JP2001520017A - ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ−１）複製の阻害 - Google Patents
ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ−１）複製の阻害Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ＨＩＶ−１調節性抗ウイルス系に向けられる。本発明は標的細胞内に抗ウイルス酵素を転移するための構成及び方法を提供する。ここでこの酵素はＨＩＶ−１調節下に置かれる。標的細胞のＨＩＶ−１感染は、抗ウイルス酵素の活性化をもたらし、その結果ウイルス複製を阻害する。このＨＩＶ−１制御性抗ウイルスアプローチは、伝統的な化学療法アプローチと組み合わせることができ、抗ウイルス薬剤の顕著な減少を可能とすると共に副作用を減らし、又ＨＩＶ−１を潜伏状態に維持することを可能とする。
Description
【０００１】 政府助成金関係 ここに記載される発明は、一部、米国公衆衛生局助成金ＲＯ１−ＡＩ３４７６
５によって援助された研究の過程で成された。政府は本発明に若干の権利を有す
る。
５によって援助された研究の過程で成された。政府は本発明に若干の権利を有す
る。
【０００２】 発明の分野 本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を阻害するため、又ＨＩＶ
感染及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を処置するための、細胞内免疫処置
方法及び組成物に関する。
感染及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を処置するための、細胞内免疫処置
方法及び組成物に関する。
【０００３】 発明の背景 Ａ）ＨＩＶ（ヒブ）及びＡＩＤＳ（エイズ） ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病
原論的作用因子である。ＨＩＶの分子特性及びＡＩＤＳの進行については、多く
のことがすでに学ばれているが、有効な治療又は予防処置方式の開発は、種々の
障害に悩まされてきた。
原論的作用因子である。ＨＩＶの分子特性及びＡＩＤＳの進行については、多く
のことがすでに学ばれているが、有効な治療又は予防処置方式の開発は、種々の
障害に悩まされてきた。
【０００４】 Ｂ）ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳ 現在、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳに対する好適な予防接種又は治療はない。ヌク
レオシド類似体及びプロテアーゼ阻害剤を含むＨＩＶ感染及びＡＩＤＳに対する
現行の方策は、耐性レトロウイルス種の進化によって証明されるように、有効性
が限定されてきた。
レオシド類似体及びプロテアーゼ阻害剤を含むＨＩＶ感染及びＡＩＤＳに対する
現行の方策は、耐性レトロウイルス種の進化によって証明されるように、有効性
が限定されてきた。
【０００５】 近年まで、広く行われているＨＩＶ感染に対する処置は、強力な蛋白質逆転写
酵素阻害剤として働く２′，３′ジデオキシヌクレオシド類似体類を含む。これ
らの化合物は、感染した個体中のＨＩＶウイルスのレベルを顕著に減少させうる
が、しかし、ＨＩＶ逆転写酵素の低い適合度のために、耐性ウイルス種の選択を
促進しうる。
酵素阻害剤として働く２′，３′ジデオキシヌクレオシド類似体類を含む。これ
らの化合物は、感染した個体中のＨＩＶウイルスのレベルを顕著に減少させうる
が、しかし、ＨＩＶ逆転写酵素の低い適合度のために、耐性ウイルス種の選択を
促進しうる。
【０００６】 ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤の開発は、治
療上のオプションの幅を広げ、ＨＩＶのライフサイクル中の複数の段階を標的と
する複合治療を可能とした。しかしながら、これらの抗レトロウイルス化合物類
は、しばしば薬物治療の複雑化及び停止を招く種々の副作用を有する。更に、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ（インビボ：生体内）における、複合治療に関係したレトロウイル
スの突然変異（ミューテーション）の程度を評価する長期間の研究は完了してい
ない（モイル（Moyle）ら、Quart. J. Med. ８６：１５５−６３（１９９３））
。現在の方法の他の難点はコストである。逆転写酵素及びプロテアーゼ阻害剤の
三つの組み合わせを用いたＡＩＤＳの処置のための年々のコストは驚異的であり
、又このような治療を際限なく続ける必要がある場合がある。
療上のオプションの幅を広げ、ＨＩＶのライフサイクル中の複数の段階を標的と
する複合治療を可能とした。しかしながら、これらの抗レトロウイルス化合物類
は、しばしば薬物治療の複雑化及び停止を招く種々の副作用を有する。更に、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ（インビボ：生体内）における、複合治療に関係したレトロウイル
スの突然変異（ミューテーション）の程度を評価する長期間の研究は完了してい
ない（モイル（Moyle）ら、Quart. J. Med. ８６：１５５−６３（１９９３））
。現在の方法の他の難点はコストである。逆転写酵素及びプロテアーゼ阻害剤の
三つの組み合わせを用いたＡＩＤＳの処置のための年々のコストは驚異的であり
、又このような治療を際限なく続ける必要がある場合がある。
【０００７】 ＨＩＶ感染を管理し、抗ウイルス薬物の用量（投薬量）を低くし、付随の毒性
を減少し、又ＨＩＶ感染した個体中での耐性株の発生を減少することのできる、
更なる治療的アプローチが必要である。
を減少し、又ＨＩＶ感染した個体中での耐性株の発生を減少することのできる、
更なる治療的アプローチが必要である。
【０００８】 Ｃ）インターフェロン及びインターフェロン誘導遺伝子 インターフェロンは、ウイルス感染及び腫瘍に対抗する細胞の防御機構に含ま
れるホルモン様蛋白質である。Ｉ型インターフェロンは、ウイルス感染に干渉し
うる一群の抗ウイルス遺伝子生産物を、シグナル伝達経路を介して誘導する能力
を有する。３つの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）依存性酵素が、誘導される遺伝子
ファミリーに含まれる：２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼ（合成酵
素）、アデノシンデアミナーゼ（脱アミノ酵素）、及びｄｓＲＮＡ依存性のイン
ターフェロン誘導プロテインキナーゼである、ＰＫＲ（バグリオニ（Baglioni）
、Cell １７：２５５−２６４（１９７９））；パターソン（Patterson）ら、Vi rology ２１０：５０８−５１１（１９９５））。ｐ６８プロテインキナーゼ（ ＰＫＲ）及び２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼ（２−５ＯＡＳ）／
ＲＮアーゼ Ｌ経路は、それぞれ蛋白質合成及び一本鎖ＲＮＡの分解を介して、
ウイルス複製を阻害する。
れるホルモン様蛋白質である。Ｉ型インターフェロンは、ウイルス感染に干渉し
うる一群の抗ウイルス遺伝子生産物を、シグナル伝達経路を介して誘導する能力
を有する。３つの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）依存性酵素が、誘導される遺伝子
ファミリーに含まれる：２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼ（合成酵
素）、アデノシンデアミナーゼ（脱アミノ酵素）、及びｄｓＲＮＡ依存性のイン
ターフェロン誘導プロテインキナーゼである、ＰＫＲ（バグリオニ（Baglioni）
、Cell １７：２５５−２６４（１９７９））；パターソン（Patterson）ら、Vi rology ２１０：５０８−５１１（１９９５））。ｐ６８プロテインキナーゼ（ ＰＫＲ）及び２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼ（２−５ＯＡＳ）／
ＲＮアーゼ Ｌ経路は、それぞれ蛋白質合成及び一本鎖ＲＮＡの分解を介して、
ウイルス複製を阻害する。
【０００９】 セリン／トレオニンキナーゼ、ＰＫＲ（これは、ＤＡＩ、ｐ６８、ｄｓｌ、Ｐ
１キナーゼ、及びＰＫdsとも呼ばれる。）は、進化において高度に保存されてき
た。相同酵素は、哺乳動物、酵母、及び植物中に存在する（チェン（Chen）ら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：７７２９−７７３３（１９９１）；コスト ゥラ （Kostura）ら、Mol. Cell Biol. ９：１５７６−１５８６（１９８９）；ラン グランド（Langland）ら、J. Biol. Chem. ２７１：４５３９−４５４４（１９ ９６））。ＰＫＲに対するヒトｃＤＮＡは２．５ｋｂのＲＮＡをエンコードし、
５５０アミノ酸の蛋白質に翻訳される（メウアーズ（Meurs）ら、Cell ６２：３
７９−３９０（１９９０））。単一のｄｓＲＮＡ分子の周囲での、２分子の６８
ｋＤａＰＫＲの２分子の結合は自己リン酸化事象を開始し、その後、真核性の開
始因子２のαサブユニットのリン酸化が起こり、ＧＤＰからＧＴＰへの再循環反
応を阻害し、蛋白質合成開始の阻害を導く（リー（Lee）ら、Virology １９３：
１０３７−１０４１（１９９３）；マシューズ（Matthews）ら、J. Virol. ６５
：５６５７−５６６２（１９９１）；パタク（Pathak）ら、Mol. Cell Biol. ８
：９９３−９９５（１９８８））。Ｉκ−Ｂα及びＨＩＶ−１ Ｔａｔトランス
作用（トランス−アクチベーション）蛋白質を含む、ＰＫＲリン酸化のための付
加的な基質が、近年同定された（ブランド（Brand）ら、J. Biol. Chem. ２７２
：８３８８−８３９５（１９９７）；マラン（Maran）ら、Science ２６５：７ ８９−７９２（１９９４）；マックミラン（McMillan）ら、Virology ２１３： ４１３−４２４（１９９５））。ｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ：生体外）にて
、ＰＫＲがヒトα−トロポミオシンの３′未翻訳ｍＲＮＡ内のｄｓＲＮＡ構造に
よって活性化されうることが報告された（デイビス（Davis）ら、Proc. Natl. A cad. Sci. USA ９３：５０８−５１３（１９９６））。
１キナーゼ、及びＰＫdsとも呼ばれる。）は、進化において高度に保存されてき
た。相同酵素は、哺乳動物、酵母、及び植物中に存在する（チェン（Chen）ら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：７７２９−７７３３（１９９１）；コスト ゥラ （Kostura）ら、Mol. Cell Biol. ９：１５７６−１５８６（１９８９）；ラン グランド（Langland）ら、J. Biol. Chem. ２７１：４５３９−４５４４（１９ ９６））。ＰＫＲに対するヒトｃＤＮＡは２．５ｋｂのＲＮＡをエンコードし、
５５０アミノ酸の蛋白質に翻訳される（メウアーズ（Meurs）ら、Cell ６２：３
７９−３９０（１９９０））。単一のｄｓＲＮＡ分子の周囲での、２分子の６８
ｋＤａＰＫＲの２分子の結合は自己リン酸化事象を開始し、その後、真核性の開
始因子２のαサブユニットのリン酸化が起こり、ＧＤＰからＧＴＰへの再循環反
応を阻害し、蛋白質合成開始の阻害を導く（リー（Lee）ら、Virology １９３：
１０３７−１０４１（１９９３）；マシューズ（Matthews）ら、J. Virol. ６５
：５６５７−５６６２（１９９１）；パタク（Pathak）ら、Mol. Cell Biol. ８
：９９３−９９５（１９８８））。Ｉκ−Ｂα及びＨＩＶ−１ Ｔａｔトランス
作用（トランス−アクチベーション）蛋白質を含む、ＰＫＲリン酸化のための付
加的な基質が、近年同定された（ブランド（Brand）ら、J. Biol. Chem. ２７２
：８３８８−８３９５（１９９７）；マラン（Maran）ら、Science ２６５：７ ８９−７９２（１９９４）；マックミラン（McMillan）ら、Virology ２１３： ４１３−４２４（１９９５））。ｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ：生体外）にて
、ＰＫＲがヒトα−トロポミオシンの３′未翻訳ｍＲＮＡ内のｄｓＲＮＡ構造に
よって活性化されうることが報告された（デイビス（Davis）ら、Proc. Natl. A cad. Sci. USA ９３：５０８−５１３（１９９６））。
【００１０】 インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、エプスタイン−バールウイルス、
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、アデノウイルス及びワクシニアウイルスを含む
多くの真核性のウイルスは、ＰＫＲ蛋白質及び／又は活性を下方調節（ダウンレ
キュレート）する方策を発達させ、効果的に複製するための、この抗ウイルスシ
ステムを取り囲む進化的要求を示した（カッツェ（Katze）、Seminars Virol. ４：２５９−２６８（１９９３）；マシューズ（Mathews）ら、J. Virol. ６５ ：５６５７−５６６２（１９９１）；モルデチャイ（Mordechai）ら、Virology
２０６：９１３−９２２（１９９５））。ＰＫＲは、脳心筋炎及びワクシニアウ
イルスによる真核性細胞の感染を、効果的に防ぐことが示された（リー（Lee） ら、Virology １９３：１０３７−１０４１（１９９３））。
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、アデノウイルス及びワクシニアウイルスを含む
多くの真核性のウイルスは、ＰＫＲ蛋白質及び／又は活性を下方調節（ダウンレ
キュレート）する方策を発達させ、効果的に複製するための、この抗ウイルスシ
ステムを取り囲む進化的要求を示した（カッツェ（Katze）、Seminars Virol. ４：２５９−２６８（１９９３）；マシューズ（Mathews）ら、J. Virol. ６５ ：５６５７−５６６２（１９９１）；モルデチャイ（Mordechai）ら、Virology
２０６：９１３−９２２（１９９５））。ＰＫＲは、脳心筋炎及びワクシニアウ
イルスによる真核性細胞の感染を、効果的に防ぐことが示された（リー（Lee） ら、Virology １９３：１０３７−１０４１（１９９３））。
【００１１】 又、ＨＩＶ−１はＰＫＲの酵素活性に干渉する方策を考案させた。ＨＩＶ−１
感染が細胞内ＰＫＲ蛋白質レベルの顕著な減少を導くことが報告された（ロイ（
Roy）ら、Science ２４７：１２１６−１２１９（１９９０））、又ＨＩＶ−１ ＴＡＲ ＲＮＡが最適ＰＫＲ活性化濃度を有し、鐘型（bell-shaped）活性曲 線に従うことが報告された（マイトラ（Maitra）ら、Virology ２０４：８２３ −８２７（１９９４）；マシューズ（Mathews）、Seminars Virol. ４：２４７ −２５７（１９９３）；モルデチャイ（Mordechai）ら、Virology ２０６：９１
３−９２２（１９９５）；サムエル（Samuel）、J. Bilo. Chem. ２６８：７６ ０３−７３０６（１９９３））。
感染が細胞内ＰＫＲ蛋白質レベルの顕著な減少を導くことが報告された（ロイ（
Roy）ら、Science ２４７：１２１６−１２１９（１９９０））、又ＨＩＶ−１ ＴＡＲ ＲＮＡが最適ＰＫＲ活性化濃度を有し、鐘型（bell-shaped）活性曲 線に従うことが報告された（マイトラ（Maitra）ら、Virology ２０４：８２３ −８２７（１９９４）；マシューズ（Mathews）、Seminars Virol. ４：２４７ −２５７（１９９３）；モルデチャイ（Mordechai）ら、Virology ２０６：９１
３−９２２（１９９５）；サムエル（Samuel）、J. Bilo. Chem. ２６８：７６ ０３−７３０６（１９９３））。
【００１２】 ２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼ（２−５ＯＡＳ）は、細胞のｄ
ｓＲＮＡ依存性抗ウイルス応答中の、他のインターフェロン誘導酵素である。ｄ
ｓＲＮＡによって活性化されると、２−５ＯＡＳはＡＴＰを２′，５′−オリゴ
アデニレート（２−５Ａ）に変換する。２−５ＯＡＳによって合成された２−５
Ａは、細胞及びウイルスのｍＲＮＡの両方を加水分解するリボヌクレアーゼＬに
結合してこれを活性化する。ＨＩＶ−１に感染した細胞において、２−５Ａのレ
ベルは、ＨＩＶ−１ビリオン（ウイルス粒子）生産に反比例の相関関係にある。
感染の初期段階において、２−５ＯＡＳの一過性の活性化があり、これは２−５
Ａのレベルの激しい増加を導く。感染のより後の段階の間中２−５Ａレベルは下
降し、ＨＩＶ−１ビリオン生産は増加する。高い２−５Ａレベルが、ＨＩＶ感染
細胞がウイルスを生成する低い能力と関連することが報告され（シュロダー（Sc
hroder）ら、J. Biol. Chem. ２６４：５６６９−７３（１９８９））、又ＨＩ Ｖ−１の生成が、２−５ＯＡＳを誘導できるインターフェロンによって阻害され
うることが報告された（ホー（Ho）ら、Lancet １（８４２９）：６０２−０４ （１９８５））。又、２−５ＯＡＳに対するアンチセンスＲＮＡが、インターフ
ェロンによるウイルス感染からの保護の喪失をもたらすことも報告された（デベ
ネデッティ（DeBenedetti）ら、Proc. Natl. Acad. Sci USA ８４：６５８−６ ２（１９８７））。
ｓＲＮＡ依存性抗ウイルス応答中の、他のインターフェロン誘導酵素である。ｄ
ｓＲＮＡによって活性化されると、２−５ＯＡＳはＡＴＰを２′，５′−オリゴ
アデニレート（２−５Ａ）に変換する。２−５ＯＡＳによって合成された２−５
Ａは、細胞及びウイルスのｍＲＮＡの両方を加水分解するリボヌクレアーゼＬに
結合してこれを活性化する。ＨＩＶ−１に感染した細胞において、２−５Ａのレ
ベルは、ＨＩＶ−１ビリオン（ウイルス粒子）生産に反比例の相関関係にある。
感染の初期段階において、２−５ＯＡＳの一過性の活性化があり、これは２−５
Ａのレベルの激しい増加を導く。感染のより後の段階の間中２−５Ａレベルは下
降し、ＨＩＶ−１ビリオン生産は増加する。高い２−５Ａレベルが、ＨＩＶ感染
細胞がウイルスを生成する低い能力と関連することが報告され（シュロダー（Sc
hroder）ら、J. Biol. Chem. ２６４：５６６９−７３（１９８９））、又ＨＩ Ｖ−１の生成が、２−５ＯＡＳを誘導できるインターフェロンによって阻害され
うることが報告された（ホー（Ho）ら、Lancet １（８４２９）：６０２−０４ （１９８５））。又、２−５ＯＡＳに対するアンチセンスＲＮＡが、インターフ
ェロンによるウイルス感染からの保護の喪失をもたらすことも報告された（デベ
ネデッティ（DeBenedetti）ら、Proc. Natl. Acad. Sci USA ８４：６５８−６ ２（１９８７））。
【００１３】 Ｄ）細胞内免疫処置 細胞内免疫処置とは、ウイルス複製に干渉してそれを防ぐようにデザインされ
た分子種の、調節された発現である。「細胞内免疫処置（intracellular immuni
zation）」という概念及び名称は、デビッド バルチモア（David Baltimore） が１９９８年に提唱した（Nature ３３５：３９５−３９６（１９９８年９月２ ９日））。バルチモアは、細胞を遺伝学的に工学的処理して、細胞にウイルス感
染に対する耐性与える蛋白質を発現させうることを提唱した。バルチモアは、Ｈ
ＩＶの場合、レトロウイルスベクターを用いて造血性幹細胞を所望の組替え構造
で形質導入することができると言及した。
た分子種の、調節された発現である。「細胞内免疫処置（intracellular immuni
zation）」という概念及び名称は、デビッド バルチモア（David Baltimore） が１９９８年に提唱した（Nature ３３５：３９５−３９６（１９９８年９月２ ９日））。バルチモアは、細胞を遺伝学的に工学的処理して、細胞にウイルス感
染に対する耐性与える蛋白質を発現させうることを提唱した。バルチモアは、Ｈ
ＩＶの場合、レトロウイルスベクターを用いて造血性幹細胞を所望の組替え構造
で形質導入することができると言及した。
【００１４】 有効とするために、細胞内免疫処置の目的のために導入される遺伝子は、（ｉ
）ウイルス複製に干渉するために十分な量にて安定して発現し、（ｉｉ）細胞に
無毒性であり、（ｉｉｉ）高効率、無毒性な方法にて標的細胞群に転移できなけ
ればならない（ウォン（Wong）ら、Curr. Top. Microbiol. Immunol. １７９： １５９−１７４（１９９２））。
）ウイルス複製に干渉するために十分な量にて安定して発現し、（ｉｉ）細胞に
無毒性であり、（ｉｉｉ）高効率、無毒性な方法にて標的細胞群に転移できなけ
ればならない（ウォン（Wong）ら、Curr. Top. Microbiol. Immunol. １７９： １５９−１７４（１９９２））。
【００１５】 細胞内免疫処置の一応用において、所望の遺伝子が、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴ
Ｒ）の制御の下に細胞に導入される。このハイブリッド遺伝子は、Ｔａｔ遺伝子
生産物によって、或いはＨＩＶ感染によってトランス作用（トランス−アクチベ
ート）されうる。Ｔａｔ蛋白質は、ＴＡＲ領域として知られるＨＩＶ ＬＴＲの
シス作用（シス−アクティング）因子に作用し、ＬＴＲからの発現を増加させる
（アルヤ（Arya）ら、Science ２２９：６９−７３（１９８５））。Ｔａｔ蛋白
質は、転写レベル及び翻訳レベルの両方において、遺伝子発現を調節すると考え
られている。最初、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ中から開始（イニシエート）される転写
の大部分は不完全であり、又生成したＲＮＡは時期が早くて短く、その平均的長
さは６０〜８０リボヌクレオチドである。ＨＩＶ−１がエンコードする１５ｋＤ
ａＴａｔ蛋白質は、この発生期の短いメッセージとの相互作用に供されてきてお
り、又細胞の補因子と関連して、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、ＴＡＲ中の安定ＲＮＡス
テム−ループ構造に結合されてきた（カシャンチ（Kashanchi）ら、Nature （ロ
ンドン）３６７：２９５−２９９（１９９４））。この蛋白質／ＲＡＮ相互作用
は、ＲＮＡ延長効率を増加させ、完全な長さのｍＲＮＡの高レベルの生成を導く
（フーン（Foon）ら、J. Biol. Chem. ２７１：４２０１−４２０８（１９９６ ）；マバンカル（Mavankal）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３：２０８９ −２０９４（１９９６））。Ｔａｔ蛋白質は、感染していない静止性Ｔ細胞が生
産性ＨＩＶ−１感染に対して高度に許容的になることを誘導しうることが報告さ
れた（リー（Li）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：８１１６−２０（１ ９９７年７月））。
Ｒ）の制御の下に細胞に導入される。このハイブリッド遺伝子は、Ｔａｔ遺伝子
生産物によって、或いはＨＩＶ感染によってトランス作用（トランス−アクチベ
ート）されうる。Ｔａｔ蛋白質は、ＴＡＲ領域として知られるＨＩＶ ＬＴＲの
シス作用（シス−アクティング）因子に作用し、ＬＴＲからの発現を増加させる
（アルヤ（Arya）ら、Science ２２９：６９−７３（１９８５））。Ｔａｔ蛋白
質は、転写レベル及び翻訳レベルの両方において、遺伝子発現を調節すると考え
られている。最初、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ中から開始（イニシエート）される転写
の大部分は不完全であり、又生成したＲＮＡは時期が早くて短く、その平均的長
さは６０〜８０リボヌクレオチドである。ＨＩＶ−１がエンコードする１５ｋＤ
ａＴａｔ蛋白質は、この発生期の短いメッセージとの相互作用に供されてきてお
り、又細胞の補因子と関連して、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、ＴＡＲ中の安定ＲＮＡス
テム−ループ構造に結合されてきた（カシャンチ（Kashanchi）ら、Nature （ロ
ンドン）３６７：２９５−２９９（１９９４））。この蛋白質／ＲＡＮ相互作用
は、ＲＮＡ延長効率を増加させ、完全な長さのｍＲＮＡの高レベルの生成を導く
（フーン（Foon）ら、J. Biol. Chem. ２７１：４２０１−４２０８（１９９６ ）；マバンカル（Mavankal）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３：２０８９ −２０９４（１９９６））。Ｔａｔ蛋白質は、感染していない静止性Ｔ細胞が生
産性ＨＩＶ−１感染に対して高度に許容的になることを誘導しうることが報告さ
れた（リー（Li）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：８１１６−２０（１ ９９７年７月））。
【００１６】 又、Ｔａｔ蛋白質は、３′からＴＡＲ領域に位置する異種遺伝子の発現（トン
グ−スタークセン（Tong-Starksen）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０：６
８４５−４９（１９８７））、細胞内免疫処置手順にて利用できる性質をも刺激
できる。
グ−スタークセン（Tong-Starksen）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０：６
８４５−４９（１９８７））、細胞内免疫処置手順にて利用できる性質をも刺激
できる。
【００１７】 米国特許第５，５５４，５２８号は、キメラジフテリアトキシン遺伝子がＨＩ
Ｖ ＬＴＲの調節制御下に配置される細胞内免疫処置の構成及び方法に向けられ
る。ＨＩＶ調節性トキシン遺伝子は、レトロウイルス（又は他の）ベクター系（
システム）を用いてＨＩＶ感受性細胞中に安定に導入され、又形質転換された細
胞は、ＨＩＶ感染に対する応答において自滅する。米国特許第５，５５４，５２
８号は、ＨＩＶ調節性ジフテリアトキシン遺伝子がトランスフェクション（移入
）された末梢血単球細胞又は骨髄細胞を用いて、ＳＣＩＤマウスを再構成した予
言的な例を開示する。
Ｖ ＬＴＲの調節制御下に配置される細胞内免疫処置の構成及び方法に向けられ
る。ＨＩＶ調節性トキシン遺伝子は、レトロウイルス（又は他の）ベクター系（
システム）を用いてＨＩＶ感受性細胞中に安定に導入され、又形質転換された細
胞は、ＨＩＶ感染に対する応答において自滅する。米国特許第５，５５４，５２
８号は、ＨＩＶ調節性ジフテリアトキシン遺伝子がトランスフェクション（移入
）された末梢血単球細胞又は骨髄細胞を用いて、ＳＣＩＤマウスを再構成した予
言的な例を開示する。
【００１８】 ベドナリク（Bednarik）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：４９５８− ４９６２（１９８９年７月））は、α2−インターフェロン遺伝子がＨＩＶ−１ ＬＴＲの調節制御下に配置される細胞内免疫処置の構成及び方法を報告した。
ＨＩＶ調節性インターフェロン遺伝子を細胞内に導入するためにレトロウイルス
が用いられ、又形質導入された細胞はＨＩＶ感染に対する耐性を示した。
