991）、Yersinia pseudotuberculosis(Vuorioら、1
991）、Haemophilus influenzae (Fleischmannら、1995）、およびPasteurella
moltocida (Delamarcheら、1995）に見いだされた。Muellerと共同研究者ら（Th
omeら、1990）は、このタンパク質がE.coliタンパク質の膜ベジクルへのin vitr
o輸入を促進することを示し、次いで、その可溶性およびシグナル配列の存在と 一致する、そのペリプラズムにおける局在を確証した（Thome & Mueller, 1991)
。より最近になって、外膜タンパク質が輸送に関与することが提唱され（Chen &
Henning, 1996)、またそのプロモーター領域がTn10トランスポゾンにより遮断 されると極度の熱ショック因子σE（σ24）依存性反応が誘導された（Missiakas
ら、1996）。しかしながら、これがＳｋｐがないことによる作用であるのか、ｓ
ｋｐの下流に位置する他のタンパク質に対する極性作用であるのかはまだわかっ
ていない。熱ショック反応は、おそらくσE（σ24）を誘導することが知られて いる（Missiakasら,1996）外膜タンパク質の濃度変化により間接的に誘導された
。
別のタンパク質はＳｋｐである。Ｓｋｐは、最初に間違ってＤＮＡ結合タンパク
質と分類され（Holckら、1987）、後に外膜関連タンパク質とされた（Hirvasら 、1990、Koskiら、1990、Koskiら、1989）きわめて塩基性のタンパク質であるが
、種々の同意語（ＯｍｐＨ、ＨｌｐＡ）がその未知の機能を物語っている。類似
体が、Salmonella typhimurium (Koskiら、1990、Koskiら、1989）、Yersinia e
nterocolitica (Hirvasら、1991）、Yersinia pseudotuberculosis(Vuorioら、1
991）、Haemophilus influenzae (Fleischmannら、1995）、およびPasteurella
moltocida (Delamarcheら、1995）に見いだされた。Muellerと共同研究者ら（Th
omeら、1990）は、このタンパク質がE.coliタンパク質の膜ベジクルへのin vitr
o輸入を促進することを示し、次いで、その可溶性およびシグナル配列の存在と 一致する、そのペリプラズムにおける局在を確証した（Thome & Mueller, 1991)
。より最近になって、外膜タンパク質が輸送に関与することが提唱され（Chen &
Henning, 1996)、またそのプロモーター領域がTn10トランスポゾンにより遮断 されると極度の熱ショック因子σE（σ24）依存性反応が誘導された（Missiakas
ら、1996）。しかしながら、これがＳｋｐがないことによる作用であるのか、ｓ
ｋｐの下流に位置する他のタンパク質に対する極性作用であるのかはまだわかっ
ていない。熱ショック反応は、おそらくσE（σ24）を誘導することが知られて いる（Missiakasら,1996）外膜タンパク質の濃度変化により間接的に誘導された
。
【０００５】 しかしながら、E.coliジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＡおよび／またはプロ
リンｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＰＰＩａｓｅＡの過剰発現により機能形の
抗体断片の発現を増加させる試みにおいて、ホールディング限界の有意な変化は
みられなかった（Knappikら、1993)。ペリプラズムにおける凝集工程は、ペリプ
ラズム性ホールディングと競合し、ジスルフィド形成および／またはプロリンｃ
ｉｓ−ｔｒａｎｓ異性体化が生じる前に生じ、その程度とは無関係であると結論
された。 まとめとして、明らかにペリプラズム性チャペロンとして作用し、機能形のペ
リプラズム性タンパク質の発現収量を最適化するのに用い得るタンパク質は現在
のところ同定されていない。 すなわち、本発明の根本的な技術的課題は、細菌において機能形のペリプラズ
ム性タンパク質の発現収量を増加させる因子を同定し、この因子を、ペリプラズ
ム性タンパク質の発現の最適化に応用することである。上記技術的課題の解決は
、クレームに特徴づけられた態様を提供することにより達成される。したがって
、本発明により、機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる（
ポリ）ペプチドをコードする核酸配列を同定および応用し、そして／または該（
ポリ）ペプチドを同定および応用することができる。本発明の技術的アプローチ
、すなわち、そのような核酸配列および／または（ポリ）ペプチドをスクリーニ
ングまたは選択するための宿主細胞コレクションにおける（ポリ）ペプチドコレ
クションとペリプラズム性タンパク質の同時発現は、先行技術には開示も示唆も
されていない。
リンｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＰＰＩａｓｅＡの過剰発現により機能形の
抗体断片の発現を増加させる試みにおいて、ホールディング限界の有意な変化は
みられなかった（Knappikら、1993)。ペリプラズムにおける凝集工程は、ペリプ
ラズム性ホールディングと競合し、ジスルフィド形成および／またはプロリンｃ
ｉｓ−ｔｒａｎｓ異性体化が生じる前に生じ、その程度とは無関係であると結論
された。 まとめとして、明らかにペリプラズム性チャペロンとして作用し、機能形のペ
リプラズム性タンパク質の発現収量を最適化するのに用い得るタンパク質は現在
のところ同定されていない。 すなわち、本発明の根本的な技術的課題は、細菌において機能形のペリプラズ
ム性タンパク質の発現収量を増加させる因子を同定し、この因子を、ペリプラズ
ム性タンパク質の発現の最適化に応用することである。上記技術的課題の解決は
、クレームに特徴づけられた態様を提供することにより達成される。したがって
、本発明により、機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる（
ポリ）ペプチドをコードする核酸配列を同定および応用し、そして／または該（
ポリ）ペプチドを同定および応用することができる。本発明の技術的アプローチ
、すなわち、そのような核酸配列および／または（ポリ）ペプチドをスクリーニ
ングまたは選択するための宿主細胞コレクションにおける（ポリ）ペプチドコレ
クションとペリプラズム性タンパク質の同時発現は、先行技術には開示も示唆も
されていない。
【０００６】 すなわち、本発明は、（ポリ）ペプチドとペリプラズム性タンパク質の同時発
現により細菌において機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させ
る（ポリ）ペプチドをコードする配列を含む核酸配列を得るための方法であって
、 （ａ）各細胞が（ｉ）核酸配列コレクション中の第一核酸配列および （ii）該ペリプラズム性タンパク質をコードする第二核酸配列を含む宿主細胞コ
レクションを得、 （ｂ）（ｉ）該核酸配列コレクションから発現し得る（ポリ）ペプチドおよび （ii）該第二核酸配列から発現し得るペリプラズム性タンパク質の発現を引き起
こすかまたは許し、 （ｃ）発現する該ペリプラズム性タンパク質の機能的収量が増加している宿主細
胞をスクリーニングまたは選択し、 （ｄ）所望により、工程（ｃ）を１回またはそれ以上反復し、 （ｅ）該宿主細胞中に含まれる第一核酸配列を得る工程を含む方法に関する。
現により細菌において機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させ
る（ポリ）ペプチドをコードする配列を含む核酸配列を得るための方法であって
、 （ａ）各細胞が（ｉ）核酸配列コレクション中の第一核酸配列および （ii）該ペリプラズム性タンパク質をコードする第二核酸配列を含む宿主細胞コ
レクションを得、 （ｂ）（ｉ）該核酸配列コレクションから発現し得る（ポリ）ペプチドおよび （ii）該第二核酸配列から発現し得るペリプラズム性タンパク質の発現を引き起
こすかまたは許し、 （ｃ）発現する該ペリプラズム性タンパク質の機能的収量が増加している宿主細
胞をスクリーニングまたは選択し、 （ｄ）所望により、工程（ｃ）を１回またはそれ以上反復し、 （ｅ）該宿主細胞中に含まれる第一核酸配列を得る工程を含む方法に関する。
【０００７】 本明細書で用いている用語「核酸配列を得る」には、例えば、例えばベクター
に含まれる核酸分子を生化学技術によりシーケンシングおよび／または回収する
ことにより核酸分子の少なくとも部分を同定することが含まれる。 本発明の文脈において、用語「（ポリ）ペプチド」は、１本鎖またはそれ以上
の、複合、すなわちペプチド結合で結合した２またはそれ以上のアミノ酸からな
る分子を示す。 用語「タンパク質」は、（ポリ）ペプチドの少なくとも部分が（ポリ）ペプチ
ド鎖間および／または（ポリ）ペプチド鎖内で二次、三次、または四次構造を形
成することにより一定の３次元配列を持つか、得ることができる（ポリ）ペプチ
ドを表す。この定義には、天然の、または少なくとも部分が人工的なタンパク質
、および上記の一定の３次元配列を有する、完全タンパク質の断片またはドメイ
ンのようなタンパク質が含まれる。 用語「ペリプラズム性タンパク質」は、細胞質中で生合成され、次いで、内膜
を通過してペリプラズムに移動するタンパク質を表す。この定義には、ペリプラ
ズム中で可溶性または結合（associated)形のままであるか、内膜または外膜に 挿入されるか、さらに媒質中に分泌されるか、または糸状ファージ粒子のような
複合構造に組み立てられ、次いで分泌されるタンパク質が含まれる。ペリプラズ
ム性タンパク質は、必ずではないが通常、該タンパク質をペリプラズムに導く少
なくとも輸送シグナルを有するであろう。 用語「機能形のペリプラズム性タンパク質」は、一定の機能を持ち、該タンパ
ク質が機能性であるのに必要な一定の３次元配列を生じるように発現中および発
現後にホールドされるペリプラズム性タンパク質を表す。本発明において「一定
の機能」は、正しくホールディングされた３次元配列に依存し、検出または測定
され得るタンパク質のあらゆる特徴である。これには、レセプター／リガンドも
しくは抗体／抗原ペアの場合のような酵素活性、すなわち標的もしくはパートナ
ーとの結合といった機能を含む。さらに、本発明の文脈において、本明細書にお
いて先に記載の該「特徴」は、例えば、該タンパク質の適切に組み立てられた３
次元配列を認識する抗体によるか、または蛍光もしくはＣＤスペクトルを用いる
蛍光もしくはα−へリックスの程度といった物理化学特性を測定することにより
検出または測定される正しくホールドされた３次元配列自身の存在であってよい
。 用語「機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量」は、発現において機能
形で産生されるペリプラズム性タンパク質の量を表す。 用語「該第一核酸配列から発現し得る（ポリ）ペプチド」は、オープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）が該第一核酸配列上に存在し、好ましくは発現に必要
なオペレーターエレメントが該核酸配列を含む対応するベクター上に存在する（
ポリ）ペプチドを表す。該核酸配列がゲノムＤＮＡの断片を含む場合は、１以上
のＯＲＦがいずれの該核酸配列に含まれていてよい。 用語「機能的収量」は、機能形で産生される該ペリプラズム性タンパク質の量
を表す。発現させる核酸配列を設計し、作製し、もしくは得、適切なベクターを
構築し、核酸配列をベクターに挿入し、適切な宿主細胞を選び、ベクターを宿主
細胞内に導入し、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質の発現を引き起こすかもし
くは許し、宿主細胞から核酸を単離するか、または核酸配列および対応するタン
パク質配列を同定する方法は当業者によく知られた標準的方法（Sambrookら、19
89）である。
に含まれる核酸分子を生化学技術によりシーケンシングおよび／または回収する
ことにより核酸分子の少なくとも部分を同定することが含まれる。 本発明の文脈において、用語「（ポリ）ペプチド」は、１本鎖またはそれ以上
の、複合、すなわちペプチド結合で結合した２またはそれ以上のアミノ酸からな
る分子を示す。 用語「タンパク質」は、（ポリ）ペプチドの少なくとも部分が（ポリ）ペプチ
ド鎖間および／または（ポリ）ペプチド鎖内で二次、三次、または四次構造を形
成することにより一定の３次元配列を持つか、得ることができる（ポリ）ペプチ
ドを表す。この定義には、天然の、または少なくとも部分が人工的なタンパク質
、および上記の一定の３次元配列を有する、完全タンパク質の断片またはドメイ
