JP2001512324A - ｍａｒＯＲＡＢオペロンに特異的なオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 marORABオペロンの転写産物に対して相補な、このオペロンのなかの遺伝子の発現を阻害する合成オリゴヌクレオチドを開示する。さらに、抗生物質に対する細菌の耐性を低下させる方法と、本発明のmarORAB特異的オリゴヌクレオチドを含有する薬学的製剤とを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 marORABオペロンに特異的なオリゴヌクレオチド発明の背景 本発明は、原核生物の多剤感受性の調節に関する。より具体的には、本発明は 、細菌の薬剤耐性に関連した疾患、異常、及び状態を治療するためのオリゴヌク レオチドの利用に関するものである。 細菌の抗生物質耐性及び抗菌物質耐性は、抗菌物質の出現以来、認識されてき た。過去においては、耐性の微生物が出現しても、効果的な代替的薬剤が次々と 開発されることで対処されてきた。Neu氏が報告（Science(1992)257:1064-1073 ）するように、この状況は最近劇的に変化し、罹病率及び致死率が増加しつつあ る。複数の、構造的には関係のない薬剤に対して耐性の病原体の数が増加してい ること、そして、今後１０年は新しいクラスの抗菌物質が生まれるとは考えられ ないという事実が、現在の医学的及び疫学的意義の危機の原因として非難の対象 になってきた（上述のNeuの文献を参照されたい）。このように、医学文献及び 科学文献に詳細に説かれているように、抗生物質に対して耐性の新しい細菌株の 出現を迎え撃つ効果的な治療法を作成する必要が高まってきている。 抗菌剤への耐性は、感染性の生物がもともと持っている性質かも知れず、又は 、突然変異の結果、あるいは、プラスミド及びトランスポゾンなど、染色体外遺 伝決定因子が移行した結果、その後に耐性生物が自然選択された結果かも知れな い。ここ数年で、抗生物質への耐性獲得に関与する染色体配列の役割に関心が高 まってきた。新しい染色体ストレス反応遺伝子座、多抗生物質耐性（mar）遺伝 子座が、複数の、構造的には異なる抗生物質及びその他の有害物質に対する本来 の多剤感受性／耐性に関与する染色体遺伝子の発現を制御していることが、Esch erichia coli及びEnterabacteriaceae属で示されている（Cohen et al.（1988） J．Bacteriol．170:5416-5422:Cohen et al.(1993)J.Infec.Dis.168:484-488） 。 marの遺伝子座は二つの転写単位、marC及びmarRABを含んでいると報告されて いる。各単位は、中心となる調節領域marOから分岐的に転写される（Cohen et a l.（1993）J．Bacteriol．175:1484-1492及びGoldman，J．et al.（1996）Antim icrobial.Agents Chemo.40:1266.1269）。両方のオペロンmarORAB及び marCが、Marの表現型が完全に発現するには必要である。marORABオペロンの転写 は、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、サリチル酸、及びその他の構造 上無関係の化合物により２から３倍誘起されることがある(上述のCohen et al.) 。活性化した細胞は、複数の無関係の抗生物質に対してだけでなく、酸化性のス トレス物質及び有機溶媒に対しても耐性となる（上述のCohen et al.;George,et al.(1983)J.Bacteriol.155:531-540;George et al.(1996)FEMSMicro.Let.139:1 .10)。 選択物質（例えばテトラサイクリン、クロラムフェニコール、ナリジクス酸、 リファンピン、ペニシリン、及びセファロスポリン）の存在下では、mar変異体 は10゜７の頻度で自然発生する（上述のGeorge,et al.J.Bacterlol．）。このよ うな変異体では、二次変異がよく蓄積さと報告されている。例えば、mar変異体 が、最近、E.coliのフルオロキノロン（原語：fluoroquinolone）耐性臨床分離 株の中に見いだされている（Maneewannakul et al.(1996)Antimicrob.Agents Ch emo.38:542-546）。 いくつかのmar変異体耐性株を性格付けした結果、marORABオペロンからmRNAの 構成的転写が、このオペロン中の様々な突然変異の結果として起きていることが 判明した（上述のCohen et al．）。これらの発見と一致して、mar遺伝子座の破 壊は耐性の完全な喪失と相関付けられている。耐性という表現型は、Tn5という トランスポゾン要素をE.coli染色体のmarA遺伝子に挿入することで、完全に逆転 されて感受性になった。（George et al.(1983)J.Bacteriol.155:541-548）。 抗菌剤治療にとって見通しの明るい新しい方法の一つは、アンチセンス・オリ ゴヌクレオチドと呼ばれる短い合成の核酸の鎖を用いて遺伝子発現を制御する方 法である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の阻害は、少な くとも部分的には、相補のメッセンジャRNA配列へオリゴヌクレオチドが結合す ることでその翻訳を防ぐ能力に依存している（概略的には、Agrawal(1992)Trend s in Biotech．10:152;Wagner et al.（1994）Nature 372:333-335;及びStein e t al.81993）Science 261:1004-1012を参照されたい）。投与された合成オリゴ ヌクレオチドは代替的な種類の治療薬を外生的に作り出すものであり、原核系及 び真核系の両方で用いられて成功している。 アンチセンス・オリゴヌクレオチドは抗寄生生物薬として開発されたものであ る が、そのいずれも、薬剤耐性寄生生物株の薬剤耐性表現型を逆転させるとは実証 されていない。PCT公報WO93/13740号は、P.falciparumのジヒドロ葉酸レダクタ ーゼ−チミジル酸シンターゼ遺伝子をコードする核酸を狙ったアンチセンス・オ リゴヌクレオチドを利用して、薬剤耐性のマラリア原虫の増殖を阻害する法を開 示している。Rapaport氏ら（Proc Natl.Acad.Sci.(USA)(1992)89:8577-8580）は 、クロロキン耐性及びクロロキン感受性P.falciparumの成長を、in vitroでのジ ヒドロ葉酸レダクターゼ−チミジル酸シンターゼ遺伝子を狙ったオリゴヌクレオ チドを用いた阻害を教示している。ＰＣＴ公報WO94/12643号は、P.falciparumの カルバモイルリン酸シンテターゼをコードする核酸を狙ったアンチセンス・オリ ゴヌクレオチドを開示している。Tao et al.（Antisense Res Dev(1995)5:123-1 29）は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる住血吸虫の増殖の阻害を教示 している。Jayaramanによる初期の実験の結果、E.coli 16S rRNAのシャインダル ガルノリボゾーム・ドッキング配列に相補のアンチセンス・オリゴヌクレオチド が、E.coli由来の無細胞抽出物中で細菌のmRNAの翻訳を阻害したことを示してい る（Jayaraman(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)93:709.713）。さらに、Gasparro 氏らによって、E.coliのアンピシリン耐性を抑制する光活動性のアンチセンスDN Aコンストラクトを用いた実験が行われた(Gasparro et al.Antisense Res.Dev． (1991)l:117.140)。より最近では、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチ ドホスホロチオエートを用いた実験の結果、Mycobacterium smegmatisの野生型 及び薬剤耐性株の成長を阻害することに成功している(Rapaport et al.（1996） Proc.Natl.Acad.Sci．(USA)93:709.713)。 細菌はかなりの程度で変異を起こすことが知られているが、その結果、現在入 手可能なほとんどの薬剤に対して耐性となった数多くの株が生じている。加えて 、新しい耐性細菌株が時間の経過と共に生まれる可能性がある。このように、こ れらの細菌感染を治療するためのさらなる治療薬及び効果的な方法を継続的に開 発していく必要がある。多剤耐性オペロンの不活化又は抑制という方法は、多く の抗菌物質及び環境ストレスに対するいくつかの原核生物の感受性を高めること によって細菌の耐性増加を迎え撃つという、理想的な新しい手段となることであ ろう。発明の概要 ここに開示された本発明はこの必要性を満たすものである。本発明者は、marO RABオペロンに見られる配列に相補のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、こ のオペロン中の一つ又はそれ以上の遺伝子の発現を阻害又は抑制することで、多 数の抗菌剤及び環境ストレスに対する細菌の感受性を高めることができるという ことを発見した。 