ＨＩＶ調節性インターフェロン遺伝子を細胞内に導入するためにレトロウイルス
が用いられ、又形質導入された細胞はＨＩＶ感染に対する耐性を示した。
【００１９】 シュレダー（Schroder）ら（FASEB Journal ４：３１２４−３１３０（１９９
０年１０月）；Int. J. Biochem. ２４（１）：５５−６３（１９９２））は、 ２−５ＯＡＳ遺伝子がＨＩＶ−１ ＬＴＲの調節制御下に配置される細胞内免疫
処置の構成及び方法を開示した。ＨＩＶ調節性２−５ＯＡＳ遺伝子をＨｅＬａ−
Ｔ４+細胞に安定にトランスフェクトするためにプラスミドベクターが用いられ た。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−２−５Ａシンテターゼプラスミド内の、ＬＴＲ配列の
Ｔａｔ誘導性活性化は、２−５ＯＡＳレベルの一過性の増加を導き、又成長した
ＨＩＶ−１ビリオンの放出を遅らせる。
０年１０月）；Int. J. Biochem. ２４（１）：５５−６３（１９９２））は、 ２−５ＯＡＳ遺伝子がＨＩＶ−１ ＬＴＲの調節制御下に配置される細胞内免疫
処置の構成及び方法を開示した。ＨＩＶ調節性２−５ＯＡＳ遺伝子をＨｅＬａ−
Ｔ４+細胞に安定にトランスフェクトするためにプラスミドベクターが用いられ た。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−２−５Ａシンテターゼプラスミド内の、ＬＴＲ配列の
Ｔａｔ誘導性活性化は、２−５ＯＡＳレベルの一過性の増加を導き、又成長した
ＨＩＶ−１ビリオンの放出を遅らせる。
【００２０】 ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの管理のための効き目のある治療的及び／又は予防的
処置方式（regimen）の必要性は依然として大きい。
処置方式（regimen）の必要性は依然として大きい。
【００２１】 発明の要約 本発明は、抗ウイルス遺伝子発現がＨＩＶトランス作用因子（トランス−アク
ティングファクター：trans-acting factor）の存在下で活性下される構成を用 いて、標的細胞に安定に抗ウイルス酵素を導入する構成及び方法を提供する。標
的細胞のＨＩＶ感染によって、抗ウイルス遺伝子発現が活性化され、ウイルス複
製が阻害される。この細胞内免疫処置のアプローチは、ＨＩＶ複製を支持し得な
い自己再生細胞の蓄積を生産することができる。又、細胞内免疫処置のアプロー
チは、他の抗ウイルス作用物質と組み合わせて用いることができ（ヌクレオシド
類似体及び／又はプロテアーゼ阻害剤などの薬剤の単一又は多数の組み合わせ）
、結果としてＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの予防及び処置のための方法を改良する。
ティングファクター：trans-acting factor）の存在下で活性下される構成を用 いて、標的細胞に安定に抗ウイルス酵素を導入する構成及び方法を提供する。標
的細胞のＨＩＶ感染によって、抗ウイルス遺伝子発現が活性化され、ウイルス複
製が阻害される。この細胞内免疫処置のアプローチは、ＨＩＶ複製を支持し得な
い自己再生細胞の蓄積を生産することができる。又、細胞内免疫処置のアプロー
チは、他の抗ウイルス作用物質と組み合わせて用いることができ（ヌクレオシド
類似体及び／又はプロテアーゼ阻害剤などの薬剤の単一又は多数の組み合わせ）
、結果としてＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの予防及び処置のための方法を改良する。
【００２２】 抗ウイルス酵素ＰＫＲの活性化は、ＨＩＶ−１感染細胞の死をもたらし、従っ
て、更なるウイルスの複製及び次いで起こる隣接した細胞の感染を防ぐ。本発明
者らは、ＨＩＶ−１転写調節下で、標的ＳｕｐＴ１リンパ芽球細胞内にＰＫＲコ
ード領域を転移できる、レトロウイルス性ベクターを構成した。標的細胞をその
後ＨＩＶ−１で攻撃誘発した。ＨＩＶ複製は、シンシチウム（融合細胞）形成に
よって測定した場合、形質導入された細胞において９３％まで阻害された。ＨＩ
Ｖ−１ ＬＴＲ ｃＤＮＡで形質導入された細胞系列を、ＰＫＲ阻害剤である２
−アミノプリンで処置することによる、ＰＫＲ活性の特異的ブロック（遮断）は
、抗ウイルス効果を逆転させた。形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞、及び親
（parental）ベクター形質導入クローン（Ｎ２−２０Ｐ）中のＰＫＲの発現及び
活性は、ＨＩＶ−１感染の後４８時間で下方調節されたが、一方、ＨＩＶ−１
ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンは、ＰＫＲの自己リン酸化活性を維
持しつつ、感染後９６時間にわたるＰＫＲ発現を示した。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−
ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンの１つは、Ｎ２−２０Ｐの対照より９３％少
ない３′−アジド−３′−デオキシチミジンを補足した場合、シンシチウム形成
を９０％まで減少させた。本発明者は又、２−５ＯＡＳ遺伝子を用いた細胞内免
疫処置がＨＩＶ感染の管理に使用できることを明らかにした。
て、更なるウイルスの複製及び次いで起こる隣接した細胞の感染を防ぐ。本発明
者らは、ＨＩＶ−１転写調節下で、標的ＳｕｐＴ１リンパ芽球細胞内にＰＫＲコ
ード領域を転移できる、レトロウイルス性ベクターを構成した。標的細胞をその
後ＨＩＶ−１で攻撃誘発した。ＨＩＶ複製は、シンシチウム（融合細胞）形成に
よって測定した場合、形質導入された細胞において９３％まで阻害された。ＨＩ
Ｖ−１ ＬＴＲ ｃＤＮＡで形質導入された細胞系列を、ＰＫＲ阻害剤である２
−アミノプリンで処置することによる、ＰＫＲ活性の特異的ブロック（遮断）は
、抗ウイルス効果を逆転させた。形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞、及び親
（parental）ベクター形質導入クローン（Ｎ２−２０Ｐ）中のＰＫＲの発現及び
活性は、ＨＩＶ−１感染の後４８時間で下方調節されたが、一方、ＨＩＶ−１
ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンは、ＰＫＲの自己リン酸化活性を維
持しつつ、感染後９６時間にわたるＰＫＲ発現を示した。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−
ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンの１つは、Ｎ２−２０Ｐの対照より９３％少
ない３′−アジド−３′−デオキシチミジンを補足した場合、シンシチウム形成
を９０％まで減少させた。本発明者は又、２−５ＯＡＳ遺伝子を用いた細胞内免
疫処置がＨＩＶ感染の管理に使用できることを明らかにした。
【００２３】 本発明の一実施態様では、 （ａ）ＰＫＲコード領域、及び （ｂ）調節要素、 を含み、前記ＰＫＲコード領域と調節要素とは機能的に結合され、ＰＫＲ発現が
ＨＩＶトランス作用因子の存在下で活性化されることを特徴とする組換え核酸を
提供する。好ましい実施態様によると、前記調節要素はＨＩＶ ＬＴＲの全て又
は部分を含む。他の好ましい実施態様によると、前記ＨＩＶトランス作用因子は
ＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質である。
ＨＩＶトランス作用因子の存在下で活性化されることを特徴とする組換え核酸を
提供する。好ましい実施態様によると、前記調節要素はＨＩＶ ＬＴＲの全て又
は部分を含む。他の好ましい実施態様によると、前記ＨＩＶトランス作用因子は
ＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質である。
【００２４】 本発明は更に、本発明に従う組替え核酸を含むベクターを提供する。好ましい
実施態様によると、前記ベクターはウイルス性ベクターである。より好ましい実
施態様によると、前記ベクターはレトロウイルス性ベクターである。最も好まし
い実施態様によると、前記ベクターはＭ−ＭｕＬＶ配列を含む。幾つかの好まし
い実施態様によると、前記レトロウイルス性ベクターは基本的にｐＭＥＡ１０５
又はｐＭＥＡ１０６の特徴を備えている。
実施態様によると、前記ベクターはウイルス性ベクターである。より好ましい実
施態様によると、前記ベクターはレトロウイルス性ベクターである。最も好まし
い実施態様によると、前記ベクターはＭ−ＭｕＬＶ配列を含む。幾つかの好まし
い実施態様によると、前記レトロウイルス性ベクターは基本的にｐＭＥＡ１０５
又はｐＭＥＡ１０６の特徴を備えている。
【００２５】 本発明は又、 （ａ）２−５ＯＡＳコード領域、及び （ｂ）調節要素、 を含み、前記２−５ＯＡＳコード領域と調節要素とは機能的に結合され、２−５
ＯＡＳ発現はＨＩＶトランス作用因子の存在下で活性化されることを特徴とする
ウイルス性ベクターを提供する。好ましい実施態様において、前記調節要素はＨ
ＩＶ ＬＴＲの全て又は部分を含む。他の好ましい実施態様によると、前記ＨＩ
Ｖトランス作用因子はＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質である。最も好ましい実施態様によ
ると、前記ウイルス性ベクターはＭ−ＭｕＬＶ配列を含む。幾つかの実施態様に
おいて、前記ウイルス性ベクターは５′及び３′Ｍ−ＭｕＬＶ ＬＴＲ及びネオ
マイシン耐性遺伝子を含む。幾つかの実施態様において、前記ベクターは基本的
にｐＭＥＡ１０９又はｐＭＥＡ１１０の特徴を備えている。
ＯＡＳ発現はＨＩＶトランス作用因子の存在下で活性化されることを特徴とする
ウイルス性ベクターを提供する。好ましい実施態様において、前記調節要素はＨ
ＩＶ ＬＴＲの全て又は部分を含む。他の好ましい実施態様によると、前記ＨＩ
Ｖトランス作用因子はＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質である。最も好ましい実施態様によ
ると、前記ウイルス性ベクターはＭ−ＭｕＬＶ配列を含む。幾つかの実施態様に
おいて、前記ウイルス性ベクターは５′及び３′Ｍ−ＭｕＬＶ ＬＴＲ及びネオ
マイシン耐性遺伝子を含む。幾つかの実施態様において、前記ベクターは基本的
にｐＭＥＡ１０９又はｐＭＥＡ１１０の特徴を備えている。
【００２６】 本発明の他の態様は、本発明に従った核酸を含む細胞、又は本発明に従うウイ
ルス性ベクターで形質導入又は形質転換されている細胞である。
ルス性ベクターで形質導入又は形質転換されている細胞である。
【００２７】 好ましい実施態様において、前記細胞は原核性細胞である。他の好ましい実施
態様において、前記細胞は真核性細胞である。幾つかの好ましい実施態様におい
て、前記細胞は幹細胞である。最も好ましい実施態様において前記細胞はＣＤ３
４発現細胞である。幾つかの好ましい実施態様において、前記細胞はＣＤ４発現
細胞である。幾つかの実施態様において、前記細胞はレトロウイルスパッケージ
ング細胞又はレトロウイルスプロデューサー細胞である。幾つかの実施態様にお
いて、前記核酸は、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化されるような方法に
て、安定に細胞ゲノムに組込まれる。幾つかの実施態様において、前記２−５Ｏ
ＡＳコード領域及び調節要素は、２−５ＯＡＳ発現がＨＩＶ感染によって活性化
されるような方法にて、安定に細胞ゲノムに組込まれる。
態様において、前記細胞は真核性細胞である。幾つかの好ましい実施態様におい
て、前記細胞は幹細胞である。最も好ましい実施態様において前記細胞はＣＤ３
４発現細胞である。幾つかの好ましい実施態様において、前記細胞はＣＤ４発現
細胞である。幾つかの実施態様において、前記細胞はレトロウイルスパッケージ
ング細胞又はレトロウイルスプロデューサー細胞である。幾つかの実施態様にお
いて、前記核酸は、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化されるような方法に
て、安定に細胞ゲノムに組込まれる。幾つかの実施態様において、前記２−５Ｏ
ＡＳコード領域及び調節要素は、２−５ＯＡＳ発現がＨＩＶ感染によって活性化
されるような方法にて、安定に細胞ゲノムに組込まれる。
【００２８】 本発明は又、本発明に従う核酸又はベクターをＨＩＶ感染に感受性の細胞に導
入することを含むことを特徴とするＨＩＶの複製を阻害する方法を提供する。好
ましい実施態様において、調節要素に機能的に結合されたＰＫＲコード領域は安
定に細胞ゲノムに組込まれ、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化される。他
の好ましい実施態様によると、調節要素に機能的に結合された２−５ＯＡＳコー
ド領域は安定に細胞ゲノムに組込まれ、２−５ＯＡＳ発現がＨＩＶ感染によって
活性化される。
入することを含むことを特徴とするＨＩＶの複製を阻害する方法を提供する。好
ましい実施態様において、調節要素に機能的に結合されたＰＫＲコード領域は安
定に細胞ゲノムに組込まれ、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化される。他
の好ましい実施態様によると、調節要素に機能的に結合された２−５ＯＡＳコー
ド領域は安定に細胞ゲノムに組込まれ、２−５ＯＡＳ発現がＨＩＶ感染によって
活性化される。
【００２９】 本発明の態様は、斯かる処置が必要な患者中のＨＩＶ複製を阻害する方法であ
って、本発明に従う核酸又はベクターを前記患者からの細胞に導入することを含
む前記方法である。好ましい実施態様において、少なくとも１つの化学療法作用
物質をも前記患者に投与される。より好ましい実施態様によると、前記化学療法
作用物質はヌクレオシド類似体及びプロテアーゼ阻害剤を含む群から選択される
。最も好ましい実施態様によると、前記化学療法作用物質はＡＺＴである。幾つ
かの実施態様において、前記核酸又はベクターはｅｘ ｖｉｖｏにて前記細胞に
導入される。幾つかの実施態様において、前記核酸又はベクターはｉｎ ｖｉｖ
ｏにて前記細胞に導入される。幾つかの実施態様において、前記核酸又はベクタ
ーは、幹細胞を特異的に標的とする。最も好ましい実施態様において、前記核酸
又はベクターは、ＣＤ３４発現細胞を特異的に標的とする。幾つかの実施態様に
おいて、前記核酸又はベクターは、ＣＤ４発現細胞を特異的に標的とする。この
方法の幾つかの実施態様において、調節要素に機能的に結合されたＰＫＲコード
領域は、安定に細胞ゲノムに組込まれ、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化
される。幾つかの実施態様において、調節要素に機能的に結合された２−５ＯＡ
Ｓコード領域は安定に細胞ゲノムに組込まれ、２−５ＯＡＳ発現がＨＩＶ感染に
よって活性化される。
って、本発明に従う核酸又はベクターを前記患者からの細胞に導入することを含
む前記方法である。好ましい実施態様において、少なくとも１つの化学療法作用
物質をも前記患者に投与される。より好ましい実施態様によると、前記化学療法
作用物質はヌクレオシド類似体及びプロテアーゼ阻害剤を含む群から選択される
。最も好ましい実施態様によると、前記化学療法作用物質はＡＺＴである。幾つ
かの実施態様において、前記核酸又はベクターはｅｘ ｖｉｖｏにて前記細胞に
導入される。幾つかの実施態様において、前記核酸又はベクターはｉｎ ｖｉｖ
ｏにて前記細胞に導入される。幾つかの実施態様において、前記核酸又はベクタ
ーは、幹細胞を特異的に標的とする。最も好ましい実施態様において、前記核酸
又はベクターは、ＣＤ３４発現細胞を特異的に標的とする。幾つかの実施態様に
おいて、前記核酸又はベクターは、ＣＤ４発現細胞を特異的に標的とする。この
方法の幾つかの実施態様において、調節要素に機能的に結合されたＰＫＲコード
領域は、安定に細胞ゲノムに組込まれ、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化
される。幾つかの実施態様において、調節要素に機能的に結合された２−５ＯＡ
Ｓコード領域は安定に細胞ゲノムに組込まれ、２−５ＯＡＳ発現がＨＩＶ感染に
よって活性化される。
【００３０】 本発明は更に、ヒト宿主中のＨＩＶ複製を防ぐ方法であって、本発明に従う核
酸又はベクターを宿主からの細胞に導入することを含む前記方法を構成する。幾
つかの実施態様において、前記核酸又はベクターはｅｘ ｖｉｖｏにて前記細胞
に導入される。幾つかの実施態様において、前記核酸又はベクターはｉｎ ｖｉ
ｖｏにて前記細胞に導入される。
酸又はベクターを宿主からの細胞に導入することを含む前記方法を構成する。幾
つかの実施態様において、前記核酸又はベクターはｅｘ ｖｉｖｏにて前記細胞
に導入される。幾つかの実施態様において、前記核酸又はベクターはｉｎ ｖｉ
ｖｏにて前記細胞に導入される。
【００３１】 本発明は又、患者又はヒト宿主中でのＨＩＶ複製を阻害又は防ぐ薬剤を調製す
るための、本発明に従う核酸又はベクターの使用を構成する。
るための、本発明に従う核酸又はベクターの使用を構成する。
【００３２】 本発明の他の態様及び利点を、図面及び以下の好ましい実施態様の詳細な説明
にて説明する。
にて説明する。
【００３３】 発明の詳細な説明 本発明は、ＨＩＶ感染感受性細胞中のＨＩＶの複製を阻害するための構成及び
方法、又ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの管理のための構成及び方法の発見に関する。
方法、又ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの管理のための構成及び方法の発見に関する。
【００３４】 本発明者らは、基本的なＨＩＶ−１の転写要素の転写制御下に、酵素ＰＫＲを
配置し、この構成を、モロニーネズミ（Moloney murine）白血病ウイルス（Ｍ−
ＭｕＬＶ）レトロウイルス媒介シャトルシステムを利用して、ＨＩＶ−１受容細
胞に導入した。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ構成で形質導入したＳｕ
ｐＴ１リンパ芽球細胞系列（lymphoblastoid cell line）は、ＨＩＶ−１ ＩＩ
ＩＢにて攻撃誘発した際に、シンシチウム（シンシチア）形成の顕著な減少を示
した。対照細胞系列とは対象的に、形質導入された細胞系列中のＰＫＲの蛋白質
及び酵素レベルは、レトロウイルス攻撃誘発の後に上昇したままであった。これ
らの結果は、インターフェロンシグナル経路を介した内因性ＰＫＲレベルを、Ｔ
ＡＲのＨＩＶ−１誘導性Ｔａｔトランス作用から生成されたＰＫＲ蛋白質で補足
することを含む、抗ＨＩＶ−１治療アプローチを示唆する。このアプローチの下
、ＰＫＲの細胞内濃度は感染した細胞内で増加し、これにより、ＰＫＲ酵素阻害
のために必要とされるＨＩＶ−１ ＴＡＲ ＲＮＡの濃度を上昇させる。
配置し、この構成を、モロニーネズミ（Moloney murine）白血病ウイルス（Ｍ−
ＭｕＬＶ）レトロウイルス媒介シャトルシステムを利用して、ＨＩＶ−１受容細
胞に導入した。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ構成で形質導入したＳｕ
ｐＴ１リンパ芽球細胞系列（lymphoblastoid cell line）は、ＨＩＶ−１ ＩＩ
ＩＢにて攻撃誘発した際に、シンシチウム（シンシチア）形成の顕著な減少を示
した。対照細胞系列とは対象的に、形質導入された細胞系列中のＰＫＲの蛋白質
及び酵素レベルは、レトロウイルス攻撃誘発の後に上昇したままであった。これ
らの結果は、インターフェロンシグナル経路を介した内因性ＰＫＲレベルを、Ｔ
ＡＲのＨＩＶ−１誘導性Ｔａｔトランス作用から生成されたＰＫＲ蛋白質で補足
することを含む、抗ＨＩＶ−１治療アプローチを示唆する。このアプローチの下
、ＰＫＲの細胞内濃度は感染した細胞内で増加し、これにより、ＰＫＲ酵素阻害
のために必要とされるＨＩＶ−１ ＴＡＲ ＲＮＡの濃度を上昇させる。
【００３５】 Ａ）定義 本明細書にて一貫して用いられる用語の以下の定義は、本発明の範囲及び実施
の理解の助けとなることが意図される。
の理解の助けとなることが意図される。
【００３６】 「細胞内免疫処置」とは、感染又はウイルス複製に干渉する生産物を発現する
ために感受性（感染し易い）細胞を遺伝学的に修飾する、ウイルス感染の処置へ
の遺伝子治療的アプローチである。
ために感受性（感染し易い）細胞を遺伝学的に修飾する、ウイルス感染の処置へ
の遺伝子治療的アプローチである。
【００３７】 「調節要素」とは、遺伝子発現を調節することのできる任意の核酸配列である
。
。
【００３８】 「機能的に（operatively）結合した調節要素」とは、適当な分子（例えば、 アクチベータ蛋白質及びポリメラーゼなど）が細胞又は無細胞系内に存在すると
きに、調節要素がポリペプチドの発現を可能とするような方法にて、ポリペプチ
ドコード領域が調節要素に接続されていることを意味する。
きに、調節要素がポリペプチドの発現を可能とするような方法にて、ポリペプチ
ドコード領域が調節要素に接続されていることを意味する。
【００３９】 「遺伝子発現」とは、核酸によってエンコードされた遺伝子情報を具現化し、
機能性ＲＮＡ又は蛋白質を生成することを意味する。
機能性ＲＮＡ又は蛋白質を生成することを意味する。
【００４０】 「ホモロジー」とは、共通の進化的起源を反映した配列の類似性を意味する。
そのアミノ酸の実質的に多数が（１）同一であるか、又は（２）保存的アミノ酸
置換によって特徴付けられるかのいずれかの場合、蛋白質がホモロジー又は類似
性をを有すると言う。
そのアミノ酸の実質的に多数が（１）同一であるか、又は（２）保存的アミノ酸
置換によって特徴付けられるかのいずれかの場合、蛋白質がホモロジー又は類似
性をを有すると言う。
【００４１】 「保存的アミノ酸置換」とは、関連する側鎖Ｒを有するアミノ酸を伴った置換
である。アミノ酸は、一般に、側鎖Ｒに基づいて７つのグループに分類される：
（１）脂肪族側鎖、（２）水酸（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側
鎖、（４）酸性又はアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳
香環を含む側鎖、及び（７）側鎖がアミノ基に融合されたプロリン、イミノ酸。
である。アミノ酸は、一般に、側鎖Ｒに基づいて７つのグループに分類される：
（１）脂肪族側鎖、（２）水酸（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側
鎖、（４）酸性又はアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳
香環を含む側鎖、及び（７）側鎖がアミノ基に融合されたプロリン、イミノ酸。
【００４２】 「実質的アミノ酸配列ホモロジー」とは、約３０％より大きい、好ましくは６
０％より大きい、更に好ましくは８０％より大きい、そして最も好ましくは９０
％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを意味する。
０％より大きい、更に好ましくは８０％より大きい、そして最も好ましくは９０
％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを意味する。
【００４３】 蛋白質の「生物学的に活性な断片（フラグメント）」とは、その蛋白質の少な
くとも１つの生物学的活性を保持している、蛋白質から誘導された断片を意味す
る。
くとも１つの生物学的活性を保持している、蛋白質から誘導された断片を意味す
る。
【００４４】 蛋白質の「生物学的に活性な誘導体」とは、その蛋白質から誘導され、その蛋
白質との実質的アミノ酸配列ホモロジーを有し、又その蛋白質の少なくとも１つ
の生物学的性質を保持している、任意の類似体、変異体（variant）、誘導体、 又は突然変異体（mutant）である。
白質との実質的アミノ酸配列ホモロジーを有し、又その蛋白質の少なくとも１つ
の生物学的性質を保持している、任意の類似体、変異体（variant）、誘導体、 又は突然変異体（mutant）である。
【００４５】 「核酸」とは、共有結合したヌクレオチドと呼ばれるサブユニットを含む重合
体化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（
ＤＮＡ）の、一本鎖及び二本鎖の両方を含む。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡを含む。
体化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（
ＤＮＡ）の、一本鎖及び二本鎖の両方を含む。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡを含む。
【００４６】 「組替え核酸」とは、実験的操作によって、天然（ネイティブ）の前後関係中
では隣接しない配列が互いに隣り合わせて配置された核酸分子である。
では隣接しない配列が互いに隣り合わせて配置された核酸分子である。
【００４７】 「ベクター」とは、核酸を宿主細胞に転移するための任意の手段である。ベク
ターという用語は、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ（エクスビボ：体
外で）、又はｉｎ ｖｉｖｏにて原核性細胞中に導入するための、ウイルス性及
び非ウイルス性の手段の両方を含む。非ウイルス性ベクターは、限定されるもの
ではないが、プラスミド、リポソーム、帯電された脂質（例えば、サイトフェク
チン（cytofectin）など）、ＤＮＡ−蛋白質複合体、及びバイオポリマー（生体
高分子）を含む。ウイルス性ベクターは、限定されるものではないが、レトロウ
イルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、バクロウイルス、ワクシニア
ウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バールウイルス、アデノウイ
ルス及び２種以上のウイルス性ベクター型のハイブリッドを含む。本発明に従う
抗ウイルス性構成に加えて、ベクターは、核酸の転移結果（どの組織への転移か
、発現継続時間など）の選択、測定及び監視（モニター）に有用な１つ以上の調
節領域及び／又は選択的マーカーを含むことができる。
ターという用語は、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ（エクスビボ：体
外で）、又はｉｎ ｖｉｖｏにて原核性細胞中に導入するための、ウイルス性及
び非ウイルス性の手段の両方を含む。非ウイルス性ベクターは、限定されるもの
ではないが、プラスミド、リポソーム、帯電された脂質（例えば、サイトフェク
チン（cytofectin）など）、ＤＮＡ−蛋白質複合体、及びバイオポリマー（生体
高分子）を含む。ウイルス性ベクターは、限定されるものではないが、レトロウ
イルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、バクロウイルス、ワクシニア
ウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バールウイルス、アデノウイ
ルス及び２種以上のウイルス性ベクター型のハイブリッドを含む。本発明に従う
抗ウイルス性構成に加えて、ベクターは、核酸の転移結果（どの組織への転移か
、発現継続時間など）の選択、測定及び監視（モニター）に有用な１つ以上の調
節領域及び／又は選択的マーカーを含むことができる。
【００４８】 「細胞」という用語は、哺乳動物細胞のような高等真核性細胞、酵母細胞のよ
うな下等真核生細胞、原核性細胞、及び古細菌細胞を含む。
うな下等真核生細胞、原核性細胞、及び古細菌細胞を含む。
【００４９】 「医薬上許容しうるキャリア」は、投与方法に関し医薬上許容でき、滅菌状態