ンのようなタンパク質が含まれる。 用語「ペリプラズム性タンパク質」は、細胞質中で生合成され、次いで、内膜
を通過してペリプラズムに移動するタンパク質を表す。この定義には、ペリプラ
ズム中で可溶性または結合（associated)形のままであるか、内膜または外膜に 挿入されるか、さらに媒質中に分泌されるか、または糸状ファージ粒子のような
複合構造に組み立てられ、次いで分泌されるタンパク質が含まれる。ペリプラズ
ム性タンパク質は、必ずではないが通常、該タンパク質をペリプラズムに導く少
なくとも輸送シグナルを有するであろう。 用語「機能形のペリプラズム性タンパク質」は、一定の機能を持ち、該タンパ
ク質が機能性であるのに必要な一定の３次元配列を生じるように発現中および発
現後にホールドされるペリプラズム性タンパク質を表す。本発明において「一定
の機能」は、正しくホールディングされた３次元配列に依存し、検出または測定
され得るタンパク質のあらゆる特徴である。これには、レセプター／リガンドも
しくは抗体／抗原ペアの場合のような酵素活性、すなわち標的もしくはパートナ
ーとの結合といった機能を含む。さらに、本発明の文脈において、本明細書にお
いて先に記載の該「特徴」は、例えば、該タンパク質の適切に組み立てられた３
次元配列を認識する抗体によるか、または蛍光もしくはＣＤスペクトルを用いる
蛍光もしくはα−へリックスの程度といった物理化学特性を測定することにより
検出または測定される正しくホールドされた３次元配列自身の存在であってよい
。 用語「機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量」は、発現において機能
形で産生されるペリプラズム性タンパク質の量を表す。 用語「該第一核酸配列から発現し得る（ポリ）ペプチド」は、オープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）が該第一核酸配列上に存在し、好ましくは発現に必要
なオペレーターエレメントが該核酸配列を含む対応するベクター上に存在する（
ポリ）ペプチドを表す。該核酸配列がゲノムＤＮＡの断片を含む場合は、１以上
のＯＲＦがいずれの該核酸配列に含まれていてよい。 用語「機能的収量」は、機能形で産生される該ペリプラズム性タンパク質の量
を表す。発現させる核酸配列を設計し、作製し、もしくは得、適切なベクターを
構築し、核酸配列をベクターに挿入し、適切な宿主細胞を選び、ベクターを宿主
細胞内に導入し、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質の発現を引き起こすかもし
くは許し、宿主細胞から核酸を単離するか、または核酸配列および対応するタン
パク質配列を同定する方法は当業者によく知られた標準的方法（Sambrookら、19
89）である。
【０００８】 好ましい態様において、本発明の方法は、さらに該第一核酸配列に含まれる（
ポリ）ペプチドをコードする配列を同定する工程を含む。 用語「該第一核酸配列に含まれる（ポリ）ペプチドをコードする配列を同定す
る」は、１以上のＯＲＦが該第一核酸配列中に存在する、本明細書において先に
記載の状況を示す。１またはそれ以上のＯＲＰがみいだされるときは、同定には
、所望により、個々のＯＲＰを分析し、必要であればさらに、個々のＯＲＰを別
個に表す核酸配列のセットを用いて工程（ａ）〜（ｅ）を反復するようなさらな
る試験を含む。該さらなる試験は当業者が実施することができる。 さらなる好ましい態様において、該ペリプラズム性タンパク質は、標準的条件
下、すなわち、該（ポリ）ペプチドを同時発現させることなく発現させたとき、
機能形では発現し得ないかまたは非常に低収量である。
ポリ）ペプチドをコードする配列を同定する工程を含む。 用語「該第一核酸配列に含まれる（ポリ）ペプチドをコードする配列を同定す
る」は、１以上のＯＲＦが該第一核酸配列中に存在する、本明細書において先に
記載の状況を示す。１またはそれ以上のＯＲＰがみいだされるときは、同定には
、所望により、個々のＯＲＰを分析し、必要であればさらに、個々のＯＲＰを別
個に表す核酸配列のセットを用いて工程（ａ）〜（ｅ）を反復するようなさらな
る試験を含む。該さらなる試験は当業者が実施することができる。 さらなる好ましい態様において、該ペリプラズム性タンパク質は、標準的条件
下、すなわち、該（ポリ）ペプチドを同時発現させることなく発現させたとき、
機能形では発現し得ないかまたは非常に低収量である。
【０００９】 別の態様において、本発明は、ペリプラズム性タンパク質が耐性マーカー、栄
養性マーカー、レポータータンパク質、マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝
子の転写のトランスアクチベーター、または標的と結合するタンパク質である方
法に関する。本明細書において先に工程（ｃ）に記載したように、機能的収量は
タンパク質機能の増加に関してスクリーニングまたは選択することにより決定さ
れる。 該タンパク質が、ペリプラズム中に機能的に存在するときにある抗生物質に耐
性を生じるβ−ラクタマーゼやゼオシンのようなペリプラズ性耐性マーカーであ
るときは、該抗生物質の存在下で宿主細胞を培養することにより選択することが
できる。機能形のマーカーを発現する宿主細胞が選択されよう。 該タンパク質がマルトース結合タンパク質またはアミノ酸結合タンパク質のよ
うなペリプラズム性栄養性マーカーである場合は、栄養要求性宿主細胞を用い、
それぞれマルトースまたはアミノ酸の存在下で該細胞を培養することにより選択
することができる。機能形のマーカーを発現する宿主細胞が選択されよう。該タ
ンパク質がアルカリホスファターゼのようなペリプラズム性レポータータンパク
質である場合は、着色反応を生じる対応基質の存在下で宿主細胞を培養すること
によりスクリーニングすることができる。機能形の該レポータータンパク質を発
現する宿主細胞が選ばれよう。 タンパク質が酵素活性を有するか、または標的と結合する分泌タンパク質であ
る場合は、個々の細胞培養上清またはプレート上の宿主細胞のコレクションのス
クリーニングは、それぞれ培地に適切な基質または標的を加え、分泌された機能
的タンパク質の量を測定もしくは決定することにより行うことができる。 当業者は過度な負担なしに、例えば、種々の知られたＥＬＩＳＡの形式に基づ
き存在するスクリーニングまたは選択プロトコールを確認し、適用することによ
り、スクリーニングまたは選択すべき個々のタンパク質および対応する機能に適
したプロトコールに達することができるであろう。さらなる好ましい態様におい
て、該第一核酸配列は、有機体のゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはｃＤＮ
Ａであるか、それらから誘導される。
養性マーカー、レポータータンパク質、マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝
子の転写のトランスアクチベーター、または標的と結合するタンパク質である方
法に関する。本明細書において先に工程（ｃ）に記載したように、機能的収量は
タンパク質機能の増加に関してスクリーニングまたは選択することにより決定さ
れる。 該タンパク質が、ペリプラズム中に機能的に存在するときにある抗生物質に耐
性を生じるβ−ラクタマーゼやゼオシンのようなペリプラズ性耐性マーカーであ
るときは、該抗生物質の存在下で宿主細胞を培養することにより選択することが
できる。機能形のマーカーを発現する宿主細胞が選択されよう。 該タンパク質がマルトース結合タンパク質またはアミノ酸結合タンパク質のよ
うなペリプラズム性栄養性マーカーである場合は、栄養要求性宿主細胞を用い、
それぞれマルトースまたはアミノ酸の存在下で該細胞を培養することにより選択
することができる。機能形のマーカーを発現する宿主細胞が選択されよう。該タ
ンパク質がアルカリホスファターゼのようなペリプラズム性レポータータンパク
質である場合は、着色反応を生じる対応基質の存在下で宿主細胞を培養すること
によりスクリーニングすることができる。機能形の該レポータータンパク質を発
現する宿主細胞が選ばれよう。 タンパク質が酵素活性を有するか、または標的と結合する分泌タンパク質であ
る場合は、個々の細胞培養上清またはプレート上の宿主細胞のコレクションのス
クリーニングは、それぞれ培地に適切な基質または標的を加え、分泌された機能
的タンパク質の量を測定もしくは決定することにより行うことができる。 当業者は過度な負担なしに、例えば、種々の知られたＥＬＩＳＡの形式に基づ
き存在するスクリーニングまたは選択プロトコールを確認し、適用することによ
り、スクリーニングまたは選択すべき個々のタンパク質および対応する機能に適
したプロトコールに達することができるであろう。さらなる好ましい態様におい
て、該第一核酸配列は、有機体のゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはｃＤＮ
Ａであるか、それらから誘導される。
【００１０】 該ゲノムＤＮＡが無作為に断片化している方法がさらに好ましい。ゲノムＤＮ
Ａは、制限酵素もしくはＤＮＡ開裂酵素、化学的開裂、機械的剪断、または超音
波処理を用いることにより断片化することができる。これらは当業者によく知ら
れた標準的方法である（Sambrookら, 1989）。 本発明のさらに好ましい態様において、該第一核酸配列は少なくとも部分的に
無作為化された配列を含む。そのような少なくとも部分的に無作為化された配列
は当業者によく知られた種々の方法、例えば、モノヌクレオチドまたはトリヌク
レオチドの混合物を用いるランダムＤＮＡ合成法（Virnekaesら、1994）により 作製することができる。本発明に従って用いることができるランダムペプチドま
たは抗体ライブラリーをコードする核酸配列のコレクションの多くの例がある。
Ａは、制限酵素もしくはＤＮＡ開裂酵素、化学的開裂、機械的剪断、または超音
波処理を用いることにより断片化することができる。これらは当業者によく知ら
れた標準的方法である（Sambrookら, 1989）。 本発明のさらに好ましい態様において、該第一核酸配列は少なくとも部分的に
無作為化された配列を含む。そのような少なくとも部分的に無作為化された配列
は当業者によく知られた種々の方法、例えば、モノヌクレオチドまたはトリヌク
レオチドの混合物を用いるランダムＤＮＡ合成法（Virnekaesら、1994）により 作製することができる。本発明に従って用いることができるランダムペプチドま
たは抗体ライブラリーをコードする核酸配列のコレクションの多くの例がある。
【００１１】 さらに好ましい態様において、本発明は、 （ａ）該第一核酸配列が糸状ファージ粒子中にパッケージされ得るベクターに含
まれ、 （ｂ）該ペリプラズム性タンパク質が糸状ファージコートタンパク質の少なくと
も部分とさらなるタンパク質の融合タンパク質であり、該発現の過程で、該さら
なるタンパク質を表現する糸状ファージ粒子のコレクションが該宿主細胞コレク
ションから作製される方法に関する。 用語「該さらなるタンパク質を表現する糸状ファージ粒子」は、過去１０年間
に開発され広く用いられているファージ表現方法により作製される粒子を表す。
該方法において、外来（ポリ）ペプチドまたはタンパク質は、一般的にファージ
、ほとんどの場合Ｍ１３、ｆ１、もしくはｆｄのような糸状ファージのコートタ
ンパク質と融合することにより、該ファージはその表面に該外来（ポリ）ペプチ
ドまたはタンパク質を表現する。ファージ表現の最も重要な局面は種々の出版物
にまとめられている（例えば、Kayら、1996）。 本発明のさらなる態様において、該第一核酸配列を含むベクターはファージベ
クターまたはファージミッドベクターである。後者では、ヘルパーファージはフ
ァージミッドベクターにコードされないファージタンパク質を供給するのに用い
られる。 本発明の別の態様において、ファージコートタンパク質はｇＶIｐ、ｇＶIIIｐ
、または好ましくはｇIIIｐである。 本発明の好ましい態様において、表現タンパク質と、同起源の結合パートナー
との結合がスクリーニングまたは選択される。該タンパク質が抗体である場合は
、該同起源の結合パートナーは対応抗原（およびその逆）である。レセプターの
場合は、同起源の結合パートナーはリガンド（およびその逆）である。本発明の
方法のこの態様の具体的な利点は、選択されたファージ粒子は宿主細胞の感染に
用いることができ、増幅させることができるため、機能的収量の増加をもたらす
希な事象を選択できることである。 さらなる別の態様において、表現されたさらなるタンパク質の活性について該
スクリーニングまたは選択がなされる。 該活性が酵素活性である場合は、個々の宿主細胞培養上清を用い酵素活性をア
ッセイすることができる。
まれ、 （ｂ）該ペリプラズム性タンパク質が糸状ファージコートタンパク質の少なくと
も部分とさらなるタンパク質の融合タンパク質であり、該発現の過程で、該さら
