JP2001514875A - 単離オステオカルシンフラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は単離された、ヒトの尿由来のオステオカルシンに関し、前記フラグメントは、アミノ酸配列〔１〕の位置１７、２１及び２４のグルタミン酸の少なくとも１つがγ−カルボキシル化されていることを特徴とする。本発明は、さらに、前記フラグメントに結合可能なモノクローナル抗体または組換え抗体、前記モノクローナル抗体を生産する細胞系統、及び前記フラグメントの定量的測定のための免疫学的検定法に関する。さらに、本発明は、骨のターンオーバー（生成及び／または吸収）の速度の測定及び／または代謝性の骨の疾患の調査のための方法に関する。 【数１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、単離された、ヒトの尿由来のオステオカルシンフラグメント、前記
フラグメントに結合可能なモノクローナル抗体または組換え抗体フラグメント、
前記モノクローナル抗体を生産する細胞系統、前記フラグメントの定量的測定の
ための免疫学的検定法に関する。さらに、本発明は骨のターンオーバー（生成及
び／または吸収）の速度の測定及び／または代謝性の骨の疾患の調査のための方
法に関する。

【０００２】 導入及び背景 本発明の背景を明らかにするために本明細書において用いられる出版物及び他
の材料並びに特に診療に関する追加の細部を与える症例は、参照により組み込ま
れる。 骨Ｇｌａタンパク質（ＢＧＰ）とも呼ばれる、ヒトオステオカルシン（ｈＯＣ
）は、骨芽細胞により合成される最も豊富な非コラーゲンタンパク質である（Po
ser 他「J. Biol. Chem.」255: 8685-91, 1980）。ほとんどの合成オステオカル
シンは、γ−カルボキシル化グルタミン酸（Ｇｌａ）により骨ヒドロキシアパタ
イトに吸収されるけれども、小部分のそれは血液流中にもれ、そこでそれを検出
することができる（Price 他「J. Biol. Chem.」256: 12760-6, 1981）。血液中
に見い出される一部のｈＯＣは吸収過程（その時に骨の組織内のｈＯＣは骨の分
解の間に放出される）に由来するとも考えられる（Gundberg及びWeinstein 「J.
Clin. Invest 」77: 1762-7, 1986）。循環しているｈＯＣのレベルは骨生成の
マーカーとして臨床的研究において広く用いられてきており（Power 及びFottre
l 「Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.」28: 287-335, 1991 ）及び血清ｈＯＣレベル
は骨の鉱物密度の測定と相関性があることが立証されてきた（Yasamura他「J. C
lin. Endocrinol. Metab. 」64: 681-5, 1987 ）。

【０００３】 種々のｈＯＣ検定法から得られた一致しない結果は、臨床的用途におけるｈＯ
Ｃの広範囲な使用を妨げた（Masters 他「Clin. Chem. 」40: 358-63, 1994, De
ftos他「Clin. Chem. 」38: 2318-21, 1992, Delmas 他「J. Bone Miner Res.」
5: 5-11, 1990 及びDiego 他40: 2071-7, 1994）。この現象は部分的には、異な
る検定法方式、すなわち、サンドイッチ検定法対競合検定法のためか、または異
なる検出技術のためと説明できた。現在では、測定標準は用いられない。しかし
ながら、たとえ、同じ標準製剤が用いられたとしても、異なった試験所で測定し
たｈＯＣレベルは直接に比較はできない（Delmas他「J. Bone Miner Res.」1990
）。

【０００４】 循環中の多様なｈＯＣ分子自体は、種々のアッセイにおけるその免疫反応性に
明らかに寄与する。グルタミン酸残基のビタミンＫ依存性γ−カルボキシル化度
は変化する（Poser 他「J. Biol. Chem.」255: 8685-91, 1980）。骨から精製さ
れたｈＯＣの減少γ−カルボキシル化はCarins及びPrice により指摘され（「J.
Bone Min. Res. 」9: 1989-97, 1994）、我々の研究において確認された（Hell
man 他「J. Bone Miner Res.」11: 1165-75, 1996 ）。

【０００５】 Ｃａ²⁺がＧｌａ残基に結合すると、α−ヘリックス構造が生成することが知ら
れている（Hauschka及びCarr「Biochemistry」21: 2538-47, 1982 及びAtkinson
他「Eur. J. Biochem.」232: 515-21, 1995 ）。ＥＤＴＡでＣａ²⁺を除去すると
、このヘリカルコンフォメーションは破壊される。脱カルボキシル化ＯＣのコン
フォメーションは、ランダムコイルとヘリカル形の間のどこかに存在する。した
がって、溶液中では、ペプチドは柔軟な構造として存在し、それについて単一の
コンフォメーションを明確に示すことはできない（Atkinson他「Eur. J. Bioche
m.」232: 515-21, 1995 ）。アルギニン残基１９及び２０の間のペプチド結合並
びに残基４３及び４４の間のペプチド結合は、トリプシン加水分解を受けやすく
、ペプチド、１−１９、２０−４３、４５−４９、１−４３及び２０−４９をも
たらし、それらは循環におけるｈＯＣ崩壊の主生成物であるかもしれない（Farr
ugia及びMelick「Calcif. Tissue Int. 」39: 234-8, 1986, Hellman他「J. Bon
e Miner Res.」11: 1165-75, 1996 及びGarnero 他「J. Bone Miner Res.」9: 2
55-4, 1994）。

【０００６】 ｈＯＣの多数の免疫反応性形が、循環において（Garnero 他「J. Bone Miner
Res.」9: 255-4）、そして尿においても（Taylor他「J. Clin. Endocrin. Metab
. 」70: 467-72, 1990）発見された。ｈＯＣのフラグメントは、骨基質の破骨分
解の間または骨芽細胞による合成後、循環タンパク質の代謝性の崩壊の結果とし
てのいずれかで生産され得る。尿中で見い出されたいくつかのフラグメントの生
産は、腎臓のクリアランスの前に起こり、そして、それの結果ではないという証
拠がある（Taylor他「J. Clin. Endcrin. Metab.」70: 467-72, 1990）。糸球体
のろ過による循環からの急速なクリアランスのため、ｓｈＯＣ（血清ヒトＯＣ）
は、骨の代謝における急性の変化を反映できたが、いくつかのｕｈＯＣ（尿ヒト
ＯＣ）フラグメントは長期の変化の指標として役立かもしれない（Price 他「J.
Biol. Chem.」256: 12760-6）。

【０００７】 尿オステオカルシンの最初に報告された測定（Taylor他「J. Clin. Endocrin.
Metab. 」70: 467-72, 1990）は、免疫反応性ＯＣフラグメントを認識するため
にポリクローナルモルモット抗ヒトＯＣ抗体を用いる競合ＲＩＡに基づく（Tayl
or他「Metabolism」37: 872-7, 1988 ）。検定法は、トリプシンフラグメント及
び合成ペプチドを用いる交差反応性から得られた情報によると、ｈＯＣ分子の分
子中央のエピトープに特異的であるということである。ポリクローナル抗体認識
のためのまず確実なエピトープは、著者により、全く広範に決定された。抗血清
の結合部位はそのタンパク質の分子中央に位置し、おそらく、アミノ酸１９と、
アミノ酸３７の前の２０〜４３トリプシン消化フラグメントのＮ末端配列の少な
くとも一部分を包含すると断定された。検定法はカルボキシル化ｈＯＣから脱カ
ルボキシル化ｈＯＣを区別することができない。言い換えると、それはｈＯＣ中
のグルタミン酸１７、２１及び２４のγ−カルボキシル化度に依存しない。さら
に、検定法により検出されたフラグメントの詳細な特徴づけが紛失している。さ
らに、この検定法は、測定前の尿試料の脱塩がＲＩＡの適切な機能のために不可
避であるという理由で、尿の日常的な測定に適切ではない。ｈＯＣに対する免疫
応答の滴定が個々の動物によって著しく変ったので、抗体生産のバッチごとでの
変化が起こりそうであり、それは明確にこの検定法の再現性を低下させる。