であり、又適当な分散若しくは湿潤剤及び懸濁剤を用いて処方された水性若しく
は油性の懸濁物である、希釈剤及び賦形剤を含む。特定の、医薬上許容しうるキ
ャリア及びキャリアに対する活性化合物の比は、溶解性及び組成物の化学特性、
特定の投与モード、及び標準の医薬慣例によって決定される。
であり、又適当な分散若しくは湿潤剤及び懸濁剤を用いて処方された水性若しく
は油性の懸濁物である、希釈剤及び賦形剤を含む。特定の、医薬上許容しうるキ
ャリア及びキャリアに対する活性化合物の比は、溶解性及び組成物の化学特性、
特定の投与モード、及び標準の医薬慣例によって決定される。
【００５０】 Ｂ）略語 本明細書では以下の略語を用いる。
【００５１】 ２−５Ａ ２′，５′−オリゴアデニレート ２−５ＯＡＳ ２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼ ＡＩＤＳ 後天性免疫不全症候群 ＡＺＴ ３′−アジド−３′デオキシチミジン ＤＭＥＭ ダルベッコ修飾イーグルの培地 （Dulbecco's modified Eagle's medium） Ｄ１０Ｇ ２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％の子牛（calf）血清、 及び１％のペニシリン（１０，０００ユニット／ｍｌ）／ ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）抗生物質混合物を 補足した８９％のＤＭＥＭで構成される培地。
【００５２】 ｄｓＲＮＡ 二本鎖ＲＮＡ ｅＩＦ−２ａ 真核性開始因子２の一つのサブユニット ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cell sort
ing） ＧＥＭＳＡ ゲル電気泳動移動度変異検定 ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス ＨＩＶ−１ ヒト免疫不全ウイルス、１型 ＨＩＶ−２ ヒト免疫不全ウイルス、２型 ｉ．ｐ． 腹腔内（腹膜組織内）注入 ＬＴＲ 長末端反復 ｍ．ｏ．ｉ 感染多重度 Ｍ−ＭｕＬＶ モロニーネズミ（Moloney murine）白血病ウイルス ＰＢＭＣ 末梢血単球細胞 ｐ．ｉ． 感染後 ＰＫＲ ｄｓＲＮＡ依存性、ＩＦＮ誘導性プロテインキナーゼ （蛋白質リン酸化酵素） ＳＣＩＤ Ｔ及びＢ細胞免疫性の両方の欠損にて特徴付けられる 重症複合免疫不全（severe combined immunodeficiency） ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＳＩＶ シミアン（simian）免疫不全ウイルス ＴＰＡ １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート ＶＳＶ 水疱性口内炎ウイルス。
ing） ＧＥＭＳＡ ゲル電気泳動移動度変異検定 ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス ＨＩＶ−１ ヒト免疫不全ウイルス、１型 ＨＩＶ−２ ヒト免疫不全ウイルス、２型 ｉ．ｐ． 腹腔内（腹膜組織内）注入 ＬＴＲ 長末端反復 ｍ．ｏ．ｉ 感染多重度 Ｍ−ＭｕＬＶ モロニーネズミ（Moloney murine）白血病ウイルス ＰＢＭＣ 末梢血単球細胞 ｐ．ｉ． 感染後 ＰＫＲ ｄｓＲＮＡ依存性、ＩＦＮ誘導性プロテインキナーゼ （蛋白質リン酸化酵素） ＳＣＩＤ Ｔ及びＢ細胞免疫性の両方の欠損にて特徴付けられる 重症複合免疫不全（severe combined immunodeficiency） ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＳＩＶ シミアン（simian）免疫不全ウイルス ＴＰＡ １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート ＶＳＶ 水疱性口内炎ウイルス。
【００５３】 Ｃ）蛋白質 本発明に従う構成及び方法は、ＰＫＲ又は２−５ＯＡＳをエンコードする核酸
を使用する。天然のヒトＰＫＲ及び２−５ＯＡＳ遺伝子は、クローン化され又配
列が決定されている（モーリー（Mory）ら、J. Interferon Research ９：２９ ５−３０４（１９８０）；ワテレット（Wathelet）ら、FEBS Letters １９６： １１３−２０（１９８６）；メウアーズ（Meurs）ら、Cell ６２：３７９−９０
（１９９０））。
を使用する。天然のヒトＰＫＲ及び２−５ＯＡＳ遺伝子は、クローン化され又配
列が決定されている（モーリー（Mory）ら、J. Interferon Research ９：２９ ５−３０４（１９８０）；ワテレット（Wathelet）ら、FEBS Letters １９６： １１３−２０（１９８６）；メウアーズ（Meurs）ら、Cell ６２：３７９−９０
（１９９０））。
【００５４】 与えられた特性の異なる変異体が自然の中には存在しうる。これらの変異体は
、蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いにて特徴付けられる
対立遺伝子のバリエーションであるか、或いは異なるスプライシング又は翻訳後
修飾を含むこともある。当業者は、単一又は多数のアミノ酸置換、欠失、付加又
は再配置を有する蛋白質の誘導体を作製することができる。これらの誘導体は、
とりわけ、（ａ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸で置換
される誘導体、（ｂ）１つ以上のアミノ酸がその蛋白質に付加される誘導体、（
ｃ）１つ以上のアミノ酸が置換基を含む誘導体、及び（ｄ）蛋白質が他のペプチ
ドと融合された誘導体を含む。これらの誘導体を得る技術は、遺伝学的（抑圧（
サプレッション）、欠失、突然変異、その他）、化学的、及び酵素的技術を含み
、これは当業者には公知である。
、蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いにて特徴付けられる
対立遺伝子のバリエーションであるか、或いは異なるスプライシング又は翻訳後
修飾を含むこともある。当業者は、単一又は多数のアミノ酸置換、欠失、付加又
は再配置を有する蛋白質の誘導体を作製することができる。これらの誘導体は、
とりわけ、（ａ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸で置換
される誘導体、（ｂ）１つ以上のアミノ酸がその蛋白質に付加される誘導体、（
ｃ）１つ以上のアミノ酸が置換基を含む誘導体、及び（ｄ）蛋白質が他のペプチ
ドと融合された誘導体を含む。これらの誘導体を得る技術は、遺伝学的（抑圧（
サプレッション）、欠失、突然変異、その他）、化学的、及び酵素的技術を含み
、これは当業者には公知である。
【００５５】 ＰＫＲ及び２−５ＯＡＳの、生物学的に活性な断片及び生物学的に活性な誘導
体が、本発明の範囲内に含まれることを意図する。
体が、本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【００５６】 Ｄ）核酸 組替えＤＮＡテクノロジーの技術は、当業者には公知である。組替え分子のク
ローニング及び発現の一般的な方法は、マニアティス（Maniatis）（Molecular Cloning （分子クローニング）、コールドスプリングハーバー研究所（Cold Spri
ng Harbor Laboratories）、１９８２）、及びアウスベル（Ausubel）（Current Protocols in Molecular Biology （最新分子生物学手順）、ウィリー アンド サンズ（Wiley and sons）、１９８７）によって記載される。これらは参照に
より本明細書に援用する。
ローニング及び発現の一般的な方法は、マニアティス（Maniatis）（Molecular Cloning （分子クローニング）、コールドスプリングハーバー研究所（Cold Spri
ng Harbor Laboratories）、１９８２）、及びアウスベル（Ausubel）（Current Protocols in Molecular Biology （最新分子生物学手順）、ウィリー アンド サンズ（Wiley and sons）、１９８７）によって記載される。これらは参照に
より本明細書に援用する。
【００５７】 Ｅ）調節要素 本発明に従う方法及び構成において、ＰＫＲコード領域又は２−５ＯＡＳコー
ド領域は、機能的に調節要素に結合され、ＰＫＲ又は２−５ＯＡＳの発現は、Ｈ
ＩＶトランス作用因子の存在下で活性化される。
ド領域は、機能的に調節要素に結合され、ＰＫＲ又は２−５ＯＡＳの発現は、Ｈ
ＩＶトランス作用因子の存在下で活性化される。
【００５８】 最も好ましい実施態様において、調節要素は、ＨＩＶ ＬＴＲの全て又は部分
を含み、又ＨＩＶトランス作用因子はＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質である。完全な長さ
のＨＩＶ ＬＴＲ、並びにＴａｔ蛋白質によるトランス作用に対して応答する能
力を保持したその任意の断片は、全て本発明に包含されることが意図される。
を含み、又ＨＩＶトランス作用因子はＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質である。完全な長さ
のＨＩＶ ＬＴＲ、並びにＴａｔ蛋白質によるトランス作用に対して応答する能
力を保持したその任意の断片は、全て本発明に包含されることが意図される。
【００５９】 又、他の調節要素を本発明の方法及び構成において用いることができる。その
一例として、Ｒｅｖ／ＲＲＥ系が挙げられる。
一例として、Ｒｅｖ／ＲＲＥ系が挙げられる。
【００６０】 ＨＩＶ Ｒｅｖ蛋白質は、負の（ネガティブ）シス作用抑制配列（ｃｒｓ）、
及び正しく配向されたＲｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）を含む異種遺伝子の発現をト
ランス作用（トランス−アクチベート）することができる（ローゼン（Rosen） ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：２０７１−７５（１９８８））。
及び正しく配向されたＲｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）を含む異種遺伝子の発現をト
ランス作用（トランス−アクチベート）することができる（ローゼン（Rosen） ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：２０７１−７５（１９８８））。
【００６１】 当技術分野は、キメラ構造のＨＩＶ調節性発現を促進させることのできる、他
の調節要素及びトランス作用因子を発見するであろう。又、当業者は、他の公知
の調節要素を加えて、加熱、冷却又は化学的化合物のような環境シグナルに応答
する調節配列のような誘導可能遺伝子の発現を媒介することもできる。
の調節要素及びトランス作用因子を発見するであろう。又、当業者は、他の公知
の調節要素を加えて、加熱、冷却又は化学的化合物のような環境シグナルに応答
する調節配列のような誘導可能遺伝子の発現を媒介することもできる。
【００６２】 Ｆ）ベクター及び遺伝子転移方法 本発明の好ましい実施態様において、蛋白質コード領域及び調節要素が、ベク
ターを用いて細胞内に導入される。最も好ましい実施態様において、蛋白質コー
ド領域及び調節要素は細胞のゲノム内に安定に組込まれる。
ターを用いて細胞内に導入される。最も好ましい実施態様において、蛋白質コー
ド領域及び調節要素は細胞のゲノム内に安定に組込まれる。
【００６３】 非ウイルス性ベクターは、リン酸カルシウム共沈、リポフェクション（lipofe
ction）（合成アニオン性及びカチオン性リポソーム）、レセプター媒介性遺伝 子送達、裸のＤＮＡ注入、エレクトロポレーション（電気窄孔法）、及びバイオ
バリスティック（生物弾道）若しくは粒子加速を含む、当技術分野にて公知であ
る任意の方法を用いて細胞内に転移させることができる。ウイルス性ベクターは
、感染及びトランスフェクションを含む、当技術分野にて公知である任意の方法
を用いて細胞内に転移させることができる。
ction）（合成アニオン性及びカチオン性リポソーム）、レセプター媒介性遺伝 子送達、裸のＤＮＡ注入、エレクトロポレーション（電気窄孔法）、及びバイオ
バリスティック（生物弾道）若しくは粒子加速を含む、当技術分野にて公知であ
る任意の方法を用いて細胞内に転移させることができる。ウイルス性ベクターは
、感染及びトランスフェクションを含む、当技術分野にて公知である任意の方法
を用いて細胞内に転移させることができる。
【００６４】 最も好ましい実施態様では、レトロウイルス性ベクターを用いて、蛋白質コー
ド領域及び調節要素を、ＨＩＶ感染感受性細胞内に導入する。
ド領域及び調節要素を、ＨＩＶ感染感受性細胞内に導入する。
【００６５】 レトロウイルスは、一般的に分裂細胞（dviding cell）に感染するウイルスを
組込む。レトロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、エンキャプシデーション（キ
ャプシドに包む）配列及び３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含
んでいる。組替えレトロウイルス性ベクターの構成は当業者には公知である。
組込む。レトロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、エンキャプシデーション（キ
ャプシドに包む）配列及び３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含
んでいる。組替えレトロウイルス性ベクターの構成は当業者には公知である。
【００６６】 組替えレトロウイルス性ベクターにおいて、一般的にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎ
ｖ遺伝子の全て又は一部が欠失され、又目的の異種核酸配列にて置き換えられる
。これらのベクターは、例えばＭ−ＭｕＬＶ、ＭＳＶ（ネズミモロニー肉腫ウイ
ルス）、ＨａＳＶ（ハーベー肉腫ウイルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、Ｒ
ＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）及びフレンドウイルスなどの異なる型のレトロウイ
ルスから構成することができる。
ｖ遺伝子の全て又は一部が欠失され、又目的の異種核酸配列にて置き換えられる
。これらのベクターは、例えばＭ−ＭｕＬＶ、ＭＳＶ（ネズミモロニー肉腫ウイ
ルス）、ＨａＳＶ（ハーベー肉腫ウイルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、Ｒ
ＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）及びフレンドウイルスなどの異なる型のレトロウイ
ルスから構成することができる。
【００６７】 一般に、本発明に従った配列を含む組替えレトロウイルスを構成するために、
ＬＴＲ、エンキャプシデーション配列、及びコード配列を含むプラスミドが構成
される。この構成は、パッケージング細胞系列をトランスフェクトするために用
いられる。ここで、細胞系列は、プラスミド中では不足しているレトロウイルス
の機能を、トランスにて供給することができる。従って、一般には、パッケージ
ング細胞系列はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現することができる。この
ようなパッケージング細胞系列は、従来技術に記載されている。特に、細胞系列
ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系列（国
際出願公開公報第ＷＯ９０／０２８０６号）、及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞
系列（ＷＯ８９／０７１５０）が挙げられる。組替えレトロウイルス性ベクター
は、当業者には公知の標準的な技術によって精製することができる。
ＬＴＲ、エンキャプシデーション配列、及びコード配列を含むプラスミドが構成
される。この構成は、パッケージング細胞系列をトランスフェクトするために用
いられる。ここで、細胞系列は、プラスミド中では不足しているレトロウイルス
の機能を、トランスにて供給することができる。従って、一般には、パッケージ
ング細胞系列はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現することができる。この
ようなパッケージング細胞系列は、従来技術に記載されている。特に、細胞系列
ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系列（国
際出願公開公報第ＷＯ９０／０２８０６号）、及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞
系列（ＷＯ８９／０７１５０）が挙げられる。組替えレトロウイルス性ベクター
は、当業者には公知の標準的な技術によって精製することができる。
【００６８】 ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶのようなレンチウイルスから誘導されるレ
トロウイルス性のベクターは、非分裂細胞（nondividing cell）への送達のため
に用いることができる。これらのウイルスは、例えばＭ−ＭｕＬＶ又は水疱性口
内炎ウイルス（ＶＳＶ）などの他のウイルスの表面糖蛋白質で偽型（pseudotype
d）されうる。ＶＳＶ糖蛋白質で偽型された高力価（タイター）ＨＩＶ−１の生 成が、バーツ（Bartz）及びヴォディッカ（Vodicka）（Methods １２（４）：３
３７−４２（１９９７年８月））によって開示されており、又多重弱毒化（mult
iply attenuated）レンチウイルス性ベクターが、ザフェリー（Zufferey）ら（N ature Biotechnology １５：８７１−７５（１９９７年９月））によって開示さ
れた。このようなレンチウイルス性ベクターは非分裂細胞に感染することができ
、宿主の幅が広く、又超遠心分離によって高力価に濃縮することができる。
トロウイルス性のベクターは、非分裂細胞（nondividing cell）への送達のため
に用いることができる。これらのウイルスは、例えばＭ−ＭｕＬＶ又は水疱性口
内炎ウイルス（ＶＳＶ）などの他のウイルスの表面糖蛋白質で偽型（pseudotype
d）されうる。ＶＳＶ糖蛋白質で偽型された高力価（タイター）ＨＩＶ−１の生 成が、バーツ（Bartz）及びヴォディッカ（Vodicka）（Methods １２（４）：３
３７−４２（１９９７年８月））によって開示されており、又多重弱毒化（mult
iply attenuated）レンチウイルス性ベクターが、ザフェリー（Zufferey）ら（N ature Biotechnology １５：８７１−７５（１９９７年９月））によって開示さ
れた。このようなレンチウイルス性ベクターは非分裂細胞に感染することができ
、宿主の幅が広く、又超遠心分離によって高力価に濃縮することができる。
【００６９】 又、キメラアデノウイルス性／レトロウイルス性ベクター系を、有効な遺伝子
送達及び長末端遺伝子発現を達成するために用いることもできる。ｉｎ ｖｉｖ
ｏにて一過性のレトロウイルス生産（プロデューサー）細胞を生成するためにア
デノウイルス性ベクターが用いられ、これにより子孫レトロウイルス粒子が隣接
する細胞に感染するキメラウイルス系が、フェング（Feng）ら（Nature Biotech nology １５：８６６−７０（１９９７年９月））によって開示された。
送達及び長末端遺伝子発現を達成するために用いることもできる。ｉｎ ｖｉｖ
ｏにて一過性のレトロウイルス生産（プロデューサー）細胞を生成するためにア
デノウイルス性ベクターが用いられ、これにより子孫レトロウイルス粒子が隣接
する細胞に感染するキメラウイルス系が、フェング（Feng）ら（Nature Biotech nology １５：８６６−７０（１９９７年９月））によって開示された。
【００７０】 Ｍ−ＭｕＬＶも又、シュナイエレ（Schnierle）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：８６４０−４５）（１９９７年８月））に開示されるように、ＨＩＶ
エンベロープ糖蛋白質で偽型され、ＣＤ−４発現細胞に対する特異性を備えたレ
トロウイルス性ベクターを発生することができる。
エンベロープ糖蛋白質で偽型され、ＣＤ−４発現細胞に対する特異性を備えたレ
トロウイルス性ベクターを発生することができる。
【００７１】 Ｇ）細胞 本発明に従った組替え構成物は、ＨＩＶ感染感受性造血性前駆及び幹細胞内、
或いは分化細胞内に転移させることができる。
或いは分化細胞内に転移させることができる。
【００７２】 幹細胞は、自己複製する能力、並びに、更に分化して特定のリニージ（系統）
に広がるリニージ限定前駆を発生する能力を有する特殊な分類の細胞である。幹
細胞は、分化全能性（生殖系列幹細胞）、分化多能性（例えば、ＣＤ３４＋造血
性幹細胞）、又は分化単能性（例えば、リンパ球前駆細胞）であろう。
に広がるリニージ限定前駆を発生する能力を有する特殊な分類の細胞である。幹
細胞は、分化全能性（生殖系列幹細胞）、分化多能性（例えば、ＣＤ３４＋造血
性幹細胞）、又は分化単能性（例えば、リンパ球前駆細胞）であろう。
【００７３】 好ましい実施態様において、構成物はヒト造血性前駆及び幹細胞に導入される
。骨髄、末梢血、及び臍帯血から分離できるこれらの原始細胞は、全ての造血性
リニージにおいて子孫を発生することができる。分化多能性幹細胞を標的とする
ことによって、ＰＫＲ又は２−５ＯＡＳのようなＨＩＶ−１調節性抗ウイルス性
酵素の導入は、ＨＩＶのマクロファージ指向性（トロピック）株及びＴ細胞指向
性株に感受性の分化細胞のための保護を提供するために、たった一回だけ行う必
要がある（ラナ（Rana）ら、J. of Virol. ７１：３２１９−３２２７（１９９ ７）。
。骨髄、末梢血、及び臍帯血から分離できるこれらの原始細胞は、全ての造血性
リニージにおいて子孫を発生することができる。分化多能性幹細胞を標的とする
ことによって、ＰＫＲ又は２−５ＯＡＳのようなＨＩＶ−１調節性抗ウイルス性
酵素の導入は、ＨＩＶのマクロファージ指向性（トロピック）株及びＴ細胞指向
性株に感受性の分化細胞のための保護を提供するために、たった一回だけ行う必
要がある（ラナ（Rana）ら、J. of Virol. ７１：３２１９−３２２７（１９９ ７）。
【００７４】 原始ヒト造血性前駆及び幹細胞は、とりわけＣＤ３４細胞表面糖蛋白質の発現
によって特徴付けられる。免疫吸着、免疫磁気分離（イムノマグネティック分離
）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む、抗ＣＤ３４抗体を用いたＣＤ３
４+細胞の富化方法が、当技術分野にて公知である。特定のＣＤ３４サブタイプ を発現する細胞及び／又は他のリニージ特異性マーカーを発現する細胞を、同様
の技術を用いて選択しうる。非リニージマーカーを発現する細胞は、イムノマグ
ネティック減耗、免疫吸着、又はＦＡＣＳによって除去しうる。又、一般には陽
性（ポジティブ）及び陰性（ネガティブ）抗体選択との組み合わせにおいて、分
画遠心法も使用して、所望の細胞個体数へと富化することができる。本発明に従
った構成物での前駆性及び幹細胞のトランスフェクションは、ＣＤ４+及びマク ロファージ子孫を含む造血系のより発達した構成要素へと分化することのできる
、免疫担当（イムノコンピテント）ＨＩＶ耐性細胞の蓄積を生成することができ
る。例３に記載されるように、高力価（タイター）プロデューサーを選択するこ
と、又十分な耐性細胞の蓄積を生成するために大部分の標的細胞を形質導入する
ことが重要である。
によって特徴付けられる。免疫吸着、免疫磁気分離（イムノマグネティック分離
）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む、抗ＣＤ３４抗体を用いたＣＤ３
４+細胞の富化方法が、当技術分野にて公知である。特定のＣＤ３４サブタイプ を発現する細胞及び／又は他のリニージ特異性マーカーを発現する細胞を、同様
の技術を用いて選択しうる。非リニージマーカーを発現する細胞は、イムノマグ
ネティック減耗、免疫吸着、又はＦＡＣＳによって除去しうる。又、一般には陽
性（ポジティブ）及び陰性（ネガティブ）抗体選択との組み合わせにおいて、分
画遠心法も使用して、所望の細胞個体数へと富化することができる。本発明に従
った構成物での前駆性及び幹細胞のトランスフェクションは、ＣＤ４+及びマク ロファージ子孫を含む造血系のより発達した構成要素へと分化することのできる
、免疫担当（イムノコンピテント）ＨＩＶ耐性細胞の蓄積を生成することができ
る。例３に記載されるように、高力価（タイター）プロデューサーを選択するこ
と、又十分な耐性細胞の蓄積を生成するために大部分の標的細胞を形質導入する
ことが重要である。
【００７５】 造血性幹細胞の単離、同定、分離及び培養のための方法は、米国特許第５，６
３５，３８７号及び米国特許第５，６４３，７４１号に開示されている。これら
は参照により本明細書に援用する。造血性幹細胞は、種々のサイトカイン類の存
在下又は非存在下、又レトロウイルスの形質導入の前又は後のいずれかに、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにて増やすことができる。造血性幹細胞のレトロウイルス形質導入
のための方法及び組成物は、国際出願公開公報第ＷＯ９６／３３２８１に開示さ
れている。これは参照により本明細書に援用する。
３５，３８７号及び米国特許第５，６４３，７４１号に開示されている。これら
は参照により本明細書に援用する。造血性幹細胞は、種々のサイトカイン類の存
在下又は非存在下、又レトロウイルスの形質導入の前又は後のいずれかに、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにて増やすことができる。造血性幹細胞のレトロウイルス形質導入
のための方法及び組成物は、国際出願公開公報第ＷＯ９６／３３２８１に開示さ
れている。これは参照により本明細書に援用する。
【００７６】 他の好ましい実施態様において、構成物は、すでにＨＩＶによる感染に感受性
である、より発達したヒト造血性細胞に導入される。これら分化した細胞は生命
期間が限られているので、ＨＩＶ−１調節性抗ウイルス性構成物の標的細胞への
導入を２回以上（多数回を含む）繰り返す必要があるだろう。幾つかの実施態様
において、抗ウイルス性構成物は、幹細胞及び分化した細胞の両方に導入される
。
である、より発達したヒト造血性細胞に導入される。これら分化した細胞は生命
期間が限られているので、ＨＩＶ−１調節性抗ウイルス性構成物の標的細胞への
導入を２回以上（多数回を含む）繰り返す必要があるだろう。幾つかの実施態様
において、抗ウイルス性構成物は、幹細胞及び分化した細胞の両方に導入される
。
【００７７】 ＨＩＶ−１は、ＣＤ４及びケモキンコレセプター（chemokine coreceptor）を
介してＴ細胞に感染する。ＣＤ−４発現リンパ球は、ＨＩＶの第１の標的であり
、又ウイルス複製の主要な源の１つを代表する。ＣＤ４+細胞は、免疫吸着、イ ムノマグネティック分離、及びＦＡＣＳを含む方法において、抗ＣＤ４抗体（陽
性（ポジティブ）選択に関し）及び他の抗体（陰性（ネガティブ）選択に関し）
を用いて、末梢血単球細胞を含む源から選択することができる。本発明に従う構
成物でのＣＤ４+のトランスフェクションは、ＨＩＶに感染した患者の末梢血及 び／又はリンパ節中のウイルス負荷を減らすことができる。
介してＴ細胞に感染する。ＣＤ−４発現リンパ球は、ＨＩＶの第１の標的であり