なるタンパク質を表現する糸状ファージ粒子のコレクションが該宿主細胞コレク
ションから作製される方法に関する。 用語「該さらなるタンパク質を表現する糸状ファージ粒子」は、過去１０年間
に開発され広く用いられているファージ表現方法により作製される粒子を表す。
該方法において、外来（ポリ）ペプチドまたはタンパク質は、一般的にファージ
、ほとんどの場合Ｍ１３、ｆ１、もしくはｆｄのような糸状ファージのコートタ
ンパク質と融合することにより、該ファージはその表面に該外来（ポリ）ペプチ
ドまたはタンパク質を表現する。ファージ表現の最も重要な局面は種々の出版物
にまとめられている（例えば、Kayら、1996）。 本発明のさらなる態様において、該第一核酸配列を含むベクターはファージベ
クターまたはファージミッドベクターである。後者では、ヘルパーファージはフ
ァージミッドベクターにコードされないファージタンパク質を供給するのに用い
られる。 本発明の別の態様において、ファージコートタンパク質はｇＶIｐ、ｇＶIIIｐ
、または好ましくはｇIIIｐである。 本発明の好ましい態様において、表現タンパク質と、同起源の結合パートナー
との結合がスクリーニングまたは選択される。該タンパク質が抗体である場合は
、該同起源の結合パートナーは対応抗原（およびその逆）である。レセプターの
場合は、同起源の結合パートナーはリガンド（およびその逆）である。本発明の
方法のこの態様の具体的な利点は、選択されたファージ粒子は宿主細胞の感染に
用いることができ、増幅させることができるため、機能的収量の増加をもたらす
希な事象を選択できることである。 さらなる別の態様において、表現されたさらなるタンパク質の活性について該
スクリーニングまたは選択がなされる。 該活性が酵素活性である場合は、個々の宿主細胞培養上清を用い酵素活性をア
ッセイすることができる。
【００１２】 さらなる態様において、該さらなるタンパク質は免疫グロブリンスーパーファ
ミリー、および好ましくは免疫グロブリンファミリーの少なくともドメインを含
む。本発明の文脈において、用語免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ
）は、免疫グロブリンまたは抗体およびＴ細胞レセプターまたはインテグリンの
ような種々の他のタンパク質を含む、免疫グロブリンホールドを有する少なくと
もドメインを有することを特徴とするタンパク質のファミリーを表す。 最も好ましい態様において、該さらなるタンパク質はＦｖ、ｓｃＦｖ、ジスル
フィド結合Ｆｖ、およびＦａｂ断片から選ばれる免疫グロブリン断片である。こ
の文脈において、用語「Ｆｖ」は、抗体分子のＶＬ（可変軽鎖）とＶＨ（可変重
鎖）部分を含む断片を表し、「一本鎖Ｆｖ」はＶＬ鎖とＶＨ鎖がペプチドリンカ
ーによりＶＬ−ＶＨもしくはＶＨ−ＶＬ方向に結合した断片である。「ジスルフ
ィド結合Ｆｖ」は、ドメイン間ジスルフィド結合により安定化した断片である。
これは、各鎖内に単一システイン残基を操作することにより作製される構造であ
る（ここで、２本鎖からの該システイン残基は酸化により結合しジスルフィドを
結合する）。用語「Ｆａｂ」は、抗体分子のＶＬ−ＣＬ（可変軽鎖および定常軽
鎖）およびＶＨ−ＣＨ１（可変重鎖および第一定常重鎖）部分を含む複合体を表
す。
ミリー、および好ましくは免疫グロブリンファミリーの少なくともドメインを含
む。本発明の文脈において、用語免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ
）は、免疫グロブリンまたは抗体およびＴ細胞レセプターまたはインテグリンの
ような種々の他のタンパク質を含む、免疫グロブリンホールドを有する少なくと
もドメインを有することを特徴とするタンパク質のファミリーを表す。 最も好ましい態様において、該さらなるタンパク質はＦｖ、ｓｃＦｖ、ジスル
フィド結合Ｆｖ、およびＦａｂ断片から選ばれる免疫グロブリン断片である。こ
の文脈において、用語「Ｆｖ」は、抗体分子のＶＬ（可変軽鎖）とＶＨ（可変重
鎖）部分を含む断片を表し、「一本鎖Ｆｖ」はＶＬ鎖とＶＨ鎖がペプチドリンカ
ーによりＶＬ−ＶＨもしくはＶＨ−ＶＬ方向に結合した断片である。「ジスルフ
ィド結合Ｆｖ」は、ドメイン間ジスルフィド結合により安定化した断片である。
これは、各鎖内に単一システイン残基を操作することにより作製される構造であ
る（ここで、２本鎖からの該システイン残基は酸化により結合しジスルフィドを
結合する）。用語「Ｆａｂ」は、抗体分子のＶＬ−ＣＬ（可変軽鎖および定常軽
鎖）およびＶＨ−ＣＨ１（可変重鎖および第一定常重鎖）部分を含む複合体を表
す。
【００１３】 さらに好ましい態様において、本発明は該第一および第二核酸が同じかまたは
異なるベクターにコードされる方法を表す。 さらなる態様において、本発明は、（ａ）本明細書で先に記載した本発明の方
法に従って核酸配列または（ポリ）ペプチドコード配列を同定し、 （ｂ）それから（ポリ）ペプチドを推定する工程を含む、ペリプラズム性タンパ
ク質と（ポリ）ペプチドの同時発現により細菌において機能形のペリプラズム性
タンパク質の発現収量を増加させる（ポリ）ペプチドを同定するための方法に関
する。
異なるベクターにコードされる方法を表す。 さらなる態様において、本発明は、（ａ）本明細書で先に記載した本発明の方
法に従って核酸配列または（ポリ）ペプチドコード配列を同定し、 （ｂ）それから（ポリ）ペプチドを推定する工程を含む、ペリプラズム性タンパ
ク質と（ポリ）ペプチドの同時発現により細菌において機能形のペリプラズム性
タンパク質の発現収量を増加させる（ポリ）ペプチドを同定するための方法に関
する。
【００１４】 （ポリ）ペプチドの推定は、（ポリ）ペプチドをコードする配列をアミノ酸配
列に翻訳することにより達成することができる。該第一核酸配列がタンパク質の
配列をコードする完全長核酸を含まない場合は、推定（ポリ）ペプチド配列をタ
ンパク質を公表されたタンパク質配列と比較するか、または上記のごとく同定し
た（ポリ）ペプチドコード配列を公表された核酸配列と比較することにより、そ
れぞれより大きな（ポリ）ペプチド、もしくは（ポリ）ペプチドコード配列を推
定し、同定することができる。本明細書において先に記載した方法に加え、スク
リーニングまたは選択した宿主細胞から既知の方法により直接（ポリ）ペプチド
を同定することができよう。例えば、該（ポリ）ペプチドは検出または標識タグ
との融合物として発現させてよい。タグをつけた（ポリ）ペプチドを単離し、ア
ミノ酸シーケンシングにより同定することができよう。 最も好ましい態様において、本発明は、本発明の方法により同定された（ポリ
）ペプチドと機能形のペリプラズム性タンパク質を同時発現させることを特徴と
する、細菌宿主細胞において該ペリプラズム性タンパク質の発現を増加させる方
法に関する。好ましくは、該細菌宿主細胞はE.coli細胞である。
列に翻訳することにより達成することができる。該第一核酸配列がタンパク質の
配列をコードする完全長核酸を含まない場合は、推定（ポリ）ペプチド配列をタ
ンパク質を公表されたタンパク質配列と比較するか、または上記のごとく同定し
た（ポリ）ペプチドコード配列を公表された核酸配列と比較することにより、そ
れぞれより大きな（ポリ）ペプチド、もしくは（ポリ）ペプチドコード配列を推
定し、同定することができる。本明細書において先に記載した方法に加え、スク
リーニングまたは選択した宿主細胞から既知の方法により直接（ポリ）ペプチド
を同定することができよう。例えば、該（ポリ）ペプチドは検出または標識タグ
との融合物として発現させてよい。タグをつけた（ポリ）ペプチドを単離し、ア
ミノ酸シーケンシングにより同定することができよう。 最も好ましい態様において、本発明は、本発明の方法により同定された（ポリ
）ペプチドと機能形のペリプラズム性タンパク質を同時発現させることを特徴と
する、細菌宿主細胞において該ペリプラズム性タンパク質の発現を増加させる方
法に関する。好ましくは、該細菌宿主細胞はE.coli細胞である。
【００１５】 さらに好ましい態様において、標準的条件下、すなわち、該（ポリ）ペプチド
の同時発現なしに発現する場合、該ペリプラズム性タンパク質は機能形で発現す
ることができないか、または収量が非常に低い。 さらに好ましい態様において、該ペリプラズム性タンパク質は、宿主細胞のコ
レクションにおいて発現するペリプラズム性タンパク質のコレクションのメンバ
ーである。本明細書で先に示したファージ表現技術のようないくつかの方法は、
スクリーニング法や選択法のためのタンパク質ライブラリーを提供する。しかし
ながら、該方法の成功は、機能的ライブラリーメンバーの発現収量の違いにより
限定される。例えば、抗体断片の場合、機能形断片の発現収量の差が大きいこと
が知られている。標準的条件下、すなわち、該（ポリ）ペプチドの同時発現なし
に発現する場合、免疫グロブリンレパートリー由来の抗体断片ライブラリーに含
まれる高い割合の断片が発現することができないか、または収量が非常に低い。
の同時発現なしに発現する場合、該ペリプラズム性タンパク質は機能形で発現す
ることができないか、または収量が非常に低い。 さらに好ましい態様において、該ペリプラズム性タンパク質は、宿主細胞のコ
レクションにおいて発現するペリプラズム性タンパク質のコレクションのメンバ
ーである。本明細書で先に示したファージ表現技術のようないくつかの方法は、
スクリーニング法や選択法のためのタンパク質ライブラリーを提供する。しかし
ながら、該方法の成功は、機能的ライブラリーメンバーの発現収量の違いにより
限定される。例えば、抗体断片の場合、機能形断片の発現収量の差が大きいこと
が知られている。標準的条件下、すなわち、該（ポリ）ペプチドの同時発現なし
に発現する場合、免疫グロブリンレパートリー由来の抗体断片ライブラリーに含
まれる高い割合の断片が発現することができないか、または収量が非常に低い。
【００１６】 さらに未知の生物学的機能を有するペリプラズム性タンパク質、またはある特
性を有するメンバーを同定するためのペリプラズム性タンパク質のコレクション
を発現する場合（例えば、予め定義された標的と結合する断片を同定することを
目的とする抗体断片ライブラリーを発現する場合）は、用語「機能形の...発現 」は、限定された生物学的機能ではなく、構造的特徴を表す。その文脈において
、タンパク質がその種のタンパク質を代表する３次元配列にホールドされるとき
、「機能的」と呼ぶことができる。例えば、抗体分子またはその断片のコレクシ
ョンを発現する場合、「機能形の...発現」は、抗体結合部位の正しいホールデ ィングがその機能、すなわち標的との結合にとって必須条件であるから、該分子
の断片が正しくホールドされた形、いわゆる免疫グロブリンホールドで発現する
場合に達成される。 さらなる好ましい態様において、該（ポリ）ペプチドはE.coliタンパク質Ｓｋ
ｐまたはその相同体である。 さらなる好ましい態様において、該（ポリ）ペプチドはE.coliタンパク質Ｆｋ
ｐＡまたはその相同体である。
性を有するメンバーを同定するためのペリプラズム性タンパク質のコレクション
を発現する場合（例えば、予め定義された標的と結合する断片を同定することを
目的とする抗体断片ライブラリーを発現する場合）は、用語「機能形の...発現 」は、限定された生物学的機能ではなく、構造的特徴を表す。その文脈において
、タンパク質がその種のタンパク質を代表する３次元配列にホールドされるとき
、「機能的」と呼ぶことができる。例えば、抗体分子またはその断片のコレクシ
ョンを発現する場合、「機能形の...発現」は、抗体結合部位の正しいホールデ ィングがその機能、すなわち標的との結合にとって必須条件であるから、該分子
の断片が正しくホールドされた形、いわゆる免疫グロブリンホールドで発現する
場合に達成される。 さらなる好ましい態様において、該（ポリ）ペプチドはE.coliタンパク質Ｓｋ
ｐまたはその相同体である。 さらなる好ましい態様において、該（ポリ）ペプチドはE.coliタンパク質Ｆｋ
ｐＡまたはその相同体である。
【００１７】 同じおよび／または同様な残基を合計した割合が一定の閾値を超えるとタンパ
ク質はホモローガスと呼ばれる。この閾値は、一列に並んだ遺伝子においてアミ
ノ酸の少なくとも１５％が同一であり、さらに少なくとも３０％が同様であると
き、当業者は通常この閾値を超えているとみなす。その文脈において、類似性は
、例えばサイズ、極性、または荷電といったアミノ酸の物理化学特性を合わす。 Ｓｋｐとホモローガスなタンパク質は、Salmonella typhimurium（Koskiら、1
990、Koskiら、1989）、Yersinia enterocolitica（Hirvasら、1991）、Yersini
a pseudotuberculosis（Vuorioら、1991）、Haemophilus influenzae (Fleischm
annら、1995）、およびPasteurella multocida (Delamarcheら、1995）のような