【０００８】 この検定法で、血清及び尿の両方で、多数の免疫反応性ＯＣフラグメントが検
定された。さらに、正常な成人の血清には検出されなかった、多数のフラグメン
トが正常な成人の尿に見い出された。しかしながら、認められた免疫反応性フラ
グメントは、詳細には特徴づけられなかった。ｕｈＯＣは、血清ｈＯＣよりも、
高い骨ターンオーバーを有する子供と、正常な成人とをより良く区別することが
できる。ｕｈＯＣ ＲＩＡにより測定すると、血清試料と尿試料の間の相関性は
良好で、この検定法は、生成過程に由来するオステオカルシンを検出することを
示す（ｒ＝０．８３、ｐ＜０．０１）。

【０００９】 これとは別に、ｕｈＯＣと血清アルカリ性ホスファターゼ測定の間でさらに良
い相関性が得られた（Taylor他「J. Clin. Endocrin. Metab. 」70: 467-72, 19
90）。骨の代謝マーカーとしてｓｈＯＣを用いる欠点はｈＯＣ濃度の明らかな毎
日の変化である（Gundberg他「J. Clin. Endcrinol. Metab.」60: 736-9, 1985)
。この課題のための１つの解決は２４時間の尿貯蔵分中でのｈＯＣ値を測定する
ことかもしれない。

【００１０】 閉経においては、血清オステオカルシンの濃度は増加する。増加のレベルは、
用いられたオステオカルシン検定法または研究された個体群における差に部分的
には依存するが、一般に閉経前の値よりも約３０〜５０％高い（Ravin 他「Bone
」19: 291-8, 1996 、Bonde 他「J. Clin. Endocrinol. Metab. 」80: 864-8, 1
995 、Garnero 他「J. Bone Miner Res.」11: 337-49, 1996、Akesson 他「J. B
one Miner Res.」1823-9, 1995）。一般に、ｈＯＣの濃度は、ホルモン置換療法
（ＨＲＴ）のような抗吸収性治療の間に低下する（Chen他「J. Bone Miner Res.
」11: 1784-92, 1996 、Hodsman 他「J. Clin. Invest.」91: 1138-48, 1993 ）
。したがって、血清ｈＯＣ測定は、治療の有効性をモニターするのに、そして、
新しい抗吸収性薬を設計する医薬の研究にも用いられる。子供及び特に思春期の
骨の代謝における高ターンオーバーはｈＯＣ濃度を著しく増加させる（Taylor他
「J. Chin. Endocrin. Metab. 」70: 467-72, 1990、Jaouhari他「Clin. Chem.
」38: 1968-74, 1992 、Gundberg他「Clin. Chim. Acta」128: 1-8, 1893）。

【００１１】 発明の概要 本発明は、単離された、ヒト由来のオステオカルシンフラグメントに関し、前
記フラグメントは、アミノ酸配列

【００１２】

【数２】

【００１３】 の位置１７、２１及び２４の少なくとも１つのグルタミン酸がγ−カルボキシル
化されていることを特徴とする。 他の面によると、本発明は、上に定義したヒトγ−カルボキシル化オステオカ
ルシンフラグメントに結合する能力を有する、モノクローナル抗体または組換え
抗体フラグメントに関する。

【００１４】 ３番目の面によると、本発明は前記モノクローナル抗体を生産する細胞系統に
関する。 第４の面によると、本発明は、上に定義されたγ−カルボキシル化オステオカ
ルシンフラグメントの定量的測定のための免疫学的検定法に関し、前記免疫学的
検定法は、前記フラグメントを含有する試料を、前記γ−カルボキシル化オステ
オカルシンフラグメントと結合する、モノクローナル抗体または組換え抗体フラ
グメントに暴露することを特徴とする。

【００１５】 第５の面によると、本発明は、個体における、骨のターンオーバー（生成及び
／または吸収）の速度の測定及び／または代謝性の骨の疾患の調査のための方法
に関し、前記方法は上に定義されたオステオカルシンフラグメントの定量的測定
に基づくものである。 これは、尿におけるオステオカルシンの単離及び特徴づけの最初の報告である
。十分に特徴づけられた試薬を用いる、尿中のこれらのｈＯＣフラグメントを検
出する３つの２−部位検定法が記載され、臨床試料を用いて確認される。記載さ
れた非競合免疫学的検定法は、日常的な臨床測定において、尿オステオカルシン
フラグメントの検出に十分に感受性の最初の検定法である。尿ｈＯＣは、血清ｈ
ＯＣよりも、思春期の被験者と成人被験者とを良く区別する。さらに、閉経前群
から閉経後群を区別するのに著しい臨床的有用性が認められる。さらに、抗吸収
性治療を受ける閉経後群におけるｈＯＣ濃度は、対照の閉経後群における濃度と
比較した時、有意に低い。同じ個体からの血清試料と尿試料は、同じ検定法を用
いると相関性があるが、本質的な差は生じる。この結果は、尿におけるｈＯＣの
フラグメントは、血清におけるｈＯＣフラグメントよりも骨の代謝の異なった状
態を反映するかもしれないことを示す。

【００１６】 発明の詳細な説明 好ましい態様によると、単離された、ヒトの尿由来のオステオカルシンフラグ
メントは、アミノ酸配列

【００１７】

【数３】

【００１８】 のｉ）位置７のアミノ酸から位置３０のアミノ酸まで、またはii）位置６のアミ
ノ酸から位置３０のアミノ酸までにわたるフラグメントであり、前記配列の位置
１７、２１及び２４のすべての３つのグルタミン酸はγ−カルボキシル化されて
いるものである。 好ましいモノクローナル抗体または組換え抗体フラグメントは、オステオカル
シンのγ−カルボキシル化されたフラグメントに関して同定されたエピトープに
特異性を有し、前記フラグメントは、上記アミノ酸配列の、 ｉ）位置７のアミノ酸から位置３０のアミノ酸まで、または ii）位置６のアミノ酸から位置３０のアミノ酸までのいずれかにわたり、かつ
前記配列の位置１７、２１及び２４のすべての３つのグルタミン酸がγ−カルボ
キシル化されているものである。

【００１９】 好ましい免疫学的検定法は、前記特異性を有するモノクローナル抗体または組
換えフラグメントを用いる。 好ましい免疫学的検定法は、少なくとも２つの異なったモノクローナル抗体ま
たは組換え抗体フラグメントを用いる非競合免疫学的検定法である。 非競合免疫学的検定法は好ましくは、一段階または二段階インキュベート手順
のいずれかで行なわれる。

【００２０】 特に好ましい免疫学的検定法は、用いられる２つのモノクローナル抗体が、 ｉ）３００５であると測定されたフラグメントのＣ末端エピトープ及びＮ末端エ
ピトープを認識する抗体２Ｈ９及び６Ｆ９、 ii）測定されたオステオカルシンフラグメント（６−１０または７−３０）上Ｎ
末端エピトープ及びＣ末端エピトープを認識する抗体６Ｆ９及び１Ｃ４、または
iii ）測定されたオステオカルシンフラグメント（６−３０または７−３０）の
Ｎ末端エピトープ及びＣ末端エピトープを認識する抗体６Ｆ９及び３Ｈ８である
ものである。

【００２１】 すべての開示された検定法は高度に感受性で、広く特徴づけられた試薬に基づ
く。閉経前及び青春期群の間のｈＯＣ濃度の差は尿試料の方が血清試料よりも明
らかに高かった。すべてのｈＯＣ検定法は、血清標本または尿標本のいずれかを
用いて効果的に閉経群を区別した。異なったｈＯＣ形を検出するそれらの能力の
ために、これらの検定法は種々の病気の状態、特に骨の代謝の病気をモニターす
るのに重要であろう。したがって、この検定法は特に、骨のターンオーバー（生
成及び／または吸収）の速度の測定及び／または代謝性の骨の疾患の調査の方法
に有用である。

【００２２】 実験 １．組換えオステオカルシン融合タンパク質の生産 材料 分子生物学試薬及び酵素は、スエーデン国ウプサラのファルマシア・バイオテ
クまたはニューイングランド・バイオラブから得た。発現ベクターｐＧＥＸ−３
Ｘをスエーデン国のファルマシア・ウプサラから得た。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
菌株（ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７，ｓ
ｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，ｌａｃ，Ｆ′ｐｒｏＡＢ，ｌａｃＩ^q ＺＤＭ１５，Ｔ
ｎ１０（ｔｅｔ^r ））をＧＳＴ−ｒｈＯＣ融合タンパク質の発現のために用いた
。Ｌ−ブロス培地、pH７．４は、１０ｇ／ｌのBacto （登録商標）Tryptone（Di
fco laboratories、米国、ミシガン州）、５ｇ／ｌのBacto （登録商標）酵母抽
出物（Difco ）及び５ｇ／ｌのＮａＣｌを含有した。イソプロピル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトシド、ＩＰＴＧ（Sigma Chemical CO. 米国）を誘導のために
用いた。