、又ウイルス複製の主要な源の１つを代表する。ＣＤ４+細胞は、免疫吸着、イ ムノマグネティック分離、及びＦＡＣＳを含む方法において、抗ＣＤ４抗体（陽
性（ポジティブ）選択に関し）及び他の抗体（陰性（ネガティブ）選択に関し）
を用いて、末梢血単球細胞を含む源から選択することができる。本発明に従う構
成物でのＣＤ４+のトランスフェクションは、ＨＩＶに感染した患者の末梢血及 び／又はリンパ節中のウイルス負荷を減らすことができる。
【００７８】 Ｈ）処置方法 患者の選択：本発明に従った方法及び構成はＨＩＶ感染細胞の死滅を媒介し、
従って子孫ウイルスの放出及び患者内での感染の広がりを防ぐ。
従って子孫ウイルスの放出及び患者内での感染の広がりを防ぐ。
【００７９】 本発明に従う方法及び構成は、すでにＨＩＶに感染した個体を処置するために
用いることができる。このアプローチは、感染に対して感受性ではない細胞（そ
うでなければ感受性である）の蓄積を生成し、又ＡＩＤＳに関連する症状を防ぐ
か、或いは改善することができる。本発明に従う方法及び構成物は、特に、１つ
以上のＨＩＶプロテアーゼ及び／又は逆転写酵素の阻害剤に耐性である、ＨＩＶ
−１感染個体の処置のために有用である。
用いることができる。このアプローチは、感染に対して感受性ではない細胞（そ
うでなければ感受性である）の蓄積を生成し、又ＡＩＤＳに関連する症状を防ぐ
か、或いは改善することができる。本発明に従う方法及び構成物は、特に、１つ
以上のＨＩＶプロテアーゼ及び／又は逆転写酵素の阻害剤に耐性である、ＨＩＶ
−１感染個体の処置のために有用である。
【００８０】 本発明に従う方法及び構成物は、性行為、静脈内（静脈注射の）薬剤の使用、
医療環境、職業、又は他の顕著な危険性のために、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの危
険性の高い、未感染個体の処置のために用いることができる。このアプローチは
ＨＩＶ感染を防ぐため、並びに有害な後遺症を防ぐために用いることができる。
医療環境、職業、又は他の顕著な危険性のために、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの危
険性の高い、未感染個体の処置のために用いることができる。このアプローチは
ＨＩＶ感染を防ぐため、並びに有害な後遺症を防ぐために用いることができる。
【００８１】 本発明に従う組替え構成は、臨床的応用のために、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎｖ
ｉｖｏによるアプローチのいずれかを用いてヒト細胞に転移することができる。
ｉｖｏによるアプローチのいずれかを用いてヒト細胞に転移することができる。
【００８２】 ｅｘ ｖｉｖｏのアプローチでは、細胞は患者から取り除かれ、富化され、培
養され、又組替え構成物で感染又はトランスフェクトされ、その後患者内に再び
導入して戻される。ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療の方法は、ブラエセ（Blaese
）ら（Science ２７０：４７５−８０（１９９５））、コーン（Kohn）ら（Natu re Medicine １（１０）：１０１７−２３（１９９５年１０月））、フェラーリ
（Ferrari）ら（Blood ８０：１１２０−２４（１９９２））によって開示され ている。これら全てを参照により本発明に援用する。
養され、又組替え構成物で感染又はトランスフェクトされ、その後患者内に再び
導入して戻される。ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療の方法は、ブラエセ（Blaese
）ら（Science ２７０：４７５−８０（１９９５））、コーン（Kohn）ら（Natu re Medicine １（１０）：１０１７−２３（１９９５年１０月））、フェラーリ
（Ferrari）ら（Blood ８０：１１２０−２４（１９９２））によって開示され ている。これら全てを参照により本発明に援用する。
【００８３】 ｅｘ ｖｉｖｏ投与のために、細胞は、一般的には約０．１〜約１００、好ま
しくは約０．１〜約１０、又最も好ましくは約０．１〜約１．０（感染性組替え
レトロウイルス粒子／細胞）の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）において形質導入され
る。幾つかの手順では、１標的細胞に対して２〜５のコロニー形成単位（ＣＦＵ
）が用いられる。遺伝子修飾された細胞は、静脈内注入及び骨髄への直接注入を
含む非経口的方法によって、患者に再導入することができる。遺伝子修飾された
細胞は、塩溶液又は他の医薬上許容しうるキャリア中にて患者に再導入される。
再導入される細胞の数は細胞個体群の純度に左右されるが、一般的な用量は、患
者の体重１キログラムに対して約１０5〜約１０8細胞である。例えば、ＣＤ３４
+細胞がｅｘ ｖｉｖｏ形質導入前に選択される場合、約１０6〜約１０8細胞が 一般的に患者内に再導入される。より富化された細胞個体群に関しては、それに
対応してより少ない細胞が患者に再導入される必要がある。異なるクローン間に
観察される様々な抗ウイルスポテンシャルのために、Ｔａｔ蛋白質の存在下にお
けるＰＫＲの適当な発現及び活性化を確認するためのプレスクリーニング工程を
、遺伝子治療法に組み込むこができる。
しくは約０．１〜約１０、又最も好ましくは約０．１〜約１．０（感染性組替え
レトロウイルス粒子／細胞）の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）において形質導入され
る。幾つかの手順では、１標的細胞に対して２〜５のコロニー形成単位（ＣＦＵ
）が用いられる。遺伝子修飾された細胞は、静脈内注入及び骨髄への直接注入を
含む非経口的方法によって、患者に再導入することができる。遺伝子修飾された
細胞は、塩溶液又は他の医薬上許容しうるキャリア中にて患者に再導入される。
再導入される細胞の数は細胞個体群の純度に左右されるが、一般的な用量は、患
者の体重１キログラムに対して約１０5〜約１０8細胞である。例えば、ＣＤ３４
+細胞がｅｘ ｖｉｖｏ形質導入前に選択される場合、約１０6〜約１０8細胞が 一般的に患者内に再導入される。より富化された細胞個体群に関しては、それに
対応してより少ない細胞が患者に再導入される必要がある。異なるクローン間に
観察される様々な抗ウイルスポテンシャルのために、Ｔａｔ蛋白質の存在下にお
けるＰＫＲの適当な発現及び活性化を確認するためのプレスクリーニング工程を
、遺伝子治療法に組み込むこができる。
【００８４】 ｉｎ ｖｉｖｏのアプローチでは、組替えベクターは直接患者に注入される。
ベクターは、選択的に標的細胞（例えば、ＣＤ３４+幹細胞又はＣＤ４+リンパ球
）に組み込まれるように構成される。例えば、切断されたＨＩＶエンベロープ糖
蛋白質でのＭ−ＭｕＬＶウイルスの偽型化は、ＣＤ４＋細胞に特異的に感染する
レトロウイルス性ベクターを生成する（シュナイエレ（Schnierle)ら、Proc. Na tl. Acad. Sci. USA ９４：８６４０−４５（１９９７年８月））。ｉｎ ｖｉ ｖｏ投与のために、約１０5〜約１０9ベクターが、静脈内注入又は骨髄内への直
接注入のような非経口的方法によって注入される。
ベクターは、選択的に標的細胞（例えば、ＣＤ３４+幹細胞又はＣＤ４+リンパ球
）に組み込まれるように構成される。例えば、切断されたＨＩＶエンベロープ糖
蛋白質でのＭ−ＭｕＬＶウイルスの偽型化は、ＣＤ４＋細胞に特異的に感染する
レトロウイルス性ベクターを生成する（シュナイエレ（Schnierle)ら、Proc. Na tl. Acad. Sci. USA ９４：８６４０−４５（１９９７年８月））。ｉｎ ｖｉ ｖｏ投与のために、約１０5〜約１０9ベクターが、静脈内注入又は骨髄内への直
接注入のような非経口的方法によって注入される。
【００８５】 本発明の方法及び構成物は、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、プロテアーゼ阻害剤及
びその組合わせなど、他の抗ウイルス薬剤と組み合わせて用いることができる。
細胞内免疫処置のアプローチは、抗ウイルス薬剤を顕著に減少させ、ＨＩＶ−Ｉ
を、無傷（intact）免疫系を維持している間の真正潜伏状態に維持し、又副作用
を減少させることができる。
びその組合わせなど、他の抗ウイルス薬剤と組み合わせて用いることができる。
細胞内免疫処置のアプローチは、抗ウイルス薬剤を顕著に減少させ、ＨＩＶ−Ｉ
を、無傷（intact）免疫系を維持している間の真正潜伏状態に維持し、又副作用
を減少させることができる。
【００８６】 ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを研究するため、又、ヒト対象における使用の前に処
置手順を最適化するために、動物モデルとしてヒト細胞で再構成されたＳＣＩＤ
マウスを用いる。ＳＣＩＤマウスは、レトロウイルス性ベクターを用いて、本発
明に従ったＨＩＶ調節性構成物でトランスフェクトされた末梢血単球細胞又は骨
髄細胞で再構成される。その後この動物をＨＩＶに暴露し、その感染に対する感
受性（感染し易さ）を監視した。
置手順を最適化するために、動物モデルとしてヒト細胞で再構成されたＳＣＩＤ
マウスを用いる。ＳＣＩＤマウスは、レトロウイルス性ベクターを用いて、本発
明に従ったＨＩＶ調節性構成物でトランスフェクトされた末梢血単球細胞又は骨
髄細胞で再構成される。その後この動物をＨＩＶに暴露し、その感染に対する感
受性（感染し易さ）を監視した。
【００８７】 例 以下の例は本発明を説明するものである。これらの例は実証の目的のためだけ
のものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
のものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８８】 例１ 材料及び方法 Ａ）オリゴヌクレオチド 以下のオリゴヌクレオチドを、ここに記載される実験のために用いた。
【００８９】 （１）配列番号１（SEQ ID NO:1）：ｐＭＥＡ００１中のヌクレオチド６８５ 〜７０１に相補的な、ＨＩＶ−１ ＬＴＲプライマー［５′−ｄ（ＣＴＧＧＣＴ
ＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣ）−３′］； （２）配列番号２（SEQ ID NO:2）：ポリＡ（１）６５−マー［５′−ｄ（Ｃ ＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡＧＧＣＣ
ＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧ）−３′］； （３）配列番号３（SEQ ID NO:3）：相補的ポリＡ（２）６３−マー［５′ｄ （ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡ
ＡＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＴＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＡＴＣＴＡＴ）−３′］；及び （３）配列番号４（SEQ ID NO:4）：ＮＦ−κＢ結合部位に対応するセンスプ ローブオリゴヌクレオチド５′−ＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧ
ＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡ−３′ Ｂ）細胞培養及びウイルス調製 ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection（メリ
ーランド州 ロックビレ）から入手した。ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに慢性的に感染
したＭｏｌｔ４細胞（Ｍｏｌｔ ４ ＩＩＩＢ）及びＳｕｐＴ１細胞をＮＩＨ
ＡＩＤＳリサーチ アンド リージェント プログラム（NIH AIDS Research Re
ference and Reagent Program）から入手し、３７℃、５％ＣＯ2にて、１００ユ
ニット／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｒ１０）（バイオフルーズ
インコーポレイテッド（Biofluids, Inc.））を補足した１０％の熱失活ドナー 子牛（calf）血清を含む、ＲＰＭＩ１６４０（ジブコ（GIBCO））中で成長させ た。アンホトロピックレトロウイルス（両指向性レトロウイルス）パッケージン
グ細胞系列ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２はアーサー・バンク博士（Dr. Arthur Bank） から提供された（コロンビア大学（Columbia University、ニューヨーク）。
ＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣ）−３′］； （２）配列番号２（SEQ ID NO:2）：ポリＡ（１）６５−マー［５′−ｄ（Ｃ ＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡＧＧＣＣ
ＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧ）−３′］； （３）配列番号３（SEQ ID NO:3）：相補的ポリＡ（２）６３−マー［５′ｄ （ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡ
ＡＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＴＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＡＴＣＴＡＴ）−３′］；及び （３）配列番号４（SEQ ID NO:4）：ＮＦ−κＢ結合部位に対応するセンスプ ローブオリゴヌクレオチド５′−ＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧ
ＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡ−３′ Ｂ）細胞培養及びウイルス調製 ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection（メリ
ーランド州 ロックビレ）から入手した。ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに慢性的に感染
したＭｏｌｔ４細胞（Ｍｏｌｔ ４ ＩＩＩＢ）及びＳｕｐＴ１細胞をＮＩＨ
ＡＩＤＳリサーチ アンド リージェント プログラム（NIH AIDS Research Re
ference and Reagent Program）から入手し、３７℃、５％ＣＯ2にて、１００ユ
ニット／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｒ１０）（バイオフルーズ
インコーポレイテッド（Biofluids, Inc.））を補足した１０％の熱失活ドナー 子牛（calf）血清を含む、ＲＰＭＩ１６４０（ジブコ（GIBCO））中で成長させ た。アンホトロピックレトロウイルス（両指向性レトロウイルス）パッケージン
グ細胞系列ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２はアーサー・バンク博士（Dr. Arthur Bank） から提供された（コロンビア大学（Columbia University、ニューヨーク）。
【００９０】 ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞系列は、２ｍＭのグルタミ
ン及び１００ユニット／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｄ１０Ｇ）で
補足した１０％の熱失活子牛血清を含む、ダルベッコ修飾イーグルの培地（ＤＭ
ＥＭ）中に維持した。Ｍｏｌｔ４ ＩＩＩＢ細胞からの培養の上清を、感染性ウ
イルスの源として用いる。上清は遠心分離（５００×ｇ、５分、４℃）によって
澄ませ、１０ｍｌずつのアリコートを−７０℃にて使用するまで保存した。ＨＩ
Ｖ−１ ＩＩＩＢの力価（タイター）は、ＳｕｐＴ１細胞の感染、連続希釈、及
び４回のシンシチウム形成の記録（スコアリング）によって計算した。
ン及び１００ユニット／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｄ１０Ｇ）で
補足した１０％の熱失活子牛血清を含む、ダルベッコ修飾イーグルの培地（ＤＭ
ＥＭ）中に維持した。Ｍｏｌｔ４ ＩＩＩＢ細胞からの培養の上清を、感染性ウ
イルスの源として用いる。上清は遠心分離（５００×ｇ、５分、４℃）によって
澄ませ、１０ｍｌずつのアリコートを−７０℃にて使用するまで保存した。ＨＩ
Ｖ−１ ＩＩＩＢの力価（タイター）は、ＳｕｐＴ１細胞の感染、連続希釈、及
び４回のシンシチウム形成の記録（スコアリング）によって計算した。
【００９１】 例２ ＰＫＲ ｃＤＮＡを含むプラスミドの構成 図１Ａに示されるように、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ−ポリ（Ａ
）カセットを、前進（ｐＭＥＡ１０５）及び逆進（ｐＭＥＡ１０６）方向にて、
ｐＮ２レトロウイルス性ベクター中にクローン化した。このレトロウイルス性ベ
クターは、複製不全（replication-incompetent）ＭＭｕＬＶ粒子を用いたＨＩ Ｖ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ−ポリ（Ａ）カセットの標的細胞への安定な
組み込みを達成するために用いることができるので、このレトロウイルス性ベク
ターが選ばれた。レトロウイルス媒介細胞内免疫処置のアプローチは、（ｉ）有
効で、良く特徴付けられた送達系（デリバリーシステム）、（ｉｉ）ＰＫＲ ｃ
ＤＮＡ構成物がＨＩＶ−１感染によってのみ高レベルにて転写及び活性化される
という特異性、（ｉｉｉ）しっかりと調節され、未感染細胞中では、そのアロス
テリック作用に関するｄｓＲＮＡへの依存性のために潜伏（沈黙）している系を
提供するように設計されている。
）カセットを、前進（ｐＭＥＡ１０５）及び逆進（ｐＭＥＡ１０６）方向にて、
ｐＮ２レトロウイルス性ベクター中にクローン化した。このレトロウイルス性ベ
クターは、複製不全（replication-incompetent）ＭＭｕＬＶ粒子を用いたＨＩ Ｖ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ−ポリ（Ａ）カセットの標的細胞への安定な
組み込みを達成するために用いることができるので、このレトロウイルス性ベク
ターが選ばれた。レトロウイルス媒介細胞内免疫処置のアプローチは、（ｉ）有
効で、良く特徴付けられた送達系（デリバリーシステム）、（ｉｉ）ＰＫＲ ｃ
ＤＮＡ構成物がＨＩＶ−１感染によってのみ高レベルにて転写及び活性化される
という特異性、（ｉｉｉ）しっかりと調節され、未感染細胞中では、そのアロス
テリック作用に関するｄｓＲＮＡへの依存性のために潜伏（沈黙）している系を
提供するように設計されている。
【００９２】 Ａ）ｐＭＥＡ００１の構成 ｐＭＥＡ００１を構成するために、野生型ＰＫＲ ｃＤＮＡを含むｐ６８−ｐ
ｃＤＮＡＩ／ＮＥＯプラスミド（グレン・バーバー博士（Dr. Glen Barber）（ ワシントン大学（University of Washington）、シアトル））から提供された。
）を、標準的な細菌培養手順によって増幅させ、又ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、
及びＨｈａＩで消化し、３６断片を得た（メウアーズ（Meurs）ら、Cell ６２：
３７９−３９０（１９９０））。ｗｔＰＫＲ ｃＤＮＡを含む１８２６ヌクレオ
チドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片を、ＤＥＡＥ−セルロースを用いて精製し
た。ｐＨＩＶα2ＩＦＮプラスミド（ダニエル・ピー・ベドナリク博士（Dr. Dan
iel P. Bednarik）、（ヒューマン ゲノム サイエンス（Human Genome Scienc
e）、ロックビレ、メリーランド州）から提供された。）をＸｈｏＩ及びＨｉｎ ｄＩＩＩで消化し、Ｕ３及びＲ領域を含む７２７ｂｐ断片と、ＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒ中に位置するウイルスＤＮＡの更なる１９５ヌクレオチドを放出した（ベドナ
リク（Bednarik）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：４９５８−４９６２ （１９８９）；ローゼン（Rosen）ら、Cell ４１：８１３−８２３（１９８５）
；ソドロスキ（Sodroski）ら、Science ２２５：３８１−３８５（１９８４））
。
ｃＤＮＡＩ／ＮＥＯプラスミド（グレン・バーバー博士（Dr. Glen Barber）（ ワシントン大学（University of Washington）、シアトル））から提供された。
）を、標準的な細菌培養手順によって増幅させ、又ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、
及びＨｈａＩで消化し、３６断片を得た（メウアーズ（Meurs）ら、Cell ６２：
３７９−３９０（１９９０））。ｗｔＰＫＲ ｃＤＮＡを含む１８２６ヌクレオ
チドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片を、ＤＥＡＥ−セルロースを用いて精製し
た。ｐＨＩＶα2ＩＦＮプラスミド（ダニエル・ピー・ベドナリク博士（Dr. Dan
iel P. Bednarik）、（ヒューマン ゲノム サイエンス（Human Genome Scienc
e）、ロックビレ、メリーランド州）から提供された。）をＸｈｏＩ及びＨｉｎ ｄＩＩＩで消化し、Ｕ３及びＲ領域を含む７２７ｂｐ断片と、ＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒ中に位置するウイルスＤＮＡの更なる１９５ヌクレオチドを放出した（ベドナ
リク（Bednarik）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：４９５８−４９６２ （１９８９）；ローゼン（Rosen）ら、Cell ４１：８１３−８２３（１９８５）
；ソドロスキ（Sodroski）ら、Science ２２５：３８１−３８５（１９８４））
。
【００９３】 バックボーン（基幹）プラスミドとして供するために、ｐＳＰ７２ベクター（
プロメガ（Promega）を、ＸｈｏＩ及びＰｓｔＩにて、その多重クローニング領 域内で消化し、より大きい２４３４ｂｐヌクレオチド断片を分離し、三重ライゲ
ーションを行って、ｗｔ ＰＫＲ ｃＤＮＡの発現を制御するＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒを含むプラスミドを作製した。制限地図化（マッピング）及びＤＮＡ配列を利
用して、所望のプラスミド構成を担持する微生物コロニーを同定した。
プロメガ（Promega）を、ＸｈｏＩ及びＰｓｔＩにて、その多重クローニング領 域内で消化し、より大きい２４３４ｂｐヌクレオチド断片を分離し、三重ライゲ
ーションを行って、ｗｔ ＰＫＲ ｃＤＮＡの発現を制御するＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒを含むプラスミドを作製した。制限地図化（マッピング）及びＤＮＡ配列を利
用して、所望のプラスミド構成を担持する微生物コロニーを同定した。
【００９４】 Ｂ）ｐＭＥＡ１０１の構成 ｐＭＥＡ００１プラスミドを、ｃＤＮＡの挿入に続く下流のポリアデニル化シ
グナルなしに作製した。ポリアデニル化シグナルは、３′ＭＭｕＬＶ ＬＴＲに
よって前進方向にクローン化された配列に与えられるであろうが、有効な逆進方
向に関し、合成６５−マーオリゴヌクレオチド、ポリＡ（１）の前の転写後プロ
セッシングが合成され、上流のＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナル、２３ヌク
レオチドスペーサー領域、ウサギβ−グロブリンｍＲＮＡからの下流のポリアデ
ニル化（ＧＴ）n（Ｔ）n配列、及び３′末端における付加的ＸｈｏＩ部位を封じ
込めた（チェン（Chen）ら、Nucleic Acids Res. １２：１７６７−１７６８（ １９８４）；ギル（Gil）ら、Cell ４９：３９９−４０６（１９８７）；レビッ
ト（Levitt）ら、Genes & Dev. ３：１０１９−１０２５（１９８９）；マック デビット（McDevitt）ら、EMBO J. ５：２９０７−２９１３（１９８６））。そ
の相補的合成オリゴヌクレオチド［ポリＡ（２）］とアニーリングされたとき、
５′Ｃｌａｌオーバーハング及び３′平滑末端は、ｐＭＥＡ００１をＣｌａｌ／
Ｈｐａｌダイジェスト内へ挿入してｐＭＥＡ１０１を作製する機会を与える。
グナルなしに作製した。ポリアデニル化シグナルは、３′ＭＭｕＬＶ ＬＴＲに
よって前進方向にクローン化された配列に与えられるであろうが、有効な逆進方
向に関し、合成６５−マーオリゴヌクレオチド、ポリＡ（１）の前の転写後プロ
セッシングが合成され、上流のＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナル、２３ヌク
レオチドスペーサー領域、ウサギβ−グロブリンｍＲＮＡからの下流のポリアデ
ニル化（ＧＴ）n（Ｔ）n配列、及び３′末端における付加的ＸｈｏＩ部位を封じ
込めた（チェン（Chen）ら、Nucleic Acids Res. １２：１７６７−１７６８（ １９８４）；ギル（Gil）ら、Cell ４９：３９９−４０６（１９８７）；レビッ
ト（Levitt）ら、Genes & Dev. ３：１０１９−１０２５（１９８９）；マック デビット（McDevitt）ら、EMBO J. ５：２９０７−２９１３（１９８６））。そ
の相補的合成オリゴヌクレオチド［ポリＡ（２）］とアニーリングされたとき、
５′Ｃｌａｌオーバーハング及び３′平滑末端は、ｐＭＥＡ００１をＣｌａｌ／
Ｈｐａｌダイジェスト内へ挿入してｐＭＥＡ１０１を作製する機会を与える。
【００９５】 Ｃ）ｐＭＥＡ１０５及びｐＭＥＡ１０６の構成 ＸｈｏＩ−ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ−ポリ（Ａ）−ＸｈｏＩ断
片は、２方向にてｐＮ２ベクターに直接サブクローン化した。宿主は、メチル化
パターンを用いて、プロウイルス挿入からの転写開始を不活性化できることが報
告されている。クローン化された構成物中のＭ−ＭｕＬＶ５′ＬＴＲから前進方
向にて開始するリードスルー（readthroug）転写による抗増殖性遺伝子の不適当
な発現は、このタイプ宿主抑制を促進するであろう（ベドナリク（Bednarik）ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：４９５８−４９６２（１９８９））。Ｄ Ｈ５α細胞のライゲーション及び形質転換、及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを用いた選択に続いて、ｐＭＥＡ１０５
及びｐＭＥＡ１０６プラスミドを分離し、制限地図（図１Ａ）によって分析した
。プラスミドの同一性の最終確認のために、ポリ（Ａ）部位の領域を配列決定し
た。
片は、２方向にてｐＮ２ベクターに直接サブクローン化した。宿主は、メチル化
パターンを用いて、プロウイルス挿入からの転写開始を不活性化できることが報