有機体由来のものが知られている。ＦｋｐＡとホモローガスなタンパク質は、例
えば多くの病原性細菌中に存在する（HorneおよびYoung,1995）。Legionella pn
eumophilaにおいて、ＰＰＩ活性を示す対応タンパク質はＭｉｐＡと呼ばれる。
ク質はホモローガスと呼ばれる。この閾値は、一列に並んだ遺伝子においてアミ
ノ酸の少なくとも１５％が同一であり、さらに少なくとも３０％が同様であると
き、当業者は通常この閾値を超えているとみなす。その文脈において、類似性は
、例えばサイズ、極性、または荷電といったアミノ酸の物理化学特性を合わす。 Ｓｋｐとホモローガスなタンパク質は、Salmonella typhimurium（Koskiら、1
990、Koskiら、1989）、Yersinia enterocolitica（Hirvasら、1991）、Yersini
a pseudotuberculosis（Vuorioら、1991）、Haemophilus influenzae (Fleischm
annら、1995）、およびPasteurella multocida (Delamarcheら、1995）のような
有機体由来のものが知られている。ＦｋｐＡとホモローガスなタンパク質は、例
えば多くの病原性細菌中に存在する（HorneおよびYoung,1995）。Legionella pn
eumophilaにおいて、ＰＰＩ活性を示す対応タンパク質はＭｉｐＡと呼ばれる。
【００１８】 さらに好ましい態様において、本発明は、該ペリプラズム性タンパク質が糸状
ファージコートタンパク質の少なくとも部分とさらなるタンパク質との融合タン
パク質である方法に関する。 該さらなるタンパク質が免疫グロブリンスーパーファミリー、好ましくは免疫
グロブリンファミリーの少なくともドメインを含む方法がさらに好ましい。 最も好ましくは、本発明は、Ｆｖ、ｓｄＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、および
Ｆａｂ断片からなる群から選ばれる免疫グロブリン断片である方法に関する。 さらに好ましい態様において、本発明は、該（ポリ）ペプチド、好ましくはＳ
ｋｐ、ＦｋｐＡ、またはＳｋｐもしくはＦｋｐＡの相同体をコードする核酸配列
、および該ペリプラズム性タンパク質をコードする遺伝子が同じかまたは異なる
ベクターにコードされているか、または該（ポリ）ペプチド、好ましくはＳｋｐ
、ＦｋｐＡ、またはＳｋｐもしくはＦｋｐＡの相同体をコードする核酸配列が細
菌宿主のゲノム中に統合されている方法に関する。
ファージコートタンパク質の少なくとも部分とさらなるタンパク質との融合タン
パク質である方法に関する。 該さらなるタンパク質が免疫グロブリンスーパーファミリー、好ましくは免疫
グロブリンファミリーの少なくともドメインを含む方法がさらに好ましい。 最も好ましくは、本発明は、Ｆｖ、ｓｄＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、および
Ｆａｂ断片からなる群から選ばれる免疫グロブリン断片である方法に関する。 さらに好ましい態様において、本発明は、該（ポリ）ペプチド、好ましくはＳ
ｋｐ、ＦｋｐＡ、またはＳｋｐもしくはＦｋｐＡの相同体をコードする核酸配列
、および該ペリプラズム性タンパク質をコードする遺伝子が同じかまたは異なる
ベクターにコードされているか、または該（ポリ）ペプチド、好ましくはＳｋｐ
、ＦｋｐＡ、またはＳｋｐもしくはＦｋｐＡの相同体をコードする核酸配列が細
菌宿主のゲノム中に統合されている方法に関する。
【００１９】 本発明を実施例により例示する。
実施例１：Ｓｋｐの同定および応用 １．１．序論 本発明者らは、ペリプラズム性タンパク質およびファージ上に表現されるタン
パク質両方のホールディングを助ける細胞性因子の探求において、ｇ３ｐ融合−
タンパク質が同じ環境で、ペリプラズム性に発現したタンパク質と同じ機構を用
いてホールドされるという仮説を用いた。本発明者らは、モデル系としてフルオ
レセイン特異的な抗体４−４−２０の極めて不完全にホールディングされた一本
鎖Ｆｖ断片を用いた（Bedzykら、1990）、（Whitlowら、1995）。以前の研究（N
iebaら、1997）は、ｓｃＦｖは天然の状態では非常に可溶性で安定であるが、細
菌ペリプラズムにおいて強く凝集することを示した。このことは、最終産物が収
量を制限するのではなく、ホールディング経路が分岐し凝集物を生じることを示
す。この場合および同様の場合では、ホールディング収量は熱力学的問題ではな
く動力学的問題であるため、潜在的に細胞性因子は該収量に寄与し得る。 本発明者らは、そのような因子が膜結合タンパク質、ペリプラズム性タンパク
質、または細胞質タンパク質であるかに関していかなる先入観もなしに該因子を
同定したかった。本発明者らは、ホールディングに直接影響することなく、生成
物の総収量に影響するあらゆる因子をみいだしたかった。したがって、本発明者
らは、ファージ表現を利用する選択系を開発した（図１Ａ）。不完全にホールデ
ィングされたｓｃＦｖ断片はｇ３ｐとの融合タンパク質として表現され、E.coli
タンパク質のライブラリーは同じファージミッド上に同時発現された。本発明者
らは、特定のE.coli細胞がこのファージミッド上にコードされた有益な因子を産
生すると、該ファージの高い分画が正しくホールドされたｓｃＦｖを表現するで
あろうから、この細胞は他のファージより優れた（outcompete）ファージを生じ
るであろうと推論した。すなわち、表現されたｓｃＦｖは一般的にすべてのファ
ージにおいて同一であるが、この方法は同じファージミッド上にコードされたさ
らなる因子の効果を、その因子自身が表現されなくても選択する。この因子は、
特定ファージを産生する宿主細胞に作用することにより、ｓｃＦｖの「品質」、
すなわち、ファージ上に表現される正しくホールドされた分子の割合を改善する
。 この戦略（図１Ａ）を用い、外膜タンパク質のホールディングまたは輸送に役
割を果たすと以前考えられていたペリプラズム性タンパク質Ｓｋｐをコードする
E.coli由来の遺伝子が豊富化された(Chen & Henning,1996 ）。
パク質両方のホールディングを助ける細胞性因子の探求において、ｇ３ｐ融合−
タンパク質が同じ環境で、ペリプラズム性に発現したタンパク質と同じ機構を用
いてホールドされるという仮説を用いた。本発明者らは、モデル系としてフルオ
レセイン特異的な抗体４−４−２０の極めて不完全にホールディングされた一本
鎖Ｆｖ断片を用いた（Bedzykら、1990）、（Whitlowら、1995）。以前の研究（N
iebaら、1997）は、ｓｃＦｖは天然の状態では非常に可溶性で安定であるが、細
菌ペリプラズムにおいて強く凝集することを示した。このことは、最終産物が収
量を制限するのではなく、ホールディング経路が分岐し凝集物を生じることを示
す。この場合および同様の場合では、ホールディング収量は熱力学的問題ではな
く動力学的問題であるため、潜在的に細胞性因子は該収量に寄与し得る。 本発明者らは、そのような因子が膜結合タンパク質、ペリプラズム性タンパク
質、または細胞質タンパク質であるかに関していかなる先入観もなしに該因子を
同定したかった。本発明者らは、ホールディングに直接影響することなく、生成
物の総収量に影響するあらゆる因子をみいだしたかった。したがって、本発明者
らは、ファージ表現を利用する選択系を開発した（図１Ａ）。不完全にホールデ
ィングされたｓｃＦｖ断片はｇ３ｐとの融合タンパク質として表現され、E.coli
タンパク質のライブラリーは同じファージミッド上に同時発現された。本発明者
らは、特定のE.coli細胞がこのファージミッド上にコードされた有益な因子を産
生すると、該ファージの高い分画が正しくホールドされたｓｃＦｖを表現するで
あろうから、この細胞は他のファージより優れた（outcompete）ファージを生じ
るであろうと推論した。すなわち、表現されたｓｃＦｖは一般的にすべてのファ
ージにおいて同一であるが、この方法は同じファージミッド上にコードされたさ
らなる因子の効果を、その因子自身が表現されなくても選択する。この因子は、
特定ファージを産生する宿主細胞に作用することにより、ｓｃＦｖの「品質」、
すなわち、ファージ上に表現される正しくホールドされた分子の割合を改善する
。 この戦略（図１Ａ）を用い、外膜タンパク質のホールディングまたは輸送に役
割を果たすと以前考えられていたペリプラズム性タンパク質Ｓｋｐをコードする
E.coli由来の遺伝子が豊富化された(Chen & Henning,1996 ）。
【００２０】 １．２．実験プロトコール ゲノムラブラリーの構築。ファージ表現ベクターｐＡＫ１００(Krebberら、19
97）の５６５６位にＮｏｔＩ部位を挿入した。ポリリンカーを、オリゴヌクレオ
チドカセットとしてこのＮｏｔＩ部位に挿入した。抗フルオレセイン抗体４−４
−２０のｓｃＦｖ断片をコードするゲル精製Ｓｆｉｌ断片（Bedzykら、1990）を
このベクターｐＨＢ１００に連結し、プラスミドｐＨＢ１０２を生じた。E.coli
ＪＭ８３のゲノムＤＮＡを、Qiagen-tip 100Gを用い、製造業者のプロトコール
に従って単離した。ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、１％アガロ
ースゲルに適用した。１ｋｂ〜６ｋｂ長の範囲を切り出し、ゲノムＤＮＡをGenE
lute（登録商標）アガローススピンカラム（Supelco）で溶出し、フェノール／ クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。ｐＨＢ１０２のポリリンカー
のＢｇIII部位をE.coliライブラリーに連結した後、連結混合物をｎ−ブタノー ルで沈殿し、E.coli XL1-Blue（Stratagene）にエレクトロポーレションした。 ５３０ｃｍ2ディッシュ（Ｎｕｎｃ）中の２ｘＹＴにプレーティングし、３７℃ で一夜培養し、次いで、コロニーを５ｍＬの２ｘＹＴでプレートから洗い取り、
ＯＤ550で測定し、グリセロールを最終濃度１０％に加え、次いで細胞を−８０ ℃で保存した。
97）の５６５６位にＮｏｔＩ部位を挿入した。ポリリンカーを、オリゴヌクレオ
チドカセットとしてこのＮｏｔＩ部位に挿入した。抗フルオレセイン抗体４−４
−２０のｓｃＦｖ断片をコードするゲル精製Ｓｆｉｌ断片（Bedzykら、1990）を
このベクターｐＨＢ１００に連結し、プラスミドｐＨＢ１０２を生じた。E.coli
ＪＭ８３のゲノムＤＮＡを、Qiagen-tip 100Gを用い、製造業者のプロトコール
に従って単離した。ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、１％アガロ
ースゲルに適用した。１ｋｂ〜６ｋｂ長の範囲を切り出し、ゲノムＤＮＡをGenE
lute（登録商標）アガローススピンカラム（Supelco）で溶出し、フェノール／ クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。ｐＨＢ１０２のポリリンカー
のＢｇIII部位をE.coliライブラリーに連結した後、連結混合物をｎ−ブタノー ルで沈殿し、E.coli XL1-Blue（Stratagene）にエレクトロポーレションした。 ５３０ｃｍ2ディッシュ（Ｎｕｎｃ）中の２ｘＹＴにプレーティングし、３７℃ で一夜培養し、次いで、コロニーを５ｍＬの２ｘＹＴでプレートから洗い取り、
ＯＤ550で測定し、グリセロールを最終濃度１０％に加え、次いで細胞を−８０ ℃で保存した。
【００２１】 ファージパニング。０．１ｍＬの塩混合物（０．８６Ｍ ＮａＣｌ、０．２ ５Ｍ ＫＣｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2）を含む１５μｇ／ｍＬテトラサイクリン（ｔｅ ｔ）含有２ｘＹＴの１０ｍＬ培養にゲノムライブラリーを保持するE.coliをＯＤ 550 ０．１で接種した。３７℃で１ｈインキュベーションし、次いでクロラムフ
ェニコール（ｃａｍ）を３０μｇ／ｍＬの濃度で加え、細胞をＯＤ550 ０．５ま
で増殖させた。次に、ヘルパーファージＶＣＳ Ｍ１３（Stratagene）１０12ｐ ｆｕを加え、攪拌せずに３７℃で１５分間インキュベーションし、次いで、３０
μｇ／ｍＬ ｃａｍ、１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔ、０．５ｍＬ塩混合物、０．１ｍＭ
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む２ｘＹＴ 培地５ ０ｍＬを加え、次いで３７℃で２ｈ振盪させた。３０μｇ／ｍＬカナマイシン（
ｋａｎ）を加え、次いで培養を３７℃で一夜増殖させた。細胞を回収し、ファー
ジミッドＤＮＡを単離した（QIAprepスピンキット、Qiagen）。培養上清から得 たファージを、氷上で１／４容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（１７％ＰＥＧ６００