【００２３】 ＰＢＳ緩衝液、pH７．３は１５０mMのＮａＣｌ、１６mMのＮａ₂ ＨＰＯ₄ 、４
mMのＮａＨ₂ ＰＯ₄ からなった。ＰＭＳＦ及び還元グルタチオンをシグマから、
プロテアーゼ因子Ｘａ、ｐｆＸａはニューイングランド・バイオラブから得た。
Glutathione Sepharose （登録商標）４Ｂカラム（床容積８ml）をファルマシア
から得た。タンパク質のサイズ分離は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ２５％グラジエント
Phastgel及び標準化のための低分子量マーカー（ファルマシア）を用いて行なっ
た。ウシのオステオカルシン（ｂＯＣ）をバイオデザイン・インターナショナル
（メイン州，ケンネブンクポート）から得た。市販の抗ｂＯＣ Ｍａｂ ＢＤ（
バイオデザイン）を第１抗体として用い、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合し
た、羊で生じさせた抗−マウスイムノグロブリンを第２抗体（アマシャム、英国
バッキンガムシア）として用いた。ＥＣＬウェスタンブロット試薬（アマシャム
）を製造者の提言にしたがって、視覚化のために用いた。

【００２４】 装置 配列決定のために設計されたヒトオステオカルシンオリゴマー及びオリゴマー
プライマーはアプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州，フォスターシ
ティー）のオリゴヌクレオチド合成機で合成した。核酸配列決定はファルマシア
からのＴ７配列決定キット及びマクロフォア（Macrophor ）装置を用いて行なっ
た。電気穿孔法はＧｅｎｅパルサー（バイオ−ラド、カリフォルニア州，リッチ
モンド）を用いて行なった。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はPhast System（ファルマシア）を用いて行なっ
た。マトリックス助力レーザー脱着（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）質量分析計〔ＬＡＳＥ
ＲＭＡＴ（登録商標）、英国，Finnigan MAT Ltd. ）をペプチドの質量を得るた
めに用いた。オン−ラインアプライド・バイオシステムズ、型１２０Ａ ＰＴＨ
アミノ酸分析機を装備したタンパク質配列決定機（アプライド・バイオシステム
ズ、型４７７Ａ）をＮＨ₂ 末端アミノ酸分析のために用いた。Ｃ８ＲＰ−３００
カラム（４．６×１００mm）（Applied Biosystems）を用いて逆相クロマトグラ
フを行なった。Phast System（商標）のマニュアルにしたがって、Phast Transf
er（商標）セミ−ドライトランスファーキット（ファルマシア）を用いて、Hybo
nd（商標）−Ｃエクストラニトロセルロース膜（アマシャム）上にタンパク質を
電気ブロットした。

【００２５】 プラスミドの構築 各々８８核酸を含有する（その内８個は互いに相補性である）、合成ヒトオス
テオカルシンオリゴマー（図１Ａ）を末端のリン酸化後室温でハイブリダイズし
た。一本鎖末端に１Ｕのクレノウポリメラーゼ及び１００μＭの各デオキシヌク
レオチド（３７℃で３０分インキュベート）を入れて１６０塩基対のヒトオステ
オカルシン挿入物を創造した。該挿入物は、遺伝子の３′末端に停止コドンとＰ
ｓｔＩ制限部位を含有している（図１Ａ）。ブラント末端挿入物をＳｍａＩ−消
化した、脱リン酸化原核細胞発現ベクターであるｐＧＥＸ−３Ｘに連結した（図
１Ｂ）。組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、得られたベクターを制限酵素
消化及び核酸配列決定により確認した。すべての分子生物学プロトコルはサムブ
ルック他の「Molecular Cloning. a Laboratory Mannual 」第２版（Cold Sprin
g Harbor Laboratory Rress 、ニューヨーク州，コールドスプリング ハーバー
、１９８９年）にしたがった。

【００２６】 ＧＳＴ−ｒｈＯＣ融合タンパク質の発現 形質転換大腸菌細胞を３７℃で、１００μｇ／mlのアンピシリンを含有してい
る２５０mlのＬ−ブロス中でＡ₆₀₀ ＝０．５まで増殖し、次いで、０．５mMの最
終濃度までＩＰＴＧを加えた。誘導細胞をさらに２時間増殖させ、遠心分離によ
り収集し、プロテアーゼ阻害剤として２mMのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）及び１mMの
ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ緩衝液中で、氷上で超音波処理により崩壊させた。超
音波処理後、トリトン−Ｘ−１００（１ｖ／ｖ％）を加えた。超音波処理物を遠
心分離（１０，０００ｇ、２０分、４℃）により清澄化し、０．４５μｍフィル
ターでろ過し、その後、製造者の提言にしたがって平衡化Glutahione Sepharose
（登録商標）４Ｂカラムにそれを適用した。

【００２７】 組換えヒトオステオカルシンの精製 濃縮後、ＧＳＴ−ｒｈＯＣ融合タンパク質を含有する溶離液を、２０mMのトリ
ス−ＨＣｌ、１００mMのＮａＣｌ、２mMのＣａＣｌ₂ 、pH８．０中でｐｆＸａと
、０．５（ｗ／ｗ）％の基質に対するプロテアーゼの比を用いて室温で３０分間
インキュベートして、ｒｈＯＣ部分を遊離させた（Nagai 及びThogersen 「Natu
re」309: 810-2, 1984）。次いで、ｒｈＯＣをＣ８ＲＰ−３００カラムを用いる
逆相クロマトグラフで混合物から分離した。ｒｈＯＣの精製の最適化は、Kaekoe
nen 他（１９９６）により詳細に記載されている。

【００２８】 タンパク質産物の確認 核酸配列決定により確認されたように、シストソマ・ジャポニクム（Schistos
oma japonicum ）グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子（Smith 及びJo
hnson 「Gene」67: 31-40, 1988 ）の３′末端で、フレーム中に融合した完全な
配列のｈＯＣ遺伝子を含有した。得られた融合タンパク質は、プロテアーゼ因子
Ｘａ開裂部位とｈＯＣ遺伝子の第１アミノ末端チロシンの間に３個の追加のアミ
ノ酸を含有している（図１Ｂ）。逆相ＨＰＬＣ精製ｒｈＯＣの分子量は質量分析
計により測定して、６０６８．１であった。この値はアミノ酸配列から計算され
た予測された分子量〔６０６４．８、ｒｈＯＣは、ｐＧＥＸ−３Ｘプラスミド中
のｐｆＸａ開裂部位のため、３個のアミノ酸残基（Gly-Ile-Pro ）の拡張を有す
る（図１Ａ及び１Ｂ）〕と矛盾しない。

【００２９】 精製ＧＳＴ−ｒｈＯＣとｒｈＯＣを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッ
ト分析を用いて、骨から精製したｈＯＣとｂＯＣと比較した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により得られた精製ＧＳＴ−ｒｈＯＣ（３２kDa ）のサイズは、ＧＳＴ（２６kD
a 、Smith 及びJohnson 「Gene」67: 31-40, 1988 ）及びｒｈＯＣ（６０６８．
１Da）を含有する融合タンパク質から予期されたものと一致している。精製ｒｈ
ＯＣは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ヒト大腿骨から精製したｈＯＣとｂＯＣの両方
に対して、同様に移動する（図２Ａ、それぞれ、レーン３，４及び６）。ウェス
タンブロット実験では、Ｍａｂ ＢＤはｈＯＣ及びｂＯＣに結合し（図２Ｂ、そ
れぞれ、レーン３及び４）、並びに、また両方の組換え形、ＧＳＴ−ｒｈＯＣ及
びｒｈＯＣ（図２Ｂ、それぞれ、レーン５及び６）に結合する。６４kDa の帯は
、たぶんＧＳＴ−ｒｈＯＣの２量体形を示す、融合タンパク質試料からも認めら
れる（図２Ｂ、レーン５）、Ｍａｂ ＢＤはＧＳＴまたは分子量マーカーのいか
なるものとも結合しない（２Ｂ、それぞれ、レーン１及び２）。