告されている。クローン化された構成物中のＭ−ＭｕＬＶ５′ＬＴＲから前進方
向にて開始するリードスルー（readthroug）転写による抗増殖性遺伝子の不適当
な発現は、このタイプ宿主抑制を促進するであろう（ベドナリク（Bednarik）ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：４９５８−４９６２（１９８９））。Ｄ Ｈ５α細胞のライゲーション及び形質転換、及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを用いた選択に続いて、ｐＭＥＡ１０５
及びｐＭＥＡ１０６プラスミドを分離し、制限地図（図１Ａ）によって分析した
。プラスミドの同一性の最終確認のために、ポリ（Ａ）部位の領域を配列決定し
た。
【００９６】 例３ レトロウイルスプロデューサー細胞系列の生産 組替えウイルスを生産するために、例２にて構成されたプラスミド（ＨＩＶ
ＬＴＲの制御の下でＰＫＲをエンコードする）をレトロウイルスパッケージング
細胞系列内に転移した。
ＬＴＲの制御の下でＰＫＲをエンコードする）をレトロウイルスパッケージング
細胞系列内に転移した。
【００９７】 Ａ）ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞のトランスフェクション ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞系列は、アンホトロピックレトロウイルス（両指向
性レトロウイルス）の生産のためのパッケージング細胞系列である。この細胞系
列は、ｇａｇ及びｐｏｌヘルパー機能を１つのプラスミドに導入し、又ｅｎｖヘ
ルパー機能を別個のプラスミドに導入することによって構成される。クローン化
されたヘルパー機能は、パッケージングシグナル又は３′−ＬＴＲ配列を含まな
い。ヘルパー機能の構造は、コンピテントウイルス（ＲＣＲ、遺伝子治療分野に
おける主要な関心事）を複製することを保証する。この系を用いる場合、コンピ
テントウイルスの複製を発生するためには、３つの独立した組替え事象が必要と
されよう。
性レトロウイルス）の生産のためのパッケージング細胞系列である。この細胞系
列は、ｇａｇ及びｐｏｌヘルパー機能を１つのプラスミドに導入し、又ｅｎｖヘ
ルパー機能を別個のプラスミドに導入することによって構成される。クローン化
されたヘルパー機能は、パッケージングシグナル又は３′−ＬＴＲ配列を含まな
い。ヘルパー機能の構造は、コンピテントウイルス（ＲＣＲ、遺伝子治療分野に
おける主要な関心事）を複製することを保証する。この系を用いる場合、コンピ
テントウイルスの複製を発生するためには、３つの独立した組替え事象が必要と
されよう。
【００９８】 標準的なリン酸カルシウム共沈技術（１０μｇのプラスミド／２×１０5ＧＰ ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞）による、３７℃、５％ＣＯ2における、１２時間のプラ スミドのトランスフェクションに続いて、トランスフェクション培地を吸引し、
５ｍｌの新鮮なＤ１０Ｇで置換した。１２時間後、Ｄ１０Ｇを吸引し、細胞を２
ｍｌのＰＢＳで濯ぎ、再び吸引した。トリプシン溶液（５００ｐｉ、０．２５％
）を各ウェルに添加し、その後３７℃、５％ＣＯ2にて５分間インキュベーショ ンした。細胞を５ｍｌのＤ１０Ｇに再懸濁し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤ
１０Ｇ中で１０-3まで希釈した。１４日後、トリパンブルー排除（Trypan blue
exclusion）によって測定して、模擬（mock）トランスフェクションされた対照 の生育力が完全に失われたのと同時に、個々のＧ４１８耐性コロニー群を、クロ
ーニングウェル中でミニ−トリプシン処理によって単離した。単離されたコロニ
ー群を、滴定（タイタリング）及び更なる特徴付けのために増やした。
５ｍｌの新鮮なＤ１０Ｇで置換した。１２時間後、Ｄ１０Ｇを吸引し、細胞を２
ｍｌのＰＢＳで濯ぎ、再び吸引した。トリプシン溶液（５００ｐｉ、０．２５％
）を各ウェルに添加し、その後３７℃、５％ＣＯ2にて５分間インキュベーショ ンした。細胞を５ｍｌのＤ１０Ｇに再懸濁し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤ
１０Ｇ中で１０-3まで希釈した。１４日後、トリパンブルー排除（Trypan blue
exclusion）によって測定して、模擬（mock）トランスフェクションされた対照 の生育力が完全に失われたのと同時に、個々のＧ４１８耐性コロニー群を、クロ
ーニングウェル中でミニ−トリプシン処理によって単離した。単離されたコロニ
ー群を、滴定（タイタリング）及び更なる特徴付けのために増やした。
【００９９】 Ｂ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞による組換えレトロウイルス力価（タイター）の決定 ＮＩＨ３Ｔ３細胞（１×１０5）を個々の６０ｍｍ2プレートに接種し、３７℃
、５％ＣＯ2において一晩プレート表面に付着させた。感染は、多重希釈にて２ 回行われた。ウイルス上清を、１００ｍｍ組織培養プレート中にで増やされた殆
ど集密的なＧ４１８耐性アンホトロピックレトロウイルスプロデューサー細胞か
ら集め、−７０℃にて凍結した。このウイルス上清を、穏やかに振動しながら３
７℃にてインキュベーションして溶かし、氷上に置き、そして１０μｇ／ｍｌの
ポリブレンを含むＤ１０Ｇ中で１×１０-6まで希釈した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞プ
レートからの消費された培地は吸引し、５００μｌの適当なウイルス上清希釈物
で置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2にて２時間、２０分に１回穏やかに 揺らしながらインキュベーションした。希釈されたウイルスを含む培地を吸引し
、５ｍｌのＤ１０Ｇを添加した。１６時間のインキュベーションの後、この培地
を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む５ｍｌのＤ１０Ｇで置換した。生存（バイアブ
ル）コロニーを１０〜１４日後に記録し、ウイルスの力価（タイター）を計算し
た。
、５％ＣＯ2において一晩プレート表面に付着させた。感染は、多重希釈にて２ 回行われた。ウイルス上清を、１００ｍｍ組織培養プレート中にで増やされた殆
ど集密的なＧ４１８耐性アンホトロピックレトロウイルスプロデューサー細胞か
ら集め、−７０℃にて凍結した。このウイルス上清を、穏やかに振動しながら３
７℃にてインキュベーションして溶かし、氷上に置き、そして１０μｇ／ｍｌの
ポリブレンを含むＤ１０Ｇ中で１×１０-6まで希釈した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞プ
レートからの消費された培地は吸引し、５００μｌの適当なウイルス上清希釈物
で置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2にて２時間、２０分に１回穏やかに 揺らしながらインキュベーションした。希釈されたウイルスを含む培地を吸引し
、５ｍｌのＤ１０Ｇを添加した。１６時間のインキュベーションの後、この培地
を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む５ｍｌのＤ１０Ｇで置換した。生存（バイアブ
ル）コロニーを１０〜１４日後に記録し、ウイルスの力価（タイター）を計算し
た。
【０１００】 ｐＮ２、ｐＭＥＡ１０５、及びｐＭＥＡ１０６プラスミドの、ＧＰ＋ｅｎｖＡ
ｍｌ２細胞中へのリン酸カルシウム媒介トランスフェクションは、ＮＩＨ／３Ｔ
３細胞の形質導入によって決定して、１０1〜１０2ｃｆｕ／ｍｌの力価（タイタ
ー）を与えるＧ４１８選択クローンをプールした。
ｍｌ２細胞中へのリン酸カルシウム媒介トランスフェクションは、ＮＩＨ／３Ｔ
３細胞の形質導入によって決定して、１０1〜１０2ｃｆｕ／ｍｌの力価（タイタ
ー）を与えるＧ４１８選択クローンをプールした。
【０１０１】 プラスミドトランスフェクションに続く個々のクローンの単離は、レトロウイ
ルス性プロデューサー細胞系列の力価（タイター）を増加した。Ｎ２−２０、１
０５−１０、及び１０６−４系列は、それぞれ１．７±０．４×１０5、１．１ ±０．１×１０4、及び１．２±０．４×１０5で滴定された。
ルス性プロデューサー細胞系列の力価（タイター）を増加した。Ｎ２−２０、１
０５−１０、及び１０６−４系列は、それぞれ１．７±０．４×１０5、１．１ ±０．１×１０4、及び１．２±０．４×１０5で滴定された。
【０１０２】 例４ レトロウイルス媒介ＳｕｐＴ１細胞形質導入 ＳｕｐＴ１リンパ芽球細胞を、例３のプロデューサー細胞系列との共生培養（
cocultivation）によって形質導入した。
cocultivation）によって形質導入した。
【０１０３】 Ａ）レトロウイルス媒介形質導入 プロデューサー細胞系列Ｎ２−２０、１０５−１０、及び１０６−４（２．０
×１０5）を１００ｍｍ2細胞培養プレート内の総容量１０ｍｌのＤ１０Ｇ中に接
種した。１２時間後培地を吸引し、１０ｍｌＰＢＳ、及び１×１０6のＳｕｐＴ １細胞及び４μｇ／ｍｌのポリブレンを含む５ｍｌのＤ１０Ｇで細胞を洗浄し、
プロデューサー細胞に添加した。２４時間間隔で、４μｇ／ｍｌのポリブレンを
含む５ｍｌのＤ１０Ｇを更に加えた。形質導入の開始から９６時間後、穏やかな
振動及び再懸濁細胞の除去によって共生培養を終了した。プロデューサー細胞を
ＰＢＳで２回濯ぎ、培地／ＰＢＳ懸濁液をプールした。細胞を遠心分離し（３５
０×ｇ、４℃、５分）、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５００μｇ／ｍｌのＧ４１
８を含む３ｍｌのＲ１０中に再懸濁した。１００μｌずつのアリコートを、２重
に９６ウェル組織培養プレート中に接種した。細胞を５００μｇ／ｍｌのＧ４１
８を含むＲ１０中にて、１：２１８７まで連続希釈した。形質導入された細胞系
列の抗体選択は、一般に１４日間を要し、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞系列（ネガ
ティブ対照）と共生培養されたＳｕｐＴＩ細胞の全てが非生存（non-viable）と
なったとき完了した。
×１０5）を１００ｍｍ2細胞培養プレート内の総容量１０ｍｌのＤ１０Ｇ中に接
種した。１２時間後培地を吸引し、１０ｍｌＰＢＳ、及び１×１０6のＳｕｐＴ １細胞及び４μｇ／ｍｌのポリブレンを含む５ｍｌのＤ１０Ｇで細胞を洗浄し、
プロデューサー細胞に添加した。２４時間間隔で、４μｇ／ｍｌのポリブレンを
含む５ｍｌのＤ１０Ｇを更に加えた。形質導入の開始から９６時間後、穏やかな
振動及び再懸濁細胞の除去によって共生培養を終了した。プロデューサー細胞を
ＰＢＳで２回濯ぎ、培地／ＰＢＳ懸濁液をプールした。細胞を遠心分離し（３５
０×ｇ、４℃、５分）、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５００μｇ／ｍｌのＧ４１
８を含む３ｍｌのＲ１０中に再懸濁した。１００μｌずつのアリコートを、２重
に９６ウェル組織培養プレート中に接種した。細胞を５００μｇ／ｍｌのＧ４１
８を含むＲ１０中にて、１：２１８７まで連続希釈した。形質導入された細胞系
列の抗体選択は、一般に１４日間を要し、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞系列（ネガ
ティブ対照）と共生培養されたＳｕｐＴＩ細胞の全てが非生存（non-viable）と
なったとき完了した。
【０１０４】 Ｂ）ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析 トリプシン化の後、約５×１０7の、Ｇ４１８選択され、形質導入された細胞 及び対照細胞を遠心分離し（３５０×ｇ、４℃、１５分）、ゲノムＤＮＡを標準
的な手順に従って分離した。全てのプロウイルス挿入に共通の新生特異性（neo
specific）プローブを作製するために、ｐＮ２ベクターをＰｓｔＩで消化し、９
２３ｂｐ断片を分離し、変性及びクレノウ（Klenow）断片、未標識ヌクレオチド
類（それぞれ３０μＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＡＴＰ）、［α−32Ｐ］−ｄ
ＴＴＰ（５０μＣｉ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＤＴＴ、２００ｍＭのＨＥ ＰＥＳ（ｐＨ６．６）及び５Ａ２６０Ｕ／ｍｌランダムヘキサデオキシリボヌク
レオチド類を含む反応緩衝液の存在下でのインキュベーションによって放射性標
識した。１．２×１０9ｄｐｍ／μｇの比活性を備えたプローブが回収された。 ハイブリダイゼーション溶液のために、２×１０6ｄｐｍ／ｍｌハイブリダイゼ ーション緩衝液を利用した。画クローンからの１０μｇのゲノムＤＮＡを、Ｘｂ
ａＩで消化した。ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞からのゲノムＤＮＡを含む陽性（ポ
ジティブ）対照を、１０．１又は０．１ｍｇのｐＭＥＡ１０６プラスミドＤＮＡ
と共に増やした。消化されたゲノムＤＮＡを０．８％亜芽ロースゲルを通して２
０ボルトにて一晩電気泳動し、変性及び中和した後、ナイロン膜に８０ｌｂｓ／
ｉｎｃｈ2の圧力にて１時間真空転写した。ＤＮＡは、ＵＶストラータリンカー （UV Stratakinker）でナイロン膜に架橋させた。３時間のプレハイブレダイゼ ーションの後、２×１０7ｄｐｍのネオプローブをブロットと共に、６８℃にて 一晩インキュベーションした。この膜を種々の濃度のＳＳＣ及びＳＤＳで洗浄し
、乾燥させ、そしてＦｕｊｉ ＢＡＳ２０００ホスホリメージャー（リン光撮影
装置：phosphorimager）で分析した。
的な手順に従って分離した。全てのプロウイルス挿入に共通の新生特異性（neo
specific）プローブを作製するために、ｐＮ２ベクターをＰｓｔＩで消化し、９
２３ｂｐ断片を分離し、変性及びクレノウ（Klenow）断片、未標識ヌクレオチド
類（それぞれ３０μＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＡＴＰ）、［α−32Ｐ］−ｄ
ＴＴＰ（５０μＣｉ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＤＴＴ、２００ｍＭのＨＥ ＰＥＳ（ｐＨ６．６）及び５Ａ２６０Ｕ／ｍｌランダムヘキサデオキシリボヌク
レオチド類を含む反応緩衝液の存在下でのインキュベーションによって放射性標
識した。１．２×１０9ｄｐｍ／μｇの比活性を備えたプローブが回収された。 ハイブリダイゼーション溶液のために、２×１０6ｄｐｍ／ｍｌハイブリダイゼ ーション緩衝液を利用した。画クローンからの１０μｇのゲノムＤＮＡを、Ｘｂ
ａＩで消化した。ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞からのゲノムＤＮＡを含む陽性（ポ
ジティブ）対照を、１０．１又は０．１ｍｇのｐＭＥＡ１０６プラスミドＤＮＡ
と共に増やした。消化されたゲノムＤＮＡを０．８％亜芽ロースゲルを通して２
０ボルトにて一晩電気泳動し、変性及び中和した後、ナイロン膜に８０ｌｂｓ／
ｉｎｃｈ2の圧力にて１時間真空転写した。ＤＮＡは、ＵＶストラータリンカー （UV Stratakinker）でナイロン膜に架橋させた。３時間のプレハイブレダイゼ ーションの後、２×１０7ｄｐｍのネオプローブをブロットと共に、６８℃にて 一晩インキュベーションした。この膜を種々の濃度のＳＳＣ及びＳＤＳで洗浄し
、乾燥させ、そしてＦｕｊｉ ＢＡＳ２０００ホスホリメージャー（リン光撮影
装置：phosphorimager）で分析した。
【０１０５】 組込まれた、ネオプローブに相補的な領域を有するＮ２−２０、１０５−１０
及び１０６−４配列を、図１Ｂに示す。サザンブロット分析は、ＧＰ＋ｅｎｖＡ
ｍｌ２細胞のゲノムＤＮＡ中にリン酸カルシウムトランスフェクションされたプ
ラスミドＤＮＡの組込みを実証した（ｐＮ２、ｐＭＥＡ１０６：図１Ｃ、レーン
４及び６）。ＮＩＨ／３Ｔ３及びＳｕｐＴ１細胞のそれぞれ上清及び共生培養プ
ロデューサーを介した形質導入による、Ｇ４１８耐性クローンの発生に加えて、
Ｇ４１８選択に続くＮ２−２０及び１０６−４形質導入ＳｕｐＴ１細胞に対する
プロウイルスの組込みを、サザンプロット分析によって評価した（図１Ｃ、レー
ン５及び７）。
及び１０６−４配列を、図１Ｂに示す。サザンブロット分析は、ＧＰ＋ｅｎｖＡ
ｍｌ２細胞のゲノムＤＮＡ中にリン酸カルシウムトランスフェクションされたプ
ラスミドＤＮＡの組込みを実証した（ｐＮ２、ｐＭＥＡ１０６：図１Ｃ、レーン
４及び６）。ＮＩＨ／３Ｔ３及びＳｕｐＴ１細胞のそれぞれ上清及び共生培養プ
ロデューサーを介した形質導入による、Ｇ４１８耐性クローンの発生に加えて、
Ｇ４１８選択に続くＮ２−２０及び１０６−４形質導入ＳｕｐＴ１細胞に対する
プロウイルスの組込みを、サザンプロット分析によって評価した（図１Ｃ、レー
ン５及び７）。
【０１０６】 Ｃ）形質導入されたＧ４１８選択ＳｕｐＴ１細胞の成長曲線分析 形質導入されたＳｕｐＴ１細胞及び対照（１×１０5）を１２ウェル組織培養 プレート内で２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中に接種した。４日後、１ｍｌのＲ
ＰＭＩ１６４０を加えた。細胞の数及び生育力を、細胞接種後２００時間までト
リパンブルー排除によって２重に決定した。生育力は９５％を越えた。
ＰＭＩ１６４０を加えた。細胞の数及び生育力を、細胞接種後２００時間までト
リパンブルー排除によって２重に決定した。生育力は９５％を越えた。
【０１０７】 ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンの、トリパンブルー
排除による成長曲線の試験は、総細胞数が、検定開始から８日間までＳｕｐＴ１
及びＮ２−２０対照から著しくかけ離れないことを明らかにした。従って、ＨＩ
Ｖ−１感染の非存在下において、１０６−４逆進方向クローンＰＫＲ中でＰＫＲ
は構造的に発現されるが、しかし、細胞成長は遅くない（図４、パネルｅ及びｆ
、未感染）。
排除による成長曲線の試験は、総細胞数が、検定開始から８日間までＳｕｐＴ１
及びＮ２−２０対照から著しくかけ離れないことを明らかにした。従って、ＨＩ
Ｖ−１感染の非存在下において、１０６−４逆進方向クローンＰＫＲ中でＰＫＲ
は構造的に発現されるが、しかし、細胞成長は遅くない（図４、パネルｅ及びｆ
、未感染）。
【０１０８】 例５ ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ形質導入ＳｕｐＴ１細胞のＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ
での攻撃誘発 ＳｕｐＴ１リンパ芽細胞系列を、ＨＩＶ−１の感染の後にＰＫＲが過発現（オ
ーバーエキスプレス：overexpress）されるように形質導入した。ＨＩＶ−１複 製はシンシチウム形成によって測定した。シンシチウムはＴリンパ球を融合し、
複数の核を有し又共通の膜を共有する。これはＨＩＶ感染の結果である。Ｓｕｐ
Ｔ１親細胞系列（ＣＤ４＋Ｔリンパ球）は、細胞内ＰＫＲ発現の対照を与えた。
Ｎ２−２０クローン（ネオマイシン選択性マーカーで形質導入さたが、ＰＫＲ
ｃＤＮＡではないＴ細胞）は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ管理ＰＫＲ ｃＤＮＡ配列な
しでの細胞内ＰＫＲ及びＭ−ＭｕＬＶ ＬＴＲ発動（ドリブン）レトロウイルス
転写発現に対する対照を与える。
での攻撃誘発 ＳｕｐＴ１リンパ芽細胞系列を、ＨＩＶ−１の感染の後にＰＫＲが過発現（オ
ーバーエキスプレス：overexpress）されるように形質導入した。ＨＩＶ−１複 製はシンシチウム形成によって測定した。シンシチウムはＴリンパ球を融合し、
複数の核を有し又共通の膜を共有する。これはＨＩＶ感染の結果である。Ｓｕｐ
Ｔ１親細胞系列（ＣＤ４＋Ｔリンパ球）は、細胞内ＰＫＲ発現の対照を与えた。
Ｎ２−２０クローン（ネオマイシン選択性マーカーで形質導入さたが、ＰＫＲ
ｃＤＮＡではないＴ細胞）は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ管理ＰＫＲ ｃＤＮＡ配列な
しでの細胞内ＰＫＲ及びＭ−ＭｕＬＶ ＬＴＲ発動（ドリブン）レトロウイルス
転写発現に対する対照を与える。
【０１０９】 Ａ）レトロウイルスで形質導入された、Ｇ４１８選択ＳｕｐＴ１細胞のＨＩＶ
−１感染 細胞の数及び生育力の決定の後、形質導入された細胞及びＳｕｐＴ１対照を、
０．１のｍ．ｏ．ｉ．において、穏やかに振動させながら２時間、３７℃、５％
ＣＯ２にて攻撃誘発した。感染細胞を５容量のＲ１０で洗浄し、組み込まれてい
ないウイルスを除去した。２×１０5感染細胞／２００μｌの１アリコートを、 ９６−ウェルプレートの各ウェル中に接種した。感染後（ｐ．ｉ．）４８時間に
おいて、細胞を１：２７まで連続希釈し、２×１０5のＳｕｐＴ１指示（インジ ケータ）細胞を各ウェルに添加した（最終容量＝３００μｌ）。シンシチウムを
顕微鏡検査によって感染後（ｐ．ｉ．）９６時間で記録した。
−１感染 細胞の数及び生育力の決定の後、形質導入された細胞及びＳｕｐＴ１対照を、
０．１のｍ．ｏ．ｉ．において、穏やかに振動させながら２時間、３７℃、５％
ＣＯ２にて攻撃誘発した。感染細胞を５容量のＲ１０で洗浄し、組み込まれてい
ないウイルスを除去した。２×１０5感染細胞／２００μｌの１アリコートを、 ９６−ウェルプレートの各ウェル中に接種した。感染後（ｐ．ｉ．）４８時間に
おいて、細胞を１：２７まで連続希釈し、２×１０5のＳｕｐＴ１指示（インジ ケータ）細胞を各ウェルに添加した（最終容量＝３００μｌ）。シンシチウムを
顕微鏡検査によって感染後（ｐ．ｉ．）９６時間で記録した。
【０１１０】 各希釈因子関する補正及び３つの値の平均化によって、３回の検定から、単一
のシンシチウム記録（スコア）を計算した。即ち、９ウェルの全てを記録して単
一のシンシチウムスコアを得た。連続希釈され、インジケータ細胞と混合された
培地に添加されたウイルスは、単独でシンシチウムを与えず、これによりビリオ
ンの短い半減期、又観察されたシンシチウムがインジケータ細胞の直接的な感染
によるものではないことを実証した。
のシンシチウム記録（スコア）を計算した。即ち、９ウェルの全てを記録して単
一のシンシチウムスコアを得た。連続希釈され、インジケータ細胞と混合された
培地に添加されたウイルスは、単独でシンシチウムを与えず、これによりビリオ
ンの短い半減期、又観察されたシンシチウムがインジケータ細胞の直接的な感染
によるものではないことを実証した。
【０１１１】 ＨＩＶ−１ ＬＴＲ発動ＰＫＲ ｃＤＮＡレトロウイルス形質導入ＳｕｐＴ１
クローンがＧ４１８選択の間にプールされた場合、シンシチウム形成は、親Ｓｕ
ｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ形質導入されたＧ４１８選択ＳｕｐＴ１細胞系列の同一
の感染と比べて平均２０〜３０％減少した。成長阻害効果は、低レベルの不適当
ＰＫＲ活性化にすら関連し、強いシス作用又はレプレッサー転写要素の近傍の形
質導入構成物の組込みは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御の下で潜在的にＰＫＲの発
現を調整でき、結果として、不適当な発現をもたらし或いはＴａｔの存在下にて
発現を失う。
クローンがＧ４１８選択の間にプールされた場合、シンシチウム形成は、親Ｓｕ
ｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ形質導入されたＧ４１８選択ＳｕｐＴ１細胞系列の同一
の感染と比べて平均２０〜３０％減少した。成長阻害効果は、低レベルの不適当
ＰＫＲ活性化にすら関連し、強いシス作用又はレプレッサー転写要素の近傍の形
質導入構成物の組込みは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲの制御の下で潜在的にＰＫＲの発
現を調整でき、結果として、不適当な発現をもたらし或いはＴａｔの存在下にて
発現を失う。
【０１１２】 プールされた形質導入細胞とは反対に、限定希釈によって得られる独立して選
択されたクローンは、シンシチウム形成においてより激しい減少を示した（図２
（ａ）、３、及び７）。逆進方向クローン、１０６−４：５６０のＨＩＶ−１攻
撃誘発は、Ｎ２−２０Ｐ対照と比較して、シンシチウム形成の最も大きい減少を
もたらした（図２、黒バー）。１０５−１０：２７、１０５−１０：２３９及び
１０６−４：５８２クローンのＨＩＶ−１での攻撃誘発は、Ｎ２−２０Ｐ対照と
比較して、それぞれ５４％、５４％及び８０％のシンシチウム減少をもたらした
（図２（黒バー）及び３）。逆進方向クローン、１０６−４：５６０及び１０６
４：５８２で観察された抗ウイルス効果は、前進方向クローン、１０５−１０：
２７及び１０５−１０：２３９に対して観察されたものよりも、それぞれ８４％
、５６％大きかった（図２、黒バー）。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ内のＣｐＧ部位の宿
主依存性ハイパーメチレーション（超メチル化）が、Ｔａｔ誘導性転写を不活性
化し、又同一のレトロウイルス構成物で形質導入されたクローン系列間の、高Ｈ
ＩＶ−１活性に観察される差異を与えうることが報告されている（グーテクンス
ト（Gutekunst）ら、J. AIDS ６：５４１−５４９（１９９３））。一回の複製 の後のＭ−ＭｕＬＶにて報告された、組込まれたＤＮＡの明白な転移は観察され
なかった。
択されたクローンは、シンシチウム形成においてより激しい減少を示した（図２
（ａ）、３、及び７）。逆進方向クローン、１０６−４：５６０のＨＩＶ−１攻
撃誘発は、Ｎ２−２０Ｐ対照と比較して、シンシチウム形成の最も大きい減少を
もたらした（図２、黒バー）。１０５−１０：２７、１０５−１０：２３９及び
１０６−４：５８２クローンのＨＩＶ−１での攻撃誘発は、Ｎ２−２０Ｐ対照と
比較して、それぞれ５４％、５４％及び８０％のシンシチウム減少をもたらした
（図２（黒バー）及び３）。逆進方向クローン、１０６−４：５６０及び１０６
４：５８２で観察された抗ウイルス効果は、前進方向クローン、１０５−１０：
２７及び１０５−１０：２３９に対して観察されたものよりも、それぞれ８４％
、５６％大きかった（図２、黒バー）。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ内のＣｐＧ部位の宿
主依存性ハイパーメチレーション（超メチル化）が、Ｔａｔ誘導性転写を不活性
化し、又同一のレトロウイルス構成物で形質導入されたクローン系列間の、高Ｈ
ＩＶ−１活性に観察される差異を与えうることが報告されている（グーテクンス
ト（Gutekunst）ら、J. AIDS ６：５４１−５４９（１９９３））。一回の複製 の後のＭ−ＭｕＬＶにて報告された、組込まれたＤＮＡの明白な転移は観察され
なかった。
【０１１３】 ＨＩＶ−１誘導性シンシチウム形成の阻害に合致して、ＳｕｐＴ１及びＮ２−
２０Ｐ対照細胞中の、感染後（ｐ．ｉ．）９６時間におけるＨＩＶ−１逆転写酵
素活性は、未感染対照の３．６倍及び４．０倍まで増加し、一方、全てのＨＩＶ
−Ｉ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質転換細胞系列中のＨＩＶ−１逆転写酵素活
性１．９倍未満増加した。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質転換クロ
ーンで観察されたシンシチウム形成の阻害は、感染前に細胞を２−アミノプリン
で処理することによって逆転した（図２、白抜きバー）。２−アミノプリンの存
在下及び非存在下にて、１０５−１０及び１０６−４クローン中のシンシチウム