この発見を利用して開発された本発明は、marORABオペロン配列由来のmRNAを 狙ったアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むが、当該アンチセンス・オリゴ ヌクレオチドは、このオペロン内の一つ又はそれ以上の遺伝子の発現を特異的に 阻害又は抑制するものであり、従って治療薬、及び、marORABオペロン配列の役 割及び生物学的意味を解明するツールの両方として有用である。 ある態様では、本発明により、marORABオペロンの転写産物に相補の、このオ ペロン中のある一つの遺伝子の発現を阻害する合成オリゴヌクレオチドが提供さ れる。 ここで用いられる場合の「オペロン」という術語は、細菌の遺伝子発現及び調 節の一単位を言う。典型的には、オペロンには、遺伝子産物の調節因子が認識可 能な核酸及び核酸中の制御要素が含まれる。marORABオペロンの場合、この核酸 には、marR、marA、及びmarBで表される遺伝子座の右向きの転写のためのプロモ ータ及びAUG開始コドンを含めた、marOで表される調節領域を含む。 本発明の目的のために、「転写産物」という術語は、DNAから転写されたリボ 核酸を言うために用いられているが、このリボ核酸の中には一つ又はそれ以上の ペプチド産物の翻訳のための基質として働くことのできるものがある。 ここで用いられる場合において、「遺伝子座」という術語は、ある特定の遺伝 子又は複数の遺伝子をコードする核酸のある染色体上の位置を言う。核酸は開始 コドンと、一つのアミノ酸残基をコードした少なくとも一つのコドンを含む。典 型的には、ある一つの遺伝子座が転写されると、少なくとも一つのmRNA転写産物 が生まれ、続いてこの転写産物が翻訳されると一つのペプチドになる。 ここで用いられる場合において、「合成オリゴヌクレオチド」という術語は、 化学的に合成された、ヌクレオチド間連結部により共有結合させたヌクレオチド のポ リマを言う。「ヌクレオチド間連結部」という術語は、このようにして少なくと も一つの５‘端から３’端向きのヌクレオチド間連結部を介してつなげたヌクレ オチド同士の間の共有結合を言う。 本発明のいくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート 、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、 ホスホラミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボ キシメチルエステル、炭酸塩、及びリン酸トリエステルのうちのいずれかから選 択される少なくとも一つのヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの別の実施例 では、オリゴヌクレオチドは、上述した連結部のうちから選択されるヌクレオチ ド間連結部に加え、少なくとも一つのホスホチオエートヌクレオチド間連結部を 含む。 いくつかの実施例では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのデオキシリ ボヌクレオチド、少なくとも一つのリボヌクレオチド、又は（複数の）デオキシ リボヌクレオチド及び（複数の）リボヌクレオチドの両方を含む。 いくつかの実施例では、合成オリゴヌクレオチドは約１５から約５０個のヌク レオチド長である。好適な実施例では、これらのオリゴヌクレオチドは約１５か ら約２１個のヌクレオチドを含む。 本発明のいくつかの特定の実施例では、marORABオリゴヌクレオチドは、配列 同定番号NO:1,NO:2，NO:3,NO:4,NO:5,及びNO:6のうちのいずれかから選択される ヌクレオチド配列を有する。 本発明の別の態様は、marORABオペロンの転写産物を、この転写産物に相補の 合成オリゴヌクレオチドに接触させるステップを含む、marORABオペロンの発現 を阻害する方法を提供するものである。本発明のいくつかの実施例では、当該オ リゴヌクレオチドは、marO,marO/R,marR,marR/A，及びmarAのうちのいずれかか ら選択される遺伝子座に相補である。本発明のさらに別の実施例では、当該オリ ゴヌクレオチドは、配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5，及びNO:6のうちの いずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む。 本発明のさらなる態様では、耐性細菌を、marORABオペロンの転写産物に相補 の合成オリゴヌクレオチドに暴露することにより、抗生物質に対する細菌の耐性 を低下させる方法が提供される。この細菌にはさらに抗生物質による処置を施し ても よい。 「抗生物質」という術語は当業において認識されており、微生物の生存率を減 少させる、又は微生物の成長又は増殖を阻害する組成を含むものである。本開示 において用いられる場合、抗生物質は、さらに抗菌物質又は殺菌物質を含むもの として意図されている。 本発明のさらなる実施例では、当該オリゴヌクレオチドは、marO,marO/R,marR ,marR/A,及びmarAのうちのいずれかから選択される遺伝子座の転写産物に対して 相補である。本発明のさらに別の実施例では、当該オリゴヌクレオチドは、配列 同定番号NO:1,NO:2,NO;3,NO:4,NO:5，及びNO:6のうちのいずれかから選択される ヌクレオチド配列を含む。 さらなる実施例では、細菌を、配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5，及び NO:6のうちのいずれかから選択される少なくとも二つの合成オリゴヌクレオチド に接触させる。 本発明のもう一つの態様は、被験者に対し、抗菌物質に対する細菌の耐性を減 少させる効果のある、marORABオペロンの転写産物に対して相補の合成オリゴヌ クレオチドを治療的量投与することにより、該被験者の細菌感染を治療する方法 に関するものである。 本発明のある一つの実施例では、当該オリゴヌクレオチドは、marO,marO/R,ma rR,marR/A,及びmarAのうちのいずれかから選択される遺伝子又は遺伝子座の転写 産物に対して相補である。本発明のさらなる実施例では、当該オリゴヌクレオチ ドは、配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3，NO:4,NO;5，及びNO:6のうちのいずれかか ら選択されるヌクレオチド配列を含む。 本発明のさらなる態様は、marORABオペロン核酸の転写産物に対して相補であ る、このオペロンの一つ又はそれ以上の遺伝子の発現を阻害する合成オリゴヌク レオチドと、生理学的に容認可能な担体とを含む薬学的に容認可能な組成である 。 ここで用いられる場合、「薬学的に容認可能な」という術語は、有効成分の生 理活性の効果に干渉しない非毒性の物質を意味する。「生理学的に容認可能な」 という術語は、細胞、細胞培養株、組織、又は生体など、生物系に適合性のある 非毒性の物質を言う。 本発明のある一つの実施例では、当該オリゴヌクレオチドは、marO,marO/R,ma rR,marR/A,及びmarAのうちのいずれかから選択される遺伝子座に相補である。 さらに別の実施例では、当該オリゴヌクレオチドは、基本的に配列同定番号NO :1,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5，及びNO:6から構成される。図面の簡単な説明 本発明の上述及びその他の目的、その様々な特徴や、本発明自体は、添付の図 面と共に以下の説明を読まれることでより充分に理解されよう。同図面において 、 図１は、本発明の代表的なオリゴヌクレオチドが標的とする配列の大体の位 置を含めた、marORABオペロンの概略図である。 図２は、本発明の代表的アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、E.coliにおい てmarA::lacZ融合体の発現を阻害する能力をグラフで示した図である。代表的オ リゴヌクレオチドはｘ軸で表され、観察されたβ−ガラクトシダーゼ活性の対応 する分光光度O.D.単位レベルを、オリゴヌクレオチド不在の対照試料に対するパ ーセントとして、ｙ軸に示す。好適な実施例の詳細な説明 本発明は、原核生物の薬剤耐性に関連した疾患及び異常を治療する上で有用で ある、marORABオペロン核酸に特異的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提 供するものである。さらに本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、病原 性における、特に薬剤耐性が関係したプロセスにおけるmarORAB配列の役割を判 断する上でも有用である。 marORAB配列は、E.coli（上述のGeorge et al.(1983)J.Bacteriol.）、Salmon ella，Shigena,Klebsiena,Citrobacter,Hafnia,及びEnterobacter菌種(Cohen et al.(1993)J.Infect.Dis.168:484-488)において報告されている。