【００３０】 ２．オステオカルシンモノクローナル抗体の生産 材料及び装置 免疫原として用いられたＧＳＴ−ｒｈＯＣは記載のように生産した（Kaekoene
n 他「Prot. Exp. Purif. 」3: 137-44, 1996 ）。ウシのオステオカルシン（ｂ
ＯＣ）をバイオデザイン・インターナショナル（メイン州、ケンネブンクポート
）から得た。フロイントの完全アジュバント（Ｆｃａ）及びフロイントの不完全
アジュバント（Ｆｉａ）をシグマ・イムノ・ケミカルズ（ミズーリ州、セントル
イス）から得た。グルタマックス−１、ダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ、１０×液体）、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（試験された組織培
養）、重炭酸ナトリウム（組織培養級）及びペニシリン−ストレプトマイシン（
Ｐ／Ｓ）溶液を有するオプチメム（Optimem)−１をギブコＢＲＬ、ライフテクノ
ロジーズ（ニューヨーク州、グランドアイランド）から、Ｈｅｐｅｓをベーリン
ガーマンハイム（独国）から、胎児のウシの血清をハイクローン（ユタ州、ロー
ガン）から購入し、培地の成分として用いた。ｈＯＣ特異的ハイブリドーマ細胞
系統をスクリーンするための試薬及び装置は、ユーロピウム標識ｈＯＣをヘルマ
ン他（「J. Bone Miner Res.」11: 1165-75, 1996 ）にしたがって製造した以外
は、ワラック・オイ（フィンランド，ツルク）から得た。

【００３１】 腹水液としてＭａｂの生産に用いたプリスタン（２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン）は、アルドリッチ−ヘミー（独国，シュタインハイム）か
ら得た。Ｍａｂの大規模生産のために用いた、テクノマウス（Tecnomouse）中空
繊維バイオリアクターは、インテグラ・バイオサイエンス・アクチェゲゼルシャ
フト（スイス国、バリゼレン）から、Ｍａｂの精製のためのタンパク質Ａアガロ
ースＡｆｆｉｇｅｌ（登録商標）をバイオ−ラド（カリフォルニア州、リッチモ
ンド）から得た。

【００３２】 マウスの免疫化及びｈＯＣ特異的Ｍａｂの選抜 免疫原として組換えＯＣ融合タンパク質を用いることは先に記載されている（
Matikainen他「Animal Cell technology: Developments towards the 21st cent
ury 」における第４７５〜９頁、１９９５）。１０ケ月令の雄のＢａｌｂ／ｃマ
ウスを、Ｆｃａと混合した４１３μｇのＧＳＴ−ｒｈＯＣ抗原（７５μｇのｒｈ
ＯＣ部分に相当する）を用いて腹腔内に免疫化した。１５週間後、Ｆｉａに混合
した３５８μｇの同じ抗原（６０μｇのｒｈＯＣ）で、マウスを追加免疫した。
最終の追加免疫投与であるＰＢＳ中の１１０μｇの抗原（２０μｇのｒｈＯＣ）
を腹腔内に８週間後に与えた。

【００３３】 ウシのオステオカルシンを、記載のように、キーホール・リムペットヘモシア
ニン（ＫＬＨ）に結合させた（Young 他「Prostaglandines 」23: 603-13, 1982
）。２匹の３ケ月令のＢａｌｂ／ｃ雄のマウスを、Ｆｃａと混合した５０μｇの
ｂＯＣ−ＫＬＨ抗原を用いて腹腔内に免疫化した。マウスをＦｉａ中の同量の抗
原で追加免疫した。最終追加免疫投与である、ＰＢＳ中の１０μｇのｂＯＣ−Ｋ
ＬＨを静脈内に与えた。

【００３４】 最終追加免疫後３日に、脾臓細胞を、マウスのミエローマ細胞ＳＰ２／０と、
先に詳細に記載したように（Lilja 他「Chin. Chem. 」37: 1618-25, 1991 ）、
融合した。ハイブリドーマを、２０％の胎児のウシの血清を含有しているグルタ
マックス−１を有するオプチメム−１中で増殖させた。ｈＯＣ特異的Ｍａｂを、
先に記載したように（Matikainen, 1995）、ウサギ抗マウスＩｇミクロ滴定ウェ
ル及びユーロピウムで標識化したｈＯＣを用いる免疫蛍光検定法（ＩＦＭＡ）で
選抜した。

【００３５】 Ｍａｂの大規模生産と精製 Ｍａｂの大規模生産までは、陽性のハイブリドーマを制限希釈法により少なく
とも２回クローン化した。２０％の胎児のウシの血清を補足したグルタマックス
−１を有するオプチメム−１を培地として用いた。ＧＳＴ−ｒｈＯＣの免疫化か
ら得られた細胞系統２Ｈ９Ｆ１１Ｆ８（２Ｈ９）及び６Ｆ９Ｇ４Ｅ１０（６Ｆ９
）並びにｂＯＣの免疫化から得られた３Ｇ８Ｅ１Ｆ１１（３Ｇ８），１Ｃ４Ｂ１
Ｄ７Ｅ７（１Ｃ４）及び３Ｈ８Ｈ２Ｄ２Ａ１２Ｆ１２（３Ｈ８）をさらなる特徴
づけのために選抜した。Ｍａｂをプリスタンで開始したＢａｌｂ／ｃマウスにお
ける腹水液として及びテクノマウス中空繊維バイオリアクター中で生産した。Ｌ
−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム及びＰ／
Ｓを補足したＤＭＥＭ（１×溶液）を腹腔内循環における培地として用いた。２
．５％の胎児のウシの血清を補足したグルタマックス−１を有するオプチメム−
１を毛細血管外の空間における収集媒体として用いた。生産されたＭａｂは、製
造者の提言にしたがって、Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）精製キットを用いて、タ
ンパク質Ａアガロースクロマトグラフにより精製した。

【００３６】 ３．エピトープマッピング、Ｍａｂの特徴づけ及び２−部位検定法 材料 Ｍａｂのサブクラスの決定において、ストレプトアビジン塗布ミクロ滴定プレ
ートをワラック・オイから、そして、ビオチン化ラット抗マウスＩｇサブクラス
特異的Ｍａｂをセロテク（英国、オックスフォード）から得た。エピトープのマ
ッピングのために、残基１７にＧｌｕを含有する合成オステオカルシンペプチド
７−１９をバヘム（Bachem、スイス国）から購入し、ウシのオステオカルシン（
ｂＯＣ）をバイオデザイン・インターナショナル（メイン州、ケンネブンクポー
ト）から得た。ヒトの大腿部からのオステオカルシンを、ヘルマン他（１９９６
）により詳細に説明されたように、過去に記載された方法（Gundberg他「Meth.
Enzymol.」107: 516-544, 1984）を修正することにより精製した。

【００３７】 ｈＯＣのカルボキシペプチダーゼＹ消化、トリプシン消化、アルキル化及び脱
カルボキシル化も先に記載されている（Hellman 他、1996）。ｈＯＣの詳細な特
徴づけ及びその修正はヘルマン他（１９９６）により記載されている。オステオ
カルシンの組換え形は第１節において説明したように生産された。構造領域にお
ける停止変異を担持する遺伝子からのｒｈＯＣ（ｄｅｌ．ｒｈＯＣ）（１０ＣＯ
ＯＨ−末端アミノ酸残基を欠く）の先端切断形の生産及び精製を同様な条件で行
なった。ｒｈＯＣ及びｄｅｌ ｒｈＯＣの両方がそのＮＨ₂ 末端に３個のアミノ
酸残基の拡張を有していた。さらに、それらは、骨からの単離ｈＯＣのγ−カル
ボキシル化特性を欠いている。