０、３．３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３０分間インキュベーションして
沈殿させ、ペレットを２ｍＬのＰＢＳ（８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ Ｋ Ｈ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．４）（Sambrookら、
1989）に再溶解した。Immunotube(Nunc)をＰＢＳ中のウシ血清アルブミン結合フ
ルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）２０μｇ／ｍＬで、４
℃で一夜コーティングし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＢＳＡ）
中の５％スキムミルクで室温で少なくとも１ｈブロックした。ファージ溶液５０
０μＬをＰＢＳＴ中の２％スキムミルクに終量５ｍＬとなるように満たし、室温
で２ｈチューブに適用した。チューブをＰＢＳＴで２０回、ＰＢＳで２回洗浄し
た。結合ファージを０．１Ｍ グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１ｍＬで１０分 間溶出した。溶出液を６０μＬの２Ｍ トリスで速やかに中和し、ファージ（典 型的には１０4〜１０6ｃｆｕ）を用いて再感染させた。
ェニコール（ｃａｍ）を３０μｇ／ｍＬの濃度で加え、細胞をＯＤ550 ０．５ま
で増殖させた。次に、ヘルパーファージＶＣＳ Ｍ１３（Stratagene）１０12ｐ ｆｕを加え、攪拌せずに３７℃で１５分間インキュベーションし、次いで、３０
μｇ／ｍＬ ｃａｍ、１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔ、０．５ｍＬ塩混合物、０．１ｍＭ
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む２ｘＹＴ 培地５ ０ｍＬを加え、次いで３７℃で２ｈ振盪させた。３０μｇ／ｍＬカナマイシン（
ｋａｎ）を加え、次いで培養を３７℃で一夜増殖させた。細胞を回収し、ファー
ジミッドＤＮＡを単離した（QIAprepスピンキット、Qiagen）。培養上清から得 たファージを、氷上で１／４容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（１７％ＰＥＧ６００
０、３．３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３０分間インキュベーションして
沈殿させ、ペレットを２ｍＬのＰＢＳ（８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ Ｋ Ｈ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．４）（Sambrookら、
1989）に再溶解した。Immunotube(Nunc)をＰＢＳ中のウシ血清アルブミン結合フ
ルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）２０μｇ／ｍＬで、４
℃で一夜コーティングし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＢＳＡ）
中の５％スキムミルクで室温で少なくとも１ｈブロックした。ファージ溶液５０
０μＬをＰＢＳＴ中の２％スキムミルクに終量５ｍＬとなるように満たし、室温
で２ｈチューブに適用した。チューブをＰＢＳＴで２０回、ＰＢＳで２回洗浄し
た。結合ファージを０．１Ｍ グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１ｍＬで１０分 間溶出した。溶出液を６０μＬの２Ｍ トリスで速やかに中和し、ファージ（典 型的には１０4〜１０6ｃｆｕ）を用いて再感染させた。
【００２２】 ファージ精製およびＥＬＩＳＡ。ファージＥＬＩＳＡを行ってＭ１３ファージ
上に機能的に表現されたｓｃＦｖの量をアッセイした。３０μｇ／ｍＬ ｃａｍ および１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔを含む２ｘＹＴ培地５ｍＬを用い３７℃で単一コ ロニーを成長させた。３０μｇ／ｍＬ ｃａｍ、１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔ、０．４
％グルコース、および０．１ｍＬ塩混合物を含む２ｘＹＴ培地１０ｍＬに一夜培
養をＯＤ550 ０．１となるよう接種した。ＯＤ550 ０．３〜０．５で、１０12ｃ
ｆｕ ＶＣＳヘルパーファージ（Stratagene)を加えた。１５分後、３０μｇ／ｍ
Ｌ ｃａｍ、１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔ、０．５ｍＬ塩混合物、および０．１ｍＬ ＩＰＴＧを含む２ｘＹＴ培地５０ｍＬを加えた。３７℃で２ｈ後、ｋａｎを最終
濃度３０μｇ／ｍＬとなるように加え、細胞を一夜増殖させた。氷上で上記のご
とく１／４容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液で３０分間インキュベーションして培養
上清からファージを沈殿させ、ペレットを１ｍＬ ＰＢＳに再溶解した。 ＣｓＣｌ １．６ｇを加えた後、ＰＢＳで容量を４ｍＬに調整した。ＣｓＣｌ 溶液を１／２ｘ１ １／２ｉｎ．ポリアロマーチューブに移し、TLN-100ローター
（Beckman Instruments）を用い、４℃で４ｈ、１０００００ｒｐｍで遠心した 。遠心後、ファージバンドを記載のごとく取り出した（Smith & Scott, 1990） 。ファージを１／２ｘ２ｉｎ．ポリカーボネートチューブに移し、ＰＢＳ ３ｍ Ｌを満たした。TLA-100.3ローターを用い、４℃で１ｈ、５００００ｒｐｍで遠 心し、次いでペレットにしたファージをＰＢＳ ３ｍＬに再溶解した。TLA-100.3
ローターを用い、４℃で１ｈ、５００００ｒｐｍでさらに遠心し、ファージをＰ
ＢＳに溶解した。ファージ粒子の濃度を分光測光法で定量した（Day, 1969）。 ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一夜、ＰＢＳ中のＦＩＴＣ−ＢＳＡで、抗レバ
ン抗体についてはＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬレバン（ポリフルクトース、Sigma ）でコートした。プレートを室温で１ｈブロックした。一定数の精製ファージ（
ＯＤで測定）（Day,1969）を、１０μＭフルオレセインまたは０．０５％レバン
の存在下または非存在下でＰＢＳＴ中の２％スキムミルクと混合し、ブロックし
たＥＬＩＳＡプレートに適用し、室温で１ｈインキュベーションした。検出は、
ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体(Pharmacia）を用い、上
記のごとく行った。
上に機能的に表現されたｓｃＦｖの量をアッセイした。３０μｇ／ｍＬ ｃａｍ および１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔを含む２ｘＹＴ培地５ｍＬを用い３７℃で単一コ ロニーを成長させた。３０μｇ／ｍＬ ｃａｍ、１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔ、０．４
％グルコース、および０．１ｍＬ塩混合物を含む２ｘＹＴ培地１０ｍＬに一夜培
養をＯＤ550 ０．１となるよう接種した。ＯＤ550 ０．３〜０．５で、１０12ｃ
ｆｕ ＶＣＳヘルパーファージ（Stratagene)を加えた。１５分後、３０μｇ／ｍ
Ｌ ｃａｍ、１５μｇ／ｍＬ ｔｅｔ、０．５ｍＬ塩混合物、および０．１ｍＬ ＩＰＴＧを含む２ｘＹＴ培地５０ｍＬを加えた。３７℃で２ｈ後、ｋａｎを最終
濃度３０μｇ／ｍＬとなるように加え、細胞を一夜増殖させた。氷上で上記のご
とく１／４容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液で３０分間インキュベーションして培養
上清からファージを沈殿させ、ペレットを１ｍＬ ＰＢＳに再溶解した。 ＣｓＣｌ １．６ｇを加えた後、ＰＢＳで容量を４ｍＬに調整した。ＣｓＣｌ 溶液を１／２ｘ１ １／２ｉｎ．ポリアロマーチューブに移し、TLN-100ローター
（Beckman Instruments）を用い、４℃で４ｈ、１０００００ｒｐｍで遠心した 。遠心後、ファージバンドを記載のごとく取り出した（Smith & Scott, 1990） 。ファージを１／２ｘ２ｉｎ．ポリカーボネートチューブに移し、ＰＢＳ ３ｍ Ｌを満たした。TLA-100.3ローターを用い、４℃で１ｈ、５００００ｒｐｍで遠 心し、次いでペレットにしたファージをＰＢＳ ３ｍＬに再溶解した。TLA-100.3
ローターを用い、４℃で１ｈ、５００００ｒｐｍでさらに遠心し、ファージをＰ
ＢＳに溶解した。ファージ粒子の濃度を分光測光法で定量した（Day, 1969）。 ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一夜、ＰＢＳ中のＦＩＴＣ−ＢＳＡで、抗レバ
ン抗体についてはＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬレバン（ポリフルクトース、Sigma ）でコートした。プレートを室温で１ｈブロックした。一定数の精製ファージ（
ＯＤで測定）（Day,1969）を、１０μＭフルオレセインまたは０．０５％レバン
の存在下または非存在下でＰＢＳＴ中の２％スキムミルクと混合し、ブロックし
たＥＬＩＳＡプレートに適用し、室温で１ｈインキュベーションした。検出は、
ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体(Pharmacia）を用い、上
記のごとく行った。
【００２３】 ファージブロット。ファージブロットについては、１０11ファージを還元１１
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、ニトロセルロース膜にブロットした。検出は、Ｅ
ＣＬキット（Amersham）を用い、ｇ３ｐのＣ末端半分を認識するモノクローナル
抗体１０Ｃ３（Tesarら、1995）（２％ミルクを含むＴＢＳＴ（２５ｍＭトリス ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中
１：５００００）を用いて室温で６０分間、次いでポリクローナル抗マウスペロ
キシダーゼコンジュゲート（Pierce)(ＴＢＳＴ／２％ミルク中１：５０００、室
温で４５分）でインキュベーションして行った。
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、ニトロセルロース膜にブロットした。検出は、Ｅ
ＣＬキット（Amersham）を用い、ｇ３ｐのＣ末端半分を認識するモノクローナル
抗体１０Ｃ３（Tesarら、1995）（２％ミルクを含むＴＢＳＴ（２５ｍＭトリス ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中
１：５００００）を用いて室温で６０分間、次いでポリクローナル抗マウスペロ
キシダーゼコンジュゲート（Pierce)(ＴＢＳＴ／２％ミルク中１：５０００、室
温で４５分）でインキュベーションして行った。
【００２４】 粗抽出ＥＬＩＳＡ。３０μｇ／ｍＬ ｃａｍを含むＬＢ培地５０ｍＬに、それ ぞれｓｃＦｖ断片をコードするプラスミドを保持するE.coli JM83の単一コロニ ーを接種した。培養を２４℃でＯＤ550 ０．５まで増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧ で誘導した。２４℃で一夜誘導した後、細胞を回収し、ＰＢＳ ４ｍＬに再懸濁 した。全細胞抽出物をフレンチプレスで１００００ｐｓｉで溶解して調製し、粗
抽出物１ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、ＴＬＡ−１００．３ローター（
Beckman Instruments）を用い、４℃、５００００ｒｐｍにて３０分間遠心した 。遠心後、可溶性物質を含む上清を１ｍＬ中ＯＤ550 ２０に標準化した。ＥＬＩ
ＳＡプレートをコートし、上記のごとくファージＥＬＩＳＡ用にブロックした。
一定量の粗抽出物を１０μＭフルオレセインまたは０．０５％レバンの存在下ま
たは非存在下でＰＢＳＴ中の２％スキムミルクと混合し、ブロックＥＬＩＳＡプ
レートに適用し、室温で１ｈインキュベーションした。ホースラディッシュパー