さらに、DNAの 近縁性の研究により、marORAB調節オペロンが保存されていることが判明してい る腸内細菌は、marORAB様配列が存在する可能性のあるもののごく一部であるか も知れないことが示唆された(上記のCohen et al.)。 E.coli染色体地図の34分座（1,636kbp）のmarORAB遺伝子座がクローンされて 配列決定されており、その調節が研究されている。(上記Cohen et al.；及びHac hler et al.(1991)J.Bacteriol.173:5532.5538)。図１に示すように、このオペ ロンは、marR,marA及びmarB遺伝子の右向きの転写のためのプロモーターオペレ ータ領域や、AUG開始コドンを含めた、marOで表される調節領域を含む。これら の遺伝子のコードするたんぱく質は、リプレッサたんぱく(Cohen et al．同書中 )であるmarR、その過発現が薬剤耐性につながる正の調節たんぱくMarA、及び完 全耐性表現型に必要であるがその機能は未知である小型のたんぱくMarB(上記Geo rge J.Bacteriol.;Yan et al.Abstr.1992 Gen.Meet.Am.Soc.Microbiol.A-26,p.5 )である。 本発明のオリゴヌクレオチドは、marORABオペロン核酸配列のうちで、実質的 にはmarORABオペロン内の遺伝子の発現を阻害するための標的として作用する何 らかの部分を狙うものである。 図１は、本発明のオリゴヌクレオチドに狙わせることのできる、このオペロン のいくつかの非制限的な領域を示す。marORABオペロンに特異的ないくつかの代 表的、非制限的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を以下の表１に掲載する 。 当業者であれば、marORABオペロンのヌクレオチド配列（上記Cohen et al.(19 93)J.Bacteriol.）が分かれば、このオペロンの一つ又はそれ以上の遺伝子の発 現を阻害するこれらの領域を狙ったその他のオリゴヌクレオチドを作製可能であ ろう。例えば、marORAB核酸を特異的に狙うその他の配列は、RNaseHで切断する ことができることで選択されてもよい。 本発明の実施において有用な、そして本発明の治療用組成における利用に適し た好適なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、marORABオペロンのなかの一つ 又はそれ以上の遺伝子の発現を阻害する点で特に活性のものである。ここで用い られる場合のオリゴヌクレオチドという術語には、二つ又はそれ以上のリボヌク レオチド、デオキシリボヌクレオチド、２‘置換リボヌクレオチド又はデオキシ リボヌクレオチド、あるいはこれらのモノマの何らかの組合せが含まれ、このと きこのようなモノマは、５’端から３‘端という連結部を介して接続され、この 連結部には、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの技術において公知のいかなる 連結部が含まれ ていてもよい。 オリゴヌクレオチドという術語は、さらに、化学修飾された塩基又は糖類を有 する、及び／又は、親油基、介在物質、ジアミンアダマンタン（原語：diamines adamantane）及びその他を含め、しかしこれらに限らず、置換基をさらに有す るこのようなポリマを包含するものである。例えば、本発明に基づいて用いられ るオリゴヌクレオチドは、ある一つのヌクレオチドの５‘端と別のヌクレオチド の３’端との間に、５‘端のヌクレオチドのリン酸が何らかの数のホスホロチオ エートなどの化学基に置換された、ホスホジエステルのヌクレオチド間連結部以 外の連結部を含んでいてもよい。ホスホロチオエートの連結部は混合Rp及びSp光 学異性体でも、又はこれらは立体規則性又は概ね立体規則性のRp又はSp型のいず れでもよい(Iyer et al.(1995)Tetrahedron Asymmetry 6:1051.1054を参照され たい)。 ホスホロチオエートの連結部を持つオリゴヌクレオチドは、ホスホラミジト（ 例えば、Agrawal et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:7079.7083を参照さ れたい）又はＨ―ホスホネート（例えばFroehler（1986）Tetrahedron Lett.27: 5575.5578を参照されたい）化学法など、当業において公知の方法を用いて作製 が可能である。ベルゴット氏らの説いた合成法（J.Chromatog.(1992)559:35.42 ）も利用可能である。その他の化学基の例には、アルキルホスホネート、ホスホ ロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバメー ト、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、炭酸塩、及びリン酸トリエ ステル又はこれらの組合せがある。例えば、米国特許第5,149,797号は、メチル ホスホネート又はホスホラミデートのフランキング領域の間にホスホロチオエー トのコア領域を介在させた伝統的なキメリック・オリゴヌクレオチドを解説して いる。１９９６年８月３１日に出願されたPCT出願PCT US96/13371号では、一つ 又はそれ以上のオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエート領域にフランクされた 一つ又はそれ以上の非イオン性オリゴヌクレオチド領域（例えばアルキルホスホ ネート及び／又はホスホラミデート及び／又はホスホトリエステルのヌクレオチ ド間連結部）を含む「逆方向の」キメリック・オリゴヌクレオチドを開示してい る。ヌクレオチド間連結部を修飾した様々なオリゴヌクレオチドは、公知の方法 に基づいて作製が 可能である（例えば、Goodchild(1990)Bioconjugate Chem.2:165-187;Agrawal e t al.,(1988)Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85:7079-7083;Uhlmann et al.(1990)Che m.Rev.90:534-583;及びAgrawal et al.(1992)Trends Biotechnol.10:152- 158を参照されたい）。 糖類の修飾の例には、リボース成分の２‘位置への修飾があり、この修飾には 、2'-Oを、1-6個の飽和又は不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基に置換した り、又は-O-アリール、あるいは2-6個の炭素原子を有するアルキル基に置換する ような修飾が、これらに限られる訳ではないがあり、ただしこのときこのような -O-アルキル、アリール又はアリル基は、（例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、ト リフルオロメチルシアノ、ニトロアシルアシロキシ、アルコキシ、カルボキシ、 カルバルコキシル、又はアミノ基に）、又はアミノ、又はハロゲン基に置換され なくても、又は置換されてもよい。これらの置換のいずれも、リボースの場合の 本来の２’-ヒドロキシル基又はデオキシリボースの場合の２'-H-を除外するも のでないと意図されている。PCT公報WO94/02498号は、DNAのコア領域をフランク する2'-O-で置換されたリボヌクレオチドの領域を有する伝統的なハイブリッド オリゴヌクレオチドを開示している。１９９６年８月３１日に出願されたPCT出 願PCT US96/13371号は、「伝統的な」ハイブリッドオリゴヌクレオチドに対して 「逆方向の」構造である、二つのオリゴデオキシリボヌクレオチド領域の間に2' -O-置換（又は2'OH、未置換の）RNA領域を含んだオリゴヌクレオチドを含む「逆 方向の」ハイブリッドオリゴヌクレオチドを開示している。 その他の修飾には、オリゴヌクレオチド分子の中間又は両端で行われるものが あり、この分子のヌクレオチド間リン酸連結部の位置に、例えば二つのアミノ基 の間に様々な数の炭素残基を持つコレステリル又はジアミン化合物などを加える 修飾や、切断されたり、又は反対側の鎖や、細菌のゲノムに結合する関連酵素又 はその他のたんぱく質に架橋結合する末端のリボース、デオキシリボース、及び リン酸への修飾がある。このような修飾されたオリゴヌクレオチドの例には、修 飾塩基及び／又はリボースの代わりのアラビノースなどの糖類を持つオリゴヌク レオチドや、その３‘端又は５’端位置の一方又は両方でヒドロキシル又はリン 酸基（その３‘端又は５’端位置で）以外の化学基に結合した糖類を有する３‘ 、５’置換オリゴヌ クレオチドがある。その他の修飾オリゴヌクレオチドは、それらの３‘端及び／ 又は５’端で、ヌクレアーゼ耐性をもたらす大型の置換基のキャップをしたもの か、又は、ヌクレオチド一個毎に一方又は両方の非架橋酸素に置換を有するもの である。このような修飾は、ヌクレオチド間の連結部のいくつか又はすべてにあ ってもよく、またオリゴヌクレオチドの一方又は両方の末端、及び／又は、この 分子の内部にあってもよい（Agrawal et al.(1992)Trends Biotechnol.10:152-1 58で検討）。 