【００３８】 ビオチン化のための試薬である、ビオチンイソチオシアネート（ＢＩＴＣ）及
び標識化のための試薬である、４−〔２−（４−イソチオシアネトフェニル）エ
チニル〕−２，６−ビス｛〔Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノ〕メチル
｝ピリジンのユーロピウム（III ）キレート（Taklo 他「Helv. Chim. Acta」76
: 877-83, 1993）は、ワラック・オイから得た。ＩＦＭＡ測定で用いた、ストレ
プトアビジン塗布ミクロ滴定プレート、Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）緩衝液、Ｄｅ
ｌｆｉａ（登録商標）洗浄溶液、Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）促進溶液及びＤｅｌ
ｆｉａ（登録商標）リサーチ蛍光計、型１２３４はワラック・オイから得た。免
疫学的検定法で用いた試薬及び装置はこの研究を通して同様であった。 Ｍａｂの特徴づけ サブクラスの決定及びエピトープのマッピングのためのペプチドの標識化をヘ
ルマン他（１９９６）にしたがって行なった。Matikainen他（１９９５）にした
がって決定すると、Ｍａｂ６Ｆ９，３Ｇ８，１Ｃ４及び３Ｈ８はサブクラスＩｇ
Ｇ１に属し、Ｍａｂ２Ｈ９はサブクラスＩｇＧ２ａに属した。

【００３９】 Ｍａｂを、記載されたように（Hellman 他、1996）、Ｅｕ標識完全ｈＯＣ，ｂ
ＯＣ及びトリプシンまたは合成ペプチドに対するそれらの結合について特徴づけ
た。ＫＬＨに接合したｂＯＣを用いる免疫化により得られた抗体１Ｃ４及び３Ｈ
８はトリプシン２０−４３フラグメントを認識した。同様にｂＯＣの免疫化から
得られたＭｂ３Ｇ８については、標識化ペプチドを用いて、特異的結合部位の位
置を突き止めることができなかった。また、完全なｂＯＣ及びｈＯＣの標識化は
、それらの３Ｇ８との免疫反応性をなくさせた。これは完全なＴｙｒ（１）が有
効な結合に必要であるのか、またはＥｕ−キレートが立体障害を引き起こすかの
いずれかを示唆する。しかしながら、標識されていない完全なｈＯＣまたはｂＯ
Ｃは、Ｍａｂ２Ｈ９を用いる２−部位方式において、この抗体により容易に認識
された。Ｍａｂ６Ｆ９はトリプシン１−１９ペプチド及び合成７−１９ペプチド
を認識した。

【００４０】 表１におけるＭａｂの要約。得られた情報にしたがって、エピトープ地図を創
造した（図３）。

【００４１】

【表１】

【００４２】 Ｍａｂのビオチン化及びＥｕ標識化 ２−部位組み合わせ検定法を創造するために、Ｍａｂ３Ｇ８、２Ｈ９及び６Ｆ
９をＢＩＴＣでビオチン化し、Ｍａｂ２Ｈ９、６Ｆ９、１Ｃ４及び３Ｈ８を前に
記載した反応条件（Hellman 他、1996）で、ユーロピウム（III ）キレートで標
識した。２−部位免疫学的検定法は、検出システムとして、ユーロピウムのよう
なランタニドキレート標識を用いる、時間分割蛍光測定法を用いた（Soini 及び
Loevgren「CRC Crit. Rev. Anal. Chem.」18: 105-53, 1987）。

【００４３】 ２−部位検定法の特徴づけ ２−部位組み合わせの４つは、アルキル化ｈＯＣ、脱カルボキシル化ｈＯＣ、
カルボキシペプチダーゼＹ−消化ｈＯＣ、組換えｈＯＣ及び先端を切断した組換
えｈＯＣに対する交差反応性の測定により、より詳細に確認された。交差反応性
の測定及びエピトープのマッピングにより得られた情報にしたがって、検定法＃
２（バイオ−３Ｇ８／Ｅｕ−２Ｈ９）は完全な長さの完全なｈＯＣ分子に対して
特異的であると考えられる。検定法＃４（バイオ−２Ｈ９／Ｅｕ−６Ｆ９）、＃
７（バイオ−６Ｆ９／Ｅｕ−１Ｃ４）及び＃９（バイオ−６Ｆ９／Ｅｕ−３Ｈ８
）は完全な長さのｈＯＣと、大きいＮＨ₂ −末端フラグメントも検出できた。検
定法＃４はｈＯＣのγ−カルボキシル化形及び完全に脱カルボキシル化した形の
両方を測定した。＃９及び＃７検定法はｈＯＣのカルボキシル化形を区別して好
んだ。標識化Ｍａｂのアフィニティー常数の測定は、スカッチャード分析（Scat
chard 「Ann. NY Acad. Sci 」51: 660-72, 1949）を用いて、ヘルマン他（１９
９６）にしたがって行なった。検定法の特徴づけを表２に要約する。

【００４４】

【表２】

【００４５】 ２−部位非競合検定法に加えて、ｈＯＣ特異的抗体を捕獲抗体として競合検定
法に用いることができた。競合検定法においては、尿中のｈＯＣフラグメントは
、限られた数の捕獲Ｍａｂへの結合についてＥｕ−標識化ｈＯＣと競合する。Ｍ
ａｂ２Ｈ９については、１Ｃ４及び３Ｈ８、または、Ｅｕ標識ｂＯＣを表１に説
明された交差反応性のために用いることができた。

【００４６】 ４．最適化検定法手順 材料及び装置 用いられたＭａｂは前の節で特徴を述べた。ハイブリドーマ細胞培養において
生産されたＭａｂに加えて、組換え抗体フラグメントも検定法コンセプトに用い
ることができた。検定法の標準化のために用いられたｈＯＣ及びＣＰＹｈＯＣ（
カルボキシ−ペプチダーゼＹ消化ｈＯＣ）は、第３節で説明したようにして生産
した。標準化における希釈剤として用いられたＴＳＡ−緩衝液（５０mMのトリス
−ＨＣｌ、１５０mMのＮａＣｌ、１５mMのＮａＮ₃ 、pH７．７５）中のＤＴＰＡ
（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）処理ＢＳＡをワラック・オイから得た。Ｏ
Ｃ ＩＦＭＡにおいて用いた材料と装置は３節に列挙した。

【００４７】 血清試料のために最適化された全部一つに組み込んだ検定法 １０μｌの試料及び標準をストレプトアビジンを塗布したミクロ滴定プレート
にピペットで落とした。較正曲線を０．５〜８０ng／mlの範囲をカバーする標準
として、ＴＳＡ緩衝液中の７．５（ｗ／ｖ）％ ＤＴＰＡ−処理ＢＳＡ中の精製
ｈＯＣを用いて製造した。次いで、５０μｌのＤｅｌｆｉａ（登録商標）緩衝液
中のビオチン化Ｍａｂ及びＥｕ標識Ｍａｂの混合物をウェルに加えた。捕獲また
はトレーサーＭａｂの量は、１００ng／ウェルのトレーサーＭａｂが検定法＃２
及び＃９で用いられた以外は２００ng／ウェルであった。検定法＃４，＃７及び
＃９におけるＤｅｌｆｉａ（登録商標）緩衝液中に５mMのＥＤＴＡを加えた。プ
レートを室温で２時間、振とうし、次いでＤｅｌｆｉａ（登録商標）洗浄溶液で
６回洗浄した。Ｅｕ蛍光を検出するために、１ウェル当り２００μｌのＤｅｌｆ
ｉａ（登録商標）の促進溶液を加えた。Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）リサーチ蛍光
計で測定する前に、プレートを室温で３０分間振とうした。

【００４８】 種々の検定法の検出の低い方の限界を、標準希釈剤によって生産したバックグ
ラウンドシグナルの２つの標準偏差に基づいて決定し、それは各検定法について
０．１μｇ／Ｌ未満であった。出現したＩＦＭＡは、４オーダーを越える大きさ
の線状応答を示し、かつ、高度に再現性があった。 尿試料のために最適化されたオステオカルシン検定法＃４のための較正曲線を
０．０５〜１６ng／mlの範囲をカバーする標準としてＴＳＡ緩衝液中の７．５（
ｗ／ｖ）％ ＤＴＰＡ処理ＢＳＡ中の精製したｈＯＣを用いて製造した。０．０
５〜１６ng／mlの範囲をカバーする同じ希釈剤中のカルボキシ−ペプチダーゼＹ
消化ｈＯＣ（ＣＰＹ ｈＯＣ）を検定法＃７及び＃９のための標準化に用いた。