オキシダーゼ結合抗マウス抗体および抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（Munro & Pelham,
1986）、および可溶性ＢＭブルーＰＯＤ−基質（Boehringer-Mannheim）を用い てシグナルを検出し、０．１Ｍ ＨＣｌで反応を止め、次いで４０５ｎｍでシグ ナルを読んだ。 タンパク質精製。同時発現Ｓｋｐの存在下または非存在下でPC-Sepharoseアフ
ィニティクロマトグラフィ（Skerra & Plueckthun, 1988）を用い、抗ホスホリ ルコリンｓｃＦｖ ＭｃＰＣ６０３−Ｈ１１(Knappik & Plueckthun, 1995）を精
製した。濃度および収量を、算定吸光係数を用いて光度測定法により推定した（
Gill & von Hippel, 1989）。
抽出物１ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、ＴＬＡ−１００．３ローター（
Beckman Instruments）を用い、４℃、５００００ｒｐｍにて３０分間遠心した 。遠心後、可溶性物質を含む上清を１ｍＬ中ＯＤ550 ２０に標準化した。ＥＬＩ
ＳＡプレートをコートし、上記のごとくファージＥＬＩＳＡ用にブロックした。
一定量の粗抽出物を１０μＭフルオレセインまたは０．０５％レバンの存在下ま
たは非存在下でＰＢＳＴ中の２％スキムミルクと混合し、ブロックＥＬＩＳＡプ
レートに適用し、室温で１ｈインキュベーションした。ホースラディッシュパー
オキシダーゼ結合抗マウス抗体および抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（Munro & Pelham,
1986）、および可溶性ＢＭブルーＰＯＤ−基質（Boehringer-Mannheim）を用い てシグナルを検出し、０．１Ｍ ＨＣｌで反応を止め、次いで４０５ｎｍでシグ ナルを読んだ。 タンパク質精製。同時発現Ｓｋｐの存在下または非存在下でPC-Sepharoseアフ
ィニティクロマトグラフィ（Skerra & Plueckthun, 1988）を用い、抗ホスホリ ルコリンｓｃＦｖ ＭｃＰＣ６０３−Ｈ１１(Knappik & Plueckthun, 1995）を精
製した。濃度および収量を、算定吸光係数を用いて光度測定法により推定した（
Gill & von Hippel, 1989）。
【００２５】 １．３．Ｓｋｐの同定 本発明者らは、E.coliゲノムライブラリーのレシピエントとして抗フルオレセ
イン抗体４−４−２０の不完全にホールディングされたｓｃＦｖ断片を表現する
ファージミッドを用いた（Bedzykら、1990、Niebaら、1997)。E.coli ＤＮＡを １〜６ｋｂにサイズ分画化し、ファージ表現のために開発されたファージミッド
のｃｏｌＥ１複製起点およびクロラムフェニコール（ｃａｍ）耐性遺伝子の間に
位置するポリリンカーに連結した（Krebberら、1997）（図１Ｂ）。すなわち、 自身のプロモーターのもとに制御されるE.coli遺伝子は、主としてベクターのコ
ピー数の作用によりファージミッド上に過剰発現する。５ｘ１０4クローンのラ イブラリーサイズは、生存し得るクローンをもたらすならば、確実にE.coliゲノ
ムの各片に相当するはずである。 ＢＳＡ−フルオレセインを用いてパニングを７回行い（図１Ａ）、各パニング
後にファージミッドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、あらゆる挿入物の蓄積
を検出した。約９９０ｂｐのバンドがパニングにより蓄積することが図２に示さ
れている。７回目のパニング後に分析した８個の単一コロニーのうち４個がこの
挿入物を保持しており、これをシーケンスし、出発コドンの上流２７２塩基から
終止コドンの下流１９９塩基までのペリプラズム性タンパク質Ｓｋｐの完全な遺
伝子のみを含むことが確認された（Holck & Kleppe,1988）（図３）。ｓｋｐの 終止コドンの後の４塩基は、ＩｐｘＤの開始コドン（ｆｉｒＡ)であり、このタ ンパク質の６５個のＮ末端アミノ酸のトランケートペプチドをもたらす。ｓｋｐ
遺伝子の開始コドンの上流１２５塩基対に、未知の機能を有する８１０ａａタン
パク質をコードしているオープンリーディングフレームの終止コドンが存在する
。相同性試験では、Haemophilus influenzae (Swiss-Prot: P46024)の保護表面 抗原Ｄ１５、およびPasteurella multocida (TREMBL: Q51930）およびNeisseria
gonorrhoeae（TREMBL: P95359）の表面タンパク質と６６．２％の類似性が示さ
れた。
イン抗体４−４−２０の不完全にホールディングされたｓｃＦｖ断片を表現する
ファージミッドを用いた（Bedzykら、1990、Niebaら、1997)。E.coli ＤＮＡを １〜６ｋｂにサイズ分画化し、ファージ表現のために開発されたファージミッド
のｃｏｌＥ１複製起点およびクロラムフェニコール（ｃａｍ）耐性遺伝子の間に
位置するポリリンカーに連結した（Krebberら、1997）（図１Ｂ）。すなわち、 自身のプロモーターのもとに制御されるE.coli遺伝子は、主としてベクターのコ
ピー数の作用によりファージミッド上に過剰発現する。５ｘ１０4クローンのラ イブラリーサイズは、生存し得るクローンをもたらすならば、確実にE.coliゲノ
ムの各片に相当するはずである。 ＢＳＡ−フルオレセインを用いてパニングを７回行い（図１Ａ）、各パニング
後にファージミッドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、あらゆる挿入物の蓄積
を検出した。約９９０ｂｐのバンドがパニングにより蓄積することが図２に示さ
れている。７回目のパニング後に分析した８個の単一コロニーのうち４個がこの
挿入物を保持しており、これをシーケンスし、出発コドンの上流２７２塩基から
終止コドンの下流１９９塩基までのペリプラズム性タンパク質Ｓｋｐの完全な遺
伝子のみを含むことが確認された（Holck & Kleppe,1988）（図３）。ｓｋｐの 終止コドンの後の４塩基は、ＩｐｘＤの開始コドン（ｆｉｒＡ)であり、このタ ンパク質の６５個のＮ末端アミノ酸のトランケートペプチドをもたらす。ｓｋｐ
遺伝子の開始コドンの上流１２５塩基対に、未知の機能を有する８１０ａａタン
パク質をコードしているオープンリーディングフレームの終止コドンが存在する
。相同性試験では、Haemophilus influenzae (Swiss-Prot: P46024)の保護表面 抗原Ｄ１５、およびPasteurella multocida (TREMBL: Q51930）およびNeisseria
gonorrhoeae（TREMBL: P95359）の表面タンパク質と６６．２％の類似性が示さ
れた。
【００２６】 １．４．ファージ表現に対するＳｋｐ同時発現の効果 Ｓｋｐがいかにそしてなぜ豊富化を生じるかを検討するため、同時発現Ｓｋｐ
の存在下または非存在下で産生されるファージを最初に特徴づけた。この目的で
、ｓｋｐを有する、そして持たないファージミッドにおいて種々の異なるｓｃＦ
ｖ断片をクローンした。ファージ力価は実験誤差内で差がなく、より多くのファ
ージの産生をもたらすためＳｋｐは選択されないことが示された。しかしながら
、Ｓｋｐの過剰発現によりファージ上の機能的抗体分子数が増加する場合は、同
じ数の精製ファージ粒子からの抗原結合ファージＥＬＩＳＡシグナルはより高い
（図４）。この効果は、程度は異なるものの試験した４抗体すべてにみられる。 次に、Ｓｋｐの過剰発現によりファージ当たりの融合タンパク質の総量が増加
するかについても試験した。この目的のために、モノクローナル抗体１０Ｃ３を
用い、Westernブロットによりファージミッド上のｓｋｐの存在下または非存在 下で、精製ファージ粒子上の完全長融合タンパク質の量を分析した（Tesarら、1
995）（図５）。ｓｃＦｖ４−４−２０では、Ｓｋｐの同時発現は、ファージ上 に存在する融合タンパク質の存在を劇的に増加した。同量の精製ファージをゲル
に適用したので、Ｓｋｐはファージ内への機能的融合タンパク質の取り込みを促
すはずであり、これは抗原結合ＥＬＩＳＡの結果にも反映される（上記参照）。
Ｓｋｐは、取り込みの最終レベルおよび程度は異なるものの試験した６抗体すべ
てにこの効果を示す。融合タンパク質は、ｇ３ｐ ｗｔ（ヘルパーファージによ りコートされた）に比べまだほんのわずかであるため、ｇ３ｐ ｗｔの減少を確 実に測定できないが、ｓｃＦｖ−ｇ３ｐ融合タンパク質は、過剰発現Ｓｋｐの存
在下でよりしばしばｇ３ｐ ｗｔを生じるようである。
の存在下または非存在下で産生されるファージを最初に特徴づけた。この目的で
、ｓｋｐを有する、そして持たないファージミッドにおいて種々の異なるｓｃＦ
ｖ断片をクローンした。ファージ力価は実験誤差内で差がなく、より多くのファ
ージの産生をもたらすためＳｋｐは選択されないことが示された。しかしながら
、Ｓｋｐの過剰発現によりファージ上の機能的抗体分子数が増加する場合は、同
じ数の精製ファージ粒子からの抗原結合ファージＥＬＩＳＡシグナルはより高い
（図４）。この効果は、程度は異なるものの試験した４抗体すべてにみられる。 次に、Ｓｋｐの過剰発現によりファージ当たりの融合タンパク質の総量が増加
するかについても試験した。この目的のために、モノクローナル抗体１０Ｃ３を
用い、Westernブロットによりファージミッド上のｓｋｐの存在下または非存在 下で、精製ファージ粒子上の完全長融合タンパク質の量を分析した（Tesarら、1
995）（図５）。ｓｃＦｖ４−４−２０では、Ｓｋｐの同時発現は、ファージ上 に存在する融合タンパク質の存在を劇的に増加した。同量の精製ファージをゲル
に適用したので、Ｓｋｐはファージ内への機能的融合タンパク質の取り込みを促
すはずであり、これは抗原結合ＥＬＩＳＡの結果にも反映される（上記参照）。
Ｓｋｐは、取り込みの最終レベルおよび程度は異なるものの試験した６抗体すべ
てにこの効果を示す。融合タンパク質は、ｇ３ｐ ｗｔ（ヘルパーファージによ りコートされた）に比べまだほんのわずかであるため、ｇ３ｐ ｗｔの減少を確 実に測定できないが、ｓｃＦｖ−ｇ３ｐ融合タンパク質は、過剰発現Ｓｋｐの存
在下でよりしばしばｇ３ｐ ｗｔを生じるようである。
【００２７】 １．５．可溶性タンパク質発現に対するＳｋｐ同時発現の効果 次に、非サプレッサー株ＪＭ８３を用い、いくつかの可溶形のｓｃＦｖ断片の
産生に対するＳｋｐの効果について試験した。抗原結合ＥＬＩＳＡ（図６）では
、同時発現Ｓｋｐ存在下で可溶性ｓｃＦｖの量が劇的に増加したことがわかる。
これが精製タンパク質の収量にも反映することを示すため、抗ホスホリルコリン
結合抗体ＭｃＰＣ６０３−Ｈ１１のｓｃＦｖ断片について試験した（Knappik &
Plueckthun,1995）。Ｓｋｐの同時発現はホスホリルコリンアフィニティクロマ トグラフィで精製したタンパク質の量を約４倍増加した。 図４および図５の結果は、ｓｃＦｖ断片のE.coliペリプラズムにおける凝集傾
向が強まれば、ファージＥＬＩＳＡにおけるＳｋｐの影響がより強まることを示
唆する。ペリプラズム中で発現するとき非常によくホールドされ、不溶性物質が
ほとんどみられないＦＩＴＣ−Ｅ２のｓｃＦｖ断片では（Vaughanら、1996、Kre
bberら、1997a）、不完全にホールディングされたｓｃＦｖ４−４−２０（Nieba
ら、1997)およびＡＢＰＣ４８−Ｃ（Ｈ２２）Ｓ (Probaら、1997、Probaら、199
8)に比べてファージＥＬＩＳＡにおけるＳｋｐの影響の減少が観察された。４−
４−２０に比べて改良された特徴を有する操作Ｆｌｕ４Ｄ５（Jung & Plueckthu
n,1997）は中等度であった。このことはｓｃＦｖの機能的発現が向上し、その凝
集傾向が低くなれば、Ｓｋｐの影響は少なくなることを示し、Ｓｋｐが不完全に
発現されたｓｃＦｖ断片およびその融合タンパク質の正しいホールディングを支
持することを示唆する。
産生に対するＳｋｐの効果について試験した。抗原結合ＥＬＩＳＡ（図６）では
、同時発現Ｓｋｐ存在下で可溶性ｓｃＦｖの量が劇的に増加したことがわかる。
これが精製タンパク質の収量にも反映することを示すため、抗ホスホリルコリン
結合抗体ＭｃＰＣ６０３−Ｈ１１のｓｃＦｖ断片について試験した（Knappik &
Plueckthun,1995）。Ｓｋｐの同時発現はホスホリルコリンアフィニティクロマ トグラフィで精製したタンパク質の量を約４倍増加した。 図４および図５の結果は、ｓｃＦｖ断片のE.coliペリプラズムにおける凝集傾
向が強まれば、ファージＥＬＩＳＡにおけるＳｋｐの影響がより強まることを示
唆する。ペリプラズム中で発現するとき非常によくホールドされ、不溶性物質が
ほとんどみられないＦＩＴＣ−Ｅ２のｓｃＦｖ断片では（Vaughanら、1996、Kre