好ましくは、本発明に基づいて用いられるオリゴヌクレオチドは、約７から約 ５０個のヌクレオチド、より好ましくは約１２から３５個のヌクレオチド、例え ば１２から約３０個、そして最も好ましくは約１５から約２１個のヌクレオチド を有することであろう。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、標的と するmarORABオペロンのmRNA転写産物の少なくとも一部に相補であるために、こ のオリゴヌクレオチドが、生理学的条件下でこのようなmRNA転写産物の少なくと も一部にハイブリダイズする又は結合することができるものであるとよい。ハイ ブリダイゼーションは、通常、mRNA転写産物の相補鎖同士の間で塩基特異的水素 結合が起きて好ましくはワトソン−クリック又はフーグスティーンの塩基対が形 成される結果であるが、その他の水素結合の形態や、塩基の積み重ねの結果ハイ ブリダイゼーションが起きることもある。 何らかの理論又は機構の制限を受けるわけではないが、本発明に基づいて用い られるオリゴヌクレオチドの活性は、大まかには、当該オリゴヌクレオチドが、 標的とする核酸へ（例えばそのmRNA転写産物の少なくとも一部分へ）結合するこ とで、その標的の機能を、ハイブリダイゼーション停止か、又はRNaseHによる標 的RNAの破壊（RNAにハイブリダイズしたときにRNaseHを活性化させる能力）のい ずれかによって損なわせるという能力に依存すると考えられる。生理学的条件下 でのこのようなハイブリダイゼーションは、実際には、核酸配列の機能に対する 干渉を観察することにより測定される。 このように、本発明に基づいて使用される好適なオリゴヌクレオチドは、標的 の核酸と適した二本鎖（又はフーグスティーンの塩基対機構による三本鎖）を形 成し、RNaseHを活性化させ、それにより標的のＲＮＡ分子転写産物の効果的な破 壊を起こさせることができるものであり、さらにin vivoでの溶核分解（例えば エンドヌ クレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性）に耐えることができるものである。上 述したオリゴヌクレオチドに対する数多くの修飾や、当業において公知のその他 の修飾により、これらの好適な性質のそれぞれに特異的かつ成功裡に対処できる 。 治療用製剤の形の本発明の合成アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、原核生 物の薬剤耐性に関係した疾患、及び異常、並びに状態を治療する上で有用である 。このような製剤には、生理学的及び／又は薬学的に容認可能な担体が含まれる 。担体の性質は投与の経路に応じて異なるであろう。このような組成には、合成 オリゴヌクレオチド及び担体に加え、希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、 可溶化剤、及びその他の当業において公知の物質が含まれていてもよい。本発明 の薬学的組成には、さらに、marORABオペロン配列の発現の阻害を向上させる又 は原核生物の薬剤耐性を低下させることとなるような、その他の活性因子及び／ 又は物質が含まれていてもよい。例えば、それぞれがmarORABオペロンの異なる 領域からできた転写産物を狙った、合成オリゴヌクレオチドの組合せを、本発明 の薬学的組成に用いてもよい。本発明の薬学的組成には、さらに、ペニシリン、 セファロスボリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、マクロライド、テトラ サイクリン、リンコシド、キノロン、クロラムフェニコール、バンコマイシン、 メトロニダゾール、リファンピン、イソニアジド、fm-ブチルエタンブトール、 スペクチノマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、及びその他が 含まれていてもよい。 このような付加的な因子及び／又は物質を当該薬学的組成に含めることで、本 発明の合成オリゴヌクレオチドとの相乗作用を生じさせたり、又は本発明の合成 オリゴヌクレオチドにより引き起こされる副作用を軽減しようとしてもよい。 本発明の薬学的組成は、本発明の合成オリゴヌクレオチドが、その他の薬学的 に容認可能な担体に加え、例えば、水溶液中にあるミセル、不溶性の単層、液晶 、又は層状の層として凝集型で存在する脂質などの両親媒性物質に組み合わされ たリポソームの形状であってもよい。リポソーム製剤にとって適した脂質には、 モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、ホスホリピド、 サポニン、胆汁酸、等々があるが、これらに限定されるわけではない。特に有用 な脂質担体の一つはリポフェクチンである。このようなリポソーム製剤の調製は 、例えば米国特許第4,235,871号、米国特許第4,501,728号、米国特許第4,837,02 8号及び米国 特許第4,737,323号に開示されているように、当業において通常の技術である。 本発明の薬学的組成には、さらに、Habus氏らが説く(Bioconjug．Chem．(1995)6 :327-331)ように、細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を向上させるシクロデ キストリン等々の化合物や、又は、遅延放出ポリマを含めてもよい。 ここで用いられる場合の「治療上効果的な量」という術語は、患者にとって有 意義な利点、即ち細菌の薬剤耐性に関連した状態の治癒を示すのに充分な各有効 成分の総量の当該薬学的組成又は方法を意味する。単独で投与された個々の有効 成分について言う場合、この術語はこの成分単独について言う。組合せに用いら れた場合、この術語は、組み合わせで、順次又は同時に投与されるに関係なく、 治療効果をもたらす有効成分の合計量を言う。 本発明の治療又は利用の方法を実施する際には、治療上有効量の本発明による 合成オリゴヌクレオチドの一つ又はそれ以上が、細菌の薬剤耐性に関連した疾患 、異常又は状態に罹患した被験者に投与される。本発明の合成オリゴヌクレオチ ドを、本発明による方法に基づき、単独で、又はその他の公知の治療と組み合わ せて投与してもよい。一つ又はそれ以上のその他の治療と同時投与する場合、本 発明の合成オリゴヌクレオチドを、このその他の治療と同時に、又は順次投与し てもよい。順次投与する場合、担当医師が、その他の治療と組み合わせたときの 本発明の合成オリゴヌクレオチドを投与する適切な順序を決定することとなる。 本発明の薬学的組成に用いられた、又は本発明の方法を実施するための、当該 合成オリゴヌクレオチドの投与は、例えば経口摂取、吸入、又は皮膚、皮下、筋 肉内、又は静脈内注射など、様々な従来の方法で行なうことができる。 本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療上有効量を経口投与する場合、この合 成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液又はエリキシルの形状で あるであろう。錠剤形で投与される場合、本発明の薬学的組成は、さらにゼラチ ン又はアジュバントなどの固形の担体を含んでいてもよい。錠剤、カプセル、及 び粉末は、約５から９５％の合成オリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは 約２５から９０％の合成オリゴヌクレオチドを含むとよい。液体形で投与する場 合、水や、石油、ピーナツ油、鉱油、ダイズ油、ゴマ油などの動物又は植物起源 の油脂、あるいは合成油脂を加えてもよい。液体形の当該薬学的組成には、さら に、生理食塩水、デキ ストロース又はその他のサッカリド溶液、又はエチレングリコール、プロピレン グリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールを含めてもよい。液体 形で投与する場合、当該薬学的組成は、約０．５から９０重量％の当該合成オリ ゴヌクレオチドを含むが、好ましくは約１から５０％の合成オリゴヌクレオチド を含むとよい。 治療上有効量の本発明による合成オリゴヌクレオチドを静脈内、皮下、筋肉内 、眼内、又は腹腔内注射により投与する場合、当該合成オリゴヌクレオチドは、 発熱物質なしの非経口的に容認可能な水溶液の形であろう。ｐＨ、等張性、安定 性、等々の適切なこのような非経口的に容認可能な溶液の調製は当業の標準的技 術である。静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は眼内注射のために好適な薬学的 組成は、当該合成オリゴヌクレオチドに加え、生理食塩液、リンガー液、デキス トロース液、デキストロース及び生理食塩液、乳酸加リンゲル液、又は当業にお いて公知のその他の伝播体などの等張性の伝播体を含んでいるはずである。本発 明の薬学的組成はさらに、安定剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、又はその他の当 業者に公知の添加剤を含んでいてもよい。 本発明の薬学的組成中の合成オリゴヌクレオチドの量は、治療しようとする状 態の性質及び重篤度、及びその患者が施されたそれまでの処置の性質に依存する こととなる。最終的には、担当医師が、各個々の患者を治療する合成オリゴヌク レオチドの量を決めることとなる。まず、担当医師は低用量の合成オリゴヌクレ オチドを投与し、患者の応答を観察することとなるであろう。