【００４９】 まず、５０μｌのＤｅｌｆｉａ（登録商標）緩衝液中の４００ngのビオチン化
捕獲Ｍａｂをストレプトアビジンウェルにピペットで落とした。室温で３０分間
振とう後、過剰の捕獲ＭａｂをＤｅｌｆｉａ（登録商標）洗浄溶液を用いる２回
の洗浄により除去した。５０μｌのＤｅｌｆｉａ（登録商標）中の標識化トレー
サーＭａｂの添加の前に、標準または試料を１０μｌの容積でピペットで落とし
た。検定法＃７で２００ng／ウェルのＥｕ−１Ｃ４を用いた以外は１００ngの標
識化トレーサーを用いた。室温で２時間振とう後、ウェルを６回洗浄し、１ウェ
ル当り２００μｌのＤｅｌｆｉａ（登録商標）促進溶液を加えた。蛍光測定の前
に、プレートを室温で３０分間振とうした。検定法は高度に直線状で、かつ、再
現性があった。最も低い検出限界は０．１μｇ／Ｌ未満であった。

【００５０】 ５．尿のオステオカルシンフラグメントの単離及び特徴づけ 材料及び装置 尿のＩＦＭＡの標準化に用いたカルボキシ−ペプチダーゼＹ消化ｈＯＣ（ＣＰ
Ｙ ｈＯＣ）を第３節に説明したように生産した。バイオ−ラドからのAffi-Gel
Hz イムノアフィニティキット、Ｃ−１８固相抽出カートリッジ（Millipore ）
及びＣ−４逆相ＨＰＬＣカラム（Vydac 、米国、カリフォルニア州、ヘスペリア
）を用いて精製した６Ｆ９Ｍａｂ（第２節）を結合したイムノアフィニティクロ
マトグラフをｕｈＯＣフラグメントの単離のために用いた。マトリックス助力レ
ーザー脱着ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計〔ＬＡＳＥＲＭＡＴ（登録商標）、サ
ーモ・バイオアナライシス 英国）を質量測定のために用い、オン−ライン ア
プライド・バイオシステムズ型１２０Ａ ＰＴＨアミノ酸分析機を装備したタン
パク質配列決定機（アプライド・バイオシステムズ型４７７Ａ）をＮＨ₂ 末端ア
ミノ酸配列分析のために用いた。

【００５１】 試料収集及びｕｈＯＣ ＩＦＭＡ 尿の貯蔵分を１３才の１人の健康な男の志願者から午前中に収集し、４℃で貯
蔵した。３時間以内に貯蔵分を小分けし、−７０℃で凍結した。その後、それを
−２０℃で貯蔵した。尿の貯蔵分を融解し、遠心分離し、ろ過し、その後、任意
の単離工程にかけた。

【００５２】 尿素貯蔵分及び単離過程の異った工程の両方における免疫反応性ｕｈＯＣを、
完全なｈＯＣだけでなく、ｈＯＣのＮ末端の中間のフラグメント（アミノ酸残基
１−４３）を認識する２−部位免疫学的検定法を用いて測定した（図３）。検定
法は捕獲及びトレーサーＭａｂとしてそれぞれ、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）
６Ｆ９及び１Ｃ４を用いた（組み合わせ＃７）。較正曲線を標準としてカルボキ
シ−ペプチダーゼＹ消化ｈＯＣ（ＣＰＹ ｈＯＣ）を用いて製造した。思春期の
尿貯蔵分における免疫反応性ｕｈＯＣの量は１００ng／mlであった。第４節に記
載したように、検定法＃９（Ｍａｂ組み合わせ６Ｆ９／３Ｈ８）及び＃４（Ｍａ
ｂ組み合わせ２Ｈ９／６Ｆ９）を免疫反応性フラグメントを測定するのに用いた
。

【００５３】 オステオカルシンフラグメントの単離 最初に、思春期の尿の貯蔵分からの免疫反応性オステオカルシンフラグメント
をイムノアフィニティクロマトグラフにより吸着させた。ゲルマトリックスをＮ
−末端エピトープを認識するｈＯＣ Ｍａｂ６Ｆ９と共有結合させた（図３）。
吸着後、結合フラグメントを０．１Ｍの酢酸により溶離し、Ｃ−１８固相抽出カ
ートリッジに吸着させ、さらに８０％のアセトニトリル（ＡｃＮ）で溶離し、そ
して、蒸発させた。イムノアフィニティクロマトグラフにおいて、９０％より多
くの免疫反応性ｕｈＯＣを６Ｆ９結合ゲルに吸着させた。溶離工程（吸着工程及
びゲルの洗浄を包含する）において、１０％の吸着されたｕｈＯＣを溶離させた
。収量をもっと改善するために尿をアフィニティカラムに適用し、次いで、溶離
液を、すべて互いに一系列に結合した２本のＣ−１８固相抽出カートリッジに結
合したアフィニティカラムに通して５時間リサイクルした。蒸発後、Ｃ−１８固
相溶離液は、Ｍａｂ組み合わせ＃７を用いる尿ｈＯＣ検定法により測定した時、
少なくとも２mg／mlの免疫反応性ｕｈＯＣを含有していた。

【００５４】 次に、免疫反応性フラグメントを含有する試料をＶｙｄａｃ Ｃ−４（２．１
mm×１５０mm）逆相ＨＰＬＣカラムに適用し、アセトニトリルグラジエントで溶
離し（図４）、２７６mmで検出したピーク分画を手で収集した。試料はＯＣの多
数の免疫反応性フラグメントを含んでおり、それを７０分（３５％ ＡｃＮ）及
び８２分（４８％ ＡｃＮ）の間で溶離した（図４）。１．４〜１９．５μｇ／
mlの免疫反応性ｕｈＯＣを含有する分画をさらに分析にかけた。

【００５５】 オステオカルシンフラグメントの特徴づけ ＨＰＬＣ分画を従前どうり、２−部位免疫学的検定法＃７、＃９及び＃４によ
り分析し、免疫反応性ｕｈＯＣフラグメントを含有する分画をＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ質量分析計及びＮ−末端アミノ酸配列決定にかけた。質量分析計において、突
出したイオンの分子量は２７７８、２８１４、２９３０及び３００５であった。
分画４４（Ｍ＝２８１４）及び分画４６（Ｍ＝２９３０）はＮ−末端配列分析の
ために十分な物質を含有していた。分画４４から得た配列は残基Ｇｌｙ（７）か
ら開始するｈＯＣに匹敵する。実験の分子量２８１４を考慮すると、そのフラグ
メントは、位置１７、２１及び２４にγ−カルボキシル化残基を有し、残基７〜
３０にわたり、２８１２の計算分子量を示す（図５Ａ）。Ｇｌｕ残基のγ−カル
ボキシル化は、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ残基は当該配列決定技術を用いて、シ
グナルを与えないことが知られているという事実によりさらに支持される（Cair
ns他「Anal. Biochem.」199: 93-97, 1991）。

【００５６】 分画４６をトリプシン消化にかけ、フラグメントが予期されたように（Ａｒｇ
残基の後で）開裂し得ることを示した。さらに、決定されたＮ末端配列は、残基
Ｌｅｕ（６）から開始するｈＯＣと一致する。トリプシンで開裂したフラグメン
トのＮ末端部分の測定された分子量は１５６６で、予期された分子量（カルボキ
シル化Ｇｌｕ１７を有し、１５６５）一致した。トリプシン開裂前の分画４６の
測定された分子量（２９３０、図５Ｂ）によると、フラグメントは上記のように
３個のγ−カルボキシル化残基を有するｈＯＣの残基６−３０にわたる（計算分
子量２９２５）。分子量２７７８（図５Ｃ）及び３００５（図５Ｄ）を有するイ
オン種は、免疫反応性、クロマトグラフの行動及び分子量に基づいて、同じｈＯ
Ｃ領域の近接した構造変異体を示す。このような構造的な変異性は、γ−カルボ
キシル化もしくは更なる１〜２の残基の部分的な欠如及びまたは両方の組み合わ
せにより引き起こされ得る。フラグメントの特性は図５Ｅに記載されている。免
疫学的検定法＃７に加えて、検定法＃９も尿のオステオカルシンのこれらの形を
有効に認識する。＃４のエピトープは＃７及び＃９の組み合わせにより認識され
たエピトープとわずかに異なる。なぜなら、この組み合わせは７−３０のフラグ
メントを認識できなかったが、分子量３００５のフラグメントを検出できたから
である。尿はまだ特徴づけられていない、もっと短かいｈＯＣフラグメントを含
有しているかもしれない。