bberら、1997a）、不完全にホールディングされたｓｃＦｖ４−４−２０（Nieba
ら、1997)およびＡＢＰＣ４８−Ｃ（Ｈ２２）Ｓ (Probaら、1997、Probaら、199
8)に比べてファージＥＬＩＳＡにおけるＳｋｐの影響の減少が観察された。４−
４−２０に比べて改良された特徴を有する操作Ｆｌｕ４Ｄ５（Jung & Plueckthu
n,1997）は中等度であった。このことはｓｃＦｖの機能的発現が向上し、その凝
集傾向が低くなれば、Ｓｋｐの影響は少なくなることを示し、Ｓｋｐが不完全に
発現されたｓｃＦｖ断片およびその融合タンパク質の正しいホールディングを支
持することを示唆する。
【００２８】 実施例２：ＦｋｐＡの同定および応用 ２．１．実験プロトコール ゲノムライブラリーの構築。抗レバン抗体ＡＢＰＣ−Ｃ（Ｈ２２）ＳのｓｃＦ
ｖ断片をコードするゲル精製Ｓｆｉｌ断片（Probaら、1997、Probaら、1998）を
ベクターｐＨＢ１００に連結し（BothmannおよびPlueckthun, 1998）、プラスミ
ドｐＨＢ１２１を得た。E.coli RC354cのゲノムＤＮＡ（ChenおよびHenning, 19
96)をNucleobond AXG100カートリッジを用い、製造業者のプロトコール（Macher
ey-Nagel)に従って単離した。ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、 １％アガロースゲルに適用した。１ｋｂ〜６ｋｂ長の範囲を切り出し、ゲノムＤ
ＮＡをＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭアガローススピンカラム（Supelco）を用いて溶出 し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。E.coliライ
ブラリーをｐＨＢ１２１のポリリンカーのＢｇIII部位に連結した後、連結混合 物をｎ−ブタノールで沈殿させ、E.coli XL-1-Blue (Stratagene）にエレクトロ
ポーレーションした。５３０ｃｍ2ディッシュ（Ｎｕｎｃ）中の２ｘＹＴにプレ ーティングし、３７℃で一夜インキュベーションした後、２ｘＹＴ ５ｍＬでプ レートからコロニーを洗いとり、ＯＤ550を測定し、最終濃度５０％にグリセロ ールを加えた後、細胞を−８０℃で保存した。 ファージパニング。実施例１の記載に従ってファージパニングを行った。ＦＩ
ＴＣ−ＢＳＡを用いるかわりにＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬレバン（ポリフルクト
ース、Sigma）を用い、４℃で一夜、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）をコートした 。
ｖ断片をコードするゲル精製Ｓｆｉｌ断片（Probaら、1997、Probaら、1998）を
ベクターｐＨＢ１００に連結し（BothmannおよびPlueckthun, 1998）、プラスミ
ドｐＨＢ１２１を得た。E.coli RC354cのゲノムＤＮＡ（ChenおよびHenning, 19
96)をNucleobond AXG100カートリッジを用い、製造業者のプロトコール（Macher
ey-Nagel)に従って単離した。ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、 １％アガロースゲルに適用した。１ｋｂ〜６ｋｂ長の範囲を切り出し、ゲノムＤ
ＮＡをＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭアガローススピンカラム（Supelco）を用いて溶出 し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。E.coliライ
ブラリーをｐＨＢ１２１のポリリンカーのＢｇIII部位に連結した後、連結混合 物をｎ−ブタノールで沈殿させ、E.coli XL-1-Blue (Stratagene）にエレクトロ
ポーレーションした。５３０ｃｍ2ディッシュ（Ｎｕｎｃ）中の２ｘＹＴにプレ ーティングし、３７℃で一夜インキュベーションした後、２ｘＹＴ ５ｍＬでプ レートからコロニーを洗いとり、ＯＤ550を測定し、最終濃度５０％にグリセロ ールを加えた後、細胞を−８０℃で保存した。 ファージパニング。実施例１の記載に従ってファージパニングを行った。ＦＩ
ＴＣ−ＢＳＡを用いるかわりにＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬレバン（ポリフルクト
ース、Sigma）を用い、４℃で一夜、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）をコートした 。
【００２９】 ファージ精製およびＥＬＩＳＡ。ファージ精製およびＥＬＩＳＡは、実施例１
の記載に厳密に従って行った。 ２．２．ファージ選択と同時発現因子の同定。 E.coliゲノムライブラリーのレシピエントとして抗レバン抗体ＡＢＰＣ４８−
Ｃ（Ｈ２２）Ｓの不完全にホールディングしたｓｃＦｖ断片を表現するファージ
ミッドを用いた。E.coli ＲＣ３５４ｃ−ＤＮＡ（ｓｋｐ欠損株）を１〜６ｋｂ にサイズ分画化し、プラスミドｐＨＢ１２１のポリリンカーに連結した。すなわ
ち、自身のプロモーターのもとで制御されたE.coli遺伝子は、主としてベクター
のコピー数の影響によりファージミッド上に過剰発現される。６．４ｘ１０5ク ローンのライブラリーサイズは、生存し得るクローンをもたらすならば、確実に
E.coliゲノムの各片に相当するはずである。 レバンを用いてパニングを７回行い、各パニング後にファージミッドＤＮＡを
制限酵素ＮｏｔＩで切断し、あらゆる挿入物の蓄積を検出した。約１．７ｋｂお
よび２．０ｋｂの２本のバンドがパニングにより蓄積することが図７に示されて
いる。７回目のパニング後に分析した１７個の単一コロニーのうち１４個が１．
７ｋｂ挿入物を、３個が２．０ｋｂ挿入物を保持していた。両挿入物をシーケン
スし、１．７ｋｂのバンドは１６２９ｋｂ長の挿入物を含み、２．０ｋｂのバン
ドは１９８７ｂｐ長の挿入物を含む（図８）。両挿入物は、ペリプラズム性タン
パク質ＦｋｐＡ、および未知の機能を有するタンパク質ＳｌｙＸをコードする同
じ２つの完全な遺伝子を含む（HorneおよびYoung,1995、Missiakasら、1996）。
両挿入物はｆｋｐＡの終止コドンの上流２１８ｂｐから開始する。したがって、
両挿入物はHaemophilus influenzae HI0575と強い類似性を有するタンパク質を コードする遺伝子ｙｈｅＯの最初の２１ａａをコードする。１６２９ｂｐ挿入物
はｓｌｙＸの終止コドンの下流１５９ｂｐで終わるが、１９８７ｂｐ挿入物はｓ
ｌｙＸの終止コドンの下流５２８ｂｐで終わる。両挿入物はＳｌｙＤのＣ末端部
分をコードする（Roofら、1994、Roofら、1997、Hottenrottら、1997)。１９８ ７ｂｐ挿入物は、未知の機能を有するタンパク質であるＹｈｅＰの最初の１１７
ａａをもコードする。２つの完全遺伝子のどちらが豊富化をもたらすかを試験す
るため、ｆｋｐＡおよびｓｌｙＸをＰＣＲ増幅させ、ベクターｐＨＢ１０２の同
じ位置に別個に、および組み合わせて正確に細クローンした（実施例１参照）。
の記載に厳密に従って行った。 ２．２．ファージ選択と同時発現因子の同定。 E.coliゲノムライブラリーのレシピエントとして抗レバン抗体ＡＢＰＣ４８−
Ｃ（Ｈ２２）Ｓの不完全にホールディングしたｓｃＦｖ断片を表現するファージ
ミッドを用いた。E.coli ＲＣ３５４ｃ−ＤＮＡ（ｓｋｐ欠損株）を１〜６ｋｂ にサイズ分画化し、プラスミドｐＨＢ１２１のポリリンカーに連結した。すなわ
ち、自身のプロモーターのもとで制御されたE.coli遺伝子は、主としてベクター
のコピー数の影響によりファージミッド上に過剰発現される。６．４ｘ１０5ク ローンのライブラリーサイズは、生存し得るクローンをもたらすならば、確実に
E.coliゲノムの各片に相当するはずである。 レバンを用いてパニングを７回行い、各パニング後にファージミッドＤＮＡを
制限酵素ＮｏｔＩで切断し、あらゆる挿入物の蓄積を検出した。約１．７ｋｂお
よび２．０ｋｂの２本のバンドがパニングにより蓄積することが図７に示されて
いる。７回目のパニング後に分析した１７個の単一コロニーのうち１４個が１．
７ｋｂ挿入物を、３個が２．０ｋｂ挿入物を保持していた。両挿入物をシーケン
スし、１．７ｋｂのバンドは１６２９ｋｂ長の挿入物を含み、２．０ｋｂのバン
ドは１９８７ｂｐ長の挿入物を含む（図８）。両挿入物は、ペリプラズム性タン
パク質ＦｋｐＡ、および未知の機能を有するタンパク質ＳｌｙＸをコードする同
じ２つの完全な遺伝子を含む（HorneおよびYoung,1995、Missiakasら、1996）。
両挿入物はｆｋｐＡの終止コドンの上流２１８ｂｐから開始する。したがって、
両挿入物はHaemophilus influenzae HI0575と強い類似性を有するタンパク質を コードする遺伝子ｙｈｅＯの最初の２１ａａをコードする。１６２９ｂｐ挿入物
はｓｌｙＸの終止コドンの下流１５９ｂｐで終わるが、１９８７ｂｐ挿入物はｓ
ｌｙＸの終止コドンの下流５２８ｂｐで終わる。両挿入物はＳｌｙＤのＣ末端部
分をコードする（Roofら、1994、Roofら、1997、Hottenrottら、1997)。１９８ ７ｂｐ挿入物は、未知の機能を有するタンパク質であるＹｈｅＰの最初の１１７
ａａをもコードする。２つの完全遺伝子のどちらが豊富化をもたらすかを試験す
るため、ｆｋｐＡおよびｓｌｙＸをＰＣＲ増幅させ、ベクターｐＨＢ１０２の同
じ位置に別個に、および組み合わせて正確に細クローンした（実施例１参照）。
【００３０】 ２．３．ファージ表現に対するＦｋｐＡおよびＳｌｙＸの影響の特徴付け ＦｋｐＡおよびＳｌｙＸがいかにそしてなぜ豊富化を生じるかを検討するため
、同時発現ＦｋｐＡおよびＳｌｙＸの存在下または非存在下で産生されるファー
ジを最初に特徴づけた。抗原結合ファージＥＬＩＳＡ（図９）は、ＦｋｐＡの過
剰発現はＳｋｐを過剰発現するかまたは過剰発現していない場合に比べファージ
上の機能的抗体分子数を増加させることを示した。これに対して、ＳｌｙＸの過
剰発現はファージ上の機能的抗体分子数に影響しなかった。
、同時発現ＦｋｐＡおよびＳｌｙＸの存在下または非存在下で産生されるファー
ジを最初に特徴づけた。抗原結合ファージＥＬＩＳＡ（図９）は、ＦｋｐＡの過
剰発現はＳｋｐを過剰発現するかまたは過剰発現していない場合に比べファージ
上の機能的抗体分子数を増加させることを示した。これに対して、ＳｌｙＸの過
剰発現はファージ上の機能的抗体分子数に影響しなかった。
【００３１】 参考文献
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【図１】 選択法の模式図。Ａ：選択の原理。E.coliゲノムライブラリーはｇ３
ｐと融合しｓｃＦｖ断片と同時発現する。抗体は全体を通して同じであるが、そ
のホールディング収量は同時発現する因子に応じて異なる。この因子はファージ
上には表現されないが、ファージを産生する宿主細胞において発現し、有用な因
子の場合、表現されるｓｃＦｖ断片の「品質」を向上させる。該因子の遺伝子は
ファージ上にコードされているので、その情報はファージを抗原に対してパニン
グすることにより豊富化される。Ｂ：ライブラリー構築に用いるファージミッド
ベクター。
ｐと融合しｓｃＦｖ断片と同時発現する。抗体は全体を通して同じであるが、そ
のホールディング収量は同時発現する因子に応じて異なる。この因子はファージ
上には表現されないが、ファージを産生する宿主細胞において発現し、有用な因
子の場合、表現されるｓｃＦｖ断片の「品質」を向上させる。該因子の遺伝子は
ファージ上にコードされているので、その情報はファージを抗原に対してパニン
グすることにより豊富化される。Ｂ：ライブラリー構築に用いるファージミッド
ベクター。
【図２】 異なるパニング実施後のファージミッドプールの分析。各回のファー
ジ増殖について、一夜培養から回収した細胞からファージミッドを調製した。フ
ァージミッドプールをＮｏｔＩを用いる制限消化により分析した。M：分子量マ ーカーとしてPstI消化λ−ＤＮＡ。レーン１〜７：パニング後の感染細胞からの
ファージミッド、レーン０：第一パニング前のファージミッド。
ジ増殖について、一夜培養から回収した細胞からファージミッドを調製した。フ
ァージミッドプールをＮｏｔＩを用いる制限消化により分析した。M：分子量マ ーカーとしてPstI消化λ−ＤＮＡ。レーン１〜７：パニング後の感染細胞からの
ファージミッド、レーン０：第一パニング前のファージミッド。
【図３】 ファージ表現およびパニングにより豊富化された９５２ｂｐ挿入物の
模式図。Ｙａｅｔは機能が知られていない８１０ａａのＯＲＦ産物である。Ｙａ
ｅｔは、Haemophilus influenzaeの保護表面抗原Ｄ１５のアミノ酸、および他の