その患者について 最適な治療効果が得られるまで、合成オリゴヌクレオチドの用量を増やして投与 していき、得られたその時点以降は用量は増加させない。本発明の方法において 投与される薬学的組成の用量は、１日当り０．１から５．０mg/kg体重を含むは ずであるが、好ましくは１日当り０．１から２．０mg/kg体重を含むとよい。全 身投与する場合、当該治療用組成は、好ましくは約0.01μＭから約10μＭのオリ ゴヌクレオチド血中レベルを達成するのに充分な用量投与されるとよい。 本発明の薬学的組成を用いた静脈内治療の期間は、治療しようとする疾患の重 篤度と、各個々の患者の状態及び特異体質的反応の可能性とに応じ、様々であろ う。最終的には、担当医師が、本発明の治療用組成を用いた静脈内治療の適した 期間を 決定することとなろう。疾患によっては急激な治療が向いており、一方、長期間 の治療が必要なものもある。 marORABオペロン配列に特異的な本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド は、病原性における、より具体的には薬剤耐性が関係するプロセスにおけるこれ らの配列の役割を判断する上で有用である。例えば、細菌の薬剤耐性を阻害する アンチセンス技術の効験は、野生型のリプレッサmarRのものに比較して測定され た。野生型marRの阻害作用を測定するために、marR配列を含むDNAベクタを、mar ORABオペロンの制御下にあるlacZ配列を含む二つの異なる融合細胞株に導入して 発現させた。用いた細胞株は野生型AG100（上記George et al．(1983))及びmar 変異株AG102であった。野生型リプレッサmarRは、アッセイされた細菌株に応じ て９から47分の１に、二つの異なる融合株からのlacZの発現を減少させた。 次に、marORABオペロンの制御下にある配列の発現を阻害する上でのアンチセ ンス技術の可能性を調べるために、アンチセンス方向にクローンされたmarR及び marA遺伝子の両方を含むDNAベクタ（pKMN23）を調べて、marA-lacZ翻訳融合株か らのβ−ガラクトシダーゼ活性の産生をこれが阻害できるかどうかを調べた。よ り具体的には、pKMN23をKMN14（marO^*RA-lacZ）及びKMN-18(marORA-lacZ)細胞中 で調べた。KMN14及びKMN18の両方とも、marA配列をlacZと同じこの翻訳融合体に 含む翻訳融合細胞株である。KMN14は、marR領域にmar-R2変異を含む変異体であ る。結果を表２に示す。 上に示すように、アンチセンスmarA配列を含んだプラスミドは、融合株からの LacZの発現を５から49分の１の間に低下させることに成功しており、野生型のリ プレッサMarRを加えたときに観察されるものに匹敵する阻害作用を達成した。 アンチセンスmarA配列の阻害効果をさらに実証するために、様々な抗生物質( テトラサイクリン(Tet)，クロラムフェニコール(Cml)，アンピシリン（Amp）及 びリファンピシン(Rif)の存在下でKMN23(アンチセンス方向でクローンしたmarR 及びmarA遺伝子の両方を含む、上述したDNAベクタと同じもの)も発現させた。KM N23の効果を、実施例９に説くように勾配プレート法により細胞成長阻害を測定 することにより評価した。結果を表３に示す。 上に示すように、アンチセンス・コンストラクトにより、様々な無関係の抗生 物質に対する耐性が低下しており、marORABオペロンに関係した配列を狙ったア ンチセンス配列が、細菌の薬剤耐性を阻害する理想的なツールであることを証明 している。 アンチセンス・オリゴヌクレオチドの阻害作用を最適化するために、KMN18細 胞（上述したmarORA-lacZ融合E.coli細胞株）を、次第に濃度を濃くしたアンチ センス・オリゴヌクレオチド（10-20μＭ）と共にインキュベートした。marA配 列の転写を、サリチル酸ナトリウムを加えることで誘起した。60分間置きに試料 をβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。図２に示すように、２０μ Ｍの濃度で加えたオリゴヌクレオチドはすべて、marA-lacZ活性を低下させた。 対照のオリゴヌクレオチド101C(配列同定番号NO:7)ではmarA-lacZ活性に何ら低 かは見られなかった。さらに、アンチセンス・オリゴヌクレオチド92（配列同定 番号NO:1）及び1284（配列同定番号NO:6）は、marORA-lacZ融合たんぱくを構成 的に発現している細胞株（KMN14）からのmarA-lacZ活性を低下させた（データは 図示せず）。 ノルフロキサシンの殺菌作用に対する本発明のオリゴヌクレオチドの向上作用 を確認すべく、ML308-225-C2（単離されたMar変異E.coli株）を、次第に濃くし た濃度の代表としてのアンチセンス・オリゴヌクレオチド92(配列同定番号NO:1) 、又はオリゴヌクレオチド1284(配列同定番号NO:6)、あるいは対照オリゴヌクレ オチド1403(配列同定番号NO:8)、（オリゴヌクレオチド1284をスクランブルした 配列）で処置した。表４は、複式実験でのアンチセンス・オリゴヌクレオチド12 84に関する結果を要約したものである。 図示のように、ML308-C2に対するノルフロキサシンの殺菌作用は、アンチセン ス・オリゴヌクレオチド1284（配列同定番号NO:6）を加えることで著しく向上し た。 抗生物質の抗菌作用に対する、当該オリゴヌクレオチドの濃度を増加させた場 合の影響を確定するために、Mar変異細胞を、０．５mg/mlのノルフロキサシンの 存在下で最終濃度２０、４０、１００及び２００mMのオリゴヌクレオチド1284( 配列同定番号NO:6)で１時間処置した。様々な濃度のオリゴヌクレオチド1284(配 列同定番号NO:6)の存在下での細胞成長を、未処置の細胞で観察されたものと比 較した。結果を表５に示す。 オリゴヌクレオチド1284（配列同定番号NO:6）について上に示したように、本 発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ノルフロキサシンなどの抗生物質 の抗菌作用を高める。 観察された阻害作用がmarORABオペロンからのRNAの伝令の抑制を引き起こす特 異的アンチセンス作用であることを確認すべく、細菌の成長に対するオリゴヌク レオチド1284（配列同定番号NO:6）の作用を１又は２時間のオリゴヌクレオチド 処理の後に測定した。細菌の成長は、スクランブルした陰性対照オリゴヌクレオ チド1403(配列同定番号NO:8)で処置した後に観察されたものに比較した。濃度４ ０及び１００μＭのアンチセンス・オリゴヌクレオチド1284及びスクランブルし たオリゴヌクレオチド1403は、抗生物質の不在下では細胞生存率に何の変化もも たらさないことが示された。これらの結果は、表４で上に見られたオリゴヌクレ オチドの殺菌作用は、オリゴヌクレオチドの存在のみの結果ではなく、殺菌剤と 、本発明のmarORABオリゴヌクレオチドとの組合せの作用の結果であることを実 証するものである。 以下の実施例は、本発明を作製する及び実施する好適な形態の実例を挙げたも のであり、同じような結果を得るには代替的な方法を利用可能であろうため、本 発明の範囲を限定するものとして意図されたのではない。 実施例１ オリゴヌクレオチドの作製 以下のホスホチオエートオリゴヌクレオチド:92(配列同定番号NO:1),93(配列 同定番号NO:2),1281(配列同定番号NO:3),1282(配列同定番号NO:4),1283(配列同 定番号NO:5),1284(配列同定番号NO:6),101C(配列同定番号NO:7),1403(配列同定 番号NO:8),RK1,(配列同定番号NO:9),A2,(配列同定番号NO;10),LZ,(配列同定番号 NO:11)，ORAB2,(配列同定番号NO:12)，及びRK3,（配列同定番号NO:13）の作製を 、合成装置（スウェーデン、アップサラPharmacia Gene Assembler Series Synt hesizer,Pharmacia LKB Biotechnology)により、標準的なb-シアノエチルホスホ ラミジト法(Agrawal(1994)Methods in Molecular Biology 26:1-72のSonveaux"I Protecting Groups in Oligonucleotides Synthesis"を参照されたい、またUhlm ann et al.(1990)Chem.Rev.90:543.583).Agrawalも参照されたい)及びアミジト （スコットランド、グロスゴーCruachem社製）並びに保持体(マサチューセッツ 州ベッドフォードMillipore社製)を用いて行なった。このランダムな20-量体ホ スホジエステルは、各位置に等モルのＡ，Ｃ，Ｇ及びＴの混合を含んでいた。 この保持体を1mlのNaOH水で５５℃で１６時間処置してDNAの保護をはずした。 次にアンモニアをこの保持体から取り除き、保持体を200mlの水で洗浄し、二つ の留分をプールして凍結乾燥した。このオリゴヌクレオチドを、構築及び保護解 除後に２回エタノール沈殿させ、乾燥し、所望の濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ PBS）中に懸濁させた。 