【００５７】 ６．血清パネル及び尿パネルにおけるオステオカルシンの測定 材料及び装置 血清試料のＦＳＨ濃度をＤｅｌｆｉａ（登録商標）ｈＦＳＨ検定法（ワラック
、フィンランド国、ツルク）により測定した。尿素試料のクレアチニン濃度を、
製造者のプロトコルにしたがって、ＡＵ ＯＬＹＭＰＵＳ５１０装置を用いて測
定した。ｓｈＯＣ検定法及びｕｈＯＣ検定法のプロトコルは第５節に記載されて
いる。

【００５８】 被験者及び試料の収集 検定法の臨床的評価を、５８人の閉経前、９人の閉経周辺及び２０人の閉経後
の女性、１２人のホルモン置換療法（ＨＲＴ）を受けている閉経後の女性及び１
６人の思春期の少女から、午前８〜１１時の間に収集した血清試料及び尿試料で
行なった。女性のパネルに加えて、４６人の成人男性及び１９人の青春期の少年
からなる男性パネルからも収集した。血清試料を室温で３０分間凝固させた後、
遠心分離し、次いで、すぐに小分けし、−７０℃で貯蔵した。収集した尿試料を
最初に−７０℃で凍結し、次いで−２０℃で貯蔵した。女性を月経の状態及び血
清中のＦＳＨ濃度にしたがって、閉経前群、閉経周辺群及び閉経後群に分割した
。閉経後群はさらに、ホルモン置換療法（ＨＲＴ）を受けている被験者と受けて
いない被験者に分類した。

【００５９】 血清試料及び尿試料におけるｈＯＣ濃度 血清試料を完全な長さのｈＯＣに特異的な完全なｈＯＣ検定法（＃２）、完全
なｈＯＣだけでなく、ｈＯＣのＮ末端の中間フラグメントを認識する総合ｈＯＣ
検定法（＃４）及びｈＯＣ中のグルタミン酸のγ−カルボキシル化の程度に依存
する２つの検定法（＃７及び＃９）を用いて測定した。尿試料を２つのγ−カル
ボキシル化依存検定法（＃７及び＃９）及び検定法＃４でも測定した。分析に用
いた尿オステオカルシンの値はクレアチニンについて修正した。

【００６０】 成人被験者に比較した思春期の被験者におけるｓｈＯＣ及びｕｈＯＣ 女性において、血清試料において認められたｈＯＣ値は、成人よりも思春期の
少女の方が６〜８倍高い。尿においては、ｈＯＣ濃度は、成人に対して思春期群
を比較した時１２〜１６倍高い（図６）。男性において、血清において５倍、尿
において８〜１１倍増加した。検定法＃４で認められたｈＯＣ濃度レベルは検定
法＃７及び＃９で認められたレベルよりも約５倍低いけれども、濃度は試験され
た群の間で有意に異なる。すべての増加は非常に有意である（ｐ＜０．００１）
。正確な値は表３に要約されている。

【００６１】

【表３】

【００６２】 異なる閉経後群におけるｓｈＯＣ及びｕｈＯＣ血清中のｈＯＣ濃度における統
計学的に有意な増加が、閉経後において認められた（４０から４８％に）。興味
深いことに、尿試料においては、ｈＯＣ濃度における増加は検定法＃７及び＃９
で測定した時に、それぞれ、７５％及び７９％の高さであった（ｐ＜０．００１
）。閉経前群と閉経後群の間の尿のｈＯＣの増加は、検定法＃４で測定した時、
さらに高かった（１２５％、ｐ＜０．００１）。ＨＲＴについての閉経後の被験
者におけるｈＯＣ濃度は、血清及び尿の標本の両方におけるすべてのｈＯＣ検定
法で、閉経前群から区別できる。血清濃度における統計学上有意な低下（３０か
ら４６％に）が用いられた検定法に依存して見られた。しかしながら、尿試料に
おいて認められた低下は５０％を越えていた（図７Ａ及び７Ｂ）。検定法＃４に
より認められたｈＯＣ濃度のレベルは、検定法＃７または＃９により認められた
レベルより、約５倍低いけれども、濃度は試験された群により有意に異なる。各
検定法の識別力は表４に要約されている。

【００６３】

【表４】

【００６４】 検定法は循環しているｈＯＣの異なった形を明確に検出したけれども、血清パ
ネルを測定するそれらの性能はほぼ同一であった。ＩＦＭＡは、尿試料で測定し
た時、閉経前群から閉経後群を、そして、また、閉経後の対照群からＨＲＴ下の
閉経後群を区別するのにさらにより有効であった。 血清ｈＯＣ検定法はお互いに良く相関した。反対に、尿検定法の間に差が認め
られた。第５節で説明したように、検定法＃４は、検定法＃７及び＃９よりも、
尿において、少々異なったフラグメントを認識する。これは尿試料において測定
した時、検定法＃７及び＃９（ｒ＝０．９７６、図８Ｂ）の間の相関性よりも、
検定法＃４及び＃７（ｒ＝０．８４３、図８Ａ）の間の相関性の方が弱いことを
説明するのかもしれない。尿試料及び血清試料におけるｈＯＣ値を比較すると、
同じＭａｂの組み合わせにより測定したこれども相関性は顕著により低かった。
検定法＃７（ｒ＝０．６２５）及び検定法＃４（ｒ＝０．４２７）における尿試
料及び血清試料の間の相関性を、それぞれ、図８Ｃ及び８Ｄに図示する。すべて
の相関性は有意であり（ｐ＜０．００１）、それらを表５に要約した。

【００６５】

【表５】

【００６６】 本発明の方法を多様な態様の形で組み入れることができ、本明細書にはその内
のわずかなものが開示されているにすぎないことが分かるであろう。当業者には
本発明の精神からはずれない他の態様が存在することは明らかであろう。したが
って、記載した態様は説明のためのものであって、制限のためと解すべきではな
い。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 合成ヒトオステオカルシン挿入物の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。

【図１Ｂ】 プラスミドベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア）を示す。矢印は、ｈＯＣ
挿入物のＳｍａＩ−連結反応部位を示す。ｐｆＸａ（プロテアーゼ因子Ｘａ）開
裂部位はIle-Glu-Gly-Arg −配列後に位置する。

【図２Ａ】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図２Ｂ】 種々のオステオカルシン形のウェスタンブロット分析を示す。レーン１は低分
子量（kDa ）マーカー、レーン２はアフィニティ精製ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ
−トランスフェラーゼ）、レーン３はヒトの骨からの精製ｈＯＣ、レーン４はｂ
ＯＣ（ウシオステオカルシン）、レーン５はアフィニティ精製ＧＳＴ−ｒｈＯＣ
（ＧＳＴ組換えヒトオステオカルシン融合タンパク質）、レーン６はクロマトグ
ラフで精製したｒｈＯＣ（組換えヒトオステオカルシン）、すなわち、ＧＳＴ−
ｒｈＯＣのｐｆＸａとのインキュベートからの開裂生産物である。

【図３】 ２−部位ｈＯＣ検定法を用いたＭａｂにより認識されたおよそのエピトープの
図による表示である。分子を４つのエピトープ領域に分割し、その各々が異なる
Ｍａｂにより認識される。○で囲んだ数字は、ｈＯＣ特異的免疫学的検定法の数
を示す。アミノ末端アミノ酸及びカルボキシ末端アミノ酸は、それぞれ、１及び
４９と示した。プロテアーゼ感受性部位をＲ−Ｒ（アルギニン−アルギニン）と
示した。３つのＧｌａ残基並びにジスルフィド架橋（Ｃ−Ｃ）も示す。

【図４】 正常な思春期の尿における免疫反応性ｕｈＯＣフラグメントの測定を示す。尿
をＨＰＬＣ分画の前に免疫アフィニティクロマトグラフ及び固相抽出にかけた。
分画をｈＯＣ特異的検定法＃７を用いて免疫反応性物質について測定した。四角
はオステオカルシンで、三角はアセトニトリルに関する。