細菌のそれと６６．２％の類似性を示す（実施例１．３参照）。遺伝子ＩｐｘＤ
はＵＤＰ−３−Ｏ−［３−ヒドロキシミリストイル］−グルコサミン−Ｎ−アシ
ルトランスフェラーゼをコードする。この挿入物上に見いだされる完全なＯＲＦ
のみが遺伝子ｓｋｐである。得られるＳａｕ３ＡＩ断片がＳｋｐの完全発現ユニ
ットを含む最も小さい断片であることに注意せよ。ＳＤ、Shine-Dalgarno配列、
ｐ、プロモータ領域（天然ネットワーク分析により予測（Reese,1994））。
模式図。Ｙａｅｔは機能が知られていない８１０ａａのＯＲＦ産物である。Ｙａ
ｅｔは、Haemophilus influenzaeの保護表面抗原Ｄ１５のアミノ酸、および他の
細菌のそれと６６．２％の類似性を示す（実施例１．３参照）。遺伝子ＩｐｘＤ
はＵＤＰ−３−Ｏ−［３−ヒドロキシミリストイル］−グルコサミン−Ｎ−アシ
ルトランスフェラーゼをコードする。この挿入物上に見いだされる完全なＯＲＦ
のみが遺伝子ｓｋｐである。得られるＳａｕ３ＡＩ断片がＳｋｐの完全発現ユニ
ットを含む最も小さい断片であることに注意せよ。ＳＤ、Shine-Dalgarno配列、
ｐ、プロモータ領域（天然ネットワーク分析により予測（Reese,1994））。
【図４】 ｓｃＦｖ断片４−４−２０（Niebaら、1997）、４Ｄ５Ｆｌｕ（Jung およびPlueckthun,1997）、ＦＩＴＣ−Ｅ２（Vaughanら、1996、Krebberら、199
7a）、およびＡＢＰＣ４８−ＣＨ２２Ｓ（Probaら、1997；Probaら、1998）を表
現する、Ｓｋｐを過剰発現するかまたはせずに増殖したファージの抗原結合ＥＬ
ＩＳＡ。ファージは実施例１．２に記載のＣｓＣｌ勾配により精製された。過剰
発現したＳｋｐの存在下で増殖したファージではＳｋｐを過剰発現せずに増殖し
たファージに比べて抗原結合ＥＬＩＳＡシグナルが高くなる。可溶性抗原による
阻害は、結合が特異的であることを示している。
7a）、およびＡＢＰＣ４８−ＣＨ２２Ｓ（Probaら、1997；Probaら、1998）を表
現する、Ｓｋｐを過剰発現するかまたはせずに増殖したファージの抗原結合ＥＬ
ＩＳＡ。ファージは実施例１．２に記載のＣｓＣｌ勾配により精製された。過剰
発現したＳｋｐの存在下で増殖したファージではＳｋｐを過剰発現せずに増殖し
たファージに比べて抗原結合ＥＬＩＳＡシグナルが高くなる。可溶性抗原による
阻害は、結合が特異的であることを示している。
【図５】 ファージブロット。ｓｃＦｖ断片４−４−２０（Niebaら、1997）、 ４Ｄ５Ｆｌｕ（JungおよびPlueckthun,1997）、ＦＩＴＣ−Ｅ２（Vaughanら、19
96、Krebberら、1997a）、ＭｃＰＣ６０３−Ｈ１１(KnappikおよびPlueckthun,
1995）、ＡＢＰＣ４８−ＣＨ２２Ｓ（Probaら、1997；Probaら、1998）、および
ＡＬ２１４のｇ３ｐ融合物を保持するファージをＳｋｐを過剰発現させるか、ま
たはさせずに増殖させた。ファージは実施例１．２に記載のＣｓＣｌ勾配により
精製された。過剰発現したＳｋｐの存在下ではプラスミド上にＳｋｐを欠く場合
より融合タンパク質がファージ内により多く取り込まれる。ヘルパーファージＶ
ＣＳ Ｍ１３（Stratagene）をｇ３ｐ ｗｔのサイズ基準としてロードした。
96、Krebberら、1997a）、ＭｃＰＣ６０３−Ｈ１１(KnappikおよびPlueckthun,
1995）、ＡＢＰＣ４８−ＣＨ２２Ｓ（Probaら、1997；Probaら、1998）、および
ＡＬ２１４のｇ３ｐ融合物を保持するファージをＳｋｐを過剰発現させるか、ま
たはさせずに増殖させた。ファージは実施例１．２に記載のＣｓＣｌ勾配により
精製された。過剰発現したＳｋｐの存在下ではプラスミド上にＳｋｐを欠く場合
より融合タンパク質がファージ内により多く取り込まれる。ヘルパーファージＶ
ＣＳ Ｍ１３（Stratagene）をｇ３ｐ ｗｔのサイズ基準としてロードした。
【図６】 粗抽出ＥＬＩＳＡ。Ｓｋｐを過剰発現するか、またはしていない可溶
性ｓｃＦｖ断片４−４−２０（Niebaら、1997）およびＡＢＰＣ４８−ＣＨ２２ Ｓ（Probaら、1997；Probaら、1998）を発現するE.coli JM83からの粗抽出物を 実施例１．２に記載のごとく作製した。Ｓｋｐ存在下で産生されるＳｃＦｖ断片
はプラスミド上にＳｋｐを欠く場合より抗原結合ＥＬＩＳＡシグナルが高くなる
。可溶性抗原による阻害は結合が特異的であることを示す。
性ｓｃＦｖ断片４−４−２０（Niebaら、1997）およびＡＢＰＣ４８−ＣＨ２２ Ｓ（Probaら、1997；Probaら、1998）を発現するE.coli JM83からの粗抽出物を 実施例１．２に記載のごとく作製した。Ｓｋｐ存在下で産生されるＳｃＦｖ断片
はプラスミド上にＳｋｐを欠く場合より抗原結合ＥＬＩＳＡシグナルが高くなる
。可溶性抗原による阻害は結合が特異的であることを示す。
【図７】 異なるパニング後のファージミッドプールの分析。各回のファージ増
殖について、一夜培養から回収した細胞からファージミッドを作製した。ファー
ジミッドプールをＮｏｔＩを用いる制限消化により分析した。Ｍ：分子量マーカ
ーとしてPstI消化λ−ＤＮＡ。レーン１〜７：パニング後の感染細胞からのファ
ージミッド。レーン０：第一パニング前のファージミッド。
殖について、一夜培養から回収した細胞からファージミッドを作製した。ファー
ジミッドプールをＮｏｔＩを用いる制限消化により分析した。Ｍ：分子量マーカ
ーとしてPstI消化λ−ＤＮＡ。レーン１〜７：パニング後の感染細胞からのファ
ージミッド。レーン０：第一パニング前のファージミッド。
【図８】 ファージ表現およびパニングにより豊富化された１６２４ｂｐおよび
１９８７挿入物の模式図。ＹｈｅＯはH.influenzae HI0575と類似性が強いタン パク質である。ＦｋｐＡはペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラー
ゼである。ＳｌｙＸはまだ未知の機能を有するタンパク質である。ＳｌｙＤはペ
プチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼである。ＹｈｅＰはまだ未
知の機能を有するタンパク質である。
１９８７挿入物の模式図。ＹｈｅＯはH.influenzae HI0575と類似性が強いタン パク質である。ＦｋｐＡはペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラー
ゼである。ＳｌｙＸはまだ未知の機能を有するタンパク質である。ＳｌｙＤはペ
プチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼである。ＹｈｅＰはまだ未
知の機能を有するタンパク質である。
【図９】 ｓｃＦｖ ＡＢＰＣ４８−Ｃ（Ｈ２２）Ｓを表現するＳｋｐ、Ｆｋｐ Ａ、ＳｌｙＸ、ＦｋｐＡ＋ＳｌｙＸ、およびＦｋｐＡ＋Ｓｋｐを過剰発現するか
またはせずに増殖したファージの抗原結合ＥＬＩＳＡ（Probaら、1997; Probaら
、1998）。ファージは実施例１．２に記載のごとくＣｓＣｌ勾配により精製した
。過剰発現したＳｋｐ存在下で増殖するファージではプラスミド上にＳｋｐを過
剰発現していない場合より抗原結合ＥＬＩＳＡシグナルが高くなる。可溶性抗原
による阻害は結合が特異的であることを示す。
またはせずに増殖したファージの抗原結合ＥＬＩＳＡ（Probaら、1997; Probaら
、1998）。ファージは実施例１．２に記載のごとくＣｓＣｌ勾配により精製した
。過剰発現したＳｋｐ存在下で増殖するファージではプラスミド上にＳｋｐを過
剰発現していない場合より抗原結合ＥＬＩＳＡシグナルが高くなる。可溶性抗原
による阻害は結合が特異的であることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA03 CA04 CA07 CA12 DA06 GA11 HA11 4B063 QA01 QA05 QQ79 QR48 QS33 QX01 4H045 AA10 BA41 CA01 CA11 DA75 FA74
Claims (15)
- 【請求項１】 （ポリ）ペプチドとペリプラズム性タンパク質の同時発現に
より細菌において機能形のペリプラズム性タンパク質の発現収量を増加させる（
ポリ）ペプチドをコードする配列を含む核酸配列を得るための方法であって、 （ａ）各細胞が（ｉ）核酸配列コレクション中の第一核酸配列および （ii）該ペリプラズム性タンパク質をコードする第二核酸配列を含む宿主細胞コ
レクションを得、 （ｂ）（ｉ）該核酸配列コレクションから発現し得る（ポリ）ペプチドおよび （ii）該第二核酸配列から発現し得るペリプラズム性タンパク質の発現を引き起
こすかまたは許し、 （ｃ）発現する該ペリプラズム性タンパク質の機能的収量が増加している宿主細
胞をスクリーニングまたは選択し、 （ｄ）所望により、工程（ｃ）を１回またはそれ以上反復し、 （ｅ）該宿主細胞中に含まれる第一核酸配列を得る工程を含む方法。 - 【請求項２】 さらに、該第一核酸配列中に含まれる（ポリ）ペプチドをコ
ードする配列を同定する工程を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該第一核酸配列が有機体のゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、
またはｃＤＮＡであるかまたはそれらから誘導されるものである請求項１または
２記載の方法。 - 【請求項４】 該第一核酸配列が少なくとも部分的に無作為化された配列を
含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 （ａ）該第一核酸配列が糸状ファージ粒子中にパッケージさ
れ得るベクター中に含まれ、 （ｂ）該ペリプラズム性タンパク質が糸状ファージコートタンパク質の少なくと
も部分とさらなるタンパク質の融合タンパク質であり、 該発現の過程で、該さらなるタンパク質を表現する糸状ファージ粒子のコレクシ
ョンが該宿主細胞コレクションから生成されるものである請求項１〜４のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項６】 該さらなるタンパク質が免疫グロブリンスーパーファミリー
、好ましくは免疫グロブリンファミリーの少なくともドメインを含むものである
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 該さらなるタンパク質がＦｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合
Ｆｖ、およびＦａｂ断片の群から選ばれる免疫グロブリン断片である請求項６記
載の方法。 - 【請求項８】 （ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の方法に従って核酸配
列または（ポリ）ペプチドコード配列を同定し、 （ｂ）それから（ポリ）ペプチドを推定する工程を含む、ペリプラズム性タンパ
ク質と（ポリ）ペプチドの同時発現により細菌において機能形のペリプラズム性
タンパク質の発現収量を増加させる（ポリ）ペプチドを同定するための方法。 - 【請求項９】 請求項８記載の方法により同定される（ポリ）ペプチドとペ
リプラズム性タンパク質を同時発現させることを特徴とする細菌宿主細胞におい
て機能形のペリプラズム性タンパク質の発現を増加させる方法。 - 【請求項１０】 該ペリプラズム性タンパク質が、宿主細胞コレクションに
おいて発現する多くのペリプラズム性タンパク質コレクションである請求項９記
載の方法。 - 【請求項１１】 該（ポリ）ペプチドがＥ．ｃｏｌｉタンパク質Ｓｋｐまた
はその相同体である請求項９または１０記載の方法。 - 【請求項１２】 該（ポリ）ペプチドがＥ．ｃｏｌｉタンパク質ＦｋｐＡま
たはその相同体である請求項９または１０記載の方法。 - 【請求項１３】 該ペリプラズム性タンパク質が糸状ファージコートタンパ
ク質の少なくとも部分とさらなるタンパク質の融合タンパク質である請求項９〜
１２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 該タンパク質が免疫グロブリンスーパーファミリー、好ま
しくは免疫グロブリンファミリーの少なくともドメインを含むものである請求項
９〜１３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】 該さらなるタンパク質がＦｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結
合Ｆｖ、およびＦａｂ断片の群から選ばれる免疫グロブリン断片である請求項１
４記載の方法。
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