これらのオリゴヌクレオチドの純度を、毛細ゲル電気泳動及びイオン交換HPLC により調べた。このオリゴヌクレオチドのプレパラート中のエンドトキシン量は 、ルミナス・アメボサイト・アッセイ（原語：Luminous Amebocyte Assay）(Ban g（1953）Biol.Bull.(Woods Hole,MA)105:361-362)を用いて判定された。 実施例２ コンストラクトの作製 Ａ． ML308.225のMar変異体の選択 ML308-225(Rahman et al.(1991)Antisense Res.Dev.1:319-327)の抗生物質耐 性変異株を成長させ、LBブロスで３０℃に維持した。これらの変異株は、一晩洗 浄した培養株を、クロラムフェニコール(5μg/ml，ミズーリ州セントルイスSigm a社製)を含んだLB寒天プレートに拡げて選択され、３０℃で４８から７２時間イ ンキュベートされた。４８時間後に現れた一個のコロニを選んでさらなる研究に 用いた。耐性コロニを、抗生物質勾配プレートを用いて複数の抗生物質耐性につ いて観察した。 テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ナリジクス酸、及 びノルフロキサシンに対する最小阻害濃度（以後MICと呼ぶ）が上昇したことを 示した変異株の一つを選択し、ML308-C2と命名した。配列決定の結果、marRの とが確認された。野生型のmarR(pMAL-marR)をML308-C2内にクローンすると、MIC は野生型ML308-225株の発現するレベルのものまで低下した（未公開データ）。m arA DNAプローブを用いたノーザン分析の結果、ML308-C2はmarAを過発現するこ と、そしてMar変異体であることが確認された（未公開データ）。これらの結果 は、配列データと関連させると、marRの変異がML308.C2株におけるMar表現型を 担っているという結論を裏付けるものである。 Ｂ． pDW10及びpDW11の構成 プラスミドDNAをPromega Wizard^TMPrep Kit(ウィスコンシン州マジソン)を用い て作製した。制限エンドヌクレアーゼ及びT4DNAリガーゼ（マサチューセッツ州 ビバリー、New England Biolabs社製）をメーカの示した条件下で用いた。PCR増 幅はPerkin Elmer CetusDNAサーマル・サイクラー480を用いて行なった。Tagポ リメラーゼ及び試薬(コネチカット州ノーウォーク、Perkin Elmer Cetus社製)を 指示された通りに用いて目的の配列を増幅した。mar遺伝子座の公知のDNA配列(G enBank受け入れ番号#M96235)に基づき、コドン配列をフランクするPCRプライマ を作製し、このプライマによりmarA及びmarORABオペロン領域を増幅し、次にこ れらをpBLUESCRIPT KS（カリフォルニア州ラホーラ、Stratagene社製）のT7プロ モータの後ろにクローンした。marAPCRプライマをデザインしてmarA コドン配列を1893.2282塩基対から増幅して389塩基対の産物を得た。同様にmarO RABPCR産物（1281塩基対）も、公開された配列から1311-2592塩基対からmarORAB のDNA配列を増幅するよう設計されたプライマを用いて作製した。EcoRI及びPstI のための制限エンドヌクレアーゼ部位をPCRプライマの両端に組み込んで、pBLUE SCRIPTにクローンされたときに断片の挿入が確実に正しい方向で行われるように した。pBLUESCRIPT-marAはpDW10と、そしてpBLUESCRIPT-marORABはpDW11と名付 けられた。正しいDNA断片がクローンされたことを確かめるために、クローンさ れたPCR産物のDNA配列を、Sanger氏らの方法（Proc．Natl．Acad．Sci．USA（19 77）74:5463.5467）によりSequenase^TMシークエンシング・キット(オハイオ州ク リーブランド、U.S.Biochemical社製)を用いて決定した。 実施例３ 標的のRNAの転写 それぞれ10μｇのプラスミドpDW10(marA)及びpDW11(marORAB)を、HindIII(マ サチューセッツ州ビバリー、New England Biolabs社製)又はEcoRI(マサチューセ ッツ州ビバリー、New England Biolabs社製)を用い、提供された適した緩衝液及 び100Uの制限酵素の１倍の希釈液を含んだ50μｌの反応液中で線形にした。切断 は３７℃で２時間かけて行なわせた。この時間後、反応液を緩衝フェノール/CHC l3(1:1)で２回、CHCl₃/イソアミルアルコール(24:1)で２回抽出し、３容量の沈 殿混合液(66mMの酢酸ナトリウムのエタノール溶液)で沈殿させた。マイクロフュ ージで２０分間遠心分離してDNAを取り出し、７０％のエタノールで洗浄し、真 空下で急速に乾燥させた。その結果得られたペレットを２０μｌの水の中に再懸 濁させ、必要になるまで凍結させた状態で保管した。 ヒドロキシル基を持つRNAを、この線形にしたプラスミドから、１倍の提供さ れた緩衝液、それぞれ１mMのrATP,rCTP,rUTP、0.9mMのグアノシン、0.1mMのGTP 、２U/mlのRNasin(ウィスコンシン州マジソン、Promega社製)、２μgの線形プラ スミド及び2.5μlの50,000U/ml T7 RNAポリメラーゼ(マサチューセッツ州ビバリ ー、New England Biolabs社製)を記載した順序で加えられて含んだ 20μlの反応液中で転写させた。この反応液を３７℃で１時間インキュベートし 、１単位のRQ1 DNase(ウィスコンシン州マジソン、Promega社製)を加えた。37℃ で15分間DNAを蒸解させた後、ProbeQuant G-50スピン・カラム(ニュージャージ ー州ピスカタウェイ、Pharmacia Biotech社製)及びこのメーカのプロトコルを用 いて精製した。この結果、marORAB転写産物を含んだ約５０μｌの溶液が生成さ れた。この時点で、１アリクォートの転写産物の完全性を1％のアガロースTBEゲ ルによる電気泳動及びエチジウムブロミドによる染色で調べた。 実施例４ 標的RNAの放射性標識付け 転写産物に10μlの転写産物（転写の５分の１）、２μlの提供されたT4ポリヌ クレオチドキナーゼ緩衝液、5μlのg-³²P-ATP(オハイオ州クリーブランド、Amer sham社製、10mCi/ml)、１μlの40U/ml Rnasin、及び２μlの10U/μl T4ポリヌク レオチドキナーゼ(マサチューセッツ州ビバリー、New England Biolabs社製)を 含有する２０μｌの反応液中で³²Pの放射性標識を付けた。３７℃で１時間イン キュベートした後、上述したようにスピン・カラムを用いて転写産物を精製し、 約５０μｌの体積の放射性標識付された転写産物を生成した。転写産物の完全性 は、変性ポリアクリルアミド電気泳動及びオートラジオグラフィにより調べられ た。 実施例５ 標的のRNAのうちの利用可能な部位のRNaseHマッピング RNaseHをRNA/DNA二本鎖に対するプローブとして用いてオリゴヌクレオチドを 結合させるのに利用可能な部位のマッピングを、５μlの放射性標識付した転写 産物、１μlの10X RNase H緩衝液(400mMのTris-HCl,pH7.4,40mMのMgCl₂,10mMの ジチオスレイトール)、0.5mlの40U/μl Rnasin、１μlの500mMのランダムな20- 量体(加熱及び急速冷却したもの)、及び1.5μlの水を含有する１０μｌの反応液 で行なった。この混合液を室温で９０分間インキュベートし、１μlの１U/ml RN ase H(インディアナ州インディアナポリス、Boehringer Mannheim社製) を加えた。これで完全な反応が構成される。ランダムな20-量体か、RNase Hか、 又は両方、のいずれかを欠いた対照反応も並行して行なわせた。室温で20分間置 いた後、10μlのホルムアルデヒド付加染料を加えて反応を停止させた。試料を ５分間、９５℃まで加熱して変性させ、７μlを4％のポリアクリルアミド変性ゲ ルで電気泳動させて分析した。利用可能な部位は、反応が完全に起きたレーンに 特有の放射性標識付けされた断片が豊富に含まれていることで判別した。生じた RNA断片の長さを、放射性標識付されたDNA制限ラダーに比較することで計算した 。このラダーは、公知の長さのRNAに照らして予め目盛が付けられたものである 。 オリゴヌクレオチドの結合に利用可能な部位は、MarRの５‘の翻訳されない領 域（塩基1401から1450）及びコドン領域（塩基1708から1727）や、MarAの翻訳開 始点（塩基1890から1950）及びコドン領域（2040から2075）の両方に見られた( 番号はGasparro et al.(1991)Antisense Res.Dev.1:117-140に基づく)。 実施例６ 染色体marA-lacZ及びmarORA-lacZ融合体の構築 翻訳融合プラスミド（pMLB1034）及び転写融合プラスミド(pMBL1109)をmarA-l acZ融合体を構築するために用いた。marOR及び144塩基対のmarAを含有する818塩 基対のDra1断片を、この融合プラスミドのSma1部位にクローンした。その結果得 られるプラスミドpKMN14及びpKMN18は、marA融合体をlacZと同じ翻訳フレームに 有する。