形成には統計学的に有意な差異があったが（それぞれ、ｐ＜０．００３、０．０
０１及びｐ＜０．００２、０．００００６）、ＳｕｐＴ１対照ではなかった（ｐ
＜０．０９０）。
２０Ｐ対照細胞中の、感染後（ｐ．ｉ．）９６時間におけるＨＩＶ−１逆転写酵
素活性は、未感染対照の３．６倍及び４．０倍まで増加し、一方、全てのＨＩＶ
−Ｉ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質転換細胞系列中のＨＩＶ−１逆転写酵素活
性１．９倍未満増加した。ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質転換クロ
ーンで観察されたシンシチウム形成の阻害は、感染前に細胞を２−アミノプリン
で処理することによって逆転した（図２、白抜きバー）。２−アミノプリンの存
在下及び非存在下にて、１０５−１０及び１０６−４クローン中のシンシチウム
形成には統計学的に有意な差異があったが（それぞれ、ｐ＜０．００３、０．０
０１及びｐ＜０．００２、０．００００６）、ＳｕｐＴ１対照ではなかった（ｐ
＜０．０９０）。
【０１１４】 Ｂ）抗ＨＩＶ−１効果の可逆性 ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡクローンで観察された抗ＨＩＶ−１効
果の可逆性を、ＨＩＶ−１感染に先立つ２−アミノプリンでの処理によって実証
した（図２、白抜きバー）。化合物２−アミノプリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び
ｉｎ ｖｉｖｏの両方におけるＰＫＲ自己リン酸化を阻害するＡＴＰ類似体であ
るが、ＰＫＲのｄｓＲＮＡ結合能力には影響しない（フー（Hu）ら、J. Interfe ron Res. １３：３２３−３２８（１９９３））。
果の可逆性を、ＨＩＶ−１感染に先立つ２−アミノプリンでの処理によって実証
した（図２、白抜きバー）。化合物２−アミノプリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び
ｉｎ ｖｉｖｏの両方におけるＰＫＲ自己リン酸化を阻害するＡＴＰ類似体であ
るが、ＰＫＲのｄｓＲＮＡ結合能力には影響しない（フー（Hu）ら、J. Interfe ron Res. １３：３２３−３２８（１９９３））。
【０１１５】 ２−アミノプリンによるＰＫＲ酵素活性の阻害を試験する研究のために、１０
ｍＭの２−アミノプリンの存在下又は非存在下（感染１時間前に添加）において
２×１０5細胞を、０．１のｍ．ｏ．ｉ．におけるＨＩＶ−１ ＩＩＩＢで感染 させることによって、３回の検定を準備した。感染の２４時間後、感染細胞を１
：２７まで連続希釈し、各ウェルに２×１０5ＳｕｐＴ１インジケータ細胞を添 加した。ＨＩＶ−１感染の非存在下における１０ｍＭの２−アミノプリンで処理
したＳｕｐＴ１細胞の生育力検定は、細胞成長の減少及び延長されたインキュベ
ーション後の細胞毒性の増加を明らかとした（２４時間後は９１％生存、４８時
間後は５４％生存）。従って、２−アミノプリン処理細胞は、感染後（ｐ．ｉ．
）２４時間において連続希釈して生育力を維持した。感染後（ｐ．ｉ．）９６時
間において、上述のようにしてシンシチウム形成を記録した。
ｍＭの２−アミノプリンの存在下又は非存在下（感染１時間前に添加）において
２×１０5細胞を、０．１のｍ．ｏ．ｉ．におけるＨＩＶ−１ ＩＩＩＢで感染 させることによって、３回の検定を準備した。感染の２４時間後、感染細胞を１
：２７まで連続希釈し、各ウェルに２×１０5ＳｕｐＴ１インジケータ細胞を添 加した。ＨＩＶ−１感染の非存在下における１０ｍＭの２−アミノプリンで処理
したＳｕｐＴ１細胞の生育力検定は、細胞成長の減少及び延長されたインキュベ
ーション後の細胞毒性の増加を明らかとした（２４時間後は９１％生存、４８時
間後は５４％生存）。従って、２−アミノプリン処理細胞は、感染後（ｐ．ｉ．
）２４時間において連続希釈して生育力を維持した。感染後（ｐ．ｉ．）９６時
間において、上述のようにしてシンシチウム形成を記録した。
【０１１６】 ４種類のクローン中の３種類のクローンが、２−アミノプリンの存在下で、Ｓ
ｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ対照と比較して統計学的に有意なシンシチウム形成の
増加を示した（１０５−１０：２７：ｐ＜０．００００１及び０．０００８；１
０５−１０：２３９：ｐ＜０．００４及び０．０３；１０６−４：５８２：ｐ＜
０．００２及び０．０１）。
ｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ対照と比較して統計学的に有意なシンシチウム形成の
増加を示した（１０５−１０：２７：ｐ＜０．００００１及び０．０００８；１
０５−１０：２３９：ｐ＜０．００４及び０．０３；１０６−４：５８２：ｐ＜
０．００２及び０．０１）。
【０１１７】 例６ ＨＩＶ感染の間のＰＫＲ発現及び活性 Ａ）ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ感染の間のＰＫＲ発現 感染後（ｐ．ｉ．）７２時間におけるＳｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ対照中のＰ
ＫＲ蛋白質レベルは未決定であるが、ウエスタンブロット分析は、感染後９６時
間において、ＰＫＲ発現が試験された４種類のＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃ
ＤＮＡクローン中で維持されていることを実証した（図４）。
ＫＲ蛋白質レベルは未決定であるが、ウエスタンブロット分析は、感染後９６時
間において、ＰＫＲ発現が試験された４種類のＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃ
ＤＮＡクローン中で維持されていることを実証した（図４）。
【０１１８】 蛋白質調製物は、懸濁細胞（感染時において２×１０6）を、２細胞容量のＮ Ｐ−４０溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ
2、１２０ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０）で溶 解することによって得た。５０ｍｇの蛋白質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分離した。２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭのグリシ
ン、２０％のメタノール中で２０分間平衡化した後、バイロラッド（BioRad）の
トランス−ブロットＳＤセミ−ドライ転写セル（Trans-Blot SD Simi-Dry Trans
fer cell）を用いて、２５ボルト、室温にて、蛋白質をニトロセルロースに１時
間転写した。ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３７
ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレート（
Ｔｗｅｅｎ２０、シグマ（Sigma））内に調製された７．６％のドライスキムミ ルクブロッキング溶液中で、ゆっくりと振とうしながら、４℃にて１６時間イン
キュベーションした後、ブロットを多量のＴＢＳ−Ｔ中でゆっくりと振とうしな
がら室温で５回濯いだ（２回は速やかに、１×１５分、２×５分）。その後、ブ
ロットはウサギクローナル抗ＰＫＲ抗体の１：１０００希釈物と共に、１５ｍｌ
のＴＢＳ−Ｔ中で１時間インキュベーションした。ポリクローナル抗ＰＫＲ抗体
は、チャールズ イー サムウェル博士（Dr. Charles E. Samuel）（カリフォ ルニア大学サンタバーバラ校（University of California at Santa Barbara） ）から提供された。ブロットを抗体溶液から取り除き、上述のようにしてＴＢＳ
−Ｔで洗浄して、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役マウス抗ウサ
ギ血清（ピアス（Pierce）の１：２５００希釈物と共に、１時間ゆっくりと振と
うしながらインキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、ブロットは化学
ルミネセンス溶液（ＥＣＬ、アマーシャム（Amersham））で、製造者の指示書に
従って現像した。Ｘ−ＯＭＡＴフィルム（コダック（Kodak））上の露光像を現 像し、イメージ分析ソフトウェア（マッキントッシュ（Macintosh）ＮＩＨイメ ージプログラム、バージョン１．６０）。
2、１２０ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０）で溶 解することによって得た。５０ｍｇの蛋白質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分離した。２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭのグリシ
ン、２０％のメタノール中で２０分間平衡化した後、バイロラッド（BioRad）の
トランス−ブロットＳＤセミ−ドライ転写セル（Trans-Blot SD Simi-Dry Trans
fer cell）を用いて、２５ボルト、室温にて、蛋白質をニトロセルロースに１時
間転写した。ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３７
ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレート（
Ｔｗｅｅｎ２０、シグマ（Sigma））内に調製された７．６％のドライスキムミ ルクブロッキング溶液中で、ゆっくりと振とうしながら、４℃にて１６時間イン
キュベーションした後、ブロットを多量のＴＢＳ−Ｔ中でゆっくりと振とうしな
がら室温で５回濯いだ（２回は速やかに、１×１５分、２×５分）。その後、ブ
ロットはウサギクローナル抗ＰＫＲ抗体の１：１０００希釈物と共に、１５ｍｌ
のＴＢＳ−Ｔ中で１時間インキュベーションした。ポリクローナル抗ＰＫＲ抗体
は、チャールズ イー サムウェル博士（Dr. Charles E. Samuel）（カリフォ ルニア大学サンタバーバラ校（University of California at Santa Barbara） ）から提供された。ブロットを抗体溶液から取り除き、上述のようにしてＴＢＳ
−Ｔで洗浄して、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役マウス抗ウサ
ギ血清（ピアス（Pierce）の１：２５００希釈物と共に、１時間ゆっくりと振と
うしながらインキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、ブロットは化学
ルミネセンス溶液（ＥＣＬ、アマーシャム（Amersham））で、製造者の指示書に
従って現像した。Ｘ−ＯＭＡＴフィルム（コダック（Kodak））上の露光像を現 像し、イメージ分析ソフトウェア（マッキントッシュ（Macintosh）ＮＩＨイメ ージプログラム、バージョン１．６０）。
【０１１９】 ＨＩＶ−１感染の非存在下にて、２種類の逆進方向クローン、１０６−４：５
６０及び１０６−４：５８２は、Ｎ２−２０Ｐ対照と比較して、上昇したＰＫＲ
蛋白質レベルを示した（図４、パネルａ、ｅ及びｆ、未感染細胞）。これらのク
ローンは、正常な割合の細胞増殖を示し、ＰＫＲが失活状態にあることを示唆す
る。又、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンのＰＫＲ蛋白
質レベルの増加は、発現レベルの増加よりも寧ろ、蛋白質安定性の増加に起因だ
ろう。
６０及び１０６−４：５８２は、Ｎ２−２０Ｐ対照と比較して、上昇したＰＫＲ
蛋白質レベルを示した（図４、パネルａ、ｅ及びｆ、未感染細胞）。これらのク
ローンは、正常な割合の細胞増殖を示し、ＰＫＲが失活状態にあることを示唆す
る。又、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンのＰＫＲ蛋白
質レベルの増加は、発現レベルの増加よりも寧ろ、蛋白質安定性の増加に起因だ
ろう。
【０１２０】 形質導入されたクローン中のＰＫＲのレベルは、感染後（ｐ．ｉ．）７２及び
９６時間で顕著に低くなる。これは、恐らく生産的感染の欠如によって、システ
ムを発動するために利用できるＴａｔ蛋白質のレベルが低いためであろう。ＨＩ
Ｖ−１ ＬＴＲ制御下でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの
発現が、ＨＩＶ−Ｉ感染Ｈ９及びＬ８４６０Ｄジャーカット（Jurkat）細胞内で
それぞれ３２２倍及び２７８倍になることが報告されている（ソドロスキ（Sodr
oski）ら、Science ２２５：３８１−３８５（１９８４）；トーミス（Thomis）
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：１０８３７−１０８４１（１９９２） ）。このレベルまでのＰＫＲの過発現（オーバーエキスプレッション）は、ここ
に報告される研究では観察されないが、しかし、幾つかの理由のために、そのよ
うなレベルは予想されない。第１に、真核性システム中の野生型ＰＫＲ蛋白質過
発現は、その抗増殖性及び自己調節特性のために困難であると立証された（ロン
ドン（London）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：４６１６−４６２０（ １９９３））。第２に、ｅＩＦ−２Ｂの量が細胞内濃度制限内にあるので、細胞
質の酵素的に活性なＰＫＲの高レベルは達成できない。３０％のｅＩＦ−αがそ
のリン酸化状態に修飾されたとき、全ての蛋白質翻訳開始は阻害される（ハーシ
ェイ（Hershey）、J. Biol. Chem. ２６４：２０８２３−２６（１９８９））。
第３に、ＩＦＮ処理ＳｕｐＴ１及びＨｅＬａ細胞内のＰＫＲ ｍＲＮＡのレベル
は、ＲＮアーゼ保護検定によって測定したとき、それぞれ４．５倍及び５．８倍
増加するが、しかし蛋白質レベルは約２−倍だけ増加する。
９６時間で顕著に低くなる。これは、恐らく生産的感染の欠如によって、システ
ムを発動するために利用できるＴａｔ蛋白質のレベルが低いためであろう。ＨＩ
Ｖ−１ ＬＴＲ制御下でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの
発現が、ＨＩＶ−Ｉ感染Ｈ９及びＬ８４６０Ｄジャーカット（Jurkat）細胞内で
それぞれ３２２倍及び２７８倍になることが報告されている（ソドロスキ（Sodr
oski）ら、Science ２２５：３８１−３８５（１９８４）；トーミス（Thomis）
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：１０８３７−１０８４１（１９９２） ）。このレベルまでのＰＫＲの過発現（オーバーエキスプレッション）は、ここ
に報告される研究では観察されないが、しかし、幾つかの理由のために、そのよ
うなレベルは予想されない。第１に、真核性システム中の野生型ＰＫＲ蛋白質過
発現は、その抗増殖性及び自己調節特性のために困難であると立証された（ロン
ドン（London）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：４６１６−４６２０（ １９９３））。第２に、ｅＩＦ−２Ｂの量が細胞内濃度制限内にあるので、細胞
質の酵素的に活性なＰＫＲの高レベルは達成できない。３０％のｅＩＦ−αがそ
のリン酸化状態に修飾されたとき、全ての蛋白質翻訳開始は阻害される（ハーシ
ェイ（Hershey）、J. Biol. Chem. ２６４：２０８２３−２６（１９８９））。
第３に、ＩＦＮ処理ＳｕｐＴ１及びＨｅＬａ細胞内のＰＫＲ ｍＲＮＡのレベル
は、ＲＮアーゼ保護検定によって測定したとき、それぞれ４．５倍及び５．８倍
増加するが、しかし蛋白質レベルは約２−倍だけ増加する。
【０１２１】 Ｂ）ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローン内のＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ感染の間のＰＫＲ自己リン酸化レベル 感染後（ｐ．ｉ．）の指示された時間において調製されたＮＰ−４０抽出物（
３０μｇの蛋白質）を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）
、５０ｍＭのＫＣｌ、４００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプロエタノー
ル、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのア
プロチニン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のグリセロール
）で総容量３００μｌに希釈した。１０μｌの抗ヒトＰＫＲウサギ抗血清を各試
料に添加し、各サンプルを氷上で６０分間インキュベーションした。プロテイン
ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Protein A Sepharose CL-4B）（ファルマシア（Pha
macia）（５０μｌの緩衝液Ａ中５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）懸濁液）を各チュー ブに加え、その後連続回転しながら３０分間、４℃にてインキュベーションした
。セファロースをペレット化し（４２０×ｇ、４℃、５分）、３００μｌの緩衝
液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．
１ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
のグリセロール）で４回洗浄し、緩衝液Ｃ（２ｍＭのＭｎＣｌ2及び２ｍＭのＭ ｇＣｌ2を含む緩衝液Ｂ）で２回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、セファ ロースを５０μｌを、０又は０．１μｇ／ｍｌのポリ（ｒＩ）−ポリ（ｒＣ）及
び２．５μＣｉ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（＞７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む緩衝液Ｃ
中に再懸濁した。セファロースを１０分間３０℃にてインキュベーションした。
ＳＤＳ試料緩衝液（４Ｘ）を各試料に添加し、各試料を９５℃にて３分加熱した
。蛋白質を８．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ゲルを乾燥してオート
ラジオグラフィーによって分析した。
３０μｇの蛋白質）を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）
、５０ｍＭのＫＣｌ、４００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプロエタノー
ル、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのア
プロチニン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のグリセロール
）で総容量３００μｌに希釈した。１０μｌの抗ヒトＰＫＲウサギ抗血清を各試
料に添加し、各サンプルを氷上で６０分間インキュベーションした。プロテイン
ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Protein A Sepharose CL-4B）（ファルマシア（Pha
macia）（５０μｌの緩衝液Ａ中５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）懸濁液）を各チュー ブに加え、その後連続回転しながら３０分間、４℃にてインキュベーションした
。セファロースをペレット化し（４２０×ｇ、４℃、５分）、３００μｌの緩衝
液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．
１ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
のグリセロール）で４回洗浄し、緩衝液Ｃ（２ｍＭのＭｎＣｌ2及び２ｍＭのＭ ｇＣｌ2を含む緩衝液Ｂ）で２回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、セファ ロースを５０μｌを、０又は０．１μｇ／ｍｌのポリ（ｒＩ）−ポリ（ｒＣ）及
び２．５μＣｉ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（＞７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む緩衝液Ｃ
中に再懸濁した。セファロースを１０分間３０℃にてインキュベーションした。
ＳＤＳ試料緩衝液（４Ｘ）を各試料に添加し、各試料を９５℃にて３分加熱した
。蛋白質を８．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ゲルを乾燥してオート
ラジオグラフィーによって分析した。
【０１２２】 ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローン及び対照のＰＫＲ自
己リン酸化を、０．１μｇのポリ（ｒｌ）−ポリ（ｒＣ）と共に又は無しで、Ｈ
ＩＶ−１ ＩＩＩ感染の後２４時間間隔で試験した（図５）。ＰＫＲ自己リン酸
化とｅＩＦ−２αリン酸化との間に直接的関係があることが報告されている（モ
ルデチャイ（Mordechai）ら、Virology ２０６：９１３−２２（１９９５）；ス
ハドルニク（Suhadolnik）ら、Cancer Res. ４３：５４６２−６６（１９８３）
）。未処理ＳｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ対照系列のＮ２−２０抽出物中のＰＫＲ
自己リン酸化レベルは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡクローンに対し
て観察されたものより低かった。０．１μｇ／ｍｌのポリ（ｒＩ）−ポリ（ｒＣ
）の添加は、ＰＫＲ活性化レベルを正確に鐘型活性化曲線へとシフトさせた。０
．１μｇ／ｍｌのポリ（ｒＩ）−ポリ（ｒＣ）処理ＳｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ
抽出物と、対応する未処理抽出物との比較は、全てではなくても大部分のｐｋｒ
が阻害されることを明らかにした。０、０．１及び１．０μｇ／ｌのポリ（ｒＩ
）−ポリ（ｒＣ）で感染後（ｐ．ｉ．）２４時間に、クローン１０６−４：５６
０のＰＫＲ自己リン酸化の量は増加した（それぞれ２４３、３７４及び４９２ホ
スホリメージャー単位）。これらの結果は、ＨＩＶ−Ｉ感染に起因するＴＡＲ
ＲＮＡの細胞内濃度によってＰＫＲは阻害されないことを示唆する。ＨＩＶ−１
ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ配列の存在は、ＳｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ対照中
で観察されるＰＫＲ活性の阻害を防ぎ、又ＨＩＶ−１攻撃誘発で観察される抗ウ
イルス活性に寄与する。
己リン酸化を、０．１μｇのポリ（ｒｌ）−ポリ（ｒＣ）と共に又は無しで、Ｈ
ＩＶ−１ ＩＩＩ感染の後２４時間間隔で試験した（図５）。ＰＫＲ自己リン酸
化とｅＩＦ−２αリン酸化との間に直接的関係があることが報告されている（モ
ルデチャイ（Mordechai）ら、Virology ２０６：９１３−２２（１９９５）；ス
ハドルニク（Suhadolnik）ら、Cancer Res. ４３：５４６２−６６（１９８３）
）。未処理ＳｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ対照系列のＮ２−２０抽出物中のＰＫＲ
自己リン酸化レベルは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡクローンに対し
て観察されたものより低かった。０．１μｇ／ｍｌのポリ（ｒＩ）−ポリ（ｒＣ
）の添加は、ＰＫＲ活性化レベルを正確に鐘型活性化曲線へとシフトさせた。０
．１μｇ／ｍｌのポリ（ｒＩ）−ポリ（ｒＣ）処理ＳｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ
抽出物と、対応する未処理抽出物との比較は、全てではなくても大部分のｐｋｒ
が阻害されることを明らかにした。０、０．１及び１．０μｇ／ｌのポリ（ｒＩ
）−ポリ（ｒＣ）で感染後（ｐ．ｉ．）２４時間に、クローン１０６−４：５６
０のＰＫＲ自己リン酸化の量は増加した（それぞれ２４３、３７４及び４９２ホ
スホリメージャー単位）。これらの結果は、ＨＩＶ−Ｉ感染に起因するＴＡＲ
ＲＮＡの細胞内濃度によってＰＫＲは阻害されないことを示唆する。ＨＩＶ−１
ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ配列の存在は、ＳｕｐＴ１及びＮ２−２０Ｐ対照中
で観察されるＰＫＲ活性の阻害を防ぎ、又ＨＩＶ−１攻撃誘発で観察される抗ウ
イルス活性に寄与する。
【０１２３】 Ｃ）ＮＦ−κＢゲル電気泳動移動度変異検定 細胞核抽出物を、感染後（ｐ．ｉ．）７２時間において、記載されたようにし
て（シュライベル（Schreiber）ら、Nucleic Acids Res. １７：６４１９（１９
８９））ＨＩＶ−１感染及び模擬感染されたクローンから調製した。１０又は５
０ｎｇ／ｍｌの１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰ
Ａ）で３０分間処理したＳｕｐＴ１細胞を、陽性（ポジティブ）対照として使用
した。ＮＦ−κＢ結合部位（配列番号４（SEQ ID NO:4））に対応する相補的、 合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし、又Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを
利用して［γ32Ｐ］ＡＴＰで末端標識化（end-label）した。プローブの比活性 は、１．６×１０6ｄｐｍ／μｇと計算された。ゲル電気泳動移動度変位検定（ ＧＥＭＳＡ）を、５μｇの細胞核抽出物を利用して、記載されたようにして行っ
た（バチェレリ（Bachelerie）ら、Nature ３５０：７０９−１２（１９９１） ）。ＮＦ−κＢの、そのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列に対する特異性は、５０
倍モラーまで超過した６５−マーポリ（Ａ）アニールされたオリゴヌクレオチド
のインキュベーションによって実証し、又４０倍モラー超過したラジオイナート
（radioinert）の存在下ににおける競合試験を通して、［32Ｐ］標識化プローブ
とのインキュベーション前２０分において、アニーリングされたκＢオリゴヌク
レオチドを加えた。
て（シュライベル（Schreiber）ら、Nucleic Acids Res. １７：６４１９（１９
８９））ＨＩＶ−１感染及び模擬感染されたクローンから調製した。１０又は５
０ｎｇ／ｍｌの１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰ
Ａ）で３０分間処理したＳｕｐＴ１細胞を、陽性（ポジティブ）対照として使用