【図５Ａ〜５Ｅ】 正常な思春期の尿から単離した免疫反応性ｈＯＣフラグメントの特性を示す。

【図５Ａ】 アミノ酸残基７−３０（Gly-Asp ）にわたる尿から単離された最も目立つフラ
グメント４４の質量分析。

【図５Ｂ】 アミノ酸残基７−３０（Leu-Asp ）にわたる尿ｈＯＣフラグメント４６の質量
分析。

【図５Ｃ】 尿ｈＯＣフラグメント４３の質量分析。

【図５Ｄ】 尿ｈＯＣフラグメント４７の質量分析。

【図５Ｅ】 尿から単量されたｈＯＣフラグメントの特性及び完全なｈＯＣの特性。

【図６】 ｈＯＣ ＩＦＭＡにより測定した、思春期と成人の試料の間の血清及び尿にお
けるｈＯＣ濃度の差を示す。ｈＯＣ免疫学的検定法で測定した、尿及び血清試料
におけるｈＯＣ濃度は、思春期の少女の方が閉経前の女性よりも明らかに高かっ
た。

【図７Ａ，７Ｂ】 ＩＦＭＡで測定した、閉経前、閉経後及びＨＲＴを用いた閉経後群の女性にお
けるｈＯＣレベルを示す。成人女性の血清試料（図７Ａ）及び尿試料（図７Ｂ）
において得られた濃度。閉経群の間の差は、尿試料では、血清試料におけるより
も、同じＭａｂの組合せを用いて測定した時ですら、明らかであった。

【図８Ａ−８Ｄ】 成人女性パネルからの尿及び血清試料において測定した種々の検定法の間の相
関性を示す。

【図８Ａ】 検定法＃４及び＃７により測定したｕｈＯＣの間の相関性。

【図８Ｂ】 検定法＃７及び＃９により測定したｕｈＯＣの間の相関性。

【図８Ｃ】 検定法＃７により測定した血清及び尿の試料の間の相関性。

【図８Ｄ】 検定法＃４により測定した血清及び尿試料の間の相関性。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１５日（２０００．２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【数１】 の位置１７、２１及び２４の少なくとも１つのグルタミン酸がγ−カルボキシル
化されていることを特徴とする前記フラグメント。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (71)出願人 レブグレン，ティモ フィンランド国，エフイーエン−20100 トゥルク，イリオピストンカトゥ ２ ホ ー 155 (71)出願人 バーナネン，ホー．カレルボ フィンランド国，エフイーエン−90550 オウル，ペイコンティエ ２ デー 43 (71)出願人 ペテルソン，キム フィンランド国，エフイーエン−20810 トゥルク，ティーレンテキヤーンカトゥ 14 エー 20 (72)発明者 ヘルマン，ユッカ フィンランド国，エフイーエン−20100 トゥルク，アミラーリストンカトゥ ５ セー 12 (72)発明者 カーコーネン，サンナ−マリア フィンランド国，エフイーエン−20300 トゥルク，ムルトマーンティエ 39 (72)発明者 カルプ，マティ フィンランド国，エフイーエン−20660 リットイネン，カムパカトゥ １ (72)発明者 レブグレン，ティモ フィンランド国，エフイーエン−20100 トゥルク，イリオピストンカトゥ ２ ホ ー 155 (72)発明者 バーナネン，ホー．カレルボ フィンランド国，エフイーエン−90550 オウル，ペイコンティエ ２ デー 43 (72)発明者 ペテルソン，キム フィンランド国，エフイーエン−20810 トゥルク，ティーレンテキヤーンカトゥ 14 エー 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 CA04 DA02 DA06 EA04 GA03 GA11 HA01 HA15 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA13 4B065 AA26X AA92X AA93Y AB01 AB05 BA02 BA08 CA24 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 BA10 CA44 DA30 DA76 EA50 FA74 【要約の続き】

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離された、ヒトの尿由来のオステオカルシンフラグメント
   であって、アミノ酸配列 【数１】 の位置１７、２１及び２４の少なくとも１つのグルタミン酸がγ−カルボキシル
   化されていることを特徴とする前記フラグメント。
2. 【請求項２】 フラグメントが請求項１に記載されたアミノ酸配列の位置７
   のアミノ酸から位置３０のアミノ酸にわたり、かつ、前記配列の位置１７、２１
   及び２４のすべての３つのグルタミン酸がγ−カルボキシル化されていることを
   特徴とする請求項１に記載のフラグメント。
3. 【請求項３】 フラグメントが、請求項１に記載されたアミノ酸配列の位置
   ６のアミノ酸から位置３０のアミノ酸にわたり、かつ、前記配列の位置１７、２
   １及び２４のすべての３つのグルタミン酸がγ−カルボキシル化されていること
   を特徴とする請求項１に記載のフラグメント。
4. 【請求項４】 請求項１、２または３に記載のヒトγ−カルボキシル化オス
   テオカルシンフラグメントに結合する能力を特徴とするモノクローナル抗体また
   は組換え抗体フラグメント。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のモノクローナル抗体または組換え抗体フラ
   グメントであって、オステオカルシンのγ−カルボキシル化フラグメントに関し
   て同定されたエピトープへの特異性を特徴とし、前記フラグメントは、請求項１
   に記載されたアミノ酸配列の、 ｉ）位置７のアミノ酸から位置３０のアミノ酸まで、または ii）位置６のアミノ酸から位置３０のアミノ酸までのいずれかにわたり、かつ
   前記配列の位置１７、２１及び２４のすべての３つのグルタミン酸がγ−カルボ
   キシル化されている前記フラグメント。
6. 【請求項６】 請求項４または５に記載のモノクローナル抗体を生産する細
   胞系。
7. 【請求項７】 請求項１に記載のγ−カルボキシル化オステオカルシンフラ
   グメントの定量的測定のための免疫学的検定法であって、前記フラグメントを含
   有する試料を、前記γ−カルボキシル化オステオカルシンフラグメントに結合す
   るモノクローナル抗体または組換え抗体フラグメントに暴露することを特徴とす
   る免疫学的検定法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の免疫学的検定法であって、オステオカルシ
   ンのγ−カルボキシル化フラグメントに関して同定されたエピトープに特異的な
   モノクローナル抗体または組換え抗体フラグメントを用いることを特徴とし、前
   記フラグメントは、請求項１に記載されたアミノ酸配列の ｉ）位置７のアミノ酸から位置３０のアミノ酸まで、または ii）位置６のアミノ酸から位置３０のアミノ酸までのいずれかにわたり、かつ
   前記配列の位置１７、２１及び２４のすべての３つのグルタミン酸がγ−カルボ
   キシル化されているものである、前記免疫学的検定法。
9. 【請求項９】 免疫学的検定法が、少なくとも２つの異なったモノクローナ
   ル抗体または組換え抗体フラグメントを用いる非競合的であることを特徴とする
   請求項７または８に記載の免疫学的検定法。
10. 【請求項１０】 前記非競合免疫学的検定法が、１段階または２段階インキ
    ュベート手順で行なわれることを特徴とする請求項９に記載の免疫学的検定法。
11. 【請求項１１】 前記用いられる２つのモノクローナル抗体が、３００５で
    あると測定されたフラグメントの、Ｃ末端エピトープ及びＮ末端エピトープを認
    識する抗体２Ｈ９及び６Ｆ９であることを特徴とする請求項９に記載の免疫学的
    検定法。
12. 【請求項１２】 前記用いられる２つのモノクローナル抗体が、測定された
    オステオカルシンフラグメント（６〜３０または７〜３０）の、Ｎ末端エピトー
    プ及びＣ末端エピトープを認識する抗体６Ｆ９及び１Ｃ４であることを特徴とす
    る請求項９に記載の免疫学的検定法。
13. 【請求項１３】 前記用いられる２つのモノクローナル抗体が、測定された
    オステオカルシンフラグメント（６〜３０または７〜３０）の、Ｎ末端エピトー
    プ及びＣ末端エピトープを認識する抗体６Ｆ９及び３Ｈ８であることを特徴とす
    る請求項９に記載の免疫学的検定法。
14. 【請求項１４】 個体における、骨のターンオーバー（生成及び／または吸
    収）の速度の測定及び／または代謝性の骨の疾患の調査のための方法であって、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載のフラグメントの定量的測定を特徴とする方
    法。
15. 【請求項１５】 請求項７〜１３のいずれか１項に記載の免疫学的検定法を
    用いることを特徴とする請求項１４に記載の方法。