プラスミドpKMN19及びpKMN21はmarAをプロモータのないlacZ遺伝子の上 流位置に挿入させているため、転写融合体ができている。pKMN14及びpKMN19のma rOR(A)断片はpHHM191プラスミドを由来とするが、このプラスミドは、ミッセン ス突然変異をmarRの４５番目のアミノ酸に有しており、一方、pKMN18及びpKMN21 は、野生型pHHM183プラスミドを由来とするmarOR(A)を有する。marRのXmnI部位 からmarAのDra1部位までを持つ５６塩基対の断片もまた、これら融合プラスミド に挿入して、pKMN16というa marA-lacZ翻訳融合プラスミドと、pKMN21というmar A-lacZ転写融合プラスミドにした。 プラスミドpKMN14、pKMN18、及びpKMN16のなかのそれぞれmarOR^*A-lacZ、marO RA-lacZ、及びmar(R)A-lacZ翻訳融合体を部位特異的組換えメカニズムによりASS 111の染色体中に形質導入したが、このASS111は、，1.24kbのmarORAB欠失を含む と共に、lacZ，phoA'，及びrecAである。最初に、これらの融合プラスミドを、r ecA’株である(Seone，A．et al．(1996)J．Bacteriol．177:530.535)ASS11Oに 個々に形質転換させた。この転換体をλRZ5に感染させて、λRZ5(marA-lacZ)組 換え体を形成させた。この組換え体溶解産物を用いてプラスミドのないASS110株 及びアンピシリン耐性(50μg/ml)溶原を選別した。次に、これらの精製溶原から 得られた溶解産物を用いてASS111を感染させた。 アンピシリン耐性溶原性の染色体DNAにmarA-lacZ融合体があるかを、PCRによ ってmarR-lacZ断片及びmarA-lacZ断片について確認した。marRの５‘端にハイブ リダイズすることのできるプライマRK1(5'-GTGAAAAGTACCAGCGATCTG-3';配列同定 番号NO:9)をmarR-lacZ断片の増幅に、そしてmarAの５’端にハイブリダイズする ことのできるプライマA2(5'-GGTGAATTCATGACGATGTCCAGACGC-3';配列同定番号NO: 10をmarA-lacZ断片の増幅に用いた。lacZの中間部分にアニールすることのでき るプライマLZ(5'-ATGTGCTGCAAGGCGAT-3';配列同定番号NO:11)をlacZプライマと して両方の構築で用いた。 実施例７lac 及びT7プロモータのもとでのmarR及びアンチセンスmarAのクローニング プライマORAB2(5,-GGACTGCAGGCTAGCCTTGCATCGCAT-3';配列同定番号NO:12)はma rO(Gen Bank配列#M96235)のヌクレオチド1311から1328にハイブリダイズしてPSt I部位を生ずる。プライマRK3(5'-TCTTGAATTCTTACGGCAGGACTTTCTTAAG-3';配列同 定番号NO:13)はmarRの３‘端のヌクレオチド1858から1879にハイブリダイズして EcoR1部位を生ずる。これらのプライマを、野生型AG100 E.coli及びMar変異AG10 2株からmarOR遺伝子を増幅するのに用いた。その結果得られた570塩基対のPst1- EcoR1PCR断片を、pSPORT1を由来とするカナマイシン耐性のpSPOKプ ラスミド(ワシントンD.C.、Gibco/BRL社製)のPst1-EcoR1部位にクローンした(上 記Manneewannakul et al.(1994))。このmarOR/pSPOKプラスミドでは、それぞれl ac又はT7プロモータから、IPTG又はT7 RNAポリメラーゼによりmarR遺伝子の発現 を誘起することができる。 marRのSacII部位からmarAのDra1部位までの４７３塩基対の断片をpSPOK.のSna B1部位に挿入した。その結果得られたコンストラクトpKMN23では、marA遺伝子は pSPOKのlacプロモータの反対方向を向いているが、このコンストラクトをアンチ センスmarAコンストラクトに選択した。クローニング・ベクタpMLB1034又はpMLB 1109を用いて、転写及び翻訳融合体の両方でmarAをlacZに融合させた。これらの 融合体を前に説明したmar欠失株に導入した。さらに、marRの330塩基対及びmarA の143塩基対から成る473塩基対部分をlacプロモータ/T7ポリメラーゼ系の後ろに アンチセンス方向でクローンした(pKMN23が生成された)。 実施例８ E ．coliのDNA形質転換及びオリゴヌクレオチド処理 細菌株へのDNA形質転換を上記Cohen et al.JBacteriol.(1993))が前に説いた ようなCaCl₂法を用いて、又は電気穿孔法により行なった。コンピテント細胞(10⁵ )を、様々な濃度のmarORAB又は対照オリゴヌクレオチドを容れたチューブに移 した。オリゴヌクレオチドの取り込みを、１分間の熱ショック（４２℃）又は電 気穿孔により誘起し、試料を３０℃で１又は２時間、インキュベートした。実験 に応じて、オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートした株を、β−ガラクト シダーゼ・アッセイ、又はコロニ形成及び／又はタイム・キル実験（原語：time kill experiment）に用いた。 実施例９ 勾配プレートアッセイ 塩酸テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン 、リファンピン、ナリジクス酸及びノルフロキサシンに対する細菌の感受性を、 勾配 プレート法によりアッセイした(Microbiology:Including Immunology及びMolecu lar Genetics(3rd ed.)(Davis et al．eds.(1980)J.P．Lippincott Co.,Philade lphia,PA)。 実施例１０ β-ガラクトシダーゼ・アッセイ アンチセンス・オリゴヌクレオチドのある、又はない株KMN14及びKMN18を３０ ℃で中間対数期まで成長させた。５０マイクロリットルのコンピテント細胞を適 したオリゴヌクレオチドで処置し、１分間熱ショックを与え、室温で３０分間イ ンキュベートして、オリゴヌクレオチドをmRNAにアニールさせた。次にLBブロス を1mlまで加え、細胞／オリゴヌクレオチドの混合液を３０℃で３０分間インキ ュベートした。３０分間のインキュベート後、KMN18（野生型）に５mMサリチル 酸ナトリウムを加えて誘起し、一方KMN14は誘起しなかった（構成的にmar mRNA を発現させた）。次に、細胞／オリゴヌクレオチドの混合試料を１時間間隔で取 り出し、Miller氏の方法（Immunochemistry(1972)でβ-ガラクトシダーゼについ てアッセイした。 実施例１１ KMN18 のβ-ガラクトシダーゼ活性の阻害 E.coliKMN18株(marORA-lacZ融合細胞株)では、marA転写産物は５mMのサリチ ル酸ナトリウムを３０分間のインキュベート後に加えると誘起可能であった。KM N18を、次第に濃度を濃くした（4-20μＭ）のアンチセンス・オリゴヌクレオチ ドと共にインキュベートした。次に細胞を５mMのサリチル酸で誘起した。試料を ３０分後及び６０分間隔で取り出し、β-ガラクトシダーゼ活性についてアッセ イした。サリチル酸と一緒に３０分間及び６０分間インキュベートすると、２0 μＭの濃度のときのオリゴヌクレオチド92及び1284はmarA-lacZ活性を低下させ ていた（図２）。対照オリゴヌクレオチド101はmarA-lacZ活性の低下を示さなか った。20μＭで、同じ及びさらに別のオリゴヌクレオチド、すなわち1403、スク ランブルした1284、を調べた。４つの別々の実験で、オリゴヌクレオチド92 及び1284は著しい活性を呈した。これらの研究の結果、アンチセンス・オリゴヌ クレオチド92及び1284はLacZの発現に用量応答作用を呈することが示された。 実施例１２marORAB 特異的オリゴヌクレオチドを用いた、ノルフロキサシンの殺菌作用の増 強 ML308-225-C2のコンピテント細胞(Mar変異株)(50μl，10⁷細胞）を、次第に濃 度を濃くしたアンチセンス・オリゴヌクレオチド1403，92,又は1284と共に３０ 分間、氷上でインキュベートした。この細胞／オリゴヌクレオチド混合液に、４ ２℃で１分間熱ショックを与えるか、又は電気穿孔し（て取り込みを行なわせ） た。この細胞懸濁液を氷上に２分間置いた後、室温に３０分間置いて、アンチセ ンス・オリゴヌクレオチドをmRNAに結合させた。LBブロス（450μｌ）をこの混 合液に加え、この混合液を１及び２時間、３０℃でインキュベートした。３０℃ で３０分間インキュベートした後に、1XのMICのノルフロキサシン(0.5μg/ml)を 細胞懸濁液に加えた。１時間ノルフロキサシンに暴露した時点で、100μｌアリ クォートの細胞／オリゴヌクレオチド混合液を回収し、PBSで希釈し、この様々 な希釈液をLB寒天プレートに塗った。３０℃で一晩インキュベートした後、コロ ニの数をすべてのプレートで計数した。すべての実験において、試料は複式又は 三重にして塗抹し、プレート上のすべてのコロニを計数した。 アンチセンス・オリゴヌクレオチド1284(配列同定番号NO:6)は、ノルフロキサ シンのML308-C2に対する殺菌作用を上に表４に示すように向上させた。二つの別 々の実験で、100-200μＭの方が、20-40μＭのオリゴヌクレオチドよりもより大 きな作用があった。こうしてオリゴヌクレオチド1284を、そのスクランブルされ た対照1403(配列同定番号NO:8)に比較して、その作用がmarRAB RNAの伝令を抑制 することを狙った特異的アンチセンス作用であるかを判定した。40及び100μＭ の濃度を表４の結果に基づいて選んだ。表５に示されるように、対照オリゴヌク レオチド1403の存在単独では、細胞の生存率に何ら変化はなかった。1XMICのノ ルフロキサシンに１時間暴露した後では、1284では生存率に２３％の低下が見ら れたが、対照的に1403では6％であった。この作用は、２時間で消失する ように見られた。この結果は、ノルフロキサシンの殺菌作用に対して耐性であっ たmar変異体へのノルフロキサシンの殺菌作用を高める上で、オリゴヌクレオチ ド1284に特異的作用があることを示すものであった。等価物 当業者であれば、ごく通常の実験を行なうのみで、ここに説明した特定の物質 及び手法の等価物を数多く認識され、また確認可能であることであろう。このよ うな等価物は本発明の範囲にあるとみなされ、以下の請求の範囲の包含するとこ ろである。 配列表