した。ＮＦ−κＢ結合部位（配列番号４（SEQ ID NO:4））に対応する相補的、 合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし、又Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを
利用して［γ32Ｐ］ＡＴＰで末端標識化（end-label）した。プローブの比活性 は、１．６×１０6ｄｐｍ／μｇと計算された。ゲル電気泳動移動度変位検定（ ＧＥＭＳＡ）を、５μｇの細胞核抽出物を利用して、記載されたようにして行っ
た（バチェレリ（Bachelerie）ら、Nature ３５０：７０９−１２（１９９１） ）。ＮＦ−κＢの、そのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列に対する特異性は、５０
倍モラーまで超過した６５−マーポリ（Ａ）アニールされたオリゴヌクレオチド
のインキュベーションによって実証し、又４０倍モラー超過したラジオイナート
（radioinert）の存在下ににおける競合試験を通して、［32Ｐ］標識化プローブ
とのインキュベーション前２０分において、アニーリングされたκＢオリゴヌク
レオチドを加えた。
【０１２４】 ＰＫＲがＩκ−Ｂαをリン酸化する能力は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃ
ＤＮＡ形質導入クローンからの細胞核抽出物中のＮＦ−κＢ結合レベルの試験に
よって調べた。Ｉκ−ＢαはＮＦ−κＢと複合し、その転写エンハンサーの性質
を抑制するように働く細胞質蛋白質である。リン酸化によって、Ｉκ−Ｂαは細
胞核内にトランスロケーションするＮＦ−κＢ、及びＩκ−Ｂα、ＮＦ−κＢ、
ＩＮＦ−β、サイトカイン、イムノモジュレータ、及びウイルス遺伝子などのκ
Ｂ結合部位を含むトランス作用プロモーター要素を解放する（ツェン（Tzen）ら
、Ex. Cell Res. ２１１：１２−１６（１９９４））。ＳｕｐＴ１細胞のＮＦ−
κＢアクチベータＴＰＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）での処理は、ｐ５０：ｐ６５及びｐ
５０：ｐ５０ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性の、それぞれ７２％及び７９％刺激を
もたらした。ＧＥＭＳＡ検定の特異性は、４０倍及び８０倍超過のラジオイナー
ト（放射不活性）オリゴヌクレオチドと結合する、放射性κＢオリゴヌクレオチ
ドに対する競合、及び５倍〜５０倍モラー超過のラジオイナート、無関係ＤＮＡ
競合の存在下での結合排除不可能性によって実証された。ｐ５０：ｐ５０及びｐ
５０：ｐ６５ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性は、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢでの感染の
後に、１０５−１０及び１０６−４形質導入クローン中で有意な調整されなかっ
た（図６）。これらのデータは、ＰＫＲが、ＳｕｐＴＩ細胞内のＩＦＮ−βレベ
ルを増加させるこの選択的経路を介しては働かず、又ＰＫＲ活性化によって間接
的に刺激されるＨＩＶ−１ ＬＴＲからの転写開始でもないことを示唆する。Ｐ
ＫＲに無関係な機構による感染の非存在下にて観察されたＮＦ−κＢの構造的な
活性は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ内に位置する複数のＮＦ−κＢ結合部位との相互作
用を介して、この細胞系列内でＨＩＶ−１が有効に複製する能力に寄与しうる（
ナベル（Nabel）ら、Nature（ロンドン）３２６：７１１−７１３（１９８７） ）。
ＤＮＡ形質導入クローンからの細胞核抽出物中のＮＦ−κＢ結合レベルの試験に
よって調べた。Ｉκ−ＢαはＮＦ−κＢと複合し、その転写エンハンサーの性質
を抑制するように働く細胞質蛋白質である。リン酸化によって、Ｉκ−Ｂαは細
胞核内にトランスロケーションするＮＦ−κＢ、及びＩκ−Ｂα、ＮＦ−κＢ、
ＩＮＦ−β、サイトカイン、イムノモジュレータ、及びウイルス遺伝子などのκ
Ｂ結合部位を含むトランス作用プロモーター要素を解放する（ツェン（Tzen）ら
、Ex. Cell Res. ２１１：１２−１６（１９９４））。ＳｕｐＴ１細胞のＮＦ−
κＢアクチベータＴＰＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）での処理は、ｐ５０：ｐ６５及びｐ
５０：ｐ５０ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性の、それぞれ７２％及び７９％刺激を
もたらした。ＧＥＭＳＡ検定の特異性は、４０倍及び８０倍超過のラジオイナー
ト（放射不活性）オリゴヌクレオチドと結合する、放射性κＢオリゴヌクレオチ
ドに対する競合、及び５倍〜５０倍モラー超過のラジオイナート、無関係ＤＮＡ
競合の存在下での結合排除不可能性によって実証された。ｐ５０：ｐ５０及びｐ
５０：ｐ６５ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性は、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢでの感染の
後に、１０５−１０及び１０６−４形質導入クローン中で有意な調整されなかっ
た（図６）。これらのデータは、ＰＫＲが、ＳｕｐＴＩ細胞内のＩＦＮ−βレベ
ルを増加させるこの選択的経路を介しては働かず、又ＰＫＲ活性化によって間接
的に刺激されるＨＩＶ−１ ＬＴＲからの転写開始でもないことを示唆する。Ｐ
ＫＲに無関係な機構による感染の非存在下にて観察されたＮＦ−κＢの構造的な
活性は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ内に位置する複数のＮＦ−κＢ結合部位との相互作
用を介して、この細胞系列内でＨＩＶ−１が有効に複製する能力に寄与しうる（
ナベル（Nabel）ら、Nature（ロンドン）３２６：７１１−７１３（１９８７） ）。
【０１２５】 例７ ＡＺＴで処理されたＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローン
内でのＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ感染の阻害 細胞内免疫処置アプローチは伝統的な抗ウイルス薬剤化学療法アプローチと組
み合わせて使用される。
内でのＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ感染の阻害 細胞内免疫処置アプローチは伝統的な抗ウイルス薬剤化学療法アプローチと組
み合わせて使用される。
【０１２６】 対照細胞及び形質導入されたクローンを、逆転酵素阻害剤である３′−アジド
−３′デオキシチミジン（ＡＺＴ）でＨＩＶ−１感染前に処理し、ＨＩＶ−１
ＬＴＲ発動ＰＫＲ ｃＤＮＡ配列とＡＺＴとの間のコンビナトリーｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ効果を調べた。ＡＺＴを、最終濃度０、５、１０、５０、１００又は１００
０ｎＭにて、感染の１時間前に加えた。
−３′デオキシチミジン（ＡＺＴ）でＨＩＶ−１感染前に処理し、ＨＩＶ−１
ＬＴＲ発動ＰＫＲ ｃＤＮＡ配列とＡＺＴとの間のコンビナトリーｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ効果を調べた。ＡＺＴを、最終濃度０、５、１０、５０、１００又は１００
０ｎＭにて、感染の１時間前に加えた。
【０１２７】 対照Ｎ２−２０Ｐ細胞（■）では、計算値３１３．３ｎＭのＡＺＴにてシンシ
チウム形成の９０％阻害が達成できた（図７）。これとは対照的に、１０５−１
０：２７（▲）及び１０５−１０：２３９（×）細胞系列では、８２％減少した
計算値５５．８ｎＭのＡＺＴにてシンシチウム形成の９０％阻害が達成された。
１０６−５８２（●）細胞系列は、９０％シンシチウム阻害のために計算値２３
．３ｎＭのＡＺＴ（９３％の減少）を必要とした。これとは対照的に、１０６−
４：５６０（▼）細胞系列のシンシチウム形成は、ＡＺＴの非存在下にて９３％
減少され、ＡＺＴの追加により更に増強されることはなかった。
チウム形成の９０％阻害が達成できた（図７）。これとは対照的に、１０５−１
０：２７（▲）及び１０５−１０：２３９（×）細胞系列では、８２％減少した
計算値５５．８ｎＭのＡＺＴにてシンシチウム形成の９０％阻害が達成された。
１０６−５８２（●）細胞系列は、９０％シンシチウム阻害のために計算値２３
．３ｎＭのＡＺＴ（９３％の減少）を必要とした。これとは対照的に、１０６−
４：５６０（▼）細胞系列のシンシチウム形成は、ＡＺＴの非存在下にて９３％
減少され、ＡＺＴの追加により更に増強されることはなかった。
【０１２８】 例８ ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ クローンの、潜在的感染細胞内ＨＩ
Ｖ−１のリアクチベーション（再活性化）阻害能 ＨＩＶプロウイルスの組込まれたコピーを含む細胞系列を使用して、ＨＩＶ−
１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡクローンが慢性的に感染した系におけるウイルス
再活性化を阻害する能力を明らかにした。
Ｖ−１のリアクチベーション（再活性化）阻害能 ＨＩＶプロウイルスの組込まれたコピーを含む細胞系列を使用して、ＨＩＶ−
１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡクローンが慢性的に感染した系におけるウイルス
再活性化を阻害する能力を明らかにした。
【０１２９】 ＡＣＨ−２は、ゲノム中にＨＩＶプロウイルスのコピーを１つ含むリンパ球細
胞系列である（ポメランツ（Pomerantz）ら、Cell ６１：１２７１−７６（１９
９０））。Ｕ１は、ゲノム中に組込まれたＨＩＶプロウイルスのコピーを２つ含
む前単核細胞系列である（フォルクス（Folks）ら、Science ２３８：８００− ０２（１９８７））。
胞系列である（ポメランツ（Pomerantz）ら、Cell ６１：１２７１−７６（１９
９０））。Ｕ１は、ゲノム中に組込まれたＨＩＶプロウイルスのコピーを２つ含
む前単核細胞系列である（フォルクス（Folks）ら、Science ２３８：８００− ０２（１９８７））。
【０１３０】 慢性感染細胞系列、ＡＣＨ−２及びＵ１を、例４に記述したようなレトロウイ
ルスプロデューサ細胞系列のレトロウイルス性上清を用いて、ＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒ−ＰＫＲ ｃＤＮＡで形質導入した。ＨＩＶ発現は、腫瘍壊死因子アルファ（
ＴＮＦ−α、５０ｎｇ／ｍｌ）での処理によって誘導した（フォルクス（Folks ）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：２３６５−６８（１９８９））。細 胞は培養で維持した。ＨＩＶ―１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入Ｕ１及び
ＡＣＨ−２は、ＨＩＶ−１誘導性シンシチウム形成をそれぞれ９９％及び９９％
阻害した。コン（Kon）ら（J. Biol. Chem. ２７１：１９９８３−９０（１９９
６））によって記述されたウエスタン分析によって、形質導入されたＵ１細胞内
での、形質導入後９６時間に亙るＰＫＲ発現の増加が明かとなった。
ルスプロデューサ細胞系列のレトロウイルス性上清を用いて、ＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒ−ＰＫＲ ｃＤＮＡで形質導入した。ＨＩＶ発現は、腫瘍壊死因子アルファ（
ＴＮＦ−α、５０ｎｇ／ｍｌ）での処理によって誘導した（フォルクス（Folks ）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：２３６５−６８（１９８９））。細 胞は培養で維持した。ＨＩＶ―１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入Ｕ１及び
ＡＣＨ−２は、ＨＩＶ−１誘導性シンシチウム形成をそれぞれ９９％及び９９％
阻害した。コン（Kon）ら（J. Biol. Chem. ２７１：１９９８３−９０（１９９
６））によって記述されたウエスタン分析によって、形質導入されたＵ１細胞内
での、形質導入後９６時間に亙るＰＫＲ発現の増加が明かとなった。
【０１３１】 例９ ＡＩＤＳの動物モデル ヒト抹消血単球細胞（ＰＢＭＣ）で再構成されたＳＤＩＤマウスをモデル系と
して用い（マークハム（Markham）ら、J. Virol. ７０（１０）：６９４７−５ ４（１９９６年１０月）；リッツァ（Rizza）ら、J. Virol. ７０：７９５８− ６４（１９９６年１１月））、特許請求される方法及び組成物のｉｎ ｖｉｖｏ
での効力を実証し、又ヒト対象に使用する前に処置手順を最適化した。
して用い（マークハム（Markham）ら、J. Virol. ７０（１０）：６９４７−５ ４（１９９６年１０月）；リッツァ（Rizza）ら、J. Virol. ７０：７９５８− ６４（１９９６年１１月））、特許請求される方法及び組成物のｉｎ ｖｉｖｏ
での効力を実証し、又ヒト対象に使用する前に処置手順を最適化した。
【０１３２】 ＰＢＭＣは、健康なＨＩＶ血清反応陰性のドナーから血液交換療法により得、
フィコール―パークエ密度勾配遠心法により精製した。
フィコール―パークエ密度勾配遠心法により精製した。
【０１３３】 生後４〜６週間のＣＢ１７ ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス（ＳＣＩＤマウス）を
、全ての食物、水、及び敷きわら（bedding）を使用前に加圧蒸気滅菌した、特 定の無菌状態に維持した。
、全ての食物、水、及び敷きわら（bedding）を使用前に加圧蒸気滅菌した、特 定の無菌状態に維持した。
【０１３４】 ＰＢＭＣは、例４に記述したようにして、組替えウイルスプロデューサー系列
との共生培養によって、或いはレトロウイルス上清又はより濃縮されたレトロウ
イルス調製物での直接感染によって形質導入する。細胞は、例３Ａにあるように
、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性に関して選択する。ＳＣＩＤマウスは、２×１
０7の形質導入ＰＭＢＣの腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により再構成する。
との共生培養によって、或いはレトロウイルス上清又はより濃縮されたレトロウ
イルス調製物での直接感染によって形質導入する。細胞は、例３Ａにあるように
、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性に関して選択する。ＳＣＩＤマウスは、２×１
０7の形質導入ＰＭＢＣの腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により再構成する。
【０１３５】 再構成（ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤ）マウスを、再構成後２時間、８日、又は２
週間においてＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株で感染させる。感染のために、１０5〜１ ０2の組織培養の連続１０倍希釈感染性用量のＨＩＶ−１を、再構成マウスにｉ ．ｐ．（腹腔内）注入する。ウイルス特異性ＰＣＲ、ｐ２４検定、及び腹膜潅流
法により得られた細胞を用いた共生培養検定によって、ＨＩＶ感染を期間中監視
（モニタ）した。
週間においてＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株で感染させる。感染のために、１０5〜１ ０2の組織培養の連続１０倍希釈感染性用量のＨＩＶ−１を、再構成マウスにｉ ．ｐ．（腹腔内）注入する。ウイルス特異性ＰＣＲ、ｐ２４検定、及び腹膜潅流
法により得られた細胞を用いた共生培養検定によって、ＨＩＶ感染を期間中監視
（モニタ）した。
【０１３６】 例１０ ２−５ＯＡＳ遺伝子を用いた細胞内免疫処置 先の研究は、２−５ＡのレベルがＨＩＶ−１ビリオン生産と相互に反比例し、
感染のより後の段階中に、２−５Ａレベルが低下するとＨＩＶ−１ビリオン生産
が増加することを実証した。４０ｋＤａ２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡの発現を、ＨＩ
Ｖ−１ ＬＴＲの制御下に置くプラスミド構造を構成し、レトロウイルス送達系
を介してＴリンパ球細胞へ導入した。その後、細胞をＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株で
攻撃誘発した。
感染のより後の段階中に、２−５Ａレベルが低下するとＨＩＶ−１ビリオン生産
が増加することを実証した。４０ｋＤａ２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡの発現を、ＨＩ
Ｖ−１ ＬＴＲの制御下に置くプラスミド構造を構成し、レトロウイルス送達系
を介してＴリンパ球細胞へ導入した。その後、細胞をＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ株で
攻撃誘発した。
【０１３７】 ｐＭＥＡ００２プラスミドを、その上でｐＭＥＡ０００３を構築するバックボ
ーン（基幹）ベクターとして使用し、ここで、ＰＫＲをエンコードするｃＤＮＡ
を除去し、２−５ＯＡＳをエンコードするｃＤＮＡで置換した。ｐＭＥＡプラス
ミドはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、デオキシヌクレオシド３リン酸塩の存
在下でクレノウ（Klenow）ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端
とした。続くＥｃｏＲ１での消化により、ＰＫＲ ｃＤＮＡを３１２７ｂｐ平滑
末端ＥｃｏＲＩｐＳＰ７２−ＨＩＶ−１ ＬＴＲ断片から解放し、この断片をＤ
ＥＡＥセルロースを用いて精製した。２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡを、ミリグラム量
の２−５ＯＡＳの発現のために用いられた（コン（Kon）及びスハドルニク（Suh
adolnik）、J. Biol. Chem. ２７１：１９９８３−９０（１９９６））ｐＮＫ０
４から得た。ｐＮＫ０４をＮｄｅＩで消化し、クレノウ断片と共に満たし、又Ｅ
ｃｏＲ１で消化して２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡの全てを含む１２４２ｂｐ断片を解
放した。この断片をＤＥＡＥ−セルロースを用いて精製した。
ーン（基幹）ベクターとして使用し、ここで、ＰＫＲをエンコードするｃＤＮＡ
を除去し、２−５ＯＡＳをエンコードするｃＤＮＡで置換した。ｐＭＥＡプラス
ミドはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、デオキシヌクレオシド３リン酸塩の存
在下でクレノウ（Klenow）ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端
とした。続くＥｃｏＲ１での消化により、ＰＫＲ ｃＤＮＡを３１２７ｂｐ平滑
末端ＥｃｏＲＩｐＳＰ７２−ＨＩＶ−１ ＬＴＲ断片から解放し、この断片をＤ
ＥＡＥセルロースを用いて精製した。２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡを、ミリグラム量
の２−５ＯＡＳの発現のために用いられた（コン（Kon）及びスハドルニク（Suh
adolnik）、J. Biol. Chem. ２７１：１９９８３−９０（１９９６））ｐＮＫ０
４から得た。ｐＮＫ０４をＮｄｅＩで消化し、クレノウ断片と共に満たし、又Ｅ
ｃｏＲ１で消化して２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡの全てを含む１２４２ｂｐ断片を解
放した。この断片をＤＥＡＥ−セルロースを用いて精製した。
【０１３８】 精製されたｃＤＮＡ及びベクター断片を共にライゲーションし（ＥｃｏＲ１結
合末端と平滑末端を介して）、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が再生された４３７４ｂ
ｐ断片を生成した。ライゲーション混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α細胞
を形質転換した。２０コロニーからのＤＮＡを、プラスミドＤＮＡ煮沸ミニプレ
プ(miniprep）法を用いて単離した。プラスミド構造を、制限分析及びサンガー （Sanger）ジデオキシヌクレオチドシーケンシングによって、Ｔ７、ＨＩＶ−１
ＬＴＲ、及びＳＰ６プライマーを用いて分析した。ｐＭＥＡ１０３ベクターを
作製するために、ｐＭＥＡ００３をＨｐａＩ及びＣｌａＩで消化し、又ｐＭＥＡ
１０１の構成に利用されるポリアデニル化配列を含む合成オリゴヌクレオチドを
、２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡ配列の下流に挿入した。ＸｈｏＩ−ＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒ−２−５０ＡＳ−ポリ（Ａ）−ＸｈｏＩ配列を切り出し、精製し、又前進及び
逆進方向にてｐＮ２のＸｈｏＩ部位に挿入し、それぞれｐＭＥＡ１０９及びｐＭ
ＥＡ１１０を作製した。
合末端と平滑末端を介して）、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が再生された４３７４ｂ
ｐ断片を生成した。ライゲーション混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α細胞
を形質転換した。２０コロニーからのＤＮＡを、プラスミドＤＮＡ煮沸ミニプレ
プ(miniprep）法を用いて単離した。プラスミド構造を、制限分析及びサンガー （Sanger）ジデオキシヌクレオチドシーケンシングによって、Ｔ７、ＨＩＶ−１
ＬＴＲ、及びＳＰ６プライマーを用いて分析した。ｐＭＥＡ１０３ベクターを
作製するために、ｐＭＥＡ００３をＨｐａＩ及びＣｌａＩで消化し、又ｐＭＥＡ
１０１の構成に利用されるポリアデニル化配列を含む合成オリゴヌクレオチドを
、２−５ＯＡＳ ｃＤＮＡ配列の下流に挿入した。ＸｈｏＩ−ＨＩＶ−１ ＬＴ
Ｒ−２−５０ＡＳ−ポリ（Ａ）−ＸｈｏＩ配列を切り出し、精製し、又前進及び
逆進方向にてｐＮ２のＸｈｏＩ部位に挿入し、それぞれｐＭＥＡ１０９及びｐＭ
ＥＡ１１０を作製した。
【０１３９】 レトロウイルスプロデューサー細胞系列及び組換えウイルスを生成するために
、例３に記載される方法を用いて、ＨＩＶ ＬＴＲの制御下の２−５ＯＡＳをエ
ンコードするプラスミドを、レトロウイルスパッケージング細胞系列に転移した
。組換えレトロウイルスを、例４に記載されるようにしてＴリンパ球細胞に形質
導入し、形質導入された細胞を、例５に記載されるようにしてＨＩＶ−１ ＩＩ
ＩＢ株で攻撃誘発した。
、例３に記載される方法を用いて、ＨＩＶ ＬＴＲの制御下の２−５ＯＡＳをエ
ンコードするプラスミドを、レトロウイルスパッケージング細胞系列に転移した
。組換えレトロウイルスを、例４に記載されるようにしてＴリンパ球細胞に形質
導入し、形質導入された細胞を、例５に記載されるようにしてＨＩＶ−１ ＩＩ
ＩＢ株で攻撃誘発した。
【０１４０】 形質導入されたクローンの幾つかは、シンシチウムス記録により確認した際、
感染されたＴリンパ球対照と比較して７０％より大きいＨＩＶ−１ビリオン生産
の減少を示した。これらのクローンの幾つかを更なる特徴付けのために選択した
。１つのクローン、１０９−２０：５は、感染後（ｐ．ｉ．）９６時間を通し、
首尾一貫してシンシチウム形成並びに延長された２−５ＯＡＳの発現の９０％阻
害を示した。
感染されたＴリンパ球対照と比較して７０％より大きいＨＩＶ−１ビリオン生産
の減少を示した。これらのクローンの幾つかを更なる特徴付けのために選択した
。１つのクローン、１０９−２０：５は、感染後（ｐ．ｉ．）９６時間を通し、
首尾一貫してシンシチウム形成並びに延長された２−５ＯＡＳの発現の９０％阻
害を示した。
【０１４１】 これらの研究は、２−５ＯＡＳ遺伝子を単独又は他の化学療法作用物質と組み
合わせて用いた細胞内免疫処置が、ＨＩＶ感染の管理のための長期間処置の可能
性を有することを示す。
合わせて用いた細胞内免疫処置が、ＨＩＶ感染の管理のための長期間処置の可能
性を有することを示す。
【０１４２】 本明細書にて議論された全ての参考文献を参照により援用する。
【０１４３】 当業者は、目的を実行するために、又言及される結果及び利点を得るために本
発明は良く適応されると共にそれに固有のものであることを容易に理解されよう
。本発明は、その精神又は基本的な特性からかけ離れることなく他の特定の形態
にて実施できる。従って、本発明の範囲を示すためには、上述の詳細な説明より
も寧ろ添付の特許請求の範囲を参照されたい。
発明は良く適応されると共にそれに固有のものであることを容易に理解されよう
。本発明は、その精神又は基本的な特性からかけ離れることなく他の特定の形態
にて実施できる。従って、本発明の範囲を示すためには、上述の詳細な説明より
も寧ろ添付の特許請求の範囲を参照されたい。
【配列表】
【図１】 図１Ａ及び図１ＢはＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ構成物の構成及び
ゲノム全体を示す。図１Ａは、前進（ｐＭＥＡ１０５）及び逆進（ｐＭＥＡ１０
６）方向にて、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２レトロウイルス性ベクターにクローン化さ
れたＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ−ポリ（Ａ）配列を示す。図１Ｂは
、これらの構成のＧＰ＋ｅｎｖ Ａｍｌ２レトロウイルスプロデューサー細胞系列へのゲノム組込みを示す。ｐＮ
２（Ｎ２−２０）中のＸｂａＩ部位、ｐＭＥＡ１０５（１０５−１０）及びｐＭ
ＥＡ１０６（１０６−４）の位置、及び［３２Ｐ］−ネオプローブに対して相補
的な配列を含む断片のサイズが示される。ポリ（Ａ）配列は、アステリスク（＊
）３′からＰＫＲ ｃＤＮＡ配列までとして描写される。図１Ｃは、ＸｂａＩ消
化された、指示された細胞源からのゲノムＤＮＡのサザンプロットを示す。レー
ン１〜３：１０、１、及び０．１ｎｇのｐＭＥＡ１０６（２６８１）で補足され
たＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞；レーン４：Ｎ２−２０レトロウイルス生産細胞（
３２８３ｂｐ）、レーン５：Ｎ２−２０形質導入Ｇ４１８選択ＳｕｐＴ１細胞（
３２８３ｂｐ）；レーン６：１０６−４レトロウイルス生産細胞（２６８１ｂｐ
）；レーン７：１０６−４形質転換Ｇ４１８選択ＳｕｐＴＩ細胞（２６８１ｂｐ
）。矢印は、予想される３２８３及び２６８１ｂｐ断片の移動を描写する。ラム
ダＨｉｎｄＩＩＩ消化からの断片の移動を示す。
ゲノム全体を示す。図１Ａは、前進（ｐＭＥＡ１０５）及び逆進（ｐＭＥＡ１０
６）方向にて、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２レトロウイルス性ベクターにクローン化さ
れたＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ−ポリ（Ａ）配列を示す。図１Ｂは
、これらの構成のＧＰ＋ｅｎｖ Ａｍｌ２レトロウイルスプロデューサー細胞系列へのゲノム組込みを示す。ｐＮ
２（Ｎ２−２０）中のＸｂａＩ部位、ｐＭＥＡ１０５（１０５−１０）及びｐＭ
ＥＡ１０６（１０６−４）の位置、及び［３２Ｐ］−ネオプローブに対して相補
的な配列を含む断片のサイズが示される。ポリ（Ａ）配列は、アステリスク（＊
）３′からＰＫＲ ｃＤＮＡ配列までとして描写される。図１Ｃは、ＸｂａＩ消
化された、指示された細胞源からのゲノムＤＮＡのサザンプロットを示す。レー
ン１〜３：１０、１、及び０．１ｎｇのｐＭＥＡ１０６（２６８１）で補足され
たＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２細胞；レーン４：Ｎ２−２０レトロウイルス生産細胞（
３２８３ｂｐ）、レーン５：Ｎ２−２０形質導入Ｇ４１８選択ＳｕｐＴ１細胞（
３２８３ｂｐ）；レーン６：１０６−４レトロウイルス生産細胞（２６８１ｂｐ
）；レーン７：１０６−４形質転換Ｇ４１８選択ＳｕｐＴＩ細胞（２６８１ｂｐ
）。矢印は、予想される３２８３及び２６８１ｂｐ断片の移動を描写する。ラム
ダＨｉｎｄＩＩＩ消化からの断片の移動を示す。
【図２】 図２は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ形質導入ＳｕｐＴ１細胞のＨＩＶ−１
ＩＩＩＢでの攻撃誘発を示す。クローンを、０．１のｍ．ｏ．ｉ．にてＨＩＶ−
１ ＩＩＩＢで感染させ、シンシチウムを多重希釈において４重に記録した。１
回のシンシチウムのスコアは、例５に記載されるようにして計算した。連続希釈
、及びＳｕｐＴＩ指示（インジケーター）細胞の添加の前にＨＩＶ−１を培地単
独とインキュベーションした対照は、感染の９６時間後にシンシチウムを与えな
かった。黒及び白抜きバーは、それぞれ０及び１０ｍＭの２−アミノプリンを表
す。結果は、２回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．（標準誤差）を代表するもの
である。
ＩＩＩＢでの攻撃誘発を示す。クローンを、０．１のｍ．ｏ．ｉ．にてＨＩＶ−
１ ＩＩＩＢで感染させ、シンシチウムを多重希釈において４重に記録した。１
回のシンシチウムのスコアは、例５に記載されるようにして計算した。連続希釈
、及びＳｕｐＴＩ指示（インジケーター）細胞の添加の前にＨＩＶ−１を培地単
独とインキュベーションした対照は、感染の９６時間後にシンシチウムを与えな
かった。黒及び白抜きバーは、それぞれ０及び１０ｍＭの２−アミノプリンを表
す。結果は、２回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．（標準誤差）を代表するもの
である。
【図３】 図３Ａ〜３Ｆは、ＨＩＶ−１感染で発生したシンシチウムの写真（倍率×１０
０）を示す。形質導入され、選択されたクローン（１×１０6細胞）を、ＨＩＶ −１で２時間、０．１のｍ．ｏ．ｉ．にて感染させた。細胞を洗浄し、又５×１
０5細胞／ｍｌにて、熱失活ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０中で再培養した 。写真は、感染後（ｐ．ｉ．）９６時間において、オリンパス（Olympus）イン バーテッド研究用顕微鏡で撮影された。図３Ａ＝ＳｕｐＴ１；図３Ｂ＝Ｎ２−２
０Ｐ；図３Ｃ＝１０５−１０：２７；図３Ｄ＝１０５−１０：２３９；図３Ｅ＝
１０６−４：５６０；図３Ｆ＝１０６−４：５８２。
０）を示す。形質導入され、選択されたクローン（１×１０6細胞）を、ＨＩＶ −１で２時間、０．１のｍ．ｏ．ｉ．にて感染させた。細胞を洗浄し、又５×１
０5細胞／ｍｌにて、熱失活ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０中で再培養した 。写真は、感染後（ｐ．ｉ．）９６時間において、オリンパス（Olympus）イン バーテッド研究用顕微鏡で撮影された。図３Ａ＝ＳｕｐＴ１；図３Ｂ＝Ｎ２−２
０Ｐ；図３Ｃ＝１０５−１０：２７；図３Ｄ＝１０５−１０：２３９；図３Ｅ＝
１０６−４：５６０；図３Ｆ＝１０６−４：５８２。
【図４】 図４Ａ〜４Ｆは、ＨＩＶ−Ｉ ＩＩＩＢ感染の間の、ＰＫＲ発現のウエスタン
ブロット分析を示す。ＰＫＲの蛋白質レベルは、ＨＩＶ−１感染後に２４時間間
隔でウエスタンブロットによってモニターした。横に沿わせた牛（bovine）血清
アルブミン（６５ｋＤａ。レインボー分子量マーカーを含む。アメーシャム（Am
ersham））の移動によって、ＰＫＲは６８ｋＤａであると決定された。「Ｕ」は
未感染細胞を示す。結果は２回の独立した実験を代表するものである。図４Ａ＝
ＳｕｐＴ１；図４Ｂ＝Ｎ２−２０Ｐ；図４Ｃ＝１０５−１０：２７；図４Ｄ＝１
０５−１０：２３９；図４Ｅ＝１０６−４：５６０；図４Ｆ＝１０６−４：５８
２。
ブロット分析を示す。ＰＫＲの蛋白質レベルは、ＨＩＶ−１感染後に２４時間間
隔でウエスタンブロットによってモニターした。横に沿わせた牛（bovine）血清
アルブミン（６５ｋＤａ。レインボー分子量マーカーを含む。アメーシャム（Am
ersham））の移動によって、ＰＫＲは６８ｋＤａであると決定された。「Ｕ」は
未感染細胞を示す。結果は２回の独立した実験を代表するものである。図４Ａ＝
ＳｕｐＴ１；図４Ｂ＝Ｎ２−２０Ｐ；図４Ｃ＝１０５−１０：２７；図４Ｄ＝１
０５−１０：２３９；図４Ｅ＝１０６−４：５６０；図４Ｆ＝１０６−４：５８
２。
【図５】 図５Ａ及び図５Ｂは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クロー
ン中における、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ感染を通してのＰＫＲ自己リン酸化レベル
を示す。細胞は、ＨＩＶ−Ｉ ＩＩＩＢでの感染の後、指示された時間において
収集した。蛋白質抽出及び免疫沈降の後に、自己リン酸化検定を行った。抽出物
は、酵素検定の間中に０（図５Ａ）又は０．１μｇ／ｍｌ（図５Ｂ）のポリ（ｒ
Ｉ）−ポリ（ｒＣ）で補足された。結果は、Ｆｕｊｉ ＢＡＳ２０００ホスホリ
メージャー（リン光撮影装置）での分析によって定量されたものである。各試料
に関して、各バーは左側から右側へ、それぞれ感染後０、２４、４８、７２及び
９６時間を示す。
ン中における、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ感染を通してのＰＫＲ自己リン酸化レベル
を示す。細胞は、ＨＩＶ−Ｉ ＩＩＩＢでの感染の後、指示された時間において
収集した。蛋白質抽出及び免疫沈降の後に、自己リン酸化検定を行った。抽出物
は、酵素検定の間中に０（図５Ａ）又は０．１μｇ／ｍｌ（図５Ｂ）のポリ（ｒ
Ｉ）−ポリ（ｒＣ）で補足された。結果は、Ｆｕｊｉ ＢＡＳ２０００ホスホリ
メージャー（リン光撮影装置）での分析によって定量されたものである。各試料
に関して、各バーは左側から右側へ、それぞれ感染後０、２４、４８、７２及び
９６時間を示す。
【図６】 図６は、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢで感染されたＨＩＶ−１ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃ
ＤＮＡ形質導入クローン中でのＮＦ−κＢ活性化を示す。ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ
感染（＋）及び未感染（−）ＳｕｐＴ１細胞からの細胞核抽出物を、感染の７２
時間後に調製した。５μｇの細胞核抽出物蛋白質を、０．０３７５ｐｍｏｌ［γ
−32Ｐ］ＡＴＰ末端標識化κＢオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベー
ションし、非変性４％ＴＢＥアクリルアミドゲル上で分離した。
ＤＮＡ形質導入クローン中でのＮＦ−κＢ活性化を示す。ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ
感染（＋）及び未感染（−）ＳｕｐＴ１細胞からの細胞核抽出物を、感染の７２
時間後に調製した。５μｇの細胞核抽出物蛋白質を、０．０３７５ｐｍｏｌ［γ
−32Ｐ］ＡＴＰ末端標識化κＢオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベー
ションし、非変性４％ＴＢＥアクリルアミドゲル上で分離した。
【図７】 図７は、ＨＩＶ−Ｉ ＬＴＲ−ＰＫＲ ｃＤＮＡ形質導入クローンの、３′−
アジド−３′−デオキシチミジンでの処理を示す。各クローン（２×１０5細胞 ）を、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢでの感染の１時間前に、指示された濃度のＡＺＴと
共にインキュベーションした。感染後（ｐ，ｉ．）４８時間において細胞を連続
希釈し、２×１０5のＳｕｐＴ１指示（インジケーター）細胞を各ウェルに添加 した。シンシチウムスコアを感染後（ｐ．ｉ．）９６時間において計算した。◆
＝ＳｕｐＴ１、■＝Ｎ２−２０Ｐ、▲＝１０５−１０：２７、×＝１０５−１０
：２３９、▼＝１０６−４：５６０、●＝１０６−４：５８２。結果は、３回の
独立した実験の平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を代表するものである。
アジド−３′−デオキシチミジンでの処理を示す。各クローン（２×１０5細胞 ）を、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢでの感染の１時間前に、指示された濃度のＡＺＴと
共にインキュベーションした。感染後（ｐ，ｉ．）４８時間において細胞を連続
希釈し、２×１０5のＳｕｐＴ１指示（インジケーター）細胞を各ウェルに添加 した。シンシチウムスコアを感染後（ｐ．ｉ．）９６時間において計算した。◆
＝ＳｕｐＴ１、■＝Ｎ２−２０Ｐ、▲＝１０５−１０：２７、×＝１０５−１０
：２３９、▼＝１０６−４：５６０、●＝１０６−４：５８２。結果は、３回の
独立した実験の平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を代表するものである。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月２３日（２００１．３．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４３】 当業者は、目的を実行するために、又言及される結果及び利点を得るために本
発明は良く適応されると共にそれに固有のものであることを容易に理解されよう
。本発明は、その精神又は基本的な特性からかけ離れることなく他の特定の形態
にて実施できる。従って、本発明の範囲を示すためには、上述の詳細な説明より
も寧ろ添付の特許請求の範囲を参照されたい。
発明は良く適応されると共にそれに固有のものであることを容易に理解されよう
。本発明は、その精神又は基本的な特性からかけ離れることなく他の特定の形態
にて実施できる。従って、本発明の範囲を示すためには、上述の詳細な説明より
も寧ろ添付の特許請求の範囲を参照されたい。
【配列表】 SEQUENCE LISTING
<110> Suhadolnik, Robert J.
Adelson, Martin E.
Iacono, Kathryn T.
Temple University - Of The Commonwealth System of
Higher Education
<120> Inhibition of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1)
Replication
<130> 6056-240 PC
<140>
<141>
<150> 60/061,981
<151> 1997-10-16
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:HIV-1 LTR
primer
<400> 1
ctggctagct agggaac 17
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: contains
upstream polyadenylation signal, 23 nucleotide
spacer region, downstream polyadenylation beta
signal and XhoI site
<400> 2
cgatagatct aataaaagac cgcgggccct taaggccttg tgtgttggtt ttttgtgtgc 60
tcgag 65
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:complemtary to
SEQ ID NO: 2
<400> 3
ctcgagcaca caaaaaacca acacacaagg ccttaagggc ccgcggtctt ttattagatc 60
tat 63
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: sense probe
oligonucleotide corresponding to NF-kappa beta
binding site
<400> 4
acaagggact ttccgctggg gactttccag gga 33
<110> Suhadolnik, Robert J.
Adelson, Martin E.
Iacono, Kathryn T.
Temple University - Of The Commonwealth System of
Higher Education
<120> Inhibition of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1)
Replication
<130> 6056-240 PC
<140>
<141>
<150> 60/061,981
<151> 1997-10-16
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:HIV-1 LTR
primer
<400> 1
ctggctagct agggaac 17
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: contains
upstream polyadenylation signal, 23 nucleotide
spacer region, downstream polyadenylation beta
signal and XhoI site
<400> 2
cgatagatct aataaaagac cgcgggccct taaggccttg tgtgttggtt ttttgtgtgc 60
tcgag 65
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:complemtary to
SEQ ID NO: 2
<400> 3
ctcgagcaca caaaaaacca acacacaagg ccttaagggc ccgcggtctt ttattagatc 60
tat 63
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: sense probe
oligonucleotide corresponding to NF-kappa beta
binding site
<400> 4
acaagggact ttccgctggg gactttccag gga 33
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 37/04 37/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ａ６１Ｋ 35/76 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 スハドルニク，ロバート ジェイ アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19001 ロズリン ススクハンナ アベニ ュー 2727 (72)発明者 アデルソン，マーチン イー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08817 エディソン カレッジ ドライブ 45 (72)発明者 ヤーコノ，キャスリン ティー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 フィ ラデルフィア ミルブルク ロード 11740 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA21 BA80 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 GA11 GA18 GA19 HA01 HA12 4B065 AA01X AA57X AA90X AA97Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 AA17 AA20 CA53 NA14 ZB332 ZC552 4C086 AA01 AA02 EA17 MA02 MA04 NA05 ZB33 ZC55 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZB33 ZC55
Claims (50)
- 【請求項１】 （ａ）ＰＫＲコード領域、及び （ｂ）調節要素、 を含み、前記ＰＫＲコード領域と調節要素とは機能的に結合され、ＰＫＲ発現が
ＨＩＶトランス作用因子の存在下で活性化されることを特徴とする組換え核酸。 - 【請求項２】 前記調節要素はＨＩＶ ＬＴＲの全て又は部分を含むことを
特徴とする請求項１の組換え核酸。 - 【請求項３】 前記ＨＩＶトランス作用因子はＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質である
請求項１の組換え核酸。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかの項に記載の核酸を含むことを特徴
とするベクター。 - 【請求項５】 前記ベクターはウイルス性ベクターである請求項４のベクタ
ー。 - 【請求項６】 前記ベクターはレトロウイルス性ベクターである請求項５の
ベクター。 - 【請求項７】 前記ベクターはＭ−ＭｕＬＶ配列を含むことを特徴とする請
求項６のレトロウイルス性ベクター。 - 【請求項８】 前記ベクターは基本的にｐＭＥＡ１０５又はｐＭＥＡ１０６
の特徴を備えていることを特徴とする請求項７のレトロウイルス性ベクター。 - 【請求項９】 請求項１の核酸を含む細胞。
- 【請求項１０】 前記細胞は原核性細胞である請求項９の細胞。
- 【請求項１１】 前記細胞は真核性細胞である請求項９の細胞。
- 【請求項１２】 前記細胞は幹細胞である請求項１１の細胞。
- 【請求項１３】 前記細胞はＣＤ３４発現細胞である請求項１２の細胞。
- 【請求項１４】 前記細胞はＣＤ４発現細胞である請求項１１の細胞。
- 【請求項１５】 前記細胞はレトロウイルスパッケージング細胞である請求
項９の細胞。 - 【請求項１６】 前記細胞はレトロウイルスプロデューサー細胞である請求
項９の細胞。 - 【請求項１７】 前記核酸は安定に細胞ゲノムに組込まれ、ＰＫＲ発現がＨ
ＩＶ感染によって活性化される請求項１１〜１４のいずれかの項に記載の細胞。 - 【請求項１８】 （ａ）２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼコー
ド領域、及び （ｂ）調節要素、 を含み、前記２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼコード領域と調節要
素とは機能的に結合され、２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼ発現は
ＨＩＶトランス作用因子の存在下で活性化されることを特徴とするウイルス性ベ
クター。 - 【請求項１９】 前記調節要素はＨＩＶ ＬＴＲの全て又は部分を含むこと
を特徴とする請求項１８のウイルス性ベクター。 - 【請求項２０】 前記ＨＩＶトランス作用因子はＨＩＶ Ｔａｔ蛋白質であ
る請求項１８のウイルス性ベクター。 - 【請求項２１】 前記ベクターはレトロウイルス性ベクターである請求項１
８〜２０のいずれかの項に記載のウイルス性ベクター。 - 【請求項２２】 前記ベクターはＭ−ＭｕＬＶ配列を含むことを特徴とする
請求項２１のレトロウイルス性ベクター。 - 【請求項２３】 前記ベクターは基本的にｐＭＥＡ１０９又はｐＭＥＡ１１
０の特徴を備えていることを特徴とする請求項２２のレトロウイルス性ベクター
。 - 【請求項２４】 請求項１８のウイルス性ベクターで形質導入又は形質転換
されている細胞。 - 【請求項２５】 前記細胞は原核性細胞である請求項２４の細胞。
- 【請求項２６】 前記細胞は真核性細胞である請求項２４の細胞。
- 【請求項２７】 前記細胞は幹細胞である請求項２６の細胞。
- 【請求項２８】 前記細胞はＣＤ３４発現細胞である請求項２７の細胞。
- 【請求項２９】 前記細胞はＣＤ４発現細胞である請求項２６の細胞。
- 【請求項３０】 前記細胞はレトロウイルスパッケージング細胞である請求
項２４の細胞。 - 【請求項３１】 前記細胞はレトロウイルスプロデューサー細胞である請求
項２４の細胞。 - 【請求項３２】 前記２′，５′−オリゴアデニレートシンテターゼコード
領域及び調節要素は安定に細胞ゲノムに組込まれ、２′，５′−オリゴアデニレ
ートシンテターゼ発現がＨＩＶ感染によって活性化される請求項２６〜２９のい
ずれかの項に記載の細胞。 - 【請求項３３】 請求項１の核酸、又は請求項４又は１８のいずれかのベク
ターをＨＩＶ感染に感受性の細胞に導入することを含むことを特徴とするＨＩＶ
の複製を阻害する方法。 - 【請求項３４】 調節要素に機能的に結合されたＰＫＲコード領域は安定に
細胞ゲノムに組込まれ、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化されることを特
徴とする請求項３３の方法。 - 【請求項３５】 調節要素に機能的に結合された２′，５′−オリゴアデニ
レートシンテターゼコード領域は安定に細胞ゲノムに組込まれ、２′，５′−オ
リゴアデニレートシンテターゼ発現がＨＩＶ感染によって活性化される請求項３
３の方法。 - 【請求項３６】 斯かる処置が必要な患者中のＨＩＶ複製を阻害する方法で
あって、請求項１の核酸、又は請求項４又は１８のいずれかのベクターを前記患
者からの細胞に導入することを含む前記方法。 - 【請求項３７】 少なくとも１つの化学療法作用物質をも前記患者に投与さ
れることを特徴とする請求項３６の方法。 - 【請求項３８】 前記化学療法作用物質はヌクレオシド類似体及びプロテア
ーゼ阻害剤を含む群から選択されることを特徴とする請求項３７の方法。 - 【請求項３９】 前記化学療法作用物質はＡＺＴである請求項３８の方法。
- 【請求項４０】 前記核酸又はベクターはｅｘ ｖｉｖｏにて前記細胞に導
入される請求項３６の方法。 - 【請求項４１】 前記核酸又はベクターはｉｎ ｖｉｖｏにて前記細胞に導
入される請求項３６の方法。 - 【請求項４２】 前記核酸又はベクターは、ＣＤ３４発現細胞を特異的に標
的とする請求項３６の方法。 - 【請求項４３】 前記核酸又はベクターは、ＣＤ４発現細胞を特異的に標的
とする請求項３６の方法。 - 【請求項４４】 調節要素に機能的に結合されたＰＫＲコード領域は、安定
に細胞ゲノムに組込まれ、ＰＫＲ発現がＨＩＶ感染によって活性化される請求項
３６〜４３のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項４５】 調節要素に機能的に結合された２′，５′−オリゴアデニ
レートシンテターゼコード領域は安定に細胞ゲノムに組込まれ、２′，５′−オ
リゴアデニレートシンテターゼ発現がＨＩＶ感染によって活性化される請求項３
６〜４３のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項４６】 ヒト宿主中のＨＩＶ複製を防ぐ方法であって、請求項１の
核酸、又は請求項４又は１８のいずれかのベクターを宿主からの細胞に導入する
ことを含む前記方法。 - 【請求項４７】 前記核酸又はベクターはｅｘ ｖｉｖｏにて前記細胞に導
入される請求項４６の方法。 - 【請求項４８】 前記核酸又はベクターはｉｎ ｖｉｖｏにて前記細胞に導
入される請求項４６の方法。 - 【請求項４９】 前記核酸又はベクターは、ＣＤ３４発現細胞を特異的に標
的とする請求項４６の方法。 - 【請求項５０】 前記核酸又はベクターは、ＣＤ４発現細胞を特異的に標的
とする請求項４６の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6198497P | 1997-10-16 | 1997-10-16 | |
| US60/061,984 | 1997-10-16 | ||
| PCT/US1998/021880 WO1999019496A1 (en) | 1997-10-16 | 1998-10-15 | Inhibition of human immunodeficiency virus (hiv-1) replication |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001520017A true JP2001520017A (ja) | 2001-10-30 |
Family
ID=22039490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000516047A Pending JP2001520017A (ja) | 1997-10-16 | 1998-10-15 | ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ−１）複製の阻害 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1029062A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001520017A (ja) |
| AU (1) | AU1189899A (ja) |
| CA (1) | CA2306444A1 (ja) |
| WO (1) | WO1999019496A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| CA2484251C (en) * | 2002-04-30 | 2015-06-23 | University Of South Florida | Materials and methods for inhibition of respiratory syncytial virus infection |
| US7595303B1 (en) | 2002-09-05 | 2009-09-29 | University Of South Florida | Genetic adjuvants for immunotherapy |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0693126B9 (en) * | 1993-04-02 | 2007-09-12 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Method for selective inactivation of viral replication |
-
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- 1998-10-15 WO PCT/US1998/021880 patent/WO1999019496A1/en not_active Application Discontinuation
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