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/47 Ａ６１Ｋ 31/496 31/496 31/505 31/505 31/545 31/545 31/65 31/65 31/7008 31/7008 31/7048 31/7048 31/708 31/708 45/00 38/00 48/00 45/00 Ａ６１Ｐ 31/04 48/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ボン ホフ エリック アメリカ合衆国 02181 マサチューセッ ツ州 ウェルズレイ、レッドウィングロー ド 33

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． marORABオペロンの転写産物に相補の、前記オペロンの発現を阻害する合 成オリゴヌクレオチド。 ２． 発現が阻害される遺伝子が、marO,marO/R,marR,marR/A，及びmarAのうち のいずれかから選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ３． 前記オリゴヌクレオチドが、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート 、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、リ ン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、 炭酸塩、及びリン酸トリエステルのうちのいずれかから選択されるヌクレオチド 間連結部を少なくとも一つ含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ４． 前記合成オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのホスホロチオエートのヌ クレオチド間連結部を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。 ５． 少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオ リゴヌクレオチド。 ６． 少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌク レオチド。 ７． 少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む、請求項５に記載のオリゴヌク レオチド。 ８． 前記オリゴヌクレオチドが、約１５から２１個のヌクレオチド長である、 請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ９． 配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5，及びNO:6のうちのいずれかから 選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １０． marORABオペロン核酸の転写産物を、前記転写産物に相補の合成オリゴ ヌクレオチドに接触させるステップをふくむ、marORABオペロンの発現を阻害す る方法。 １１． 前記オリゴヌクレオチドが、marO,marO/R,marR,marR/A，及びmarAのう ちのいずれかから選択される遺伝子の転写産物に対して相補である、請求項１０ に記載の方法。 １２． 前記オリゴヌクレオチドが、配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5， 及びNO:6のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１１ に記載の方法。 １３． 被験者の細菌を、marORABオペロンの転写産物に相補の合成オリゴヌク レオチドへの感染に暴露することで、抗生物質に対する細菌の耐性を低下させる ステップを含む、抗生物質に対する細菌の耐性を低下させる方法。 １４． 前記オリゴヌクレオチドが、薬学的担体に入れられて被験者に投与され る、請求項１３に記載の方法。 １５． さらに少なくとも一つの抗生物質を被験者に投与するステップを含む、 請求項１４に記載の方法。 １６． 前記抗生物質が、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、 スルホンアミド、マクロライド、テトラサイクリン、リンコシド、キノロン、ク ロラムフェニコール、バンコマイシン、リファンピン、イソニアジド、又はトリ メト プリムのうちのいずれかから選択される、請求項１５に記載の方法。 １７． 前記オリゴヌクレオチドが、marO,marO/R,marR,marR/A，及びmarAのう ちのいずれかから選択される遺伝子座の転写産物に対して相補である、請求項１ ３に記載の方法。 １８． 前記オリゴヌクレオチドが、配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5， 及びNO:6のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３ に記載の方法。 １９． 前記細菌が、配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5，及びNO:6のうち のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する、少なくとも二つの合成オ リゴヌクレオチドに暴露される、請求項１８に記載の方法。 ２０． 前記被験者の感染が、Escherichia，Salmonella，Shigella，Klebsiell a，Citrobacter,Hafnia,or Enterobacterの種である、請求項１３に記載の方法 。 ２１． marORABオペロンの転写産物に対して相補の合成オリゴヌクレオチドを 治療量、被験者に投与することにより、被験者の細菌感染を治療する方法。 ２２． 前記細菌感染が、多剤耐性を有する少なくとも一つの細菌による感染を 含む、請求項２１に記載の方法。 ２３． 前記被験者に、さらに抗生物質が投与される、請求項２１に記載の方法 。 ２４． 前記抗生物質が、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、 スルホンアミド、マクロライド、テトラサイクリン、リンコシド、キノロン、ク ロラムフェニコール、バンコマイシン、リファンピン、イソニアジド、又はトリ メトプリムのうちのいずれかから選択される、請求項２３に記載の方法。 ２５． 前記感染が、Escherichia，Salmonella，Shigena，Klebsiella，Citrob acter，Hafnia，又はEnterobacterを含む、請求項２１に記載の方法。 ２６． 前記オリゴヌクレオチドが、marO,marO/R,marR,marR/A，及びmarAのう ちのいずれかから選択される遺伝子の転写産物に相補である、請求項２１に記載 の方法。 ２７． 前記オリゴヌクレオチドが、配列同定番号NO:l,NO:2,NO:3,NO:4,NO:5， 及びNO:6のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２６ に記載の方法。 ２８． marORABオペロンの転写産物に対して相補である、前記オペロンのうち のある一つの遺伝子座の発現を阻害する合成オリゴヌクレオチドと、生理学的に 容認可能な担体とを含む薬学的に容認可能な組成。 ２９． 前記オリゴヌクレオチドが、marO,marO/R,marR,marR/A，及びmarAのう ちのいずれかから選択される遺伝子の転写産物に対して相補である、請求項２８ に記載の薬学的に容認可能な組成。 ３０． 前記オリゴヌクレオチドが、基本的に配列同定番号NO:1,NO:2,NO:3,NO: 4,NO:5，及びNO:6から成るヌクレオチド配列を有する、請求項２８に記載の薬学 的に容認可能な組成。